LE CLUB DE LA TRANSPLANTATION Infections virales et transplantations6 et 7 Octobre 2005

S. ALAIN, CHU Dupuytren, LimogesRESISTANCE DU CYTOMEGALOVIRUS AUX ANTIVIRAUX APRES TRANSPLANTATION

Le CytomgalovirusVirus de la famille des HerpesviridaeUbiquitairePersiste sous forme latente aprs la primo-infection

La physiopathologie de linfection favorise lmergence de rsistances

Linfection CMV

Infection symptomatique aprs transplantation dorgane solide Rein-pancras : 50%Cur-poumon : 39-41%Foie et pancras : 22-29%Cur et rein : 8-35%

Rsistance aux antiviraux aprs transplantation : 0-13%

La rsistance du CMV aux antiviraux, essentiellement au GCV, aprs transplantation est proccupante plus dun titre :

Elle augmente la frquence des pisodes de virmie, symptomatiques ou non, Elle acclre le dveloppement de la maladie CMV, Elle favorise le rejet de greffeElle augmente la mortalit. (Bhorade et al., J. Heart Lung Transpl., 2002)

Quappelle-t-on rsistance au traitement?La persistance dune rplication virale sous traitement bien conduit dfinit la rsistance cliniqueCauses pharmacologiques/immunologiques/virologiques

La mise en vidence dune souche rsistante par ltude du phnotype ou du gnotype dfinit la rsistance virologique

Comment aborder ltude des rsistances?Quels en sont les mcanismes molculaires ?Comment merge une souche rsistante ?Quand et Comment la rechercher ?Que reprsentent les rsistances en transplantation dorgane ?Quelles conduites peut-on proposer ?

Mcanismes molculaires de rsistancedu CMV aux antiviraux

Les molcules antivirales disponibles inhibent lADN polymrase viraleADN polymraseUL54UL97GCV-PPPCDV-PPPFAFoscarnetPFAGanciclovirGCVCidofovirCDVGCV-PPGCV-PCDV-PKinases cellulaires

Prodrogues :ADN polymraseUL54UL97ACV-PPACV-PPPGCV-PPGCV-PPPAciclovirGCVVal-GCVACVVal-ACVValaciclovirL-Valine

GanciclovirCidofovirFoscarnetRsistance isole au ganciclovirPar dfaut de phosphorylationUL97Rsistance au cidofovir Et Au ganciclovirRsistance au foscarnetMutationRsistance croiseUL54MutationAssociation de rsistances

Cycle intracellulaire du CMVTerminases7UL97, UL27pp65EGFr

Site daction des antivirauxpp65IE72IE E L23456UL54TerminasesEGFrBenzimidazolsMaribavirGCV, CDV, FOS

UL97Srine-thronine Kinase de 707 aa, 78KDa

Active par autophosphorylation

Indispensable la sortie des particules virales hors du noyau Substrat naturel inconnu

Phosphoryle accessoirement le GCVmaribavir, avec UL27

Localisation des principales substitutions d'acides amins responsables de la rsistance au ganciclovir dans la phosphotransfrase UL97 : Plus de 70 % des mutations de rsistance connues sont situes entre les acides amins 460 et 607

UL54ADN Polymrase ADN dpendante, 140KDa, 3->5 exonuclase

Associe une protine accessoire UL44

Assure la rplication du gnome viral

IV-region CIIVIIIIIVIIVNH2COOH408 495410412413419415501 545503513516522588

722756 781 787802805809812821

D981-982987

Localisation des principales substitutions dacide amin responsables de rsistance dans UL54

Rsistance au cidofovir : Rsistance au ganciclovir et au cidofovir : Rsistance au foscarnet Rsistance au ganciclovir et au foscarnet :

Exo I Exo II Exo III301

Quels sont les mcanismes dmergence dune souche rsistante?

Influence des mutations sur la slection des rsistancesLes mutations de UL97 sont les premires apparatreElles confrent un niveau de rsistance modr au GCV (CI50 < 30) Diminuent peu ou pas la capacit rplicative du virus mutantLes mutations de UL54 apparaissent plus tardivementElles confrent un niveau de rsistance levMais diminuent la capacit rplicative du virus

Influence des mutations de UL54 sur la capacit rplicative du virus(Springer et al., J Clin Microbiol, 2005) (Ducancelle et al., J Clin Virol., 1999)

Emergence dune souche rsistante in vivoEmery, J exp.Med., 1999; J. clin. Virol, 2001Cintique virale au cours dune infection CMV non traite : temps de doublement de la population 1 2 jours

Dcroissance virale sous traitement : 1/2 vie 1 2 jours

Emergence du mutant : La souche mute prexiste au traitement, devient dominante sous traitement puis redevient indtectable larrt du traitementTraitement200copies/mlCopies/mlMutantSauvageT21jEn comptition

Quels sont les facteurs de risque de rsistance?Existe-t-il des facteurs prdictifs ?

