ISOLASI, PENGELOMPOKKAN WARNA DAN OPTIMASIMEDIA PERTUMBUHAN AKTINOMISET SELULOLITIK

ASAL HUTAN SULAWESI TENGAH

Oleh:

ASIH WIDAYANI

G 34102076

DEPARTEMEN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR2006

ABSTRAK

ASIH WIDAYANI. Isolasi, Pengelompokkan Warna dan Optimasi Media PertumbuhanAktinomiset Selulolitik Asal Hutan Sulawesi Tengah. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI danYULIN LESTARI.

Sebanyak 63 isolat Aktinomiset diisolasi dari contoh tanah hutan Taman Nasional LoreLindu, Sulawesi tengah. Isolat Aktinomiset dikelompokkan berdasarkan warna koloninya menjadienam kelompok warna. Beberapa isolat menghasilkan pigmen terdifusi yang berbeda. Delapanisolat Aktinomiset diantaranya menghasilkan zona bening. Tiga isolat Aktinomiset terpilihberdasarkan indeks selulolitiknya, yaitu A5D4-3, D2D2-2, dan E2D1-2, diukur biomassanya dandiuji aktivitas selulasenya. Isolat A5D4-3 dan E2D1-2 memiliki biomassa terbesar ketika peptonditambahkan pada media pertumbuhan CMC, sedangkan isolat D2D2-2 memiliki biomassaterbesar ketika ekstrak khamir ditambahkan pada media pertumbuhan CMC. Isolat A5D4-3memiliki aktivitas FPase lebih besar (0.022 nkat/ml), dibanding CMCase dan aviselase ketikamenggunakan media pertumbuhan CMC dengan penambahan pepton. Isolat D2D2-2 memilikiaktivitas CMCase lebih besar (0,373 nkat/ml), dibanding CMCase dan FPase ketika menggunakanmedia pertumbuhan CMC dengan penambahan ekstrak khamir. Isolat E2D1-2 memiliki aktivitasaviselase lebih besar (0,012 nkat/ml), dibandingkan CMCase dan FPase ketika menggunakanmedia pertumbuhan CMC dengan penambahan pepton.

ABSTRACT

ASIH WIDAYANI. Isolation, Colour Grouping and Growth Media Optimation of CellulolyticActinomycetes from Central Sulawesi Forest. Supervised by ANJA MERYANDINI dan YULINLESTARI.

Sixty three isolates of Actinomycetes were isolated from soil sample of Lore LinduNational Park forest, Central Sulawesi. Those isolates were grouped into six colour groups basedon the color of their colony. Some isolates produced different diffusible pigment. Eight isolates ofActinomycetes produced clearing zone. Biomass and cellulase activity of three isolates, A5D4-3,D2D2-2, and E2D1-2 were measured based on their cellulolytic index. A5D4-3 and E2D1-2 hadthe highest biomass when peptone was added into CMC growth media, meanwhile D2D2-2 hadthe highest biomass when yeast extract was added into CMC growth media. A5D4-3 had higherFPase activity (0.022 nkat/ml) than CMCase and avicelase when CMC growth media was addedwith peptone. D2D2-2 had higher CMCase activity (0.373 nkat/ml) than avicelase and FPase whenCMC growth media was added with yeast extract. E2D1-2 had higher avicelase activity (0.012nkat/ml) than CMCase and FPase when CMC growth media was added with peptone.

ISOLASI, PENGELOMPOKKAN WARNA DAN OPTIMASIMEDIA PERTUMBUHAN AKTINOMISET SELULOLITIK

ASAL HUTAN SULAWESI TENGAH

Skripsisebagai salah satu syarat untuk memperolah gelar

Sarjana Sains padaDepartemen Biologi

Oleh:

ASIH WIDAYANIG 34102076

DEPARTEMEN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR2006

Judul Skripsi : Isolasi, Pengelompokkan Warna dan Optimasi Media Pertumbuhan AktinomisetSelulolitik Asal Hutan Sulawesi Tengah

Nama : Asih WidayaniNIM : G34102076

Menyetujui

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Anja Meryandini, MS Dr. Ir. Yulin LestariNIP. 131663016 NIP. 131779515

MengetahuiDekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MSNIP. 131473999

Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat-Nya sehingga penulisberhasil menyelesaikan laporan skripsi ini. Penelitian ini berjudul Isolasi, Pengelompokkan Warnadan Optimasi Media Pertumbuhan Aktinomiset Selulolitik Asal Hutan Sulawesi Tengah, yangdilaksanakan dari bulan Februari hingga Agustus 2006 di Laboratorium Mikrobiologi DepartemenBiologi FMIPA IPB.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Anja Meryandini, MS. dan Dr. Ir. Yulin Lestari yangtelah memberikan dana, ilmu, saran dan solusi selama penelitian. Penulis juga mengucapkanterima kasih kepada Dra. Triadiati, M.Si. yang telah memberikan contoh tanah dan Dr. NisaRachmania Mubarik, M.Si. sebagai Kepala Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB.Mba Heni, ibu Kokoy, Bapak Endang, Bapak Jaka, dan Bapak Husen sebagai laboran diLaboratorium Mikrobiologi. Kepada teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi Dewi, Nirli,Vitria, Mia, Dhilah, Mba elsie, Tika, Ari, Tika T, Desi, ibu It. Kepada teman baikku Awi, Neenda,Juve, Popi, Adisti, Ajeng dan teman-teman Biologi angkatan 39 yang tidak dapat disebutkan satupersatu atas segala dukungan dan doanya.

Tak lupa terima kasih kepada orang tuaku, seluruh keluarga, dan Mas Anto untuk doa, kasihsayang, dan dorongan semangatnya selama ini.

Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat.

Bogor, September 2006

Asih Widayani

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 13 Agustus 1984. Penulis merupakan anak keduadari lima bersaudara dari Ayah Djuhanda dan Ibu Wiwi Suswiti.

Tahun 2002 penulis lulus dari SMUN 48 Jakarta Timur, dan berhasil masuk Jurusan Biologi,Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2002melalui jalur SPMB. Selama perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliahBotani Umum pada tahun akademik 2004/2005 dan 2005/2006, mata kuliah Biologi pada tahunakademik 2005/2006, mata kuliah Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh pada tahun akademik2005/2006 dan mata kuliah Fisiologi Mikroba pada tahun akademik 2005/2006. Penulis pernahmelaksanakan praktik lapang di PDAM Tirta Pakuan Bogor dengan judul Analisa PenurunanKandungan Bakteriologis Pada Setiap Proses Pengolahan Air Cipaku PDAM Tirta Pakuan. Tahun2005 penulis memenangkan Lomba Karya Tulis Ilmiah tingkat IPB dan tahun 2006 sebagai juaraI pada Lomba Pekan Ilmiah Nasional.

