ASOCIACION DE ENDOCRINOLOGIA Y NUTRICION

Sesión del día 18 de noviembre de 1971

HGH HUMANA: SU DETERMINACION RADIOINMUNOLOGICA

P. FERRER Bou

INTRODUCCIÓN. -Los métodos radioinmunológicos se introdujeron en el campo de las técnicas de Bioquúnica en 1960 por Y ALLOW y BERSON para la determinación de la insulina.

Desde ese momento, teóricamente, todas las hormonas proteicas y poi ipeptídicas y por con sigui en te las hormonas hipofisarias se pueden dosi6car siguiendo principios análogos; no obstante, para algunas de ellas existen problemas técnicos que hace que estén sólo al alcance de centros altamente especializados o de investigación.1

Principios análogos a los empleados en los métodos radioinmunoló­gicos son aplicables a:

Sustancias que estén ligadas a una proteína que de suyo tenga una cierta especificidad .2

Hietto, ligado a Sidero6lina. Cobre ligado a Ceruloplasmina. B12 por su factor intrínseco o ligante. En todos estos casos las proteínas específicas están presentes en los

medios biológicos sin necesitar una inmunización previa. Sustancias desprovistas de antigenicidad, pero posibles de conjugarse

con la albúmina bovina, transformándose así en antígenos. En este grupo podemos encuadrar a esteroides, testosterona, cortisol

y Aldosterona qLle conjugados con la albún1i na bovina dan lugar a anti­cuerpos capaces de neutralizar el efecto biológico de la hormona esteroide correspondiente. Tales anticuerpos son específicos, como lo demuestran las técnicas «in vitro» de inhibición hapténica.

PRINCIPIOS GENERALES DEL RADIOINMUNOENSAYO. -Basándonos en que todas las hormonas proteicas estudiadas tienen poder antigénico, ellas formarán con sus inmw1osueros correspondientes un complejo Hotmo­na ·Anticuerpo.

116 ANALES SECCJÓN MEOlClNA

HORMONA+ ANTICUERPO~ HORMONA - AC ANTIHORMONA

Por otra parte la molécula hormonal puede modificarse para per­mitir la recepción de un isótopo radiactivo (! 131 ó Jl25

) sirt que por ello se afecte en grado apreciable su actividad antigénica.

Si consideramos la reacción anterior con hormona marcada obte­nemos:

HORMONA * + ANTICUERPO<! HORMONA * - AC ANTIHORMONA

Reacción de equilibrio que obedece a la ley de masas y que es inhibida de manera competi tiva por la adición de hormona no mar­cada3 (.6g. 1 ).

STANOAROS 10mus" M~RClOII

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iRAZADOR -Htl.UII mcms

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ANTICUeRPOS COMPl eJO HORMONAS LIBRES

5 ~ ==-=- ~ s ~~ iJ

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2 e: ..=:¡ ~ -~ ;..1

Frc. l. - Esquema del fundamento de las valoraciones radioinmunológicas.

Observando el esquema vemos que «para una cantidad fija y cons­tante de anticuerpo- antihormona y de hormona marcada, la cantidad de esta última que se combi nará con los anticuerpos será iuver!;atnente proporcional a la cantidad de hormona no marcada añadida».

Por tanto, para dosificar la cantidad desconocida de hormona pre­sente en un medio biológico, se utiliza un sistema representado por una cantidad muy débil de trazador T, una cantidad también muy débil de anticuerpo específico y concentraciones conocidas crecientes de hor­mona purificada o standard .

El sistema se trata en condiciones experimentales idénticas (incu­bación) que el problema.

FERRER. IIGII HUMANA 117

Se establece la curva standard (Úg. 2) de las concentraciones cre­cientes de hormona en función de la relación.

Hormona ligada

Hormona libre

Los valores de la citada relación para los problemas trasladados a la curva nos darán su cantidad.

