LAS HERRAMIENTAS BIOTECNOLGICAS PARA EL DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS

Y PARA SU MEJORAMIENTO GENTICO

I. TORRES-PACHECOM. M. GONZLEZ CHAVIRAR. G. GUEVARA GONZLEZ

INTRODUCCIN

Se estima que para el ao 2025 habr en la Tierra ocho mil millones dehabitantes; aproximadamente dos mil millones ms que en la actualidad.Asimismo, se ha afirmado que actualmente existen alrededor de 800millones de seres humanos que padecen alguna forma de hambre. Laagricultura sigue siendo la fuente primaria de alimentos e independien-temente de los excedentes de los pases desarrollados, la seguridad ali-mentaria en los pases en desarrollo depende esencialmente de ellos mis-mos. Los economistas sealan que la transferencia neta de alimentos deuna regin del planeta a otra normalmente no rebasa el 10% (1). Noobstante no hay ms suelo que incorporar al cultivo; inclusive, por ejem-plo en Mxico, se est reduciendo la superficie cultivable por efecto delos fenmenos de erosin y del crecimiento de la mancha urbana. Asque el reto es incrementar la capacidad productiva con un impacto mni-mo en el ambiente.

La revolucin verde que impuls un incremento significativo en losrendimientos agrcolas, y que ha permitido tambin el desarrollo de nue-vas variedades de vegetales (figura 1), desafortunadamente trajo consigotambin algunos efectos que han contribuido al deterioro ambiental. Eluso masivo de pesticidas qumicos como estrategia para luchar contra lasplagas y enfermedades y as aumentar la produccin no siempre ha teni-do el efecto esperado, aunque su uso ha crecido hasta diez veces en elperiodo de 1945 a 1989. Curiosamente los daos causados por plagasy enfermedades se incrementaron de 7 a 13% en el mismo periodo.

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No se puede asumir una posicin a ultranza contra los agroqumicos,pero su uso debe darse con fundamento en el conocimiento del parsi-to (etiologa), de los factores ambientales que influyen en el desarrollodel sndrome (epidemiologa), y del husped (la planta y sus mecanis-mos de resistencia o susceptibilidad). Es en este contexto que se visuali-za el diagnstico de enfermedades en plantas en este documento.

EL DIAGNSTICO

Las aplicaciones de la biotecnologa en el campo del diagnstico sani-tario, se han orientado a la deteccin, etiologa, estudios epidemiolgi-cos y determinacin de elementos responsables de patogenicidad, tantoen plantas como en animales. Asimismo, las herramientas de la biotec-nologa orientadas al diagnstico gentico han permitido esclarecer conmayor precisin casos de paternidad y ha ayudado a establecer la identi-dad para la proteccin.

En el caso de la agricultura, un diagnstico adecuado provee la infor-macin bsica necesaria que a su vez permite establecer las opciones pa-ra manejar pequeas particularidades de cada organismo o condiciny as elegir la mejor accin para enfrentar adecuadamente un problema

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Figura 1DESARROLLO DE NUEVAS VARIEDADES

Variedades de maz generadas por el Programa de Mejoramiento del INIFAP.

particular; de lo contrario la estrategia de control elegida podra ser in-fructuosa o eventualmente agravar el estado sanitario del cultivo.

El diagnstico aporta en el caso de las enfermedades de plantas loselementos esenciales para la prevencin y ste es un componente impor-tante para el diseo de sistemas de manejo integrado. El manejo integra-do por su parte, ha sido planteado de manera recurrente como la estrate-gia ms sustentable para el manejo de los problemas de orden sanitario.

Tradicionalmente, en lo que concierne a la etiologa, en una primeraetapa se recurra al examen de los sntomas y signos. Los sntomas sonmanifestaciones de la enfermedad que brindan una orientacin generalsobre la causa del problema, pero normalmente no son definitivos paraidentificar todas las enfermedades, pues en algunos casos son comunespara varios grupos de fitopatgenos. Los signos son elementos general-mente morfolgicos o fisiolgicos tpicos del agente causal que caracte-rizan al patgeno. En los casos donde es posible encontrarlos claramen-te, ayudan de manera importante y permiten un diagnstico ms rpido.Por ejemplo, la deteccin de hongos fitopatgenos se basaba originalmen-te en caractersticas morfolgicas, dada la amplia gama de modificacionesexistentes en sus estructuras como septos, forma, tamao, color y organi-zacin de los conidios, esporangiforos, conidiforos, estructuras dereproduccin sexual, formacin de clamidosporas y otras, pero no todaslas enfermedades producen signos. En algunos casos tambin se usabanalgunas tcnicas de tincin, rango de hospederos y medios selectivos.

En cuanto a bacterias fitopatgenas, la mayora eran difciles de iden-tificar por rasgos visibles a travs del microscopio, por lo que se hacanecesario recurrir a ciertas tcnicas de tincin, espectro nutricional, ino-culaciones, serologa, medios selectivos y otras pruebas especficas. En elcaso de virus, la sintomatologa, el uso del rango de hospederos, la pre-sencia de inclusiones citoplasmticas, la forma de transmisin y varieda-des diferenciales eran algunas de las herramientas usadas tradicional-mente para su deteccin y eventual identificacin. Diversos fitopatge-nos son difciles de identificar usando criterios morfolgicos, los cualespueden ser tardados y requerir amplios conocimientos en taxonoma.

Las tcnicas de deteccin con herramientas de la biotecnologa pue-den en general, generar rpidamente resultados ms seguros. El usode la biotecnologa en el campo del diagnstico fitosanitario se inici desdelos aos sesenta usando mtodos serolgicos de laboratorio. Sin embargo,prcticamente con estos mtodos, no se haca nada en lo que concierne

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a bacterias y hongos antes del desarrollo de una prueba llamada ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) y el uso de anticuerpos monoclonales.