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL ............................ ................................ ................................ ............. vii

DAFTAR GAMBAR ............................ ................................ ................................ ........ vii

DAFTAR LAMPIRAN ............................ ................................ ................................ ..... viii

PENDAHULUAN............................ ................................ ................................ ............. 1Latar Belakang ............................ ................................ ................................ . 1Tujuan ............................ ................................ ................................ .............. 2

WAKTU DAN TEMPAT ............................ ................................ ................................ . 2

BAHAN DAN METODE ............................ ................................ ................................ . 2Bahan ............................ ................................ ................................ ............... 2Metode ............................ ................................ ................................ ............. 2

Isolasi Aktinomiset ............................ ................................ ..................... 2Colour grouping ............................ ................................ ......................... 2Pengukuran indeks selulolitik............................ ................................ ..... 2Optimasi pertumbuhan isolat selulolitik terpilih pada mediapertumbuhan yang berbeda............................ ................................ ......... 2Pengukuran biomassa ............................ ................................ ................. 2Pengukuran aktivitas selulase............................ ................................ ..... 2

HASIL............................ ................................ ................................ ............................... 3Isolasi Aktinomiset............................ ................................ ........................... 3Colour Grouping............................ ................................ .............................. 3Pengukuran Indeks Selulolitik............................ ................................ .......... 3Optimasi Pertumbuhan Isolat Selulolitik Terpilih pada MediaPertumbuhan yang Berbeda............................ ................................ .............. 4Pengukuran Aktivitas Selulase............................ ................................ ......... 4

PEMBAHASAN ............................ ................................ ................................ ............... 5Isolasi Aktinomiset............................ ................................ ............................ 5Colour Grouping ............................ ................................ ............................... 5Pengukuran Indeks Selulolitik............................ ................................ ........... 5Optimasi Pertumbuhan Isolat Selulolitik Terpilih pada MediaPertumbuhan yang Berbeda............................ ................................ ............... 6Pengukuran Aktivitas Selulase............................ ................................ .......... 6

SIMPULAN ............................ ................................ ................................ ...................... 7

SARAN ............................ ................................ ................................ ............................. 7

DAFTAR PUSTAKA ............................ ................................ ................................ ....... 8

DAFTAR TABEL

1 Indeks selulolitik isolat terpilih ............................ ................................ ...................... 32 Biomassa tiga isolat selulolitik pada sumber karbon dan sumber nitrogen yang

berbeda setelah 10 hari pertumbuhan pada suhu ruang ............................ .................. 4

DAFTAR GAMBAR

1 Persentase jumlah isolat Aktinomiset pada contoh tanah A, D, dan E....................... 32 Contoh masing-masing warna koloni isolat yang berbeda-beda ............................ .... 33 Aktivitas selulase isolat A5D4-3 pada media pertumbuhan CMC dengan penambahan

pepton dan media pertumbuhan avisel dengan penambahan pepton yang diuji padasuhu 40 ºC dan pH 6.5............................ ................................ ................................ .... 4

4 Aktivitas selulase isolat D2D2-2 pada media pertumbuhan CMC dengan penambahanekstrak khamir dan media pertumbuhan avisel dengan penambahan ekstrak khamiryang diuji pada suhu 40 ºC dan pH 6.5 ............................ ................................ .......... 4

5 Aktivitas selulase isolat E2D1-2 pada media pertumbuhan CMC dengan penambahanpepton dan media pertumbuhan avisel dengan penambahan pepton yang diuji padasuhu 40 ºC dan pH 6.5............................ ................................ ................................ .... 4

DAFTAR LAMPIRAN

1 Komposisi media agar-agar............................ ................................ .......................... 102 Komposisi media pertumbuhan............................ ................................ .................... 113 Metode pengujian aktivitas CMCase (Miller 1959) ............................ ..................... 134 Metode pengujian aktivitas aviselase (Okada 1999) ............................ .................... 135 Metode pengujian aktivitas FPase (Alam et al. 2004)............................ .................. 136 Kurva standar glukosa............................ ................................ ................................ .. 137 Isolat Aktinomiset yang diisolasi dari contoh tanah dengan menggunakan media agar-

agar CMC............................ ................................ ................................ ..................... 148 Pengelompokkan warna miselia Aktinomiset yang ditumbuhkan pada media YMA

selama 14 hari pada suhu ruang ............................ ................................ ................... 169 Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni ............................ .............................. 1710 Aktivitas selulase isolat A5D4-3 yang ditumbuhkan pada media pertumbuhan dengan

penambahan pepton ............................ ................................ ................................ ..... 1811 Aktivitas selulase isolat D2D2-2 yang ditumbuhkan pada media pertumbuhan dengan

penambahan ekstrak khamir............................ ................................ ........................ 1812 Aktivitas selulase isolat E2D1-2 yang ditumbuhkan pada media pertumbuhan dengan

penambahan pepton ............................ ................................ ................................ ..... 18

1

PENDAHULUAN

Latar BelakangMikroorganisme membutuhkan nutrisi

untuk mendukung pertumbuhan selnya.Nutrisi yang dibutuhkan terdiri atasmakronutrien dan mikronutrien. Makronutrienyang dibutuhkan yaitu karbon (C), nitrogen(N), fosfor (P), sulfur (S), kalium (K),magnesium (Mg), kalsium (Ca), natrium (Na)dan besi (Fe). Mikronutrien yang dibutuhkanyaitu tembaga (Cu), mangan (Mn), seng (Zn),nikel (Ni), molibdenum (Mo), kobalt (Co)(Prescott et al. 1999). Hampir 50% beratkering sel terdiri atas karbon, oleh karena itukarbon (C) merupakan makronutrien yangpaling utama dibutuhkan. Prokariot autotrofmenggunakan CO2 sebagai satu-satunyasumber karbon, sedangkan yang bersifatheterotrof menggunakan molekul organiksebagai sumber karbon untuk pertumbuhan(Madigan et al. 2000).

Selulosa, komponen terbesar tumbuhan,sebagai salah satu sumber karbon merupakanpolimer linier anhidroglukosa dengan ikatanβ-1,4-glikosida (Li & Gao 1997). Di dalamtumbuhan, selulosa tersusun dalam bentukfibril yang terdiri atas beberapa molekulselulosa yang diikat oleh ikatan hidrogen.Fibril-fibril tersebut membentuk kristal parsialyang merupakan ciri pembeda dari pati.Hidrolisis selulosa dapat dilakukan secarakimiawi maupun secara enzimatikmenggunakan selulase(Haki & Rakshit 2003).

Selulase, enzim penghidrolisis selulosa,merupakan enzim kompleks yang terdiri atas:(1) kompleks endo-β-1,4- glukanase:endoselulase, Carboxymethyl cellulase(CMCase), atau Cx selulase; (2) kompleksekso- β-1,4-glukanase: selobiohidrolase,aviselase, atau C1 selulase; (3) β-1,4-glukosidase atau selobiase (Crueger &Creuger 1984). Banyak bakteri dapat tumbuhdengan selulosa sebagai sumber karbon,namun hanya beberapa kelompok bakteriyang mampu mendegrasi komponen selulosasecara keseluruhan. Bakteri yang mampumenghasilkan sistem selulase yang lengkapdisebut dengan true cellulolytic bacteria,sedangkan yang hanya mampu menghasilkanendoglukanase dan β-glukosidase disebutpseudocellulolytic bacteria (Coughlan &Mayer 1991). Sintesis selulase dapat diinduksidengan keberadaan selulosa kristal atau aviselsebagai sumber karbon. Sebaliknya sumberkarbon lain dapat menghambat sintesisselulase. Penambahan ekstrak khamir tidakberpengaruh secara langsung terhadap sintesis

selulase, tapi dapat menunjang pertumbuhanbakteri (Wartel & Schrempf 1996).

