Espectroscopia uv visible, validacion

Espectroscopía

UV-Visible

1

2013

Bouguer, Lambert y Beer.

La ley fotométrica fue planteada

independientemente (y de distintas maneras)

por Bouguer en 1729, Lambert en 1760 y Beer

en 1852.

Lambert interesado en la representación de la

profundidad en la pintura y en la transparencia

del aire, propuso en 1760 la ley fotométrica

finalmente llamada Ley de Lambert-Beer, que

relaciona la absorción de luz con las

propiedades del material atravesado.

2

Johann Heinrich

Lambert (1728 - 1777),

matemático, físico,

astrónomo y

filósofo alemán.

ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA Y VISIBLE

TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA

T = P / P0 A = - log T = log (P0 / P)

LEY DE LAMBERT Y BEER. ABSORTIVIDAD

A = k.b.c

Absortividad (a):

Absorbancia de una solución de 1 gramo por litro, en celda de 1 cm de paso óptico.

a = A / cb Unidades: L g-1cm-1.

Coeficiente de extinción específica [E (1 %, 1 cm)]:

Absorbancia de una solución de 1 % (1g/100 mL), en celda de 1 cm paso óptico.

E (1 %, 1 cm) = A / cb = 10 a Unidades: g%-1 cm-1.

Absortividad molar (ε):

Absorbancia de una solución de 1 mol por litro, en celda de 1 cm paso óptico.

= a PM Unidades: M-1 cm-1.

3

PoP

Los valores de a, E (1 %, 1 cm) y ε, a una longitud de onda específica y en un

solvente determinado, son característicos del analito.

CALIBRACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO

1.El nivel 0 % de transmitancia con el obturador del instrumento cerrado

2. El nivel del instrumento al 100 % de transmitancia (cero de absorbancia)-BLANCO

4

Simple

haz

Doble

haz

LIMITACIONES A LA APLICABILIDAD DE LA LEY DE LAMBERT Y BEER

Son las desviaciones de la linealidad entre absorbancia y concentración cuando el

paso óptico (b) es constante.

Desviaciones reales

A concentraciones 0,01 M o menores, el índice de refracción es esencialmente constante.

5

Son producidas por:

a) Concentraciones elevadas del analito (>0,01M). (Produce alteración de la

distribución de cargas entre las moléculas cercanas).

b) Concentraciones elevadas de electrolitos.

c) Los cambios en el índice de refracción del sistema analítico, pues como a depende

del índice de refracción de la muestra:

𝑎 = 𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑛

(𝑛2+2)2

Desviaciones instrumentales

a) Radiación policromática

• La deducción de la ley de Lambert-Beer supone radiación monocromática

• Los monocromadores en realidad proporcionan una banda de longitudes de onda.

Cuando a' = a''..., esta ecuación se simplifica a A = a'bc y se cumple la ley de Beer.

6

𝐴 = 𝑙𝑜𝑔𝑃0λ´ + 𝑃0λ´´ + ⋯

𝑃0λ ´. 10−𝑎´𝑏𝑐 + 𝑃0λ´´ . 10−𝑎´´𝑏𝑐 + ⋯

b) Radiación espúrea

Son reflexiones procedentes de componentes ópticos y del monocromador.

Llegan al detector debido a la dispersión por partículas de polvo y a las reflexiones en las

superficies interiores, pudiendo no haber atravesado la muestra.

Posen longitudes de onda que son muy diferentes de las de la banda de luz principal

utilizada.

Ps es la potencia de la radiación espúrea no

absorbida.

7

Desviaciones químicas

Causadas por equilibrios en solución que involucran a la especie

absorbente y alteran su concentración.

Originan desviaciones positivas o negativas, dan lugar a un

producto con un espectro de absorción diferente al del analito.

Ejemplos:

reacciones de asociación-disociación

reacciones ácido-base

polimerización

formación de complejos

reacciones con el solvente.

8

APLICACIONES

ANÁLISIS CUALITATIVO

• Se realiza barrido espectral (espectro de absorción).