Precisamente con la ELISA, fundamentada en la deteccin con anti-cuerpos, en particular monoclonales y ensayos de inmunoabsorbanciade enzimas conjugadas e inmunoflourescencia (IF) (2, 3), se dispara elpotencial del diagnstico. Estas herramientas fueron de gran importan-cia en virologa, bacteriologa y micologa porque se podan identificary detectar rpidamente ms y diferentes patgenos (4,5). Posteriormen-te llegaron tecnologas basadas en el cido desoxirribonucleico (DNA),y como ejemplo principal tenemos el caso de la reaccin en cadena dela polimerasa (PCR), y su capacidad para amplificar un DNA blanco millo-nes de veces en relativamente corto tiempo (6).

A continuacin se presentan brevemente los fundamentos de las tc-nicas biotecnolgicas ms relevantes tanto inmunolgicas como molecu-lares, que se emplean en la deteccin de patgenos en plantas.

MTODOS INMUNOLGICOS

Existen varios mtodos basados en los principios inmunolgicos, algu-nos de ellos con aplicaciones muy especficas.

ELISA (enzyme linked inmmunoabsorbent assay). Este es un anlisis am-pliamente aceptado como mtodo de inmunodeteccin para su uso conpatgenos de plantas ya que es verstil, confiable, simple en su realiza-cin, emplea reactivos econmicos y consigue alta sensibilidad al cuanti-ficar biomasa del patgeno en tejidos de plantas (2, 7). La tcnica msusual es la del sndwich de doble anticuerpo (DAS-ELISA), la cual estbasada en el uso de un anticuerpo monoclonal que se fija en un soporteslido; por ejemplo, placas de microtitulacin, tubos de ensayo, o mem-branas de nitrocelulosa. El soporte est recubierto con el anticuerpoespecfico para el antgeno de inters (4). El soporte recubierto se usapara agregarle el extracto de la muestra de inters (ejemplo: a los poci-llos de una microplaca). Si el patgeno (antgeno) se encuentra presen-te en la muestra, es entonces capturado por el anticuerpo que cubreel soporte. Cualquier resto de tejido que no se adhiera al anticuerpo esremovido mediante lavados. Un segundo anticuerpo, dirigido contra el

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antgeno, es conjugado a una enzima que suele ser peroxidasa o fosfa-tasa alcalina. Este anticuerpo capturar cualquier partcula de antgenoque quede enlazada al anticuerpo que cubre el soporte. Una vez ms, elmaterial no enlazado ser removido de la placa por sucesivos ciclos delavados. La presencia del anticuerpo conjugado es revelada mediante laadicin del sustrato de la enzima. La intensidad del cambio de color serproporcional a la cantidad de antgeno capturado por los anticuerpos.El color producido depender del reactivo especfico que se utilice. Engeneral, si se produce color se considera una reaccin positiva que indi-ca la presencia del patgeno, y si no hay cambio de color, la muestra esconsiderada negativa (2).

Inmunoflorescencia. En la inmunofluorescencia directa (IFA), anticuer-pos especficos contra el patgeno son conjugados con molculas fluo-rescentes, comnmente isotiocianato de fluorescena (FITC) o isotiocia-nato de rodamina (RITC). La presencia o ausencia del antgeno en la mues-tra se detecta mediante microscopa de fluorescencia (8). Una variantede esta metodologa es la inmunofluorescencia indirecta, en la que lareaccin antgeno-anticuerpo se revela con un segundo anticuerpo mar-cado con una molcula fluorescente. Una propiedad importante de estesistema es la posibilidad de obtener resultados cuantitativos cuando elnmero de unidades fluorescentes pueden ser contadas (por ejemplo c-lulas bacterianas o esporas de hongos); lo anterior tiende a ser muytedioso y lento lo cual restringe el nmero de muestras que suelen eva-luarse. Para superar esta limitacin se han desarrollado sistemas autom-ticos y programas de computadoras acoplados al microscopio y ahora esposible realizar este tipo de anlisis a gran escala (5).

Actualmente existen paquetes de deteccin comerciales para unagran diversidad de virus, bacterias, hongos y otros patgenos (tablas 1y 2) (5).

Este tipo de ensayos ha sido particularmente til en la deteccin y lo-calizacin de hongos en material vegetal y suelo (9, 10, 11) y en el diag-nstico de enfermedades causadas por bacterias fitopatgenas (12).

TabEJEMPLOS DE VIRUS PATGENOS Y OTROS

DE TCNICAS IN

Patgeno Cultivo que afecta

Virus mosaico de la yuca africana (ACMV) YucaVirus mosaico de la alfalfa (AlMV) AlfalfaVirus de la mancha clortica de la manzana ( ACLSV) ManzanaVirus mosaico de la manzana (AMV) ManzanaVirus 2 del esprrago (AV2) EsprragoVirus mosaico de la bractea del pltano (BaBMV) PltanoVirus del amacollamiento de la punta del pltano (BaBTV) PltanoVirus estriado del pltano (BSV) PltanoVirus enanismo Amarillo de la cebada (BYDV) CebadaVirus mosaico comn del frijol (BCMV) FrijolVirus moteado de la vaina del frijol (BPMoV) FrijolVirus mosaico Amarillo del frijol (BYMV) FrijolVirus de la vena amarilla necrtica de la remolacha (BNYVV) FrijolVirus de la Hoja moteada de la cereza (BLMoV) Cerezas y otras frutillasVirus del chamuscado del cereza (BSV) Cerezas y otras frutillasVirus del shock de la cereza (BShV) Cerezas y otras frutillasVirus agujeta de zapato de la cereza (BStV) Cerezas y otras frutillasVirus de la marchitez amplia del frijol (BBWV) FrijolVirus mosaico de la coliflor (CaMV) ColesVirus del enrollamiento de la hoja de la cereza (CLRV) CerezasVirus del crisantemo (ChV) CrisantemosVirus de la tristeza de los ctricos (CTV) Ctricos