Bakteri selulolitik dapat bersifat aerobmaupun anaerob. Dalam kondisi aerobikdegradasi selulosa akan menghasilkan CO2

dan air, sedangkan dalam kondisi anaerobikakan menghasilkan metan selain CO2 dan air(Perez et al. 2002). Bakteri selulolitik yangbersifat aerob antara lain berasal dari genusCellulomonas, Cellovibrio, Pseudomonas,Serratia, Streptomyces. Bakteri selulolitikyang bersifat anaerob antara lain berasal darigenus Bacteroides, Clostridium,Ruminococcus (Coughlan & Mayer 1991).

Aktinomiset merupakan salah satu kelasdari filum Bacteria, ordo Actinomycetales.Berdasarkan ciri morfologi dan kandungandinding selnya, genus Aktinomiset terbagidalam dua kelompok, yaitu genusStreptomyces dan genus non Streptomyces.Genus Streptomyces merupakan genusterbesar Aktinomiset. Streptomyces memilikikemampuan untuk mendegradasi selulosa,hemiselulosa, dan lignin, yang banyakterdapat dalam tanaman (Holt et al. 1994;Madigan et al. 2000).

Aktinomiset masuk dalam kelompokbakteri berfilamen, Gram positif dengan %GC tertinggi diantara bakteri lainnya, yaitusebesar 63-78% (Madigan et al. 2000).Aktinomiset bereproduksi dengan spora aerial(konidia) atau melalui fragmentasi miselia.Aktinomiset memiliki dua macam miselia,yaitu miselia aerial dan miselia substrat.Kedua miselia ini mampu menghasilkanpigmen yang menyebabkan perbedaan warnapada masing-masing koloni. Perbedaan warnamasing-masing koloni dapat dijadikan tahapawal identifikasi genus dan spesies padaaktinomiset. Tahap identifikasi selanjutnyaadalah uji produktivitas melanin, karenakelompok warna spora yang sama dapatdimiliki anggota yang berasal dari genusmaupun spesies yang berbeda (Holt et al.1994).

Dalam dunia industri, enzim selulolitiktermofil dapat diaplikasikan pada industrimakanan dan pemanis yang membutuhkanproses bertemperatur tinggi, sepertipasteurisasi (Jang & Chang 2005). Selain ituenzim selulolitik dapat dimanfaatkan untukmenjernihkan dan mengekstrak jus buah,digunakan untuk biostoning bahan jeans,digunakan untuk memperbaiki kualitas nutrisipakan kuda atau sapi, serta digunakan dalampengolahan limbah industri (Haki & Rakshit2003).

2

Taman Nasional Lore Lindu yang beriklimtropis dan terdiri atas hutan hujan tropis danhutan perkebunan, terletak di desa Toro,Kabupaten Donggala, Sulawesi Tengah.Taman Nasional Lore Lindu memiliki kera-gaman flora yang tinggi, lebih dari 100spesies tumbuhan dapat ditemukan di TamanNasional ini. Kondisi hutan yang berserasahmemungkinkan diisolasinya Aktinomisetselulolitik (Holt et al. 1994; Madigan et al.2000).

TujuanTujuan dari penelitian ini adalah untuk

mengisolasi Aktinomiset selulolitik, menge-lompokkan koloni Aktinomiset berdasarkanwarna, dan mengetahui media yang optimaluntuk pertumbuhan dan aktivitas selulaseAktinomiset selulolitik.

WAKTU DAN TEMPAT

Penelitian dilaksanakan mulai bulanFebruari sampai Agustus 2006 diLaboratorium Mikrobiologi DepartemenBiologi Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.

BAHAN DAN METODE

BahanBahan yang digunakan yaitu contoh tanah

hutan konservasi Taman Nasional Lore LinduSulawesi Tengah, yang terdiri atas (1) tanahhutan primer dengan vegetasi dominantumbuhan hutan (A); (2) tanah hutan kakaonamun masih banyak terdapat tumbuhanhutan, memiliki nama daerah pahawa pongko1 (D); (3) tanah hutan dengan vegetasidominan berupa tanaman kakao dan sedikittumbuhan hutan, memiliki nama daerahpahawa pongko 2 (E).

MetodeIsolasi Aktinomiset. Isolasi Aktinomiset

dari contoh tanah dilakukan denganmengencerkan contoh tanah hingga 10-5 dandisebar pada media agar-agar Carboxy MethylCellulose (CMC) pH 7 (lampiran 1),diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang.Kemudian isolat yang diperoleh dimurnikankembali pada media agar-agar CMC.

Colour grouping. Isolat Aktinomiset yangtelah murni ditumbuhkan pada media YeastMalt Agar (YMA) (lampiran 1) selama 14 hari

pada suhu ruang. Selanjutnya dilakukanpengelompokan isolat aktinomiset berdasar-kan warna koloninya.

Pengukuran indeks selulolitik. IsolatAktinomiset yang telah murni ditumbuhkanpada media agar-agar CMC pH 7 dandiinkubasi selama 6 hari pada suhu ruang.Untuk mengetahui indeks selulolitik dila-kukan pewarnaan dengan congored 0.1 %sehingga zona bening yang terbentuk disekitarkoloni terlihat jelas. Indeks selulolitikdidapatkan melalui pengukuran zona beningyang terbentuk di sekitar koloni dikurangidiameter koloni dibagi diameter koloni.

Optimasi pertumbuhan isolat selulolitikterpilih pada media pertumbuhan yangberbeda. Optimasi pertumbuhan dilakukandengan menumbuhkan tiga isolat selulolitikterpilih berdasarkan indeks selulolitik yangterbesar (isolat E2D1-2), sedang (isolatA5D4-3), dan terkecil (D2D2-2) pada enammedia pertumbuhan yang berbeda. Mediapertumbuhan yang digunakan yaitu CMCdengan penambahan (NH4)2SO4 (M1), CMCdengan penambahan pepton (M2), CMCdengan penambahan ekstrak khamir (M3),avisel dengan penambahan (NH4)2SO4 (M4),avisel dengan penambahan pepton (M5) danavisel dengan penambahan ekstrak khamir(M6) (Lampiran 2). Sebanyak dua koloniisolat berdiameter 0.5 cm yang tumbuh padamedia agar-agar CMC diinokulasikan kedalam 50 ml media pertumbuhan dalam 250ml erlenmeyer, diinkubasi dengan agitasi 140rpm selama 10 hari pada suhu ruang dandiukur aktivitas selulasenya.

Pengukuran biomassa. Pengukuranbiomassa dilakukan berdasarkan berat keringkoloni isolat yang telah ditumbuhkan padamedia pertumbuhan selama 10 hari. Endapanhasil sentrifugasi (4000 xg, 30 menit)dikeringkan pada suhu 80 ºC selama 24 jamdan dilakukan sebanyak dua kali ulangan,supernatan yang merupakan ekstrak kasarenzim selulase diuji aktivitasnya.

