ENFEKSİYON HASTALIKLARINDA

GEN VE SİTOKİN TEDAVİSİ

Dr.Oğuz Reşat Sipahi

İNSAN GEN TEDAVİSİ

Hastaya hastalığının tedavisi açısından fayda sağlamak amacıyla hücrelerine yeni genetik materyal

eklenmesidir.Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

VEKTÖR TİPLERİ

– Retrovirüsler

– Adenovirüsler

– Adeno associated virüsler

– Alfavirüsler

– Lipozomlar

– PlazmitlerMedic. Clin. North Amer., 1996, 80: 1201

ENFEKSİYON HASTALIKLARINDA GEN TEDAVİSİ YAKLAŞIMLARI

• Nükleik asit yapılı: Antisense RNA ya da DNA, RNA tuzakları, ribozimler.

• Protein yapılı: Transdominan negatif proteinler (TNP), tek zincirli antikorlar, solubl reseptörler.

• İmmünoteröpetik yaklaşımlar: Genetik aşılar ve patojene özel lenfositler.

Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

GEN TEDAVİSİNİN ETKİNLİĞİNİ ARTIRAN FAKTÖRLER

• Hedef hücre kitlesinin iyi seçilmesi.

• Gen tedavisi vektörünün etkinliği

• Gen ürününün uygun ekspresyonu, regülasyonu ve stabilitesi.

• Gen inhibisyon ürününün gen replikasyonu üzerine etkinliği.

Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

RETROVİRAL VEKTÖRLER

• Yapımı ve çoğaltması kolaydır.

• Hücre DNA’sına rastgele bağlanır.

• 7 kb’dan büyük genleri aktaramaz.

• Ancak bölünen hücreleri enfekte edebilir.

• Oldukça defektif hale getirilerek immünojeniteleri azaltılabilir.

NEJM, 1995, 333: 1204.

ADENOVİRÜSLER

• Her türlü hücreyi enfekte edebilir (germ dahil).

• Yapımı ve çoğaltması kolaydır, 10-12 kb’lik genleri aktarabilir.

• Enfekte ettiği hücrede ekstrakromozomal olarak kalır.

• Retrovirüsler kadar defektif ve nonimmünojenik değillerdir.

• Eş zamanlı immünosupresif kullanılarak etkinlik artırılabilir.

NEJM, 1995, 333: 1204.

ADENO ASSOCIATED VIRUS (AAV)

• Stabil hücreleri enfekte edebilir.

• Wild tip AAV DNA’nın spesifik bölgelerine bağlanma özelliğine sahiptir, ama vektörlerde bu özellik azalmaktadır.

• Etkinlik gösterebilmesi için adenovirüslere ihtiyaç duyar.

• >5 kb genleri aktaramaz.

Medic. Clin. North Amer., 1996, 80: 1201

ALFAVİRÜSLER

• Alfavirüs genusu Sindbis virüs, Semliki Forest virüs ve Venezuelan equine virüsten oluşur. Pozitif polariteli RNA virüsleridir.

• RNA aşıları yapımında kullanılır.• Konuk transkripsiyon mekanizmasına bağlı değildir.• İmmünojeniktir.• dsRNA oluşumuna ve protein kinaz RNA aktive ve 22-

5’ oligozadenilat sentetaz yolarının aktivasyonuna ve apopitoza yol açabilir.

• Ölümsüzlük genleri ile alternatif çözümler.Gene Therapy, 2000, 7: 89

LİPOZOMLAR

• DNA içeren zarflı lipit kompleksleridir. Hücre içine

füzyon ve/veya endositozla girer.

• Spesifik doku ya da hücrelere yönlendirilebilirler.

(asialofetuin, transferrin)

• Nonimünojeniktirler.

• Her boy DNA’yı aktarabilirler.

Medic. Clin. North Amer., 1996, 80: 1201

PLAZMİTLER

• Yapımı kolaydır ve küçüktür1.

• İmmünojenitesi azdır1.

• Konuk DNA ve RNA mekanizmasına bağlı olarak çalışır1.

• Hücreler tarafından spontan olarak, ama inefektif oranda

alınırlar1.

• Büyük DNA fragmanlarının taşınmasında uygun değildir1.

