EXPRESION, PURIFICACION PARCIAL Y ESTUDIOS

COMPUTACIONALES DE LA IDShr PRODUCIDA EN Pichia pastoris

HOMERO SAENZ SUAREZ

TESIS DE GRADO PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO

DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

Luis Alejandro Barrera A. Ph.D, Director

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE POSGRADO

Bogotá DC

Diciembre de 2005

ii

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946.

"La Pontificia Universidad Javeriana no se hace responsable por los conceptos,

criterios, opiniones y conclusiones expresados por sus alumnos, solo velará porque el

trabajo no tenga ataques personales y únicamente se vea en él, el anhelo de buscar la

verdad y la justicia".

iii

EXPRESION, PURIFICACION PARCIAL Y ESTUDIOS

COMPUTACIONALES DE LA IDShr PRODUCIDA EN Pichia pastoris

HOMERO SAENZ SUAREZ APROBADO: ___________________________ Luis Alejandro Barrera A Ph.D Director

___________________________ Julio Delgado Ph.D Jurado 1

___________________________ Felipe García Ph.D Jurado 2

___________________________

Patricia Landázuri Ph.D Jurado 3

___________________________ Orlando Acevedo Ph.D Jurado 4 ___________________________ Ramón Fayad Ph.D Jurado 5

iv

A José Alejandro y Marco Antonio Quienes Constituyen los Pilares que Soportan mi Lucha Diaria por la Vida

v

AGRADECIMIENTOS

El autor desea expresar sus agradecimientos a: El Estado Venezolano en la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” por el financiamiento para mi formación doctoral. La Pontificia Universidad Javeriana en el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) por ofrecerme la oportunidad de adquirir conocimiento y experiencias que han permitido mi crecimiento personal. El Dr. Luis Alejandro Barrera por su voluntad de aceptarme como su estudiante. El Dr. Leonardo Lareo, quien dirigió gran parte de este trabajo. Linda, mi apoyo incondicional Mi familia que me ofrendó gran parte de su tiempo. Mis compañeros de doctorado Raúl, Patricia y Olga Yaneth por su alto sentido de compañerismo. Los miembros del IEIM, los actuales y los ausentes, por su generosidad. Belarmino Sosa y familia, las manos siempre amigas, aun con la distancia. Fidelia y Teresa, quienes atendiendo el llamado Divino tuvieron que marcharse. Finalmente, a Dios Todopoderoso que me permitió llegar con vida a este día.

vi

INDICE GENERAL

PORTADA i

NOTA ACLARATORIA ii

HOJA DE APROBACION iii

AGRADECIMIENTOS iv

DEDICATORIA v

INDICE GENERAL vi

INDICE DE TABLAS x

INDICE DE FIGURAS xii

RESUMEN xiii

ABSTRACT

INTRODUCCION 1

OBJETIVOS 4

REVISION DE LITERATURA 5

Errores Innatos del Metabolismo 5

Mucopolisacaridosis Tipo II o Síndrome de Hunter 6

Estructura del Gen de la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa 10

Ensayos Terapéuticos para el Síndrome de Hunter 10

Terapia de Reemplazo Enzimático 11

Sistemas de Expresión de Proteínas Recombinantes 15

La Enzima Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa 20

Glicosilación de Proteínas 24

Aplicación de Programas Computacionales en el Análisis de Macromoléculas 29

MATERIALES Y METODOS 31

SEPARACIÓN DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA

RECOMBINANTE (IDShr) EXPRESADA EN Pichia pastoris

Y Escherichia coli 31

Determinación de la Concentración de Proteínas 31

Determinación de Actividad Enzimática de la IDShr 31

Determinación de Actividad Proteolítica 32

vii

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida 32

Western Blot 33

Producción de Anticuerpos Policlonales contra Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa

Humana Recombinante (IDShr) 33

Preparación de una Columna de Afinidad (Superosa 6 GP-anti IDShr) 34

Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris 34

Concentración de Proteínas por Liofilización 35

Dializado de Muestras para Actividad IDShr 35

Ruptura Celular de Pichia pastoris 35

Separación de la IDShr Expresada en Escherichia coli. 36

EXPRESION DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA

RECOMBINANTE (IDShr) EN Escherichia coli EMPLEANDO EL SISTEMA

DE FUSION DE GENES GLUTATION S-TRANSFERASA (GST) 37

Plásmidos 37

Microorganismos 37

Purificación de los plásmidos 37

Separación de la Banda del cDNA de la IDSh del pUC13-IDSh 38

Digestión del plásmido pGEX 3X 39

Desfosforilación del pGEX 3X-IDSh Digerido 39

Obtención del constructo pGEX 3X-IDSh 39

Preparación de Células Competentes de E. coli 39

Transformación en E. coli competentes 40

Bancos de E. coli 40

Expresión de la IDShr en Escherichia coli JM109-pGEX 3X. 41

ANALISIS COMPUTACIONAL DE LA ENZIMA IDURONATO 2 SULFATO

SULFATASA HUMANA (IDSh) 41

Acceso Computacional a la Secuencia de IDSh 41

Accesibilidad, Hidrofobicidad, Flexibilidad 41

Punto Isoeléctrico y Peso Molecular 41

Sitios de Fosforilación 41

Sitios de Glicosilación 41

viii

Bloques y Prints 42

Perfil de Antigenicidad 42

Alineamientos 42

Estructura Secundaria 42

Estructura Terciaria 42

Modelo Estructural del Sitio Activo 43

Análisis de las Mutaciones Puntuales 43

RESULTADOS 44

SEPARACIÓN DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA

RECOMBINANTE (IDShr) EXPRESADA EN Pichia pastoris Y Escherichia

coli 44

Determinación de la Concentración de Proteínas 44

Determinación de Actividad Enzimática de la IDShr 44

Producción de Anticuerpos Policlonales Contra la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa

Humana Recombinante (IDShr) 44

Preparación de una Columna de Afinidad (Superosa 6 GP-anti IDShr) 49

Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris 50

Separación de la IDShr Expresada en Escherichia coli 59

EXPRESION DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA

RECOMBINANTE (IDShr) EN Escherichia coli EMPLEANDO EL SISTEMA

DE FUSION DE GENES GLUTATION S-TRANSFERASA (GST) 64

ANALISIS COMPUTACIONAL DE LA IDURONATO 2 SULFATO SULFATASA HUMANA (IDSh) 64

Hidrofobicidad, Accesibilidad y Flexibilidad. 65

Punto Isoeléctrico y Peso Molecular 65

Sitios de Fosforilación 65

Sitios de Glicosilación 69

Bloques y Prints 71

Alineamientos 71

Estructura Secundaria 73

Estructura Terciaria 84

ix

Modelo Estructural y Funcional para el Sitio Activo 89

Cálculo del “Root Mean Square” (RMS) 94

Perfil de Antigenicidad 94

Modelo de Estructura Terciaria de la IDSh Con la Secuencia del Péptido Señal 96

Análisis de las Mutaciones Puntuales 103

Efecto de las Mutaciones Estudiadas Sobre la Estructura Terciaria de la IDSh 109

DISCUSION 111

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 129

BIBLIOGRAFIA 131

x

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis (MPS) 7

Tabla 2. Efecto de Procesos de Congelación-Descongelación sobre

la Actividad de IDS plasmática 45

Tabla 3. Concentración y Título de Anticuerpos Policlonales Anti-IDShr

(IgG) Obtenidos en Conejo 46

Tabla 4. Cuadro Resumen de Ensayo para Demostrar Capacidad de

Inmunoreconocimiento de una Columna de Superosa 6 GP anti-IDShr 49

Tabla 5. Condiciones Experimentales de los cultivos M-7 y M-13

de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 50

Tabla 6. Resultados Obtenidos para Algunos Parámetros de los Cultivos

M-7 y M-13 de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 51

Tabla 7. Niveles de Proteínas Durante el Proceso de Ultrafiltración de

Sobrenadantes de Cultivos de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 51

Tabla 8. Efecto de la Diálisis Sobre la Actividad IDShr en las Diferentes

Fracciones Obtenidas Durante el Proceso de Ultrafiltración 53

Tabla 9. Concentración de Proteínas Mediante Liofilización y su Efecto

Sobre la Actividad de la IDShr en Fracciones Obtenidas por Ultrafiltración. 53

Tabla 10. Actividad Enzimática de Fracciones de IDShr Separadas por

Cromatografía de Afinidad (Superosa 6 GP-anti-IDS) 54

Tabla 11. Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris

GS115 pPIC9-IDS/28 57

Tabla 12. Cuantificación Mediante ELISA de IDShr Expresada en

Pichia pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 Durante las Fases del Proceso de

Ultrafiltración 58

Tabla 13. Actividad IDShr en cultivos de E. coli JM109-pUC-13/IDS en

tres niveles de escalado 61

Tabla 14. Niveles de Proteínas y Actividad IDshr en E. coli

JM 109-pUC 13/IDS Durante el Proceso de Ultrafiltración de

Sobrenadantes y en Lisados 61

xi

Tabla 15. Separación Cromatográfica de IDShr Expresada en E. coli 62

JM 109 pUC-13/IDS

Tabla 16. Separación de IDShr Expresada en E. coli JM109-pUC-13/IDS 63

Tabla 17. Predicción Computacional de la Estructura Secundaria de la

IDSh Mediante 11 Programas de Predicción de Estructura de Proteínas 73

Tabla 18. Aminoácidos del Sitio Activo de ARSA, ARSB e IDS 90

Tabla 19. Relación Entre la Severidad Fenotípica del Síndrome de Hunter y la Naturaleza y Ubicación del Aminoácido Mutado

en 114 Mutaciones Puntuales de la IDSh 106

xii

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Algunos Síntomas Asociados al Síndrome de Hunter 9

Figura 2. Mecanismo de Conversión de Císteína a Formil-glicina 21

Figura 3. Procesamiento de la IDS 21

Figura 4: Detección Mediante Western-blot. de la IDShr Expresada en E. coli 23

Figura 5. Detección Mediante Western-blot de la IDShr Expresada in

P. pastoris 24

Figura 6. Electroforesis del Anticuerpo Policlonal anti-IDShr 46

Figura 7. Especificidad del Anticuerpo Policlonal Anti-IDShr 47

Figura 8. Western blot de Sobrenadante de E. coli 47

Figura 9. Cromatografía de Afinidad para la IDShr Expresada

en P. pastoris 48

Figura 10. Electroforesis PAGE-SDS 12% de Sobrenadante de

Cultivo de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 e IDShr pura (TKT) 52

Figura 11. Cromatograma de Exclusión Molecular de Retentado de

Ultrafiltración de Cultivos de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 55

Figura 12. Cromatografía de Afinidad para la Separación IDShr

Expresada en P. pastorisGS115 pPIC9-IDS/28 56

Figura 13. Cromatograma de Exclusión Molecular de Retentado de

Ultrafiltración de Cultivos de E. coli JM 105 pUC13-IDS/28 60

Figura 14. Secuencia aminoacídica de la IDSh 64

Figura 15. Perfil de Hidrofobicidad de la IDSh 66

Figura 16. Perfil de Accesibilidad de la IDSh 67

Figura 17. Perfil de Flexibilidad de la IDSh 68

Figura 18. Sitios Potenciales de Fosforilación (Presencia de T y Y) en la IDSh 69

Figura 19. Sitios Potenciales de O-glicosilación (Presencia de T, S o Y) en la

IDSh 70

Figura 20. Sitios potenciales de N-glicosilación en la IDSh 70

Figura 21. Alineamiento de la IDSh con la Arilsulfatasa B 72

Figura 22. Alineamiento de la IDSh con la Arilsulfatasa A 72

xiii

Figura 23. Predicción de la Estructura Secundaria de IDSh. 82

Figura 24. Predicción de un Fragmento de la Estructura Terciaria de la IDSh. 85

Figura 25. Predicción de un Segmento de la Estructura Terciaria de la IDSh. 85

Figura 26. Modelo Propuesto para la Estructura Terciaria de la IDSh 86

Figura 27. Predicción de la Estructura Terciaria de la IDSh. 87

Figura 28. Sitios Potenciales N-glicosilación en la Forma Madura de la IDSh 88

Figura 29. Ubicación de los Sitios potenciales N-glicosilación en

la forma madura de la IDSh. 89

Figura 30. Localización de los Aminoácidos (rojo/azul) que

Componen el Sitio Activo de la IDSh. 91

Figura 31. Molécula de Heparan Sulfato 92

Figura 32. Heparan Sulfato en el Sitio Activo de la IDSh. 93

Figura 33. Ubicación del Manganeso en el Sitio Activo de la IDSh. 94

Figura 34. Perfil de Antigenicidad de la IDSh 95

Figura 35. Ubicación en el Modelo de Estructura Terciaria de la IDSh de Cuatro Péptidos Diseñados para la Producción de Anticuerpos IgY anti-IDShr 96

Figura 36. IDSh conteniendo el Péptido Señal 98

Figura 37. Perfil de Hidrofobicidad del α-MF 99

Figura 38. Perfil de Hidrofobicidad del Péptido Señal. 99

Figura 39. Perfil de Hidrofobicidad de la IDSh con el Péptido Señal. 100

Figura 40. Perfil de Flexibilidad del Péptido Señal 100

Figura 41. Perfil de Flexibilidad de la IDSh con Péptido Señal 101

Figura 42. Western blot de Sobrenadantes y Lisados de P. pastoris pPIC-9/IDS

del cultivo M-22 101

xiv

RESUMEN

Con el propósito de mejorar las condiciones de expresión y purificación de la IDShr

expresada en P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 y E. coli pUC 13-IDS/28 se adelantó el

presente trabajo que contempló una parte experimental y otra computacional. Con relación a

la parte experimental se empleó como método de detección de la IDShr una prueba

fluorométrica con el uso del sustrato MU-αIdoA-2S, que permitió comprobar que la IDShr

expresada en esos modelos biológicos era activa. Empleando como antígeno IDShr

purificada y donada por TKT, se obtuvo en conejos un anticuerpo policlonal anti-IDShr, el

cual fue empleado para la elaboración de una columna de afinidad, usada durante el proceso

de purificación.

Se realizaron 20 cultivos P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 a nivel de biorreactor con

volúmenes de trabajo de 1.0 a 3.0 litros. Los cultivos fueron centrifugados y los

sobrenadantes sometidos a ultrafiltración empleando secuencialmente membranas para

exclusión de moléculas de 100 y 30 KDa. Los retentados de esta manera obtenidos fueron

corridos en cromatografía de exclusión molecular y los picos con actividad IDShr se

sometieron a cromatografía de afinidad. Las fracciones obtenidas con un nivel de siete

purificaciones y menos del 2% de recuperación mostraron actividades enzimáticas hasta de

58,78 nmol/h/mg de proteína, es decir, más de 4 y 9 veces los valores de referencia del

laboratorio del IEIM para la IDSh plasmática y leucocitos. Sin embargo, estos valores no

cumplen las expectativas para la producción de la enzima recombinante en cantidades

clínicamente útiles. La cuantificación de IDShr por ELISA, mostró que menos del 1%

corresponde a IDShr. Lo anterior demuestra que el nivel de expresión en P. pastoris fue bajo.

Igualmente en E. coli pUC 13-IDS/28 los niveles de actividad y expresión fueron bajos. En

los dos casos más del 60% de las proteínas totales se encontraron en el ultrafiltrado final

(menor a 30 KDa) y presentaron actividad IDShr, lo cual posiblemente se deba a actividad

proteolítica que genera fragmentos que mantienen parte del sitio activo y pueden presentar

actividad enzimática

En busca de mejorar el sistema de expresión fue clonado el cDNA de la IDSh empleando el

plásmido de expresión pGEX 3X y se expresó la IDShr en E. coli JM109 bajo el sistema

xv

GST, lográndose obtener 17.28 ng de IDShr/mg de proteína, el paso siguiente lo constituye la

purificación de la enzima por cromatografía de afinidad.

El análisis computacional permitió la obtención de información de la IDSh acerca de sus

perfiles de hidrofobicidad, flexibilidad, accesibilidad y antigenicidad, punto isoeléctrico,

peso molecular, sitios potenciales de fosforilación, O y N-glicosilación, prints, bloques y

alineamientos con otras moléculas con similaridades a la IDSh. Esta información fue

empleada para la elaboración de modelos computacionales de predicción de las estructuras

secundaria, terciaria y sitio activo. El modelo de estructura terciaria permitió el diseño

exitoso de péptidos específicos para la producción de anticuerpos IgY anti-IDShr.

Se logró establecer que el constructo pPIC 9-IDS/28 contiene los 25 residuos del péptido

señal y los 8 aminoácidos del propéptido. Estos residuos debieron ser eliminados, pues el

constructo contiene la señal de secreción α-MF, constituyen una zona altamente hidrofóbica

que cubre la entrada al bolsillo que contiene los aminoácidos que constituyen el sitio activo.

Lo anterior permite explicar los bajos niveles de expresión de IDShr, dado que esos residuos

adicionales deben alterar la conformación de la enzima recombinante con consecuencias

directas en su plegamiento. Al no encontrarse correctamente plegada la proteína es retenida,

no puede abandonar el retículo endoplásmico y es factible que se degrade a nivel de los

proteosomas. Se lisaron células de P. pastoris y se encontraron intracelularmente actividades

hasta de 4.24 nmol/h/mg de proteína, en un cultivo que en los sobrenadantes había sido

detectada actividad IDShr de 3.25 nmol/h/mg. Algunas moléculas pueden escapar al sistema

de control y son secretadas. Dos o más de estas moléculas pueden asociarse por las regiones

hidrofóbicas y este tipo de asociaciones explican la presencia, en Western blot de

sobrenadantes, de bandas correspondientes a pesos aproximados a 120 KDa.

El análisis de las mutaciones puntuales asociadas al modelo de estructura terciaria permitió

contribuir al establecimiento de una relación genotipo-severidad de la enfermedad.

Palabras Clave: IDShr, Hunter, Estructura terciaria, P. pastoris, E. coli

xvi

ABSTRACT This work was carried out in order to improve the expression conditions and purification of

the hrIDS in and E. coli JM109/pUC13-IDS-28. The work comprises two parts an

experimental and a computational one. In relation to the experimental part, a fluorometric

test using MU-αIdoA-2S as substrate was used for the detection of the hrIDS, this test was

used in order to check that the hrIDS expressed in those biological models was biologically

active. Using as antigen the purified hrIDS (donated by TKT), a polyclonal antibody against

α-hrIDS was obtained in rabbit, this was used to make an affinity chromatography column,

that was employed in the purification trials.

Twenty cultures of P. pastoris GS115/pPIC9-IDS-28 were carried out used working volumes

from 1.0 to 3.0 liters. The supernatants were sequentially ultra-filtrated, using membranes

with molecular exclusion between 30 and 100 kDa. The retained fractions were resolved in

molecular size exclusion chromatography and the collected material showing hrIDS activity

were submitted to affinity chromatography. The obtained fractions with a purity degree of

seven and less than 2% recovery showed enzymatic activities up to 58.78 nmol/h/mg of

protein, that is to say, more than 4 and 9 times our reference values for the hIDS in plasma

and leukocytes. However, these values do not meet the expectations for the production of the

recombinant enzyme in quantities clinically useful. The ELISA quantification of hrIDS,

showed that less than 1% corresponds to hrIDS. This demonstrates that the expression level

in P. pastoris was low. In E. coli/pUC13-IDS-28 the activity levels and expression were low.

In the two cases more than 60% of the total proteins with hrIDS activity were in a fraction of

less than 30 KDa,. These active fragments could be possibly due to proteolitic action, which

generate peptides that retain part of the active site of the enzyme.

In search of improving the expression system, the cDNA of the hIDS was cloned using the

expression vector pGEX 3X. The construct (pGEX 3X-IDS) was transformed and expressed

in JM109 under the GST system, allowing us to obtain 17.28 ng hrIDS/mg of protein.

The computational analysis allowed us to obtain the information about the hydrophobicity,

flexibility, accessibility, antigenicity profiles and isoelectric point, molecular weight,

xvii

potential sites of phosphorilation, O- and N-glicosilación of hIDS, prints, blocks and

alignments with other molecules with some similarities to the hIDS. This information was

employed for the elaboration of computational models and for the prediction of the

secondary, tertiary and active site structures.

The terciary structure pattern allowed the successful design of specific peptides for the

production of IgY antibodies against hrIDS.

It was established that the construct pPIC9-IDS-28 contains the 25 aminoacids of signal

peptide and the 8 amino acids of the pro-peptide. Those residues must be eliminated from the

construct because it contains the signal of secretion of α-MF and for that reason constitute a

highly hydrophobic area that may hinder the entrance of the substrate to the pocket that

contains the amino acids that constitute the active site. Thes findings may explain the low

level of expression of hrIDS, because those additional residues should alter the conformation

of the recombinant enzyme leading to an inappropriate folding. When the protein is not

correctly folded it is retained within the endoplasmic reticulum and it is possibly digested at

the proteosome. P. pastoris cells were lised and we found intracellular activities up to 4.24

nmol/h/mg, were found whereas hrIDS activity in the supernatant was 3.25 nmol/h mg. We

then postulate that some molecules may escape from the control system and are released

from the cell. Two or more of these molecules can be associated through the hydrophobic

regions which would explains the presence, in the supernatants Western-Blot, several bands

of a MW close to 120 kDa.

The analysis of the point mutations, and its affection the tertiary structure, allowed to draw

some retarlations between genotype and the severity of the disease .

Keywords: hrIDS, Hunter, Structures third, P. pastoris, E. coli

INTRODUCCION

En el Síndrome de Hunter o mucopolisacaridosis tipo II (MPS II) (McK 309900),

existe deficiencia de la enzima Iduronato 2-Sulfato-Sulfatasa (IDS) (E.C. 3.1.6.13),

ocasionando con ello, acumulación tisular de heparán sulfato y dermatán sulfato,

además de excreción urinaria de los mencionados glicosaminoglicanos. Las

consecuencias de ésta deficiencia enzimática se traducen en cuadros clínicos con facies

toscas, disostosis múltiple, deformidades esqueléticas, hepatoesplenomegalia, estatura

corta, hipertensión pulmonar, alteraciones en el miocardio, retardo mental y muerte

prematura (1).

En esta enfermedad, como en otros errores innatos del metabolismo, el defecto se halla

a nivel del gen que codifica para la enzima, lo cual la convierte en una patología

intratable mediante la terapéutica convencional. Por consiguiente, el manejo de la MPS

II, tradicionalmente ha sido dirigido a tratar de corregir las manifestaciones clínicas de

la enfermedad. En tal sentido se ha utilizado, el uso de audífonos, fisioterapia y terapia

ortopédica. Sin embargo, el tratamiento ideal para la MPS II, como para la mayoría de

los errores innatos del metabolismo, debe ser aquel que pueda implementarse en etapas

tempranas de la vida, lo cual permitirá prevenir las secuelas a largo plazo. En este

sentido, dada la urgente necesidad humana en que se ha convertido la búsqueda de

nuevas medidas terapéuticas para enfermedades corrientemente intratables, como las

genéticas, laboratorios académicos, farmacéuticos y de biotecnología orientan sus

intereses, en gran medida, en el estudio de alternativas clínicas para los pacientes con

este tipo de patologías. Con relación a esto, se ha tratado a los pacientes, mediante

infusión de plasma normal, sin embargo, dicha terapia ha resultado muy costosa.

Adicionalmente, se ha probado el transplante alogénico de médula ósea, lo cual ha

permitido la corrección metabólica en algunos tejidos, sin embargo, la escasa

disponibilidad de donantes, las complicaciones inmunológicas, la alta tasa de mortalidad

de los pacientes transplantados y la poca eficiencia en la prevención de la progresión del

deterioro neurológico en pacientes con fenotipo severo, ha limitado su aplicación.

2

Los hallazgos biotecnológicos de los últimos años, han proporcionado la base

experimental para implementar estudios conducentes a buscar el desarrollo de

terapéuticas tales como reemplazar los genes defectuosos, es decir, terapia génica o

bien, proveer la enzima o proteína deficiente a los tejidos en los cuales es deficiente, es

decir, terapia de reemplazo enzimático (TRE).

La terapia de reemplazo enzimático ha sido exitosa en el tratamiento de enfermedades

como la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) para la cual se emplea la

adenosina deaminasa (AD) de bovino, la enfermedad de Gaucher tipo I en la cual se

utiliza la β-glucocerebrosidasa, la enfermedad de Fabry en cuyo caso se le proporciona

al paciente la α-Galactosidasa y MPS I con la utilización de la α-L-iduronidasa. Así

mismo existen protocolos de TRE para enfermedades metabólicas, como las hemofilias

A y B, ocasionadas por deficiencia de los factores de coagulación VIII y IX, las

deficiencias de α1-antitripsina, hormona del crecimiento y enzimas pancreáticas en la

fibrosis quística. Se estan llevando a cabo ensayos clínicos de TRE para un número

importante de enfermedades de depósito lisosomal, tales como, Pompe, Niemann-Pick

tipo B, Wolman, las MPS VII, VI y IVA, las cuales son enfermedades de

almacenamiento lisosomal causadas por deficiencia de las enzimas, α-glucosidasa,

esfingomielinasa, lipasa ácida, β-glucuronidasa, N-acetilgalactosamina 4-sulfato

sulfatasa y N-acetilgalactosamina-6-sulfato-sulfatasa, respectivamente y de otras

patologías no lisosomales como el angioedema hereditario en el cual existe deficiencia

del inhibidor de la C1-esterasa y la enfermedad de pénfigo vulgar en donde se presenta

una respuesta autoinmune a la desmogleina-3. En el caso de la MPS II el uso de enzima

recombinante producida en células CHO está aprobado para Europa.

El potencial uso de enzimas en TRE exige la obtención y purificación de proteínas en

cantidades necesarias para los estudios de estructura, función, estabilidad,

direccionamiento, antigenicidad y pruebas pre-clinicas. La obtención a partir de sus

fuentes naturales ha sido difícil y laboriosa. Los bajos volúmenes obtenidos, los altos

costos, los largos períodos de tiempo empleados y los avances en el conocimiento de la

estructura, función, regulación y manipulación de los genes, han dado paso, a la

3

producción de proteínas en modelos biológicos mediante la tecnología del ADN

recombinante, con el fin de obtener un producto similar al humano. Los resultados de

estudios recientes, presentan a la levadura metilotrófica Pichia pastoris y la bacteria

Escherichia coli como buenos modelos de expresión de proteínas humanas con fines

clínicos.

Aunque la TRE resulta una alternativa terapéutica factible, los costos de esta terapia,

para las enfermedades que existe, son extremadamente altos. Para mejorar esta situación

y contribuir a que la TRE se coloque al alcance de pacientes de escasos recursos, el

Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) de la Pontificia Universidad

Javeriana, desde hace varios años orienta gran parte de los esfuerzos investigativos a

generar información para implementar protocolos de TRE para mucopolisacaridosis,

entre ellas, el síndrome de Hunter. El presente trabajo se orientó a la purificación de la

IDShr y el análisis computacional de la enzima, puesto que no existen reportes

experimentales acerca de sus estructuras secundaria, terciaria ni de su sitio activo. El

empleo de programas computacionales que tienen como base la información acumulada

en bases de datos como Gen Bank, ExPASy y EMBL, permitió, mediante modelación

homóloga, el desarrollo de modelos computacionales de predicción de la estructura y

funcionabilidad de la proteína. La información generada por el análisis computacional

permitió explicar el comportamiento de la proteína recombinante y entender resultados

experimentales de los procesos de expresión en Pichia pastoris y Eschericia coli y

purificación de la enzima heteróloga. Además, contribuirá a orientar la futura

experimentación. Por ejemplo, el desarrollo de nuevos constructos para la expresión y

los estudios del comportamiento de la molécula en el proceso de direccionamiento a los

tejidos de los pacientes Hunter.

4

OBJETIVOS

Objetivo General

Lograr avances en la modelación computacional de la estructura de la IDSh y en los

procesos de expresión y purificación de la proteína recombinante expresada en

P. pastoris y E coli con miras a la producción de mayores cantidades de enzima

activa para uso en TRE en pacientes con el Síndrome de Hunter.

Objetivos específicos 1. Adaptar un método fluorométrico usado en la determinación de la enzima en plasma

para la detección de IDShr en muestras de P. pastoris y E. coli.

2. Mejorar el sistema de purificación de la IDShr mediante la producción de un

anticuerpo policlonal y su empleo en cromatografía de afinidad.

3. Implementar un sistema de purificación de la IDShr más rápido y sencillo

introduciendo dos etapas de ultrafiltración, una de exclusión molecular y una de

cromatografía de afinidad.

4. Contribuir al mejoramiento del sistema de expresión y purificación de la IDShr en

E. coli empleando el sistema GST.

5. Obtener información computacional de la IDSh con respecto a los perfiles de

hidrofobicidad, accesibilidad, flexibilidad, antigenicidad, el punto isoeléctrico, el

peso molecular, los potenciales sitios de fosforilación, N- y O-glicosilación,

bloques, prints y alineamientos con moléculas cuya estructura terciaria está

determinada experimentalmente.

6. Emplear la información computacional obtenida para la elaboración de modelos de

las estructuras secundaria, terciaria y sitio activo de la IDSh.

7. Emplear la información computacional obtenida para el mejoramiento del sistema

de expresión y purificación de la IDShr

8. Contribuir al establecimiento de una relación genotipo-severidad en la enfermedad

de Hunter.