• Se compara el espectro obtenido de la muestra que contiene el analitoabsorbente y el espectro de un estándar de dicho analito.

• Requiere proceso de aislamiento y/o purificación de los analitos absorbentescontenidas en la muestra.

El análisis del espectro UV-Visible no se utiliza como criterio único de identificación,sino como análisis complementario.

ANÁLISIS CUANTITATIVO

Amplia aplicabilidad tanto a sistemas orgánicos como inorgánicos

Sensibilidades de hasta 10-7 M

De moderada a alta selectividad

Buena precisión

Fácil adquisición de datos9

Procedimientos para el Análisis Espectrofotométrico

1. Selección de la longitud de onda

2. Determinación de la relación entre absorbancia y concentración

a) Método sin la adición de estándar

b) Método con la adición de estándar:

útil para contrarrestar los efectos de matriz de la muestra.

A1 = b Vx Cx

Vt

A2 = b Vx Cx + b Vs Cs

Vt Vt

Donde A1 y A2 son las absorbancias de la muestra diluída y de la muestra diluída

más estándar

10

Algunas utilidades de la espectrofotometría:

DETERMINACIÓN DE ELEMENTOS POR MEDIO DE AGENTES

COMPLEJANTES

Los complejos de ciertos elementos presentan en muchos casos ≥ 104 M-1cm-1 y

absorben fuertemente en el visible.

Los altos coeficientes de absortividad molar permiten la determinación de

concentraciones del orden de mg/l ó ppm.

2, 2´ Dipiridilo 1,10 fenantrolina Difenilcarbazona

11

H In + H2O H3O+ + In-

Forma ácida Forma básica

Especie absorbente a la Especie absorbente a lb

DETERMINACIÓN DE CONSTANTES DE DISOCIACIÓN DE INDICADORES

ÁCIDO-BASE

Ka = [ In- ]eq [ H+ ]eq

[ H In ]eq

pKa = - log [ In- ]eq [ H+ ]eq . = pH – log [ In- ]eq .

[ H In ]eq [ H In ]eq

Cuya constante de equilibrio o constante de acidez, sería:

Y cuyo pKa, sería:

12

Procedimiento

(1) Determinar la longitud de onda de máxima absorción para cada una

de las dos formas (In- y InH).

l InH : 520 nm

l In-: 430 nm

13

Se determina la λ de máxima absorción para cada una de las dos formas (In- y InH).

Se preparan dos soluciones de indicador con diferentes pH:

Una solución ácida, donde todo el indicador estará en su forma InH

y una solución básica, donde todo el indicador estará en su forma In-.

(2) Verificar la ley de Lambert y Beer para ambas formas del indicador.

InH

y = 150.50x + 0.02

R2 = 1.00

y = 10.10x + 0.02

R2 = 0.99

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

cc (g/ L)

Ab

sAbs 520nm

Abs 430 nm

Absortividad de InH a 520 nm (a520 InH) 150,50 L g-1cm-1

Absortividad de InH a 430 nm (a430 InH) 10,10 L g-1cm-1

In-

y = 73.00x + 0.00

R2 = 1.00

y = 9.81x + 0.01

R2 = 0.96

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 0.002 0.004 0.006 0.008

cc (g/ L)

Ab

s

Abs 520nm

Abs 430 nm

Absortividad de In- a 520 nm (a520 In-) 9,81 L g-1cm-1

Absortividad de In- a 430 nm (a430 In-) 73,00 L g-1cm-1

14

Se verifica Lambert y Beer para ambas formas del indicador.

Se preparan soluciones de distintas concentraciones de la forma ácida (InH) y de la forma básica

(In-) trabajando a pH extremos (asegurando la existencia de sólo una de las formas del indicador).

Luego se grafica Abs = f (concentración) y se obtiene de la curva de calibración la absortividad

de ambas formas (InH y In-), a las dos λ de onda máximas de absorción.

(3) Determinación de la concentración de ambas formas InH y In- a

distintos pH cercanos al pKa.