Emergence d une souche rsistante : Facteurs de risque aprs transplantation dorgane (1)Statut srologique D+/R-Utilisation danticorps anti-lymphocytes (SAL)Transplantation pulmonaire ou rein-pancras

Rplication virale intenseCharge virale leve (Nle : 4-6 log)Augmentation rapide de la virmie

Episodes rpts de maladie CMVAdministration prolonge dantiviral (prophylaxie > TT anticip)

Concentration plasmatiques suboptimales de lantiviral au site de linfectionMauvaise biodisponibilit (GCV oral)Toxicit ncessitant des rductions de dose

Facteurs de Risque de rsistance (2)Absence dassociation entre gnotype gB CMV et maladie CMV ou rsistance

La charge virale circulante permet-elle de prdire lmergence de rsistance aprs transplantation ?Sous traitement :Disparition de lantignmie en 10 15 joursNgativation de la PCR en 15-21 jours Valeur prdictive de la pente de dcroissance ?

Emery et al., 2001

La dcroissance virale sous traitement lors du premier pisode dinfection CMV est prdictive des rcurrences, en labsence de rsistanceHumar et al., JID, 186, 2002

FDR de rcurrenceEnviron 60 jours aprs le premier pisode de maladie CMV (ganciclovir et valaciclovir)Absence de clearance virale lissue du premier traitement p33,8

Quand craindre lmergence dune souche rsistante?

Devant une augmentation ou une persistance de la charge virale (PCR ou antignmie) sous traitement dose efficace chez un patient ayant t expos de faon prolonge un antiviral (prophylaxie ou traitements rpts)Ce dautant que ce patient prsente dautres facteurs de risque de rsistance

La rponse retarde au traitement ne traduit pas systmatiquement une rsistance, mais reprsente un facteur de risque de rcurrence, surveiller.

Llvation de lantignmie dans les 2 premires semaines dun traitement est possible. Elle nest pas associe une rsistance. (Gerna et al., JID 2003; Nichols et al., Blood 2001)

Comment mettre en vidence une souche rsistante ?

Mthodes de dtection des rsistances Phnotype : Dfinit la concentration inhibitrice 50% et 90% de lantiviral test

Ncessite lisolement du virus en culture cellulaire

Long et difficile standardiser

Etudie le comportement du virus quel que soit lantiviral ou les mutations (nouveaux antiviraux)Foyer de Cellules infectes

Mesure des CI50 et CI90 sur virus titr Interprtation du phnotype : CI50 du virus test------------------------- = IS50 > 3CI50 souche sensible de rfrence

Mesure en chiquierAntagonisme-indiffrence-synergieConcentrations de ganciclovir en M

Mthodes de dtection des rsistancesGnotype :

Recherche les mutations de rsistance dans un gne donn : UL97 ou UL54Directement dans le prlvementPlus sensible que le phnotypePermet la dtection de mutations nouvelles

Non standardis pour le CMV :Absence de banque de donnes sur les mutations de rsistancesSensibilit variable des mthodes de gnotypages : de 10% 50%Amplificationpar PCRsquenceInterprtationDu gnotypeRFLPRapidenon exhaustif

Corrlation gnotype-phnotypeLa mise en vidence dune mutation connue est corrle la rsistance clinique et phnotypique

Lorsquune nouvelle mutation est observe, sa responsabilit dans la rsistance doit tre dmontrePar tude du phnotype des souches mutesPar transfert de la rsistance une souche sauvagePar tude de lactivit enzymatique de la polymrase en prsence de lantiviral

La prsence de mlanges de souches peut tre un obstacle la dtection des rsistancesLes souches testes sont le plus souvent les souches circulantes. Les souches mutes peuvent tre slectionnes au site de linfection.