5

REVISIÓN DE LITERATURA

Errores Innatos del Metabolismo Los errores innatos del metabolismo (EIM), son desórdenes bioquímicos causados por

defectos en la estructura o función de proteínas, producto de alteraciones a nivel de los

genes que codifican para dichas biomoléculas. Existen cerca de 550 patologías

asociadas a EIM y aunque no son muy frecuentes, tomados como grupo pueden afectar

al 1% de los recién nacidos (1).

La gran mayoría de estas enfermedades se producen por mutaciones que alteran la

expresión fenotípica de proteínas. Pueden presentarse por defectos en una sola enzima

como la fenilalanina-hidroxilasa en la fenilcetonuria o involucrar varias enzimas como

en el Síndrome de Zellweger, en cuyo caso varias peroxinas pueden estar afectadas.

Puede generarse disfunción de un transportador como la cistinosina en la cistinosis,

defecto en un receptor como el de las LDL en la hipercolesterolemia familiar o

deficiencia de una hormona como en el hipotiroidismo (1). Una clasificación

fisiopatológica (2), ubica a las enfermedades metabólicas en tres grandes grupos. El

primero comprende los desórdenes de complejos moleculares como los desórdenes

lisosomales, peroxisomales, síntesis de colesterol y otros. El segundo grupo abarca los

defectos del metabolismo intermediario que conducen a intoxicación, tales como los

defectos del ciclo de la urea, aminoacidopatías (fenilcetonuria, homocistinuria,

tirosinemia, etc), acidemias orgánicas (propiónica, metilmalónica, isovalérica, etc). El

último grupo incluye entidades con síntomas debidos a deficiencias energéticas, como

son las glicogenosis, defectos en la oxidación de ácidos grasos o desórdenes en la

cadena respiratoria.

A pesar de tratarse de enfermedades relativamente raras, el estudio de los EIM está

indicado en casos en que el paciente presenta crisis neonatales, retardo o regresión del

desarrollo psicomotor, problemas óseos generalizados, facies toscas, anormalidades

oculares, organomegalia, hipoglicemia, convulsiones, acidosis o hiperamonemia de

difícil manejo, cuerpos cetónicos, azúcares reductores o cristales raros en orina, olores

extraños (moho, mantequilla rancia, pies sudados, jarabe quemado o pescado

6

descompuesto) o asociación de las crisis con ingesta de proteínas, carbohidratos,

productos lácteos o cuando existan antecedentes familiares de dichas enfermedades (3).

Puesto que en las enfermedades metabólicas hay bloqueo de una o varias rutas del

metabolismo normal, la ausencia o acumulación de metabolitos específicos, constituye

la base de las pruebas de laboratorio (3), que junto con las manifestaciones clínicas

permiten el diagnóstico de estas enfermedades. La mayoría de los EIM son

enzimopatías, las cuales generalmente se heredan en forma recesiva y usualmente se

necesitan niveles menores al 10% de la actividad metabólica normal, para que existan

manifestaciones clínicas. Debido a que estas entidades se generan por alteraciones a

nivel genético, no existe tratamiento farmacológico convencional y su manejo

tradicionalmente, está dirigido a corregir o prevenir algunas manifestaciones clínicas,

por ejemplo, el empleo de dietas, en el caso de las acidemias orgánicas y los desórdenes

de aminoácidos (2) o el transplante de córnea, el uso de audífonos y la terapia

ortopédica en las mucopolisacaridosis (4,5).

Mucopolisacaridosis Tipo II o Síndrome de Hunter

Las mucopolisacaridosis (MPS) son EIM en los cuales existe deficiencia de alguna de

las hidrolasas lisosómicas que catalizan la degradación de mucopolisacáridos, más

corrientemente denominados glucosaminoglicanos (GAG). Considerando la enzima

deficiente, estas enfermedades se clasifican en siete grupos (Tabla 1). Cuando existe

deficiencia de la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa (IDS), corresponde al tipo II (MPS II) y

es conocida como Síndrome de Hunter (McK 309900), puesto que Charles Hunter fue

quien la describió por primera vez en 1917 (1). La deficiencia enzimática origina,

excreción urinaria y acumulación sistémica de heparán y dermatán sulfato a nivel

lisosomal (2).

7

Tabla 1. Clasificación de las Mucopolisacaridosis (MPS)1.

MPS Epónimo Enzima Deficiente GAGs Acumulados Manifestaciones Clínicas

Tipo IH Hurler α-L-Iduronidasa Dermatán y Heparán sulfato Opacidad corneal Disostosis multiple

Organomegalia Enfermedad cardíaca Muerte en infancia

Tipo IS Scheie α-L-Iduronidasa Dermatán y Heparán sulfato Opacidad corneal

Rigidez articular Inteligencia normal

Tipo IH/S Hurler/Scheie α-L-Iduronidasa Dermatán y Heparán sulfato Fenotipo intermedio entre IH y IS

Tipo II Hunter (leve) Iduronato sulfatasa (IDS) Dermatán y Heparán sulfato Inteligencia normal Corta estatura

Supervivencia 20-60 años

Tipo II Hunter (severa) Iduronato sulfatasa (IDS) Dermatán y Heparán sulfato Disostosis múltiple Organomegalia

Muerte antes de 15 años Tipo IIIA Sanfilippo A Heparan N-sulfatasa

(Sulfamidasa) Heparán sulfato Deterioro mental profundo.

Hiperactividad. Manifestaciones somáticas medias.

Tipo IIIB Sanfilippo B α-N-acetil glucosaminidasa Heparán sulfato Fenotipo similar a IIIA

Tipo IIIC Sanfilippo C Acetil-CoA:α-glucosamida acetiltransferasa

Heparán sulfato Fenotipo similar a IIIA

Tipo IIID Sanfilippo D N-acetil glucosamina 6 sulfatasa

Heparán sulfato Fenotipo similar a IIIA

Tipo IVA Morquio A N-acetil galactosamina 6 sulfatasa (GALNS)

Queratán y Condroitín sulfato

Deformidades esqueléticas Hipoplasia odontoide

Opacidad corneal Tipo IVB Morquio B β-galactosidasa Queratán sulfato Espectro similar a IVA

Tipo V No existe

Tipo VI Maroteaux Lamy Arilsulfatasa B Dermatán sulfato Disostosis múltiple Opacidad corneal

Inteligencia normal

Tipo VII Sly β–glucuronidasa (GUSB) Dermatán, Heparán y Condroitín sulfato

Disostosis múltiple Hepatoesplenomegalia

Amplio espectro de severidad incluyendo hidrops fetalis

VIII No existe Hialuronidasa

1 Tomado de Sáenz H et al, 2004.

8

Los GAG constituyen el mayor componente de la matriz no fibrosa del tejido conectivo

y se encuentran en grandes cantidades en el cartílago, hueso, vasos sanguíneos,

válvulas cardíacas, piel, tendones, córnea y en pequeñas cantidades en otros órganos

como el hígado y el cerebro (6). Químicamente, estos heteropolisacáridos están

compuestos por residuos de hexosaminas y ácidos urónicos. En el caso de heparán

sulfato, sus unidades monoméricas son N-acetilglucosamina y ácido L-idurónico,

encontrándose excepcionalmente el ácido D-glucurónico, mientras que en el

dermatán sulfato son N-acetilgalactosamina 4-sulfato y acido L-idurónico. La IDS

cataliza la reacción de remoción del sulfato en posición C-2 del ácido L-idurónico

presente en el heparán sulfato y el dermatán sulfato (1). La deficiencia de esta reacción

no permite la degradación normal de los mencionados GAG y explica su acumulación

intralisosomal y excreción urinaria. Estas dos alteraciones fisiológicas permiten el

diagnóstico de la enfermedad a nivel de laboratorio, con el hallazgo de estos GAG en

orina y la determinación de la actividad de la enzima en plasma y células como

leucocitos o fibroblastos (2).

Las consecuencias del defecto molecular se traducen en cuadros clínico que presentan

características, en grado variable, en un crónico y progresivo curso que involucra facies

toscas, disostosis múltiple, pecho en quilla, cráneo alargado, corta estatura, mano en

garra, genu valgum, limitaciones del movimiento articular, hepatomegalia,

hipertricosis, macroglosia, sordera neurosensorial y hernias inguinales o umbilicales

(Figura 1) (7). Se han descrito tres presentaciones clínicas de la enfermedad: moderada,

intermedia y severa. En la forma leve o moderada, a diferencia de las formas

intermedia y severa, no hay compromiso de la esfera mental y los pacientes sobreviven

cinco o seis décadas, con aparición tardía de la sintomatología, mientras que en la

forma intermedia los síntomas aparecen más tardíamente que en la forma severa, en la

cual se presentan las manifestaciones clínicas entre los dos y cuatro años de edad,

además del retardo mental los afectados presentan alteraciones del comportamiento y

generalmente, muerte antes de la adolescencia (7).

9

A B

C D Figura 1. Algunos Síntomas Asociados al Síndrome de Hunter. Son evidentes la hepatomegalia (A), facies toscas (B), mano en garra (C), lesiones dérmicas nodulares (D).

La incidencia de la enfermedad para Israel se reportó con una frecuencia de

1:34.000 en hombres nacidos vivos (8), en el Reino Unido, se estimó en 1:132.000 (9),

10

en Australia 1:165.000 (10) y en la Columbia Británica en 1:111.000 (11), mientras

que para Colombia no existen datos de prevalencia de la enfermedad.

Estructura del Gen de la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa

El Síndrome de Hunter es una enfermedad ligada al cromosoma X y el gen de la IDS

está ubicado citogenéticamente en la región Xq28 (12). El gen de la IDSh tiene

aproximadamente 24 kb que comprenden nueve exones y ocho intrones (12-14). Un

cDNA de 2,3 Kb codifica la secuencia completa de 550 aminoácidos de la IDSh (12).

En la región del promotor no se encuentran secuencias del tipo cajas TATA o CAAT,

sin embargo, se hallan dos secuencias consenso GC, esto es consistente con la

característica de dicho gen de presentar bajos niveles de transcripción (13). De otro

lado, se ha reportado un pseudogen (IDS2), localizado a 20 Kb del gen de la IDS y

aunque tiene secuencias homólogas a los exones 2 y 3 y a los intrones 2, 3 y 7 del gen

de la IDS, su función es desconocida (15).

Para la IDSh se han reportado 309 mutaciones, de las cuales 167 son puntuales, 27 por

“splicing” alternativo, 55 pequeñas delecciones, 23 pequeñas inserciones, 2 indels, 8

rearreglos y una duplicación (7,16-39). La literatura no reporta estudios que establezcan

el efecto de las mutaciones sobre la funcionalidad enzimática y el fenotipo en pacientes

con síndrome de Hunter.

Ensayos Terapéuticos para el Síndrome de Hunter En la MPS II, como en la mayoría de los EIM la alteración se encuentra en el gen, por

lo cual no existe tratamiento farmacológico y esto la convierte en una enfermedad

incurable. Sin embargo, se han intentado terapéuticas como el transplante de médula

ósea (40-43), que no ha resultado exitoso al no lograrse la regresión de los síntomas ni

detener la progresión del deterioro mental, además de los riesgos infectocontagiosos y la

dificultad de conseguir donantes histocompatibles. El tratamiento con intercambio de

plasma (44), tampoco demostró beneficio clínico alguno, a pesar que hubo un aumento

en la actividad de la enzima plasmática. Por otro lado, el transplante de fibroblastos

(45), aunque generó aumento en la actividad de la enzima y el correspondiente

11

incremento en la degradación del heparán sulfato y dermatán sulfato, igualmente resultó

poco efectivo. De otro lado, cuando se utilizó IDS obtenida a partir de orina humana se

observó una disminución en los niveles intralisosomales de GAG (46), sin llegar a

convertirse en la medida terapéutica ideal. Otros intentos de terapia los han constituido

los implantes subcutáneos de membrana amniótica (47) y de células madres

hematopoyéticas (48). Actualmente, se adelanta el primer TRE en humanos (49).

Después de los ensayos en el modelo animal, un ratón knockout (ids-KO) obtenido por

delección del exon 4 y parte del 5 y de pruebas en monos, Muenzer y colaboradores

(49), han evaluado en 12 pacientes, tres dosis (0.15, 0.5 y 1.5 mg/Kg) de IDShr

producida en células CHO. Posteriormente, se aumento el número de pacientes a 45 y

mas recientemente a 96, con dosis semanales de enzima recombinante de 0.5 mg/kg de

peso corporal. En todos los casos se ha observado disminución en los depósitos

lisosomales de glicosaminoglicanos y reducción de los mismos en orina.

Trabajos recientes in vitro, empleando vectores virales han mostrado diferentes niveles

de eficiencia en la disminución de los depósitos de GAG en células deficientes en IDS

(50-57). Así mismo, se han adelantado algunos protocolos para suplir IDS a células

cultivadas deficientes en la enzima y se han logrado importantes niveles de corrección

empleando proteína recombinante suplementada a neuronas y células gliales (56),

fibroblastos, células COS y linfoblastoides (58-61).

Los resultados obtenidos hasta ahora, demuestran que células normales o transformadas

para producir IDShr, secretan al medio la enzima y que está puede ser captada por otras

células mediante receptores de superficie como el receptor de manosa 6-fosfato (58-61).

Luego la enzima es endocitada hasta los lisosomas y allí puede catalizar la hidrólisis de

heparán sulfato y dermatán sulfato. Lo anterior, convierte al síndrome de Hunter en una

enfermedad potencialmente tratable mediante TRE.

Terapia de Reemplazo Enzimático El tratamiento ideal para enfermedades incurables, como los EIM, debe ser aquel que

pueda implementarse en etapas muy tempranas de la vida y de esta manera, prevenir la

aparición de la sintomatología y las secuelas a largo plazo. Con relación a esto, los

12

hallazgos biotecnológicos, a partir de los años 80, tales como la clonación del ADN, la

síntesis de oligonucleótidos, aislamiento y empleo de enzimas restricción y la

utilización de plásmidos bacterianos, reorientaron la investigación en biomedicina y

proporcionaron la base experimental para iniciar el desarrollo de terapéuticas no

convencionales, como son reemplazar o suplementar los genes defectuosos por medio

de la terapia génica o proveer enzimas funcionales exógenas a los tejidos en los cuales

están ausentes o son deficientes, mediante la TRE.

Los primeros protocolos clínicos de terapia génica de células somáticas aparecieron en

la década de los 90 y en la actualidad, más de 4000 pacientes llevan en sus cuerpos

células modificadas mediante ingeniería genética, producto de más de un centenar de

protocolos de terapia génica en marcha (57). Sin embargo, aunque esta novedosa

terapéutica se asume como la solución esperada, por largo tiempo, para el tratamiento

de un gran número de enfermedades intratables, los resultados en algunos pacientes,

sugieren que aún no se han logrado los niveles óptimos de transferencia y expresión de

los genes exógenos y sus productos. Esto ha conducido a que su empleo se haya

restringido, mientras se desarrollan sistemas más eficientes de transferencia de los genes

terapéuticos y se profundice en el conocimiento de los mecanismos de expresión y

regulación genética, de esos genes exógenos, en las células transfectadas. Como

consecuencia de esto y hasta tanto no se solucionen los problemas que presenta la

terapia génica, el desarrollo en la producción y disponibilidad de proteínas

recombinantes para TRE parece que tendrá en corto tiempo un impacto mayor sobre el

tratamiento de estas patologías (62-64). En este sentido, estudios tendientes al empleo

de TRE en un número importante de enfermedades, tales como, Pompe, Niemann-Pick

tipo B, Wolman, las MPS VII, VI y IVA, las cuales son enfermedades de

almacenamiento lisosomal causadas por deficiencia de las enzimas: α-glucosidasa,

esfingomielinasa, lipasa ácida, β-glucuronidasa, N-acetilgalactosamina 4-sulfato

sulfatasa y N-acetilgalactosamina-6-sulfato-sulfatasa, respectivamente. Así mismo

existen protocolos de TRE para enfermedades metabólicas, no lisosomales, como la

inmunodeficiencia severa combinada, causada por deficiencia de adenosina deaminasa

(ADA), el angioedema hereditario en donde existe deficiencia del inhibidor de la C1-

esterasa, la enfermedad de pénfigo vulgar en donde se presenta una respuesta

13

autoinmune a la desmogleina-3, las hemofilias A y B, ocasionadas por deficiencia de los

factores de coagulación VIII y IX, las deficiencias de α1-antitripsina, hormona del

crecimiento y enzimas pancreáticas en la fibrosis quística (62-64).

La inmunodeficiencia severa combinada fue la primera enfermedad hereditaria no

lisosomal tratada con TRE (65). También, las enfermedades de Gaucher (66,67), de

Fabry (68,69) y MPS I (70,71), se encuentran en fase de aplicación en humanos. Las

otras enfermedades mencionadas, actualmente se encuentran en fases experimentales, a

nivel de laboratorio, en ensayos con modelos animales o en sus fases tempranas

preclínicas (70-81). Todos estos datos, indican que la TRE se presenta a corto plazo

como la medida terapéutica más viable para el manejo en forma eficiente, menos

traumática y más económica de pacientes con enfermedades hasta ahora incurables.

El principio general de la TRE es proporcionarle al paciente la enzima deficiente, sin

embargo para esto es necesario solucionar algunos problemas como la obtención de la

molécula y su direccionamiento a los tejidos en el organismo del paciente. Esto último,

debe ser considerado a dos niveles: el órgano y la célula blanco, puesto que la

deficiencia enzimática puede estar localizada en el espacio extracelular, en el citosol o

en un compartimiento subcelular, en este último caso, la enzima exógena debe

atravesar varias barreras naturales. Cuando el espacio extracelular es el blanco, el

acceso es fácil, tales son los casos del tratamiento de la inmunodeficiencia severa

combinada con la ADA (65) y la suplementación enzimática a nivel pancreático en la

fibrosis quística (81). Si la deficiencia se encuentra a nivel citosólico o subcelular, la

enzima exógena debe atravesar la membrana plasmática, en el primer caso y

adicionalmente, la membrana de la organela, como en las enfermedades mitocondriales

o peroxisomales (1,2). Los lisosomas se comunican con el espacio extracelular a través

de mecanismos endocíticos, gracias a lo cual, en las enfermedades de depósito

lisosomal, es posible llevar enzimas exógenas endocitadas a los lisosomas y de esta

manera poner en contacto la enzima terapéutica con el material a hidrolizar.

En algunos casos en TRE se ha tenido que modificar la molécula de utilidad clínica

para poder dirigirla a los tejidos afectados, aumentar su vida media en el torrente

14

sanguíneo, mejorar su estabilidad o para que sea reconocida por receptores específicos

expresados en las células blanco. Un ejemplo lo constituye la gangliosidiosis GM2 en

cuyo caso la Hexosaminidasa A, es endocitada en cantidades superiores por los

astrocitos tipo I, comparados con las células indiferenciadas epiteloides (82). Con

relación a esto, procedieron a cationizar la enzima conjugándola con poli-lisina lo que

condujo a un aumento en la adsorción de la enzima a la membrana plasmática y su

posterior internalización. Otra enzima modificada con el propósito de lograr una mayor

eficiencia en su empleo clínico fue la ADA que se conjugó con polietilenglicol (83). El

tiempo de permanencia en el plasma aumentó de 30 minutos a 30 horas, se inhibió la

proteólisis y disminuyó la antigenicidad. La enzima N-acetilgalactosamina 4-sulfato

sulfatasa, deficiente en el síndrome de Maroteaux-Lammy, fue igualmente modificada

buscando mejorar el direccionamiento al tejido cartilaginoso. Esta enzima fue

conjugada con poli-lisina o etildiamino para que cationizada difundiera más fácilmente

a través de la matriz extracelular, lográndose un nivel importante en la reducción de los

depósitos de GAG, en el miocardio y menor para otros órganos (80).

En las células blanco, si bien los receptores reconocen un ligando, la especificidad

puede variar, así por ejemplo, las neuronas tienen afinidad por la toxina tetánica, debido

a que posee un alto contenido de gangliósidos y un fragmento de 50 KDa es retenido

por las neuronas sin resultar tóxico. Aprovechando esto, se fusionó ese fragmento a la

hexosaminidasa A, lo cual hizo que la enzima modificada se internalizara en mayor

proporción que la normal (82). El caso más llamativo de modificación de la molécula

terapéutica, por su eficiencia, lo constituyen las deglicosilaciones sucesivas de la β-

glucocerebrosidasa, para eliminar los residuos de ácido siálico y galactosa y exponer los

de manosa. Lo cual permitió que fuera reconocida por los receptores de manosa

presentes en la superficie de los macrófagos (84).

Aunque los resultados anteriores consolidaron la idea de la necesidad de modificaciones

para el mantenimiento en el plasma o el reconocimiento a nivel celular de la enzima de

utilidad terapéutica, recientemente la lipasa ácida lisosomal, deficiente en las

enfermedades de Wolman y Wilson, en las cuales hay almacenamiento de esteres de

15

colesterol, fue expresada en la levadura Pichia pastoris (P. pastoris) y sin ningún tipo

de modificación química a nivel de laboratorio, fue empleada en ratones con deficiencia

de la enzima, logrando disminuir los niveles de colesterol en intestino, hígado y bazo

(75). Es necesario anotar que, todos los intentos en las enfermedades con compromiso

del SNC, como Tay-Sachs, Sandhoff, Niemann-Pick, Sly, no han logrado revertir los

síntomas por la incapacidad de las enzimas para atravesar la barrera hematoencefálica

(1). Esto último, ha llevado a pensar en la posibilidad de una administración directa por

cateterización arterial en los órganos involucrados, a pesar de existir ya un fallido

intento con la enfermedad de Tay-Sachs, debido a la escasa cantidad de enzima

empleada (82). Este procedimiento podría solucionar los problemas de necesidad de

altas concentraciones de la enzima terapéutica y su pérdida a nivel hepático o su

dilución plasmática.

Recientemente (85), se probó con éxito, un sistema de reconocimiento y endocitosis

hasta lisosomas de las enzimas α-L-iduronidasa y α-glicosidasa, empleando receptores

de la familia LDL. Las enzimas fueron fusionadas a un fragmento del receptor asociado

a proteinas (RAP), una molécula residente del retículo con función de chaperona en la

síntesis de lipoproteínas, lo que explica porque es reconocido por los receptores

empleados. Además de ser un sistema independiente de las glicosilaciones, algunos de

estos receptores están involucrados en fenómenos de transcitosis, lo cual ofrece la

potencialidad de emplearse para atravesar la barrera hematoencefálica. También fue

ensayada con buenos resultados (86), otra alternativa independiente de las

glicosilaciones, la cual consistió en la fusión de la β-glucuronidasa a un fragmento del

factor de crecimiento similar a la insulina tipo II (IGF-II), el cual es reconocido por el

receptor de manosa 6-fosfato independiente de catión (IGF-II/CI-MPR) y luego

endocitado hasta los lisosomas.

Sistemas de Expresión de Proteínas Recombinantes El uso de enzimas en TRE exige previamente, la producción y purificación de dichas

moléculas en cantidades suficientes para efectuar estudios de cinética de expresividad,

caracterización bioquímica, bioactividad, antigenicidad, estabilidad y aun modificarlas

químicamente, si es el caso, antes de ser ensayadas en modelos animales y su posterior

16

empleo en terapia humana. Sin embargo, la obtención y purificación de proteínas a

partir de sus fuentes naturales para estudios de estructura y función con el propósito de

ser empleadas con fines terapéuticos ha sido una labor difícil y laboriosa, situación aun

más complicada para las enzimas lisosomales, especialmente las sulfatasas dada la poca

expresividad de ellas por parte de las células. Los bajos volúmenes obtenidos por esta

vía, los altos costos, los largos períodos de tiempo empleados y los avances en el

conocimiento de la estructura, función, regulación y manipulación de los genes, han

dado paso, a la producción de proteínas con la tecnología del ADN recombinante en

modelos biológicos, con el fin de obtener un producto similar al humano. Dentro de

estas posibilidades se han probado los cultivos de bacterias, levaduras y líneas celulares

de mamíferos. Puesto que las bacterias no pueden glicosilar, solo pueden emplearse

para la expresión de proteínas no-glicosiladas o susceptibles de ser glicosiladas en el

laboratorio (87). Aunque las líneas celulares CHO y COS son sistemas tradicionalmente

utilizados para la expresión de glucoproteínas, su manipulación es bastante compleja,

costosa y no siempre esas proteínas son estables o correctamente ensambladas, por lo

cual el rendimiento es bajo (58-61). La expresión de proteínas y su posterior escalado

en modelos biológicos como Escherichia coli (E. coli) (88-90), o levaduras

metilotróficas como P. pastoris han resultado una metodología rápida, eficiente y a

bajo costo. Así, resultados de estudios recientes (91-97), presentan a este tipo de

levadura como un excelente modelo de expresión de proteínas humanas.

E. coli constituye un buen modelo biológico para la expresión de proteínas

recombinantes no glicosiladas por ser un organismo relativamente simple, fácil de

cultivar en altas densidades y su genoma bien conocido. Desde hace más de 25 años

(88), este sistema de expresión ha permitido obtener grandes volúmenes de proteínas

heterólogas (88-90), facilitado por el diseñado de plásmidos compatibles con el genoma

de cepas desarrolladas para uso biotecnológicos. Los elementos genéticos de los

plásmidos de expresión incluyen un origen de replicación (ori), marcadores de

resistencia antibiótica, promotores transcripcionales, regiones de iniciación de la

traducción así como secuencias de terminación de la transcripción y traducción (89). En

la actualidad existen más de 70 sistemas de expresión basados en plámidos pET y

pBAD los cuales incluyen promotores, sitios múltiples de clonación, sitios de clivaje

17

para proteasas, compañeros de fusión y un gran numero de modificaciones genéticas

dependiendo de los propósitos de expresión (90).

El estrés metabólico al cual es sometida la célula bacteriana al utilizarse como sistema

de expresión, resulta en la acumulación de productos insolubles producto de la

formación de cuerpos de inclusión. Estos agregados son generalmente proteínas

incorrectamente plegadas y biológicamente inactivas. En condiciones normales las

proteínas citoplasmáticas son capaces de plegarse espontáneamente, mientras que los

agregados requieren chaperonas, lo que significa que los cuerpos de inclusión son

acumulados de intermediarios incorrectamente plegados por ineficiencia en la actividad

de las chaperonas (89). Para resolver esa situación existen dos alternativas, intentar

solubilizar los agregados y lograr que las proteínas se plieguen correctamente o

modificar las estrategias de producción para obtener proteínas solubles (90). Dado que

el primero de los casos no es lo deseable puesto que la recuperación es poca y la

probabilidad de plegamiento es escaso, se han realizado exitosos ensayos reduciendo la

temperatura (30°C), lo que permite la síntesis de chaperonas, sin embargo, esta

disminución de temperatura conduce a una disminución en el crecimiento y como

consecuencia una merma en la biomasa. Igualmente, se han desarrollado cepas como

c41 y c43 que contribuyen a la expresión soluble de proteínas recombinantes. De otro

lado, la vía más simple para producir proteínas recombinantes en E. coli son los cultivos

en lote, sin embargo, los nutrientes son proporcionados desde el inicio y esto puede

guiar a cambios en el pH, oxígeno disuelto y disminución del sustrato. En cultivos lote

alimentado, la fuente de energía puede ajustarse de acuerdo a la rata de consumo y otros

factores pueden ser regulados para obtener máxima producción de proteína y biomasa

(90). Otra buena estrategia para evitar los cuerpo de inclusión es la co-expresión de

chaperonas (88-90). También ha sido muy exitoso el empleo de “tags” de afinidad, muy

útiles para la purificación de la proteína recombinante y que a la vez previenen la

proteólisis e incrementan la solubilidad (89,90). Entre estos tenemos MBP, NusA, GTS

y más frecuentemente un pequeño fragmento N-terminal del IF2 (90). De otra parte se

han expresado proteínas empleando constructos de fusión con lacZ o GFP y un sistema

18

basado en un complejo oleosina-GFP, empleando el factor de clivaje Xa para separar la

GFP y posteriormente reconstituir la parte lipídica con la adición de triglicéridos (90).

Más de 25 años de empleo de E. coli en la expresión genética, han establecido que es

un buen modelo biológico para muchas aplicaciones científicas de expresión de

proteínas. En E. coli se han logrado expresar, entre otras proteínas humanas, insulina,

eritropoyetina, interferon α, hemoglobina, glucagón, hormona del crecimiento y factor

de crecimiento epidérmico.

P. pastoris es una levadura metilotrófica, en virtud de lo cual, es capaz de metabolizar

el metanol como su única fuente de carbono, para ello su genoma cuenta con dos genes

que codifican para la alcohol oxidasa, AOX1 y AOX2 (96). El primero de ellos es

responsable de la mayoría de las actividades celulares de la alcohol oxidasa y su

expresión es regulada e inducida por el metanol, típicamente la concentración de esta

enzima corresponde a más o menos 30% del total de proteína soluble, en células que

crecen en medios con metanol como fuente de carbono. El gen AOX1 ha sido aislado e

incorporado en plásmidos y el promotor AOX1 usado para dirigir la expresión de un

importante número de genes (97). La regulación del promotor se realiza a nivel

transcripcional y se efectúa mediante un proceso que contempla dos etapas, una de

represión-derrepresión y otra de inducción. El crecimiento sobre glucosa reprime la

transcripción, aun en presencia del inductor metanol, por lo cual es recomendado para

una óptima inducción, el crecimiento en medio con glicerol (96,97).