Solución de Rojo de

Metilo 0,01 % 10,00 mL 10,00 mL 10,00 mL 10,00 mL

AcNa 0,04 F 25,00 mL 25,00 mL 25,00 mL 25,00 mL

AcH 0,02 F 50,00 mL 25,00 mL 10,00 mL 5,00 mL

Agua destilada c.s.p. 100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL

pH 4,70 5,05 5,45 5,90Abs a 520 nm 1,097 0,796 0,456 0,276

Abs a 430 nm 0,356 0,432 0,585 0,658

Abs520 nm = a520InH.b.(cc InH) + a520In-.b.(cc In-)

Abs430 nm = a430In-.b.(cc In-) + a430InH.b.(cc InH)

15

• Consiste en la determinación de la concentración de ambas formas InH y In- a distintos pH

cercanos al pKa.

• Se preparan soluciones de la misma concentración total del indicador con distintos pH,

• se mide la absorbancia a las dos λ máximas de absorción de ambas formas del indicador,

• se determina la concentración de las formas InH y In- en cada una de las soluciones preparadas.

Cc InH = . (a430In- . Abs520) – (a520In

- . Abs430) .

(a520InH . a430In-) – (a520In

- . a430InH)

Cc In- = . (a520InH . Abs430) – (a430InH . Abs520) .

(a520InH . a430In-) – (a520In

- . a430InH)

pH Cc. InH (g/L) Cc. In- (g/L) pKa Ka

4,70 0.0070 0.0039 4.9557 1.10716 x 10-5

5,05 0.0049 0.0052 5.0256 9.42651 x 10-6

5,45 0.0025 0.0076 4.9687 1.07463 x 10-5

5,90 0.0012 0.0088 5.0531 8.84878 x 10-6

Ka media = 1,0023 x 10-5

pKa = 5,00

16

Espectroscopía de

Fluorescencia

17

Fluorescencia La fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia, son procesos

fotoluminiscentes, las moléculas de analito se excitan para dar una especie, cuyo espectro de emisión brinda información para el análisis cualitativo y cuantitativo.

Tienen un límite de detección del orden de partes por billón y un amplio rango lineal (permiten la determinación cuantitativa de especies orgánicas e inorgánicas, a nivel de trazas).

Debido a su alta sensibilidad, suelen aplicarse como método de detección en HPLC y electroforesis capilar.

Su utilidad está limitada, ya que pocas especies presentan fotoluminiscencia.

18

Teoría de la fluorescencia y fosforescencia

1) Estados excitados

El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haber dos electrones con los cuatro números cuánticos iguales.

Estado Singulete: Dos electrones en un orbital con estados de spínopuestos (apareados). No presentan un campo magnético neto (moléculas diamagnéticas), no son atraídas ni repelidas por un campo magnético permanente.

Estado Doblete: es el estado fundamental de un radical libre, tiene electrones desapareados, el electrón impar puede tomar dos orientaciones en un campo magnético, lo que otorga ligeras diferencias de energía al sistema. Son moléculas paramagnéticas y son influenciadas por campos magnéticos.

19

Teoría de la fluorescencia y fosforescencia

Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía superior, se forma un singulete o triplete. En el estado singulete excitado, el espín del electrón promocionado continúa apareado con el del estado fundamental, en el estado triplete los espines de los dos electrones están desapareados (paralelos).

Una molécula es paramagnética en el estado triplete y diamagnética en el estado singulete. Una transición singulete-triplete excitado, es menos probable que la transición singulete-singulete excitado.

Estado singulete

fundamental

Estado singulete

excitado

Estado triplete

excitado

20

2. Procesos de desactivación (a)

Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante combinación de varios mecanismos:

Por medio de la fluorescencia y la fosforescencia que conllevan la emisión de un fotón de radiación.

Mediante procesos no radiantes de desactivación o relajación (flechas onduladas).

El camino hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado.

