LP 6,7 - Diagnosticul in Infectie Cu HIV

7/23/2019 LP 6,7 - Diagnosticul in Infectie Cu HIV

http://slidepdf.com/reader/full/lp-67-diagnosticul-in-infectie-cu-hiv 1/102



http://www.mtxlsi.com/FinstripWasherSpecs.htm



DIAGNOSTIC SEROLOGIC

IN INFECTIA HIV/SIDA



Este bine sa doresti sa fi diagnosticat la

timp!

TRATAMENT

MONITORIZARE

CRESTE CALITATEA

VIETII

Beneficii

Temeri

CONTAGIOZITATE

SCADE CALITATEA VIETII

AGRAVARE



1990

Romania

raporteaza 1094

cazuri de SIDA la

copii,reprezentând

jumătate din

totalul de cazuride

SIDA pediatric din

Europa



ENCEFALOPATIE HIV

Infectie HIV in SNC



1. DIAGNOSTIC SEROLOGICTESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta

ELISATESTE RAPIDE

TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta

WESTERN BLOT

RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)

IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

2. DETECTIA DIRECTA A VIRUSULUI

SAU A PRODUSELOR VIRALEIZOLARE VIRALA

DETECTIA ANTIGENEMIEI p24

DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL

(ARN HIV PLASMATIC SAU ADN HIV PROVIRAL LIMFOCITAR)



TESTE DE TRIAJ



ELISA INDIRECTA

ETAPE

1. Incubare ser pacient 1h la 37ºC

2. Spalare

3. Incubare conjugat (Ac anti IgG uman x enzima)- 1h la 37ºC

4. Spalare

5. Incubare substrat 20 – 30 min la temp camerei

6. Citire la spectrofotometru – DO probe, martori, cut off



Spalator

automat

Distribuirea probelor cu

pipeta automata





Spectrofotometru



ELISA de competitie

ETAPE

Incubare ser pacient si conjugat 1h la 37ºC Spalare

Incubare substrat 20 – 30 min la temp camerei

Citire la spectrofotometru – DO probe, martori,

cut off



WESTERN BLOT- test imunoblot folosit pentru confirmarea prezentei anticorpilor

in diferite infectii

- se bazeaza pe detectia anticorpilor defalcati pe grupe antigenice

TESTE DE CONFIRMARE



UTILIZARE

Detectia proteinelor virale

Caracterizarea preparatelor de anticorpi

mono- si policlonali

Determinarea specificitatii raspunsului

imun impotriva antigenelor virale



PRINCIPIU

Proteinele dintr-un lizat viral sunt separate

electroforetic dupa greutatea moleculara

prin SDS-PAGE (sodium dodecil sulfat)

Transferate pe o membrana de

nitroceluloza

Detectie prin anticorpi marcati radioactiv

(autoradiografie) sau enzimatic

(COLORIMETRIC)



ELECTROFOREZA

Pe gel de poliacrilamida

Apoi proteinele sunt transferate pe omembrana de nitroceluloza prin difuzie,

electroforeza sau prin afinitateFixarea se face prin simpla absortie

pasiva, prin legaturi covalente pe

membrana diazotata sau prin legarespecifica pe membrana acoperita deanticorpi



Tehnica

WESTERN BLOT

1. SDS-PAGE

2. BLOT (transfer)

3. DETECTIA

ANTICORPILOR



WESTERN BLOT – detectia Ac serici

Substrate

Stop

color



Western blot

in infectia HIV

gp160

gp120

gp41

p66

p31

p24

p17

p10/11

p7/9

p51

p55

Criteriul minim depozitivitate

• 2 env

+

•

1 gag



ELISA

POZITIV IN DUPLICAT

WESTERN BLOT

NEGATIV=

ABSENTAINFECTIEI HIV

! Ferestraserologica

risc rezidual al

transfuziei = 2/1 milion

NEGATIV

INDETERMINAT

- repeta la 6-8 saptamini

- alt test de confirmare

POZITIV=

INFECTIE HIV

Ag p24- 1.48/1 milion

ADN proviral –

1.48/1 milion

ARN HIV – 1.01/1 milion

DIAGNOSTIC SEROLOGIC HIV



Test Elisa + in duplicat

WB –

Este posibil acest rezultat?; explicati.



Pacient 15 ani

test de triaj infectie HIV

Ce test s-a folosit si care sunt urmatorii pasi?



http://www.immuneepitope.org/

http://hcv.lanl.gov/





Diagnostic molecular invirusologie



Diagnosticul molecular invirusologie

AMPLIFICAREA TINTEI

–PCR

–NASBA (nucleic acid sequenced based

amplification)

AMPLIFICAREA SEMNALULUI

–B-DNA (branched DNA)



PCRPOLYMERASE

CHAIN

REACTION

Metoda utilizata pentru detectia ADN-ului de orice tip.