Pengukuran aktivitas selulase. AktivitasCarboxy Methyl Cellulase (CMCase),aviselase, dan Filter Paperase (FPase) diukurdengan metode DNS (Miller 1959) denganglukosa sebagai standar dan dilakukansebanyak dua kali ulangan (Lampiran 3, 4, 5& 6). Gula pereduksi yang dihasilkan diukurdengan spektrofotometer pada panjanggelombang 540 nm. Satu unit aktivitasselulase didefinisikan sebagai jumlah enzimyang menghasilkan 1 µmol glukosa dalamsatu menit, setara dengan 16.67 nkat/ml(Dybkaer 2001).

3

Tanah A67%

Tanah D27%

Tanah E6%

Persentase jumlah isolatAktinomiset pada contoh tanah A,D, dan E.

Gambar 1

Pengukuran aktivitas CMCase dilakukandengan menambahkan sebanyak 1 ml filtratekstrak kasar enzim dengan 1ml CMC 1 %dalam bufer fosfat 0.2 M pH 6.5, diinkubasiselama 2 jam pada suhu 40 ºC. Pengukuranaviselase dilakukan dengan menambahkansebanyak 2 ml filtrat ekstrak kasar enzimdengan 2 ml avisel 2 % dalam bufer fosfat 0.2M pH 6.5, diinkubasi selama 2 jam pada suhu40 ºC. Reaksi dihentikan dengan penambahan20 µl NaOH 2 M, kemudian disentrifugasipada kecepatan 1500 xg selama 15 menit(Okada 1999). Pengukuran FPase dilakukandengan menambahkan sebanyak 1 ml filtratekstrak kasar enzim dengan 0.5 g kertas saringWhatmann no. 1 (1 x 6 cm), diinkubasiselama dua jam pada suhu 40 ºC (Alam et al.2004).

HASIL

Isolasi AktinomisetDari 50 contoh tanah didapatkan 63 isolat

Aktinomiset (Lampiran 7). Dari gambar 1terlihat isolat Aktinomiset banyak dijumpaipada contoh tanah A dengan persentasisebesar 66.67 %, sedangkan pada contohtanah D sebesar 26.97 %, dan pada contohtanah E sebesar 6.35 %.

Colour GroupingDari hasil pengamatan didapatkan 6

kelompok warna koloni yang berbeda serta 3warna pigmen terdifusi (Gambar 3 danLampiran 8). Isolat A2D5-3 dan isolat A3D1-1 menghasilkan pigmen terdifusi berwarnacoklat tua, isolat A2D4-1 menghasilkanpigmen terdifusi berwarna kuning, dan isolatD4D2-4 menghasilkan pigmen terdifusiberwana coklat. Beberapa isolat jugamenghasilkan eksudat berupa cairan yaituisolat A1D1-2, A1D3-1, A4D1-3, A4D1-4,dan D2D2-2.

Pengukuran indeks selulolitikDari 63 koloni isolat yang didapatkan

delapan diantaranya memiliki indeksselulolitik yang besar (Tabel 1 dan Lampiran9). Indeks selulolitik terbesar dimiliki olehisolat E2D1-2 yaitu sebesar 3.8, sedangkanindeks selulolitik terkecil dimiliki oleh isolatD2D2-2 yaitu sebesar 1.8.

Tabel 1 Indeks selulolitik isolat terpilihNo. Nama

IndeksSelulolitik

1. A2D5-2 2.8

2. A5D2-2 2.3

3. A5D4-3 2.125

4. D1D4-3 2.143

5. D2D2-2 1.8

6. D3D3-1 3

7. D4D2-4 2.75

8. E2D1-2 3.8

Contoh masing-masing warnakoloni isolat yang berbeda-beda. (a) Isolat A4D4-2 denganwarna koloni abu-abu; (b) IsolatA4D-1 dengan warna koloniabu-abu tua; (c) Isolat D1D2-2dengan warna koloni coklat; (d)Isolat A4D3-3 dengan warnakoloni hitam; (e) Isolat A4D3-5dengan warna koloni merahmuda; (f) Isolat D4D2-4 denganwarna koloni putih.

(a) (b)

(c) (d)

(f)(e)

Gambar 2

4

Optimasi Pertumbuhan Isolat SelulolitikTerpilih pada Media Pertumbuhan yangBerbeda

Data pada tabel 2 menunjukkan isolatA5D4-3 dan E2D1-2 memiliki pertumbuhanlebih baik pada media pertumbuhan M2dengan biomassa masing-masing sebesar 30mg dan 80 mg dibanding media pertumbuhanlainnya. Isolat D2D2-2 memiliki pertumbuhanlebih baik pada media pertumbuhan M2 danM3 yaitu dengan biomassa masing-masingsebesar 70 mg.

Pengukuran Aktivitas SelulasePengukuran aktivitas selulase dilakukan

sebanyak dua kali ulangan terhadap aktivitasCMCase, aviselase, dan FPase (Lampiran 10,11, dan 12). Gambar 3 memperlihatkanaktivitas selulase isolat A5D4-3 pada mediapertumbuhan CMC dengan penambahanpepton (M2) dan media pertumbuhan aviseldengan penambahan pepton (M5). Pada mediapertumbuhan M2 aktivitas CMCase, aviselase,dan FPase memiliki aktivitas masing-masingsebesar 0.011, 0.015 dan 0.022 nkat/ml. Padamedia pertumbuhan M5 aktivitas CMCase,aviselase, FPase memiliki aktivitas masing-masing sebesar 0.006, 0.004 dan 0.01 nkat/ml.

Aktivitas selulsase isolat D2D2-2 padamedia pertumbuhan CMC dengan penam-bahan ekstrak khamir (M3) dan mediapertumbuhan avisel dengan penambahanekstrak khamir (M6) terlihat pada gambar 4.Pada media pertumbuhan M3 aktivitas CMC-ase, aviselase, dan FPase memiliki aktivitasmasing-masing sebesar 0.373, 0.069 dan0.219 nkat/ml. Pada media pertumbuhan M6aktivitas CMCase, aviselase, dan FPasememiliki aktivitas masing-masing sebesar0.126, 0.11 dan 0.044 nkat/ml.

Gambar 5 memperlihatkan aktivitas selulaseisolat E2D1-2 pada media pertumbuhan CMCdengan penambahan pepton (M2) dan mediapertumbuhan avisel dengan penambahanpepton (M5). Pada media pertumbuhan M2aktivitas aviselase sebesar 0.012 nkat/ml,sedangkan CMCase dan FPase tidak memilikiaktivitas. Pada media pertumbuhan M5aktivitas aviselase dan FPase masing-masingsebesar 0.005 dan 0.003 nkat/ml, sedangkanCMCase tidak memiliki aktivitas.