Virus mosaico del chcharo de vaca (CwMV) Chcharo de vacaVirus moteado verde del pepino (CGMV)s Pepinos y otras cucurbitceasVirus mosaico del pepino (CMV) Pepinos y otras cucurbitceas

Virus latente comn del ajo GCLV Ajo

Geminiviruses - 3F7: Varias dicotiledneas (Chile, jitomate, etc.,)

Virus del enrollamiento de la hoja de la vid (GLRV) VidVirus A de la Vid (GAV) VidVirus de la mancha clortica del tomate (TCSV) Jitomate

Virus mosaico de la lechuga (LMV) LechugaVirus moteado clorotico del maz (MCMV) Maz

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la 1QUE SE PUEDEN DETECTAR MEDIANTE EL USOMUNOLGICAS

Patgeno Cultivo que afecta

Virus del mosaico del pepino (PeMV) MelnVirus mosaico del moteado tenue del chile (PeMMV) ChileVirus moteado del chile(PeMV) Chile y cebollaVirus de la viruela de la ciruela (PPV) CiruelaVirus mosaico de la nochebuena (PVM) Noche buenaVirus mosaico aucuba de la papa) (PoAMV) PapaVirus latente de la papa (PLV) PapaVirus del enrrollamiento de la hoja de la papa (PLRV) PapaVirus M de la Papa (PVM) PapaVirus S de la papa (PVS) PapaVirus T de la papa (PVT) PapaVirus V de la papa (PVV) PapaVirus X de la papa (PVX) PapaVirus Y de la papa (PVY) PapaVirus enanismo de la ciruela (PDV) CiruelaVirus de mancha anillada necrtica de la ciruela (PNRV) CiruelaVirus del mosaico del suelo del trigo (S-BWMV) TrigoVirus del mosaico sureo del frijol (SBMV) FrijolVirus mosaico de la soya (SMV) SoyaVirus mosaico de la calabaza (SqMV) CalabazaVirus de la mancha anillada latente de la fresa (SLRV) FresaVirus del amarillamiento suave asociado a la edad de la fresa Fresa(SMYE-aV)Virus baciliforme de la caa (SBaV) Caa de azcarVirus mosaico de la caa (SMV) Caa de azcarVirus jaspeado del tabaco (TEV) Tabaco y otras

solanceasVirus mosaico del tabaco (TMV) Tabaco y otras

solanceasTobacco Rattle Virus Tabaco y otras

solanceasVirus de la mancha anillada del tabaco (TRsV) Tabaco y otrasVirus estriado del Tabaco (TSV) TabacoVirus moteado de la vena del tabaco (TVMV) Tabaco y otras

solanceasVirus de la mancha anillada del tomate (ToRsV) JitomateVirus de la marchitz manchada del tomate (TSWV) Jitomate

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Virus del enanismo mosaico del maiz (MDMV) MazVirus mosaico del maz (MMV) MazVirus estriado del maz (MSV) MazVirus rayado del maz (MStV) MazVirus mosaico raya blanca del maz (MWLMV) MazVirus de la mancha necrtica del meln (MNSV) MelnVirus enanismo Amarillo de la cebolla (OYDV) CebollaVirus mosaico de la papaya (PMV) PapayaVirus mancha anillada de la papaya (PRsV)) PapayaVirus mosaico del suelo de chcharo PS-(BMV) Chcharo

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Virus Aspermy del tomate ( ToAV) JitomateVirus del anillamiento negro del tomate (ToBRV) JitomateVirus del apachurramiento peludo del tomate (ToBSV) JitomateVirus mosaico del tomate(ToMV JitomateVirus mosaico del nabo (TuMV) NaboVirus 2 mosaico de la sanda ( WMV2) SandaVirus moteado plateado de la sanda (WSMV) SandaVirus enanismo del trigo (WDV) TrigoVirus mosaico del huso estriado del trigo (WSSMV) TrigoVirus mosaico estriado del trigo TrigoVirus mosaico amarillo de la calabacita (ZYMV) Calabacitas

y calabazas

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DIAGNSTICO MOLECULAR

Con el advenimiento de la biologa molecular y la posibilidad de com-parar secuencias representativas y conservadas de regiones de DNA gen-mico, se ha incrementado significativamente el nmero de patgenosy en particular los parsitos que pueden ser analizados sobre todo a tra-vs de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

A continuacin se enunciarn las caractersticas de las principales tc-nicas moleculares.

Hibridacin de cidos nucleicos. ste es un anlisis basado en el uso desondas especficas de DNA del patgeno. Las sondas contienen DNA com-plementario especfico para las regiones conservadas del genoma delpatgeno. La sonda se marca con radiactividad o con un reactivo fluo-rescente, por ejemplo digoxigenina, la cual es incorporada en la sondapara actuar como una etiqueta que permite la identificacin.

El DNA en la muestra que va a ser analizada es expuesto y enlazadoa una membrana de soporte. Una sonda de DNA marcada es posterior-mente agregada a la membrana. Si el DNA blanco (DNA del patgeno deinters) est enlazado a la membrana, la sonda del DNA lo encontrary se hibridar con ella. La etiqueta incorporada en la sonda permite ladeteccin de las molculas de DNA hibridadas durante los pasos subsi-guientes, ya sea por exposicin a una pelcula fotosensible o por la adi-cin de un cromgeno que causar un cambio de color observado en lasmuestras que contengan el complejo DNA blanco-sonda.

