Aislamiento y purificación

Objetivos:

•Aislar, concentrar y estabilizar el producto.

• Remover las impurezas (proteínas, ácidos nucléicos, etc.).

¿Qué es aislar o extraer la proteína y qué es purificar la proteína?

¿Para qué lo vamos a hacer?

¿Cómo lo vamos a hacer?

Aislamiento:Obtención de extracto(s) u homogenado.

Purificación:Obtención de una proteína de interés.

…Y ¿En base a qué vamos a plantear el esquema para aislar y purificar nuestra proteína?

Criterios para la extracción y el aislamiento:

Solubilidad.Tamaño.Carga .

Especificidad.Fuente.

Concentración de proteína en la fuente.

Problemas.

Desarrollo y optimización(Ganar tiempo e implentar procedimientos más baratos).

Minimizar la manipulación disminuyendo el número de pasos(evitar perdida de la estructura y de la actividad).

Extracción…Ruptura mecánica o fractura celular

(métodos fisicos).+

Ruptura celular o lisis celular: Métodos físicos(presion osmótica) o químicos

(lisis enzimática)+-----------------------------------------------------------= Extracto crudo.

Precauciones en la extracción.Cambios de pH. Temperatura.

Oxidación de S-S. Proteasas.

(Reducir interacciones no ideales)

Fraccionamiento, clarificación y/o separación.Métodos de separación y clarificación:

Filtración: separación por tamaño(gasa o papel filtro).

Centrifugación diferencial: separación de componentes o constituyentes celulares basados en tamaño y densidad.

Esquema general de la centrifugación diferencial.

Separación…

¿Qué vamos a separar?

¿Para qué vamos a separarlo?

¿En que nos vamos a basar para separarlo?

¿Cómo vamos a separarlo?

Extracto crudo:

Mezcla compleja de componentes celulares; el tipo de componentes en la mezcla depende de la fuente celular y el tratamiento que le demos al extracto (por ejemplo centrifugación diferencial).

Criterios para proponer el esquema de purificación.

Metodologías preestablecidas

+

¿¿Sentido común?? (precio, disponibilidad de la fuente, estabilidad

de la proteina, objetivo de la purificación, …)

…como separar las proteínas?...

(Definir propiedades útiles para este propósito)

Carga, tamaño, solubilidad, y afinidad.

Precipitación por saladoDebido a la competencia por las moléculas de

agua de la capa de solvatación de la proteína, estas llegan a precipitar

Por efecto de la concentración de sal es igual o semejante la fuerza iónica donde incrementa o disminuye la solubilidad de las proteínas. Competencia por las moléculas de agua que forman parte de la capa de solvatación.

Las proteínas precipitadas se pueden remover rápidamente con pasos de centrifugación según sea el caso (proteínas contaminantes o proteína de interés).

Precipitación por salado Ventajas: método reversible. Simple.Efectivo.Barato. No tiene efectos adversos sobre la actividad

de la enzima y tampoco desnaturaliza la estructura.

Elimina gran parte de proteínas no específicas.

La concentración de sal a la cual hay precipitación es característica de cada proteina o grupo de proteínas.

¿Qué cantidad de (NH4)2SO4 es necesaria pa preparar una solución saturada?(4.1M)

Para equilibrio completo hay que agitar 1 hora y despues centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min y se obtiene un pellet.

V específico del sulfato de amonio es 0.54mL/g

¿Cuál es la concentracion del sulfato de amonio cuando esta 100%?

Seguimos con la separación…• Los métodos cromatográficos, nos ayudaran a

separar la mezcla de proteínas que obtenemos después de la precipitación por salado.

• Los métodos cromatográficos varían según el estado de la proteína, el volumen de la muestra y como siempre de las propiedades fisicoquímicas de la proteína de interés.

• Cromatografía en columna.

Cromatografía en columna

Desalado…El desalado de la muestra ayuda a tener

nuestra proteína en condiciones óptimas para realizar los estudios posteriores así como para tenerla en solucion.

Nosotros, procedemos con una cromatografía de exclusión molecular también conocida como filtración en gel o tamiz molecular (también podría usarse diálisis pero el procedimiento lleva mucho mas tiempo).

Filtración en gel.Este método separa las proteínas de acuerdo

a su tamaño.

La columna de sephadex contiene dextranos con enlaces entre cruzados que genera un tamaño de poro determinado.

Vamos a utilizar este método para desalar y cambiar el búfer de las proteínas que precipitamos con el sulfato de amonio.

Esquema de la filtración en gel.

Mas cromatografía…En el proceso de purificación son de gran utilidad las cromatografías de intercambio iónico y de afinidad ya que nos permiten separar mezclas de proteínas con respecto a su carga(que depende de la composición particular de a.a.) y sus propiedades de unión a ligantes específicos respectivamente.

Cromatografía de intercambio iónico.

Cromatografía de intercambio iónicoLas proteínas se unen o no a la matriz, según la

carga de ambas.Proteínas que se unen mas fuertemente a la matriz

son las de mayor carga neta y opuesta a la carga de la matriz.

En la elución salen primer los compuestos que tienen menor afinidad por la columna (misma carga de la matriz).

Para eluir las proteínas unidas a la matriz, se provoca un cambio en las condiciones del medio (generalmente se incrementa gradualmente la fuerza iónoca con un gradiente de menor a mayor concentracion de sal (NaCl usalmente) o tambien se puede cambiar el pH

Centrífuga.

Manejo de centrífugas: Martes 3 de agosto 11-13h con el ingeniero Raúl Martínez Dehesa curso de centrífugas.

Cromatografía de afinidad.

Métodos de detección y cuantificación.