Se ha lograda la producción de proteínas recombinantes citoplasmáticas y secretadas en

niveles similares a E. coli y superiores a S. cereviciae (97). Un aspecto importante para

el sistema de expresión, lo constituye el hecho de que P. pastoris secreta muy bajas

cantidades de proteínas nativas y por consiguiente los productos secretados pueden

llegar a constituir más del 80% de las proteínas del medio (93,94).

Como organismo eucariótico, P. pastoris posee varias de las ventajas de los sistemas de

expresión de eucariotes superiores, tales como el procesamiento, plegamiento y

modificaciones postranslaciones de las proteínas. A diferencia de Saccharomyces

19

cereviciae (S. cereviciae), no hiperglicosila ni presenta manosas terminales con

uniones glucosídicas α-1,3 (responsables de hiperantigenicidad) y sus cadenas

glicosídicas del tipo alta en manosas, tienen en promedio 8 a 14 residuos de ese azúcar

(98), contrastando con los 50-100 residuos en S. cereviciae (99). Gracias a lo anterior,

P. pastoris constituye un sistema de expresión adecuado para glicoproteínas humanas,

pues sus patrones de glicosilación, si bien no son idénticos, son más parecidos (94), a

los patrones presentes en mamíferos que los de S. cereviciae, muy empleada hasta hace

algunos años.

Fermentaciones de alta densidad parecieran ideales para la producción de proteínas

heterólogas, pues aumentan los niveles de secreción al medio de cultivo. Sin embargo,

otras moléculas, como las proteasas, igualmente aumentan sus concentraciones. En estas

condiciones proteínas como la invertasa (99) y la lisozima bovina (93) son levemente

estables y otras como el factor de crecimiento epidérmico son significativamente

degradadas (100). Para minimizar la proteólisis se han empleado estrategias como el

cambio de cultivo con la variación de pH, la adición de casaminoacidos (97) o el uso de

cepas mutantes para PEP4. Este gen codifica para una proteasa responsable de la

activación de otras proteasas (93).

La mayoría de los protocolos para la expresión de proteínas heterólogas en P. pastoris

han contemplado la utilización de cassettes de expresión de una sola copia (92-98), sin

embargo, más recientemente se han empleado constructos de genes heterólogos con

multicopias (100). Este modelo biológico puede ser utilizado para expresión de

proteínas intracelulares o de secreción. En este último caso, el empleo de secuencias de

señal de secreción ha resultado muy eficiente (91, 94,97).

Algunos ejemplos de proteínas heterólogas humanas expresadas en P. pastoris,

producidas con propósitos clínicos son: D-alanina carboxipeptidasa, superóxido

dismutasa, invertasa, factor de crecimiento epidérmico, interleuquinas 2 y 11, una

subunidad del receptor de IgE, factor de crecimiento 1- similar a insulina, inhibidor 6 de

proteinasa, factor de necrosis tumoral (TNF) y análogos TFN-9, TFN-6 y TFN-Arg,

interferón, caspasa 3, antitrombina, factor de crecimiento endotelio-vascular, quitinasa,

20

colágeno tipo I, tropomiosina, carnitina palmitotransferasa, quimiotripsinógeno,

β-hidroxiesteroide deshidrogenasa, catalasa e inhibidor de angiogénesis k4k5 (91-95).

La Enzima Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa La Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa (EC 3.1.6.13) es una hidrolasa, la cual actúa sobre

enlaces ester-sulfato y cataliza la reacción de hidrólisis del grupo sulfato en posición C-

2 del ácido L-idurónico presente en el dermatán sulfato y heparán sulfato (1). Un

péptido precursor de 550 aminoácidos es codificado por un cDNA de 2.3 Kb (14).

Este precursor presenta ocho sitios potenciales de glicosilación, 62 de O-glicosilación y

26 de fosforilación (101). Los primeros 25 residuos corresponden a la secuencia del

péptido señal y otros ocho residuos son removidos posteriormente, durante el proceso

de maduración de la proteína (102). La comparación de la secuencia de aminoácidos de

la IDSh muestra marcada homología con otras sulfatasas estudiadas, como las

Arilsulfatasas A, B y C (103,104). Fue comprobado mediante mutagénesis dirigida en

células COS, que el centro activo está relacionado con la cisteína en posición 84 (60),

que al igual que en otras sulfatasas para su actividad catalítica requiere la conversión

postranslacional de la cisteína en un residuo de ácido 2-amino-3-oxoproico o formil-

glicina (105,106). La figura 2 presenta el mecanismo propuesto para la mencionada

conversión química.

La enzima ha sido aislada de fluidos corporales como líquido amniótico, plasma y

orina (46,107-109), de órganos como placenta, hígado, riñón e intestino (110-113), de

fibroblastos humanos (59), y enzima recombinante obtenida de células cultivadas (58-

61). En todos los casos se ha considerado que las formas maduras presentan pesos

moleculares entre 42 y 45 KDa y que existe eliminación de una forma menor de 14-18

KDa. Estas formas maduras son el producto, de un procesamiento que incluye

glicosilaciónes, deglicosilaciones, fosforilaciones y proteólisis (Figura 3) (58-61).

Inicialmente es sintetizado un precursor de 76 KDa, que por fosforilación y

glicosilación genera una forma de 90 KDa, la cual, por proteólisis origina una forma de

62 KDa y otra de 18 KDa. Posteriormente una deglicosilación conlleva a la formación

21

de un glicopeptido de 55 KDa que finalmente por una segunda proteólisis entrega la

forma madura de 45 KDa.

Figura 2. Mecanismo de Conversión de Císteína a Formil-glicina. Inicialmente el grupo tiol es oxidado hasta tioaldehido, usando un compuesto X como agente aceptor de hidrógenos. Enseguida, el tioaldehido es hidrolizado y se libera H2S. finalmente el aldehido es regenerado por la entrada de agua. Traducido de Bond C et al (104).

Figura 3. Procesamiento de la IDS. Los valores entre paréntesis indican los pesos moleculares de los péptidos sin glicosilar. Traducido de Millat et al (59-61).

Se han caracterizado varias formas de la IDS en tejidos y fluidos humanos con tres

formas A, B y C. En hígado, las formas A y B solo se distinguen entre ellas por su punto

isoeléctrico, siendo la más ácida la forma B y se hacen indistinguibles con la remoción

del ácido siálico (110). Tanto en suero como en líquido amniótico se determinó

únicamente la forma C (107), mientras que en orina (109) y fibroblastos en cultivo las

formas A y B (46). La forma A resultó más termolábil que la B (110), mientras que la

actividad enzimática es óptima a un pH 4.5 (109,110,111), decrece después de 55°C y

es nula por encima de 64°C (112). Los procesos de purificación han resultado poco

eficientes, así, cuando se utilizó un protocolo que incluyó precipitación con sulfato de

amonio, columnas cromatográficas de conA-sefarosa y DEAE Bio-Gel, se extrajeron las

22

formas A y B con rendimientos de 2.3 y 21.2% y purificaciones del orden de 6.7 y 37.6,

respectivamente (110). Los pesos moleculares de las formas aisladas obtenidos por

filtración en gel, variaron entre 170 y 190 KDa para la forma B y entre 80 y 115 KDa

para la forma A, mientras que cuando, los mismos, se determinaron por

ultracentrifugación resultaron entre 81 y 83 y entre 83 y 94 KDa, respectivamente (110).

Posteriormente, el mismo autor (112), agregó al protocolo una electroforésis preparativa

y una columna de fenil-sefarosa CL-48 para aislar solamente la forma B, con un

rendimiento del 6.5% y purificación de 30030 veces. En este caso, el peso molecular

varió entre 80 y 100 KDa. Para extraerse de orina (109), se empleó precipitación con

sulfato de amonio, pasaje por columna cromatográfica de conA-sefarosa, una nueva

precipitación con sulfato de amonio y empleo de una columna de DEAE-celulosa,

separándose las formas A y B con recuperaciones de 17 y 16% y purificaciones de 77 y

124 veces. A partir de 100 litros de orina se obtuvieron 4.4 mg, que se emplearon para

la producción de anticuerpos-IDS en ratones y estandarización de una técnica de

ELISA. Más recientemente (113), se purificó IDSh a partir de hígado y otros órganos

como placenta, riñón e intestino, obteniéndose resultados similares en todos los casos.

El protocolo de purificación incluyó columnas cromatográficas de conA-sefarosa, azul

A-agarosa, PBE 94, TSK HW 50S-fractogel, fenil-sefarosa CL-4B y TSK G3000SW

ultrapac. Utilizando cantidades menores de tejido que en los protocolos anteriores, se

obtuvieron recuperaciones de 5 y 2% y purificaciones de 549450 y 205128 para las

formas A y B de hígado. En todos los casos estudiados, se obtuvieron formas peptídicas

largas y cortas de IDS purificada, tanto para las formas A como B variaron en peso

molecular, entre 39 y 44 KDa y entre 17 y 18.5 KDa al establecerse los pesos por

exclusión molecular, mientras que al estimarse por electroforésis fueron de 42 y de 30

para el péptido largo y para el corto de 18 y de 14 KDa. Aún no se ha determinado la

estructura cristalina de la enzima ni caracterizado sus glicosilaciones.

En cuanto a su actividad biológica, la pierde rápidamente en agua, soluciones como

NaCl 10-100 mM, condroitin 4-sulfato y 6-sulfato 0.1 mM. Nitrocatecol sulfato y

fosfatos la inhiben, mientras que Mn++ 2 mM la incrementa y la albúmina sérica bovina

(BSA) 0.1% la estabiliza (114).

23

Con el propósito de implementar protocolos de TRE para la enfermedad de Hunter, en

el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) de la Pontificia Universidad

Javeriana, el cDNA de la IDS humana fue clonado y expresado en E. coli (Figura 4) y

en P. pastoris (Figura 5) (115,116). Empleando la cepa JM109 de E. coli y el plásmido

pUC 13-IDS se obtuvo actividad catalítica de 1.5 nmol/h/mg de proteína (115) y con la

utilización del plásmido pPIC 9-IDS y la cepa GS115 de P. pastoris valores de

actividad biológica de 2.54 nm/h/mg de proteina a nivel de 10 ml de cultivo (117).

Posteriormente se aumentaron los volúmenes de trabajo hasta 100 ml y se obtuvieron

valores de actividad IDS de 0.75 nm/h/mg de proteina (117). Se ha escalado el

proceso a nivel de biorreactor (118), con el objeto de obtener cantidades de IDShr

suficientes para los procesos de purificación y estudios de caracterización bioquímica de

la enzima recombinante. Esto permitirá las pruebas en animales de experimentación,

como paso previo antes de su empleo en humanos. Actualmente se cuenta con pruebas

de inmunodetección de IDShr como Dot Blot y ELISA (119,120).

Figura 4. Detección Mediante Western blot de la IDShr Expresada en E. coli A (Western blot de 8% SDS-PAGE) y B (Western blot de 12% SDS-PAGE). 1A = lisado, 4B = sobrenadante. 2A y 3B = lisado y sobrenadante control. Tomado de Landázuri P et al (116).

1 2 3 4

A B

KDa 62 52 49 40

KDa 97 49 43 41 40

24

Figura 5. Detección Mediante Western blot de la IDShr Expresada en P. pastoris Carril 1: sobrenadante control, Carriles 2-5: sobrenadantes de 0, 24, 48 y 72 horas de cultivo. Tomado de Landázuri P et al (115). Glicosilación de Proteínas Las glicoproteínas son proteínas con uno o más grupos de carbohidratos

(oligosacáridos) unidos por enlaces covalentes a ciertos a aminoácidos de su cadena

polipeptídica. Un alto porcentaje (91.7%) de las proteínas de mamíferos son

glucoproteínas, el 8.3 % restante son potenciales proteínas no glicosiladas, algunas de

las cuales se asocian a subunidades glicosiladas (121). Las glicoproteinas están

presentes en todos los organismos vivos con diversidad de funciones. Son

glicoproteinas los receptores, componentes de canales y transportadores de membranas

biológicas, hormonas, enzimas, factores de trascripción, componentes de la matriz

extracelular, moléculas de adhesión, neurotransmisores, inmunoglobulinas y moléculas

estructurales. Lo anterior explica la diversidad de funciones en las cuales están

involucradas estas biomoléculas, entre las cuales se pueden señalar el reconocimiento

celular, el intercambio molecular célula-célula y las células-medio, la transmisión de

mensajes bajo el control de los sistemas nervioso y hormonal, la actividad de células

contráctiles, el bloqueo e inducción de rutas metabólicas, el equilibrio iónico y

1 2 3 4 5

25

molecular intra y extracelularmente, algunas actividades relacionadas con la respuesta

inmune, la regulación del ciclo celular, el direccionamiento y otras (122).

Con base en la unión entre la secuencia aminoacídica y las cadenas hidrocarbonadas,

las glucopreoteínas, pueden clasificarse en tres grupos (123):

1. N-glicosiladas, en cuyo caso se presentan enlaces glucosidicos tipo N, es decir,

uniones que involucran el grupo amida de la asparagina (N) y el azúcar N-

acetilglucosamina, en las secuencias N–X–S y N–X–T, donde X puede ser cualquier

aminoácido excepto prolina.

2. O-glicosiladas, en las cuales existen enlaces glucosídicos tipo O, es decir uniones

entre el OH de serina o treonina y el azúcar N-acetilgalactosamina, se incluyen aquí las

uniones a la hidroxiprolina e hidroxilisina de los colágenos

3. GPI-enlazadas, en las cuales se encuentran enlaces glucosilfosfatidilinositol (GPI), es

decir, la unión entre el aminoácido terminal del extremo carboxilo y un residuo

fosforiletanolamida unido a un oligosacárido, el cual a su vez, esta unido mediante una

glucosamina al fosfotidilinositol.

La glicosilación de proteínas se lleva a cabo por una vía biológica compleja, ordenada y

no al azar, dependiente de la secuencia de la proteína, del fenotipo celular y del medio

ambiente fisiológico de la célula sintetizadora. Este proceso puede ser descrito como un

conjunto de eventos químicos que se inician en el retículo endoplasmático y terminan en

el aparato de Golgi (122).

La síntesis de la secuencia aminoacídica de toda glicoproteína se inicia en ribosomas

libres en el citoplasma, con la traducción de su correspondiente ARNm. En principio se

forma una secuencia de 25-30 aminoácidos hidrofóbicos que van a constituir la

secuencia señal. Al empezar a emerger estos aminoácidos del canal del ribosoma son

reconocidos por la partícula de reconocimiento de la secuencia señal (PRS),

ribonucleoproteína compuesta por 300 ribonucleótidos y seis péptidos (122). La síntesis

proteica se detiene hasta que el complejo ribosoma-péptido señal-PRS encuentra sobre

la membrana del retículo un complejo de proteínas, conocido como translocón (124), el

26

cual esta compuesto por el receptor de la PRS, el receptor del ribosoma, el receptor de la

secuencia señal, la peptidasa señal, la oligosacaril transferasa y la sec 69 que constituye

el canal por el cual se transloca el péptido naciente hacia el lumen del retículo

endoplásmico, en donde sufrirá modificaciones postranslacionales como eliminación del

péptido señal por la peptidasa señal, formación y reorganización de puentes de disulfuro

por la proteína disulfuro isomerasa, adición y remoción de azucares y plegamiento

(122).

La síntesis del oligosacárido a ser transferido a un residuo de asparagina del péptido

naciente, se inicia en la cara citoplasmática de la membrana del retículo. Un lípido de

membrana, el dolicol-fosfato (compuesto por unas veinte unidades de isopreno), sirve

como aceptor, inicialmente le es transferida una N-acetilglucosamina-P (GlcNAc-P) a

partir de UDP-GlcNAc bajo la catálisis de la GlcNAc-fosfotransferasa. Posteriormente

otra GlcNAc-transferasa cataliza la adición de una nueva molécula de GlcNAc, luego

secuencialmente a partir de nucleótidos GDP-manosa le son agregadas cinco manosas

con el concurso de las manosiltransferasas I, II, III, IV y V. El complejo formado es

transladado a través de la membrana del retículo endoplásmico, producto de un

movimiento de “flip flop” dirigido por la flipasa e hidrólisis de ATP. Las manosil

transferasas VI, VII, VIII y IX (residentes del retículo endoplásmico), adicionan

secuencialmente cuatro manosas y las glucosil transferasas I y II agregan una y dos

moléculas de glucosa, sin embargo, en este caso no se emplean azucares de nucleótidos

sino el donador es el dolicol-fosfato, al cual se le transfieren los azucares a nivel

citoplasmático. El oligosacárido de 14 azucares (2 GlcNAc-9 manosas y 3 glucosas), es

transferido en bloque sobre el peptido naciente, en una reacción catalizada por la

oligosacaril transferasa y sufre modificaciones en el retículo endoplásmico y luego en el

complejo de Golgi. Una manosidasa elimina una manosa y las glucosidasas I y II

hidrolizan una y las dos restantes moléculas de glucosa. Con excepción de

Schizosacharomyces pombe, que no elimina la manosa, este procesamiento

oligosacarídico es conservado evolutivamente (125). La eliminación de las tres glucosas

es la base de un mecanismo de regulación del correcto plegaje de la glicoproteína, en el

cual intervienen dos proteínas residentes del retículo, la calnexina y la calnereticula, la

primera componente de membrana y segunda proteína soluble. Luego de que dos de

27

las glucosas han sido eliminadas, el glicopéptido se une a la calnexina y/o

calnereticulina, luego se expone al ERp57 otro factor de plegamiento y cuando el tercer

residuo de glucosa es eliminado, el complejo se disocia. Si la proteína no está bien

plegada, el oligosacárido es reglucosilado por una glucosiltransferasa y la proteína se

asocia con las mencionadas lectinas, repitiéndose el ciclo hasta lograr su plegamiento

correcto (126) o ser degrada por el proteosoma 23S, para lo cual es transportada

retrógradamente a través de la membrana (127). Al superar este punto de control la

glicoproteína en formación pasa al complejo de Golgi en donde continua su

procesamiento.

En el complejo de Golgi existen compartimentalizadas, glucosiltransferasas,

glicosidasas, fosforilasas y fosfatasas que van a permitir la modificación del

oligosacárido en formas muy variadas dependiendo del destino final, el tipo de tejido y

organismo específico. Si las proteínas tienen como destino ser secretadas, o formar

parte de una membrana biológica, en la cara cis de Golgi, las manosidasas 1a y 1b

eliminan cuatro moléculas de manosa, estos oligosacáridos corresponden a los

denominados de alta manosa compuestos, entonces por dos acetilglucosaminas y 5-8

manosas. En la cara medial, GlcNAc transferasas I y II adicionan una y luego otra

molécula de GlcNAc, mientras que la fucosil transferasa cataliza la reacción de

trasferencia de una fucosa. Finalmente, en la cara trans de Golgi la galactosil trasferasa

y la sialil transferasa dirigen la adición de dos galactosas y dos ácidos siálicos,

respectivamente, teniendo como donadores los nucleótidos GDP-fucosa, UDP-

Galactosa CMP-ácido siálico, los cuales ingresan a las cavidades del complejo de Golgi

mediante sistemas de transporte tipo antiporte, que permite la salida y con ello el

reciclaje de los nucleótidos. Los oligosacáridos así formados son conocidos como

oligosacáridos complejos y pueden hallarse desde dos hasta cinco cadenas

hidrocarbonadas. El tercer tipo de oligosacárido que puede encontrarse en una

glicoproteína es del tipo híbrido, en este caso en la cara medial de Golgi, no son

eliminadas manosas, se adicionan dos acetilglucosaminas y en trans Golgi galactosas y

ácidos siálicos. Aunque las cadenas híbridas y de alto contenido de manosa se forman

por procesamiento de cadenas complejas, todos los N-oligosacáridos conservan en

común una estructura pentasacárida (2 N-acetilglucosaminas y 3 manosas).

28

A diferencia de las glicoproteínas de secreción y de membrana, las destinadas a

convertirse en proteínas lisosómicas sufren a nivel del complejo de Golgi un

procesamiento diferente para ser direccionadas a los lisosomas a través de un marcador

biológico especifico denominado el parche manosa 6-fosfato. En la cara cis de Golgi, en

una primera reacción catalizada por la N-acetilglucosaminil-fosfotransferasa se

transfiere N-acetilglucosamina-P al carbono seis de uno o varios residuos de manosa y

en una segunda reacción catalizada por una fosfodiesterasa, es removida la N-

acetilglucosamina, dejando fosforiladas las manosas en posición 6. En las caras medial

y trans de Golgi existen receptores de manosa 6-fosfato, los cuales reconocen el

mencionado motivo y retienen las enzimas que luego en vesículas recubiertas de clatrina

son dirigidas a los lisosomas, con la participación de receptores de la familia SNARE

(128).

Aunque los mecanismos de O-glicosilación no estan completamente dilucidados,

existen varias diferencias en la síntesis con respecto a las N-glicoproteinas. En el caso

de las O-glicosilaciones la unión se realiza entre el OH de la serina/treonina y la N-

acetilgalactosamina o la galactosa, en el caso de los colágenos, menos frecuentes son las

O-glicosilaciones utilizando fucosa, xilosa o glucosa (129). Adicionalmente, se han

reportado las O-glicosilaciones glucosa-tirosina y manosa-triptofano, en la glicogenina

y una ARNasa humana (129). En este tipo de glicosilación los azucares se unen uno a

uno, no participa el dolicol fosfato ni las glucosidasas (123). Existen enzimas

específicas para las O-glicosilaciones, sin embargo, hay otras comunes para N y O-

glicosilaciones. Aunque se conocen unos pocos casos de O-glicosilación directa de

proteínas citoplasmáticas y nucleares, la formación de O-glicanos se efectúa en el

retículo endoplásmico y el complejo de Golgi. En el caso de las levaduras se inicia con

la adición de dos manosas a partir del dolicol-P-Manosa y en el aparato de Golgi hay

elongación con 1-7 residuos (125), mientras que para los mamíferos se han postulado

dos modelos: en el primer caso, en el retículo hay adición de manosas con catálisis de la

O-manosil transferasa 1 (POMT1) y elongación con diversos azucares en el aparato de

Golgi (129). En el segundo caso se inicia directamente en el complejo de Golgi, en

29

donde se transfieren Galactosa, GlcNAc, GalNAc y posterior elongación y modificación

con adición de polilactosamina, acido siálico, fucosa, sulfatos y acetilos.

Con relación a las proteínas enlazadas a GPI, la primera etapa en la síntesis consiste en

la transferencia de la GlcNAc, desde UDP-GlcNAc hasta el inositol fosfato. La

GlcNAc es desacetilada e inmediatamente son adicionados tres residuos de manosa y

posteriormente la fracción fosforil etanolamida que permite la unión al aminoácido

terminal del extremo carboxilo del péptido (123).

Se ha señalado que las glicosilaciones están involucradas en los procesos de plegaje

(126,127,130), direccionamiento (128), estabilidad (130,131), transporte (130),

reconocimiento (132), señalización (133), secreción (134) y actividad catalítica en el

caso de las enzimas (130,131).

Aplicación de Programas Computacionales en el Análisis de Macromoléculas

Existen una serie de programas computacionales que proporcionan una amplia gama de

predicciones a nivel estructural de macromoléculas, de las cuales, aun no se ha logrado

experimentalmente determinar su estructura tridimensional. Este tipo de estudios exigen

seguir una metodología computacional, utilizando diversos programas que son de libre

acceso y que en muchos casos son servidores Web, siendo esto una herramienta muy

importante y de gran utilidad como fuente de datos. Posteriormente, con los datos

obtenidos, se procede a realizar un análisis bioquímico de la macromolécula con el

propósito de obtener un modelo o aproximaciones a la estructura y función de la

biomolécula en estudio (135). Dentro de las herramientas computacionales usadas

tenemos servidores Web, los cuales presentan múltiples opciones para el análisis de las

estructuras moleculares en estudio y programas que permiten visualizar estas moléculas.

De los servidores más comúnmente empleados podemos señalar al National Center for

Biotechnology Information (NCBI) (136), establecido en 1988 como una fuente para la

información de biología molecular, el cual crea bases de datos públicas, conduce

investigaciones en biología computacional, desarrolla herramientas de sofware para

analizar los datos de los genomas, información biomédica y otras opciones. El servidor

30

del Swiss Institute of Bioinformatics (SIB): ExPASy (Expert Protein Analysis System)

Molecular Biology Server (137), está dedicado al análisis de secuencias y estructura de

proteínas, presenta un gran sistema de enlaces a bases de datos y ofrece opciones para

la predicción de gran número de aspectos estructurales de las moléculas en estudio.

Está claramente establecido que menos del 1% del total de proteínas tienen estructura

terciaria determinada experimentalmente y cerca del 20% de los dominios del total de

proteínas son reportados como producto de la predicción computacional por homología.

Lo que significa que tenemos conocimiento de menos del 10% del total de proteínas y

aunque la mayoría de estas estructuras tridimensionales han sido obtenidas por

cristalografía o resonancia magnética nuclear (NMR), también muchas de ellas son

producto del modelaje teórico (138). Dadas las limitantes técnicas y económicas que

significa las tecnologías señaladas, surge como alternativa viable la predicción

computacional, siguiendo algoritmos establecidos, pero que necesariamente requieren el

concurso de la experiencia experimental del investigador (138).

31

MATERIALES Y METODOS

SEPARACIÓN DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EXPRESADA EN Pichia pastoris Y Escherichia coli .

Determinación de la Concentración de Proteínas

La concentración de proteínas totales se estableció mediante la técnica de Folin-Lowry

(139), para lo cual se emplearon 20 µl de cada muestra, se le adicionaron 500 µl del

reactivo de cobre (0,278 g de tartrato de sodio y potasio, 66 mg de CuSO4.5H2O, 2.0 g

de NaCO3.10H2O en 100 ml de agua desionizada) y se incubaron a 55°C durante cinco

minutos, enseguida les fueron agregados 2.0 ml del reactivo de folin (625 ml de folin

en 100 ml de agua) y se realizó la lectura de absorbancia a 610 nm. Para estimar la

concentración de proteína total en las muestras, se elaboró una curva de calibración de

BSA, con soluciones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mg/ml.

Determinación de Actividad Enzimática de la IDShr Para la determinación de la actividad enzimática de la IDShr se empleó el sustrato

fluorométrico 4-metil umbeliferil-α-iduronato 2-sulfato (MU-αIdoA-2S) 1.25 mM

(140). A 10 µl de muestra se le adicionaron 20 µl de buffer del sustrato

(CH3COONa/CH3COO y Pb(CH3COO)2.3H20 10 mM) y se incubó a 37ºC durante

cuatro horas, al cabo de las cuales se le adicionaron 40 µl de buffer Pi/Ci (NaH2PO4

0.4 M, C6H5Na3O7.2H2O 0.2M pH 4.5 y NaN3 0.02%) y 10 µl de LEBT (suspensión

de enzimas lisosomales de hígado de conejo, parcialmente purificadas). La solución fue

incubada por 24 horas a 37ºC. La reacción se detuvo con 650 µl de buffer de parada

(NaHCO3/NaCO3 0.5M, pH 10.7, conteniendo glicina 1.7 mM). La fluorescencia fue

determinada en un fluorómetro Turner 450, con longitudes de onda de excitación y

emisión de 360 y 415 nm, respectivamente. Como control se empleó plasma humano.

La actividad enzimática fue expresada como nanomoles de sustrato convertido por hora

por miligramos de proteína total (nmol/h/mg de proteína total).

Para el cálculo de la actividad catalítica de la enzima se utilizó la siguiente fórmula

32

Actividad IDS = (FA - FB) X FF X D

4h

FA: Fluorescencia de MU-αIdoA-2S

FB: Fluorescencia de Blanco

D: Dilución de la muestra.

FF: Factor de fluorescencia. Calculado como:

0.6 mg x 1µmol x 30 µl x 1000nmol x 1 = 0.9 ml 198.2mg 10µl µmol 10 (1) (2) (3) (4) (5)

En donde:

(1) = Concentración de Sustrato.

(2) = Peso Molecular de Sustrato.

(3) = Relación volumen total/volumen de muestra.

(4) = Factor de conversión a nmol.

(5) = Sensibilidad del Fluorómetro.

Determinación de Actividad Proteolítica

A 1.0 ml de cada muestra le fue añadido 1.0 ml de solución de caseína al 1% (p/v)

preparada en buffer fosfato. Se incubó a 65°C durante 30 minutos y se adicionó a

cada muestra 1.0 ml de ácido tricloroacético al 15% (p/V). La reacción se detuvo

incubando por cinco minutos a 4°C, se leyó la absorbancia a 280 nm de longitud de

onda y el cálculo fue realizado estimando que 0.5 unidades de DO son equivalentes a

10 unidades proteolíticas (UP/ml/min) (141).

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida

A las muestras se les adicionó un volumen igual de buffer de carga (Tris-HCl 50 mM,

pH 6.8, ditiotreitol 100 mM, dodecil sulfato de sodio (SDS) 2%, azul de bromofenol

0.1% y glicerol 10%). Las proteínas se separaron por electroforesis en geles de

poliacrilamida al 12% (SDS/PAGE), según el método descrito por Laemmli (142).