Les souches mutes minoritaires peuvent ne pas tre dtectes, voire tre perdues lors de lisolement viral

Chez un patient multitrait peuvent coexister des souches rsistantes diffrents antiviraux

Souche sauvage (Cycle viral normal)Souche muteAntiviralLes techniques de squenage doivent tre standardises et sensibles

La sensibilit dpend de la mthode de squenageLa dtection prcoce des souches rsistantes est ncessaire

Patiente B. LymphomeDucancelle et al., J.Clin Virol, 2005

Etude pidmiologique des isolats squentielsIsolat B3 : GCV/CDV R, PFA S3 souches

M 1 2 3 4 5 6 7 M

ConsensusSenseAntisenseAD169N495N/KL501I/L

ATCAACACTATGAAGTATCCCAACTCGAACAAGGCCACTAD 169Non dtecte 495501

Que reprsente la rsistance aux antiviraux en pratique clinique aprs transplantation?

Les leons du VIH : Incidence de la rsistance1 : Jabs et al, JID 1998; 2 : Boivin et al., JID 2001; 3: Jabs et al., AAC 1998; 4 : Weinberg et al., JID 2003

Rsistance du CMV aux antiviraux aprs transplantation dorgane (Lurain, JID, 2002)2 cohortes de patients : Cleveland : 2345 patients suivis de 1990 2001 (Etude prospective)Chicago : 200 patients prsentant une infection active CMV (Etude rtrospective)Tous sous GCV en prophylaxie ou traitement

Recherche des souches rsistantes circulantesPhnotype et gnotype

Cohorte de Chicago (Lurain, JID, 2002)

N (%) de patients avec une ADNmie ou une virmie

Organe

transplant

Total

rsistance

Poumon

99

15 (15,2)

Coeur

38

2 (5,3)

Foie

18

1 (5,6)

Rein

45

1 (2,2)

Total

200

19 (9,5)

Cohorte de Cleveland (Lurain, JID, 2002)

N (%) de receveurs

Organe

transplant

Total

Rsistance

Poumon

228

5 (2,2)

Coeur

790

2 (0,25)

Foie

495

0 (0)

Rein

832

4 (0,48)

Total

2345

11 (0,47)

Facteurs de risque (Lurain, JID, 2002)Transplantation pulmonaire

Statut D+/R- (28/30 patients hbergeant une souche rsistante)

Plusieurs mois ou annes de traitement cumul

Mutations : 19 patients -cohorte de Chicago(Lurain, JID, 2002)Rsistance confirme par le phnotype UL97 : 19/19 (100%) des patients->codons 460 607UL54 : 6/19 (30%)->Rsistance croise au cidofovir (5/6) ->rsistance associe au foscarnet (1/6, trait par foscarnet)

Dlai dapparition des mutations : UL97 : 5,5 36 mois UL54 : 5 13 mois, toujours aprs UL97

Les traitements prophylactiques sont-ils pourvoyeurs de rsistance?En faveur :Inhibition incomplte de la rplication viraleVal ACV =ACV < GCV GCV oral=> 45% versus 91% GCV IVVal GCV = GCVnempchent pas la primo-infection (infection active pendant ou larrt de la prophylaxie)administration prolonge En dfaveur :Faible charge virale sous traitementRversion de la population larrt du traitement

Rsistance du CMV aprs prophylaxie par ganciclovir oral (Limaye, Lancet, 2000)Toutes les souches rsistantes portent des mutations dans UL97 en position 460, 594 ou 595

N (%) de patients

Statut

Total

Maladie CMV

Rsistance

D+/R+

67

8

0

D+/R-

173

17

5

Total

240

25 (10,4%)

5 (2,1%)

Rsistance du CMVaprs prophylaxie par ganciclovir oral : facteurs de risque(Limaye, Lancet, 2000)Primo-infection (Charge virale leve) : D+/R- (5/67, 7% versus 0/173)Immunodpression : Greffe de pancras +/- rein (4/19, 21% versus rein 1/20, 5%)

Prophylaxie par GCV et rsistances

Rsistance du CMV aprs traitement premptif par ganciclovir IV en transplantation pulmonaire (Limaye, JID, 2002)45 patients D+/R+ et D+/R-TT premptifGCV IV 5mg/Kg/J x 2n = 37ProphylaxieGCV IV 5mg/Kg/jn = 8Maladie CMV due une souche rsistante au GCV3/181/210%

Prophylaxie et rsistancesValaciclovirAlain et al., 2004 : 27 receveurs de rein virmiques pendant ou larrt de la prophylaxie (suivi 1 an)Recherche systmatique de rsistance : 1/27 (3,8%) : UL97 M460I, sans consquences cliniques, clearance spontane du virus.