La hibridacin in situ y la de punto son variantes interesantes del an-lisis por hibridacin molecular. La hibridacin in situ se realiza normal-mente en placas de plstico o de vidrio en las que se localizan los DNAs delas muestras. Las placas son expuestas a la sonda marcada y si el DNAo RNA blanco est presente en la seccin de tejido, la sonda lo localizar,se enlazar a ella y posteriormente se detectar por fluorescencia o colo-racin segn la marca. La hibridacin de punto se realiza depositando elcido nucleico sobre una membrana y posteriormente el DNA o RNA blan-co es detectado por medio de la sonda marcada.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es un desarrollo meto-dolgico que potenci de manera espectacular el diagnstico fitosanita-

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rio. Tal y como se ha descrito en los primeros captulos de este libro, conla PCR las secuencias de DNA especfico se pueden amplificar (multiplicar)de manera exponencial, a travs de ciclos repetidos de condiciones ade-cuadas para la sntesis de dicha biomolcula (7). As, la PCR se realiza eje-cutando una serie de ciclos con cambios de temperatura. Elevar la tem-peratura permite la separacin de las cadenas de DNA, el ciclo de tempe-ratura fro permite que se unan las sondas y la enzima polimerasa repro-duce una copia exacta del material blanco. La especificidad se le confie-re a la reaccin mediante el uso de sondas, en este caso oligonucletidosde 13-27 nucletidos que en las condiciones de reaccin especficas dis-paran la sntesis. Los productos de la reaccin son posteriormente anali-zados e identificados mediante la electroforesis de gel, en hibridacin degota o bien usados dentro de una estrategia de anlisis de marcadoresmoleculares.

La posibilidad del diagnstico se ha potenciado an ms con la posi-bilidad de cuantificar los productos de la PCR a travs del sistema de tiem-po real. La PCR en tiempo realest revolucionando la manera de lle-var a cabo los diagnsticos de las enfermedades en plantas en la medidaque incrementa el conocimiento sobre la transcripcin de genes espec-ficos en el genoma de los patgenos y aumenta la disponibilidad de mssecuencias de genes especficos de estos organismos. Como la mayora delos virus tienen genomas de RNA, para aplicar la PCR en cualquier moda-lidad primero se le tiene que hacer una copia en DNA, proceso que seconoce como RT-PCR. En el caso de los virus con genoma de DNA, bacte-rias, hongos, nemtodos y fitoplasmas, la PCR se aplica directamente.

La determinacin de la secuencia nucleotdica de genes conservadosha permitido desarrollar protocolos de deteccin precisos y especficosbasados en la hibridacin molecular o en la PCR con diversos niveles deespecificidad en virus, hongos, y bacterias disponibles incluso a nivel co-mercial; algunos ejemplos se mencionan en la tabla 2.

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LA DETECCIN DE PATGENOS COMO BASE DEL DIAGNSTICO; CASOS EXITOSOS

Hasta aqu se ha referido la deteccin de patgenos como diagnsti-co per se. Las circunstancias determinan en la generalidad de los casosque el diagnstico se oriente en algunos de ellos al aporte de informa-cin parcial. Sin embargo, la deteccin del patgeno tambin se usa paraconocer algunos otros aspectos del diagnstico visto en un sentido msamplio, ya sea en el campo de la etiologa, epidemiologa o mecanismosde patogenicidad.

Por ello se sealarn a continuacin algunos logros que se han tenidoy otros que se pudieran alcanzar a partir del monitoreo del patgeno endiferentes condiciones.

Determinaciones etiolgicas. Algunas enfermedades tienen un periodo delatencia muy largo entre la infeccin y la manifestacin de los sntomasy esto, obviamente, limita la definicin del momento adecuado para laaplicacin y definicin del tipo de agroqumico por aplicarse puesto quese desconoce el agente causal. Esta situacin puede ser superada median-te ensayos cinticos en diferentes rganos de la planta que permitanmedir el progreso de la enfermedad a travs de la deteccin del DNAusando la PCR en tiempo real. Estas alternativas del uso de las herra-mientas biotecnolgicas han permitido manejar ms adecuadamente lasenfermedades causadas por ejemplo por Pyrenopeziza brassicae y Septoriatritici (13). Existen situaciones particularmente complejas en ciertas enfer-medades en que se han podido manejar de manera eficaz mediante eluso de herramientas biotecnolgicas que han permitido la deteccinsimultnea de varios patgenos involucrados en un mismo sndrome;por ejemplo virus (14), hongos (15) o bacterias (16). En eventos de estanaturaleza es posible disear acciones especficas o complementarias demanejo en que se tome ventaja de este conocimiento. Adicionalmente,se ha observado en estudios con virus y hongos fitopatgenos que lacombinacin de ELISA y PCR acelera y mejora la sensibilidad de la detec-cin cuando hay elementos en la planta que inhiben esta ltima (17, 18,19, 20, 21). Asimismo, la combinacin de anlisis mediante PCR y RFLPs(polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin), ha resul-tado ser un procedimiento efectivo para diferenciar ciertos virus que me-diante tcnicas serolgicas resultan indistinguibles (22).

Determinaciones epidemiolgicas. Muchas epidemias se inician y se dis-persan mediante esporas que son transportadas por el viento. Por lo

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tanto el monitoreo, colecta en trampas y su anlisis posterior por PCR,puede permitir detectar rpidamente las esporas de un patgeno espe-cfico, incluso si slo captura un nmero muy bajo de stas (23). Estaprctica permite disear oportunamente una estrategia para contendercon la enfermedad de manera preventiva. Lo anterior no slo permiteprevenir a nivel de predio sino a nivel de cuenca o regin.

Por otro lado este tipo de estrategia de monitoreo tambin puede ser-vir para evaluar las posibilidades de sobrevivencia de las esporas en dife-rentes condiciones y territorios a las que el viento las mueva. De estamanera, se estaran aportando elementos de carcter epidemiolgico.