La fotoluminiscencia se limita a pocos sistemas que presentan características estructurales y ambientales que permiten que las velocidades de los procesos de desactivación no radiantes se demoren hasta el punto en el que la reacción de emisión puede competir cinéticamente con ellos.

21

Esquema de procesos de excitación y desexcitación

Procesos de desactivación (b)1) Relajación vibracional:

en disolución el exceso de energía vibracional se pierde mediante colisiones entre las moléculas de las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz (t1/2=10-12 seg).

23



2) Conversión interna: son procesos intermoleculares donde la molécula pasa a un estado electrónico de menor energía sin emisión de radiación. Es más eficaz cuando dos niveles de energía electrónicos están lo suficientemente cerca como para que haya solapamiento de los niveles de energía vibracional.




3) Conversión externa o amortiguación colisional:ocurre por interacción y transferencia de energía entre la especie excitada y el disolvente u otros solutos. Todas las condiciones que tienden a reducir el número de colisiones entre partículas (bajas temperaturas y elevada viscosidad) desfavorecen este mecanismo y tienden a aumentar la fluorescencia.

27




3) Conversión externa o amortiguación colisional:ocurre por interacción y transferencia de energía entre la especie excitada y el disolvente u otros solutos. Todas las condiciones que tienden a reducir el número de colisiones entre partículas (bajas temperaturas y elevada viscosidad) desfavorecen este mecanismo y tienden a aumentar la fluorescencia.

4) Cruce entre sistemas: Se invierte el espín de un electrón excitado y cambia la multiplicidad de la molécula. La probabilidad de esta transición aumenta cuando los niveles vibracionales de los dos estados se solapan. Es mas frecuente en moléculas con átomos pesados (Br y I).La presencia de especies paramagnéticas en la disolución (O2) favorecen este proceso y disminuyen la fluorescencia.

29

Fluorescencia y Fosforescencia

“VARIACION DE STOKES”:

Debido a la alta eficiencia de la

relajación vibracional, la

desactivación ocurre desde el menor

nivel vibracional del estado excitado

hacia un estado vibracional del

estado basal, con corrimiento de la

banda de emisión hacia mayores l y

menores con respecto a la de

absorción.

Un triplete tiene menor energía que un singulete excitado, por lo que la fosforescencia emitida al

desactivarse desde un triplete será de mayor l que la de la desactivación fluorescente.

La fluorescencia no involucra cambios en el espín electrónico (Tiempo de vida =10-5 segundos).

En la fosforescencia se rota el espín para generar el estado triplete, aumentando el tiempo de vida, (10-4 a

segundos).

31

La fosforescencia comprende la desactivación desde un estado triplete excitado, luego de un cruce intersistemas.

32

Estructura

Temperatura Rigidez estructural

Solvente

Viscosidad

pH

Fluorescencia

Variables que afectan a la fluorescencia y

fosforescencia

kf : fluorescencia

kces : cruce entre sistemas

kce : conversión externa

kci : conversión interna

kpd : predisociación

kd : disociación

kf, kpd y kd dependen principalmente de la estructura química del compuesto, mientras que el resto de

las constantes están fuertemente influenciadas por el entorno y en menor medida por la estructura.

Variables que afectan a la fluorescencia y

fosforescencia1) Rendimiento cuántico o eficiencia cuántica

Es la relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia respecto al número

total de moléculas excitadas. Para moléculas altamente fluorescentes como la fluoresceína, la eficacia cuántica es cercana a la unidad.

Las especies químicas que no presentan fluorescencia apreciable tienen eficacias que se acercan a cero.

El rendimiento cuántico de fluorescencia de un compuesto, puede calcularse a partir de las

constantes de velocidad relativas de los procesos por los cuales el estado singulete excitado

mas bajo se desactiva.

33

dpdcicecesf KKKKKK

Kf

excitadasmoléculasden

fluorescenquemoléculasden

º

º

2. Factores estructurales (a) La fluorescencia más intensa la presentan los compuestos que tienen grupos

funcionales aromáticos.