• In vivo elektroporasyon ile uptake artırılabiliyor2.

1. Gene Therapy, 2000, 7: 89

2. 3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Widera et al, poster no: 591.

ANTISENSE DNA YA DA RNA

• Spesifiktir.

• İmmünojenitesi azdır.

• Ekstarasellüler alandan

hücre içine geçişi zordur.

• Yeterli gen inhibisyonu için etkin vektörlere ihtiyaç duyar.

• Bir molekül yalnızca bir molekülü inhibe edebilir.

Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

RİBOZİMLER

• Spesifik katalitik etkiye sahip antisense RNA molekülleri

– “Hammerhead” (U-H H=A veya C veya U)

– “Hairpin” (C-U-G)

• Bir molekül birden fazla molekülü inhibe eder.

• Küçük transkripsiyon ünitelerinden oluşur.

• Spesifiktir.

• RNAazlara duyarlıdır.Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

TUZAK RNALAR

• Fazlaca sentezlenen trans aktive edici proteinlere

spesifik “cis acting” elemanlara benzer RNA’lar.

• Mutasyonlara daha az duyarlı.

• Sellüler proteinler de etkilenebilir.

• Bir molekül bir molekülü inhibe eder.

• RNAazlara duyarlıdır.

Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

TRANS DOMİNAN NEGATİF PROTEİNLER

(TNPler)

• Regulatuar ve yapısal proteinlerin dominan negatif

formları

• İmmünojeniktir.

• RevM, Tat ve TREV, Tax, Rex

Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

NÜKLEİK ASİT AŞILARI

• Hücrelere plazmitlerle enfeksiyon etkenlerinin DNA

veya RNA’sı verilerek kendi proteinlerinin

ürettirilmesi ve immünolojik yanıt elde edilmesi.

• Kolay hazırlanır, hem sıvısal hem de hücresel

immün yanıta yol açar, çoklu doza gerek yoktur.

• Farklı hücrelere enfeksiyon, anti-DNA antikor

oluşması, istenmeyen yerlere entegrasyon.

Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

Ratlarda standart influenza virüs aşısı ile DNA aşısı

karşılaştırılmış. DNA aşısı hemaglütinine hümoral yanıta ek

olarak, internal nükleoprotein ve matriks proteinine karşı

hücresel yanıt oluşmuş ve DNA aşısı daha etkili bulunmuş.Nat. Med. 1995, 1: 583

HBV DNA‘nın çeşitli bölgelerine karşı oluşturulan

antisenselerin hücre kültüründe ve hayvan modellerinde

etkinliği kanıtlanmıştır.

Medic. Clin. North Amer., 1996, 80: 1201

AIDS ile ilişkili lenfoma olgularından yüksek doz

kemoterapi (YDK) amacıyla periferik kök hücre

nakli için CD34+ hücre toplanmış. Hücrelere HIV 1

rev ve tat genlerine yönelik hammerhead ribozim

içeren vektörle gen tedavisi yapılmış. Sonuçlara göre

erken gen ekspresyonu 1/20.000-1/100.000

mononükleer hücre arasındaymış, ancak

transplantasyonun üçüncü ayından sonra gen

ekspresyonu kaybolmuş.

3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Castonatto et al, poster no: 583.

Biri HIV(+) ve HAART alan, diğeri HIV (-) sekiz tek

yumurta ikizlerinden enfekte olmayanın periferik

mononükleer hücreleri (PBMH) alınıp, dışarıda TAR

antisense ve Rev TNP taşıyan vektörle transdükte edilmiş

ve enfekte olana verilmiş. Başta transdükte/transdükte

olmamış PBMH 0,12 iken, 30. haftada 20 imiş. HAART

alırken ve viral yük<500 iken, hepatit nedeniyle tedaviyi

bırakmak zorunda kalan bir vakadaysa viral yük

300.000’ler civarına çıkmış olmasına rağmen

transdükte/transdükte olmamış PBMH oranı 40 olmuş.

3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000 , Morga et al.

Beş AIDS ile ilişkili lenfoma olgusundan yüksek doz

kemoterapi (YDK) amacıyla periferik kök hücre

nakli için CD34+ hücre toplanmış. Hücrelere HIV 1

reverse transkriptaz genine yönelik antisense ve Rev

TNP içeren vektörle gen tedavisi yapılmış. Sonuçlara

göre nakiller tutmuş, YDK gen ekspresyonu

miktarını artırmış ama süresini etkilememiş.

