Ki67-index på bröstcancer - reproducerbarhetsstudie

Ki67-index på Ki67-index på bröstcancer - bröstcancer -

reproducerbarhetsstreproducerbarhetsstudieudieLennart MellblomLennart Mellblom

KarlskronaKarlskrona

Proliferationsbedömning – Proliferationsbedömning – varför? varför?

Flera studier har visat att proliferationsmarkörer utgör viktiga prognosfaktorer och är därmed viktiga faktorer för ställningstagande till och val av kompletterande behandling av bröstcancer och detta gäller även flera andra maligna tumörformer.

Bröstcancer NHG 2 kan indelas i en prognostiskt gynnsam och en ogynnsam grupp med hjälp av fr. a. proliferationsmarkörer.

Oncotype DXRecurrence score (RS)

Proliferationsbedömning – Proliferationsbedömning – metodermetoder

Mitosräkning Flödescytometrisk bedömning av S-fas fraktion Genuttrycksprofiler (Oncotype DX,

MammaPrint ..) Thymidine-labeling index Immunhistokemisk färgning av cellcykelprotein

PCNA – S-fasmarkör (co-faktor till DNA-polymeras) Ki67/MIB1 – G1-M-fas-markör, negativ under G0-fas Cyklin A – S-fasmarkör PHH3 - fosfohiston H3 – markör för sen G2 och M-

fas, som är fixeringskänslig och ger c:a 80% högre värden än mitosräkning. Färgar inte pyknos eller apoptos, men tidig profas (rund positiv kärna).

Ki67/MIB1Ki67/MIB1

Uttrycks under tidig G1-, S-, M- och G2-faserna, men inte under G0-fas.

Når maximalt uttryck under M-fasen. Starkt nukleolinfärgning under S-

fasen. Brytpunkt mellan lågproliferativ och

högproliferativ tumör 15% för medelvärdesräkning och 22% för hot-spot räkning.

Cyklin ACyklin A

Uttrycks under hela S-fasen. Brytpunkt mellan lågproliferativ och

högproliferativ tumör 8% för medelvärdesräkning och 11% (15%) för hot-spot räkning

Utskickat materialUtskickat material i i tidigare testtidigare test

Vävnadssnitt från bronkialcarcinoidVävnadssnitt från bronkialcarcinoid Vävnadssnitt från magsäcks-GISTVävnadssnitt från magsäcks-GIST Vävnadssnitt från optimalt fixerad Vävnadssnitt från optimalt fixerad

bit (BC1) från bröstcancer NHG 2bit (BC1) från bröstcancer NHG 2 Vävnadssnitt från rutinmässigt Vävnadssnitt från rutinmässigt

fixerad bit (BC2) från bröstcancer fixerad bit (BC2) från bröstcancer NHG 2 (samma cancer)NHG 2 (samma cancer)

StudieuppläggStudieupplägg i tidigare i tidigare testtest

2 glas med vardera 2 snitt (carcinoid + 2 glas med vardera 2 snitt (carcinoid + GIST respektive BC1 + BC2) GIST respektive BC1 + BC2)

Alla deltagande lab färgade enligt egna Alla deltagande lab färgade enligt egna rutinerrutiner

Alla lab bedömde enligt interna rutinerAlla lab bedömde enligt interna rutiner Glas skickades till NordiQC för färgning Glas skickades till NordiQC för färgning

och bedömningoch bedömning Glas från samtliga lab skickades till DAKO Glas från samtliga lab skickades till DAKO

och LRI för mätning på digital bild med och LRI för mätning på digital bild med bildanalys-system (ACIS respektive bildanalys-system (ACIS respektive Aperio)Aperio)

Bedömningsresultat, Ki67-index, Bedömningsresultat, Ki67-index, tidigare utskicktidigare utskick