Pueden presentar fluorescencia, compuestos con grupos carbonilo en estructuras

alifáticas y alicíclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados.

La mayoría de los compuestos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en solución

y su eficiencia cuántica aumenta con el número de anillos y grado de condensación.

En aromáticos, los sustituyentes dadores de electrones (OH, F, OCH3 y NH2 ),

incrementan la fluorescencia al aumentar la probabilidad del pasaje del estado excitado

al basal, al contribuir con la deslocalización de los electrones; ocurriendo lo contrario

con los grupos atractores de electrones.

La falta de rigidez en la molécula, favorece la desactivación no radiante por conversión

interna.

Ciertos agentes quelantes orgánicos, fluorescen mas intensamente al estar complejados

con un ión metálico no paramagnético, debido al aumento de rigidez de la estructura.

Se puede incrementar la fluorescencia adsorbiendo la molécula a un soporte sólido.

34

3. Influencia de la temperatura Al aumentar la temperatura disminuye la eficacia cuántica de fluorescencia, debido

a que aumentan las colisiones entre las moléculas y por lo tanto aumenta la

probabilidad de desactivación por conversión externa.

4. Influencia del solvente

Una disminución en la viscosidad del solvente aumenta la probabilidad de la

conversión externa y produce el mismo efecto que el aumento de temperatura.

También disminuye la fluorescencia en solventes que tienen átomos pesados.

Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan a los disolventes

compuestos que contienen átomos pesados, ya que en estas condiciones aumenta

la velocidad de formación del triplete.

35

El oxigeno suele disminuir la intensidad de fluorescencia:

Esto puede deberse a una oxidación de la sustancia

o a las propiedades paramagnéticas del oxigeno molecular, que favorece el cruce entre sistemas y

la conversión de las moléculas excitadas al estado triplete (produciendo fosforescencia).

Otras especies paramagnéticas tienden a disminuir la fluorescencia.

6. Efecto del oxigeno disuelto

5. Efecto del pH

La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos

en el anillo depende normalmente del pH.

Tanto la l de absorción como la de emisión, difieren entre la forma ionizada y la

no ionizada. Esto sugiere que los procedimientos analíticos basados en la medida

de fluorescencia requieren un control del pH.

Cuanto mayor es el número de formas resonantes, mayor es la estabilidad del

estado excitado y la consecuencia es fluorescencia.

36

Otros factores responsables de las desviaciones negativas a concentraciones elevadas:

Autoaniquilación o autoquenching.: Se produce como consecuencia del choque entre moléculas excitadas, lo cual origina

una desactivación en forma de energía no radiante.

Autoabsorción.: la longitud de onda de emisión se solapa con la longitud de onda de absorción, produciendo una

disminución de la fluorescencia medida. La radiación emitida atraviesa la solución y es reabsorbida por otras moléculas en ella

que se relajan en forma no radiante. Este fenómeno puede ser ocasionada por las especies del analito u otras especies

presentes en solución.

7. Efecto de la concentración La potencia de emisión fluorescente F es proporcional

a la potencia radiante del haz de excitación absorbido por el sistema.

Reemplazando con Lambert-Beer se obtiene la serie de Maclaurin.

Si bc es pequeño solo el primer término del polinomio es significativo y la ecuación se convierte en lineal.

La ecuación establece una relación lineal entre la concentración y la intensidad de fluorescencia.

A concentraciones superiores, los términos no pueden ser despreciados y se pierde la linealidad.

)´( 0 PPKF

...

!3

303,2

!2

303,2.303,2´

32

0

bcbcPKF

K.CFconstantessonbyPSi

303,2´

o

0

bcPKF

37

Sensibilidad y especificidad

La alta sensibilidad se debe a que el poder de fluorescencia se puede medir independientemente de la relación P y P0. En cambio en espectrofotometría, la medición requiere evaluar ambos parámetros P y P0, ya que la absorbanciaes proporcional a la relación entre ambas intensidades.

