Efeitos do monoterpeno (-)-mirtenol sobre o Sistema ...

RENORBIO

Programa de Pós-graduação em Biotecnologia

Efeitos do monoterpeno (-)-mirtenol sobre o Sistema

Nervoso Central: estudos in vitro e in vivo

Maria Rosilene Cândido Moreira

João Pessoa-PB

2013

MARIA ROSILENE CÂNDIDO MOREIRA



Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia com sede na Universidade Federal Rural de Pernambuco e ponto focal na Universidade Federal da Paraíba, como requisito para obtenção do grau de Doutora em Biotecnologia. ORIENTADOR: Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Rivelilson Mendes de Freitas

João Pessoa-PB

2013

MARIA ROSILENE CÂNDIDO MOREIRA



Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia com sede na Universidade Federal Rural de Pernambuco e ponto focal na Universidade Federal da Paraíba, como requisito para obtenção do grau de Doutora em Biotecnologia.

Aprovada em _____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________ Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida

Orientador (RENORBIO-UFPB)

___________________________________________________ Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa Examinador interno (RENORBIO-UFPB)

____________________________________________________ Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio

Examinador interno (RENORBIO-UFPB)

_____________________________________________________ Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley

Examinador externo (UFPE)

_____________________________________________________ Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior

Examinador externo (UFPB)

Dedico este trabalho à minha filha Gabrielle, que já era desejada antes do doutorado e acompanhou intraútero a concretização desta tese, um sonho realizado, assim como sua concepção... Gestá-la durante a etapa final do doutorado foi uma experiência ímpar, pois, dividir o tempo em escrever a tese e preparar seu enxoval contribuiu para reduzir a ansiedade típica da fase de qualificação e preparou-me para ter mais autoconfiança no momento da defesa. Dedico este título também ao meu esposo, Rogério Moreira, companheiro e amigo, responsável maior pelas minhas conquistas profissionais e pessoais, pois é sempre o primeiro a me encorajar a tentar; graças a ele, consegui chegar até aqui. Amo vocês dois!!!

A Deus, que pôs pessoas de bom espírito no meu caminho, para colaborar, cada uma a seu modo, para que eu pudesse obter este título; Aos familiares, que apoiaram e acompanharam desde o início minha trajetória acadêmica; Ao dileto professor Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida, pessoa ímpar que, com sua gentileza e sabedoria constantes, aceitou-me como sua orientanda, agregando ao meu o seu valioso nome e conhecimento científico, para que eu pudesse aprender e crescer como pesquisadora, por quem tenho e terei sempre uma grandiosa admiração e a quem sou eternamente grata; Ao estimado professor Dr. Rivelilson Mendes de Freitas, meu co-orientador, que compartilhou comigo um pouco do seu saber, acreditou na minha capacidade intelectual e encorajou-me a seguir em frente, ora instigando-me a produzir, ora confortando-me com palavras otimistas que foram muito importantes para a finalização desta fase da minha vida, a quem tenho e terei sempre como amigo, exemplo de professor competente e referência como pesquisador na área da saúde. Agradeço especialmente por me iniciar no mundo fascinante da pesquisa experimental, dos ensaios pré-clínicos e das patentes; Aos integrantes do Laboratório de Pesquisas em Neuroquímica Experimental da UFPI (LAPNEX), Amanda Cardoso, Oskar Almeida, Jéssica Costa, Daianne Costa, Rusbene Albuquerque e Giselle Zaira, pela valiosa ajuda nos ensaios experimentais que lá realizei; Ao professor Dr. José Maria Barbosa Filho pelas valiosas considerações efetuadas na qualificação da tese; Ao amigo ex-renorbiano professor Dr. José Ferreira Lima Júnior, que me falou sobre o processo seletivo para o doutorado Renorbio, incentivando-me a concorrer a uma vaga e, após minha aprovação, apoiando-me nesta trajetória até eu finalizá-la; Aos amigos Marcylenne e Célio Adriano que abriram suas residências e me acolheram durante minhas idas e vindas a João Pessoa, e ainda apresentaram-me alguns lugares atrativos da capital paraibana; Aos colegas de doutorado Allan Reis Albuquerque e Maria Soraya Franco, pelo apoio e agradável presença durante as semanas intensivas em disciplinas cursadas na UFPB; Às colegas Renorbianas Leiz Veras e Adrianny Amorim pelas agradáveis companhias nas disciplinas e congressos relacionados ao doutorado dos quais participamos; Às colegas e aos colegas docentes da Unidade Acadêmica de Enfermagem do CFP/UFCG da qual faço parte, que compreenderam a importância do doutorado para meu crescimento profissional, aprovando meu pedido de afastamento para concluí-lo;