Pavlopoulou et al., 2005 : 83 receveurs de rein Val ACV (43) versus GCV oral (40)Aucune suspicion de rsistance pendant les 6 mois post-greffe

Evolution de la patiente BE. FaVCVMMFAZALeucopnieDetection M460I

Sheet:

1er trim.

2e trim.

3e trim.

4e trim.

Est

Ouest

Nord

Graph3

2

3

3

1

7

14

1

5

5

9

10

9

8

2

3

9

7

7

1

3

110

110

140

73

40

25

20

27

10

11

11

8

26

46

2

2

0

AgCMV(pp65positive cells/200 000)

Days post-transplantation

Ag CMV (pp65positive cells/200 000)

figure 1 (2)

oral VCV

MMF

azathioprine

Figure 1 : Clinical and virological course of the patient

VCV : valaciclovir ; MMF : mycophenolate mofetil

Leucopenia

figure 1 (2)

2

3

3

1

7

14

1

5

5

9

10

9

8

2

3

9

7

7

1

3

110

110

140

73

40

25

20

27

10

11

11

8

26

46

2

2

0

AgCMV(pp65positive cells/200 000)

Days post-transplantation

Ag CMV (pp65positive cells/200 000)

Graph2

2

3

3

1

7

14

1

5

5

9

10

9

8

2

3

9

7

7

1

3

110

110

140

73

40

25

20

27

10

11

11

8

26

46

2

2

0

Detection of a M460I mutated CMV strain in plasma

AgCMV(pp65positive cells/200 000)

Days post-transplantation

Ag CMV (pp65positive cells/200 000)

donnes

Days post-transplantationAgCMV(pp65positive cells/200 000)

132

153

193

231

337

4114

441

475

495

559

5710

589

648

752

783

919

967

1137

1201

1273

134110

138110

141140

14873

15540

16225

16920

17627

18310

19011

19711

2118

21826

22546

2392

2672

3360

figure 1

oral VCV

MMF

azathioprine

Figure 1 : Clinical and virological course of the patient

VCV : valaciclovir ; MMF : mycophenolate mofetil

Leucopenia

figure 1

2

3

3

1

7

14

1

5

5

9

10

9

8

2

3

9

7

7

1

3

110

110

140

73

40

25

20

27

10

11

11

8

26

46

2

2

0

AgCMV(pp65positive cells/200 000)

Days post-transplantation

Ag CMV (pp65positive cells/200 000)

Feuil3

Detection of a M460I mutated CMV strain in plasma

Slection prcoce de rsistance au GCV aprs valaciclovir chez un transplant rnal (Hantz etal., AAC 2005)

Traitement prventif et rsistancesDeux tableaux se discernent :Rsistances prcoces : au cours ou la fin de la prophylaxiePeu de consquences cliniquesDisparition spontane de la virmie Associes des charges virales faibles ou modres (1000 10 000 copies) persistantesRsistances tardives survenant dans la premire anneAprs plusieurs expositions aux antivirauxassocies une maladie CMVde pronostic plus rservAssociant parfois plusieurs souches

Quelles alternatives peut-on envisager?Association de deux molcules (ganciclovir et foscarnet)Alternatives thrapeutiques :Baisse de limmunosuppression (Anglicheau et al., 2003)Nouveaux antiviraux

Conclusion 1Lmergence de souches rsistantes aprs transplantation dorgane est possible, sous traitement prophylactique, anticip, ou curatif.

Elle est favorise par :Des traitements sub-inhibiteurs prolongs avec persistance dune rplication viraleUne profonde immunodpressionUne charge virale leve (antignmie ou ADNmie)Un statut D+/R-

Et doit donc tre recherche chaque fois quune rplication virale persiste sous traitement bien conduit, malgr la leve de limmunosuppression

Cest pourquoi tout traitement anti-CMV, mme prophylactique justifie une surveillance virologique

Conclusion 2La mise en vidence dune souche rsistante associe:Un test molculaire sur sang total ou leucocytes (tube EDTA)Un isolement des souches virales circulantes (virmie, tube hparin) chaque fois que possibleUne tude des souches au site de linfection en cas de maladie CMV

Observatoire de la rsistance du CMV aux antiviraux aprs transplantation dorgane et greffe de moelleCentre National de Rfrence du Cytomgalovirus

1) Enqute rtrospective sur les prlvements de lanne 2004, en cours

2) Enqute prospective avec recueil de donnes cliniques et virologiques et recueil systmatique de prlvement devant toute infection CMV

3) Possibilit dobtenir, sur envoi de souche ou de prlvement, une recherche de rsistance sous 8 jours.