Biomassa (mg)MediaPertumbuhan Isolat

A5D4-3Isolat

D2D2-2Isolat

E2D1-2M1 10 40 50M2 30 70 80M3 20 70 60M4 2 12 52M5 22 32 62M6 12 52 42

Biomassa tiga isolat selulolitik padasumber karbon dan sumber nitrogenyang berbeda setelah 10 haripertumbuhan pada suhu ruang

Tabel 2

Aktivitas selulase isolat A5D4-3pada media pertumbuhan CMCdengan penambahan pepton danmedia pertumbuhan aviseldengan penambahan peptonyang diuji pada suhu 40 ºC danpH 6.5.

Gambar 3

00.0050.01

0.0150.02

0.025

CMCase Aviselase FPase

Enzim Selulase

Akt

ivit

asSe

lula

se(n

kat/

ml)

CMC Avisel

Aktivitas selulase isolat D2D2-2pada media pertumbuhan CMCdengan penambahan ekstrak khamirdan media pertumbuhan aviseldengan penambahan ekstrak khamiryang diuji pada suhu 40 ºC dan pH6.5..

Gambar 4

0

0.1

0.2

0.3

0.4

CMCase Aviselase FPase

Enzim Selulase

Akt

ivita

sse

lula

se

(nk

at/m

l)

CMC Avisel

Aktivitas selulase isolat E2D1-2pada media pertumbuhan CMCdengan penambahan pepton danmedia pertumbuhan avisel de-ngan penambahan pepton yangdiuji pada suhu 40 ºC dan pH 6.5..

Gambar 5

0

0.005

0.01

0.015

CMCase Aviselase FPase

Enzim Selulase

Akt

ivit

asS

elul

ase

(nka

t/ml)

CMC Avisel

5

PEMBAHASAN

Isolasi AktinomisetTanah memiliki komposisi mikroorga-

nisme yang sangat beragam, 10-33 % dian-taranya merupakan Aktinomiset dan genusStreptomyces merupakan genus yang sangatmelimpah. Kondisi tanah yang disukaiAktinomiset yaitu pada pH basa atau netraldan sangat sensitif pada kondisi tanah yangbersifat asam (Atlas & Bartha 1998). Habitatalami Aktinomiset yang meliputi tanah dankompos menyebabkan genus ini memilikikemampuan untuk mendegradasi selulosa (McCarthy 1987 diacu dalam Coughlan & Mayer1991 ).

Isolasi Aktinomiset dilakukan denganmenggunakan media agar-agar selektif CMCpH 7 untuk mendapatkan isolat Aktinomisetselulolitik. Isolat Aktinomiset paling banyakditemukan pada contoh tanah hutan primer(A) yaitu dengan persentase sebesar 66.67 %.Kondisi tanah yang berserasah me-mungkinkan didapatkannya isolat Aktinomisetselulolitik.

Colour GroupingBerdasarkan hasil pengamatan terhadap 63

isolat Aktinomiset yang diremajakan padamedia YMA, hanya 46 isolat yang berhasilditumbuhkan. Hal ini mungkin dikarenakanisolat Aktinomiset sebelumnya ditumbuhkanpada media agar-agar CMC dengan sumberkarbon yang minimal, sehingga isolatAktinomiset tidak mampu untuk tumbuh.

Untuk sporulasi Streptomyces mem-butuhkan media dengan rasio C:N yang tinggi(Wendisch & Kutzner 1991). Beberapa mediayang biasa digunakan yaitu: (1) media YMA;(2) media agar-agar oatmeal; (3) media agar-agar pati mineral inorganik; (4) media agar-agar gliserol-asparagin; (5) media trace saltsolution; (6) media trace elements solutionSPV-4 (Shirling & Gottlieb 1966 diacu dalamWendisch & Kutzner 1991 ; Voelskow 1988diacu dalam Wendisch & Kutzner 1991).

Dalam penelitian ini digunakan mediaYMA untuk mengelompokan warna koloniAktinomiset. Aktinomiset dapat menghasilkanpigmen yang beragam yang mewarnai strukturvegetatif dan miselia aerialnya. Selain itu jugaAktinomiset menghasilkan warna pigmenyang berdifusi. Beberapa warna pigmen yangtelah dilaporkan yaitu: (1) oranye-merah tuaatau violet; (2) merah violet-biru; (3) kuning-oranye; (4) hijau-keabu-abuan; (5) hijau; (6)merah kecoklatan-merah tua; (7) abu-abu-hitam (Wendisch & Kutzner 1991).

Berdasarkan letaknya, pigmen dibedakan atas:(1) endopigmen, yang hanya mewarnai kolonisaja; (2) eksopigmen, yang dikeluarkan kemedia. Eksopigmen bersifat larut dalam airdan berdifusi ke media.

International Streptomyces Project (ISP)melaporkan beberapa tipe warna miselia aerialpada Streptomyces, yaitu kuning, violet,merah, biru, hijau, abu-abu, dan putih(Wendisch & Kutzner 1991). Meskipun telahdilaporkan tipe warna miselia aerial padaStreptomyces, namun ada beberapa warnamiselia aerial yang tidak dapat didefinisikan.Ersya (2004) mengelompokkan warna sporaAktinomiset yang berasal dari Sumatra, Jawa,Kalimantan Timur, dan Tembagapura IrianJaya menjadi 7 kelompok warna yaitu abu-abu, putih, hitam krem, coklat, merah muda,dan merah. Isolat Aktinomiset tersebut jugamenghasilkan pigmen terdifusi yaitu kuning,coklat hitam, coklat, coklat muda, hijau tua,hijau dan krem. Dari 46 isolat yangditumbuhkan pada media YMA didapat 6kelompok koloni, yaitu merah muda, abu-abu,abu-abu tua, putih, coklat, dan hitam. Selainitu juga didapatkan tiga pigmen terdifusi,yaitu coklat tua, coklat, dan kuning.

Pengukuran indeks selulolitikPembentukan zona bening menunjukkan

bahwa selulosa yang terdapat di dalam mediadihidrolisis oleh enzim selulase menjadisenyawa yang sederhana yaitu selobiosa yangkemudian disederhanakan menjadi duamolekul glukosa (Perez et al. 2002).Pengukuran zona bening yang terbentukdisekitar koloni merupakan analisis semikuantitatif aktivitas bakteri selulolitik(Coughlan & Mayer 1991). Koloni isolat yangditumbuhkan pada media agar-agar CMCberumur 6 hari disiram dengan larutan congored 0.1 %, untuk memperjelas terbentuknyazona bening. Congo red memiliki interaksiyang kuat dengan polisakarida yangmengandung rantai ikatan β-(1 4) D-glukopiranosil (Teather & Wood 1982).

Untuk memperjelas visualisasi zonabening yang terbentuk, media agar-agardisiram dengan larutan HCl 1M yang akanmerubah warna menjadi biru sertamenghentikan aktivitas enzim (Teather &Wood 1982). Zona bening yang tidak ikutterwarnai menandakan bahwa selulosa telahterhidrolisis menjadi senyawa yang lebihsederhana oleh enzim selulase. Enzim selulasemerupakan enzim ekstraseluler, yaitu enzimyang dihasilkan di dalam sel dan dilepaskanke dalam media sehingga dapat

6

menghidrolisis makromolekul seperti selulosa,kemudian hasil hidrolisis diserap sel (Crueger& Crueger 1984).