Às professoras Alba Rejane Moura, Edineide Nunes e Milena Costa, que aceitaram me substituír nas atividades docentes, fator decisivo para a aprovação do meu afastamento; Às amigas Edina Rodrigues e Jackelya Araújo, pelo incentivo, apoio e envio de palavras e pensamentos positivos nos momentos difíceis vividos na pós-graduação; Aos professores doutores Damião Pergentino, Fábio Sampaio, Siqueira Júnior e Almir Wanderley, pelas considerações pontuadas na seção de defesa; À secretaria e a coordenação do Renorbio – Ponto Focal Paraíba, pelas orientações fornecidas sobre matrícula, disciplinas, reuniões, qualificação e defesa da tese.

“A razão é o passo, o aumento da ciência o caminho,

e o benefício da humanidade é o fim.”

Thomas Hobbes

http://pensador.uol.com.br/autor/thomas_hobbes/

MOREIRA, M.R.C. Efeitos do monoterpeno (-)-mirtenol sobre o Sistema Nervoso Central: estudos in vitro e in vivo. 2013. 191p. Tese (Pós-graduação em Biotecnologia, Rede Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO), Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa.

RESUMO

O (-)-mirtenol (MIR) é um monoterpeno encontrado em diversas plantas aromáticas. Entretanto, ainda não foram descritas na literatura suas propriedades psicofarmacológicas. Nesse sentido, este estudo teve como objetivo investigar a influência do mirtenol sobre o sistema nervoso central de camundongos Swiss e ratos Wistar para verificar seu efeito ansiolítico, neuroléptico e anticonvulsivante, além do potencial antioxidante e tóxico. Foram realizados ensaios ansiolíticos utilizando-se os testes do labirinto em cruz elevado (TLCE) e de transição claro-escuro (TTCE), além dos testes do campo aberto (TCA) e Rota Rod para avaliar os efeitos sobre o sistema locomotor desses animais. O efeito anticonvulsivante foi analisado pelos testes de convulsão induzida por pentilenotetrazol (PTZ), picrotoxina (PIC) e pilocarpina (P) e o neuroléptico pelo teste de catalepsia induzida por haloperidol (HAL). Para verificar o potencial tóxico realizou-se screening hipocrático, avaliação da massa corporal, consumo alimentar e produção de excretas, análise dos parâmetros hematológicos e bioquímicos e avaliação morfológica macroscópica e histopatológica de órgãos dos animais experimentais. Adicionalmente, estudou-se o perfil antioxidante, através das metodologias in vitro (TBARS, remoção do radical nitrito e hidroxila) e in vivo [lipoperoxidação, produção de nitrito e atividade das enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa reduzida (GSH)]. No TLCE, o mirtenol aumentou significativamente o número de entradas (MIR=5,6; Controle=3,1) e o tempo de permanência dos animais nos braços abertos (MIR=106,8s; Controle=47,5s) e, no TTCE, aumentou significativamente o tempo de permanência dos animais no compartimento claro (MIR=187,4s; Controle=105,1s). No TCA e Teste do Rota Rod, não houve alterações significativas dos parâmetros observados. Nos testes sobre convulsão, o mirtenol aumentou a latência para a primeira convulsão [P(MIR=21,5s; Controle=11,9s); PTZ(MIR=280,4s; Controle=87,3s); PIC(MIR=696,0s; Controle=522,4s)] e diminuiu a porcentagem destas [P(MIR=53,3%;); PTZ(MIR=37,3%); PIC(MIR=33,3%)], assim como o percentual de mortes dos animais [P(MIR=53,3%); PTZ(MIR=48,3%); PIC(MIR=33,3%)]. No teste da catatonia o mirtenol reduziu significativamente o tempo de permanência dos animais na posição antifisiológica induzida (MIR=0,9s; HAL=29,7s). Na avaliação da toxicidade, o screening hipocrático revelou boa tolerabilidade do mirtenol e não houve alterações significativas no padrão alimentar, produção de excretas, massa corporal, parâmetros hematológicos, bioquímicos, morfológicos ou histopatológicos. Quanto ao potencial antioxidante, o mirtenol reduziu a lipoperoxidação (MIR=86,8%; VitC=56%), o teor de nitrito (MIR=85,3%; VitC=24,5%) e aumentou a atividade das enzimas antioxidantes nos animais tratados [CAT(MIR=102,3%; SOD (MIR=39,5%); GSH(MIR=12,2%)]. Conclui-se que o mirtenol apresenta potencial ansiolítico sem efeito sedativo, atividade neuroléptica, anticonvulsivante e antioxidante, com baixa toxicidade, podendo ser considerado potencial bioproduto na formulação de fitomedicamentos. Palavras-chave: mirtenol, ansiolítico, antioxidante, neuroléptico, anticonvulsivante, sistema nervoso central, monoterpeno, óleos essenciais.