3rd Annual Congress of American Society of Gene

Therapy, 2000, Scadden et al, poster no: 601.2

Kombine immün yetmezlikli fareden toplanan CD34+ hücrelere CCR5 ve anti TAT ve REV ribozim kombine

olarak bir retroviral vektör aracılığıyla uygulanmış. Bunlardan oluşan T hücre ve makrofajlarda bir

anomaliye rastlanmamış.

3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Bai et al, poster no: 577.

Lactococcus lactishas’da bulunan bir gen bölgesinin modifiye edilmesiyle özel olarak insan CCR5 ve HIV pol

genlerinin ortasına yerleşmekte olan bir DNA sekansı elde edilmiş. Bununla yapılan hücre kültürü deneylerinde

oldukça başarılı olunmuş.

3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Long et al, poster no: 576.

ANTİENFEKSİYÖZ HÜCRESEL PROTEİNLER

• Enfeksiyöz ajanın hücreye ulaşmasını hücre içine girmesini direk ya da yapısal veya regülatuar proteinleini etkileyerek indirek olarak engellerler, ya da ajanın gen ekspresyonunu engelleyecek hücresel proteinleri artırır ya da azaltır. 1

• İmmünolojik değillerdir. 1

• sCD4 reseptörleri, eritrositler üzerine CD4 reseptörü yerleştirilmesi. 2

1 Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42

2 3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, Cronin et al, poster no: 585.

İki hafta boyunca alkol içirilen farelerde ve su içirilen

farelerde deneysel Klebsiella pneumoniae pnömonisi

oluşturulmuş. Alkol alan grupta IL-17 azalırken,

mortalite artmış.

Bundan yola çıkılarak bir grup fareye adenoviral

vektörle IL-17 geni verilmiş. Verilen grupta mortalite

azalmış.

3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Kolls et al, poster no: 598.

TEK ZİNCİRLİ ANTİKORLAR (intrabodies)

• Ağır ve hafif zincir Ig genlerinin birleştirilmesiyle

elde edilen tek zincirli antikorlardır.

• Hücre içinde fonksiyon görürler ve immünojenik

değillerdir.

Clin. Micr. Rev., 1998, 13:

42

Bir grup farenin dendritik hücreleri IL-40 geni içeren adenoviral vektörle işlemlenmiş, diğer gruba plasebo

vektör verilmiş. Her iki grup ta üç hafta ölü, ardından canlı Pseudomonas aeruginosa’ya maruz bırakılmışlar. İlk

grupta %90, ikincide %0 sağkalım olmuş (p<0,0005).

3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Kikuchi et al, poster no: 594

Deneysel woodchuck hepatiti (WHV) DNA aşısı modelinde bir grup hayvana WHVDNA ile birlikte IL-12

geni bir grup hayvana yalnızca WHVDNA verilmiş. Kombine grupta viremi görülmezken (4/4), yalnız

WHVDNA alan grupta %75 (3/4) viremi görülmüş.

3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Garcia et al, poster no: 595.

İNTİHAR GENLERİ

• Enfekte hücrelerin seçici olarak öldürülmesini

öngörür.

• HSV-TK ve sitozin deaminaz.

Clin. Micr. Rev., 1998, 13:

42

AJAN SPESİFİK T LENFOSİTLER

• Hastaların kendi T8 ve T4 hücrelerinin dışarıda

immünoterapi yapıldıktan sonra geri verilmesi.

• Ret engellenmiş olur ve istenilen antijenlere karşı

hücresel yanıt elde edilebilir.

Clin. Micr. Rev., 1998, 13:

42

SİTOKİNLER

Hematopoetik ve nonhematopoetik seriye ait hücreler tarafından üretilen, normal

immünolojik fonksiyonlar için genellikle kritik, bazı hastalıklarda salınımları değişebilen,

immün sistem hücrelerinin büyüme, gelişme ve aktivasyonunda ve enflamatuar yanıtın

düzenlenmesinde görevli, otokrin, parakrin ve endokrin etkilerde bulunabilen pleiotropic

moleküllerdir.