Optimasi Pertumbuhan Isolat SelulolitikTerpilih pada Media Pertumbuhan yangBerbeda

Faktor yang mempengaruhi pertumbuhanmikrob yaitu media pertumbuhan yangdigunakan, suhu, pH, dan aerasi. Mediatumbuh yang biasa digunakan terdiri atas: (1)media sintetik; dan (2) media kompleks.Media sintetik merupakan media sederhanayang seluruh komponennya telah diketahui(Prescott et al. 1999; Madigan et al. 2000).Aktinomiset, khususnya Streptomyces,merupakan bakteri kemoorganotropik yangdapat tumbuh pada media sintetik yang hanyamengandung sumber karbon organik (misalselulosa), sumber nitrogen inorganik (NH4

+

atau NO3-), dan beberapa garam mineral

lainnya (Wendisch & Kutzner 1991).Media kompleks mengandung komponen

nutrisi yang lengkap seperti pepton, ekstrakdaging, dan ekstrak khamir. Peptonmerupakan protein hidrolisat yang berfungsisebagai sumber karbon, sumber energi, dansumber nitrogen (Prescott et al. 1999).Ekstrak khamir merupakan substrat terbaikpada sebagian mikroorganisme yang me-ngandung vitamin B dan dapat berfungsisebagai sumber nitrogen dan sumber karbon.

Hasil pengukuran biomassa (Tabel 2),menunjukkan bahwa ketiga isolat memilikipertumbuhan lebih baik ketika ditumbuhkanpada media pertumbuhan CMC dibandingkanmedia pertumbuhan avisel. Hal ini dika-renakan CMC, selulosa yang mudah larut,lebih mudah dihidrolisis dibanding aviselyang memiliki struktur kristalin. Isolat A5D4-3 dan isolat E2D1-2 tumbuh baik pada mediapertumbuhan CMC dengan penambahanpepton, isolat D2D2-2 tumbuh baik padamedia pertumbuhan CMC denganpenambahan ekstrak khamir dibandingkanmedia pertumbuhan lainnya. Hal ini me-nunjukkan meskipun Aktinomiset mamputumbuh pada media yang sederhana, namunpertumbuhannya akan lebih baik jikamenggunakan media kompleks.

Pengukuran Aktivitas SelulaseHasil pengukuran aktivitas selulase ketiga

isolat selulolitik terpilih, menunjukkan mediapertumbuhan dapat menginduksi aktivitasselulase yang berbeda pada ketiga isolatAktinomiset. Adhi et al. (1989) melaporkanStreptomyces viridosporus T7A dan S. badius

menghasilkan endoglukanase (CMCase)ketika ditumbuhkan pada media yangmenggunakan ekstrak khamir. Selain itu pula,sumber karbon yang berbeda dapatmempengaruhi aktivitas selulase yang berbedapula (Coughlan & Mayer 1991). MacKenzieet al. (1987) melaporkan S. flavogriseus danS. olivochromogenes menghasilkan selulaseyang lebih tinggi ketika ditumbuhkan padamedia xilan dibanding selulosa sebagaisumber karbon.

Hasil pengukuran aktivitas selulolitik(gambar 3, 4 dan 5) menunjukkan, aktivitasCMCase, aviselase, dan FPase lebih besarketika ditumbuhkan pada media CMC sebagaisumber karbon dibandingkan avicel. IsolatA5D4-3 memiliki aktivitas FPase lebih baikdibanding CMCase dan aviselase ketikamenggunakan media pertumbuhan CMCdengan penambahan pepton. Isolat D2D2-2memiliki aktivitas CMCase lebih baikdibanding aktivitas aviselase dan FPase ketikamenggunakan media pertumbuhan CMCdengan penambahan ekstrak khamir. IsolatED212 memiliki aktivitas aviselase lebih baikdibanding aktivitas CMCase dan FPase ketikamenggunakan media pertumbuhan CMCdengan penambahan pepton.

Berbagai kondisi dapat menginduksi kerjaenzim. Kondisi substrat yang minimummengakibatkan kerja enzim memecah substratmenjadi lambat, sedangkan pada substrat yangmelimpah memungkinkan kontak antaraenzim dengan substrat lebih besar, sehinggaakan menghasilkan produk yang lebih banyak(Prescott et al. 1999). Hal ini terjadi padaaktivitas selulolitik yang tinggi ketikaAktinomiset ditumbuhkan pada mediapertumbuhan dengan penambahan pepton atauekstrak khamir. Keberadaan pepton atauekstrak khamir menunjang pertumbuhanbakteri sehingga enzim yang dihasilkan lebihbanyak.

Hidrolisis selulase seutuhnya membu-tuhkan interaksi yang sinergis antara aktivitasendoglukanase dan eksoglukanase. Endo-glukanase aktif menghidrolisis selulosa amorfdan selulosa terlarut (CMC), sedangkaneksoglukanase aktif menghidrolisis selulosakristalin (Coughlan & Mayer 1991).Endoglukanase dan eksoglukanase akanmenghidrolisis selulosa menjadi selobiosa,kemudian β-glukosidase akan memecahselobiosa menjadi dua molekul glukosa (Perezet al. 2002). Untuk mengetahui interaksi yangsinergis antara aktivitas endoglukanase daneksoglukanase perlu dilakukan pengukuranaktivitas FPase, dengan menggunakan kertas

7

saring Whatmann no. 1 sebagai substrat.Kertas saring merupakan substrat yangmajemuk karena memiliki ujung-ujung bebasdan amorf sampai serat-serat kristalin.

Berdasarkan gambar 3, 4, dan 5, dapatterlihat bahwa hanya isolat A5D4-3 yangmemiliki enzim endoglukanase (CMCase) daneksoglukanase (aviselase) yang bekerja secarasinergis. Isolat D2D2-2 memiliki aktivitasCMCase yang tinggi namun aktivitasaviselase yang rendah sehingga memilikiaktivitas FPase yang tidak tinggi. Hal yangsama dimiliki oleh isolat E2D1-2 yang hanyamemiliki aktivitas aviselase.

SIMPULAN

Dari 50 contoh tanah didapatkan 63 isolatAktinomiset, delapan diantaranya mampumenghasilkan zona bening disekitar koloni.Dari 46 isolat yang mampu tumbuh baikdidapatkan 6 kelompok warna koloni.Penambahan pepton dan ekstrak khamir padamedia pertumbuhan CMC dapat lebih me-ningkatkan pertumbuhan ketiga isolatAktinomiset selulolitik terpilih dibandingkan(NH4)2SO4. Aktivitas selulase lebih tinggiketika CMC digunakan sebagai sumberkarbon, dibanding dengan ketika aviseldigunakan sebagai sumber karbon. Pada isolatA5D4-3, pepton menginduksi aktivitas FPase,pada isolat D2D2-2 ekstrak khamirmenginduksi aktivitas CMCase, sedangkanpada isolat E2D1-2 pepton menginduksiaktivitas aviselase.