CURVA STANDARD OE H G H

1-25 2 ·5 5·0 1·00

1{0/Ml OE HOH

8 F 2·30

1-50

1·00

0·60

0·43

0·25

0 ·10

FIC. 2

Como .la mayoría de complejos hormona - Ac antihormona son solu­bles a las débiles concentraciones a que ellos se producen, es necesario separar la hormona no reaccionante del complejo (Hormona- Anticuer­po) marcado que puede conseguirse por varios métodos.4 (tabla I) .

HALES y RANDLE, en Cambridge, trabajando con insulina, consi­deraron el hecho que el Ac-antiinsulina y el complejo que forma este anticuerpo con la insulina puede precipítarse con un suero antigamma globulina (úg. 3 ).

118 A;\!ALES SECCIÓN ~IEDICINA

TABLA l.- Métodos para la separación de la hormonct libre de la hormomt ligada al anticuerpo ( hormona-Ac antihormona)

Método

Croma toe [ect rofo­resis

Fundamento

Hormona no reaccionante sólo absorbida por el papel

Carbón vegetal, Adsorción hormona no re:Jccio-talco nante Cuarzo microprcci-pitado

Aplicado a:

Insulina, HGH, glucagón, ACTII; lactógeno placenta­rio, prolactina hu­mana

Insulina, glucagón, ACTH, TSH

Filtración con gel Diferencia de tamaño molecular Insulina, HGH y emre hormona libre y complejo angiotensina

Absorción en plás- Utilización de la fase sólida del tico anticuerpo (precipitada por anti­

gamma g!obulina, conjugada a polímeros y absorbida en plás­tico)

Resina intercambio Hormona no reaccionante absor- Insulina y HGH iónico bida por la resina

Reoforesis Adsorción hormona libre por el Insulina, HGH soporte y migración de la hor-

P1:ecipitación quí­Ollca

Doble Anticuerpo

mona anticuerpo a lo largo del soporte

Hormona anticuerpo, más gam­ma globulina no inmune precipi­tada por sales u etanol

Hormona anticuerpo precipitado por adición de un anticuerpo de antigamma globulina

Insulina y gluca­gón, ACTH y TSH

Insulina, HGH, ACTH, TSH, HCG

Emplearon este princ1p1o para desarrollar el método del Doble Anticuerpo, que para la HGH consiste en: precipitar cuantitativa­mente el complejo radiactivo hormona-anticuerpo por la adición de un segundo anticuerpo de antigamma globulina.

La separación de la hormona marcada ligada al an ticuerpo preci­pitado, de la hormona marcada libre se hace por filt ración sobre mem­branas de acetato de cel ulosa. La radiactividad contenida en el :fil tro

FERRER. HCH IIU~!ANA 119

HGH T' ANT I HGH CO MPLEJO F

:c::::b ~ ·~ o o o o o •

+ + ~ =~ + 11 o o o o o •

~ ~ +11 o o

- • o o. o + m .. o ~

mm Ull '( CtOU liiA

" :K fiJADA • HCH liBRE fRHitiTAOO OH COMPlEJO INMUNE

FJ<;. 3. - Esquema de la wlo1·aci6n de IIGI-I por doble anticuerpo.

se determina en un detector de radiaciones gamma de centelleo líquido o bien en otro detector gamma, bien sea del tipo pozo e incluso en uno de planchetas.

METODOLOGÍA PARA DOBLE ANTICUERPO. - A ) Formación de com­plejo.

Incubación de la H GH en presencia de Ac-anti HGH durante un tiempo tanto menor cuanto mayor sea la temperatura.

B) I nhibición competitiva por parte de H GH no marcada. Añad ir hormona marcada, e ÜlCLrbar .

C) Precipi tación del complejo radiactivo. Mediante la adición del anticuerpo de anti gamma globulinn.

D) Separación del complejo ligado de la H GH libre.~

E) Determinación cuantitativa del complejo radiactivo ligado.