33

Western Blot

Las proteínas presentes en las muestras de E. coli y P. pastoris, se separaron mediante

SDS-PAGE y fueron transferidas a papel de nitrocelulosa Hybond. La membrana fue

bloqueada con TTBS (TBS, Tween 0.1%) y leche descremada al 5% (143). Como

control positivo fue utilizado un anticuerpo monoclonal donado por Kasuko Sukegawa

de la Universidad de Gifu del Japón. Como anticuerpo secundario se empleó anti-IgG

de ratón marcado con peroxidasa (Sigma), para el control positivo y cuando se probó

su especificidad o al ser utilizado como control el anticuerpo policlonal producido en

conejo, se uso como anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa

(Sigma).

Producción de Anticuerpos Policlonales contra Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa Humana Recombinante (IDShr).

Para la producción de anticuerpos policlonales se utilizó IDShr purificada y donada por

Transkariotic therapies (TKT). Se utilizaron dos conejos, a los cuales se les inoculó con

concentraciones diferentes de IDShr (100 µg/ml o 50 µg/ml). Se realizaron cinco

inmunizaciones con intervalos de siete días, utilizando en la primera adjuvante

completo de Freund´s y en las siguientes, adjuvante incompleto de Freud´s. El suero

obtenido del sangrado de los animales se diluyó 1:2 con PBS pH 7.2, luego fue

filtrado empleando una membrana de 0.45 µm y se corrió con un flujo de 1.0 ml/min,

en una columna de afinidad Hi-Trap Protein A (Amersham Pharmacia Biotech), como

buffer de corrida se empleó PBS pH 7.2 y se eluyó con ácido cítrico 0.1 M pH 3.6.

Las fracciones fueron colectadas en 60 µl de Tris-HCl 1.0 M pH 9.0, cuantificadas por

el método de Folin-Lowry y evaluadas por PAGE-SDS 12%. El título de los

anticuerpos fue determinado por Dot blot, para lo cual 25 ug/ml del antígeno fueron

colocados sobre una membrana de nitrocelulosa HYBOND 0.22 nm previamente

humedecida en TBS (Tris HCl 20 mM pH 7.5, NaCl 500 mM) y como control se utilizó

suero preinmune del conejo. La membrana fue bloqueada con una solución de TBS,

BSA 1% y se lavó con TTBS. Posteriormente, se realizaron diluciones dobles seriadas

del anticuerpo en TTBS-BSA 2% y nuevamente fue lavada. Se adicionó el anti-IgG de

conejo marcado con peroxidasa en una concentración de 0.4 ug/ml en solución TTBS-

34

BSA 2% y se realizó un último lavado. Para visualizar la prueba, la membrana de

nitrocelulosa, fue tratada con una solución de 3´-3´ Diaminobenzidina durante 30

segundos, se incubó durante 30 minutos en PBS pH 7.2 y se dejó secar (119). La

especificidad del anticuerpo policlonal obtenido fue comprobada por Western blot. La

IgG purificada fue dializada contra PBS 0.1 M pH 7.0 para ser empleada en la

elaboración de una columna de afinidad.

Preparación de una Columna de Afinidad (Superosa 6 GP-anti IDShr)

Para la preparación de una columna de afinidad se utilizaron 2.0 ml de Superosa 6 PG

(Amersham Pharmacia Biotech), los cuales fueron lavados con 20 ml de agua destilada

estéril y se mezclaron con 4.0 ml de NaIO4, se incubó en agitación a temperatura

ambiente durante dos horas, al cabo de las cuales se lavó con 20 ml de PBS, fueron

adicionados 12 mg de CNBr y nuevamente se lavó con 20 ml de agua destilada estéril.

Enseguida, le fueron adicionados 25 mg de IgG anti-IDS y se dejó en incubación

durante 12 horas. Se empacó la columna y fue equilibrada con 20 ml de PBS (143). La

columna se probó con una muestra de retentado del cultivo M-13 de P. pastoris.

Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris

Para la expresión de la IDShr se empleó la cepa GS115 (Invitrogen) de P. pastoris

transformada con el plásmido pPIC9-IDS (115). Utilizando el clon pPIC9-IDS/28

fueron realizados 20 cultivos a nivel de biorreactor, con volúmenes de trabajo de uno

hasta tres litros los mismos se denominaron secuencialmente M-1 hasta M-20. La

levadura recombinante fue crecida en medio salino (3.5 ml de H3PO4 85%, 0.15 g

CaSO4·2H2O, 2.4 g de K2SO4, 1.95 g de MgSO4·7H2O, 0.65 g KOH) durante 120

horas, con inducción por metanol (0.5%) cada 12 horas a partir de las 24 horas de

cultivo (144). Los cultivos fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 min a 4°C y los

sobrenadantes obtenidos sometidos a ultrafiltración en un sistema Amicon con el

empleo secuencial de membranas de celulosa regenerada YM-100 y YM-30 (“cut off”

de 100 y 30 KDa, respectivamente). Las fracciones concentradas (volúmenes máximos

de 10 ml) obtenidas de esta forma, fueron corridas en una columna de exclusión

molecular, de Sephacryl S-200 (Amersham Pharmacia Biotech), de longitud 40 cm y

35

con un flujo de 0.5 ml/min, empleando como solución de corrida buffer acetato 0.1 M

pH 5.0. Los picos de absorbancia a 280 nm, que mostraron actividad IDShr fueron

corridos en columna de Superosa 6 GP-anti IDS, de longitud 3.5 cm y con flujo de 0.2

ml/min. La columna fue equilibrada con PBS pH 7.2 y las fracciones de IDShr fueron

eluídas con TBS pH 8,75. Los eluídos de la columna de afinidad fueron cuantificados

por el método de Folin-Lowry, determinada su actividad proteolítica, actividad IDShr y

evaluados por electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% según las metodologías

descritas anteriormente.

Concentración de Proteínas por Liofilización

Con el propósito de probar un protocolo de liofilización como sistema de concentración,

se tomaron muestras de cada una de las fracciones del proceso de ultrafiltración. Las

mismas fueron dejadas 48 horas a -70°C y se liofilizaron durante 12 horas empleando

un liofilizador LabCongo (Lyph-lock-6-freez Dry). Los liofilizados fuero reconstituidos

en 1.0 ml de buffer acetato 0.1 M pH 5.0.

Dializado de Muestras para Actividad IDShr

Con el fin de establecer el efecto de un proceso de diálisis sobre la actividad enzimática

de la IDShr, se dializaron durante 24 horas contra TRIS-HCl 0.1 M pH 7.0 muestras de

cada una de las fracciones de la ultrafiltración y posteriormente se sometieron a la

prueba de actividad enzimática. Para activar la membrana (12 KDa), se lavó en agua

destilada durante tres horas, se colocó en una solución de sulfito de sodio al 0.3% a

80°C durante un minuto y luego dos minutos a 60°C. Fue lavada con ácido sulfúrico al

0.2% y luego con agua caliente.

Ruptura Celular de Pichia pastoris

Células obtenidas de la centrifugación del cultivo denominado M-13' fueron sometidas

a ruptura celular (145). Para lo cual el precipitado obtenido por centrifugación del

cultivo fue resuspendido en solución salina e incubado a 4°C por 24 horas. Un mililitro

de la solución fue centrifugado a 3000 rpm durante 10 min y el precipitado fue

resuspendido en 1.0 ml de buffer de ruptura (NaH2PO4 50 mM, EDTA 1.0 mM, glicerol

5% (v/v), PMSF 1.0 mM y pH 7.44 ajustado con NaOH 5N). Se leyó la absorbancia a

36

600 nm y se ajustó a una DO entre 50-100. La solución así tratada, fue alicuotada en

dos eppendorf y se agregó un volumen igual de perlas de vidrio. Las muestras fueron

sometidas a 9 ciclos de incubación en hielo y agitación en vortex de 30 y 90 segundos,

respectivamente. Las muestras fueron centrifugadas a 10000 rpm a 4° durante 10 min. A

los sobrenadantes obtenidos se les determinó actividad IDShr y cuantificación de IDShr

por ELISA.

Separación de la IDShr Expresada en Escherichia coli. Para la expresión de la IDShr recombinante se empleó la cepa JM109 de E. coli

transformada con el plásmido pUC13-IDS (JM109-pUC13/IDS) (116). La bacteria se

hizo crecer en LBA (triptona 1%, extracto de levadura 5%, cloruro de sodio 1% ) con

50 µg/ml de ampicilina y en medio mínimo (K2HPO4/KH2PO4 0.05M pH 7.2; NH4Cl

0.1%, MgCl2.6H2O 0.01%, NaCl 0.001%, MnCl2.4H2O 0.001%, FeCl3.6H2O

0.001%, xylosa 0.5%, metionina 3.0 mM y tiramina 3.0 M), con 50 µg/ml de

ampicilina. Las fermentaciones discontinuas se realizaron en frasco agitado

(erlenmeyer) durante ocho horas a 37°C y 250 rpm. Como control se empleó la cepa

JM109 sin transformar. Los cultivos fueron centrifugados a 3500 rpm por 20 minutos a

4°C y a los sobrenadantes obtenidos se les realizó cuantificación de proteínas y

actividad IDShr empleando las técnicas ya descritas.

Los precipitados obtenidos de la centrifugación se sometieron a ruptura celular, para lo

cual se resuspendieron en buffer de ruptura (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 200 mM,

glicerol 5%, ditiotreitol 1.0 mM, PMSF 1.0 mM), luego se les adicionaron 300 µg/ml de

lisosima y se incubó durante una hora a 4ºC. La suspensión fue sometida a tres ciclos

de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y centrifugada a 13000 rpm a 4°C

por 15 minutos. Finalmente, los sobrenadantes fueron dializados contra Tris-HCl 0.1 M

conteniendo NaCl 0.1M (146).

Los sobrenadantes de la centrifugación tanto de los cultivos como de los precipitados

obtenidos después de la ruptura enzimática, fueron sometidos a ultrafiltración en un

sistema AMICON con el empleo secuencial de membranas de celulosa YM-100 y

37

YM-30 para la excluir moléculas mayores a 100 KDa y menores de 30 KDa,

respectivamente. Luego, se corrieron en una columna de exclusión molecular de

Sefacryl S-200 (Amersham Pharmacia Biotech), de longitud 40 cm y con un flujo de 0.5

ml/min, empleando buffer acetato pH 5.0 como solución de corrida. Los picos de

absorbancia a 280 nm, que mostraron actividad IDShr fueron corridos con flujo de 0.2

ml/min en una columna de afinidad, de longitud 3.5 cm, realizada con Superosa 6-GP-

anti IDS. La columna fue equilibrada con PBS pH 7.2 y las fracciones de IDShr fueron

eluídas con TBS pH 8,75.

EXPRESION DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EN Escherichia coli EMPLEANDO EL SISTEMA DE FUSION DE GENES GLUTATION S-TRANSFERASA (GST)

Plásmidos

El gen de la IDSh fue obtenido a partir del plásmido pUC13-IDS, el cual contiene la

secuencia regulatoria y la 3' del gen de la β-galactosidasa del operón lac, un sitio

múltiple de clonación, un origen de replicación, un sitio de trascripción-terminación y

el gen de resistencia a la ampicilina (116). El pUC13-IDS se construyó insertando el

cDNA de la IDSh (1.65 kb), en el sitio de restricción para la enzima EcoRI, el tamaño

total de este constructo es de 4.4 kb.

Como plásmido de expresión fue empleado el pGEX 3X que contiene el gen de la

glutation S-transferasa, un origen de replicación, un sitio múltiple de clonación, el gen

de resistencia para ampicilina y la región para el factor de clivaje Xa. El tamaño de este

plásmido es de 4.52 Kb (147).

Microorganismos

Para la multiplicación de los plásmidos pUC13-IDS y pGEX 3X-IDS y la expresión de

la IDShr se empleó la cepa JM109 de E. coli.

Purificación de los plásmidos

La obtención de los plásmidos se realizó a partir de cultivos de E. coli JM109

transfectadas con el pUC13-IDS y E. coli DH5α transfectada con el pGEX 3X. De los

38

cultivos se tomaron 1.5 ml que fueron centrifugados a 3000 rpm durante 15 minutos a

4°C. El precipitado fue resuspendido en 200 µl de TEG (Tris 25 mM, EDTA 10 mM pH

8.0) y dejado a temperatura ambiente durante cinco minutos, al cabo de los cuales se le

adicionaron 400 µl de buffer de lisis (NaOH 0.2 N, SDS 1%) y se colocó en hielo

durante cinco minutos. Luego le fueron adicionados 300 µl de acetato de sodio 3.0 M

pH 4.8 y después de homogenizar se dejó cinco minutos en hielo, al cabo de los cuales

se centrifugó a 12000 rpm durante cinco minutos a 4°C. Al sobrenadante separado le

fueron adicionados 480 µl de isopropanol frío y se incubó a -20°C por 20 minutos.

Luego se centrifugó a 12000 rpm durante 15 minutos a 4°C, posteriormente el

sobrenadante fue descartado y el precipitado resuspendido en 100 µl de TE 1X (Tris-

HCl 10mM pH 8.0, EDTA 1 mM pH 8.0) (148). La concentración de ADN plasmídico

se cuantificó por espectrofotometría. Posteriormente el ADN se sometió a electroforesis

en gel de agarosa al 1.5% y se visualizó con bromuro de etidio (149).

Separación de la Banda de cDNA IDSh del pUC13-IDSh

El plásmido pUC13-IDSh fue digerido usando dos unidades de enzima EcoRI, por cada

µg de DNA plasmídico en un volumen final de 50 µl, luego incubado durante cuatro

horas a 37°C. Los productos de la digestión se separaron por electroforesis en gel de

agarosa al 1.5 % y corrida en buffer TBE 1X (Trisma base 1.0 M, ácido bórico 1.0 M y

EDTA 20 mM) y visualización con bromuro de etidio. El fragmento de 1,65 kb

correspondiente al cDNA de la IDSh se extrajo del gel y fue purificado empleando el

Kit de purificación de ADN Wizard PCR Prep de Promega. Dicho fragmento fue

retirado del gel, transferido a un tubo eppendorf e incubado a 65°C hasta que la agarosa

se licuó, luego de lo cual le fue adicionado 1.0 ml de resina y homogenizado durante 20

segundos y luego se procedió a extraer la agarosa realizando vacío. La suspensión fue

transferida a una minicolumna, se le adicionaron 2.0 ml de isopropanol al 80%, después

de centrifugar a 10000 rpm por dos min, la minicolumna fue transferida a otro

eppendorf para eluir el ADN. Se le adicionaron 50 µl de agua libre de nucleasas y se

centrifugó a 10000 rpm durante un minuto.

39

Digestión del plásmido pGEX 3X

Para la digestión del plásmido pGEX 3X se empleó una mezcla de reacción compuesta

de 1.0 µl EcoRI, 1.0 µl de buffer 10x, 4.0 µl de agua libre de nucleasas y 4.0 µl del

vector, se incubó por dos horas a 30°C y se inactivó la enzima con una incubación a

65°C durante 15 minutos.

Desfosforilación del pGEX 3X-IDSh Digerido

Para desfosforilar los vectores se siguieron las instrucciones del fabricante de la

enzima “Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal” (CIAP) (Promega) (150) y las

recomendaciones de Sambrook et al (148). Para el cálculo de los picomoles de extremo

a desfosforilar se empleó la fórmula:

04.3×⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

kb

linealends TallaADN

gADNpmol µ

En donde: (3.04) = Coeficiente de extinción molar.

Obtención del constructo pGEX 3X-IDSh

Para lograr la ligación entre los vectores linealizados y desfosforilados se siguieron las

instrucciones del fabricante de la enzima “T4 DNA Ligase” (Promega) (150) y las

recomendaciones de Sambrook et al (148). Se ensayaron las relaciones molares

inserto:vector 5:1, 3:1 y 1:1. Para el cálculo de los nanogramos de inserto se utilizó la

fórmula:

( ) ba

VectorkbInsertokbVectorng

Insertong ××

=)(

)()(

En donde: ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

ba . Relación molar de

VectorInserto

.

Preparación de Células Competentes de E. coli

La preparación de células competentes de E. coli se efectúo con CaCl2, para lo cual una

colonia de E. coli JM109, se inoculó en 40 ml medio LB y se incubó toda la noche en

40

agitación a 37°C. Luego 400 µl de este cultivo se inocularon en 40 ml de medio fresco

y fueron incubados a 37°C, con agitación hasta una DO entre 0.3 y 0.4 a 600 nm. Este

cultivo fue transferido a tubo de polipropileno de 50 ml y dejado en hielo por 10

minutos, al cabo de los cuales se centrifugó durante cinco minutos a 3000 rpm a 4°C,

se descartó el sobrenadante y el precipitado fue resuspendido en 20 ml de una solución

fría de CaCl2 50 mM. La solución fue dejada en hielo durante 30 minutos,

posteriormente centrifugada a 2500 rpm durante cinco minutos a 4°C, el precipitado

se resuspendió en 4.0 ml de CaCl2 50 mM frío y se dejó por 24 horas a 4°C (149).

Transformación en E. coli competentes

10 ng del plásmido pGEX 3X-IDS se agregaran a 100 µl de cultivo de E. coli JM109

competentes. La mezcla se colocó en hielo por 30 minutos, después de los cuales se

sometió a un choque térmico a 42°C por dos minutos, posteriormente fue adicionado

1.0 ml de medio LB e incubado con agitación suave por una hora a 37°C. Finalmente se

sembraron alícuotas de 50, 100 y 200 µl de las colonias transformadas, en cajas de Petri

con medio LB agar con 50 µg/ml ampicilina (LBA). Las placas se incubaron durante 16

horas a 37°C. Las colonias de las células que crecieron en agar LBA se aislaron y

resuspendieron en 3.0 ml de medio LBA para luego incubarse durante toda la noche

en agitación a 250 rpm a 37ºC (148). De estos cultivos se tomaron 1.5 ml para la

extracción del ADN plásmido y su corrida en gel de agarosa al 1.5% y se visualizó con

bromuro de etidio.

Bancos de E. coli

Los bancos de cepas fueron realizados según el método descrito por Poutou y

colaboradores (151). Las cepas se crecieron en LB por 12 horas a 37 °C y 250 rpm.

Posteriormente se le agregó al volumen de cultivo igual cantidad de medio

suplementado con glicerol al 60% (v/v). Alícuotas de 1.0 ml fueron congeladas a -70 °C

en viales de crioconservación.

41

Expresión de la IDShr en Escherichia coli JM109-pGEX 3X.

Se realizaron cultivos de E. coli JM109-pGEX 3X en LBA en volúmenes de trabajo de

100 ml empleando fiolas de 500 ml, sometidos a 250 rpm de agitación y 37°C por 18

horas. Los cultivos fueron centrifugados a 4000 rpm por 15 minutos y se tomaron

muestras de sobrenadantes y lisados, obtenidos según metodología descrita, para

pruebas de actividad IDShr y ELISA.

ANALISIS COMPUTACIONAL DE LA ENZIMA IDURONATO 2 SULFATO SULFATASA HUMANA (IDSh) Acceso Computacional a la Secuencia de IDSh

El número de acceso para la IDSh a Gen Bank es AAA63197 (136), a Medline se

realizó por el número 91046030, a PubMed con el código 2122463 y allí se encontró

la secuencia aminoacídica de la IDS, en formato FASTA, necesario para los estudios

computacionales, obtenida a partir de la traducción conceptual del cDNA reportada por

Wilson (12,13).

Accesibilidad, Hidrofobicidad, Flexibilidad

Para la predicción de los perfiles de accesibilidad, hidrofobicidad y flexibilidad se

empleó “ProScale" de ExPASy (152).

Punto Isoeléctrico y Peso Molecular

Para las predicciones del punto isoeléctrico y del peso molecular se utilizó el programa

Comput pI/MW (153).

Sitios de Fosforilación

Los potenciales sitios de fosforilación fueron determinados por Netphos-2 (154).

Sitios de Glicosilación

Los potenciales sitios de O- y N-glicosilaciones fueron establecidos por los programas

Net-Oglyc 3.1 (155) y Net-Nglyc 1.0 (156), respectivamente.

42

Bloques y Prints

Los bloques y prints de similaridad con otras moléculas, se obtuvieron mediante el

programa Findermotif (157).

Perfil de Antigenicidad

Para la determinación del perfil de antigenicidad se utilizó el programa JaMBW Chapter

3.1.7 (158).

Alineamientos

Los alineamientos de secuencias fueron realizados empleando el programa BLAST de

NCBI (159).

Estructura Secundaria

Para predecir la estructura secundaria se empleó “Proteomics and Sequence Análisis

Tools” de ExPASy, la secuencia de 517 aminoácidos se remitió a los siguientes

programas de predicción de estructura secundaria: GOR, GOR 1, GOR 3, nnPred,

Sspro, Casp, Meta-Predict, Fasta, SUB, rdb y Psi-Pred y se obtuvo un consenso de

las predicciones de dichos programas (159-165).

Estructura Terciaria

En la predicción de la estructura terciaria se utilizó “Proteomics tools” de ExPASy,

para lo cual, la secuencia de 517 aminoácidos se remitió a los siguientes programas de

predicción de estructura terciaria: SWISS-MODEL, Geno3d, CPH models, 3D-PSSM,

ProSup, SWEET (166-170). Para construir los fragmentos peptídicos que no tuvieron

predicción computacional se empleó el programa BLAST (159), el cual mediante

múltiples alineamientos permitió obtener fragmentos de otras moléculas con secuencias

similares a la IDSh. Finalmente, los 62 residuos que no se encontraban en ninguno de

los fragmentos obtenidos fueron adicionados manualmente uno a uno, atendiendo a su

orientación de acuerdo a la predicción secundaria, para lo cual se empleó el programa

Swiss-pdb Viewer (spdbv) versión 3.7 (166). El modelo de estructura fue minimizado

con el programa Discover 3, del paquete de Insight II 2004, en un computador Silicon

43

Graphic Octane. Para visualizar la estructura tridimensional, se emplearon los

programas RasMol versión 2.6 (171) y spdbv 3.7 (166).

Modelo Estructural del Sitio Activo

Un análisis teórico y computacional de la comparación de estructura y función de otras

sulfatasas (103-106,172), permitió proponer un modelo para el sitio activo de la IDSh.

Para la construcción del heparán sulfato (uno de los sustratos naturales de la IDSh), se

empleó el programa WebLab Viewer Pro (173).

Análisis de las Mutaciones Puntuales

Un análisis teórico y computacional se realizó para las mutaciones puntuales de la IDSh

(16-39).

44

RESULTADOS SEPARACIÓN DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EXPRESADA EN Pichia pastoris Y Escherichia coli.

Determinación de la Actividad enzimática de la IDShr

La actividad enzimática se determino mediante una técnica fluorométrica (140) y para la

misma se empleó como control plasma humano, el cual se mantenía congelado y se

descongelaba para cada ensayo. Progresivamente junto con las descongelaciones la

actividad de la IDSh disminuía. La tabla 2 muestra las variaciones en actividad catalítica

con relación a los procesos de congelación-descongelación de los plasmas empleados.

Producción de Anticuerpos Policlonales Contra la Iduronato 2-Sulfato Sulfatasa Humana Recombinante (IDShr). Los animales fueron sacrificados a los 36 días y se obtuvieron de los conejos 1 y 2,

respectivamente, 85 y 50 ml de sangre, de los cuales fueron obtenidos 45 y 30 ml de

suero. Las fracciones de IgG separadas fueron cuantificadas mediante la técnica de

folin-Lowry y el título de los anticuerpos fue determinado por la técnica de Dot blot

(Tabla 3).

Las fracciones purificadas fueron corridas en PAGE-SDS al 12% (Figura 6) y en todos

los casos pudieron evidenciarse las bandas correspondientes a las cadenas livianas y

pesadas de la IgG purificada.

La especificidad del anticuerpo policlonal producido fue comprobada por Western blot,

empleando proteína purificada por TKT (Figura 7). El anticuerpo policlonal reconoció

una banda entre 70 y 80 KDa. Además, en un sobrenadante de E. coli reconoció bandas

de 20, 40, 60 y 120 KDa (Figura 8). En un retentato (fracción entre 30 y 100 KDa) de

M-12 reconoció bandas de 70 y 120 KDa (Datos no mostrados).

45

Tabla 2. Efecto de Procesos de Congelación-Descongelación sobre la Actividad de IDS plasmática

Los plasmas fueron conservados a -20°C, se descongelaron para cada prueba y fueron empleados como control en una prueba fluorométrica con el sustrato MU-αIdoA-2S para la determinación de actividad IDSh

Plasma Pruebas (Horas) Fluorescencia Act. IDS

(nmol/h/mg) Disminución

(%) Primera ( 0h) 10 27 1 Segunda (96 h) 23 10.35 61.66 Tercera (936 h) 1 2.70 90.00 Cuarta (1584 h) 4 1.80 94.44 Primera ( 0h) 57 25.65 2 Segunda (192 h) 30 13.50 47.36 Tercera (1296 h) 11 4.95 80.67 Cuarta (1488 h) 6 2.70 89.47 Primera (0h) 54 36.00 3 Segunda (96 h) 37 16.55 54.02 Tercera (264 h) 23 10.35 71.25 Cuarta (312 h) 12 5.40 85.00 Primera (0h) 225 50.63 4 Segunda (72 h) 54 23.52 53.54 Tercera (696h) 29 13.05 74.22 Cuarta (1704 h) 13 5.85 88.44 Primera (0h) 72 42.89 5 Segunda (360) 45 32.45 24.34 Tercera (504) 24 12.86 70.01 Cuarta (576) 7 5.40 87.40

46

Tabla 3. Concentración y Título de Anticuerpos Policlonales Anti-IDShr (IgG) Obtenidos en Conejos

La concentración de IgG fue determinada por la técnica Folin-Lowry y es expresada en mg/ml, mientras que el título fue establecido mediante Dot blot, empleando IDShr purificada por TKT.

Figura 6. Electroforesis de Anticuerpo Policlonal anti-IDShr. PAGE-SDS al 12%. Carriles: 1 Suero preinmune, Carriles 2, 3, 4 y 5 corresponden a las fracciones 1, 2, 3 y 4 de IgG purificadas empleando una columna de afinidad Hi trap proteina A.

Conejo 1 Conejo 2

Fracción Concentración Título Fracción Concentración Título

Suero Total 39.601 Suero Total 43.60

1 13.10 1/32768, 1 7.84 1/16384

2 7.50 1/16384 2 2.10 1//2048

3 2.00 1//2048 3 0.10 1/256

4 0.01 1/1024 4 0.01 1/128

Concentración Total 30.56

Concentración Total 12.31

50 KDa

25 KDa

1 2 3 4 5

47

1 2 A B Figura 7. Especificidad del Anticuerpo Policlonal Anti-IDShr. A=PAGE-SDS 12%, 1=Marcador de peso molecular 2=IDShr purificada por TKT. B=Western blot de la enzima purificada, empleando como anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa.

Figura 8. Western Blot de Sobrenadante de E. coli. Un anticuerpo policlonal anti-IDShr producido en conejo reconoció bandas de 120, 60, 40 y 20 KDa. Se uso como anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa.

220 130 90 70 60 40 30 20 16 10

IDShr

120KDa

60 KDa

40 KDa

20 KDa

48

Preparación de una Columna de Afinidad (Superosa 6 GP-anti IDShr).

Se probó la capacidad de reconocimiento de la IDShr por parte de la columna de

afinidad empleando retentato obtenido por ultrafiltración (fracción entre 30 y 100 KDa)

del cultivo M-13. Como buffer de corrida se empleó acetato 0.1 M pH 5.0. Un primer

pico de absorbancia a 280 nm, fue recogido y correspondió a la fracción de proteína no

retenida por la columna que no mostró actividad IDShr. El segundo pico de absorbancia

(Figura 10), contenía IDShr, lo cual se determinó por actividad enzimática. La columna

mostró capacidad de reconocimiento de la IDShr, la cual fue eluída con TBS pH 8.5 y

se recogió en los tubos 16-22, conteniendo cada tubo 1.0 ml. Estas fracciones fueron

concentradas hasta 1.0 ml en centricones Amicon YM-10, los cuales fueron sometidos

a centrifugación a 3.500 rpm por 3.0 h a 4°C y determinadas la concentración de

proteína total y actividad IDShr. La tabla 4 detalla los resultados de este experimento

conducente a la comprobación de inmunoreconocimiento de la IDShr columna

preparada, como etapa final del proceso de separación de la enzima recombinante.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Fracciones

Abs

orba

ncia

s

Figura 9. Cromatografía de Afinidad para la IDShr Expresada en P. pastoris. La gráfica muestra los resultados del experimento para comprobar que la columna de Superosa 6 GP-anti IDShr preparada reconocía específicamente la IDShr presente en un retentato (fracción entre 30 y 100 KDa) obtenido por ultrafiltración. La detección de proteínas se realizó mediante la lectura de absorbancia a 280 nm de longitud de onda.

49

Tabla 4. Cuadro Resumen de Ensayo para Demostrar Capacidad de Inmunoreconocimiento de una Columna de Superosa 6 GP anti-IDShr.

El retentato corresponde a la fracción proteíca entre 30 y 100 KDa obtenida por ultrafiltración. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.