SARAN

Perlu dilakukan pencirian karaktermorfologi, analisis DAP dan produksi pigmenmelanin untuk identifikasi lebih lanjut isolatAktinomiset yang telah didapatkan. Selain itujuga perlu dilakukan optimasi mediapertumbuhan dengan menggunakan sumberkarbon lain yang dapat menginduksi aktivitasselulase.

8

DAFTAR PUSTAKA

Adhi TP, Korus RA, Crawford DL. 1989.Production of mayor ekstrasellularenzymes during lignocellulosedegradation by two Streptomycetesin agitated submerged cultur.Appl Environ Microbiol 5: 1165-1168.

Alam MZ, Manchur MA, Anwar MN. 2004.Isolation, purification,characterization of cellulolyticenzymes produced by Streptomycesomiyaensis. J Biol Sci 10: 1647-1653.

Atlas RM, Bartha R. 1998. MicrobialEcology. Ed ke-4.Benjamin/Cummings Publishing.

Coughland MP, Mayer F. 1991. The cellulosedecomposing bacteria and theirenzyme systems. Di dalam BalowsA, Triper HG, Dworkin M, HarderW, Schleifer KH, editor. TheProkaryotes, A Handbook on Biologyof Bacteria: Ecophysiology,Isolation, Identification,Application. Vol I. NewYork: Springer Verlag. Hlm460-516.

Crueger W, Crueger A. 1984. Biotechnology:A Textbook of IndustriMicrobiology. Brock TD, editor.Sunderland: MinauerAssociates.

Dybkaer R. 2001. Unit ”katal” for catalyticactivity. J Pure Appl Chem 73: 927-931.

Ersya DA. 2004. Pencirian Actinomycetesisolat lokal: colour grouping,produksi pigmen melanin,dan resistensi antibiotik[skripsi]. Bogor: FakultasMatematika dan Ilmu PengetahuanAlam, Institut Pertanian Bogor.

Haki GD, Rakshit SK. 2003. Developments inindustrially important thermostableenzymes: a review. BioresourceTechnol 89: 17-34.

Holt et al. 1994. Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology . Ed ke-9.Baltmore: Williams and wilkins.

Jang HD, Chang KS. 2005. Thermostablecellulase from Streptomyces sp. :scale up production in afermenter. Biotechnol Letters 27:239-242.

Li X, Gao P. 1997. CMC-liquefying enzyme alow molecular mass initialcellulose decomposing cellulaseresponsible for fragmentation fromStreptomyces sp. LX. J ApplMicrobiol 83: 59-66.

Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000.Biology of Microorganisms. Ed ke-9.New Jersey: Prentice Hall.

MacKenzie CR, Bilous D, Schneider H,Johnson KG. 1987. Induction ofcellulolytic and xylanolytic enzymesystems in Streptomyces sp. ApplEnviron Microbiol 53: 2835-2839

Miller GL. 1959. Dinitrosalisic assay. AnalChem 31: 426-428.

Okada G. 1999. A novel concept for theenzymatic degradation mechanism ofnative cellulose. Di dalam: Ohmiyaet al., editor. Genetics Biochemistryand Ecology of CelluloseDegradation Cel. Tokyo: UniPublisher. Hlm 76-85.

Perez J, Dorado JM, Rubia T de la, MartinezJ. 2002. Biodegradation andbiochemical treatments of cellulose,hemicellulose, and lignin: anoverview. Int Microbiol 5:53-63.

Prescott LM, Harley JP, Klein DA. 1999.Microbiology. New York: Mc GrawHill.

Teather RM, Wood PJ. 1982. Use of congored polysacharide interactions inenumeration and characterization ofcellulolytics bacteria from the bovinerumen. Appl Environ Microbiol 43:777-780.

Walter S, Schrempf H. 1996. Physiologicalstudies of cellulase (avicelase)synthesis in Streptomyces reticuli[catatan penelitian]. Appl EnvironMicrobial 62: 1065-1069.

Wendisch FK, Kutzner HJ. 1991. The familyStreptomycetaceae. Di dalamBalows A, Triper HG, Dworkin M,Harder W, Schleifer KH, editor. TheProkaryotes, A Handbook on Biologyof Bacteria: Ecophysiology,Isolation, Identification, Application.Vol I. New York: Springer Verlag.Hlm 460-516.

9

LAMPIRAN

10

Lampiran 1 Komposisi media agar-agarMedia agar-agar CMC (100 ml)

Komposisi Jumlah (gram)CMC 1MgSO4

.7H2O 0.02KNO3 0.075K2HPO4 0.05FeSO4

.7H2O 0.002CaCl2

.2H2O 0.004Pepton 0.2Agar-agar 1.5

Komposisi media agar-agar YM (100 ml)Komposisi Jumlah (gram)Ekstrak khamir 0.4Ekstrak malt 1Glukosa 0.4Agar-agar 1.5

11

Lampiran 2 Komposisi media pertumbuhanMedia pertumbuhan 1 (M1) (100 ml)

Komposisi Jumlah (gram)CMC 1MgSO4

.7H2O 0.02KNO3 0.075K2HPO4 0.05FeSO4

.7H2O 0.002CaCl2

.2H2O 0.004(NH4)2SO4 0.2

Media pertumbuhan 2 (M2) (100 ml)Komposisi Jumlah (gram)CMC 1MgSO4

.7H2O 0.02KNO3 0.075K2HPO4 0.05FeSO4

.7H2O 0.002CaCl2

.2H2O 0.004Pepton 0.2

Media pertumbuhan 3 (M3) (100 ml)Komposisi Jumlah (gram)CMC 1MgSO4

.7H2O 0.02KNO3 0.075K2HPO4 0.05FeSO4

.7H2O 0.002CaCl2

.2H2O 0.004Ekstrak khamir 0.2

Media pertumbuhan 4 (M4) (100 ml)Komposisi Jumlah (gram)Avisel 1MgSO4

.7H2O 0.02KNO3 0.075K2HPO4 0.05FeSO4

.7H2O 0.002CaCl2

.2H2O 0.004(NH4)2SO4 0.2

Media pertumbuhan 5 (M5) (100 ml)Komposisi Jumlah (gram)Avisel 1MgSO4

.7H2O 0.02KNO3 0.075K2HPO4 0.05FeSO4

.7H2O 0.002CaCl2

.2H2O 0.004Pepton 0.2

12

Media pertumbuhan 6 (M6) (100 ml)Komposisi Jumlah (gram)Avisel 1MgSO4

.7H2O 0.02KNO3 0.075K2HPO4 0.05FeSO4

.7H2O 0.002CaCl2

.2H2O 0.004Ekstrak khamir 0.2

13

y = 2.1276x - 0.0837R2 = 0.9987

0

0.2

0.40.6

0.8

1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Konsentrasi Glukos a (m g/ml)

Ab

sorb

ans

i

Lampiran 3 Metode pengujian aktivitas CMCase (Miller 1959)Pereaksi Blanko (ml) Kontrol (ml) Sampel (ml)