MOREIRA, M.R.C. Effects of monoterpene (-)-myrtenol in Central Nervous System: studies in vitro and in vivo. 2013. 191p. Thesis (Pós-graduate in Biothecnology, Northeast Biotechnology Network - RENORBIO), Federal University of Paraíba (UFPB), João Pessoa.

ABSTRACT

(-)-myrtenol (MYR) is a monoterpene found in various aromatic plants. However, te scientific literature has not yet described any psychopharmacological properties of this molecule. This study aimed to investigate the influence of myrtenol on the central nervous system of male Swiss mice and Wistar rats checking their anxiolytic, neuroleptic and anticonvulsant activities, in addition to its antioxidant and toxic potentials. Anxiolytic assays were performed using the elevated plus maze test (EPM) and light-dark transition test (LDT), besides the open field test (OFT) and Rota Rod test to assess the effects on the locomotor system of these animals. The neuroleptic activity was checked by the test of catalepsy induced by haloperidol (HAL). The anticonvulsant effect was analyzed by seizures induced by pentylenetetrazol (PTZ), picrotoxin (PIC) and pilocarpine (P). To check the potential toxicity hippocratic screening was performed, by assessment of body weight, food consumption and production of excreta, the hematological and biochemical parameters, as well as macroscopic and histopathological organs of experimental animals. Additionally, was studied the antioxidant profile the study on the antioxidant profile, through in vitro (TBARS, removal of nitrite and hydroxyl radical) and in vivo techniques [lipid peroxidation, nitrite production and activity of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and reduced glutathione (GSH)]. In EPM, myrtenol administration significantly increased the input numbers (MYR=5.6; Control=3.1) and time spent by the animals in the open arms (MYR=106.8s; Control=47.5s) when compared with the control group and in the LDT myrtenol increased significantly the time spent by animals in the light compartment (MYR=187.4s; Control=105.1s). In OFL and Rota Rod test, the results revealed no significant changes in the parameters observed. In seizures induced, the results revealed that the myrtenol increased the latency to the first seizure [P(MYR=21.5s; Control=11.9s); PTZ(MYR=280.4s; Control=87.3s); PIC(MYR=696.0s; Control=522.4s)] and decreased the percentage of seizures [P(MYR=53.3%;); PTZ(MYR=37.3%); PIC(MYR=33.3%)], as well as the percentage of deaths of animals [P(MYR=53.3%); PTZ(MYR=48.3%); PIC(MYR=33.3%)]. The test of catatonia showed a significant reduction in the time spent in the antiphysiologic position (MYR=0.9s; HAL=29.7s). On the toxicity studies, the hippocratic screening showed good tolerability of myrtenol and no significant changes in dietary patterns, production of excreta, body weight, hematological and biochemical parameters and morphological or histopathological findings. About the antioxidant potential, myrtenol reduced lipid peroxidation (MYR=86.8%; VitC=56%), level of nitrite (MYR=85.3%; VitC=24.5%) and increased antioxidants enzymes activity [CAT(MYR=102.3%; SOD (MYR=39.5%); GSH(MYR=12.2%)] in treated animals. In conclusion, myrtenol has anxiolytic potential without sedative effect, possesses neuroleptic, anticonvulsant and antioxidant activities, with low toxicity and can be considered a potential bioproduct in formulation of phytomedicine. Keywords: (-)-myrtenol, anxiolytic, antioxidant, neuroleptic, central nervous system, monoterpene, essential oils.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática do receptor GABAA ............................... 33