Contribucin al conocimiento de los mecanismos de patogenicidad. La posibi-lidad de deteccin in situ de patgenos tales como virus, independiente-mente de que sea una herramienta con la que se puede avanzar sobre laetiologa, tambin permite usarla para determinar algunos elementos delos mecanismos de accin de los diversos agentes patognicos (24). Conuna visin ms amplia del anlisis del potencial de esta posibilidad sepuede obtener informacin relacionada con los sitios de localizacin delpatgeno como virus en la planta, de la velocidad de su movilidad y trans-ferencia, etc. Por ello se puede visualizar como una herramienta quepuede contribuir al conocimiento de los mecanismos de patogenicidad.Un aspecto interesante que puede ser abordado a travs de las metodo-logas moleculares es el de la interaccin de patgenos en un mismo hos-pedero. Esta situacin puede derivar en la posibilidad de comprendermejor los mecanismos de patogenicidad y tambin para desarrollar nue-vas estrategias para el manejo de las enfermedades que involucran mez-clas de patgenos (24, 25).

Otras aplicaciones. Muchos de los pesticidas que se utilizan actualmen-te tienen un solo sitio de accin, por lo tanto una simple mutacin en elgene blanco puede derivar en resistencia al pesticida. Por medio de laPCR se pueden detectar los cambios en la secuencia genmica de pat-genos resistentes a pesticidas. Estudios al respecto se han realizado porhibridacin molecular para detectar la resistencia en hongos a fungici-das cuyo principio activo es el benomyl (26). Los datos as obtenidos pue-den mejorar el entendimiento del desarrollo de las resistencias y en algu-nos casos superar la condicin particular inherente al uso de pesticidas,modificndolo genticamente.

Por otro lado la secuenciacin y comparacin de regiones genmicascodificantes (o no) de varios patgenos tales como virus, bacterias, hon-gos y nemtodos han permitido hacer no slo el diagnstico sino inclu-sive precisar propuestas taxonmicas (27, 28).

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EXPERIENCIA EN MXICO EN EL DIAGNSTICO MOLECULARDE VIRUS EN AGRICULTURA

Las enfermedades de etiologa viral pueden ocasionar prdidas de has-ta el 100%; no obstante la media de daos se estima en 30% (29). Lasprimeras acciones de diagnstico en Mxico, se orientaron exclusiva-mente a la deteccin de los diferentes virus patgenos al inicio de lossesenta. En un principio, dicha deteccin se realizaba usando plantasdiferenciales, propiedades de infectividad, punto de inactivacin trmi-ca, longevidad in vitro, estudios histopatolgicos, transmisin y purifica-cin (30). A partir de fines de la dcada de los setenta, se empieza a rea-lizar esta actividad usando mtodos inmunolgicos. De esta manera,a mediados de los ochenta, en un esfuerzo interdisciplinario se estable-ce de manera inequvoca la presencia por lo menos en el Bajo, noroes-te y noreste del pas del virus mosaico del pepino (CMV), el virus mosai-co del tabaco (TMV) y el virus jaspeado del tabaco (TEV), algunas vecesinvolucrados en problemas significativos. Otros ejemplos importantes devirus patgenos de cultivos en Mxico, se presentan a continuacin.

Rizado amarillo del chile. A fines de la dcada de los ochenta se detectannuevos virus en los cultivo de chile en Mxico; los geminivirus (31), a loscuales se les asoci con la enfermedad denominada como atigrado del

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Figura 2ENFERMEDAD PRODUCIDA EN EL CULTIVO DE CHILE

En el panel A se muestran a varios adultos de la mosquita blanca y en el panel B, unaplanta de jitomate con sntomas.

chile. Esta deteccin se realiz en el noroeste del pas, en la regin pro-ductora de hortalizas en Sinaloa. Por lo menos, a alguno de esos gemi-nivirus se le relacion de manera preferencial con el tipo de chile serra-no, (serrano golden mosaic virus (SGMV). Por otro lado, en el sur del estadode Tamaulipas apareci una enfermedad en el cultivo de chile transmi-tida por la mosquita blanca (figura 2), que pareca de etiologa viral a lacual se le llam rizado amarillo. No obstante ninguno de los virus cono-cidos que tenan por hospedero a la planta del chile reproduca la enfer-medad (29). Es hasta 1993, al reportar que mediante la clonaciny la determinacin de la secuencia nucleotdica (parcial) de DNAs aso-ciados a la enfermedad, que se encontr un geminivirus que no habasido reportado previamente al cual se le denomin virus huasteco delchile (PHV)(32).

Posteriormente, mediante la secuenciacin, comparacin de secuen-cias y uso de PCR (figura 3), se establece la identidad de otro geminivirusque conjuntamente con el PHV es capaz de reproducir los sntomas delrizado amarillo: el virus texano del chile (TPV) llamado en algunos art-culos ahora PepGMV (33), cuya presencia en chile haba sido ya reportadaen Texas (34). La secuenciacin completa del PHV y del PepGMV (35, 36)permiti disear sondas especificas, lo cual a su vez permiti que se rea-lizaran estudios sobre la distribucin de estos virus en Mxico y en partede los Estados Unidos, no slo en chile, sino tambin en jitomate y en lamaleza (14, 37). Adems, gracias a este esfuerzo fue posible relacionar-

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Figura 3 PLANTAS DE CHILE ENFERMAS POR GEMINIVIRUS Y SU DETECCIN POR PCR

En el panel A la planta mostrando los sntomas y en el panel B se muestra la fotografade un gel que muestra los DNAs virales amplificados.

los filogenticamente con los geminivirus conocidos. Este ejercicio per-miti entre otras cosas, establecer que PHV y PepGMV tienen una protena(BR1) que comparten con una gran similitud entre ellos ms que conningn otro virus (36). Lo anterior permiti conjuntamente con estu-dios de carcter biolgico, determinar que el PHV es capaz de comple-mentar la funcin del PepGMV, pero no lo contrario (33, 36). La raznde lo anterior es que en el caso del PHV se demostr que la protena dela cpside juega un papel importante en el movimiento de este virus(38).