Volumen Proteína Proteína Total Act. Específica

Fase (ml) (mg/ml) (mg) (nmol/h/mg) Act. Total (nmol/h) Purificaciones

Recuperación (%)

Sobrenadante 160 2.50 400.00 8.45 3380.00

Ultrafiltración (Retentato) 10 3.04 30.4 9.73 295.79 1.15 8.75

Cromatografía de Afinidad (Eluído) 1.0 2.04 2.04 38.8 79.15 4.59 2.34

50

Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris

En la tabla 5 se detallan algunas de las condiciones experimentales en las cuales se

realizaron los cultivos. Además de los valores de actividad enzimática la tabla 6 muestra

los resultados para algunos parámetros evaluados en los mencionados cultivos. Para

obtener información acerca de los porcentajes de recuperación de proteína a través del

proceso de separación, esta se cuantificó en las diferentes fracciones del proceso de

ultrafiltración. Para dichas fracciones se utilizó la siguiente nomenclatura: menor a 100

KDa que correspondía al ultrafiltrado por la membrana para excluir moléculas mayores

de 100 KDa; menor a 30 KDa el ultrafiltrado por la membrana para excluir moléculas

menores de 30 KDa y Retentato, que correspondía a la fracción retenida en la

membrana para 30 KDa, es decir entre 30 y 100 KDa. Los resultados presentados en

la tabla 7 indican que menos del 7% del total de proteínas están en el rango de 30-100

KDa y el 70% fuera del mismo. Se evidencia que cerca del 20% de las proteínas

presentes en los cultivos se pierden durante el proceso.

Tabla 5. Condiciones Experimentales de los cultivos M-7 y M-13 de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28.

Cultivos

Condiciones Experimentales M-7 M-13

Porcentaje de oxígeno disuelto Máximo (%OD) 102.1 91.5

Porcentaje de oxígeno disuelto Mínimo (%OD) 39.8 27.5

pH 5.90 5.96

Temperatura (ºF) 85.7 85.5

Los cultivos se realizaron a nivel de birreactor de 3.0 litros durante 120 horas.

51

Tabla 6. Resultados Obtenidos para Algunos Parámetros de los Cultivos M-7 y M-13 de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28.

Cultivos

Parámetros M-7 M-13

Velocidad específica de crecimiento (L/h) 0.15 0.18

Velocidad específica de inducción (L/h) 0.0056 0.0031

Factor de rendimiento Y(x/s) crecimiento 0.47 0.63

Factor de rendimiento Y(x/s) inducción 0.14 0.017

Productividad Máxima (U*1000/h) 444.94(33h) 725.71(35h)

Rendimiento máximo (U/g metanol) 3.12 (33h) 9.54 (35h)

Actividad Proteolítica máxima (UP/ml/min) 0.185 0.211

Actividad IDShr máxima (nmol/h/mg) 29.36 (47h) 25.40 (35h)

Los cultivos se realizaron a nivel de biorreactor de 3.0 litros durante 120 horas.

Tabla 7. Concentración de Proteínas Durante el Proceso de Ultrafiltración de Sobrenadantes de Cultivos de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28

Fracción

Recuperación (%)

Proteína (mg/ml)

Vol (ml)

Proteína

total (mg)

Sobrenadante 3.32 160 531.20 100

Menor a 100 KDa 2.86 150 430.00 80.94

Retentato (Entre 100 y 30 KDa) 3.58 10 35.85 6.75

Menor a 30 KDa 2.66 140 373 70.21

La concentración de proteínas se determinó mediante la técnica de Folin-Lowry.

La figura 10 muestra la electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% con SDS, de un

sobrenadante de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 y de la IDShr purificada por TKT.

52

El patrón electroforético evidencia una banda entre 80 y 90 KDa para la proteína

purificada y para el sobrenadante del cultivo de la levadura, varias bandas en un rango

entre 20 y 120 KDa.

1 2 3 Figura 10. Electroforesis PAGE-SDS 12% de Sobrenadante de Cultivo de

P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 e IDShr pura (TKT). 1=sobrenadante, 2= marcador de peso molecular y 3= IDShr pura.

Con relación al efecto de la diálisis sobre la actividad IDShr se presentaron en las

fracciones no dializadas, disminuciones inferiores al 10% (Tabla 8).

La liofilización afectó la actividad IDShr, disminuyéndola considerablemente. En el

caso del retentato se redujo en 79.33 %, mientras que en las otras feacciones las

disminuciones fueron superiores al 90% (Tabla 9).

IDShr

220 130 90 70 60 40 30 20 16 10

53

Tabla 8. Efecto de la Diálisis Sobre la Actividad IDShr en las Diferentes Fracciones Obtenidas Durante el Proceso de Ultrafiltración.

Se dializó contra TRIS-HCl 0.1 M pH 7.0 durante 24 horas empleando una membrana de 12 KDa. La actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. Tabla 9. Concentración de Proteínas Mediante Liofilización y su Efecto Sobre la Actividad de la IDShr en Fracciones Obtenidas por Ultrafiltración.

SL=Sin liofilizar. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. En cuanto a la separación de la IDShr expresada en P. pastoris, la tabla 10 muestra los

niveles de actividad de varias fracciones separadas mediante la metodología descrita.

Actividad IDShr (nmol/h/mg de proteína) Fracción Dializado No Dializado Disminución (%)

Sobrenadante 1.68 1.52 9.53

Menor a 100 KDa 1.82 1.65 9.44

Retentato 1.79 1.62 9.50

Menor a 30 KDa

1.94 1.83 6.68

Proteínas (mg/ml) Actividad IDShr (nmol/h/mg)

Fracción SL Liofilizado SL Liofilizado Disminución (%)

Sobrenadante 0.58 1.30 3.56 0.302 91.54

Mayor a 100 KDa 0.60 2.07 2.02 0.14 93.07

Menor a 100 KDa 0.54 1.17 2.74 0.25 90.88

Retentato 0.45 1.11 2.66 0.55 79.33

Menor a 30 KDa 0.46 1.43 2.71 0.20 92.62

54

La actividad IDShr alcanzó valores hasta de 58,78 nmol/h/mg de proteína, es decir, más

de cuatro y nueve veces los valores promedio para las muestras de plasma y leucocitos,

respectivamente, procesadas durante cinco años en el laboratorio del IEIM.

La figura 11 muestra un cromatograma de exclusión molecular de los retentatos de

ultrafiltración y son visibles tres picos de absorbancia a 280 nm, presentando actividad

IDShr el primero de ellos. Esta fracción con actividad IDShr se sometió a cromatografía

de afinidad y se recogieron dos fracciones (Figura 12). La primera no retenida, sin

actividad IDShr y la segunda correspondiente a la que contenía la enzima recombinante,

demostrado mediante la prueba de actividad catalítica de IDSh.

Tabla 10. Actividad Enzimática de Fracciones de IDShr Separadas por Cromatografía de Afinidad (Superosa 6 GP-anti-IDS)

Muestra (Cultivo)

Proteína total (mg/ml)

Actividad IDShr (nmol/h/mg)

7 0.91 32.211 12 1.16 2.71

13.1 1.73 37.67 13.2 1.11 58.78 13.3 0.78 14.42

El valor de referencia del IEIM para IDSh plasmática es de 12.41 nmol/h/ml y para leucocitos de 6.96 nmol/h/ml. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. La tabla 11 resume el proceso de separación y señala los niveles de recuperación y

purificaciones alcanzadas. Se evidencia que con niveles de 7 purificaciones solamente

se recuperan 0.22% de proteína y menos del 2% de la actividad. La cuantificación por

ELISA (método indirecto) indica que sólo 8.13% (14.3 µg) de la IDShr de los

sobrenadantes es recuperada en los retentatos y más del 60% (108 µg) se pierde en la

fracción menor a 30 KDa (Tabla 12).

55

Figura 11. Cromatograma de Exclusión Molecular de Retentato de Ultrafiltración de Cultivos de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28. Se utilizó una columna de Sefacryl S-200 y la presencia de proteína se monitoreo mediante absorbancia (AU) a 280 nm. Se señala el pico de absorbancia con actividad IDShr determinada con el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2 .

56

Figura 12. Cromatografía de Afinidad para la Separación IDShr Expresada en P. pastorisGS115 pPIC9-IDS/28. Se empleó una columna de Superosa 6 GP anti-IDS y la presencia de proteína se monitoreo mediante absorbancia (AU) a 280 nm. El primer pico de absorbancia corresponde a proteína no retenida. Se señala el pico eluído con TBS pH 8.5, el cual presentó actividad IDShr determinada con el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.

57

Tabla 11. Separación de la IDShr Expresada en Pichia pastoris GS115 pPIC9-IDS/28

Se empleó ultrafiltración secuencial con membranas de 100 y 30 KDa, exclusión molecular con Sefacryl S-200 y cromatografía de afinidad utilizando Superosa 6 GP- anti IDShr. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. El retentato corresponde a la fracción entre 30 y 100 KDa.

Volumen

Fase (ml) Proteína (mg/ml)

Proteína Total (mg)

Act. Esp (nmol/h/mg)

Act. Total (nmol/h) Purificaciones

Recuperación (%)

Sobrenadante 160 3.3 528 8.27 4366.65

Ultrafiltración (Retentato) 10 4.3 430 17.65 758.95 2.13 17.38

Exclusión Molecular 2.0 2.6 5.20 20.12 104.62 2.43 2.39

Cromatografía Afinidad 2.0 0.60 1.20 58.00 69.60 7.01 1.59

58

Tabla 12. Cuantificación Mediante ELISA de la IDShr Expresada en Pichia pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 Durante las Fases del Proceso de Ultrafiltración.

Fracción

Volumen

(ml)

Proteína

(µg/ml)

Proteína Total

(µg)

IDShr

(µg/ml)

IDShr Total

(µg)

IDShr

(%)

Recuperación

IDShr (%)

Sobrenadante 160 330 52800 1.10 176 0.33

Menor de 100 KDa 150 270 40500 0.94 141 0.34 80.11

Menor de 30 KDa 135 250 33750 0.80 108 0.32 61.36

Retentato 10 340 3400 1.43 14.3 0.42 8.13

Se empleó ultrafiltración secuencial con membranas de celulosa de 100 y 30 KDa. El retentato corresponde a la fracción entre 30 y 100 KDa. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.

59

Separación de la IDShr Expresada en Escherichia coli.

Inicialmente se realizaron cultivos durante 24 horas con volúmenes de trabajo de 100 ml

de LBA y MMA, detectándose actividades IDShr máximas de 0.54 y 0.010 nmol/h/mg

de proteína, respectivamente. La producción se escaló a 500 ml empleando LBA y se

detectó actividad máxima de 0.75 nmol/h/mg de proteína, a las ocho horas de

crecimiento. Tomando como referencia este tiempo, se realizó un ensayo preliminar de

escalado a 1.0 L en biorreactor y se encontró una actividad de 1.91 nmol/h/mg de

proteína (Tabla 13).

Con el propósito de separar la IDShr se hicieron cultivos de ocho horas con volúmenes

de trabajo de 100 ml y/o 500 ml, los sobrenadantes fueron utilizados para el proceso de

separación de la enzima recombinante. La tabla 14 muestra las concentraciones de

proteínas y actividad IDShr de las fracciones de cada una de las etapas del proceso de

ultrafiltración.

Retentatos obtenidos por ultrafiltración fueron sometidos a exclusión molecular y las

fracciones con actividad IDShr se corrieron en cromatografía de afinidad. La tabla 15,

muestra que aunque fueron obtenidas fracciones de la exclusión molecular con actividad

IDShr, la cromatografía de afinidad no separó la IDShr presente en las mismas.

La figura 13 muestra un cromatograma típico de exclusión molecular de retentato

obtenido por ultrafiltración. En todos los casos se observaron dos picos de absorbancia

muy próximos que trataron de resolverse aumentando la longitud de la columna hasta

80 cm, sin embargo los resultados fueron similares. Estas fracciones presentaron

actividad IDShr (Tabla 14). La tabla 16 permite observar que con purificaciones del

orden de 2.68, el porcentaje de recuperación estuvo por debajo del 1%

60

Figura 13. Cromatograma de Exclusión Molecular de Retentato de Ultrafiltración de Cultivos de E. coli JM 109 pUC13-IDS/28. Se empleó una columna de Sefacryl S-200 y la presencia de proteína se monitoreo mediante absorbancia (AU) a 280 nm. Los dos picos de absorbancia presentaron actividad IDShr que fue determinada con el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.

61

Tabla 13. Actividad IDShr en cultivos de E. coli JM109-pUC-13/IDS en tres niveles de escalado.

Se utilizó medio de cultivo LB suplementado con 50 µg/ml de ampicilina y 3.0 mM de tiramina. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.

Tabla 14. Concentración de Proteínas y Actividad IDshr en E. coli JM 109-pUC 13/IDS Durante el Proceso de Ultrafiltración de Sobrenadantes y en Lisados

Fracción Proteína (mg/ml) Act. IDShr (nmol/h/mg)

Sobrenadante 3,93 1.20

Menor a 100 KDa 3,78 1,19

Retentato 2,81 1,86

Menor a 30 KDa 3,59 0,4

Lisados 1,55 2,82

El retentato corresponde a la fracción entre 30 y 100 KDa. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.

Volumen Act. IDShr

LBAT (ml) Proteína Total

(mg/ml) Tiempo de Cultivo

(horas) (nmol/h/mg)

100 2,48 8 0,54 500 2,94 8 0,75 1000 2,16 8 1,91

62

Tabla 15. Separación Cromatográfica de IDShr Expresada en E. coli JM 109 pUC-13/IDS.

Los retentatos (fracción entre 30 y 100 KDa), fueron obtenidos por ultrafiltración. Para la exclusión molecular se empleó una columna de Sefacryl S-200 y la cromatografía de afinidad se realizó utilizando una columna de Superosa 6 GP anti-IDShr. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S. NR = No retenida, ND = No determinada.

Exclusión Molecular Cromatografía de Afinidad

Muestra Proteína Act. IDShr Proteína Act. IDShr

(Retentato) (mg/ml) (nmol/h/mg) (mg/ml) (nmol/h/mg)

A 2.75 3.88 NR ND

F 2.85 4.22 NR ND

L 2.88 3.25 NR ND

H 2.62 3.99 NR ND

K 2.96 2.03 NR ND

63

Tabla 16. Separación de IDShr Expresada en E. coli JM109-pUC-13/IDS.

Se empleó ultrafiltración secuencial con membranas de celulosa de 100 y 30 KDa, el retentato corresponde a la fracción entre 30 y 100 KDa, exclusión molecular con Sefacryl S-200 y cromatografía de afinidad utilizando Superosa 6 GP- anti IDShr. La concentración de proteínas se determinó por la técnica de Folin-Lowry y la actividad IDShr se estimó empleando el sustrato fluorométrico MU-αIdoA-2S.

Volumen Proteína Proteina Total Act. Específica

Fase (ml) (mg/ml) (mg) (nmol/h/mg) Act. Total (nmol/h/) Purificaciones

Recuperación (%)

Sobrenadante 160 3.93 628.8 1.20 754.57

Ultrafiltración (Retentato) 10 2.81 28.1 1.86 52.27 1.55 22.30

Cromatografía de Afinidad (Eluído) 2.0 0.82 1,64 3.22 5.28 2.68 0.70

64

EXPRESION DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EN Escherichia coli EMPLEANDO EL SISTEMA DE FUSION DE GENES GLUTATION S-TRANSFERASA (GST).

Los perfiles electroforéticos de los ADN plasmídicos obtenidos a partir de las colonias

de E. coli JM 109 transfectadas con el plasmido pGEX 3X-IDS y crecidas en agar

LBA, mostraron en cuatro casos bandas de aproximadamente 6.5 Kb, es decir el tamaño

del constructo de expresión. De las cuatro bandas se seleccionó la de mayor intensidad y

se procedió a realizar un banco. Se efectuaron pruebas de actividad y cuantificación de

IDShr por ELISA en sobrenadante y lisado celular. En el lisado se detectó IDShr en

cantidad de 17.28 ng/mg de proteína, pero no se detectó actividad enzimática.

ANALISIS COMPUTACIONAL DE LA IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA (IDSh)

El gen de la IDSh (12), codifica para un precursor de 550 aminoácidos, de los cuales 25

corresponde al péptido señal y otros ocho residuos son eliminados posteriormente

durante el procesamiento de la enzima (Figura 14). La IDSh está conformada por 29 A

(5.6%) 24 R (4.6%), 21 D (7.5%), 39 N(4.1%), 6 C(1.2%), 23 Q(4.4%), 24 E(4.6%),

29 G (5.6%), 15 H (2.9%) , 22 I (4.3%), 55 L (10.6), 19 K (3.7%), 8 M (1.5%), 28 F

(5.4%), 49 P (9.5%), 41 S (7.9), 21 T (4.1), 7 W (1.4%), 26 Y (5.0%), 31 V(5.6%).

Tiene 63 residuos negativos y 43 positivos.

MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP Figura 14. Secuencia aminoacídica de la IDSh. Los primeros 25 residuos corresponden al péptido señal (rojo) y otros ocho aminoácidos (azul) son hidrolizados durante el procesamiento de la enzima. En verde se indican los sitios de N-glicosilación.

65

Hidrofobicidad, Accesibilidad y Flexibilidad. El perfil de hidrofobicidad (Figura 15), muestra variaciones para las diferentes regiones

de la proteína entre -2.5 y 3. Sin embargo, cerca del 80% de las zonas no superan el 1.5

y una pequeña región entre los residuos 1 y 35 resulta en una marcada hidrofobicidad.

El perfil de accesibilidad, en una escala de 0-8, muestra que los valores varían entre 4.2

y 7.8 y que ninguna zona de la molécula presenta valores inferiores a 4. Un alto

porcentaje de la enzima tiene valores de accesibilidad entre 5.5 y una pequeña región

hasta 7.8 (Figura 16). El perfil de flexibilidad (Figura 17), en una escala de 0-0.5,

demuestra que la IDSh es una molécula muy flexible, puesto que la misma presenta

valores que fluctúan entre 0.39 y 0.49 y el 95% de la molécula tiene valores de

flexibilidad superiores a 0.42. Existen dos zonas altamente flexibles, la primera entre

los residuos 50 y 80 que corresponden en el péptido maduro a la región de posiciones

80-110 y la segunda que corresponde a la zona del péptido maduro desde el residuo 440

hasta el final de la proteína, en donde se encuentra el residuo R468, considerado un sitio

altamente mutable.

Punto Isoeléctrico y Peso Molecular

Los valores de predicción computacional fueron 5.15 para el punto isoeléctrico y

58.479 KDa para el peso molecular.

Sitios de Fosforilación

En la secuencia de la IDSh existen 26 sitios potenciales de fosforilación (Figura 18), 14

serinas (posiciones 50, 90, 149, 152, 162, 201, 217, 299, 305, 316, 369, 470, 477, 481),

5 treoninas (posiciones 93, 99, 170, 195, 500) y 7 tirosinas (posiciones 128, 151, 158,

165, 306, 348, 452).

66

Figura 15. Perfil de Hidrofobicidad de la IDSh. para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.

67

Figura 16. Perfil de Accesibilidad de la IDSh. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro .

68

Figura 17. Perfil de Flexibilidad de la IDSh. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.

69

Sitios de Glicosilación

La figura 19 muestra los potenciales sitios de O-glicosilación. Sin embargo, ninguno de

los residuos de T, S o Y es considerado con potencial presencia de glicósidos. Para el

caso de las N-glicosilaciones se establecieron siete potenciales sitios de glicosilación en

residuos de asparagina, en presencia de secuencias N-X-T/S (Figura 20). Los sitios

potenciales de N-glicosilación son las asparaginas en posiciones 115, 144, 246, 280,

325, 513 y 537.

Figura 18. Sitios Potenciales de Fosforilación en la IDSh. Para el análisis computacional fue utilizado el programa Netphos-2.0 y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.

70

Figura 19. Sitios Potenciales de O-glicosilación (Presencia de T, S o Y) en la IDSh. Para el análisis computacional fue utilizado el programa Net-Oglyc 3.1 y se empleó la

secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.

Figura 20. Sitios potenciales de N-glicosilación en la IDSh. Para el análisis computacional fue utilizado el programa Net-Nglyc 1.0 y se empleó la secuencia del péptido maduro, es decir, el aminoácido 1 de la figura corresponde al residuo 34 del péptido maduro.

71

Bloques y Prints

Los bloques y los prints son secuencias con similaridad, sin embargo el tamaño de los

prints es mayor que el de los bloques. Se encontraron prints comunes con moléculas de

las familias de las sulfatasas (sulfatasas 1 y 2), rodopsinas y caderinas Con relación a

los bloques, se encontraron motivos similares con 114 moléculas, entre ellas ATP

sintasa, transaldolasa, glutamato metiltransferasa, guanilato ciclasa, luciferasa,

fosfoglucoisomerasa, fosfolipasa A2, fosfodiesterasa tipo I, ARN polimerasa, MAP

kinasa, proteína CAP, proteína M, giberelina, flagelina, interlucina 13, citocromo C,

proteína ribosómica 16S, proteina resistente a tetraciclina, toxina difterica, proteína

sigma de Salmonella virulens, factor de elongación 1, factor de transcripción TFIID,

replicasa de luteovirus, P-40 del herpes virus y otras.

De las cinco moléculas con similaridad en prints y las 114 con bloques similares a

secuencias de la IDS, solamente las dos sulfatasas mencionadas tienen estructura

tridimensional determinada experimental. Sus números de acceso a SWISSPROT son

PS00523 y PS00149, que en NCBI corresponden a P15289 y P15848. Estas moléculas

son las Arylsulfatasas A (EC. 3.1.6.8) y B (EC. 3.1.6.12). Las secuencias de estas

enzimas fueron alineadas con la secuencia de la IDSh.

Alineamientos

El alineamiento de la IDSh con la aril sulfatasa B(1FSU), mostró que existe un 24% de

similaridad (98/407) y 37% de positividad (154/407), mientras que el 22% (91/407)

corresponde a gaps. En el segundo caso, alineamiento con aril sulfatasa A (1AUK),

estos mismos parámetro fueron 26% (125/474), 38% (183/474) y 16% (80/474),

respectivamente. Los alineamientos se presentan en las figuras 21 y 22. Las siglas

1FSU y 1AUK son los códigos de identificación en el banco de datos de proteínas del

Brookhaven National Laboratory. El término similaridad significa que existe el mismo

aminoácido en la posición, mientras que positividad indica existe un residuo parecido.

Se habla de un gap cuando el programa tiene que realizar un movimiento sobre la

secuencia alineada para poder encontrar un aminoácido igual o parecido al que se

compara con la otra molécula.

72

Query: 5 NVLLIIVDDLR-PSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRR 63 N++LI DDL LGCYG +PN+DQLA+ L F + + ++ PSR + LTGR Sbjct: 4 NIVLIFADDLGYGDLGCYGHPSSTTPNLDQLAAGGLRFTDFYVPVSLATPSRAALLTGRL 63 Query: 64 PDTTRLYDFNSYWRVHAG---NFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYS 119 P +Y G T+ + GY+T GK +H G+ P+ Sbjct: 64 PVRMGMYPGVLVPSSRGGLPLEEVTVAEVLAARGYLTGMAGK-WHLGVGPEGAFLPPHQG 122 Query: 120 ---WSFPPYHPSSEKYENTKTCRGP----DGELHANLLCPVDVL-----DVPEGTLPDKQ 167 + PY +N TC P DG L+ P+ +L + LP + Sbjct: 123 FHRFLGIPYSHDQGPCQNL-TCFPPATPCDGGCDQGLV-PIPLLANLSVEAQPPWLPGLE 180 Query: 168 STEQAI--QLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDG 22 + A L+ + PFFL H H P + F Sbjct: 181 ARYMAFAHDLMADAQRQDRPFFLYYASHHTHYPQFSGQSFA------------------- 221 Query: 226 LPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSAL 285 +R R + S+ LD VG L++A+ Sbjct: 222 ----------------------------------ERSGRGPFGDSLMELDAAVGTLMTAI 247 Query: 286 DDLQLANSTIIAFTSDHG---WALGEHG-----EWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASL 337 DL L T++ FT+D+G + G K + ++ P + + PG A Sbjct: 248 GDLGLLEETLVIFTADNGPETMRMSRGGCSGLLRCGKGTTYEGGVREPALAFWPGHIA—305 Query: 338 PEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVP 386 PG + +L + L PTLA LAG +P Sbjct: 306 ----------------------PG-VTHELASSLDLLPTLAALAGAPLP 331 Figura 21. Alineamiento de la IDSh con la Arilsulfatasa B. (Sbjct = IDS, Querry = ARSB). Existe 24% de similaridad (98/407), 37% de positividad (154/407) y 22% (91/407) corresponde a gaps. Para el análisis computacional se empleò el programa BLAST.

Query: 120 W-SFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLL-CPVDVLDVPEGTLPDKQS------TEQ 171 + ++ Y SE Y + + C D N+ C +D D E K T++ Sbjct: 121 FDTYFGYLLGSEDYYSHERCTLIDA---LNVTRCALDFRDGEEVATGYKNMYSTNIFTKR 177 Query: 172 AIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAY 231 AI L+ P FL + H P + P+E+ K Sbjct: 178 AIALITNHPPE-KPLFLYLALQSVHEPLQVPEEYLK------------------------ 212 Query: 232 NPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDF-QRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQL 290 P DF Q K R Y VS +D VG + +AL L Sbjct: 213 ------------------------PYDFIQDKNRHHYAGMVSLMDEAVGNVTAALKSSGL 248 Query: 291 ANSTIIAFTSDH-GWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLD 349 N+T+ F++D+ G L W + GR SL E G + ++ Sbjct: 249 WNNTVFIFSTDNGGQTLAGGNNWP----------------LRGRKWSLWEGGVRGVGFV- 291 Query: 350 PFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHV 396 ++ L + G ++ +L+ + PTL LA P+ F V Sbjct: 292 ---ASPLLKQKGVKNRELIHISDWLPTLVKLARGHTNGTKPLDGFDV 335

Figura 22. Alineamiento de la IDSh con la Arilsulfatasa A. (Sbjct = IDS, Querry = ARSA). Existe 26% de similaridad (125/474), 38% de positividad (183/474), mientras que 16% (80/474) corresponde a gaps. Para el análisis computacional se empleò el programa BLAST.

73

Estructura Secundaria Con los resultados de cada programa de predicción de estructura secundaria, residuo

por residuos, se construyó la tabla 17 la cual es presentada en fragmentos de 20

aminoácidos para facilitar su comprensión. Los dos números en el encabezado de la

última columna corresponde a la posición de los residuos en la proteína madura y la

última fila de la tabla es el consenso de los programas empleados computacionalmente.

El consenso de las predicciones de los programas empleados, permitió la construcción

de un modelo para la estructura secundaria de la IDSh. Para el mismo, los loops

(enrollamientos al azar) y turns (vueltas) se homologaron a coils, por lo cual la

presentación del esquema se hace solamente con base en hélices, hojas plegadas y coils,

correspondiendo a cada una de estas estructuras el 33, 13 y 54%, respectivamente. Las

regiones sin predicción computacional, fueron establecidas con base en los aminoácidos

y las estructuras contiguas a estas regiones. La figura 22 representa el modelo de

predicción de la estructura secundaria de la enzima, las regiones no predichas por

consenso, fueron establecidas con base en los aminoácidos y las estructuras contiguas a

estas regiones.

Tabla 17. Predicción Computacional de la Estructura Secundaria de la IDSh Mediante 11 Programas de Predicción de Estructura de Proteínas.