LabLab CarcinoCarcinoidid

GISTGIST BC1BC1 BC2BC2 MetodMetod

NordiQCNordiQC 22 1010 3535 3535 Räkn i def ytaRäkn i def yta

HalmstadHalmstad 22 88 20-2520-25 2020 Räkn i def ytaRäkn i def yta

HelsingborHelsingborgg

<1<1 5-85-8 1515 2525 Skattn hot Skattn hot spotspot

JönköpingJönköping <2<2 <2<2 4040 4444 SkattningSkattning

KalmarKalmar 22 1414 5656 6060 Aperio hot Aperio hot spotspot

KarlskronaKarlskrona 11 77 3030 3030 SkattningSkattning

KristianstaKristianstadd

33 1010 35-4035-40 4545 Räkn i def ytaRäkn i def yta

LinköpingLinköping <2<2 55 4040 3030 SkattningSkattning

Lund Lund <2<2 1010 4040 4040 SkattningSkattning

MalmöMalmö <1<1 1313 3838 4545 SkattningSkattning

VäxjöVäxjö <1<1 77 2020 3333 Räkn i def ytaRäkn i def yta

Delprojekt 2 - uppläggDelprojekt 2 - upplägg

4 bedömare (Dorthe Grabau, Vibeke 4 bedömare (Dorthe Grabau, Vibeke Jensen, Erik Holm, Lennart Mellblom)Jensen, Erik Holm, Lennart Mellblom)

Gemensamma bedömningsriktlinjerGemensamma bedömningsriktlinjer 2 bildanalyssystem (ACIS, Aperio)2 bildanalyssystem (ACIS, Aperio) Två färgningar – DAKO – färgat i Två färgningar – DAKO – färgat i

Glostrup samt Ventana färgat i OdenseGlostrup samt Ventana färgat i Odense 12 bröstcancrar + fall från tidigare 12 bröstcancrar + fall från tidigare

utskick (4 st)utskick (4 st)

Bedömningsriktlinjer Bedömningsriktlinjer (1/3)(1/3)

Bedömningen utförs på invasiv cancer Bedömningen utförs på invasiv cancer inom det/de områden som har högst inom det/de områden som har högst andel positiva cancercellkärnor/ytenhet andel positiva cancercellkärnor/ytenhet (”hot spot”)(”hot spot”)

En ”hot spot” omfattar i allmänhet minst En ”hot spot” omfattar i allmänhet minst 200 cancerceller200 cancerceller

Vid minsta tvekan om vilka områden som Vid minsta tvekan om vilka områden som utgörs av invasiv cancer skall IHC för utgörs av invasiv cancer skall IHC för basalceller (ex p63, SMMS-1) utförasbasalceller (ex p63, SMMS-1) utföras


I vissa fall (ex riklig lymfocytinfiltration, I vissa fall (ex riklig lymfocytinfiltration, kraftig stromareaktion) kan kraftig stromareaktion) kan dubbelfärgning för Ki67 och dubbelfärgning för Ki67 och cytokeratin underlätta bedömningencytokeratin underlätta bedömningen

Bedömningen utförs med x40 objektivBedömningen utförs med x40 objektiv Räkna index på c:a 200 celler. Detta Räkna index på c:a 200 celler. Detta

kan normalt göras i 1-2 synfältkan normalt göras i 1-2 synfält Index anges med så exakt siffra som Index anges med så exakt siffra som

möjligt; ingen intervallbedömningmöjligt; ingen intervallbedömning


Som positiv kärna räknades sådana Som positiv kärna räknades sådana där kärnfärg för DAB (brun) där kärnfärg för DAB (brun) överstiger hematoxylinfärgen (blå). överstiger hematoxylinfärgen (blå). Gränsfall räknas som negativa utom Gränsfall räknas som negativa utom när nukleol(er) är brunsvartanär nukleol(er) är brunsvarta

Räkningen skedde inom markerad Räkningen skedde inom markerad ring (= ”konsensus-hotspot”) ring (= ”konsensus-hotspot”)

Alla snitt räknades först med den ena, Alla snitt räknades först med den ena, sedan med den andra antikroppen sedan med den andra antikroppen (DAKO resp. Ventana)(DAKO resp. Ventana)

Ki67-index, Ki67-index, bildexempel på bildexempel på

gränsfallgränsfall

Smal pil = positivSmal pil = positiv

Bred pil = negativBred pil = negativ

PreparatPreparat

Tidigare fall: 1 carcinoid, 1 GIST, 2 BC Tidigare fall: 1 carcinoid, 1 GIST, 2 BC NHG 2.NHG 2.