-se bazeaza pe obtinerea unui numar mare de catene

tinta prin repetatea unui nr. n de cicluri, ce contin in

principal 3 etape:

- denaturarea

- aditia primerilor la capetele secventei tinta

- extensia primerilor

PCR Amplifies a Targeted



p gSequence

Target Sequence

DNA Strand

Double Helix

DNA StrandSupercoiledDNA Strand

Chromosome



PCR 1 Denaturare



PCR – 1- Denaturare

Secventa tinta

PCR- 2 CUPLAREA PRIMERILOR LA



PCR- 2 – CUPLAREA PRIMERILOR LA

CAPETELE SECVENTEI TINTA

Target Sequence

Target Sequence

Primer 1Primer 2

Biotin

Biotin



PCR -3 – Elongarea primerilor sub actiunea

Taq Polimerazei

Secventa tinta

ADN Polimeraza Taq

Secventa tinta

End of the 1st PCR Cycle Results in Two



End of the 1st PCR Cycle - Results in Two

Copies of Target Sequence

Target Amplification



Target Amplification

No. of No. AmpliconCycles Copies of

Target

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

20 1,048,576

30 1,073,741,822

1 cycle = 2 Amplicon







PCR:



Master Mix

Mg2+

Mn2+

dNTP

Target DNA

Taq DNA

Polymerase

Primers

•forward primer

•reverse primer



RT- PCR

Reverstranscriere + PCR



Reverse Transcription - Step 2 –



Reverse Transcription Step 2

Reverstranscriptaze Catalizeaza extensia

Primerului prin incorporarea nucleotidelor

complementare

E d f R T i ti St 3



End of Reverse Transcription - Step 3 –

Rezulta sinteza ADNcomplementar (cDNA)

pe secventa tinta ARN



Safety Gloves, Laboratory Coat



Safety Glasses

Biohazard Container



Biohazard Container

0.5% sodium hypochlorite, ethanol,

Biological Safety Hood



Biological Safety Hood

Vortex Mixer



Vortex Mixer

Centrifuge and/or Microcentrifuge (min. RCF 12,500 x g),



Centrifuge and/or Microcentrifuge (min. RCF 12,500 x g),

some tests require a refrigerated, high speed centrifuge (min. RCF 24,000 x g)

Dry-heat Temperature Block



Dry heat Temperature Block

Incubator (37 C ± 2 C)0

Dedicated Pipettor and Screw-cap Tube Rack,



•Screw-cap tube racks (to hold Master Mix tubes)

Multichannel Pipettor and Tips

PCR System consumables



PCR System consumables

(tubes, base, tray and retainer).

Analyser Consumables/parts



Analyser Consumables/partsD-cups

A-rings, A-ring Holder

Thermal Cycler



Thermal Cycler PCR System 9600 or System 2400

COBAS AMPLICOR™ Analyser



COBAS AMPLICOR Analyser

DETECTIA AMPLICONULUI



DETECTIA AMPLICONULUI

• Electroforeza in gel de agar, colorare

cu bromura de ethidiu si comparare

cu markeri de GM cunoscuta

• Hibridizare cu sonde moleculare

marcate complementare si apoidetectie (+/- spectrofotometrica)



Hibridizare



Detectie

spectrofotometrica Add Stop Solution and

Measure Absorbance

Capture

Probe

Microwell Plate

Addition

of Substrate

Tetramethylbenzidine

(TMB) Substrate

Biotin

BSA

BSA

Hydrogen

Peroxide

Avidin-horseradish peroxidase

(Av-HRP conjugate)



Diagnostic molecular in

infectia HIV

DIAGNOSTIC SEROLOGIC



DIAGNOSTIC SEROLOGICTESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta

ELISA

TESTE RAPIDE

TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta

WESTERN BLOT

RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

DETECTIA VIRUSULUI SAU A PRODUSELORVIRALE

IZOLARE VIRALADETECTIA ANTIGENEMIEI p24

DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL

(ARN HIV PLASMATIC SAU ADN HIV PROVIRAL LIMFOCITAR)

Utilizarea metodelor moleculare in



Utilizarea metodelor moleculare in

infectia HIV

• Fereastra serologica

• Nou-nascuti din mame seropozitive HIV

• Initierea si monitorizarea terapiei

antiretrovirale• iv>5-10.000 corelat cu nr. CD4 si status clinic

• iv>30-50.000 indiferent de nr. CD4 si status clinic

• Monitorizarea: reducerea iv sub 50 copii ARN

HIV/ml la 24 sapt



Precizati tipul dereactie

reprezentata

mai sus si

principiul

tehnicii.

In ce viroze

aceastatehnica este de

electie?



• MC, 25 ani . Se apreciaza ca se gasestein fereastra serologica pentru infectia HIV.

Ce semnifica aceasta notiune si ce etapa

urmeaza in diagnostic.



Nou nascut din mama seropozitiva HIV.

Care este testul de electie folosit pentru

diagnosticul infectiei, precizand si etapele

sale.



• CE TEHNICA ESTE UTILIZATA IN

ETAPA DE CONFIRMARE A INFECTIEIHIV? CE CRITERII TREBUIE

OBLIGATORIU INDEPLINITE PENTRU A

SPUNE CA TESTUL ESTE POZITIV?

CUM SE PROCEDEAZA IN CAZUL UNUI

TEST INDETERMINAT? MENTIONATI

PRINCIPALELE CAI DE TRANSMITERE

ALE INFECTIEI HIV.

LP 6,7 - Diagnosticul in Infectie Cu HIV

Documents

Transcript of LP 6,7 - Diagnosticul in Infectie Cu HIV