Esto es fácil de comprender si visualizamos que es más fácil detectar una “pequeña señal que una pequeña diferencia entre dos grandes señales”.

Para aumentar la sensibilidad se puede aumentar la potencia de la lámpara o amplificar la señal fluorescente.

Su especificidad resulta de la necesidad de conjugar dos espectros: el de excitación y el de emisión. Es poco probable que dos compuestos tengan la misma longitud de onda de excitación y de emisión de fluorescencia, por esto es que el método tiene alta especificidad.

38

Absorbancia

Fluorescencia

Fluorescencias vs Absorción

Fluorescencia Absorción

Más sensible Menos sensible

F=2,3.K´..b.c.Po T=P/Po=10-bc

Se mide F

A >Po>S

Se mide T

A > Po = S

(aumento proporcional de P)

Más selectiva Menos selectiva

41

Instrumentos de medida

(1) fluorímetro o espectrofluorímetro1) Casi todos los instrumentos de

fluorescencia utilizan ópticas de doble haz, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.

2) El haz proveniente de la fuente atraviesa un filtro o monocromador de excitación que transmite la radiación y excluye la de emisión.

3) La fluorescencia es emitida en todas las direcciones, pero la mejor manera de observarla es en un ángulo de 90º con respecto al haz de excitación; a otros ángulos, la dispersión por la solución y las paredes de la cubeta, puede causar grandes errores en la medida de la intensidad.

4) La radiación emitida llega al detector fotoeléctrico luego de atravesar el filtro o monocromador de emisión.

5) El haz de referencia pasa por un atenuador, que reduce su poder aproximadamente 100 veces.

6) Ambos rayos llegan a un amplificador diferencial y de allí al registrador.

Figura 5. Esquema de un fluorímetro o

espectrofluorímetro.

(1)

(2)

(3)

(4)(5)

(6)

42

Instrumentos de medida

Espectrofluorímetros

Tipo 1: son los que tienen un filtro para seleccionar la λ de excitación y un monocromadorde red o prisma para la selección de la λ de emisión.

Tipo 2: son los “verdaderos” espectrofluorímetros, que tienen dos monocromadores; uno de ellos permite variar la λ de excitación y el otro permite obtener el espectro de emisión.

Fluorímetros

Son análogos a los fotómetros de absorción donde se utilizan filtros para seleccionar las longitudes de onda de excitación y emisión.

43

Aplicaciones

1. Determinación de especies inorgánicas

Existen dos tipos de métodos: Los directos donde se forma un quelato fluorescente y se mide su emisión; y los indirectos, donde se mide la disminución de emisión que se debe a la acción atenuadora de la sustancia que se quiere determinar. Este último método es más utilizado en la determinación de aniones.

2. Determinación de especies orgánicas

Se pueden determinar enzimas, coenzimas, medicamentos, productos naturales, esteroides y vitaminas. Siendo útil en el análisis de productos alimentarios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales.

44

Validación de Métodos

Analíticos

45

INTRODUCCIÓN (1)

Un producto farmacéutico puede comercializarse

si cumple una serie de requisitos,

Estos se verifican a través de ensayos químicos,

físicos y microbiológicos.

Mediante ensayos descriptos en un Método

Analítico se comprueba que el producto cumple

con las especificaciones exigidas.

46

INTRODUCCIÓN (2)

Un Método Analítico consta de un conjunto de

ensayos, necesarios para efectuar el análisis

completo de una sustancia.

Existen 3 tipos fundamentales de ensayo:

Ensayos de Identificación: se verifica la identidad del

producto analizado.

Ensayos de Valoración: se verifica la concentración ypureza del principio activo en la forma farmacéutica en

ensayo.

Ensayos de disolución: se evalúa la liberación de losprincipios activos contenidos en el productofarmacéutico.

47

INTRODUCCIÓN (3)

Tipos de Métodos Analíticos:

Métodos estándar (de refencia):

desarrollados por organizaciones de prestigio internacional.

Métodos oficiales: exigidos por organismos de regulación gubernamentales.