Substrat CMC 1 % 1 1 1Ekstrak kasar enzim - - 1

Inkubasi pada suhu 40 ºC selama 2 jamAkuades 1 - -

DNS 2 2 2Ekstrak kasar enzim - 1 -

Larutan dikocok dan dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 15 menitLarutan didinginkan lalu diukur absorbansi pada panjang gelombang 540 nm

Lampiran 4 Metode pengujian aktivitas aviselase (Okada et al. 1999)Pereaksi Blanko (ml) Kontrol (ml) Sampel (ml)

Substrat Avisel 2 % 1 1 2Ekstrak kasar enzim - - 2

Inkubasi pada suhu 40 ºC selama 2 jamReaksi dihentikan dengan penambahan 20 μl NaOH 2M, kemudian disentrifugasi pada

kecepatan 1500 xg selama 15 menit, sebanyak 2 ml larutan ditambahkan DNSAkuades 1 - -

DNS 2 2 2Ekstrak kasar enzim - 1 -

Larutan dikocok dan dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 15 menitLarutan didinginkan lalu diukur absorbansi pada panjang gelombang 540 nm

Lampiran 5 Metode pengujian aktivitas FPase (Alam et al. 2004)Pereaksi Blanko Kontrol Sampel

Substrat kertas saringWhatmann n0.1 (1x 6

cm)

1 1 1

Ekstrak kasar enzim - - 1Inkubasi pada suhu 40 ºC selama 2 jam

Akuades 1 ml - -DNS 2 ml 2 ml 2 ml

Ekstrak kasar enzim - 1 ml -Larutan dikocok dan dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 15 menit

Larutan didinginkan lalu diukur absorbansi pada panjang gelombang 540 nm

Lampiran 6 Kurva standar glukosa

14

Lampiran 7 Isolat Aktinomiset yang diisolasi dari contoh tanah dengan menggunakanmedia agar-agar CMC

No ContohTanah

JumlahMikrob

(105)Isolat No Contoh

Tanah

JumlahMikrob

(105)Isolat

1 A1D1 17 A1D1-1A1D1-2A1D1-4

27 D1D3 23 -

2 A1D2 18 - 28 D1D4 22 D1D4-2D1D4-3

3 A1D3 19 A1D3-1A1D3-2A1D3-3

29 D1D5 31 -

4 A1D4 14 - 30 D2D1 12 -

5 A1D5 10 - 31 D2D2 15 D2D2-2

6 A2D1 12 - 32 D2D3 17 -

7 A2D2 15 - 33 D2D4 20 D2D4-2D2D4-3D2D4-4

8 A2D3 20 - 34 D3D1 20 D3D1-1

9 A2D4 22 - 35 D3D2 17 D3D2-1D3D2-3D3D2-4

10 A2D5 16 A2D5-2A2D5-3

36 D3D3 17 D3D3-1

11 A3D1 17 A3D1-1 37 D3D4 10 -

12 A3D2 29 A3D2-1 38 D4D1 9 D4D1-2

13 A3D4 10 - 39 D4D2 9 D4D2-1D4D2-4

14 A3D5 35 - 40 D4D5 30 -15 A4D1 36 A4D1-1

A4D1-2A4D1-3A4D1-4A4D1-5

41 D5D1 25 D5D1-4

16 A4D2 24 A4D2-1 42 D5D2 9 -

17 A4D3 32 A4D3-1A4D3-2A4D3-3A4D3-5A4D3-6A4D3-7

43 D5D3 7 -

15

No ContohTanah

JumlahMikrob

(105)Isolat No Contoh

Tanah

JumlahMikrob

(105)Isolat

18 A4D4 29 A4D4-1A4D4-2A4D4-3

44 E1D1 10 E1D1-1

19 A4D5 13 A4D5-1A4D5-2A4D5-3A4D5-5

45 E1D2 9 -

20 A5D1 5 A5D1-1A5D1-2A5D1-3

46 E1D3 15 -

21 A5D2 5 A5D2-1A5D2-2

47 E1D4 10 -

22 A5D3 11 A5D3-1A5D3-2A5D3-5

48 E1D5 9 E1D5-2

23 A5D4 17 A5D4-1A5D4-2A5D4-3

49 E2D1 7 E2D1-1E2D1-2

24 A5D5 10 A5D5-1A5D5-2

50 E2D2 12 -

25 D1D1 21 -

26 D1D2 7 D1D2-1D1D2-2

16

Lampiran 8 Pengelompokkan warna miselia Aktinomiset yang ditumbuhkan pada media YMAselama 14 hari pada suhu ruang

No Warna Isolat No Warna Isolat No Warna Isolat1 Merah muda A1D1-1 17 Hitam A4D3-3 33 D2D4-22 A4D1-2 18 Abu-abu A1D1-2 34 D3D1-13 A4D1-3 19 A1D1-4 35 Putih A5D1-14 A4D1-4 20 A1D3-1 36 A5D1-35 A4D1-5 21 A2D5-2 37 A5D3-16 A4D2-1 22 A2D5-3 38 A5D3-57 A4D3-5 23 A3D1-1 39 D1D4-38 A4D3-6 24 A4D3-1 40 D2D4-49 A4D3-7 25 A4D4-2 41 D3D2-110 A5D4-1 26 A4D5-1 42 D3D2-411 A5D4-2 27 A4D5-2 43 D4D2-412 D1D2-1 28 A5D2-2 44 E2D1-213 D2D2-2 29 A5D3-2 45 Abu-abu tua A2D4-114 coklat A4D4-3 30 A5D4-3 46 A4D1-115 D1D2-2 31 A5D5-116 D3D3-1 32 D1D4-2

17

Lampiran 9 Zona bening yang terbentuk di sekitar koloni

Keterangan: (a) Isolat A2D5-2; (b) Isolat A5D2-2; (c) Isolat A5D4-3; (d) Isolat D1D4-3; (e) IsolatD2D2-2; (f) Isolat D3D3-1; (g) Isolat D4D2-4; (h) Isolat E2D1-2

(a) (b) (c) (d) (e)

(f) (g) (h)

18

Lampiran 10 Aktivitas selulase isolat A5D4-3 yang ditumbuhkan pada media pertumbuhan denganpenambahan pepton

Enzim Sumber Karbon Aktivitas Selulase(nkat/ml)

CMCase CMC 0.011Avisel 0.006

Aviselase CMC 0.015Avisel 0.004

FPase CMC 0.022Avisel 0.01

Lampiran 11 Aktivitas selulase isolat D2D2-2 yang ditumbuhkan pada media pertumbuhan denganpenambahan ekstrak khamir

Enzim Sumber Karbon Aktivitas Selulase(nkat/ml)

CMCase CMC 0.373Avisel 0.126

Aviselase CMC 0.069Avisel 0.011

FPase CMC 0.219Avisel 0.044

Lampiran 12 Aktivitas selulase isolat E2D1-2 yang ditumbuhkan pada media pertumbuhan denganpenambahan pepton

Enzim Sumber Karbon Aktivitas Selulase(nkat/ml)

CMCase CMC 0Avisel 0

Avicelase CMC 0.012Avisel 0.005

FPase CMC 0Avisel 0.0003