Duktal cancer NHG 1: 2 fallDuktal cancer NHG 1: 2 fall Duktal cancer NHG 2: 3 fallDuktal cancer NHG 2: 3 fall Duktal cancer NHG 3: 2 fallDuktal cancer NHG 3: 2 fall Duktal cancer NHG 3, lymfocytrik: 2 fallDuktal cancer NHG 3, lymfocytrik: 2 fall Lobulär cancer: 3 fallLobulär cancer: 3 fall

Dataredovisning för Dataredovisning för spridning av Ki67-indexspridning av Ki67-index

Aperios bildanalysprogram är anpassat för Aperios bildanalysprogram är anpassat för bedömning av ER och PR i tre olika bedömning av ER och PR i tre olika intensitetsnivåer, ej för Ki67intensitetsnivåer, ej för Ki67

Bedömning av Ki67 har utförts av Bedömning av Ki67 har utförts av morfologiskt oerfaren personmorfologiskt oerfaren person

Aperiodata utfaller i detta test med sämre Aperiodata utfaller i detta test med sämre resultat än manuella bedömningar och resultat än manuella bedömningar och DAKO:s ACISDAKO:s ACIS

Jag har därför valt att ej redovisa Jag har därför valt att ej redovisa Aperiodata när maximala spridningen angesAperiodata när maximala spridningen anges

Statistik (P-O Bendahl)Statistik (P-O Bendahl)

Jämförelse mellan de båda antikropparna Jämförelse mellan de båda antikropparna visar ett något högre värde för prover färgade visar ett något högre värde för prover färgade med Ventana (1,9-4,0% för manuella med Ventana (1,9-4,0% för manuella bedömningar och 0,3% för ACIS) vid parat t-bedömningar och 0,3% för ACIS) vid parat t-test för varje bedömaretest för varje bedömare

Parvisa korrelationer för kontinuerlig skala Parvisa korrelationer för kontinuerlig skala mellan de 4 bedömarna varierar mellan 0.94 mellan de 4 bedömarna varierar mellan 0.94 och 0.98och 0.98

Korrelationen på kontinuerlig skala mellan de Korrelationen på kontinuerlig skala mellan de 4 bedömarna å ena sidan och ACIS å andra 4 bedömarna å ena sidan och ACIS å andra sidan varierar mellan 0.93 och 0.96sidan varierar mellan 0.93 och 0.96

Kappavärdets tolkning

Kappa > 0,8 = very good Kappa 0,6 – 0,8 = good Kappa 0,4 -0,6 = moderate Kappa 0,2 – 0,4 = fare Kappa < 0,2 = poor

Statistik (P-O Bendahl)Statistik (P-O Bendahl) Grad av överensstämmelse efter Grad av överensstämmelse efter

kategorisering <20% vs kategorisering <20% vs ärärför för bedömare C/D och bedömare B/ACIS med bedömare C/D och bedömare B/ACIS med DAKO-ak; ingen perfekt överensstämmelse DAKO-ak; ingen perfekt överensstämmelse för något par med Ventana-akför något par med Ventana-ak

Den genomsnittliga parvisa Den genomsnittliga parvisa överensstämmelsen (inkl Aperiodata) vid överensstämmelsen (inkl Aperiodata) vid kategorisering är 93% för DAKO-ak och 85% kategorisering är 93% för DAKO-ak och 85% för Ventana-akför Ventana-ak

Medelkappa över alla parvisa jämförelser Medelkappa över alla parvisa jämförelser (inkl Aperiodata) efter kategorisering är 0.85 (inkl Aperiodata) efter kategorisering är 0.85 för DAKO-ak och 0.69 för Ventana-akför DAKO-ak och 0.69 för Ventana-ak

Ki67-överensstämmelse i Ki67-överensstämmelse i SweQA- utskicket 2010SweQA- utskicket 2010