ELEMENTOS NECESARIOS PARA UNA DOSIFICACIÓN. - Anticuerpos; Obtenidos mediante inmunización de animales, generalmente el cobaya,

120 ¡\l\i\LES SECClÓI'< MEDTCl!,,\

con pequeñas can tidades de hor mona homogeneizada (0,1- 1 mg) en in­yección repetida cada quince días o un mes de intervalo .

La existencia de reacciones cruzadas permite la utilización de inmu­nosueros conseguidos con la ayuda de anim ales, para la insulina, el glucagón y la ACTH . D ada la estrecba especificidad inmunológica de la HGH y quizá de la TSH, se bace necesario para estos inmunosueros partir de bormona humana.6

Titulación anticuerpos: Se hacen diluciones decrecientes del orden de l0-3

, 10- 4 ... de antisueros que se incuban con una cantidad fija

de hormona marcada y en ausencia de toda otra hoxmona . La d ilución de anticuerpo que fija w1 50 % de hormona marcada

se toma como valor b ase, dando lugar al punto O de la cutva; para la HGH este valor es del orden del 40 al 60 % de la r adiactividad total.

Hormonas marcadas: Como los derivados radiactivos son el medio de calcular la reacción es preciso que sean altamente puri6cados .7

El marcaje normalmente se efectúa por electroforesis según la téc­nica de Greenwood y Hunter, partiendo de hormonas bien purificadas, pero luego de marcadas han de purificarse de nuevo.

Los derivados radiactivos han de ser de elevada «actividad espe­cífica>> ya que la sensibilidad del método depende además de la calidad del an ticuerpo, de la actividad específica de la hor mona marcada . De­bido a l a desnaturalízaci.ón que sufren las hormonas marcadas, deben ser utilizadas en los ocbo d ías qLle siguen a su preparación, tratándose de 1131

; por eso se usa más el 1125, que por tener vida media más larga

permite un tiempo más largo de utilización . Como su actividad espe­cífica es menor parece lógico gue sería necesario introducir más 1125

gue P 31 para obtener la misma actividad específica. En la práctica, y debido a la mayor pureza de ]as preparaciones de 112~' Jas cantidades empleadas actualmente de uno u otro para producir tma alta actividad específica son muy similares.

Preparaciones standard : Deberían ser para su uso <<Ídénticas» a las sustancias a valorar.

Como por el momento no puede obtenerse sintéticamente la hor­mona (8), ésta tiene que ser p reparada por extracción a partir de glán­dulas pituitarias. El producto final contiene una proporción vatiable de hormona desnaturalizada y la potencia biológica de los diversos stan­dards usados por los diversos autores puede variar considerablemente .

Se está preparando un patrón primario o internacional por la O.M.S., que permitirá la calibración de otros patrones ahora en uso.

En las determinaciones que hemos efectuado el standard empleado es un patrón secundario, preparado por pesada y proveniente de U.S .A. ; de aquí que los valores se expresen en ng y no en U . l.

FERRER. HGH HUMANA 121

EsPECIFICIDAD DE LOS ANÁLISIS RADTOtNMUNOLÓcrcos. - Lo que se mide, aunque con precisión y sensibilidad, en un análisis radioinmu­nológico es una fracción inmunológicamente relacionada con la mues­tra de hormona utilizada como standard. Ni el standard nl la hormona marcada utilizada para la radioiodación necesitan ser de la misma espe­cie, mientras suceda que la inhibición de la hormona marcada y anti­suero por la hormona usada como sta ndard sea paralela en plasma y en extracto crudo de la hormona que hay que medir.

La especificidad depende: A) Pureza del antígeno, que se puede admitit tanto para él como

para el marcado un 5 % de impmezas. B) Extinciencia y grado de reacciones cruzadas. CONDICIONES INDISPENSABLES PARA LA DOSIFICACIÓN RADIOINMU­

NOLÓGICA.- 1) Es preciso que la hormona sea antigénica y que ella induzca la formación de anticuerpo; a este postulado puede darse un sentido más amplio.

