Immobiline-based two-dimensional gel electrophoresis: An optimised protocol for resolution of human...

5
Immobiline-based two-dimensional gel electrophoresis: An optimised protocol for resolution of human colonic mucosal proteins An optimised protocol for the production of two-dimensional protein patterns of human colonic mucosal cells using immobilised pH gradients in the first dimension is pre- sented. We tested a wide variety of solubilising agents and electrophoretic parameters, separately and in combination. Protein solubilisation was found to be best using a lysis solution containing 9 M urea, 2% Triton X-100, 2% 2-mercaptoethanol, 0.8% Pharma- lyte pH 3±10 and 8 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). Horizontal streaking of basic proteins in the first dimension was virtually eliminated by a combination of wash- ing Immobiline strips in 100 mM asorbic acid, pH 4.5, for 24 h before use and isoelectric focusing samples at 40 o C. The presence of 2% glycerol in the first dimension resulted in tighter resolution throughout the entire pH range. The use of these conditions may prove to have broad applicability to the generation of optimally resolved Immobiline- based two-dimensional protein patterns of many other tissues. Keywords: Two-dimensional gel electrophoresis / Isoelectric focusing / Immobilised pH gradients / Detergent solubilisation of proteins / Human colonic mucosa / Colonic carcinoma EL 3660 Charles Chan 1 Robert S. Warlow 2 Pierre H. Chapuis 1 Ronald C. Newland 3 E. Leslie Bokey 1 1 University of Sydney Department of Colon & Rectal Surgery 2 Immunology Department 3 Department of Anatomical Pathology, Concord Repatriation General Hospital, Sydney, NSW, Australia With the introduction of Immobiline compounds in 1982 [1], immobilised pH gradients (IPG) could be formed with narrow or broad pH ranges which remain stable over time. This allows for true steady-state separations with no cathodic drift, resulting in reproducible IEF patterns and higher loading capacity. However, difficulties remained in some applications (especially membrane protein separa- tions) with precipitation at the sample application site and streaking particularly in the basic pH range. We present here a protocol for the production of two-dimensional pat- terns of human colonic mucosal cell proteins obtained by biopsy using IPG in the first dimension in the presence of Triton X-100, urea, and carrier ampholytes. This protocol has been optimised to produce high resolution spots over a broad pH range (3±10.5) and, in particular, successfully addresses the problem of horizontal streaking of basic proteins from milligram loadings of solubilised whole tis- sue homogenates. Fresh human colonic tissue was obtained from surgical specimens of patients undergoing colorectal resections. The mucosal layer was carefully dissected away under a dissecting stereo microscope and washed gently in nor- mal saline at 4 o C for about 10 min to remove excess con- taminating red blood cells. Excess moisture was absor- bed with filter paper. The samples were then cut into 50 mg pieces, wrapped in aluminium foil, frozen in liquid nitrogen and stored at ±70 o C. All samples were proc- essed in this way immediately after surgical removal. Just prior to electrophoresis, the frozen tissue samples were thawed to room temperature and solubilised in lysis solu- tion containing 9 M urea, 2% Triton X-100, 2% 2-mercap- toethanol, 0.8% Pharmalyte pH 3±10 and 8 mM PMSF (freshly prepared as a 160 mM PMSF stock solution dis- solved in isopropanol). Ten mg aliquots of tissue were dis- persed using an Eppendorf micropestle in flat-bottom 1.5 mL Eppendorf tubes, vortexed with 500 mL of lysis sol- ution, and incubated for 1 h at room temperature. Sam- ples in lysis solution were diluted with an equal volume (500 mL) of sample solution containing 8 M urea, 0.5% Tri- ton X-100, 2% 2-mercaptoethanol, 0.8% Pharmalyte 3± 10, and 0.1% bromophenol blue. This mixture was vor- texed and centrifuged for 10 min at 10 000 ´ g. Immobiline DryStrips (17-1235-01; Pharmacia, Uppsala Sweden) pH 3.0±10.5 (190 ´ 3.3 ´ 0.5 mm) were thawed for 20 min, washed in 100 mM ascorbic acid, pH 4.5, for 24 h, washed twice for 15 min (each time) in double dis- tilled water (DDW) and then once for 30 min in 2% glyc- erol in DDW. Strips were air-dried overnight at room tem- perature, before either rehydrating for isoelectric focusing or refreezing for storage. Prior to isoelectric focusing, these Immobiline strips were rehydrated overnight in a reswelling cassette filled with a solution of 8 M urea, 0.5% Triton X-100, 10 mM DTT, 2 mM acetic acid, 2% glycerol and a few grains of Orange G to colour the strips faintly yellow to facilitate strip alignment. A sheet of Gelbond PAG film was cut to size and used as an additional gasket to allow the strips to swell to a thickness of 0.5 mm. All solutions were made up in DDW and degassed for Correspondence: Dr. C. Chan, Anatomical Pathology Depart- ment, Royal North Shore Hospital, Pacific Highway, St Leonards NSW 2065, Australia E-mail: [email protected] Fax: +61-2-9437-5420 Electrophoresis 1999, 20, 3467±3471 3467 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 1999 0173-0835/99/1717-3467 $17.50+.50/0 Proteomics and 2-DE