La informacin molecular referida ha permitido tambin que median-te el uso de biobalstica, aislamiento e inoculacin de protoplastosy deteccin de los patgenos en la planta se hayan obtenido plantas resis-tentes a ambos geminivirus solos o en infeccin mixta (39, 40), y ademsse haya avanzado en el entendimiento de algunos elementos que pareceninvolucrados en los mecanismos que determinan tales respuestas (39).

Virus de RNA en chile y jitomate. Entre los virus de este tipo, cuyo estu-dio ha sido abordado con herramientas biotecnolgicas, destacan elvirus mosaico del tabaco (TMV), el virus mosaico de pepino (CMV) y el vi-rus jaspeado del tabaco (TEV). Los virus TMV, TEV y CMV tienen una distri-bucin ms amplia que los geminivirus, si bien no necesariamente estninvolucrados en un sndrome. De todos modos es relevante sealar quese les ha encontrado en infecciones mixtas en prcticamente todas lascombinaciones posibles con los geminivirus PHV y PepGMV (37).

Otro dato relevante obtenido con el estudio de estos virus, es que almenos en el caso la variante ms conspicua en Mxico de TEV, producesntomas ms severos cuando la infeccin se da en condiciones de tem-peraturas menores de 17oC y humedad relativa mayor de 80 %.

ALTERNATIVAS Y VENTAJAS DEL DIAGNSTICO MOLECULARPARA EL MANEJO DE VARIEDADES DE PLANTAS

Existen dos grandes preocupaciones en las instituciones dedicadas alfitomejoramiento una vez generada la variedad mejorada. La primera esla identificacin varietal, es decir el monitoreo de la pureza gentica deesta variedad, durante los diferentes procesos que tiene que seguir hastallegar finalmente a las manos del agricultor, con el fin de garantizar quela variedad ofrecida sea el genotipo correcto y el origen especificado. La

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segunda es cmo garantizar a la institucin que la genera la proteccinde la propiedad intelectual de la variedad, para prevenir el robo de lamisma; esto es un prerrequisito para cualquier institucin ya que sinmedidas efectivas para prevenir el robo, la investigacin en este campose desalienta. Se tiene conciencia de la necesidad de mantener como se-creto comercial a los progenitores de variedades o hbridos mejoradosdesde los aos veinte, pero es hasta 1961 cuando se crea la Unin Inter-nacional para la Proteccin de Obtenciones Vegetales (UPOV) bajo ladireccin de la Organizacin Mundial de Propiedad Intelectual (OMPI)con el fin de contrarrestar el incremento del hurto de germoplasma o demateriales mejorados ya sea mediante el robo o a travs de la creacinde variedades slo cosmticamente diferentes a la original. (41, 42).

Con las herramientas biotecnolgicas que analizan directamente elDNA, se puede realizar un muestreo eficiente del genoma para un anli-sis a fondo de variedades importantes. La informacin tiene varios usosrelevantes, entre los que destacan: a) conocer el grado de relacin gen-tica de los materiales y en algunas especies, permitir la seleccin de pro-genitores para maximizar efectos de heterosis; b) evaluar la pureza gen-tica y descripcin varietal con precisin y poder de discriminacin. Di-chas metodologas tambin son tiles para la identificacin de lneaso materiales que deben preservarse para maximizar la diversidad genti-ca de un banco de germoplasma (43).

Para este tipo de diagnstico se tienen metodologas que usan diver-sos marcadores moleculares de DNA tales como RFLPs, AFLPs, RAPDs y SSRsque han sido usadas en los ltimos aos para estudiar la diversidad gen-tica en distintas especies (44, 45, 46, 47, 48) que se describen a continua-cin y las cuales se han utilizado para enfrentar diferentes problemticasen los cultivares mexicanos.

RFLPS (polimorfismos en la longitud de fragmentos de restriccin)

Con esta metodologa se pueden comparar decenas o cientos de locipolimrficos en varias plantas cultivadas; puede ser altamente discrimi-nativa y generar un muestreo del genoma suficientemente amplio.Usualmente se requiere un promedio de tres meses para elaborar unperfil de 50-100 variedades con 60-100 sondas individuales (49, 50, 51).

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En Mxico se ha utilizado para el mapeo en maz de regiones gen-micas que controlan la floracin masculina y femenina, androestrilidad,intervalo de floracin, rendimiento de grano, nmero de mazorcas y degranos bajo condiciones de sequa (52, 53, 54). Tambin se ha aplicadoen maz tropical para mapear los genes relacionados con la resistencia algusano barrenador de la caa de azcar y Diatraea spp., as como para rea-lizar un anlisis gentico de las regiones del genoma que controlan laadaptacin a valles altos y costa (55, 56). Esta informacin ha permitidoestablecer al INIFAP un programa de mejoramiento asistido por marcado-res moleculares, del cual se han generado variedades de maz tolerantesa sequa que estn por liberarse y con posibilidades de sembrarse enpoco ms de un milln de hectreas (54) (figura 1).