Figura 2. Myrtus communis L. ........................................................................... 41

Figura 3. Flores e frutos de mirta........................................................................ 41

Figura 4. Animais experimentais utilizados no estudo ....................................... 48

Figura 5. Estrutura química do mirtenol ............................................................. 49

Figura 6. Aparelho de Campo Aberto ................................................................. 50

Figura 7. Aparelho Rota Rod .............................................................................. 51

Figura 8. Labirinto em cruz elevado ................................................................... 51

Figura 9. Aparelho de Transição Claro - Escuro ................................................ 52

Figura 10. Esquema do estudo dos efeitos do mirtenol sobre o SNC .............. 53

Figura 11. Esquema do estudo do potencial tóxico do mirtenol ......................... 54

Figura 12. Esquema do estudo do perfil antioxidante do mirtenol ..................... 55

Figura 13. Parâmetros observados no teste do Campo Aberto ......................... 56

Figura 14. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do Campo Aberto ....... 57

Figura 15. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de

ação do mirtenol no Teste do Campo Aberto ......................................................

57

Figura 16. Parâmetros observados no Teste do Rota Rod ................................ 58

Figura 17. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do Rota Rod .............. 59


ação do mirtenol no Teste do Rota Rod .............................................................

59

Figura 19. Parâmetros observados no TLCE ..................................................... 61

Figura 20. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do LCE ....................... 61


ação do mirtenol no Teste do LCE ......................................................................

62

Figura 22. Parâmetros observados no Teste de Transição Claro - Escuro ....... 63

Figura 23. Protocolo experimental do mirtenol no Teste de Transição Claro-

Escuro .................................................................................................................

63


ação do mirtenol no Teste de Transição Claro-Escuro .......................................

64

Figura 25. Protocolo experimental do mirtenol no Teste de Convulsão

induzida por PIC, PTZ ou P .................................................................................

65


ação do mirtenol no Teste de Convulsão induzida por PIC, PTZ ou P ...............

65

Figura 27. Parâmetros observados no Teste de Catatonia ................................ 66

Figura 28. Protocolo experimental do mirtenol no Teste da Catatonia .............. 67


ação do mirtenol no Teste da Catatonia..............................................................

67

Figura 30. Áreas cerebrais dos animais experimentais removidas para estudo

neuroquímico .......................................................................................................

71

Figura 31. Efeito do tratamento agudo com mirtenol sobre o hipocampo dos

animais experimentais .........................................................................................

116

Figura 32. Efeito do tratamento agudo com mirtenol sobre o corpo estriado

dos animais experimentais ..................................................................................

116

Figura 33. Efeito do tratamento agudo com mirtenol sobre o tecido hepático

dos animais experimentais ..................................................................................

117

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Efeito do mirtenol sobre a atividade locomotora espontânea dos

animais no teste do campo aberto ......................................................................

80

Gráfico 2. Efeito do mirtenol sobre o comportamento de empinar dos animais

no teste do Campo Aberto ..................................................................................

81

Gráfico 3. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais na

barra giratória do Rota Rod .................................................................................