Transcript of Immobiline-based two-dimensional gel electrophoresis: An optimised protocol for resolution of human...

�������������� ������������ ������� ����������� �� �� ������ ��� ���� ��������� ��� �� ���� ������� ������ ��� ����

�� ������� ������� ��� �� ��������� �� ������������ ������ ������� �� ������� ���� ������ � � ����� ������ �� �� ������� �� �� ����� ������� �� ������� � ��� � �� ������ �� �� ��� ����� ����� �� ����������� ��������������� � �� �� ������������ ������ �� ��� ������� ��� ���� �� � ��� ����� � ������ ����� ���������� � � ���� � !����� "�#$$� � �������������� � $�% ������� �� �� &'#$ �� % �� ���� ���� �� ���� � ���� (��)*+� ����,���� ����-��� ������� ������� �� �� ����� ������� ��� ������ � ������ �� � ����������� �� �������� .����� �� ������ �� #$$ �� ������� ���� �� /�0� ��� �/ � ���� �� �� ��� ������������� ���� � �� /$�1� !� ����� �� � � ���� �� �� ����� ������� ��� ��� ������ ��� ����� ���������� �� ���� �� ����� !� �� �� ��� ��������� ������� �� ��� ���� ��� ����� ��� �� �� �������� �� ������ � ��� � .����� ������ ������������ ������ ������� �� ���� ���� �������

��������� !����������� � ����������� 2 .�� ����� �������� 2 .����� �� �� �������

2 3����� �� ��� ������� �� ������� 2 ����� �� ���� ������ 2 1� ���� ��������� 45 &66$

������ ����

����� �� �����

!����� "� �������

����� �� #�����$

%� &����� '�(���

#7�������� �� )���3������� �� 1� �� 89��� )������.����� ��� 3�������&3������� �� ��������� ����� ���� 1�����9���������� :��� ������� � )���� ;)�������� ��

���� �� ����������� �� .����� �� �������� �� #�%�<#=� ������ �� �� ������� (.�:+ ��� � ���� ���������� �� ���� �� ����� ����� ����� ���� ��� ����!��� � ��� ��� ��� ��������� ���������� ���� ��������� ����� ��� ���� �� �������� .4* ������� ������� ����� ��������� ������ ������ ��� ����� ����� ��� �������� (����� � ������ ������ �����������+ ���� ������������ �� �� ���� ��� ������� ��� ������-��� ������� �� � �� �� ����� �� ����� � ������� � ������� ��� �� ��������� �� ������������ �������� �� ����� �� ���� ������ � ������� ������ �������� ����� .�: �� �� ����� ������� �� �� ����� ��!����� "�#$$� ���� �� ������ ����� ���� !��� ������� ��� �� ������� �� ����� ���� ��� ����� ����� ���� ���� �� ���� (&'#$�0+ ��� �� ������� ��� �������� ������ �� ���� � �� ����,���� ����-��� �� ������������ ���� �� ����� ������ �� �� ��� �� ��� ������ ����������

*��� ����� �� ���� ����� ��� ������ ���� ������� ������� �� ������� �������� �� ����� ���������!� ������ ��� ��� ����� � ����� ���� ��� ��������� ���� ��������� �� ���� ��� � �� ������ �� �� �� /�1 ��� ����� #$ ��� �� ���� >��� �������������� � � �� � �� 4>��� ������� ��� ������� ���� �� �� ����� !� ���� � �� ��� ��� ����0$ �� ����� ����� �� � ������� ��� � ���,� �� �?��

������� �� ���� �� '@$�1� � ���� � �� ������� �� ���� ��� ������ � ���� ������� ����� � A�������� �� ������������ �� ���,� ����� ���� � ������ �� ���� �������� �� �� ��� �� �� ���� �� ������ ���������� � � ���� � !����� "�#$$� � ��������������� � $�% ������ �� �� &'#$ �� % �� ��)*(���� � ����� �� � #6$ �� ��)* ����- �� ����� ����� � �� ���������� +� !� �� � �?���� �� ����� �� ������ ����� �� 4������ �������� �� � ���������#�0 �5 4������ ����� ����> ���� 0$$ �5 �� ���� �� ������� �� ������� ��� # � �� ���� ��������� )���� � �� ���� �� ����� �� � �� ���� �� ?�� �� ��(0$$ �5+ �� ���� �� ����� ���������� % � ���� $�0 !������ "�#$$� � �������������� � $�% ������ �� &'#$� �� $�# ��������� � �� !��� ��>��� ��� �����> �� �������� ��� #$ ��� �� #$ $$$ � ��

.����� �� 3��)����� (#@�#�&0�$#B ���������� 7���� �)��+ �� &�$'#$�0 (#�$ � &�& � $�0 ��+ �� ������� �$ ���� ���� �� #$$ �� �������� ���� �� /�0� ����/ �� ���� ���� ��� #0 ��� (��� ���+ �� ��� ����� ���� (33�+ �� ��� ��� ��� &$ ��� �� � � ����� �� 33�� )����� �� ������ �������� �� ���� ���������� ���� ���� ��������� ��� ��� ����� ���������� ���,��� ��� ������� ����� �� ��� ����� ������������ .����� �� ������ �� ������ �������� �� ���� ��� ������ �� ���� � �� ����� �� % � ���� $�0 !����� "�#$$� #$ �� 3!!� � �� ����� ���� � � ���� �� � �� ������ �� C���� : �� �� ��� �� ������ ����� �� �� �� ���� ���� ����� � ������� � ��� �� : �����: �� � ��� ��� �� ��, �� �� �� �� ������� ���-��� � �� �� ������ �� �� �� � ����-��� �� $�0 ���� �� ������ �� �� �� �� 33� �� ���� ���

��������������� 3�� 1� 1���� ��������� ����� ��� 3��������� 9��� ;���� )��� ������� � ������� �������� )� 5�����;)� �$60� ������ ��%���� �������D������������)*� E6#����/&@�0/�$

������������� #���� �� &/6@'&/@# &/6@

F �.54G�H1� H� �� :���� 6�/0# ������� #��� $#@&�$%&02��2#@#@�&/6@ I#@�0$E�0$2$

!�� �������

� +%

#0 ���� .�� ����� �������� ��� ������ �� �� �� ������� .. ����������� ���� (���������+� �� ��� �� /$�1����� � �� ��!�� .. ����������� ����� ���� (���������+�� #$$ �5 �� �� �� �� ��� �� ������ ����� �� ������ ���� ��� ��� � �� ��� .����� �� ����� ����� ��� ������� ��� ��� � ��� �� �� ���� �� � .�� ������������� ������ �� &$$ H ��� � �� ���� ���� ���& � �� ��� ������� �� &0$$ H ��� /� � ��� � ���� ��#&$ $$$ H�� ���� �� ���� �� .����� �� ������ ������ �� 33� �� ���� ���,� �� '@$�1� *�� ������������� ����� .����� �� ������ �� ���� ����� ���� ���� ��� #0 ��� ��� ��� �� �� ?�� ���������� ����� ���������� $�$0 � !�����1 � �� 6�%� 6 � ���� &$ � ���� � �� # )3) �� 33�� *�� �� ����� ����� �0 ��3!! ��� ��� � �� #$ �5 �� ���� ?�� �������� �� �����B��� �� ���� ����� $�/0 � �������� ��� �� ��� #$ �5 �� �� ?�� �������� �� ����� � ��� ���� � ����� ������ ��

� ��� (�0$ � #�$ � $�0 ��+ ���� %'#% ��� ���������� ��� � ���� 0 ����-��� � ��� �� ��� )3)���:4� �����,�� ����� ��� (�3�+ <�= ��� ����������� �� �� ������ ��-� (��6 1+� �� � ����� ��������������� $�#� � !���� $�#� � ����� �� $�# )3)� ��6�/� ��� ��� �� ���������� ��� ���� �� ���� ��������� ���� ��� (��)+ �� ����� �����,�� (3��.�+<&=� !� � ��� ���� ���� � � ����� ������� ��� (: ���� ��: �� �+ ����� �� �� ������ ��> ���� ��33�� #$ ��� ��� ���� !� )3) � �� � ����� ��������� � ��� �� ��� � �� ���� �� -���� ���� �� ��� ���� � �� �� �� ����������� ����� ������ )3) �� ������ ��� ����� ������ ������ ���� ��������� ���� �� ���� � ����� ����� !� ?�� ����� .����� ������� ��� ��� � ' � �� ��� ' ���� �� ������ �� ��)3) � � # �� ���� ���� �� ����� ����� ������ 4 ������������ ��� ������ �� #$�1 ���� ��>���� �� ����� ���� ����� �� �� /$$ H �� &$ �� ������� �� �

&/6% 1� 1��� �� ��� ������������� #���� �� &/6@'&/@#

)����� �� !� ����� ����� � �� �������� .����� ������ ��3 � �� ����� �� ���� ������� !� �������������� .�: ������ #�$ �� �� ����� ���� ��� ���� �� ���� &'#$�0� ��� ������ ���� #$$ �� �������� ���� �� /�0� ��� �/ ��� ��� � � ���� �� ����� �� �� �>�� !� ���� ������� ��� �� %'#% ������ )3)���:4 ���� � 0 ����-���� � � �� ��� #�$ �� �� ����� �� �� �� ���� ���-�� ����� �� ���� �� �� �� � �� �� �� �� ��� ���� ��� ��������J �$$� ##6� �@� 66� 00� &@� &#� ��� #/� �� 6 -3��

�� ����� �� �� ����� ��������� �� ��>�������� ����� !� ��� ��� ������ �� #0 �� ���� ������ � � ����� �� ������ � �� ���� ���� �������� ����� ���- ����� � �� !� .����� �� ������ ����� ���� �� �� ��� ������� �� @0 �� ���� ��� ����� �� ������ � ������ � �� (����� #$ ���+�!� ������� ����� ����� �� ���� �� ����� ����� �� �� ��� ��� �� .����� �� ����� �� �� ���� ��� ��� ������� �� @0 ��� 4 ����������� ������� � ��� �� � ����� ���� �� ��� ���������� (����� /�0 �+� *� ����� �� ������������� ����.����� �� ������ �� ��> ��� # � �� �$ !1� �� ������ ���� �� ��� # )��� H�� � #@ �������� �� ������ �� ������� �� ��� </=B ������ � �� ����� ��������� ������ : � �� ��> �� �� �� ����� ���������� � ����������� �� �� ���� �� ��-����� �� 3�����- <0=� *���� # ����� ���� � � ����� �� �������� �� ��������� .� ��� ����?��� � ������ �� �� : ����� ���� ����� �� �� ������� � �� ����� �� ���� � �������� �������� ����� .� �������� ��� �$$$ ���� ���� � ������

��3 ��:4 ��� ��������� � ��� �� � ������ � ����� ��� �� �� ���� �� ����� ����� .� ���� ��������� ������ ��� ����- �� ����� �� �� �������� �� ����� �� ��������� !�� ���� � ��� ���������� � ��� ��3 ��:4 �� ����� �� �� ��������� �������� ���� ������ ����� �� ����� ��� ��� �� ������>��������� K��� �� ��� ����� � ���� � ������������� ������ �� .�: �� &�0'#$ ����� �� ���� ������ �� ��� �� ����� ����� % � ���� / 1���)� � ������� � ������ ���� (3!! �� ������������� +� 9������ ��� <6= �� ��� �� � ������������������ ������ � � �� ��������� (& � #$@2�5+ ��� )�� �- �� ��� <@=�� ��� �� �$ �� ���� ����� � ���B �� ��� ��� �������� �� �������� ����� �������� �� ��� ���� ������ ����� ���� ��� ����� ����?��� � �� �� ����� �� � ������ �� �� ��� �� #$'0$ �� ��� ����������� �������B ������ �� ��� ����� �� 1���)2���2������ ����� ��� �� ��� ������� ���-��� ��� � ������,���� ����-��� �� ���� .�: �� >������� ��� �� ������ ������ ����

� ������ �� ������ �� ��������� �������� ������,���� ����-���� ������� �� � �� ����� �������� ������ ������ � ��� ����� ���� ������ ������ ��������� ��������� ���� �� �������� �� � ����������� ������ �� ������� ���� ������� ������ �� � �������������� � �� ��� � ������ �� ��� �������� ������� (!����� "�#$$� ������ �K�3�� ������������ ���������+ �� ��� ,���������� ������J 1���) �� &�<(&���� ��������� +����� �������=�������>��#��������� ������ (1���)C+� ���� � �� �� �� ��������������� � ��������J ��� �� #�#�&�&��������� ��� (!�7+�

� ���� �� !����� "�#$$2������ ����� ���2��� ���-���� �� � ���� � ������� ��� �� ��� ������� �� �� ���������� �� ���� �� �� ����� >����� ���� �� �������������� .�: ������ �� �� �� ������ � �� �� � �������������� ���� �� ��� ������� �� � 0$ �� ����� ���� ��� ��� � �� �� ������ ����� �� ����� �� � �� ����� ��� ����� ��� �� ���� �� ���� (������������� ��� �����+�

9��� ����������� �� ������ ������������ ����� .4*�� �� ���� ��� ����� �� ��� � -� �� ������� ������ �� ��� � ���� �������� �� �� ���� ����� .������ �� �������� �� ���� ���� �� �� ���� ��� <%= ������ ���� �� ���������� �>�������� ������ ����������� <�'##=� !��� ��� ��� �� ������� �� ����������� � -� �� .����� ��� �� ��������� � !� ������������������� �� �� ����� .����� ��� � �� ����������� � ����� �� ��������� ��� �������B ���� ����������� ��� ����� .�: ��� ����� �������� (1�2.�:+����������� ������������> ����������� ����������� ������� ��� � ��� ������ ���� ���� � <�=�

!�� ������� ��� �� ����� �� � ������ �������� �� ���� ��������� .����� ������ .4* ��������� �� �� ����� .�: � �� #$$ �� �������� ������ /�0� ��� /0 ��� <#$= �� ��������� .4* �� � �� ��������� (����� ����� �� �������� �� �� ���� �� +<##=� �� �� ������ �� �� ����� �� ���� �������� ��� ������� ��� ��� ������� � �� ����� �� ����������� ������3 ��:4� ������ .� ��� ��3 ��:4 ���- ���� �� ���������� �������� >����� ����,���� ����-��� �� � -�� �� ������� ��� �� ���� .4* ��� � ��� �� �� ����� �� ��� >�� ������ � ���� ���� ����������� .����� �� ������ ���� �������� ��� ��� � � ������� ���� ���� ��������� !� �� �� ���� ���������� ��� ���� �� �� ������� �� �� �������� �������B ����� � ��� � ����� ������ �� ���� �� ������ �� � ������ ���� � �/ � ���������� ���� .��������� �� �� ������������� �� �� � ������� ������ �����3!!� ���� � �� �� �� ����������� ���� �������� ��� ���� .����� �� � �� �������� ��>��� �������� ���� ������� ������������ ���������

1��������� ����� ������ .4* ��� ��������� � �������� �� �� � ���� � � �� ���� �������� ���������-��� �� ������� �� �� � � ������ �� ����� ����������� .����� �� .4* ��� � �� ���� � �� ������� �� #$'�0�1� ������ ����� .�: � � ������� ��� �������� ���� ������ ����� ���� ��� ���������� � ��� ��� �� ���� �� ����� ����������.�� �� �$�1� ������ ���� ����� � ��� ���-������ �� � ���� ����� �� �� ����� � �� �� � ��� �� ����� ���� ��3 ���������� �� �� �� ���������� ����� �� .�: � ������ �� /'@ <#�=� .� ��� ��

������������� #���� �� &/6@'&/@# ��3 ������ ������� �� �� ����� ����� &/6�

����� � >���� �� ���� �� ������� .4* ����������� ���� ��� ������ C�� �� ���� ������ ���� � ������� �� #$� #0� �$� �0� &$� &0� /$� /0� �� 0$�1� !�� � �� �� �� �� ��� ��������� �� �� �� /$�1� ����� ��������� �� /0�1 �� ����� ��� ����������-��� �� �������� �� �� �������� ������������ /$�1� ��� ����� � ��� � ����� �� �������������� �� � �� �� ����� � �� �� � � ������ ���� ������� �� ��� �� � ���� � ����� �� ?��� ������� �� ��� ��������� (#$'�$�1B ��� ��� �� ������ ����� �� �� �����+� ���� �?�� �� ���� ��� ���������� ����� ���������� � � ��� ����� ��� �������� ���� ������ �� � ������ �� �������� ���� #$�� /0�1 (��� ��� �����+ �� ������ � � �� ���� ����������� ������� ����� ������ �� ������ � ��������� ����� ��� �� ��� � �� �� ����� ���-��� �� ��� ������� �������� ������� ������ .� ���������� ���� ������ <#�=� � ���� ���� �� ���� ���� ����� ������� � �� �� ��� ���������� ��-��� ���������� ���� ������ �������� ������ � ������������������ ��� ��� �� ���� ��������� ��������� ����� ��������� ��� �� ��� ��� )��� ������������� ��� ������� ����� (���� �� ������� �� ���� ������+��� �� �� ��� �� ����� >����� �� ������ ���&$ ��� ���� ���������� ������ �� �� ����������� �� �������������� .4*�

*���� � � ������� �� ��� ��� �� ������� .����� �������� �� #$$ �� �������� ��� ��� �/ � �� ���������.4* �� �� ��� �������� �� /$�1� � ���������� ��*��� /� (�� �������� ��� ����+ �� /� (�/ � ����������� ����+ ����� �� ��������� �� ���� ��� ����� ������� �� ����� ������� �� .����� �� ������ ��� �/ � ��

#$$ �� �������� ���� � ���������� �� *��� /� (.4* ��/$�1+ �� /� (.4* �� #$�1+ � �� � ������� �� ����������� ��� ����� ������ �� /$�1�

.� ��� ������ ���- ���� ����� �� ���� ������ ����� ��������� .4* ���� .�:� �� �� ����� ������� ����� ���� ��������� �������� ��� ���� ����������� ����,���� ����-��� �� �� ����� � �� �� � � !��� ���������� ��� ��� �������� ���� �� ����� ?�� �������������� � ����?��� ����� ���������� �� ������ ��� �� ������ �� ������ �� ��������� ���� ������������ �� � !����� "�#$$� $�% ������ ����� ����� % � ��� �� � ��� ��� �� ��� �������� ���� �������� �� �������������� � � �� ��3 � ���� ��� ������K� ��������� ������ �� ����������� �� ������ �� ������� �� ���� �� ������ � ������ �� ����,���� ����-���J (�+ � �/ � ���� �� .����� �� ������ �� #$$ ���������� ���� �� /�0B �� (��+ �� ������ ���������� /$�1 ����� .4*�

� � �� ���� �� ���� ������� � ��� ��� .������ ������ ��3 ��:4� ����� �� � ������� ���� ������������ ��� ��� ������� � �� ������ �� ��� ������� ����� ��� �� �� ��� ��� �� ��3 ������ ������� �������� ����� �������� � �� ������ � ��������� �� ������� �� ����� �� ���� ������ �� ��� ��� � ���� ������� ������ ����� �� ���� � )���������� �������� �� �� ��� ����� ���� � �� � �� ���L�� ������� �������

�� ����� ���� �� ���� ���� ����� ���� ��� ����� ��������� �� ������� ���������� !������ "������ ������� ������ �� "������ ��� ��� �������� ������#����� ��

&/@$ 1� 1��� �� ��� ������������� #���� �� &/6@'&/@#

)����� � !� ��� ��� �� �������� ��� ������� �� ������ .4* �������� �� ���� ��� ����� �� ��3 ������ ��������� ����� �� ���� ������� (�+ .4* �� /$�1 �� �� �������� ��� ����B (�+ .4* �� /$�1 ���� � �/ � ���� �� .����� �� �������� #$$ �� �������� ���� �� /�0B (�+ .4* �� #$�1 ���� � �/ � ���� �� .����� �� ������ �� #$$ �� �������� ���� �� /�0�*������������� .4* ��� ������ ����� ##$ �� .�: ������ ���� ���� �� ���� &'#$�0� )������������ )3)���:4 ��� ������ ����� %'#% ������ � � ���� 0 ����-��� � � #$$ �� �� ����� : � �� ����� ���� 1�������� K�� ���� K ��

������� �$������ ��� %�������� &�������� ����� �������� �� ����� ��� �� ��� �� ��#������' ���������� �� �����������' ����������

9��� *������ �� #���B �� ���� ���� A� � �6� #���

����������

<#= KL ?����� K�� 4-� M�� 9������� �� :�� :����,,�� 4�� :N��� ����������� 9�� ���� � ��� (� )������ )��'�� *�����#�%�� +� #&/'#00�

<�= ������������ 3� *�� ���������-� ��� ���� � 1� 9�� %���� )��,���� #�%%� -./� /#�'/�&�

<&= ������������ 3� *�� ���� � 1� 9�� %�� 0���� ����������#�%%� -� &0'/$�

</= �������� ;� ��� *����� ��� 9�� �� K� A�� �������������#�%%� 1� /%%'/�6�

<0= ��-������ A�� 3����-� 9�� ��J 9�� �� K� A� (4�+� ����,��������,2���� 3+4� !������� 7�������O�� �P����#�%6� ��� ��'�@�

<6= 9����� �� ��� )����,� A��1�� )������ 1�� 9�������� !���� �� )�� ��������� ��� M������� !�� ������������� 3� *�� M��-� ���� *�� ������������� #��@� -+�6��'6�/�

<@= )�� �-� A�� K���� A�� A���-� ��� 5����� *�� M�������� ������ �� ��� ������������� #��@� -+� 6�0'6�%�

<%= ������ ��� ��������� 4�� *������� ��� :����,,�� 4�� 9��������� :�� ������������� #�%@� 4� #6�'#@$�

<�= 9��� ��� !�� : ��� 1�� K����� �� 5�� 9������� �� :�� �������,������ #�%@� +� &$0'&#��

<#$= 9������� �� :�� 1������ ��� 1��� � 4�� 1����� 1�� %��0���� ���������� #�%�� -� ##0'#�#�

<##= � � ��� M�� K���� ��� K��,����� ��� ������������� #�%@�+� ��&'��@�

<#�= :N��� ��� ���� � ���*������� 1�� M���-� 9�� )���� �� A� 9��������� )� ��� ������������� #��#� - � 60&'60%�

������������� #���� �� &/6@'&/@# ��3 ������ ������� �� �� ����� ����� &/@#