12 fall bedömdes av 26 laboratorier12 fall bedömdes av 26 laboratorier Kategorisering i 4 grupper (0-10, 11-Kategorisering i 4 grupper (0-10, 11-

20, 21-50 och >50%)20, 21-50 och >50%) Genomsnittlig överensstämmelse 59%Genomsnittlig överensstämmelse 59% Genomsnittligt kappa 0.4Genomsnittligt kappa 0.4 Genomsnittligt kappa vid Genomsnittligt kappa vid

kategorisering i 2 nivåer vid 20% = kategorisering i 2 nivåer vid 20% = 0.54 (jfr 0.85 med DAKO-ak och 0,69 0.54 (jfr 0.85 med DAKO-ak och 0,69 för Ventana-ak))för Ventana-ak))

Kappavärden vid kategorisering i 4 nivåer

DAKO-ak för A-D+ACIS: Medelkappa 0.6 (jfr 0.4)

DAKO-ak för A-D: Medelkappa 0.62

Ventana-ak för A-D+ACIS: Medelkappa 0.58

Ventana-ak för A-D: Medelkappa 0.56

Spridningsdiagram Spridningsdiagram bedömare C/D bedömare C/D

delningsgräns vid 20%delningsgräns vid 20%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

02

04

06

08

01

00

C

0 20 40 60 80 100D

DAKO - Överensstämmelse C/D

Ki67-fördelning A-D+ACIS

0

20

40

60

80

100

Ki6

7, %

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16Prep

A B C D ACIS

Ki67-fördelning A-D+ACIS

Statistik (P-O Bendahl)Statistik (P-O Bendahl)sammanfattande sammanfattande

kommentarerkommentarer De manuella bedömarna (A-D) har god De manuella bedömarna (A-D) har god

överensstämmelse oavsett antikroppöverensstämmelse oavsett antikropp ACIS-systemet ger Ki67-värden som ACIS-systemet ger Ki67-värden som

ligger mycket närmare manuella ligger mycket närmare manuella bedömningar än Aperios system för bedömningar än Aperios system för ER/PRER/PR

Ventana-ak ger något högre Ki67-Ventana-ak ger något högre Ki67-värden än DAKO-akvärden än DAKO-ak

Den parvisa överensstämmelsen är Den parvisa överensstämmelsen är bättre för DAKO än för Ventanabättre för DAKO än för Ventana

Spridning av Ki67-index för Spridning av Ki67-index för manuella bedömningar i manuella bedömningar i

nuvarande (2x4 = 8) och tidigare nuvarande (2x4 = 8) och tidigare (11 x1 = 11) prover från samma (11 x1 = 11) prover från samma

kloss; alla färgningarkloss; alla färgningarTumörTumör LägstLägst

nuvarannuvarandede

HögstHögst

nuvarannuvarandede

LägstLägst

tidigatidigarere

HögstHögst

tidigartidigaree

CarcinoiCarcinoidd

44 88 <1<1 33

GISTGIST 1414 1919 <2<2 1414

BC1BC1 4444 5959 1515 5656

BC2BC2 5050 6868 2020 6060

Spridning av Ki67-index för ACIS-Spridning av Ki67-index för ACIS-bedömning i nuvarande (2 glas) bedömning i nuvarande (2 glas) och tidigare (7-11 glas) prover och tidigare (7-11 glas) prover

från samma kloss; alla färgningarfrån samma kloss; alla färgningarTumörTumör LägstLägst

denna denna gånggång

HögstHögst

denna denna gånggång

LägstLägst

tidigaretidigare

testtest

HögstHögst

tidigaretidigare

testtest

CarcinoCarcinoidid

Trasigt Trasigt glasglas

77 11 66

GISTGIST 77 1313 44 1010

BC1BC1 5252 6161 1111 3737

BC2BC2 6767 7474 2323 6363

Spridning av Ki67-index för alla Spridning av Ki67-index för alla bedömningar i nuvarande prover bedömningar i nuvarande prover

NHG 1; alla färgningarNHG 1; alla färgningarKlossnKlossnrr

ManuelManuell minl min

8 bed.8 bed.