82

Gráfico 4. Efeito do mirtenol sobre o número de entradas dos animais nos

braços abertos no TLCE ....................................................................................

83

Gráfico 5. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais nos

braços abertos no TLCE .....................................................................................

85

Gráfico 6. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais no

compartimento claro no TTCE ............................................................................

86

Gráfico 7. Efeito do mirtenol sobre o tempo de catatonia induzida por

haloperidol nos intervalos mensurados ...............................................................

101

Gráfico 8. Efeito do mirtenol sobre o tempo total de catatonia induzida por

haloperidol ...........................................................................................................

102

Gráfico 9. Efeito da aministração oral de mirtenol em doses repetidas sobre o

consumo de ração dos animais ...........................................................................

110

Gráfico 10. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre

o consumo de água dos animais .........................................................................

111


a produção de excretas pelos animais ................................................................

111


a massa corporal dos animais .............................................................................

112

Gráfico 13. Efeito do mirtenol sobre a produção de TBARS .............................. 124

Gráfico 14. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical nitrito ...................... 125

Gráfico 15. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical hidroxila .................. 126

Gráfico 16. Efeito do mirtenol sobre o nível de peroxidação lipídica no

hipocampo dos animais experimentais ...............................................................

127

Gráfico 17. Efeito do mirtenol sobre o teor de nitrito no hipocampo dos


128

Gráfico 18. Efeito do mirtenol sobre a atividade da catalase no hipocampo dos


129

Gráfico 19. Efeito do mirtenol sobre a atividade da superóxido dismutase no

hipocampo dos animais experimentais ............................................................

130

Gráfico 20. Efeito do mirtenol sobre a atividade da glutationa reduzida no

hipocampo dos animais experimentais ...............................................................

131

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Classificação dos transtornos de ansiedade ....................................... 31

Quadro 2. Mecanismos de ação e efeitos adversos de algumas drogas

utilizadas no tratamento da ansiedade .................................................................

34

Quadro 3. Modelos animais de ansiedade dos estudos pré-clínicos com

produtos naturais ..................................................................................................

36

Quadro 4. Screening hipocrático dos animais tratados com mirtenol .................. 109

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Efeito do mirtenol sobre o grooming dos animais ................................ 80

Tabela 2. Efeito do mirtenol sobre o número de quedas dos animais ................. 83

Tabela 3. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por pilocarpina .................... 93

Tabela 4. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por pentilenotetrazol ........... 94

Tabela 5. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por picrotoxina .................... 95

Tabela 6. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre os parâmetros

hematológicos dos animais experimentais ..........................................................

113

Tabela 7. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre os parâmetros

bioquímicos dos animais experimentais .............................................................

114

Tabela 8. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre o peso dos órgãos

dos animais experimentais ...................................................................................

115

Tabela 9. Patentes encontradas nas bases de dados ....................................... 136

Tabela 10. Aplicações das patentes relacionadas ao mirtenol ............................ 137

Tabela 11. Categorias de detentores das patentes concedidas relacionadas ao

mirtenol ................................................................................................................

138

Tabela 12. Patentes relacionadas ao mirtenol depositadas por país .................. 138

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAPH 2,2’-azobis [2 metilpropionamidina] diidroclorido

AC Ácido ascórbico

ADT Antidepressivo tricíclico

ALE Atividade Locomotora Espontânea

ALT Alanina aminotransferase

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AST Aspartato aminotransferase