Linfection CMV peut-tre symptomatique, allant du syndrome CMV la maladie CMV touchant un ou plusieurs organes, ou asymptomatique uniquement dtectable par les techniques virologiques PCR, antignmie, cultureElles sont difficiles estimer, variant en fonction du degr dimmunosuppression mais aussi du type de mutant rsistant et des possibilits thrapeutiques.La rsistance clinique peut aller de la simple excrtion dun virus rsistant la maladie CMV rsistante au traitement. La surveillance virologique permet de suspecter la rsistance virologique avant la rsistance clinique devant la persistance dune rplication viraleCes molcules sont sans effet sur le virus latent elles sont virustatiquesModes de rsistance du CMV aux antivirauxThioure, LeflunomideGCV, CDV, FOS : inhibiteurs de UL54Benzimidazols : BDCRB, TCRB : inhibiteurs des terminasesMaribavir (indolocarbazole) : inhibiteur de la sortie du noyau/tgumentationThioure, LeflunomideGCV, CDV, FOS : inhibiteurs de UL54Benzimidazols : BDCRB, TCRB : inhibiteurs des terminasesMaribavir (indolocarbazole) : inhibiteur de la sortie du noyau/tgumentationDomaine catalytique, sites dautophosphorylationNombreuses dltions de 1 17 codons dans la rgion 590-607397 : mutation de rsistance au maribavirD 205E : mutation compensant partiellement la rsistance lie aux mutations 460 (?) et 594Les mutations sont rparties sur la totalit du gne

Avec un regroupement dans des domainesfonctionnels conservs conservs La capacit rplicative du virus peut tre mesure par la quantification du virus produit en culture ou par la mesure de lactivit polymrasique de lADN polymrase de la souche, produite in vitro.Dcroissance de la charge virale en dessous du seuil de dtection (200copies/ml de sang) en 21 jours sous traitement

Tous les facteurs favorisant la rplication du CMV se retrouvent dans les facteurs favorisants lmergence de rsistance. Ainsi, daprs ltude de Limaye et al. 2002, Le statut srologique D+/R_, le nombre de rcurrences dinfection CMV, lutilisation dagents anti-lymphocytes, un fort pic de charge virale, ainsi quune exposition prolonge au traitement sont significativement associs au risque de rsistance.La souche rsistante peut rester confine au site de linfection et ne pas tre dtectable dans la circulation gnrale

Aprs prophylaxie (Humar 2005) pas dassociation entre anti-lymphocytes et infection larrt de la prophylaxie, alors que l association avec le statut srologique persiste. Le temps ncessaire pour diminuer de moiti la quantit de CMV mesure dans le sang est de 1,5 2 jours selon les patients. La dcroissance est modifie par lapparition de souches rsistantes au traitementExemples : Patients 1 et 2 : pas de rcurrence ; Patients 3 et 4 : rcurrences 52 patients prophylaxie par GCV oral ou IV 12semPremier pisode de maladie CMV (syndrome CMV et/ou atteinte dun organe) : surveillance virologique rapproche (hebdomadaire)Cependant rcurrence nest pas synonyme de rsistance (Boivin 2001 : 1/12)TT GCV IV 10mg/kg/j 2 3 semainesAfin de standardiser les mesures on utilise un index de sensibilit, en rfrence une souche sensible de rfrence ou au rsultat dun panel disolats sensibles tests au laboratoireMaribavir : effet synergique avec le cidofovir, additif avec les autres molculesIntrt des prlvements au site de linfection, en plus du prlvement sanguin.Utiliser des mthodes sensiblesCe qui diminue beaucoup moins le fitness de la souche que laccumulation de mutationsDuring antiviral treatment its important to detect as early as possible resistant strains that can be minority within isolates*Aucune maladie CMV dans ce groupe, et donc aucune recherche de rsistance# Taux lev de virmies : 40 et 45 % pour valGCV et GCV respectivement