2) Se necesita que la hormona pueda ser marcada por un isótopo, el más frecuente 1125 o 1131

, pero también e• o H 3•

3) Es preciso que la reacción sea «específica» . 4) Hay que emplear un b uen método de separación de hormona

marcada libre y hormona marcada fijada a los anticuerpos. 5) En fin, es preciso que el sistema inmunológico sea aplicable a

los medios biológicos en los cuales se quiere dosificar la hormona. Para ello, el medio biológico no puede modificar la reacción inmunológica de base ni la técnica de separación de la hormona libre y la hormona marcada fijada a los anticuerpos. El medio no debe tampoco engendrar una degradación de la hormona marcada.

6) El comportamiento inmunológico de la preparación hormonal debe ser idéntico a la hormona endógena que se desea dosificar .

VALORACIÓN DE HGH. - Después del sexto mes de vida, durante los cuales la secreción de HGH alcanza cifras particularmente elevadas, se produce un notable descenso en su producción, que da lugar a que las cifras halladas en el niño de un año y en el adulto sean práctica­mente las mismas.

Los valores nonnales plasmáticos empleando el método del dobJe anticuerpo son: .3-15 ng/ ml ( 7,4 ng/ ml) varones, 5,5 ng/ ml, mujeres 8 ng/ml.

Idealmente las pruebas deben hacerse en condiciones extrictamente «basales», con el paciente en cama y en decúbito, en su defecto ha­biendo estado en reposo absoluto durante 3 horas seguidas y en ausen­cia de todo tratamiento de HGH.

Conseguidas las condiciones ideales, no se ha observado variación en los niveles de HGH del varón y la mujer.

122 ANALES SECCfÓN MEDICINA

Aparte de las determinaciones basales con las ct1ales a veces en personas normales no se logra detectar la presencia de HGH plasmá­tica, o en otros casos de posible disfunci6n hipo:fisari a, se hacen nece­sarias las pruebas dinámicas de frenamiento o estimulación .

Pruebas estimulación: A) Hipoglucemia causada por la inyecci6n intravenosa o subcutánea de 0,1 U/kg peso corporal de insulina nor­mal, pero es más adecuado usar la mitad de esta dosis en los casos que se sospecha una sensibilidad aumentada a la insulina. Cuando hay resis­tencia, 0,3 U/kg peso de insulina.

B) Hiperaminoacidemia provocada por la administraci6n de Argi­nina.

Perfusión intravenosa 20 gr/m~ ClH Arginina durante 30 minutos en 300 ml de suero fisiológico .

Conviene efectuar las dos p ruebas y de no ser posible es preferible el test de la insulina, pues a veces algunas personas no responden al estímulo de la Argi ni na. Además se ha visto el fracaso de w1a u o tra prueba en producir un aumento de HGH en niños normales.

Para que una prueba se dé como positiva, hace falta que dé por lo menos 8 ng de aumento tras la estimulación por la hipoglucemia, pero debe tenerse en cuenta que existen factores perturbadores, como el «stress» que suponen las extraccions reptiQas d sangre que pueden motivar amplias variaciones en las respuestas individuales del sujeto.

PR UEB A EST IMU l ACIO N DE l l. HG H PO I lA INSU l i NA

A 1 " 15 1 " 125

' 1 ' 1 " 1 " "' 1 ' "' ~· 1 ' " 10 e" .. 1 ' .. "' 1 ' u w 1 " ¡: ~ 0.75 .. _, "' ~ 1 "' .. lm 1 5 _,

o.

1 X 1 ~

X

1 FrG. 4 ' 0.25 o 1

1 o 30 60 go JIENPI ••mos

Insulina: Se dosifica simultáneamente la HGH y glucosa en el tiempo: O, 30, 60, 90, 120 y 180 minutos.