BZD Benzodiazepínico

CAT Catalase

CI50 Concentração Inibitória 50%

CID-10 Classificação Internacional de Doenças – versão 10

CHCM Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média

CT Colesterol Total

DSM-IV Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais – IV

DZP Diazepam

EP Espacenet

E.P.M. Erro Padrão da Média

FLU Flumazenil

GABA Ácido Gama Aminobutírico

GSH Glutationa Reduzida

HAL Haloperidol

HCM Hemoglobina Corpuscular Média

IC Intervalo de confiança

IMAO Inibidor da monoamina oxidase

INPI Instituto Nacional de Propriedade Intelectual

ISRS Inibidor seletivo da reabsorção de serotonina

LCE Labirinto em Cruz Elevado

MDA Malondialdeído

MIR Mirtenol

NEBA Número de Entradas nos Braços Abertos

NO Óxido Nítrico

NPS Nitroprussiato de Sódio

OH Radical hidroxila

OMS Organização Mundial de Saúde

P Pilocarpina

PEBA Porcentagem de Entradas nos Braços Abertos

PIC Picrotoxina

PTBA Porcentagem do Tempo de Permanência nos Braços Abertos

PTZ Pentilenotetrazol

5-HT1A Receptor 5-Hidroxitriptamina – 1ª

SNC Sistema Nervoso Central

SNGPC Sistema Nacional de Gerenciamento de Produtos Controlados

SOD Superóxido Dismutase

TA Transtorno de Ansiedade

TAG Transtorno de Ansiedade Generalizada

TBA Ácido Tiobarbitúrico

TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

TCA Teste do Campo Aberto

TLCE Teste do Labirinto em Cruz Elevado

TTCE Teste de Transição Claro – Escuro

TPBA Tempo de Permanência nos Braços Abertos

Trolox 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico

USPTO United States Trademark Office

VCM Volume Corpuscular Médio

WHO World Health Organization

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO .................................................................................................... 19

REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 24

1 Produtos naturais na saúde coletiva: do preparado popular ao fitofármaco 25

2 Ansiedade e ansiolíticos: dos sintéticos aos produtos naturais ................ 30

3 Considerações sobre Myrtus communis L. e o monoterpeno (-)-mirtenol.. 40

OBJETIVOS .......................................................................................................... 45

1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 46

2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 46

MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 47

1 MATERIAL ..................................................................................................... 48

2 MÉTODOS ..................................................................................................... 52

3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................... 75

RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 76

CAPÍTULO 1 - Avaliação do efeito ansiolítico do mirtenol .......................... 77

CAPÍTULO 2 - Avaliação do efeito anticonvulsivante do mirtenol ............. 90

CAPÍTULO 3 - Avaliação do efeito neuroléptico do mirtenol ...................... 97

CAPÍTULO 4 - Avaliação do potencial tóxico do mirtenol ........................... 105

CAPÍTULO 5 - Avaliação do perfil antioxidante do mirtenol ....................... 121

CAPÍTULO 6 - Prospecção do mirtenol no tratamento da ansiedade ........ 134

CONCLUSÕES ..................................................................................................... 140

PERSPECTIVAS ................................................................................................... 142

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 144

ANEXOS ............................................................................................................... 174

20

____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Introdução

INTRODUÇÃO

A utilização de plantas medicinais para o tratamento, cura e prevenção de

doenças que acometem a espécie humana é tão antiga quanto a própria existência

do homem na Terra. O Brasil apresenta uma grande diversidade genética vegetal,

englobando de 15 a 25% de todas as espécies vegetais do planeta (JOLY et al,

2011), sendo a região Nordeste uma das regiões exploradoras desta riqueza

vegetal, embora ainda de maneira tímida, na investigação de plantas para o

tratamento de diversos tipos de doenças.

Nas condições que afetam o Sistema Nervoso Central (SNC), pesquisas em

diversos países têm sido desenvolvidas com o intuito de desvelar novas

possibilidades de tratamento contra a ansiedade, uma condição patológica que

acomete cada vez mais pessoas em todo o mundo, sendo considerada pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma das condições mentais mais

preocupantes da saúde pública deste século (WORLD HEALTH ORGANIZATION -

WHO, 2002).

Os transtornos fóbicos-ansiosos e os de ansiedade, assim denominadas as

condições inseridas na categorias F40 e F41 da Classificação de Transtornos

Mentais e de Comportamento da CID-10 (OMS, 1993), revelam-se através de

manifestações de angústia extrema, com alterações cardiovasculares que levam a

taquicardia, palpitações e até dor precordial, com início insidioso e diagnóstico

tardio, o que leva muitos acometidos a carregarem o problema durante anos, sem

realizar tratamento adequado (WHO, 2002).