ManuelManuell maxl max

8 bed.8 bed.

ACIS ACIS minmin

2 bed.2 bed.

ACIS ACIS maxmax

2 bed.2 bed.

1111 1212 2020 1111 1313

1313 1313 3030 1717 1818


NHG 2; alla färgningarNHG 2; alla färgningarKlossnrKlossnr ManuelManuel

l minl min

8 bed.8 bed.


8 bed.8 bed.

ACIS ACIS minmin

2 bed.2 bed.

ACIS ACIS maxmax

2 bed.2 bed.

11 99 1919 1414 1515

44 3636 5454 3737 3838

1616 6262 8484 6868 7171


NHG 3; alla färgningarNHG 3; alla färgningarKlossnrKlossnr ManuelManuel

l minl min

8 bed.8 bed.


8 bed.8 bed.

ACIS ACIS minmin

2 bed.2 bed.

ACIS ACIS maxmax

2 bed.2 bed.

22 6565 9292 7777 7878

1515 88 2525 1010 1616


NHG 3, lymfocytrik; alla NHG 3, lymfocytrik; alla färgningarfärgningar

KlossnrKlossnr ManuelManuell minl min

8 bed.8 bed.


8 bed.8 bed.

ACIS ACIS minmin

2 bed.2 bed.

ACIS ACIS maxmax

2 bed.2 bed.

1212 7676 9595 7272 7575

1414 4343 8383 5151 5252


lobulär ca; alla färgningarlobulär ca; alla färgningarKlossnrKlossnr ManuelManuel

l minl min

8 bed.8 bed.


8 bed.8 bed.

ACIS ACIS minmin

2 bed.2 bed.

ACIS ACIS maxmax

2 bed.2 bed.

33 1212 4646 3131 3535

99 77 1919 88 1010

1010 4646 6565 4545 4545

SammanfattningSammanfattning

Standardiserad färgning och Standardiserad färgning och gemensamma bedömningsriktlinjer kan gemensamma bedömningsriktlinjer kan öka graden av samstämmighet till en öka graden av samstämmighet till en kliniskt användbar nivå vid bedömning kliniskt användbar nivå vid bedömning av Ki67-indexav Ki67-index

ACIS (och möjligen fler ACIS (och möjligen fler bildanalyssystem) har hög grad av bildanalyssystem) har hög grad av överensstämmelse med manuella överensstämmelse med manuella beräkningar och klarar lobulära såväl beräkningar och klarar lobulära såväl som lymfocytrika cancrar minst lika bra som lymfocytrika cancrar minst lika bra som manuell beräkningsom manuell beräkning

Ki67-rapporteringKi67-rapportering

Det finns önskemål att rapportera enligt kontinuerlig skala

I dag delas tumörer in i två grupper med Ki67-index c:a 20% som delningsvärde

ER och PgR rapporteras i 4 intervaller (<1, 1-10, 11-50, >50)

KI67-index - KI67-index - räkneprinciperräkneprinciper

Konsekutiv räkning av alla celler i ett x40 synfält Konsekutiv räkning av 200 celler i ett x40 synfält Räkning med hjälp av 10 x 10 grid Räkning med hjälp av Millerruta Räkning av alla celler inom ett definierat

mikroområde Räkning inom flera synfält Räkning av >200 celler vid gränsvärde (10 – 30) ……..

Kvantitativa IHC-Kvantitativa IHC-bedömningarbedömningar

ERER PgRPgR HER2HER2 Ki67Ki67 p53p53 p16p16 …………

Framtida Framtida immunogruppsfrågorimmunogruppsfrågor

Kvantitativa IHC-bedömningar exklusive SweQA-bröstpanelen

Rutiner för verifiering av ny ak för IHC-analys

Rutiner för driftkontroller av IHC-analyser

EBBE och hans farfar tackar för uppmärksamheten.EBBE och hans farfar tackar för uppmärksamheten.

Ki67-index på bröstcancer - reproducerbarhetsstudie

Documents

Transcript of Ki67-index på bröstcancer - reproducerbarhetsstudie