En individuos normales se observa un aumento de IIGH y una disminuci6n de la glucemia a los 30 minutos (fig. 4 ).

FERRilR. llGH H UM t\NA 123

El test carece de valor si la bajada de la glucemia no representa al menos el 50 % de la cifra basal.

Arginina: Se dosifica la HGH y glucemia en tiempos de: 40, O, 30, 60 y 120 minu tos.

En individuo normal se observa una elevación de HGH que puede alcanzar 22 ng a los 60 minutos y una elevación, aunque pequeña, de la glucemia.

Después de las dos horas las tasas de HGH se encuentran en los límites de los valores normales (hg. 5) .

PRUEBA ES TI MUL ACION lf HOH

"' ARG ININA 30

2

~

/ \ ~ 1 50 / \

20 ~ / \ .... i- / \ <

/ \ ~ 1 \ "' :! 1 5

~ 1 ..

1 ' 10 :r !! 1 ' ' " o 050 1 ' :r

1

1 '-- ---- 1

1 - 1 _, 1 FIG. 5

~o 00 90 120 150 160

11!11111111

En tres pacientes estudiados por nosotros con la prueba de estimu­lación por la insulina (fig. 6 ).

M.G.C. - Retraso de crecirniemo, déficit hipofisarío en el sector HGH.

Efectuamos dos veces la prueba; en una de ellas no se consiguió la bajada de glucosa, pero en ambos casos no se observa ninguna esti­muJación .

Por responder a las pruebas funcionales de corteza suprarrenal y tiroides nos hace suponer un déficít selectivo de HGH.

A.R.M.- Retraso de crecimiento con déficit de tiroides y de HGH. Respuesta positiva pero lenta a los 120 minutos. El valor basal es

normal. La prueba es normal tratándose de un hipotiroideo, ya que en casi

todos ellos hay comportamiento semejante. M.M.G. - Síndxome de Turner. Respuesta positiva al test, como ocurre normalmente en este sín­

drome. Pruebas frenamiento: Los test de frenamiento se basan en el blo­

queo prácticamente completo de la secreción de HGH por la adminis-

124 ANALES SECCIÓN MEDICINA

GLUCEMIA ICIIIU I HGH l!CIU

e o

8 0

70

60

50

•o

30

20

10

- ------6'

' '

1

' ' ' ' ' ' ' _lllM..G ) t_

/ /

,.~.M._

------ • _ ----- - - ------- _... ,.., / M.G C._ MGC.

--~ ·-- ' /

o 30 60 90 120

Frc. 6.- Prueba de estimulación de la secrecton de hormona de crecimiento (·- - .- -), mediante hipoglucemia (--), provocada por la administración intravenosa de insulina

normal (0,1 U.I.jkg. de peso).

traci6n oral de 45 gr de glucosa/m2 de superficie; en la pníctica 20 a 30 gr de glucosa.

Por vía endovenosa 10 gr/m2, haciendo las tomas de muestras an­

tes de la admjnistraci6n y cada 10 minutos durante 1 hora. Glucosa oral. Se determina la HGH y la glucosa en los tiempos O, 30, 60, 120

y 240 minutos. En individuos normales las cifras descienden hasta casi O, en un

plazo de 30 ó 60 minutos. Esta prueba sólo tiene aplicación en los casos de acromegalia, o gigan-

FERRER. HCH HUMANA 125

tismo, que suponen una tasa elevada de HGH. En caso de tumor hipo­fisario el valor de HGH no desciende (fig. 7 ).

fiG. 7

tSO

~ 125

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PRUE BA f RENAC IO N ~ HGH tll GLUCO SA ORAL

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J; o :r

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o 15 30 60 120 180 TH•t~ MIMUIOI

Efectuamos la prueba en cuatro pacientes acromegálicos, ellos habían sido tratados quírúrgicamente.

dos de

C. R. Acromegalia clínicamente inactiva después Tiempo HGH ng/ml Insulina [J.U/ml

basal 2 49 30' 1 60 6<F o 68 90' 0,5 105

120' 5 102 150' 4 142 180' 1 55

de hipofisectomía. Glicemia gr % ml

0,73 1,42 1,62 1,70 1,34 1,29 0,99

El nivel basal de HGH es normal. La hiperglucernia provocada frena bien la secreción.