Uma vez diagnosticado o transtorno de ansiedade, dependendo do grau em

que o mesmo é classificado, o tratamento pode consistir de acompanhamento

psicoterapêutico e realização de práticas corporais integrativas ou complementares,

com ou sem o auxílio de terapêutica medicamentosa; entretanto, pelo fato de muitos

só se descobrirem doentes após muito tempo, geralmente os ansiolíticos estão

associados à abordagem multiprofissional.

A venda de ansiolíticos lidera o ranking dos medicamentos controlados mais

comercializados no Brasil. Após os ansiolíticos, aparecem os anticonvulsivantes.

Uma pesquisa realizada pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)

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revelou que, de 2007 a 2010, os ansiolíticos Clonazepam, Bromazepan e

Alprazolan, nesta ordem, foram os três mais vendidos no país (BRASIL, 2012).

No Estado da Paraíba, dados do Sistema Nacional de Gerenciamento de

Produtos Controlados (SNGPC/ANVISA) revelaram que, no período compreendido

entre 2009 e 2011, Clonazepam, Bromazepam e Diazepam foram os três princípios

ativos mais consumidos pela população paraibana; um reflexo do panorama

nacional (BRASIL, 2012).

Embora o estudo tenha listado somente os princípios ativos, os

medicamentos conhecidos pela população apresentam-se com nomes comerciais

variados, muitas vezes, confundindo as pessoas por apresentarem nomes

parecidos, porém, em concentrações diferenciadas e outras características que

alteram a farmacocinética da droga, desencadeando efeitos colaterais que incluem

variações do humor, alterações na locomoção, relaxamento muscular, tremores,

dependência química, dentre outros.

No campo da neuropsicofarmacologia, a busca por novas farmacoterapias de

plantas medicinais para doenças psiquiátricas progrediu significativamente na

década passada. Entre essas plantas, o grupo das aromáticas tem despertado muito

interesse, por possuírem amplas indicações na medicina popular. No Brasil,

aproximadamente 65 a 80% da população depende unicamente dos preparados

obtidos das plantas para o tratamento de desordens na saúde (AGRA; FREITAS;

BARBOSA-FILHO, 2007). No entanto, o uso popular não constitui processo

suficiente para validação etnofarmacológica de uma planta ou constituinte,

necessitando de estudos que comprovem sua segurança e eficácia. Nesse contexto,

e considerando a imensa diversidade da flora brasileira, existem diversas espécies

sendo estudadas, revelando muitas descobertas promissoras para a área de saúde.

Dentre as plantas com promissoras atividades farmacológicas, Myrtus

communis L., uma espécie da família Myrtaceae tem sido investigada. É uma planta

arbustiva aromática procedente da região mediterrânica da Europa, sendo muito

cultivada mundialmente. Conhecida popularmente como “murta-comum” ou “mirta”, o

seu habitat preferencial é xerofílico (seco), podendo ser encontrada em diversas

regiões do Brasil, tradicionalmente utilizada no sul do país no tratamento de

problemas estomacais (SALVAGNANI et al., 2008).

22

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Diversas indicações medicinais estão atribuídas à mirta. Textos médicos

egípcios já referiam seu uso como remédio para desordens urinárias, dores, azia,

inchaços e expectorante. Na Grécia, era utilizada como contraceptivo e na Turquia,

para tratamento de problemas menstruais (ÖZKAN; GÜRAY, 2009). É ainda

indicada no tratamento de insônia e condições nervosas (REZAIE et al., 2012).

Ainda nesse sentido, o óleo essencial de mirta tem sido encontrado no

comércio popular como substância medicinal, indicado para condições patológicas

diversas, tais como as descritas anteriormente, podendo ser adquirido no comércio

virtual, através de sites que comercializam produtos naturais.

