1. Aislamiento y purificacin
Objetivos:

Aislar, concentrar y estabilizar el producto. 2. Remover las impurezas (protenas, cidos nuclicos, etc.).

Qu es aislar o extraer la protena y qu es purificar la protena?
Para qu lo vamos a hacer?
Cmo lo vamos a hacer?
3. Aislamiento:
Obtencin de extracto(s) u homogenado.
Purificacin:
Obtencin de una protena de inters.
Y En base a qu vamos a plantear el esquema para aislar y purificar nuestra protena?
4. Criterios para la extraccin y el aislamiento:
Solubilidad.
Tamao.
Carga .
Especificidad.
Fuente.
Concentracin de protena en la fuente.
5. Problemas.
Desarrollo y optimizacin(Ganar tiempo e implentarprocedimientos ms baratos).
Minimizar la manipulacin disminuyendo el nmero de pasos(evitar perdida de la estructura y de la actividad).
6. Extraccin
Ruptura mecnica o fractura celular
(mtodos fisicos).
+
Ruptura celular o lisis celular: Mtodos fsicos(presion osmtica) o qumicos
(lisis enzimtica)
+
-----------------------------------------------------------
= Extracto crudo.
7. Precauciones en la extraccin.
Cambios de pH.
Temperatura.
Oxidacin de S-S.
Proteasas.
(Reducir interacciones no ideales)
8. Fraccionamiento, clarificacin y/o separacin.
Mtodos de separacin y clarificacin:
Filtracin: separacin por tamao(gasa o papel filtro).
Centrifugacin diferencial: separacin de componentes o constituyentes celulares basados en tamao y densidad.
9. Esquema general de la centrifugacin diferencial.
10. Separacin
Qu vamos a separar?
Para qu vamos a separarlo?
En que nos vamos a basar para separarlo?
Cmo vamos a separarlo?
11. Extracto crudo:
Mezcla compleja de componentes celulares; el tipo de componentes en la mezcla depende de la fuente celular y el tratamiento que le demos al extracto (por ejemplo centrifugacin diferencial).
12. Criterios para proponer el esquema de purificacin.
Metodologas preestablecidas
+
Sentido comn??
(precio, disponibilidad de la fuente, estabilidad de la proteina, objetivo de la purificacin, )
13. como separar las protenas?...
(Definir propiedades tiles para este propsito)
Carga, tamao, solubilidad, y afinidad.
14. Precipitacin por salado
Debido a la competencia por las molculas de agua de la capa de solvatacin de la protena, estas llegan a precipitar
Por efecto de la concentracin de sal es igual o semejante la fuerza inica donde incrementa o disminuye la solubilidad de las protenas. Competencia por las molculas de agua que forman parte de la capa de solvatacin.
Las protenas precipitadas se pueden removerrpidamente con pasos de centrifugacin segn sea el caso (protenas contaminantes o protena de inters).
15. Precipitacin por salado
Ventajas:
mtodo reversible.
Simple.
Efectivo.
Barato.
No tiene efectos adversos sobre la actividad de la enzima y tampoco desnaturaliza la estructura.
Elimina gran parte de protenas no especficas.
16. La concentracin de sal a la cual hay precipitacin es caracterstica de cada proteina o grupo de protenas.
Qu cantidad de (NH4)2SO4 es necesaria pa preparar una solucin saturada?(4.1M)
Para equilibrio completo hay que agitar 1 hora y despues centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min y se obtiene un pellet.
V especfico del sulfato de amonio es 0.54mL/g
Cul es la concentracion del sulfato de amonio cuando esta 100%?
17. Seguimos con la separacin

Los mtodos cromatogrficos, nos ayudaran a separar la mezcla de protenas que obtenemos despus de la precipitacin por salado. 18. Los mtodos cromatogrficos varan segn el estado de la protena, el volumen de la muestra y como siempre de las propiedades fisicoqumicas de la protena de inters. 19. Cromatografa en columna.

Cromatografa en columna
20. Desalado
El desalado de la muestra ayuda a tener nuestra protena en condiciones ptimas para realizar los estudios posteriores as como para tenerla en solucion.
Nosotros, procedemos con una cromatografa de exclusin molecular tambin conocida como filtracin en gel o tamiz molecular (tambin podra usarse dilisis pero el procedimiento lleva mucho mas tiempo).
21. Filtracin en gel.
Este mtodo separa las protenas de acuerdo a su tamao.
La columna de sephadex contiene dextranos con enlaces entre cruzados que genera un tamao de poro determinado.
Vamos a utilizar este mtodo para desalary cambiar el bfer de las protenas que precipitamos con el sulfato de amonio.
22. Esquema de la filtracin en gel.
23. Mas cromatografa
En el proceso de purificacin son de gran utilidad las cromatografas de intercambio inico y de afinidad ya que nos permiten separar mezclas de protenas con respecto a su carga(que depende de la composicin particular de a.a.) y sus propiedades de unin a ligantes especficos respectivamente.
24. Cromatografa de intercambio inico.
25. Cromatografa de intercambio inico
Las protenas se unen o no a la matriz, segn la carga de ambas.
Protenas que se unen mas fuertemente a la matriz son las de mayor carga neta y opuesta a la carga de la matriz.
En la elucin salen primer los compuestos que tienen menor afinidad por la columna (misma carga de la matriz).
Para eluir las protenas unidas a la matriz, se provoca un cambio en las condiciones del medio (generalmente se incrementa gradualmente la fuerza inoca con un gradiente de menor a mayor concentracion de sal (NaCl usalmente) o tambien se puede cambiar el pH
26. Centrfuga.
Manejo de centrfugas: Martes 3 de agosto 11-13h con el ingeniero Ral Martnez Dehesa curso de centrfugas.
27. Cromatografa de afinidad.
28. Mtodos de deteccin y cuantificacin.