AFLP (polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados)

Se basa en la deteccin de una amplificacin selectiva por PCR de frag-mentos generados por enzimas de restriccin a partir del DNA genmico.El DNA es cortado normalmente con dos endonucleasas de restriccin,una de corte raro y otra de corte frecuente; los productos de estas diges-tiones se ligan a secuencias conocidas de DNA de doble cadena llamadasadaptadores, las cuales sirven como DNA blanco para las posterioresamplificaciones. Sin embargo para la mayora de DNAs la cantidad defragmentos que podran ser amplificados simultneamente de esta ma-nera sera demasiado alta para resolverse en cualquier sistema de anli-sis de fragmentos, por lo que los iniciadores AFLP tienen en su extremo3 un nmero de nucletidos selectivos (que depende de la complejidaddel genoma que se est analizando) que se extienden hacia dentro delfragmento de restriccin. Uno de estos iniciadores es marcado radiacti-va o no radiactivamente; de sta forma solamente un subgrupo de frag-mentos de restriccin sern amplificados y visualizados (entre 50 y 150).Estos fragmentos son separados mediante electroforesis de geles desna-turalizantes de acrilamida, generndose as los patrones de bandas cono-cidas como huellas genticas AFLP, donde se observan numerosas ban-das, cada una de las cuales son potencialmente polimrficas debido acambios en los sitios de restriccin y/o por inserciones o deleciones quemodifican los tamaos de los fragmentos. El ensayo de AFLP virtualmen-te es capaz de crear un nmero ilimitado de fragmentos a partir de nano-gramos de DNA. Por su confiabilidad, reproducibilidad y potencia se con-

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sidera altamente verstil y de gran utilidad para produccin de huellasgenticas (fingerprinting) de DNA (57) (figura 4).

En Mxico su uso es cada vez ms frecuente y se han utilizado para elanlisis de la diversidad gentica de plantas como el agave Agave tequila-na var. azul, en el que se encontr que no existe variabilidad gentica eneste cultivo, de lo cual se puede inferir el peligro que esto representapara la industria tequilera (58). Tambin se ha usado para el anlisis dela diversidad gentica de fitopatgenos del frijol como son Colletotrichumlindemuthianum y Macrophomina phaseolicola. Lo anterior ha permitido alPrograma de Mejoramiento de Frijol del INIFAP estar en posibilidad degenerar variedades resistentes a las razas de estos patgenos especficasde cada regin de Mxico (58, 59, 60). Esta metodologa se ha utilizadotambin para monitorear la variacin genotpica de Colletotrichum linde-muthianum. Lo anterior representa un gran avance en el conocimientode los mecanismos utilizados por hongos que carecen de ciclo sexualpara generar variabilidad gentica (61) y para la realizacin de huellasgenticas de diferentes especies de variedades mexicanas.

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Figura 4 ENSAYO DE AFLP

Gel para anlisis tipo AFLP de la diversidad gentica de materiales de maz tolerantesa sequa pertenecientes a los programas de biotecnologa y mejoramiento de maz delINIFAP.

RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar)

Esta metodologa consiste en la amplificacin de DNA utilizando oli-gonucletidos al azar. Normalmente un solo oligonucletido es utilizadocomo iniciador y las regiones flanqueadas por secuencias repetidas inver-tidas con homologa al oligonucletido, sern amplificadas de acuerdocon las condiciones normales para amplificacin de PCR (62). En estosmarcadores idealmente, cada uno de los fragmentos amplificados por eluso de iniciadores al azar representara un locus especfico en el genomay los polimorfismos detectados pueden bsicamente ser el resultado devarios tipos de eventos tales como: a) insercin de grandes fragmentosde DNA entre los dos sitios de alineacin lo que origina un fragmentomuy largo provocando que se pierda; b) la delecin de un fragmento deDNA que lleve uno de los dos sitios de alineacin lo que provoca tambinsu prdida; c) la sustitucin de un nucletido que puede afectar el ali-neamiento de uno de los dos iniciadores por cambios en la homologalo que provoca la ausencia o presencia del polimorfismo o el cambio enel tamao del fragmento; y d) insercin o delecin de pequeos frag-mentos de DNA lo que origina cambios en el tamao del fragmento. Enla prctica, sin embargo, cambios en el tamao son raros. Un fragmentoparticular generado por esta metodologa est usualmente presente (ale-lo A) o ausente (alelo a) la cual es una distribucin tpica para mar-cadores dominantes. Un fragmento se presenta nicamente cuando eshomocigoto (AA) o heterocigoto (Aa), y slo su ausencia da a entenderla presencia de genotipo (aa) (63).

SSR (Deteccin de secuencias repetidas o anlisis de microsatlites)

Las secuencias repetidas de DNA son aquellas que tienen una unidadncleo de dos o cinco nucletidos tales como (AT), (CTT) y (ATGT), lascuales estn repetidas en tandem y dispersas por todo el genoma. Estaspequeas secuencias son la base de la PCR en este mtodo ya que se uti-lizan iniciadores complementarios a las regiones que las flanquean, lascuales son generalmente conservadas entre genotipos de la misma espe-cie, amplificando de esta manera los fragmentos que contienen las SSR.El polimorfismo es creado cuando los productos de PCR de diferentesindividuos varan en longitud como resultado de la variacin en el nme-ro de unidades repetidas en las SSR. Varios investigadores han iniciado su

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desarrollo y uso en un amplio rango de especies de plantas, como porejemplo: maz (Zea mays L) (64), trigo (Triticum aestivum L.) (65), soya(Glycine max L) (66), cebada (Hordeum vulgare L) (67), arroz (Oryza sati-va L) (68), aguacate (Persea americana), (69) y otras muchas.