Secuencia IDS T D A L N V L L I I V D D L R P S L G C 34-53 GOR H H H H H H E E E E E E T C C T T T T T GOR1 H H H H H H E E E E E E E E E T T E E T GOR3 H H H H H H H H E H H C C C C C C C C C Nnpredict H H H E E E E E Sspro C C C C C E E E E E E E C C C C C C C C Casp C C C C C E E E E E E C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L E E E E E E L L L L L L L L Fasta L L L L L E E E E E E L L L L L L L L L SUB L E E E E E L L L Psi-Pred C C C C C E E E E E E E C C C C C C C C Rdb E L L L L E E E E E E L L L L L L L L L Concenso H H H E E E E E E E L C C C C L L C

74

Secuencia IDSh Y G D K L V R S P N I D Q L A S H S L L 54-73 GOR T T E E E E E C C T C E E E E C E C H H GOR1 E E E E E E E E E T H H E E H H H H H H GOR3 C C C E E E E C C C H H H H H H H H H H Nnpredict H H H H H H H H Sspro C C C C C C C C H C H H H H H H C C C E Casp C C C C C C C C C C H H H H H H H C C E MetaPred L L L L L L L L L L H H H H H H H L L L Fasta L L L L L L L L L L H H H H H H H L L E SUB L L L L L L H H H H H H H Psi-Pred C C C C C C C C C H H H H H H H C C E E Rdb L L L L L L L L L L H H H H H H H L L E Concenso L L L L L L H H H H H H H H H H Secuencia IDSh F Q N A F A Q Q A V C A P S R V S F L T 74-93 GOR H H H H H H H E E E E E T T E E E E E T GOR1 H H H H H H H H E E E E E T E E E E E E GOR3 H H H H H H H H H E C C C C E E E E E E Nnpredict H H H H H H H H H H E E Sspro E C C E E C C C C C C C H H H H H H H C Casp E C C C E C C C C C C C C C H H H H H H MetaPred E L L L E L L L L L L L L L H H H H H H Fasta E L L L E L L L L L L L L L H H H H H H SUB H H H H H H H H H L E Psi-Pred E E E E E E C C C C C C H H H H H H H H Rdb E L L L E L L L L L L L L L H H H H H H Concenso E H H H E H H H C C L H H H H H H Secuencia IDSh G R R P D T T R L Y D F N S Y W R V H A 94-113 GOR T C C T T E E E E T T T T T T T E E T C GOR1 T C C T T E E E E E T T T T T E E E E C GOR3 E C C C C C E E E E E H C C E E E E E E Nnpredict E H E E E E Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso L C C L E C C E E C

75

Secuencia IDSh G N F S T I P Q Y F K E N G Y V T M S V 114-133GOR T T T C C E E T E T T T T T T E E E E E GOR1 T T T C E E E E E E T T T T T E E E E E GOR3 C C C C C C E E E E C C C C E E E E E E Nnpredict E E E E E E Sspro C C C C H H H H H H H H C C C C E E E E Casp C C H H H H H H H H H H H C C C E E E E MetaPred L L H H H H H H H H H H H L L L E E E E Fasta L L H H H H H H H H H H H L L L E E E E SUB L L L L L E E E E E Psi-Pred C C C C C H H H H H H H C C C C E E E E Rdb L L H H H H H H H H H H H L L L E E E E Concenso H H H H H H H H H H H E E E E E Secuencia IDSh G K V F H P G I S S N H T D D S P Y S W 134-153GOR E E E E E C T C C C T C T T T C T T T T GOR1 E E E E E E T C C C T C T T T C T T T T GOR3 E E E E E C C C C C C C C C C C C C E E Nnpredict E E Sspro E E E C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L L L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso E E E E L C C C C L C L L L Secuencia IDSh S F P P Y H P S S E K Y E N T K T C R G 154-173GOR C E C T C C C C C T T T T T T T T T C C GOR1 E E E T C C C C C H H H H T T T T T T C GOR3 E C C C C C C C C C C E C C C E E C C C Nnpredict Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Meta Pred L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso C C C C C C C C L L L L L L L L C

76

Secuencia IDSh P D G E L H A N L L C P V D V L D V P E 174-193GOR C T C H H H H H H E E E E E E E E E C T GOR1 C T H H H H H H H E E E E E E E E E E T GOR3 C C C C C C H C H C C C C C C C C C C C nnpredict Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso C C C C C C L L L L C C C C C L C C Secuencia IDSh G T L P D K Q S T E Q A I Q L L E K M K 194-213GOR T C C C T C C C H H H H H H H H H H H H GOR1 T H C C T H H H H H H H H H H H H H H H GOR3 C C C C C C C H H H H H H H H H H H H H nnpredict H H H H H H H H H H Sspro C C C H H H H H H H H H H H H H H H H H Casp C C C C H H H H H H H H H H H H H H H H MetaPred L L L H H H H H H H H H H H H H H H H H Fasta L L L L H H H H H H H H H H H H H H H H SUB L L L L L L L L H H H H H H H H H Psi-Pred C C C C H H H H H H H H H H H H H H H C rdb L L L L H H H H H H H H H H H H H H H H Concenso C C C H H H H H H H H H H H H H H H H Secuencia IDSh T S A S P F F L A V G Y H K P H I P F R 214-233GOR T C C C H H H H H H T T C C T T E E T C GOR1 H H H H H H H H H H T T C C T E E E T E GOR3 H H H C H H H H H H H C C C C C C C C C nnpredict E E E E E Sspro C C C C C E E E E E E C C C C C C C C C Casp C C C C C E E E E E E E C C C C C C C C MetaPred L L L L L E E E E E E E L L L L L L L L Fasta H L L L L L E E E E E E E L L L L L L L SUB L L L E E E E E L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C E E E E E C C C C C C C C C C rdb L L L L L H H H H H E E L L L L L L L L Concenso C E E E E E E E C C L L L L L C

77

Secuencia IDSh Y P K E F Q K L Y P L E N I T L A P D P 234-253GOR C T T T T E E C C C T E E E E C C C C C GOR1 C T T H H H E E C H H E E E E E C C C E GOR3 C C H H H H H H C H H H H H H C C C C C nnpredict H Sspro C C H H H H H H H H C C C C C C C C C C Casp C C H H H H H H C C H H C C C C C C C C MetaPred L L H H H H H H L L H H L L L L L L L L Fasta L L L H H H H H H L L H H L L L L L L L SUB L L H L L L L L L Psi-Pred C C C H H H C C C C C C C C C C C C C C rdb L L H H H H H H L L H H L L L L L L L L Concenso C H H H H H H C H H C C C C C Secuencia IDSh E V P D G L P P V A Y N P W M D I R Q R 254-273GOR T E T T C C C C E E E C T T E E E E H T GOR1 E E E T E E E E E E E E T T E E H E H H GOR3 C C C C C C C C C C C C C C H H H H H H nnpredict H H H E E E E E E H H H H H Sspro C C C C C C C C C C C C C C H H H H C C Casp C C H H H H H H H H H C C C C H H H H H MetaPred L L H H H H H H H H H L L L L H H H H H Fasta L L L H H H H H H L L H H L L L L L L L SUB L L L H H H H H H H H H L L L L H H H H Psi-Pred C C H H H H H H C C C C C C C H H C C C rdb L L H H H H H H H H H H H L L H H H H H Concenso L L H H H H H H H H H C C L H H H H H Secuencia IDSh E D V Q A L N I S V P Y G P I P V D F Q 274-293GOR H H H H E E E E E E T T C C E E E E E E GOR1 H H H H E E E E E E T T E E E E E E E E GOR3 H H H H E E E C C C C C C C C C E H E E nnpredict E H H H Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C H H H H Casp H H H H H C C C C C C C C C C C H H H H MetaPred H H H H H L L L L L L L L L L L H H H H Fasta H H H H H L L L L L L L L L L L H H H H SUB H H L L L L L H H H H Psi-Pred C H H C C E E C C C C C C C C C H H H H rdb H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Concenso H H H H H E E C C C L C C C C C H H H H

78

Secuencia IDSh R K I R Q S Y F A S V S Y L D T Q V G R 294-313GOR E T T T T T E E E C E C T T T E E E E E GOR1 E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E GOR3 H H H E E E E E E E E E E C C H H H H H nnpredict E E E E H H Sspro H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Casp H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H MetaPred H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Fasta H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H SUB H H H H H H E E E H H Psi-Pred H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H rdb H H H H H H H H L L L L L E E E E E E L Concenso H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H Secuencia IDSh L L S A L D D L Q L A N S T I I A F T S 314-333GOR E E E H H H H H H H H H C E E E E E E C GOR1 E E E H H H H H H H H H E E E E E E E C GOR3 H H H H H H H H H H H H H H E E E E E H nnpredict H H Sspro H H H H H H H C C C C C C E E E E E E C Casp H H H H H H H H C C C C E E E E E E E C MetaPred H H H H H H H H L L L L L E E E E E E L Fasta H H H H H H H H L L L L L E E E E E E L SUB H H H H H H H H H H H E E E Psi-Pred H H H H H H H C C C C C C E E E E E E C rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso H H H H H H H H H H H L E E E E E E E Secuencia IDSh D H G W A L G E H G E W A K Y S N F D V 334-353GOR T C T C C C C C H C H H H T T C T T T C GOR1 T C T C H H H H H H H H H H H C T T H E GOR3 C C C H E H H C H C H H H H H C H H H H nnpredict H H H H H E H H H H H H H H Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C rdb L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso C C C C C C C C H C H H H C L L L C

79

Secuencia IDSh A T H V P L I F Y V P G R T S S L P E A 354-373GOR E E E E E E E E E E C T T C C C C C H H GOR1 T C T C H H H H H H H H H H H C T T H E GOR3 H H E C C E E E E E C C C C C C C C H H nnpredict H H H H H Sspro C C C E E E E E E C C C C C C C C C C C Casp C C C C C E E E E C C C C C C C C C C C MetaPred L L L L L E E E E L L L L L L L L L L L Fasta L L L L L E E E E L L L L L L L L L L L SUB E E E E E L L L L L L H H Psi-Pred C C C E E E E E E C C C C C C C C C C C rdb L L L L L E E E E L L L L L L L L L L L Concenso C E E E E E C C C C C C H H Secuencia IDSh G E K L F P Y L D P F D S A S Q L M E P 374-393GOR H H H E E E T E C C T T H H C C C C C C GOR1 H H H E E E E E C C T H H H H H H E E H GOR3 H H H H C H C C C C C C C H H H H C C C nnpredict H H H H H H H H Sspro C C C C C C H C C C H H H H H H H C C C Casp H C C C C C C C C C C C C H H H H H H C MetaPred H L L L L L L L L L L L L H H H H H H L Fasta H L L L L L L L L L L L L H H H H H H E SUB H L L L L L L L L L Psi-Pred C C c C C C C C C C C C C C H H H H C C rdb H L L L L L L L L L L L L E E E E E E L Concenso H H H L L L C C L L H H H H H C C Secuencia IDSh G R Q S M D L V E L V S L F P T L A G L 344-413GOR T T H C H E E E E H H H H E H H H H C C GOR1 T H H H H H E E H H H H H E H H H H H H GOR3 C C C C C H H E H H H H H H H H H H H H nnpredict E E E Sspro C C C C C C C C C C C C H H H H H H H C Casp C C C C C C E E C H H C H H H H H H H H MetaPred L L L L L L E E L H H L H H H H H H H H Fasta L L L L L L L E E L H H L H H H H H H H SUB L L H H H H H H Psi-Pred C C C C C C C E E E C C H H H H H H H H rbd L L L L L L E E L H H L H H H H H H H H Concenso C C C E E E H H H H H H H H H H H

80

Secuencia IDSh A G L Q V P P R C P V P S F H V E L C R 414-433GOR C T E E E E T T E T C T T E E H H H H H GOR1 E E E E E E T E E E E E E E H H H H H H GOR3 C C C C C C C C C C C C C C C E E H H H nnpredict H E E E E E E E Sspro C C C C C C C C C C C C C C C H E H E C Casp H C C C C C C C C C C C C C C C C C C C MetaPred H L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Fasta H H L L L L L L L L L L L L L L L L L L SUB L L L L L L L L L H H H H H Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C rdb H L L L L L L L L L L L L L L L L L L L Concenso C C C C C C H H H H Secuencia IDSh E G K N L L K H F R F R D L E E D P Y L 434-453GOR H H H H H H H H H H H C C C T T C T T C GOR1 H H H H H H H H H H H H H H T T C T T C GOR3 H C H H H H H H H H H H H H C C C C C C nnpredict E E E E E E E E H H H Sspro C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Casp C C C C H H H H H C C C C C C C C C E E MetaPred L L L L H H H H H H L L L L L L L L E E Fasta L L L L L H H H H H L L L L L L L L L E SUB H H H H H H H H H L L L L L L Psi-Pred rdb L L L L H H H H H L L L L L L L L L E E Concenso H H H H H H H H H L L C L E Secuencia IDSh P G N P R E L I A Y S Q Y P R P S D I P 454-473GOR T C C C E E E E E E T T C T C T T C E C GOR1 T C C C E E E E E E E E C T C T T E E E GOR3 C C C C C E E E E C C C C C C C C C C C nnpredict E E E Sspro C C C C C C C H C C C C C C C C C C C C Casp E E E C C C C H H H C C C C C C C C C C MetaPred E E E L L L L H H H L L L L L L L L L L Fasta E E E L L L L H H H L L L L L L L L L L SUB L L L E E E E E L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C rdb E E E L L L L H H H L L L L L L L L L Concenso E C C C C E E E H C C C C C C

81

Secuencia IDSh Q W N S D K P S L K D I K I M G Y S I R 474-493GOR T T C T T C T C H H H E E E E E E E E E GOR1 T E C T T C T C H H H E E E E E E E E E GOR3 E C C C C C C C H H H H H E E E E E E E nnpredict H E E E E E E E Sspro C C C C C C C C H H H H H C C C C C E E Casp C C C C C C C C H H H H H H C C E E E E MetaPred L L L L L L L L H H H H H H L L E E E E Fasta L L L L L L L L H H H H H H L L E E E E SUB L L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C C E E E E E C C C C C C C Rdb L L L L L L L L H H H H H L L L H H H H Concenso L C C C H H H H H E E L E E E E Secuencia IDSh T I D Y R Y T V W V G F N P D E F L A N 494-513GOR E E E T T E E E E E T C C C T H H H H H GOR1 E E E E E E E E E E E C C C T H H H H H GOR3 E E E E E E E E E E E C C C C H H H H H nnpredict E E E E E E E E H H H Sspro E C C C C C C E E E E C C C C C C C C C Casp C C C E E E E E E C C C C C C C C C C C MetaPred L L L E E E E E E L L L L L L L L L L L Fasta L L L E E E E E E L L L L L L L L L L L SUB E E E E E E L L H H H H Psi-Pred C C C C C E E E E E C C C C C H H H C C Rdb L L L H H H H H H L L L L L L L L L L L Concenso E E E E E E E E E E C C C C H H H H Secuencia IDSh F S D I H A G E L Y F V D S D P L Q D H 514-533GOR H H H H C H H H E E E E T C C C T H T E GOR1 H H H H H H H H E E E E T C C H H H H E GOR3 H H H H H H H H E E E C C C C C H C C C nnpredict H E E E Sspro C C C C C H H H H C C C C C C C C H H C Casp C C C C C C C H E E C C C C C C H H H H MetaPred L L L L L L L H E E L L L L L L H H H H Fasta L L L L L L L H E E L L L L L L H H H H SUB E E E E E L L L L Psi-Pred C C C C C H H H C C C H H H C C C C C C Rdb L L L L L L L L H E E L L L L L L H H H Concenso H C H H H E E E L C C C H H H H

82

Secuencia IDSh N M Y N D S Q G G D L F Q L L M P 534-550GOR T T T T T T T T T C E E E E E C C GOR1 E E E T T T T T T E E E E E E E H GOR3 C C C C C C C C C C H H H E H C H nnpredict H H H H Sspro C C C C C C C H H H H H H H H C C Casp C H C C C H H H H H H H H H H H C MetaPred L H H L L H H H H H H H H H H H L Fasta L H L L L H H H H H H H H H H H L SUB L L L L L L L L L L L L Psi-Pred C C C C C C C H H H H H H H C C C Rdb H L L L H H H H H H H H H H H H L Concenso C C C H H H H H H H H H H C Los programas GOR, GOR-1, GOR-3 predicen para Helice (H), Coil (C), Hoja

plegada (E) y Beta turn (T), los programas Sspro y Casp lo hacen para Hélice (H),

Hoja plegada (E) y Coil (C), los programas MetaPred, Fasta, SUB y rdb predicen

para regiones en Hélice (H), Hoja Plegada (E) y Loop (L), mientras que nnPredict

solamente para Hélice (H) y Hoja Plegada (E).

83

Figura 23. Predicción de la Estructura Secundaria de IDSh. Coil, hoja plegada, hélice. Los resultados son producto del consenso de 11 programas de predicción de estructura secundaria de proteínas.

45

63

80

93

N

128

137

H

N

197

214

192

244

264

277

289

325

A

362

377

402

414

430

Y

Q

499 508

529

550

84

Estructura Terciaria

Ninguno de los programas predijo una estructura de la molécula, solamente SWISS-

MODEL, entregó dos fragmentos por similaridad con las estructuras experimentalmente

determinadas 1AUK e IFSU que corresponden a la Arilsulfatasa A (ARSA) y la

Arilsulfatasa B (ARSB). El primer segmento comprende los aminoácidos ubicados

desde la posición número 34 hasta la 108, su secuencia es:

DALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSR

VSFLTGRRPDTTRLYDFNSY (Figura 24) y el segundo segmento con predicción

(Figura 25), comprende los aminoácidos en posiciones 287 a 341, con la secuencia:

PIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLAQLANSTIIAFTSDHGWAL.

Los resultados de los alineamientos múltiples presentaron un total de 29 proteínas con

fragmentos de identidades con la IDSh entre 21 y 52%. Dentro de ese grupo de

moléculas tenemos Arilsulfatasa de P. aeruginosa, ARSB humana, Flavohemoglobina

de Eutrophus, Dihidropteridina reductasa de C. elegans, las cadenas D, E, F de la F1 de

la ATPasa de Berillium fluoride. De misma molécula, la cadena A en hígado de rata, las

cadenas D, E F de bovino y la cadena B en cloroplastos. Igualmente, las cadenas A y B

transaldolasa de los mutantes E96a, N35a, D17a y T156a de E. coli. Finalmente, otras

moléculas como tiosterasa, transaldolasa B, d-aminociclasa, el dominio de unión del

receptor beta. Un total de 15 fragmentos que contenían secuencias con identidades

entre el 37 y 52%, fueron unidos a los fragmentos obtenidos de SWISS-MODEL

empleando el programa Swiss-Pdb Viewer (spdbv) versión 3.7. Además, 62 residuos

que no se encontraban en ninguno de los fragmentos, fueron adicionados manualmente

uno a uno, atendiendo a su orientación de acuerdo a la predicción secundaria. El modelo

fue sometido a minimización energética con el programa Discover 3 del paquete Insigth

II de 2004, para lo cual fue empleado un computador Silicon Graphics Octane. Para la

visualización de la estructura tridimensional, se emplearon los programas RasMol

versión 2.6 y spdbv versión 3.7. Las figuras 27 y 28 presentan el modelo propuesto

para la estructura terciaria completa de la IDSh. El modelo presenta 33,3% en helice,

7,2% en hoja plegada y 59,5% en coil, que son porcentajes similares a los obtenidos en

la predicción secundaria.

85

Figura 24. Predicción de un Fragmento de la Estructura Terciaria de la IDSh.

(Residuos 34-108). Visualización de la molécula mediante el programa RasMol 2.6. Este fragmento fue enviado por Swiss Model.

Figura 25. Predicción de un Segmento de la Estructura Terciaria de la IDSh.

(Residuos 254-308). Visualización de la molécula por el programa RasMol 2.6. Este fragmento fue enviado por Swiss Model.

NH2

COOHNH2

COOH

86

Figura 26. Modelo Propuesto para la Estructura Terciaria de la IDSh. Visualización de la molécula mediante el programa RasMol 2.6.

87

Figura 27. Predicción de la Estructura Terciaria de la IDSh. Visualización de la molécula mediante el programa spdbv 3.7.

La figuras 28 y 29 muestran la ubicación de los cinco sitios de N-glicosilación

presentes en el péptido después de procesado y se puede evidenciar que todos ellos

están expuestos. La visualización de la estructura se realizó con spdbv 3.7.

88

Figura 28. Sitios Potenciales N-glicosilación en la Forma Madura de la IDSh. La visualización de la molécula fue realizada por spdbv 3.7. En amarillo se señala la cisteína 84 y en rojo los sitios de N-glicosilación.

89

Figura 29. Ubicación de los Sitios potenciales N-glicosilación en la Forma Madura de la IDSh. La visualización de la molécula fue realizada por spdbv 3.7. En amarillo se señala la cisteína 84 y en rojo los sitios potenciales de N-glicosilación.

Modelo Estructural y Funcional para el Sitio Activo

El análisis teórico y computacional de la comparación de estructura y función de otras

sulfatasas (103-106,172), permitió proponer un modelo para el sitio activo de la IDSh.

Se conoce que las sulfatasas requieren para su activación una modificación

postranslacional que se realiza a nivel del retículo endoplásmico, consistente en la

transformación de un residuo de cisteína en formilglicina (103). En la IDSh el residuo

90

de cisteína que sufre la oxidación hasta formilglicina corresponde a la cisteína en

posición 84. Los residuos ubicados cerca de la cisteína y que experimentalmente se

demostró que componen el centro activo de la ARSA (172) y la ARSB (104), se

comparan con los homólogos de la IDSh en la tabla 18. Con base en esta información se

localizaron los residuos conservados y su ubicación espacial se muestra en la figuras

30 y 32, mientras que la figura 31 ilustra uno de los sustratos de la IDSh, el heparan

sulfato, molécula elaborada empleando el programa WebLab Viewer Pro (173).

Considerando la similitud de la organización del centro activo de la IDSh y de las

ARSA y ARSB se postula que al igual que estas dos enzimas en donde se demostró

experimentalmente la necesidad de iones de magnesio, en el primer caso y de calcio en

el segundo (104, 172), para ser activa la IDSh requiere la presencia de un catión

divalente, se propone que en este caso sea el manganeso, dado que está establecido que

este catión incrementa la capacidad catalítica de la enzima (114). Su posible

localización dentro del centro activo se muestra en la Figura 33.

Tabla 18. Aminoácidos del Sitio Activo de ARSA, ARSB e IDS

AMINOACIDO ARSB ARSA IDS D 53 29 451

D 54 30 46 C 91 61 84 R 95 72 88 K 145 123 135 H 147 125 138 H 242 229 226 D 300 281 334 N 301 282 350 K 318 302 347

1Posición del aminoácido en la secuencia primaria

91

Figura 30. Localización de los Aminoácidos (rojo/azul) que Componen el Sitio Activo de la IDSh. En Verde se señala la cisteína 84. Visualización de la molécula mediante el programa spdbv 3.7.

92

Figura 31. Molécula de Heparan Sulfato. Este GAG es uno de los sustratos naturales de la IDSh. Estructuras elaboradas con el programa WebLab Viewer Pro.

SO4=SO4=

93

Figura 32. Heparan Sulfato en el Sitio Activo de la IDSh. Los aminoácidos que conforman el sitio activo en verde y el heparan sulfato en rosado. Visualización mediante el programa spdbv 3.7

94

Figura 33. Ubicación del Manganeso en el Sitio Activo de la IDSh. En rojo-azul se observa el heparan sulfato. Visualización mediante el programa spdbv 3.7

Cálculo del “Root Mean Square” (RMS)

El “Root Mean Square” (RMS), es una medida que permite establecer la diferencia en

la distribución espacial de los átomos de dos moléculas. El modelo de estructura

terciaria de la IDSh fue comparado con la ARSB y la ARSA y se encontraron valores de

0.78 y 0.86 Å respectivamente.

Perfil de Antigenicidad

La figura 34 muestra el perfil de antigenicidad de la IDSh. Para la producción, en

huevo de gallina de anticuerpos IgY contra la IDSh se diseñaron cuatro péptidos con

secuencias no conservadas en las sulfatasas y la figura 35 muestra la ubicación de los

mismos en el modelo de estructura terciaria de la IDSh. Los niveles de reconocimiento

variaron en forma descendente en las IgY generadas por los péptidos 2, 3, 1 y 4.

95

Figura 34. Perfil de Antigenicidad de la IDSh. Se indican las zonas en las cuales se encuentran las secuencias de los cuatro péptidos diseñados para la producción de anticuerpos IgY. Las flechas de colores verde, rojo, amarillo y magenta corresponden a las zonas de los péptidos 1, 2, 3 y 4 respectivamente.

Figura 35. Ubicación en el Modelo de Estructura Terciaria de la IDSh de Cuatro Péptidos Diseñados para la Producción de Anticuerpos IgY anti-IDShr. Los colores verde, rojo, amarillo y magenta corresponden a los péptidos 1, 2, 3 y respectivamente. Visualización mediante el programa spdbv 3.7.

Modelo de Estructura Terciaria de la IDSh Con la Secuencia del Péptido Señal.

Con el propósito de comparar la secuencia nativa de la IDSh y la expresada en nuestro

trabajo (116), se empleo BLAST de NCBI (136). La secuencia del cDNA de la IDSh

nativa (12) y la secuencia nucleotídica que codifica para la enzima recombinante,

obtenida por secuenciación (116), se alinearon y esto permitió establecer que el

plásmido de expresión pPIC-9/IDS contiene tanto la secuencia señal nativa de la IDSh,

como la secuencia completa del α-MF (174).

Al modelo de estructura terciaria se adicionaron los 33 aminoácidos que se eliminan en

el proceso de maduración de la enzima. Para esto se empleó el programa spdbv 3.7 y la

97

nueva estructura fue sometida a procesos de minimización. La figura 36 presenta el

modelo computacional de la IDSh que incluye los mencionados residuos. En la misma

se puede observar que los 33 aminoácidos adicionales, forman una hélice, una parte de

la cual cubre completamente la entrada al bolsillo donde se encuentran los aminoácidos

que componen el sitio activo y la región restante se pliega buscando ubicarse en un

espacio que presenta la estructura de la proteína. Para el péptido señal fueron

establecidos los perfiles de flexibilidad e hidrofobicidad e igualmente se hizo la

predicción computacional de estos dos perfiles para la IDSh con el péptido señal. Tanto

el α-MF (Figura 37) como el péptido señal (Figura 38), presentan un alto grado de

hidrofobicidad lo cual aumenta la hidrofobicidad de la enzima, con un cambio de -1 a 3

(Figura 39) y ocurre algo similar con la flexibilidad, puesto que el péptido señal también

posee un alto nivel de flexibilidad, un cambio de 0.4 a 0.5 (Figuras 40 y 41).

Los lisados obtenidos de la ruptura de células del cultivo M-13' mostraron niveles de

actividad enzimática que variaron entre 0.58 y 4.24 nmol/h/mg de proteína. Los

sobrenadantes de este cultivo presentaron actividad de 3.25 nmol/h/mg de proteína. La

presencia de IDShr intracelularmente, permite pensar que la actividad total del sistema

de expresión podría llegar a ser hasta el doble de la encontrada en los sobrenadantes.

Adicionalmente, un Western blot de sobrenadantes y lisados de P. pastoris pPIC9-IDS/

10 del cultivo M-22 (Figura 42), demuestra la presencia de IDShr intracelularmente

(Sosa A y Barrera LA, comunicación personal).

98

Figura 36. IDSh conteniendo el Péptido Señal. En verde se muestran los 25 residuos del péptido señal y los ocho siguientes del propéptido y en rojo los aminoácidos que conforman el sitio activo. Visualización mediante el programa spdbv 3.7.

99

Figura 37. Perfil de Hidrofobicidad del α-MF. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy.

Figura 38. Perfil de Hidrofobicidad del Péptido Señal. Para el análisis

computacional fue empleado ProScale" de ExPASy:

100

Figura 39. Perfil de Hidrofobicidad de la IDSh con el Péptido Señal. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy.

Figura 40. Perfil de Flexibilidad del Péptido Señal. Para el análisis computacional

fue empleado ProScale" de ExPASy.

101

Figura 41. Perfil de Flexibilidad de la IDSh con Péptido Señal. Para el análisis computacional fue empleado ProScale" de ExPASy.

Figura 42. Western blot de Sobrenadantes y Lisados de P. pastoris pPIC-9/IDS del cultivo M-22. Carriles 1 IDShr Purificada (TKT), Carriles 2,3,4 Sobrenadantes y Carriles 5,6,7 lisados.

~ 120-200kDa

~36-40kDa

~ 55-66kDa

1 2 3 4 5 6 7

102

Los cultivos mostraron niveles de actividad proteolítica que cuando fueron superiores a

6,25 UP/ml/min fueron asociadas a disminuciones en la actividad IDShr (144). Con

respecto a esto sabemos que se han encontrado (175,176), cuatro tipos de proteasas en

P. pastoris carboxipeptidasa Y, aminopeptidasa, proteinasa A (PrA) y proteinasa B

(PrB). La primera hidroliza enlaces peptídicos en el extremo C y la aminopeptidasa en

el extremo N, mientras que la PrA lo hace en secuencias LL-/-VY la PrB tiene

actividad proteolítica similar a tripsina. Durante los procesos de purificación se observó

actividad catalítica IDShr en fracciones menores a 30 KDa producto de la

ultrafiltración. La presencia y acción de proteasas permite explicar el fenómeno

observado. Con relación a esto, la actividad proteolítica de la carboxipeptidasa y la

aminopeptidasa no generan fragmentos pequeños, además no existen dentro de la IDShr

secuencias blanco para la PrA y la proteólisis por parte de la PrB puede generar

diversidad de fragmentos dentro de los cuales podemos encontrar los siguientes:

PSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR LVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHA GNFSTIPQYF KENGYVTMSV GKVFHPGISS NHTDDSPYSWSFPPYHPSSE KYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR VSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTE QAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR RPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPE GTLPDKQSTE QAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR YPK

103

LYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAV GYHKPHIPFR YPKEFQ. Estos fragmentos tienen pesos moleculares inferiores a 30 KDa y todos poseen seis de

los nueve residuos que conforman el sitio activo. La literatura reporta cuatro mutaciones

en las cuales la proteína es incompleta: E177Term, L213Term, Y103Term y R433Term

y los fenotipos corresponden a presentaciones moderadas o intermedias, lo que significa

que estas proteínas mutadas presenta actividad biológica. A excepción de R433Term las

otras formas de proteína tienen pesos moleculares pequeños y conservan seis de los

nueve aminoácidos del centro activo lo cual sugiere que fragmentos como los que puede

generar la PrB se presentaron durante las fermentaciones y son responsables de la

actividad catalítica determinada en las fracciones menores a 30 KDa.

Análisis de las Mutaciones Puntuales Se analizaron 114 (de las cuales se obtuvo la información) de las 169 mutaciones

puntuales reportadas (16-39) y se encontró que corresponden 9 (7.9%), 31 (27.1%), 2

(3.5%), 19 (16.6%), 11 (9.6%), 14 (12.2%) y 23 (20.1%) a los exones II, III, IV, V,

VI, VII, VIII y IX, respectivamente. Al ubicarse sobre el modelo de estructura terciaria

se observa que 87.8% de estas mutaciones se encuentran en regiones en coil.