Métodos de revistas científicas: usados con especial atención y requieren previa validación.

Métodos del propio laboratorio:

siempre documentados y previamente validados.

Se validan:

1. Métodos Analíticos.

2. Métodos de control de limpieza.

3. Equipos e instalaciones, Procesos, Software, Personal, etc.

48

VALIDACIÓN DE METÓDOS ANALÍTICOS

Validar significa demostrar que un método es

adecuado para el propósito que fue diseñado.

(Según ICH).

Mediante una validación se demuestra que los resultados obtenidos a partir del método analítico son confiables.

Se valida debido a que:

1. Disminuye los costos debido a que no serán necesarias las

repeticiones de ensayos, disminuyendo el gasto de materiales y

tiempo de trabajo.

2. Permite un conocimiento profundo de las características del

método analítico.

3. Constituye un requisito regulatorio.

(ICH:The International Conference on Harmonisation of TechnicalRequirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)

49


Los métodos descriptos en Farmacopeas se

consideran validados .

Sin embargo la validez de estos métodos es

discutible, debido a diferencias en los excipientes

empleados y en la calidad de las materias primas

según su origen.

Resulta necesario validar el método analítico para

cada producto.

Todos los Métodos Analíticos desarrollados en el

laboratorio o publicados en revistas científicas

deben ser validados.

50


Tipos de Validación:

Validación Prospectiva:

Para métodos nuevos.

Validación Retrospectiva: Para métodos repetidamente utilizados, no validados

anteriormente y de los que se tiene documentación suficiente para probar la bondad del método.

Revalidación:

Repetición parcial o total de una validación debido a cambios efectuados que pueden afectar la bondad del método validado.

51

52

Los parámetros a considerar en una validación:

1) Selectividad y Especificidad (*)

2) Linealidad y rango

3) Exactitud

4) Precisión

5) Robustez

6) Sensibilidad

7) Límite de detección y cuantificación del analito (LOD/LOQ)

(*) Preferentemente se realizan durante el desarrollo del método analítico.



53

1) Especificidad / Selectividad:

El método desarrollado debe ser capaz de resolver el analito de la

matriz de sus productos de degradación y de sustancias relacionadas.

Este parámetro se refiere a la propiedad del método analítico de

producir una señal medible debida sólo a la presencia del analito y

que no corresponda a la interferencia de otros componentes de la

muestra.

Estos componentes pueden ser excipientes, productos de

degradación, impurezas de síntesis.


54

Para evaluar la Selectividad:

1) Se introducen determinados interferentes (impurezas,

sustancias relacionadas) y se compara la respuesta con respecto a la solución que contiene sólo analito)

2) Se realizan degradaciones forzadas (ácidas, alcalinas, reductoras,

oxidantes fuertes ó débiles, hidrolíticas) y se evalua que la señal de

los compuestos productos de la degradación sea distinta del

analito.

3) Comparar con otros métodos o técnicas la habilidad del método

en medir el analito (preferentemente con distintos principios de

detección).


55

2) LINEALIDAD:

Se refiere a la proporcionalidad entre la concentración del

analito y su respuesta.

Además se determina el rango lineal, es decir el intervalo de

concentraciones de analito para el cual el método ha sido

probado, dentro de ese rango se pueden realizar

interpolaciones en una curva estándar.


56

3) EXACTITUD:

La exactitud indica la capacidad del método analítico para

proporcionar resultados lo más cerca posible del valor verdadero.

Si la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es pequeña, la

exactitud es buena.

No deben confundirse exactitud y precisión.

La precisión está relacionada con la dispersión de una serie de mediciones,

pero no da ninguna indicación de lo cerca que están del valor verdadero.

Podemos tener mediciones muy precisas pero poco exactas, sin embargo,

para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de precisión.


57

% Recuperación =C3

(C1 – C2) x 100

C1: Concentración de la muestra fortificada

C2: Concentración de la muestra sin fortificar

C3: Concentración de fortificación

¿ Como se determina la Exactitud?