Harrison’s Principles of Internal Medicine, 14th ed., 1998, s: 1753

SİTOKİNLER-2

• Lenfosit ve monositer seri immünoregülatuar sitokinler: IL-2, IL-4, TGF , interferonlar.

• Proinflamatuar sitokinler: IL-1, IL-6, TNF , IL-8, MCP-1, MCP-2, MCP-3, RANTES, MIP-1 ve MIP-1 beta.

• Lökositer seri immünoregülatuar sitokinler: IL-3, IL-7, GM-CSF, G-CSF.

Harrison’s Principles of Internal Medicine, 14th ed., 1998, s: 1753

HIV ve YALNIZCA IL-2

1995’ten önce yapılmış toplam 155 olgudan oluşan

randomize kontrollü üç çalışmanın meta analizinde,

IL-2 grubu medyan 28 ay, plasebo grubu medyan 30

ay izlenmiş. CD4+ hücre artışı IL-2 grubunda

anlamlı derecede yüksek (368’e karşı 153, p=.003).

HIV RNA düşüşü anlamlı derecede yüksek (-0,98’e

karşı –0,63 log kopya/ml, p=.004) Mortalitede azalma

yok (Dokuza karşı 16 olgu p=.22).

JID, 2000, 182: 428

HIV ve HAART+IL-2

• Non-AIDS, 200<CD4 (+) hücre <500, HIV RNA < 10.000kopya/ml olan ve HAART alan 82 HIV(+) olgu ART+IL-2 ya da ART almak üzere iki gruba (39/43) bölünmüş, 78’i çalışmayı tamamlamış. 52. haftada ortalama CD4 (+) artışı (%112’ye karşı, %18, p<.001), <50 kopya/ml HIV RNA elde edilenler (%67’ye karşı %36, p=.02) ve log cinsinden ortalama HIV RNA düşüşü (-0,28’e karşı –0,09, p=.03) IL-2 alan grupta daha yüksek bulunmuş.

JAMA, 2000, 284: 183

HCV ve IFN vs IFN + RBV

Tedavi

Şekli

Hasta sayısı

Tedavi süresi

Tedavi sonu yanıt

Kalıcı yanıt

Relaps

IFN 231 24 %29 %6 %80

IFN +plasebo 503 48 %29 %16 %44

IFN +RBV 505 24 %55 %33 %40

IFN +RBV 505 48 %51 %41 %21

Viral hepatit 2001, 2000, s:213

HBV ve INF vs INF + LAMHBeAg (+) 837 kronik HBV hepatiti olgusunu kapsayan ve INF

ile plaseboyu karşılaştıran 15 randomize kontrollü çalışmanın meta analizinde HBVDNA/HBeAg/HBsAg kaybı sırasıyla tedavi grubunda %37/33/7.8, kontrol grubundaysa %17/12/1,8 (p<.001) bulunmuştur.

Ann. Int. Med., 1993, 119: 31

HBeAg (+) 837 kronik HBV hepatitli olgu üç gruba ayrılmış, bir gruba 32 hf. 100 mg/gün LAM, bir gruba 32 hf. 10.000.000 INF haftada 3 kere, son grubaysa 8 hf. 100 mg/gün LAM, ardından 16 hf. diğer gruplardaki dozlarda INF +LAM verilmiş. 52. haftanın sonunda HBeAg serokonversiyonu sırasıyla %19/18/29 bulunmuşsa da p>.05 bulunmuştur.

Gut, 2000, 46: 562

HCV ve PEG-INF vs INF

Tedavi

Şekli

TBHS İSHS 48. hf.

VY*

72. hf. VY*

72. hf. ALT N.*

PEG-INF 267 223 %69 %39 %45

INF 264 161 %28 %19 %25

*p<.001

NEJM, 2000, 343: 1666

HCV + KCS ve PEG-INF vs INF Tedavi

Şekli

TBHS İSHS 48. hf.

VY*

72. hf. VY*

72. hf. ALT N.**

PEG INF (90 mcg)

96 78 %44 %30 %20

PEG INF (180 mcg)

87 67 %42 %15 %34

INF 88 64 %14 %8 %20

*p<.001, **p=.004

NEJM, 2000, 343:1673