Con el propósito de establecer una correlación entre las mutaciones puntuales de la

IDSh y la severidad de la enfermedad de Hunter se realizó un análisis teórico y

computacional. Para dicho análisis se consideró como referencia al sitio activo la

ubicación de la cisteína 84 y una región circunscrita en un círculo con radio de 10 Å.

Esta región fue considerada cercana al sitio activo y los residuos fuera de este círculo se

catalogaron como lejanos. La clasificación de los aminoácidos se consideró a pH

fisiológico y se establecieron tres grupos de aminoácidos: hidrofóbicos (G, A, V, L, I,

M, P, F, W); polares neutros (S, T, N, Q, Y, C) y polares cargados (K, R, D, H, E)

(177). La tabla 19 resume los parámetros considerados en el análisis y en la misma se

pueden realizar las siguientes observaciones:

104

1. Todas las mutaciones en la región cercana a la cisteína 84 resultan en presentaciones

severas (A82E, A85S, A85T, P86R, P86R, P86Q, P86L, R88G, R88H, R88L,

R88P).

2. Cualquier aminoácido mutado por Arginina genera un fenotipo severo (S71R,

H335R, W337R, L339R, P358R, L403R, C422R, P120R, K135R). En estos casos

existe un cambio drástico por la introducción de carga eléctrica de la Arginina que

afecta las interacciones electrostáticas en la zona mutada. Es una excepción la

L102R que corresponde a una presentación moderada.

3. Si muta R el fenotipo es moderado (R48P, R95T, R468L). Esto sugiere que los

cambios electrostáticos no son tan severos y se produce una proteína mutada con

niveles de actividad responsable del fenotipo moderado. Sin embargo la mayoría de

las mutaciones en la posición R468- proporcionan fenotipos severos. Este sitio se

considera un sitio altamente mutable y su frecuencia es alta en todas las etnias con

presentaciones severas de la enfermedad (16)

4. Cualquier aminoácido mutado por lisina genera un fenotipo severo (E341K,

E434K, I485K). La presencia de lisina en esos sitios genera cambios drásticos en las

interacciones de los aminoácidos de la proteína.

5. Si muta K siempre el fenotipo es severo (K135R, K135N, K227Q, K227M, K347T).

La pérdida de la carga eléctrica de la lisina produce cambios electrostáticos severos

en la proteína mutada.

6. Cuando la Prolina es mutada por Histidina el fenotipo es moderado (P120H, P266H,

P469H). En estas mutaciones hay cambio de un aminoácido aromático por otro

aromático y el efecto del cambio de hidrofóbico a polar cargado es disminuido por

la distancia al centro activo (21.43, 34.18, 39.65 Å), están ubicadas lejos de la

Cisteína 84.

7. Si muta la H por un residuo polar neutro como la tirosina (H229Y) da un fenotipo

severo, pero si la mutación es lejos (31.46 Å) del sitio activo como H342Y el efecto

es leve y se expresa como un fenotipo moderado.

8. Mutaciones de aminoácidos hidrofóbicos por glutamato generan un fenotipo severo

(A82E, G224E, G336E). Existen cambios severos en la carga eléctrica de las zonas

mutadas y se afectan las interacciones electrostáticas generándose una proteína

mutada con poca o ninguna actividad catalítica. Existe una excepción, la mutación

105

A79E, la misma se produce a 10.23 Å del sitio activo y para la cual no tengo

explicación. Además, mutaciones de D por E (D308E) resultan en presentaciones

moderadas, lo cual se explica porque los dos residuos son polares cargados

negativamente y las alteraciones no deben ser drásticas.

9. Si es mutado el E por un residuo positivo (E34K, E434K) se presenta un fenotipo

severo. El cambio de la naturaleza de la carga eléctrica constituye un cambio

drástico en la estructura y función de la enzima que ocasiona su perdida de actividad

catalítica. Aunque el E se mute por un residuo hidrofóbico si la mutación es

distante del sitio activo (23.27 Å) resulta una presentación clínica moderada como

en el caso de E125V, en donde al parecer la distancia al sitio activo disminuye el

efecto que pudieran tener las nuevas interacciones electrostáticas en el sitio de

mutación.

10. Si mutan aminoácidos alifáticos por Aspartato (G94D, G340D, A346D, N63D) se

tienen fenotipos moderados. Si la mutación es de residuos aromáticos la

presentación de la enfermedad es severa (Y54D, H138D, Y225D), en este caso el

tamaño del aminoácido que se pierde y la carga del aminoácido introducido causan

cambios en la estructura e interacciones de la proteína mutada convirtiéndola en una

molécula sin actividad biológica.

11. Si se muta aspartato por residuos aromáticos (D478Y) el fenotipo es severo. Si este

último tipo de mutaciones son alejadas del sitio activo como D334G (15.85 Å),

D187V (23.23 Å) y D198G (29.89 Å) o se realizan por residuos de asparagina

(D45N, D334N), los fenotipos son moderados. La distancia al sitio activo permite o

no que los efectos locales del cambio de carga y tamaño de los residuos, tengan

efecto sobre las interacciones de los aminoácidos del sitio activo y el cambio de

aspartato por asparagina no genera muchos cambios puesto que las estructuras

químicas en este caso son parecidas y por consiguiente la proteína mutada no sufre

variaciones importantes en su estructura y consecuentemente en su función.

12. Se presentan fenotipos severos cuando hay mutaciones por tirosina (C24Y, C432Y,

D478Y, S117Y, H229Y). La introducción de una molécula aromática en su sitio

destinado genéticamente a un residuo alifático produce cambios de conformación,

responsable de la perdida de actividad en la enzima mutada. En el último caso, si

bien el cambio es residuo aromático por aromático, existe una diferencia de carga

106

que igualmente genera cambios en la estructura proteíca y pérdida de la actividad

biológica. Sin embargo, la mutación puede presentarse alejada del centro activo

como en H342Y (31.46 Å) o N115Y (17,68 Å) en cuyo caso el fenotipo es

moderado.

13. Si es mutado tirosina por un residuo polar neutro (Y108C, Y108S) el fenotipo es

moderado, sin embargo, si el cambio es por un aminoácido polar cargado (Y225D,

Y54D) el fenotipo es severo. El primer caso sugiere que el cambio por aminoácidos

neutros no llegan a alterar significativamente la molécula de IDSh, pero si se

introduce una variación en la carga eléctrica, la proteína es afectada producto de las

nuevas interacciones electrostáticas.

14. Mutaciones por prolina son responsables de fenotipos severos (V89P, L92P,

L182P, L259P, L221P, L314P, H159P, A205P, Q465P).

15. Mutaciones de polar neutro a residuos hidrofóbicos pueden resultar en fenotipos

moderados (T118I, S299I) cuando son distantes del sitio activo (21.63 y 34.21 Å),

con excepción de S349I que es de presentación severa. Este tipo de mutaciones

resultan severas cuando se encuentran ubicadas en una hélice (T309A, N265I) o

cuando el aminoácido hidrofóbico es aromático (S132V, S143F, C184F). El reporte

de las dos últimas mutaciones indica que el fenotipo es de moderado a severo, lo

que evidencia la subjetividad en la observación clínica.

16. Cambios de la misma naturaleza, es decir, aminoácidos hidrofóbico por

hidrofóbico (A346V) o polar neutro por polar neutro (S71N) resulta en fenotipo

moderado. Este tipo de mutaciones sugiere que al tener la misma naturaleza química

los aminoácidos involucrados en la mutación, los cambios no son tan drásticos y la

enzima mutada mantiene algún nivel de actividad biológica, responsable del

fenotipo moderado de la enfermedad.

107

Tabla 19. Relación Entre la Severidad Fenotípica del Síndrome de Hunter y la Naturaleza y Ubicación del Aminoácido Mutado en 114 Mutaciones

Puntuales de la IDSh.

Mutación

Severidad

Cambio de aminoácido

Distancia

a C-84 (Å)

Exón

L41P M-S A/A 14.61 2 D45N M PC/PN 9.18 2 R48P M PC/A 15.63 2 Y54D S PN/PC 23.77 2 N63D M PN/PC 24.61 2 S71R S PN/PC 26.05 2 S71N M PN/PN 26.05 2 A79E M A/PC 10.23 2 Q80Term S PN/ 10.00 2 A82E S A/PC 8.19 3 C84Term S PN/ 0.0 3 A85P S A/A 3.1 3 A85S S A/PN 3.1 3 A85T S A/PN 3.1 3 P86R S A/PC 4.71 3 P86Q S A/PN 4.71 3 P86L S A/A 4.71 3 R88C S PC/PN 5.82 3 R88G S PC/A 5.82 3 R88H S PC/PC 5.82 3 R88L S PC/A 5.82 3 R88P S PC/A 5.82 3 L92P S A/A 11.9 3 G94D M A/PC 14.03 3 R95T M PC/PN 11.91 3 L102R M A/PC 8.79 3 Y103Term S PN/ 10.23 3 Y108C M PN/ 13.48 3 Y108S M PN/PN 13.48 3 N115Y M PN/PN 17.68 3 S117Y S PN/PN 20.72 3 T118I M PN/A 20.84 3(h)

P120R S A/PC 21.43 3(h) P120H M A/PC 21.43 3(h)

108

E125V M PC/A 23.27 3 S132W S PN/A 20.72 3 L135R S A/PC 9.43 3 L135N S A/PN 9.43 3 H138D S PC/PC 15.79 3 S143F M PN/A 11.74 3 Y151Term S PN/ 10.05 4 H159P S PC/A 16.69 4 R172Term S PC/ 22.97 5(S) E177Term M PC/ 22.35 5 L182P S A/A 22.55 5 C184F M – S PN/A 18.94 5 D187V M PC/A 23.23 5 L196S M A/PN 32.33 5 D198G M PC/A 29.89 5 L213Term S A/ 19.4 5 L221P S A/A 12.50 5 G224E S A/PC 10.67 5 Y225D S PN/PC 10.46 5 L227Q S A/PC 10.60 5 L227M S A/A 10.60 5 P228L S A/A 13.59 5 P228T S A/PN 13.59 5 H229R S PC/PC 15.83 5 H229Y S PC/PN 15.83 5 P231L S A/A 17.28 5 Y234Term S PN/ 18.24 5 E245Term S PC/ 18.76 6 L259P S A/A 35.70 6 N265I S PN/A 37.25 6(h) P266R S A/PC 34.18 6 P266H M A/PC 34.18 6 L279Term S A/ 34.46 6 Q298Term S PN/ 36.10 7 S299I M PN/PN 34.39 7 D308N S PC/PN 28.57 7(h) D308E M PC/PC 28.57 7(h) T309A S PN/A 29.98 7(h) L314P S A/A 25.68 7 S333L S PN/A 16.07 7 D334N M PC/PN 15.85 7

109

D334G S PC/A 15.85 7 H335R S PC/PC 18.73 7 G336E S A/PC 21.67 8 W337R S A/PC 24.66 8 L339R S A/PC 30.75 8(h) G340D M A/PC 31.51 8(h) E341K S PC/PC 30.63 8(h) H342Y M PC/PN 31.46 8 W345Term S A/ 36.06 8 A346D M A/PC 39.31 8 A346V M A/A 39.31 8 K347T S PC/PN 40.83 8 S349I S PN/A 36.27 8 P358R S A/PC 39.20 8 G365Term S A/ 46.61 8 Q389Term S PN/ 50.77 8 Q396Term S PN/ 42.39 9 L403R S A/PC 36.00 9(h) L410P S A/A 28.27 9(h) C422R S PN/PC 34.37 9 C422Y S PN/PN 34.37 9 C432Y S PN/PN 31.13 9 E434K S PC/PC 29.63 9 R443Term M PC/ 23.90 9 Q465P S PN/A 31.12 9 Q465Term S PN/ 31.12 9 Y466Term S PN/ 32.22 9 P467L S A/A 34.24 9 R468Q S PC/PN 37.04 9 R468L M PC/A 37.04 9 R468W S PC/A 37.04 9 P469H M PC/PC 39.65 9 Q474Term M PN/ 35.20 9 W475Term M A/ 34.43 9 D478Y S PC/PN 38.25 9 P480R S A/PC 44.65 9 L482Term S A/ 44.43 9 I485R S A/PC 9 I485K S A/PC 9

A=Alifático, PN=Polar neutro, PC=Polar cargado, M=Moderado, S=Severo, h=Hélice, S=Hoja plegada.

110

Efecto de las Mutaciones Estudiadas Sobre la Estructura Terciaria de la IDSh

Sobre el modelo de estructura terciaria se realizaron cada una de las 118 mutaciones

puntuales, empleando el programa spdbv versión 3.7. Las estructuras mutadas fueron

sometidas a ciclos de minimización y se calculó el RMS. Las diferencias encontradas

para mutaciones responsables de fenotipos severos variaron entre 0.09 y 0.16 Å,

mientras que en el caso de fenotipos moderados las diferencias estuvieron entre 0.05 y

0.09 Å.

111

DISCUSIÓN

El presente trabajo se encuentra enmarcado en la línea de investigación de TRE para

mucopolisacaridosis que adelanta el EIM y que persigue implementar protocolos de

TRE para la enfermedad de Hunter. El mismo, incluyó dos partes, una experimental y

otra computacional empleando herramientas bioinformáticas. Con relación a la parte

experimental se empleó como metodología de determinación de proteínas la técnica de

Lowry (139), la cual en este caso, mostró un rango de detección dentro de los límites

establecidos para la misma.

Con el propósito de mejorar las pruebas de determinación de actividad enzimática de la

IDShr, se implementó el uso de una prueba fluorométrica (140), con el empleo del

sustrato MU-αIdoA-2S. Esta técnica, más sensible y menos laboriosa, reemplazó a la

prueba radiométrica empleada hasta entonces en el laboratorio. Puesto que fue diseñada

para muestras humanas como fibroblastos, leucocitos y plasma, tuvo que adelantarse un

proceso de adaptación para su uso con muestras procedentes de los cultivos de E. coli y

P. pastoris. Teniendo en cuenta que el fabricante del sustrato recomienda el uso de 150

y 100 µg/dL de proteína total, para leucocitos y fibroblastos, se estableció un rango de

concentración de proteína total entre 100 y 200 µg/dL para nuestro caso. Además, se

cambió el buffer de parada recomendado por el protocolo del fabricante y se empleó

buffer carbonato/bicarbonato con glicina 1.7 M pH 11.0, el cual es el buffer usado

corrientemente, en nuestro laboratorio, para otras pruebas enzimáticas que emplean

sustratos fluorométricos con base en el metil umbeliferil (MU) y se empleó puesto que

los dos detienen la reacción por elevación del pH. Los valores de actividad máximos

alcanzados en las fermentaciones realizadas se presentaron en los cultivos M-7 y M-13

(Tabla 6) y respectivamente, fueron 29.36 y 25.4 nnmol/h/mg de proteína total a las

35 y 47 horas de cultivo. Sin embargo, descendieron notablemente para el final de la

fermentación. Este producto final fue el utilizado para los ensayos de purificación.

Estos resultados de actividad sugieren que las fermentaciones deben adelantarse

solamente hasta las 35-47 horas de cultivo. El plasma humano empleado como control

en la prueba de actividad sufre un deterioro progresivo que se traduce en disminución de

112

la actividad IDSh, producto de los procesos de congelación-descongelación (Tabla 2) y

aunque no se realizaron experimentos de este tipo con las muestras procedentes de

cultivos de los microorganismos empleadas en este trabajo, es factible que las

disminuciones en la capacidad catalítica de la IDShr, presente en dichas muestras sufra

un deterioro progresivo de las mismas magnitudes.

Con el fin de obtener para su uso en los procesos de purificación, específicamente en

cromatografía de afinidad, se preparó un anticuerpo policlonal anti-IDShr en conejos.

Como antígeno se emplearon concentraciones de 100 y 50 µg/kg de IDShr pura (TKT)

y se inmunizaron dos conejos. Los resultados (Tabla 3), sugieren que la primera

concentración de antígeno resultó más efectiva para generar respuesta inmune y los

anticuerpos procedentes del primer conejo presentaron una mayor sensibilidad para

reconocer la enzima. El patrón electroforético de las IgG obtenidas (Figura 6), permitió

comprobar que fueron purificadas. El anticuerpo policlonal reconoció específicamente

la IDShr purificada por TKT (Figura 7) e IDShr presente en el retentato del cultivo M-

13 de P. pastoris e igualmente en sobrenadantes de E. coli (Figura 8).

El anticuerpo policlonal fue utilizado para la elaboración de una columna de afinidad,

la cual reconoció y retuvo IDShr presente en un sobrenadante del cultivo M-13 de P.

pastoris (Figura 9). Los datos obtenidos en este experimento de separación de la IDShr

permitieron deducir que hay un aumento de la actividad específica de más de cuatro

veces en ese paso de la purificación (Tabla 4).

Fueron adelantados una serie de experimentos conducentes a obtener información sobre

los porcentajes de recuperación de proteínas y la tabla 7 resume los resultados de uno de

estos experimentos. Con base en esta información se puede señalar que menos del 7%

de proteínas de los sobrenadantes se recuperan durante la ultrafiltración y son las que se

encuentran entre 30 y 100 KDa, es decir, el rango dentro del cual, según los reportes de

la literatura (58-61), existen las formas activas de la enzima.

El patrón electroforético de un sobrenadante de P. pastoris muestra la presencia de

proteínas en un rango entre 20 y 120 KDa (Figura 10). Los reportes de la literatura

113

señalan que P. pastoris, secreta al medio de cultivo bajas cantidades de proteínas

nativas y la mayoría de las proteínas secretadas corresponden a la proteína heteróloga

(92,96,97). Esta información permitía pensar en que la mayoría de las proteínas

presentes en los sobrenadantes (Figura 10), correspondían a la IDS recombinante, sin

embargo, en nuestro caso, la cromatografía de afinidad solo permitió recuperar

alrededor del 0.22% del total de proteínas y menos del 2% de la actividad total (Tabla

11). La cuantificación por ELISA señaló que menos del 1% corresponde a IDShr

recuperada en el proceso de ultrafiltración (Tabla 12).

Con el propósito de retirar iones o sales de fosfatos y sulfatos que pudieran afectar la

actividad de la IDShr (114), se dializaron las diferentes fracciones de las etapas del

proceso de separación. En las fracciones no sometidas a este paso, previo a la

determinación de actividad IDShr, se presentaron disminuciones y aunque menores al

10% (Tabla 8), son importantes dado los bajos niveles de actividad presentados. Lo

anterior sugiere la necesidad de adicionar este paso como parte del proceso de

separación.

Para concentrar bajos volúmenes no existió dificultad empleando centricones, sin

embargo, volúmenes mayores requieren el uso de una metodología más rápida y

eficiente, considerando la necesidad de conservar estable los bajos volúmenes de

enzima separados, expuestos a la acción de proteasas (175,176). Los resultados (Tabla

9), demuestran que aunque la liofilización concentró, afecta en forma considerable la

actividad de la enzima, posiblemente como consecuencia de alteración de la estructura

tridimensional de la molécula. En el caso del retentato, la disminución en la actividad

IDShr fue menor, posiblemente debido a que las proteínas diluidas son más susceptibles

de verse afectadas por cambios físicos y el retentato era la fracción más concentrada de

las utilizadas en este experimento (Tabla 9).

La metodología de separación de la IDShr se diseño en tres etapas, respondiendo a las

características conocidas de la enzima humana (114) y la información generada por

predicción computacional. Este diseño persigue disminuir a solo tres etapas el proceso

de separación de la IDS, el cual corrientemente consta de siete (113). Después de

114

centrifugados los cultivos, los altos volúmenes de los sobrenadantes fueron

concentrados por ultrafiltración. Puesto que la literatura reporta formas desde 39 hasta

100 KDa se utilizó un sistema de empleo secuencial de dos membranas de celulosa

para excluir proteínas de 100 y 30 KDa y obtener de esa forma una fracción concentrada

de proteínas entre 30 y 100 KDa. A sabiendas que la IDS es una enzima lisosomal y

que la predicción computacional señala que el punto isoeléctrico es pH 5.1, el buffer de

mantenimiento y corridas cromatográficas fue acetato 0.1 M pH 5.0. Los procesos de

centrifugación de los cultivos y ultrafiltración, se realizaron a 4°C, inmediatamente

finalizadas las fermentaciones. Esto con el propósito mantener la estabilidad de la

enzima recombinante, disminuir los niveles actividad proteolítica (175,176), que

afectaran la proteína expresada y evitar procesos de congelación y descongelación que

disminuyeran la actividad catalítica de la IDShr obtenida in vitro.

Los cromatogramas de retentatos de los sobrenadantes de cultivos de P. pastoris

GS115 pPIC9-IDS/28 (Figuras 11y 12), mostraron cambios de absorbancia a 280 nm

muy leves, producto de las bajas concentraciones de proteína en las muestras, lo que

sugiere un bajo nivel de expresión de la proteína recombinante. A pesar de los bajos

porcentajes de recuperación del sistema de separación, los escasos niveles de la enzima

heteróloga (Tabla 12) corresponden a IDShr con actividad catalítica. En este sentido, la

tabla 10 detalla los resultados de cinco procesos de separación, en donde la fracción

final presentó actividad IDShr hasta de 58.78 nmol/h/mg, es decir, más de cuatro veces

el valor de referencia del laboratorio del IEIM para IDSh plasmática que es de 12.41

nmol/h/ml y más de nueve veces el valor de referencia para leucocitos que es de 6.96

nmo/h/mg. Aunque este nivel de actividad enzimática no ha sido alcanzado en la

mayoría de los procesos anteriores de purificación reportados en la literatura

(60,61,102-113), no responde a los valores esperados y solo constituye un punto de

referencia para continuar en la búsqueda de optimización del sistema de expresión y

purificación que actualmente desarrolla el IEIM. Estos niveles de actividad se

presentaron fundamentalmente en muestras del cultivo M-13. Este cultivo presentó una

alta concentración de proteínas y sólo se detectaron 2.36 unidades de actividad

proteolítica (144). Lo anterior, sugiere que a diferencia de otras fermentaciones, la alta

concentración de proteína extracelular y la baja actividad proteolítica son responsables

115

de una mayor cantidad de IDShr y como consecuencia de esto, los valores de actividad

observados. Las cantidades de IDShr expresadas en este sistema de producción de

proteínas heterólogas no responden a las expectativas con miras a obtener enzima

recombinante para ser empleada clínicamente como medida terapéutica para la

enfermedad de Hunter. En este sentido es conocido que actualmente los pacientes

tratados con TRE reciben dosis semanales de enzima recombinante de 0.5 mg/kg de

peso (49). Implementadas las técnicas y con resultados que sugieren que tanto el

sistema de expresión como el de purificación deben ser mejorados, se replantearon

algunos de los propósitos iniciales y como meta fundamental dentro del estudio, mejorar

la producción de la enzima, empleando nuevas metodologías u optimizando las

existentes.

En esa búsqueda de soluciones experimentales, recientemente, se estandarizó una

prueba de ELISA simple para cuantificar IDShr, que constituye una metodología de

mucha utilidad pues permite contar con una prueba alterna, a la determinación de

actividad, para monitorear la presencia de la IDShr durante los procesos de expresión y

purificación, aunque haya perdido su actividad. En este sentido, para las diferentes

fases del proceso de ultrafiltración se determinó la cantidad de IDShr presente (Tabla

12). Los resultados señalan que menos del 1% de la proteína corresponde a la enzima

recombinante y que gran parte de ella, se encuentra en el ultrafiltrado final, es decir, en

una fracción menor a 30 KDa. Estas fracciones presentan actividad enzimática (Tablas

8 y 9), lo que sugería dos posibilidades, que podrían existir formas activas de menor

peso molecular a lo indicado en la literatura (58-61) o que eran fragmentos de la

proteína, originados por proteolisis. En el primero de los casos, se puede concluir la

necesidad de utilizar una membrana de 10 KDa para concentrar esos fragmentos o

formas de la enzima recombinante y en el segundo establecer controles del pH

(175,176) o uso de inhibidores de proteasas para contrarrestar la actividad proteolítica.

Surgieron como alternativas de trabajo, la revisión de la construcción genética de la

cepa recombinante, un análisis computacional de la enzima y la expresión de la IDShr

en E. coli, considerando obtener una proteína no glicosilada, con la posibilidad de

glicosilarla in vitro (87).

116

El análisis teórico de tipo genético indicó que en la región del promotor dr la IDS no se

encuentran secuencias del tipo cajas TATA o CAAT, sin embargo, se hallan dos

secuencias consenso GC, esto es consistente con la característica de dicho gen de

presentar bajos niveles de transcripción (13), lo cual explicaría en parte los bajos niveles

de actividad IDShr obtenidos en este trabajo.

En nuestro laboratorio, ya se había expresado la IDShr a pequeña escala en E. coli con

actividades del orden de 1,5 nmol/h/mg (115). Se trabajo en este sentido y se encontró

que la cinética de expresión a nivel de 100 ml presentó un máximo de actividad de

0.54 nmol/h/mg de proteína a las ocho horas de cultivo. Tomando como referencia

esta hora se escaló a 500 ml y luego a 1000 ml, aumentándose los niveles de actividad

a 0,75 y 1,91 nmol/h/mg (Tabla 13). En este sentido, es importante resaltar que la

comprobación de expresión de la IDShr en forma activa en este modelo biológico,

constituye la ratificación que, específicamente para nuestro caso, las glicosilaciones no

son necesarias para que la enzima sea activa. Los resultados obtenidos en la separación

de la IDShr señalan que los niveles de expresión son bajos (Tablas 13-16), igual que en

P. pastoris, a tal punto que las concentraciones de proteína recombinante no estuvieron

en el umbral mínimo de reconocimiento del anticuerpo policlonal de la columna de

afinidad y se diluyeron durante la corrida cromatográfica (Tabla 15). El proceso se

adelantó sólo hasta la exclusión molecular y el porcentaje de recuperación estuvo por

debajo del 1% (Tabla 16). Aunado a los bajos niveles de expresión de la proteína se

hizo notoria la expresión transiente de la IDShr en este modelo bacteriano. Esto como

consecuencia que el pUC13-IDS es un plásmido de mantenimiento y transporte del

cDNA de interés, en nuestro caso el de la IDSh. Esto último, orientó la investigación

hacia el empleo de un nuevo plásmido, pero esta vez de expresión. En este sentido, se

utilizó el plásmido de expresión pGEX 3X como parte de sistema de expresión GST en

E. coli. El nuevo constructo pGEX 3X-IDS se clonó en la cepa JM109 y en el lisado

celular se detectó IDShr no activa en concentración de 17.28 ng/mg de proteína total. La

IDShr expresada en este caso lleva una cola de glutatión-S-transferasa, que permite su

purificación por cromatografía de afinidad empleando una columna de sefarosa-

glutatión. La presencia de esta cola debe constituir un impedimento conformacional

para la formación del complejo enzima-sustrato. El paso siguiente lo constituye la

117

purificación de la enzima recombinante por cromatografía de afinidad y la proteína

recombinante eluída será sometida a la acción del factor Xa para clivar la cola de

glutation-S-transferasa.

La otra alternativa en busca de información de utilidad para mejorar el sistema de

expresión de proteínas heterólogas lo constituyó el análisis computacional de varios

aspectos de la enzima. Sabemos que existen un gran número de programas de

computación que han sido desarrollados para el estudio de las biomoléculas. Mediante

ellos es posible hacer predicciones en cuanto a estructura y función. Estos programas

utilizan para sus predicciones algoritmos estadísticos, neurales y genéticos, teniendo

como referencia la información acumulada en las bases de datos de Gen Bank,

ExPASy, EMBL y otras. Los programas de computación se han convertido en

herramientas útiles porque al lograr tener conocimiento de aspectos relativos a la

estructura y por consiguiente el comportamiento de una molécula, facilitan el diseño de

experimentos y permiten el ahorro de energía, tiempo y dinero que de otra manera no

sería posible. Dichas herramientas son de fácil acceso y aunque son laboriosas en su

uso, no son complicadas en su manejo. Con el empleo de este tipo de herramientas, una

revisión bibliográfica profunda y análisis teóricos se obtuvieron resultados que serán de

gran utilidad en la expresión y potencial uso IDShr en TRE para pacientes con el

Síndrome de Hunter. Se llevaron a cabo análisis computacionales a nivel de estructura

primaria y elaboración de modelos computacionales para las estructuras secundaria,

terciaria y sitio activo. De estos aspectos no existen reportes en la literatura. Con

relación al primer nivel podemos señalar que los resultados obtenidos para la

predicción del perfil de accesibilidad sugieren que la IDSh es una molécula con un alto

porcentaje de zonas de alta accesibilidad (Figura 16), lo cual está de acuerdo con el alto

porcentaje de estructura terciaria en coil (Figuras 26 y 27). Aunque 160 residuos son de

tipo hidrofóbico (Figura 14), solo la región correspondiente al peptido señal y los

siguientes 10 aminoácidos, presentan altos valores de hidrofobicidad (Figura 15), lo

que se explica por la naturaleza de las secuencias de los peptidos señal (122). También,

este bajo perfil de hidrofobicidad en gran parte de la molécula esta acorde con el alto

porcentaje de zonas expuestas en la estructura terciaria (Figura 26). El perfil de

118

flexibilidad (Figura 17), sugiere que la enzima es una molécula altamente flexible, lo

que se explica por su naturaleza de enzima, ya que esto facilita su actividad catalítica.