Existen cuatro métodos: el de mayor aplicación y utilizado en este

curso es el que consiste en agregar cantidades conocidas de analito a

la muestra (adición de estándar), cuando no se pueden preparar

blancos de muestra:

Limites:

(97-103%)


58

4) PRECISIÓN:

Está relacionada con la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica

repetidamente a múltiples muestras.La precisión se expresa matemáticamente como desviación estándar relativa (RSD) o coeficiente de variación (CV).

RSD = X

s 100

n

ii

XX1 1

1

2

n

n

iX

iX

s


59

La precisión de un método analítico se estudia sobre:

El sistema: evaluando la dispersión de al menos 10

inyecciones del estándar

El método: evaluando la dispersión de varias

preparaciones (generalmente en un números de 6)

de la muestra preparada según se indica en el

método.


60

Dentro de la PRECISIÓN del método se pueden distinguir tres tipos de estudios:

Repetibilidad Precisión Intermedia Reproducibilidad

Mismo método Mismo método Mismo método

Misma muestra Misma muestra Misma muestra

Mismo Laboratorio Mismo Laboratorio Distinto Laboratorio

Mismo analista que

lleva a cabo la

validación

Diferente analista Diferente analista

Mismo equipo Diferente equipo Diferente equipo

En un corto intervalo

de tiempo

Mayores intervalos de tiempo Largos intervalos de

tiempo


61

5) ROBUSTEZ:

Capacidad de un método analítico para que los resultados no se

vean afectados por variaciones en los parámetros del

procedimiento.

Es la resistencia de un método a cambiar los resultados cuando se

realizan desviaciones en las condiciones experimentales descriptas

en el procedimiento.

Ejemplos (en HPLC):

Diferente columna

Cambiar la temperatura

Caudal

pH de la Fase móvil

Cambiar el % de SV orgánico en la FM, etc.


62

6) Sensibilidad

Se define cuantitativamente como la variación de señal (ΔX) al

variar la concentración de analito (Δc)

Es la pendiente de la curva de calibración, que es constante en la

mayoría de las determinaciones por ser lineales.


63

7) LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN:

El propósito es evaluar el método analítico a bajas

concentraciones de analito.

LÍMITE DE DETECCIÓN:

Menor concentración de analito que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN:

Menor concentración de analito que puede ser cuantificada con una precisión y exactitud adecuada.


64

LÍMITE DE DETECCIÓN (LoD):

Expresado en forma de concentración

XLoD= Xbl + 3.SDbl LoD = XLoD - Xbl

S

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LoQ):

Expresado en forma de concentración

XLoQ= Xbl + 10.SDbl LoQ = XLoQ - Xbl

S


65

Bibliografía disponible en internet:

www.iupac.org

www.iso.org

www.ich.org ( Q2 (R1) Validación de métodos analíticos).

www.eurachem.ul.pt

www.fda.gov

www.usp.org (Capítulo <1225>).

La validación es un proceso tedioso pero garantiza la calidad

de los resultados analíticos.

Problemas a realizar en clase

Problemas de espectrofotometría: 25

Adición de estándar: 1

Ejercicios de complejos: 1

pk indicador: 5

Fluorescencia: 9

Problema 4 –validación- pág. 67-68

66

Trabajo Práctico

Análisis cuantitativo de fluoresceína en una solución

inyectable

Objetivos:

1) Reconocer las diferencias instrumentales y operacionales entre

espectroscopía de fluorescencia y espectroscopía UV-vis.

2) Comparar dos métodos analíticos espectroscópicos, uno oficial y otro del

propio laboratorio, en cuanto a su aptitud para el análisis cuantitativo de un

determinado compuesto. Los criterios a tener en cuenta son: precisión,

exactitud, sensibilidad, linealidad, selectividad y robustez.

3) Observar el fenómeno de quenching en una solución concentrada de

fluoresceína sódica.

67

Espectroscopia uv visible, validacion

Science

Transcript of Espectroscopia uv visible, validacion