La glucemia se comporta normalmente. No obstante la insulinemia muestra una respuesta lenta y prolongada,

subrayando el comienzo de un pequeño defecto de regulación glucémica poco importante.

M.G.-Acromegalia clínicamente inactiva después de hipolisectomía. Tiempo HGH ng/ml Insulina [J.U/ml Glicemia gr% ml

basal 0,5 34 0,96 30' 10 60 1,04 60' 6,5 105 1,60 90' 11,5 160 1,70

120' 6 130 1,42 150' 1 90 1,29 180' 6,5 62 1,28

126 ANALES SECCIÓN MEOJClNA

El valor basal de HGH es débil, pero la frenación por la hiperglu-cemia provocada no se produce.

La insulinemia aumenta un poco más de lo debido. La glucemia es normal. A. L.- Acromegalia clínicamente activa, no tratada .

Tiempo basal

30' 60' 90"

HGH ng/ml 5

Insulina ¡.tU/ ml 31

Glicemia gr% ml 10,1

120' 150'

8 11,5 7,5 5 5

63 1,97 110 2,51 115 2,54 75 2,04 86 1,65

Aunque el nivel de HGH basal es normal, la prueba de frenación es anormal, ya que la HGH tiene incluso tendencia a aumentar bajo la hiperglicemia provocada .

Además, la glicemia y la insulínemia (fuerte aumento durante la prueba) se comportan ya como en una diabetes química.

M. E. - Acromegalia, hipófisis irradiada; clínicamente inactiva.

Tiempo HGH ng/ml Insulina ¡.tU/ml Glicemia gr% ml basal 26 40 0,91

30' 20 250 1,38 60' 57,5 265 1,35 90' 23,5 227 1,31

120' 16,5 325 1,29 150' 16,5 1,10 180' 11,5 248 1,05

Los valores de HGH son altos en todos los momentos de la prueba. No se observa frenación. La insulínemia también aumenta mucho durante la prueba. La inactivación de la acromegalia es dudosa. Estas pruebas han sido realizadas en el laboratorio de Radioinmu­

nología de la «Clinique des maladies metaboliques et endocriniennes», Prof. J. MIROUZE (Montpellier).

CoNCLUSIONES.- Es evidente que el análisis radioinmunológico de las hormonas proteicas y peptídicas es uno de los modernos avances de la Endocrinología. Algunos análisis han producido ya datos valiosos, no fáciles de conseguir previamente con los análisis biológicos; permitiendo trabajar con muy débiles cantidades de hormona y anticuerpo, consi­guiendo detectar hasta cantidades del orden de 1 ng/ml.

f"'ERRER. HGH HU¡\<IANA 127

Aparte de la información sobre la secreción glandular que interese, otra gran aplicación de la que ya se ha hecho mucho uso es el estudio de los anticuerpos antihormonas.

Si bien las dosificaciones radioinmunológicas para insulina, HGH y otras hormonas están perfectamente resueltas, para otras existen proble­mas que ya hemos apuntado, referentes a pureza de antígeno, especifici­dad y buen método de separación.

No. obstante esperamos mucho de las técnicas radioinmunológicas, que fácilmente pueden estar al alcance de nues tros laboratorios, máxime teniendo en cuenta que ciertas firmas farmacéuticas preparan sistemas radioinmunológicos standarizados que nos permitirán ampliar cada vez más el campo del radioinmunoensayo.

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