Computacionalmente se determinaron valores de 5.15 para el punto isoeléctrico (pI) y

de 58.479 KDa para el peso molecular. Experimentalmente se han determinado valores

similares en cuanto al pI (58), sin embargo, en la determinación del peso molecular por

métodos variados, se han reportado valores entre 43 y 49 KDa para la proteína madura

en diferentes tipos celulares (110-113). Esta diferencia en el peso molecular se debe

posiblemente a que los patrones de glicosilación en la proteína nativa no son

considerados en la predicción computacional y que las formas maduras de la IDSh han

perdido en el procesamiento un fragmento de 18 KDa (12). El conocimiento del pI y el

peso aproximado de la forma madura de la enzima fueron considerados en el

establecimiento de los protocolos de purificación de la enzima recombinante,

concretamente en la selección de los poros de las membranas de ultrafiltración, la

selección del buffer de mantenimiento y el uso de cromatografía de exclusión

molecular.

En la secuencia de la IDSh existen 26 sitios potenciales de fosforilación en treoninas,

tirosinas o serinas con alta probabilidad de ocurrencia y aunque existen 61 residuos

más factibles de fosforilarse las probabilidades en estos casos son muy bajas (Figura

18). Se ha postulado (59-61), que la enzima puede estar fosforilada, sin embargo, los

autores no presentan evidencias que permitan dilucidar si esta fosforilación es a nivel

del péptido o en la parte glicosídica, en donde también cabría la posibilidad, sabiendo

que esta enzima es lisosomal y para poder llegar a los lisosomas requiere estar

fosforilada en residuos de manosa (128). Esta alta probabilidad de fosforilación permite

pensar que algunas de las múltiples isoformas tejido-específicas de la enzima humana

sean por niveles diferentes de fosforilación. Estudios de espectrometría de masas con la

proteína purificada permitirán comprobar los reales niveles de fosforilación de la IDS,

tanto en la humana nativa como en la proteína recombinante.

En cuanto a las glicosilaciones sabemos que pueden ser fundamentalmente de dos tipos

N y O-glicosilación (125). Por su naturaleza de enzima lisosómica, la IDSh sufre una

119

serie de modificaciones postranslacionales, dentro de las cuales el proceso de

glicosilación es uno de los más importantes. Este proceso de glicosilación se realiza

entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi (129-131) y las glicosilaciones

fundamentalmente son del tipo N-. El componente computacional nos indica que

existen en el péptido precursor ocho potenciales sitios de adición de azucares a residuos

de asparagina (Figura 14), el primero es eliminado al escindirse el péptido señal y los

dos últimos se pierden al eliminarse el fragmento de 18 KDa (12). Cinco de estos sitios

tienen probabilidades de glicosilarse entre el 65 y 80%, dos con probabilidades entre 50

y 60% y el último con niveles probabilísticos del 52% (Figura 20). Se ha demostrado

(60), que todos los sitios de glicosilación estan ocupados por glicósidos de

aproximadamente 2 KDa cada uno. El modelo computacional propuesto (Figuras 28 y

29) muestra que estos potenciales sitios de N-glicosilación están expuestos, lo que

facilita su ocupación por glicósidos. De los 62 potenciales sitios de O-glicosilación,

ninguno supera el 50% de probabilidad de ocurrencia, lo cual no permite considerarlo

como predicción (Figura 19).

Del total de proteínas codificadas por los 30000 genes humanos (138), un buen

porcentaje de estructuras terciarias han sido obtenidas por la industria farmacológica,

sin embargo, gran parte de ellas no se encuentran reportadas en PDB (135). De las

25000 secuencias presentes en esta base de datos solo 5100 se consideran de buena

calidad y de ellas 1100 corresponden a proteínas humanas. Sin embargo, la gran

mayoría son simplemente fragmentos o dominios. Atendiendo a esto último, menos del

1% del total de proteínas tienen estructura terciaria determinada experimentalmente

(138,178). Además, cerca del 20% de los dominios del total de proteínas son reportados

como producto de la predicción computacional por homología (138,178). En resumen se

tiene conocimiento de menos del 10% del total de proteínas. Sin embargo, como

alternativa existe la posibilidad de obtener información sobre estructura y

comportamiento de proteínas gracias al modelaje homólogo que permiten las

herramientas computacionales.

La mayoría de las estructuras tridimensionales de PDB han sido obtenidas por

cristalografía, resonancia magnética nuclear (NMR) o modelaje teórico (138,178,179)

120

Los mencionados procedimientos experimentales con frecuencia presentan limitaciones,

tales como la distorsión de algunas regiones de la estructura durante la cristalización,

debido a contacto entre moléculas cercanas en el cristal y puesto que se utilizan cristales

altamente hidratados, en ocasiones no se tiene certeza si un átomo corresponde a la

proteína o a una molécula de agua. Los cristales deben ser perfectos y esta parte del

proceso se constituye en muchos casos en la limitante del procedimiento. De otro lado,

la NMR permite determinar estructuras de proteínas en solución, sin embargo, se limita

a moléculas menores a 30 KDa, es el método de preferencia para proteínas pequeñas

que no son fáciles de cristalizar, sin embargo los resultados de la NMR son

ensamblados en modelos alternativos, en contraste con un modelo único de

cristalografía y no resultan tan exactos como los obtenidos por cristalografía. Los dos

procedimientos requieren técnicas y equipo altamente sofisticado, lo que se traducen

en altos costos para procedimientos que en muchas ocasiones implican gran inversión

de tiempo y no siempre arrojan los resultados esperados. En el caso de proteínas

humanas las fuentes de obtención es otro aspecto a considerar, puesto que son bien

conocidos los riesgos infecto-contagiosos de fluidos humanos, de los cuales con

frecuencia las cantidades de proteína separada son bajas. Ante las dificultades

anteriormente señaladas, la predicción por modelaje homólogo (138,177), ofrece la

posibilidad de tener buenas aproximaciones a la estructura tridimensional de una

proteína de interés y la aplicación de este conocimiento al diseño de experimentos y la

explicación de resultados, como es nuestro caso.

La literatura no tiene reportes acerca de sus estructuras secundaria y terciaria de la

IDSh y solo se conoce la secuencia primaria deducida conceptualmente (12). La IDSh

pertenece a las sulfatasas, las cuales son un grupo de enzimas que catalizan reacciones

de hidrólisis de esteres de sulfato de una amplia variedad de sustancias, desde moléculas

complejas como glicosaminoglicanos, glicoproteínas y glucolípidos hasta esteroides

sulfatados (103). Se considera que los genes de esta familia de enzimas, evolutivamente

están altamente conservados desde procariotes hasta humanos (103-106). Está bien

establecido que proteínas homólogas han evolucionado de un ancestro común que

conservan su función a través de la escala biológica y adoptan una estructura

tridimensional similar. Estas proteínas corrientemente tienen secuencias similares en

121

cerca del 20%, mientras que proteínas análogas llegan a tener alrededor del 10% de

similaridad (138). Dado que las secuencias similares decrecen tanto en proteínas

homólogas distantes como en análogas, el reconocimiento de homologías y analogías

es importante para una aproximación a la estructura tridimensional. Los alineamientos

de la IDSh con las ARSA y ARSB humanas, las dos únicas sulfatasas con estructura

tridimensional establecida mediante cristalografía (104, 172), mostraron similaridades

del 24 y 26% (Figuras 21 y 22), es decir, valores dentro de los rangos establecidos para

considerar una predicción con una alta probabilidad de ocurrencia (138).

El dogma central que motiva la predicción computacional señala que “la estructura

tridimensional de una proteína es determinada por su secuencia independientemente de

los factores extrínsecos” (138). Sin embargo, algunos autores consideran que debe

tenerse en cuenta el papel de los factores ambientales. Aunque es conocido que

moléculas chaperonas e intercambiadores de puentes disulfuro participan de

mecanismos de plegamiento, evidencias experimentales demuestran que estas moléculas

solamente asisten y no determinan el estado nativo final. Lo anterior permitió abordar

desde esa óptica los algoritmos estadísticos y neurales de los programas

computacionales de predicción de estructura proteica de la IDSh a nivel secundario y

terciario. En este orden de ideas, la predicción de las estructuras secundaria y terciaria,

constituyen modelos computacionales de la estructura de la enzima, inexistente hasta

ahora.

El perfil de antigenicidad (Figura 34), muestra regiones potencialmente antigénicas y

sugiere que el diseño de péptidos a emplear para la producción de anticuerpos deben

encontrarse en estas regiones. La figura 35 presenta la ubicación de los péptidos

diseñados para la producción de IgY anti-IDSh y su nivel de accesibilidad dado por

su grado de exposición. El anticuerpo generado por el péptido 2, el de mayor exposición

fue el de mayor titulo, seguido por los anticuerpos producidos como respuesta a los

péptidos 3 y 1, mientras que el último presentó el menor nivel de reconocimiento

antigénico porque su secuencia se encuentra en la última zona de la molécula que

corresponde al fragmento de 18 KDa que se elimina durante el procesamiento de la

enzima.

122

Un análisis teórico y computacional de la comparación de estructura y función de otras

sulfatasas (103-106, 172), permitió proponer un modelo para el sitio activo de la IDSh.

El hallazgo en dos pacientes, de niveles normales de sulfatasas que no presentaban

actividad catalítica, orientó los estudios para localización y mecanismo catalítico de este

grupo de enzimas (106). La enfermedad sufrida por estos pacientes es originada por un

error innato del metabolismo y se conoce como deficiencia multiple de sulfatasas. Se

ha postulado que la maquinaria bioquímica responsable de esta oxidación, reconoce una

secuencia altamente conservada en las sulfatasas, desde procariotes hasta humanos que

constituyen el motivo reconocido para la modificación postranslacional mencionada.

En la IDSh el residuo de cisteína que sufre la oxidación hasta formilglicina corresponde

a la cisteína en posición 84. Por homología con las ARSA y ARSB (Tabla 18), se

ubicaron los residuos conservados que componen el sitio activo en el modelo de

estructura terciaria y se propone un modelo de organización del sitio catalítico para la

IDSh (Figura 30). El modelo de sitio activo, incluye la propuesta de un átomo de

manganeso como el catión divalente necesario para la actividad catalítica de la IDSh,

puesto que la presencia del catión incrementa los niveles de actividad de la enzima

(114). Su posible localización dentro del centro activo se muestra en la figura 33.

El modelo de estructura terciaria fue comparado mediante el RMS con las estructuras

experimentales de las ARSA y ARSB, encontrándose diferencias no significativas

(menores de 1.0 Å), lo que sugiere que la estructura propuesta constituye un modelo

con un alto porcentaje de posibilidad de presentarse en la naturaleza, dado que se

considera que un modelo altamente comparativo presenta RMS ≤ 2.0 (135).

La expresión de proteínas humanas heterólogas en levaduras es favorecida cuando se

utilizan péptidos señales de otras levaduras, esto contribuye al correcto procesamiento

de la proteína, la interacción con las proteínas auxiliares del retículo endoplásmico para

la formación de puentes disulfuro, el plegamiento y transporte por la vía de secreción

(174), además que la recuperación de la molécula del medio de cultivo representa un

primer paso en el proceso de purificación (92). La señal de secreción empleada con

mayor frecuencia es el péptido α-Factor (α-MF) de S. cerevisiae (94). En el caso de P.

123

pastoris varias proteínas recombinantes han sido secretadas eficientemente, utilizando el

péptido señal nativo y han mostrado rendimientos dos o tres veces superiores cuando

utilizan un péptido señal de levadura como el α-MF (92). Aunque la secuencia líder α-

MF es propia de S. cerevisiae, es reconocida por la maquinaria bioquímica de P.

pastoris, lo que indica que las diferencias en el mecanismo de secreción de proteínas en

estas dos levaduras son mínimas. Incluso los niveles de proteína expresada con el α-MF

han sido superiores al compararse con los obtenidos utilizando el péptido señal de la

fosfatasa ácida (PHO1), enzima nativa de P. pastoris (180,181). Del cDNA que se

inserta en el plásmido es eliminada la secuencia señal nativa, lo que significa que el

constructo de expresión codifica solamente la secuencia madura de la proteína de

interés. La presencia del péptido señal y el α-MF ha tenido efecto sobre el

procesamiento de la proteína y consecuentemente pérdida de la actividad enzimática

(182). Existe un mecanismo de control de calidad del plegamiento de las glicoproteínas

a nivel del retículo endoplásmico (126), mediante el cual las que no presentan un

plegamiento correcto son retenidas y luego trasladadas al citoplasma y degradadas en

los proteosomas (127). Esto significa que una fracción de las proteínas destinadas a la

secreción es retenida y degradada y el procesamiento en Golgi y posterior secreción se

restringe a las proteínas plegadas correctamente o aquellas que escapan al mecanismo

de control, por saturación del mismo o por un mecanismo aun no conocido.

La presencia de la secuencia señal nativa puede estar afectando los niveles de expresión

de la IDShr y esto podría dar explicación al porque de las bajas concentraciones de

IDShr activa en la mayoría de las 20 fermentaciones realizadas. Evidentemente la

conformación de la IDShr expresada en los modelos biológicos empleados en este

trabajo está afectada por las alteraciones conformacionales que sufre la proteína al

mantener una región adicional altamente hidrofóbica que, sin duda, genera cambios en

la conformación tridimensional, que se traducen en una proteína mal plegada,

posiblemente retenida y luego degradada intracelularmente (126). Puesto que se asume

que el modelo esta diseñado para secretar la proteína heteróloga, se trabajó

fundamentalmente con los sobrenadantes. Para explorar la posibilidad surgida de

permanencia de proteína mal plegada al interior del retículo endoplásmico, complejo de

Golgi o aun que haya podido ser enviada a los lisosomas, se procedió a la ruptura de

124

células P. pastoris del cultivo M-13' y los niveles de actividad de hasta 4.24 nmol/h/mg

de proteína, sugieren que cerca del 50% de la enzima no es secretada. Más

recientemente, se detectó por Western blot (figura 42), la presencia de IDShr en lisados

celulares del cultivo M-22 de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/10 (Sosa A y Barrera LA,

comunicación personal).

La secuencia completa del α-MF consta de 85 aminoácidos, los primeros 19 residuos

corresponden al péptido señal y los siguientes 66 a la región denominada prosecuencia.

En condiciones normales a nivel del retículo endoplásmico la peptidasa señal hidroliza

en el caso de la IDSh en células humanas los primeros 25 residuos y se conservan los

ocho de la prosecuencia que contribuyen al progreso del glicopéptido a través del

retículo y del complejo de Golgi. En el caso del α-MF, los primeros 19 aminoácidos y

se conservan los restantes que son fundamentales para el transporte hasta las vesículas

de secreción en donde Kex2 hidroliza esta secuencia (174).

El análisis de la información obtenida presenta las siguientes posibilidades:

1. La peptidasa señal I (E.C. 3.4.21.89) encargada del reconocimiento del α-MF,

equívocamente reconoce el péptido señal de la IDShr y al hidrolizarlo, se pierde el

pro-péptido del α-MF. El alineamiento de los péptidos líder de la IDSh y del α-MF

no mostraron identidades significativas, lo cual disminuye la potencialidad del

evento. En este caso la enzima no sería secretada por la falta de la ayuda del α-MF

y sería probable que la proteína siga su direccionamiento hasta el lisosoma. Los

resultados del experimento de ruptura química de células de P. pastoris del cultivo

M-13' y los encontrados en M-22 (Figura 42), sugieren que parte de la enzima

permanece intracelularmente. El paso siguiente es localizarla y cuantificarla.

Igualmente, estos resultados sugieren que los niveles de actividad observados en los

sobrenadantes pueden constituir únicamente el 50% del total expresado en este

sistema.

2. La peptidasa señal I hidroliza correctamente el α-MF y la enzima pasa por el

retículo endoplásmico y llega a Golgi. Una vez allí, la endoproteasa Kex2

(3.4.21.61) de P. pastoris reconoce equívocamente la pro-secuencia nativa de la

125

IDShr, lo que traería consigo la secreción correcta de la proteína recombinante. Este

fenómeno químico tiene poca posibilidad de ocurrencia puesto que en el análisis de

la secuencia del pro-peptido de la IDSh, no se encontraron secuencias K-R ni R-R,

que son los motivos para el corte proteolítico de Kex2.

3. La peptidasa señal I hidroliza el α-MF y una vez dentro del retículo endoplásmico el

plegamiento incorrecto de la IDShr no le permite ser guiada a Golgi y por tanto

podría ser degradada a nivel de los proteosomas.

4. El reconocimiento de Kex2 es adecuado sobre la pro-secuencia de α-MF. En este

caso se podría secretar una proteína recombinate con un plegamiento inadecuado

como consecuencia de una región hidrofóbica de 25 residuos y una región

hidrofílica de 8 aminoácidos (pro-secuencia) correspondiente al péptido líder nativo

de la IDSh. Por consiguiente tendríamos una proteína probablemente inactiva.

Se procedió a elaborar el modelo computacional de la estructura terciaria de la IDSh

adicionándole el péptido señal y los ocho residuos del propéptido (Figura 36), donde se

observa claramente que los mencionados 33 residuos afectan la estructura de la enzima,

pues parte de esta secuencia se encuentra cubriendo la entrada al bolsillo de la proteína

recombinante y la restante hélice se dobla buscando acomodarse dentro de un espacio

existente en la molécula, lo cual evidentemente debe alterar la conformación de la

estructura terciaria de la enzima. Es bien claro que el bloqueo de la entrada al sitio

activo constituye un impedimento para la formación del complejo enzima sustrato. Otro

aspecto importante a considerar es la ganancia en flexibilidad de la molécula con los 33

residuos adicionales (Figura 41), lo que permite pensar en la posibilidad de

desplazamientos parciales de toda o parte de esta región como producto de interacción

con el sustrato, los cuales permitirían la unión del sustrato al sitio activo. Esto estaría

explicando porque aun con una proteína sin la conformación natural, se han encontrado

niveles de actividad.

De otro lado, cabe la posibilidad de pensar en asociaciones de tipo hidrofóbico entre los

25 aminoácidos del péptido señal de distintas moléculas IDShr, que se asociarían

rehuyendo la fase hidrofílica. Estas interacciones como fuerzas de Van der Waals

126

mantendrían unidas dos o más moléculas y nos permitiría explicar la constante

presencia de actividad IDShr en fracciones de peso molecular mayor de 100 KDa

(Tabla 9). Asociaciones como estas podrían explicar en gran medida la presencia de

una bandas de 120 KDa detectadas por Western blot en E. coli (Figura 8) y en lisados

de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/10. Así mismo esto podría dar explicación a la

presencia de varias bandas de mayor peso detectadas en los sobrenadantes con relación

a los lisados en cultivos de E. coli (Figura 4) y las de alto peso molecular detectadas en

sobrenadante de cultivo de P. pastoris GS115 pPIC9-IDS/28 (Figura 5). La presencia de

bandas de bajo peso molecular, sería responsabilidad de la actividad de proteasas

(175,176).

Con relación a la variabilidad fenotípica de la enfermedad de Hunter, es claro que la

misma es reflejo de la heterogeneidad mutacional de la IDSh. Sin embargo, los niveles

de actividad enzimática no se correlacionan con la variabilidad fenotípica, puesto que

las pruebas de detección no tienen poder de discrimación (33,34). En estos ensayos

resultan limitantes las bajas concentraciones de sustrato y las condiciones in vitro que

pretenden simular las condiciones del microambiente lisosomal. Está bien establecido

que no son capaces de detectar actividades residuales en el caso de pacientes con

presentación moderada de la enfermedad (29,33,37). Además, existen otros factores que

hacen que dos pacientes tengan los mismos niveles de actividad enzimática y la misma

mutación, pero fenotipos diferentes. En consecuencia no existe un índice patrón para el

diagnóstico de la severidad de la enfermedad y la diferenciación en formas severa,

intermedia y moderada en la mayoría de los casos conlleva un gran componente de

subjetividad. Generalmente se asocia a la forma severa el retardo mental y el grado de

expresión de los otros síntomas y los pacientes diagnósticados con la forma moderada

no presentan compromiso del SNC y sintomatología menos marcada que en la

presentación severa. Por consiguiente, la forma intermedia abre un rango de

posibilidades fácilmente influenciados por el evaluador. Sin duda, el diagnóstico de la

forma intermedia no resulta fácil de realizar y es aun más compleja la apreciación en

pacientes jóvenes. Desde hace bastante tiempo se ha hecho evidente la necesidad de

uniformizar los criterios de evaluación para el diagnóstico de la enfermedad y en esa

búsqueda de soluciones autores como Bunge en 1993 (29), propusieron criterios para

127

establecer los tres tipos de presentación de la enfermedad. Karsten en 1998 (21),

propuso la evaluación de 32 características para diferenciales en el diagnóstico y aun

así, 9 de 32 pacientes estudiados quedaron sin ubicación en uno de los tres grupos.

Varios autores para sus reportes consideran la clasificación de Neufeld en 1995 (1), la

cual considera como característica diferencial el retardo mental para la forma severa y

alguna dificultad de aprendizaje para la forma intermedia. Producto de todo lo anterior,

la literatura sobre este aspecto del síndrome de Hunter deja la posibilidad abierta a

clasificaciones diferentes para la misma mutación. Ya existen casos como L41P y

C184F que se reportan como severas y moderadas (24,33) o no llegan claramente

definidas como el reporte de H138D (33) en donde señalan que la mutación es de

moderada a intermedia., y es factible que a futuro se sigan develando mas de estas

situaciones. Dos ejemplos de la literatura demuestran claramente las discrepancias en

el fenotipo clínico. En una familia tres de los hijos que tienen la mutación R468L, que

corresponde a una zona caliente para las mutaciones y en donde las mismas

corresponden a presentaciones severas, padecen el síndrome de Hunter en su forma

moderada. El menor de ellos tiene 34 años y es PhD en economía, el otro paciente

cursa con una forma leve y tiene un IQ > 75 (31). El establecer criterios uniformes para

el diagnóstico es fundamental para el establecimiento de terapéuticas. En este trabajo se

buscó encontrar una relación genotipo-fenotipo y para ello se consideraron varios

aspectos como localización de la mutación por exón, grado de exposición en la

estructura terciaria, zonas conservadas y no conservadas en las sulfatasas, carga y

estructura de los aminoácidos implicados en la mutación y distancia de la misma a la

cisteína 84 como punto referencial al sitio activo. En el primer intento de análisis

considerando las tres presentaciones de la enfermedad, no se observó ninguna

tendencia. Par un análisis posterior, considerando lo anteriormente señalado para la

clasificación de severidad en tres tipos y asumiendo como criterio diferencial el

compromiso del SNC se adoptaron solo dos tipos de severidad, es decir, moderado y

severo. Algunos autores (27), han considerado que mutaciones en zonas evolutivamente

conservadas en las sulfatasas siempre expresan fenotipo severo y las presentes en

zonas no conservadas corresponden a presentaciones moderadas. Si bien se cumple para

varios casos no es válido para otros. Mutaciones en zonas conservadas como S491F,

E341K y G336, son de presentación severa y H342Y y D334N resultan clínicamente

128

moderadas. Igualmente mutaciones en regiones únicas en la IDSh como Y108S y

N265I son clínicamente moderadas, en tanto que otras G224E, C432Y y K347 son

fenotípicamente severas (28,31,33). A diferencia de lo encontrado en el análisis

computacional de la GALANS (183), la distancia como único factor no mostró una

relación clara entre cercanía al sitio activo y severidad. Tampoco se pudo establecer una

única relación entre severidad y tamaño del aminoácido o naturaleza química por grupo

(hidrofóbicos, polares no cargados, polares cargados). Considerando aminoácido por

aminoácido, carga, tamaño y distancia a la cisteína 84 permitió proponer algunos

criterios para establecer la correlación genotipo-severidad (Tabla 19). Las nuevas

interacciones locales por cambios electrostáticos y de estructura generados por los

cambios de residuos cargados o aromáticos generalmente resultan en variaciones

drásticas en la estructura de la proteína mutada, causando que la misma pierda o vea

disminuida su capacidad catalítica, lo que explicaría los fenotipos severos. En el caso de

las presentaciones clínicas moderadas, las proteínas mutadas no deben sufrir cambios

muy drásticos, por ejemplo, cambio de un aminoácido hidrofóbico por otro de la misma

naturaleza. La distancia a la cisteína 84, como referencia del centro activo, puede

aminorar los cambios locales, de tal manera que el efecto sobre la funcionalidad de la

enzima puede afectarse de forma mínima. Independientemente del tipo de residuo que

se mute y sea mutado, las mutaciones presentes en zonas cercanas al sitio activo

siempre resultan en fenotipos severos. En el caso de la prolina, un residuo de tipo

hidrofóbico y aromático, cualquier residuo mutado por éste se traduce en un cuadro

clínico severo. Este tipo de cambio severo ya ha sido observado con frecuencia en otras

proteínas (184-188).

Con el propósito establecer el efecto de las mutaciones sobre la conformación

tridimensional de la IDSh se compararon 50 de las estructuras mutadas con la normal

calculando el RMS, para todos los casos las diferencia encontradas no fueron

significativas, lo que sugiere que los cambios de estructura causados por las mutaciones

no pueden ser evidenciados por esta metodología y se requiere buscar otros

procedimientos más sensibles para tal fin.

129

Si bien, en este momento los esfuerzos investigativos del IEIM (2,102,115-

120,144,183), en gran medida están dirigidos a la búsqueda de alternativas terapéuticas

para la MPS II y otras mucopolisacaridosis, tanto el sistema de expresión de proteínas

humanas recombinantes para uso terapéutico, como los trabajos en la línea de

investigación en TRE constituyen modelos en desarrollo, los cuales al consolidarse van

a permitir no solo ofrecer una terapéutica para la enfermedad de Hunter, sino también

abordar, bajo esos esquemas implementados, otras enfermedades. Es muy factible que

puedan ser estudiadas muchas de las 50 enfermedades de depósito lisosomal. De igual

manera el tipo de estudio computacional que se ha llevado a cabo, constituirá una parte

integral de ese gran modelo de estudio para esas enfermedades potenciales de investigar

en la búsqueda de alternativas terapéuticas para ellas.

130

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

1. Se comprobó inequívocamente que es activa la IDShr expresada en P. pastoris y

E. coli, mediante el uso de una prueba fluorométrica adaptada para detectar la

actividad catalítica de la IDShr en estos modelos biológicos.

2. Con el propósito de mejorar el sistema de purificación de la IDShr se produjo un

anticuerpo policlonal anti-IDShr.

3. Con el fin de mejorar el sistema de purificación se implementó una metodología

que reduce de siete a tres fases, que es lo corriente para separar IDS.

4. La enzima recombinante presentó niveles de actividad de hasta 4 y 9 veces los

presentes en plasma y leucocitos humanos, sin embargo esto no es lo óptimo

para obtener cantidades clínicamente útiles. Lo que significa que deben

mejorarse los sistemas de expresión y purificación.

5. Con el propósito de mejorar el sistema de expresión se clonó el cDNA de la

IDSh en el plásmido pGEX 3X y se expresó la IDShr en E. coli JM109 con el

empleo del sistema GST.

6. Se propone un modelo computacional de estructura tridimensional de la IDSh

que presenta 33.3% en hélice, 7.2% en hoja plegada y 59.5% en coil.

7. El modelo computacional de la IDSh presenta expuestos los cinco sitios

potenciales de N-glicosilación, zonas de alta antigenicidad, una entrada al

bolsillo que contiene los aminoácidos que componen el sitio activo y en el cual

encaja el sustrato heparán sulfato. Cuando se comparó con las ARSA y ARSBA

se obtuvieron valores de RMS de 0.78 y 0.86 Å, respectivamente.

8. El modelo computacional permitió: el diseño de péptidos específicos para la

producción de anticuerpos IgY anti-IDShr; explicar los bajos niveles de

actividad de la IDShr en el sistema que se emplea actualmente; la presencia de

bandas de diferente tamaño en los sobrenadantes de P. pastoris y E. coli, la

actividad en fracciones procedentes de ultrafiltración con peso menor a 30 KDa

y contribuir a establecer una relación genotipo/severidad de la enfermedad de

Hunter.

131

En cuanto a las recomendaciones se sugiere:

1. Realizar estudios de inmunomicroscopía electrónica para monitorear la localización

intracelular de la proteína humana recombinate.

2. Adelantar estudios conducentes a la mejorar el sistema de expresión, para lo cual se

recomienda extraer el DNAc de IDSh a partir del plásmido pUC13-IDS a través de

un corte doble, combinando alguna de las enzimas Bse 118I, BsrFI, BssAI, Crf 1OI,

CpoI, CspI, Rsr 2I, Rsr II con EcoRI. Con lo cual se obtendrá el cDNA maduro de la

IDSh sin el péptido señal nativo. Clonar el fragmento aislado en los plásmidos

pPIC9 y/o pHIL-S1 con miras a su expresión en P. pastoris. Estos plásmidos portan

las señales de secreción del α-factor (S. cerevisiae) y PHO1 (P. pastoris),

respectivamente y realizar un estudio comparativo de la expresión en IDShr en P.

pastoris con las nuevas construcciones genéticas.

3. Continuar con los estudios de expresión de la IDShr en E. coli con el sistema GST

4. Realizar estudios para mejorar las condiciones de fermentación. Entre estas el pH,

con el propósito de disminuir la actividad proteolítica.

5. Incrementar la productividad del sistema para obtener cantidades suficientes de

IDShr y realizar su cristalización, lo cual permitirá comprobar experimentalmente la

validez de los modelos computacionales.

132

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