GENMICA Y DIAGNSTICO MOLECULAR EN LA AGRICULTURA

Para tratar de entender de forma general las estrategias genticas queexisten para que una planta se defienda de algn patgeno, y podereventualmente emplear esta informacin con fines de diagnstico o me-joramiento gentico, es necesario identificar y caracterizar los genes dela planta que respondan especficamente a la infeccin por algn pat-geno determinado. La utilizacin de candidatos a genes de resistencia(CGR) genes de resistencia (GR) y genes de respuesta de defensa (GRD)para la identificacin de marcadores tiles para programas de mejora-miento asistido por marcadores moleculares y diagnostico, es una opcinviable en la actualidad. Dentro de las posibilidades de aplicacin del diag-nstico molecular que en los ltimos aos se ha estado evaluando, es laasociacin entre candidatos a genes de resistencia y loci de caracterescuantitativos (QTLs), con la finalidad de ir mapeando a los genes de re-sistencia correlacionndolos con loci que previamente se hayan identifi-cado como asociados con la resistencia a algn patgeno (70, 71, 72, 73).Esta estrategia debe considerarse y apoyar los programas de seleccinasistida por marcadores moleculares, as como tambin en dilucidar lasbases moleculares de la resistencia polignica en plantas a algn patge-no. Para realizar este tipo de estudios, es necesario conocer los genes queen una planta son expresados en respuesta a un patgeno (GRD), genesen los que ya se haya comprobado su papel en la resistencia a algn pat-geno (GR), y genes que posiblemente se relacionen con la resistenciaa estos patgenos (CGR). Es precisamente la bsqueda de nuevos posiblesgenes involucrados en la resistencia a patgenos en plantas, en donde setiene un gran potencial para entender a nivel molecular los mecanismosde resistencia con los que una planta se defiende contra patgenos. Estosestudios debern impactar el desarrollo de mtodos de diagnstico msprecisos, mtodos de mejoramiento asistido por marcadores molecula-res, as como tambin en la posibilidad de disear en un momento dado,nuevas estrategias de resistencia contra patgenos especficos.

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Para encontrar candidatos a genes de resistencia contra patgenos enplantas, la elaboracin de colecciones de genes expresados etiquetados(ESTs) ha resultado una estrategia de gran importancia. Sin embargo, lascolecciones de ESTs existentes no estn completas y la mayora han sidoderivadas de bibliotecas de DNA complementario realizadas a partir deplantas crecidas bajo condiciones normales; por lo tanto, transcritos quesean inducidos de manera diferencial por el ataque de algn patgeno ala planta muy probablemente estn poco representados (74). Por loanterior, es necesario generar colecciones de ESTs especficas para dife-rentes tipos de interaccin patgeno/planta. Existen varias estrategiaspara identificar transcritos expresados diferencialmente, dentro de lasque se incluyen el despliegue diferencial (75), anlisis de diferencia re-presentacional (76), anlisis seriado de expresin gentica (77), sustrac-cin por degradacin enzimtica (78) e hibridacin sustractiva bajo con-diciones de supresin por PCR (79). El procedimiento de hibridacin sus-tractiva bajo condiciones de supresin por PCR, ha sido una metodologaque varios grupos en el mundo han utilizado para identificar genes deplantas que se expresan bajo una condicin de inters especifico (80).Este mtodo tiene las ventajas de que normaliza la cantidad de transcri-tos, enriquece los transcritos diferencialmente expresados y estos frag-mentos pueden ser directamente empleados en la construccin de mi-croarreglos de DNA para su posterior anlisis (figura 5). En Mxico, exis-ten varios grupos de investigacin que han comenzado a abordar estu-dios genmicos en plantas en respuesta a patgenos bacterianos, fngi-cos y virales, entre otros. Un ejemplo de este tipo de trabajo que se haestado desarrollando ha sido el estudio de la expresin gentica dife-rencial en plantas de chile (Capsicum chinense Jacq.) que previamente seidentificaron como resistentes a infecciones simples y mixtas por gemi-nivirus (39, 40). En este trabajo se han empleado las tcnicas de desplie-gue diferencial y de hibridacin sustractiva bajo condiciones de supre-sin por PCR, encontrndose hasta el momento poco ms de 100 frag-mentos de genes expresados en las plantas de chile mencionadas cuan-do son infectadas por los geminivirus huasteco del chile (PHV) y mosaicodorado del chile (PepGMV), que son los patgenos virales ms importan-tes en nuestro pas que atacan este cultivo. Algunos de estos genes hanresultado ser interesantes por el hecho de que presentan cierta similitudcon genes que en Arabidopsis thaliana se relacionan con resistencia a in-fecciones por el virus del mosaico del pepino mediante silenciamientognico. Actualmente, se encuentra en proceso de completar la secuen-

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ciacin de los genes que se tienen hasta el momento y la elaboracin devarias bibliotecas sustractivas de DNA complementario a partir de las plan-tas de chile resistentes a geminivirus mencionadas, siendo infectadas deforma simple y mixtas con los geminivirus PHV y PepGMV, con lo que elnmero de fragmentos de genes deber de aumentar a alrededor de mil.Con la informacin que se obtenga se espera generar datos valiosossobre genes de las plantas de chile resistentes a geminivirus, que sonexpresados en forma especfica en presencia de estos patgenos, siendoalgunos de estos genes buenos candidatos a ser genes de resistenciaa geminivirus, con lo que en un futuro se puede emplear este tipo deinformacin para los fines mencionados sobre correlaciones con QTLs,diagnstico, e inclusive diseo de nuevas estrategias de resistencia enchile contra estos patgenos.

Finalmente, con combinaciones de algunas de las metodologas men-cionadas, actualmente se est estableciendo la determinacin de la hue-lla gentica del germoplasma que tiene bajo su resguardo el INIFAP, porlo pronto en maz, frijol, papa, y chile. Por otro lado, es importante sea-lar tambin que se ha suministrado el servicio de diagnstico de la pure-za varietal en diferentes eventos tanto en el CINVESTAV-Unidad Irapuato,como en la Unidad de Biotecnologa del INIFAP en Celaya. Asimismo, en

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Figura 5UN EJEMPLO DE MICROARREGLOS DE DNA

instituciones como INIFAP, el Instituto Tecnolgico de Celaya y el CINVES-TAV-Unidad Irapuato, se ha comenzado con estudios encaminados a laexploracin de la expresin gentica global de plantas de inters paraMxico (chile, frijol, maz, pltano, etc.) en repuesta al ataque por variospatgenos a fin de que en un futuro a mediano plazo, se tenga informa-cin que pueda ayudar a generar tecnologas nacionales para el diag-nstico molecular, diseo de nuevas metodologas de resistencia y selec-cin asistida por marcadores moleculares.

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