Na composição desse óleo, o mirtenol, um monoterpeno álcool, tem sido

identificado como um dos constituintes majoritários, visto que os óleos essenciais

são compostos por duas classes químicas, a saber: os terpenóides e os

fenilpropanóides, destes, os monoterpenóides e os sesquiterpenóides são os mais

freqüentes (RAHIMMALEK et al., 2009). Embora constituam somente 1 a 2% da

composição das plantas aromáticas (FATURI et al., 2010; ALMEIDA et al., 2011), os

óleos essenciais têm sido utilizados no tratamento de doenças como a epilepsia e a

ansiedade, uma vez que vários estudos já comprovaram suas atividades

antidepressivas, sedativas, ansiolíticas e anticonvulsivantes (DE SOUSA et al.,

2007; SANTOS et al., 2011).

Trabalhos que utilizaram óleos essenciais de plantas contendo mirtenol como

um dos constituintes majoritários revelaram algumas propriedades deste

monoterpeno, apontando-o como possível agente antimicrobiano, por apresentar

efeito contra o Bacillus subtilis (LEPOITTEVIN et al., 2011), anti-cancerígeno

(EVSTATIEVA et al., 2010), inibindo células neoplásicas cervicouterinas, anti-

hiperglicêmico (ELFELLAH; AKHTER; KHAN, 1984; SEPICI-DINCEL et al., 2007),

anti-mutagênico (HAYDER et al., 2003) e agente hipotensor (SAITO et al., 1996;

SANTOS et al., 2011). Entretanto, ainda não foram encontrados estudos sobre suas

propriedades farmacológicas sobre a ansiedade e a convulsão, embora sua

estrutura química assemelhe-se a outros monoterpenóides álcoois com comprovada

atividade ansiolítica (GOMES et al., 2010; NOGUEIRA NETO et al., 2012; DE

ALMEIDA et al., 2012; LIMA et al., 2013) e anticonvulsivante (ELISABETSKY;

BRUM; SOUZA, 1999; DE SOUSA et al., 2006; SILVA et al., 2009; SAMPAIO, et al.,

2012). Além disso, por não terem sido encontrados estudos relacionando

23

____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________


monoterpenóides alcoóis com o fenômeno da catalepsia, surgiu o interesse em

utilizar o mirtenol nos ensaios experimentais com modelos animais específicos para

essas condições.

Nesse sentido, este estudo teve como objetivo investigar a influência do

mirtenol sobre o SNC, especialmente para verificar sua atividade ansiolítica,

anticonvulsivante e anticataléptica, além do seu potencial tóxico e antioxidante, de

forma aguda e crônica, em modelos animais.

Pretende-se com este trabalho fornecer subsídios para que futuros

fitomedicamentos contra ansiedade, convulsão e outras condições que acometem o

sistema nervoso central possam ser produzidos, a fim de que sejam financeiramente

mais acessíveis à coletividade necessitada e desprovidos de efeitos colaterais,

favorecendo ainda neuroproteção contra danos oxidativos decorrentes dos

processos patológicos e ampliando assim a listagem de produtos biotecnológicos na

área da saúde atualmente formulados e comercializados no Brasil.

25

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura

REVISÃO DE LITERATURA

1 Produtos naturais na saúde coletiva: do preparado popular ao fitofármaco

O uso de plantas com a finalidade de tratar e curar condições que acometem

a saúde do homem acompanha a evolução humana, datando dos tempos primitivos,

em que as mulheres retiravam das ervas seus princípios ativos, por meio de

processos variados, que tempos depois se tornou uma função atribuída aos

curandeiros (SIMÕES; SCHENKEL; SIMON, 2001 apud FIRMO et al., 2011).

No século XIX, com o advento das descobertas científicas relacionadas a

diversas condições patológicas, a indústria pôde se dedicar a fabricação de produtos

farmacêuticos sintéticos que fossem capazes de produzir os efeitos desejáveis em

curto espaço de tempo. Nesse aspecto, a indústria farmacêutica obteve seu apogeu,

produzindo e comercializando uma variedade de medicamentos, com cores,

tamanhos e sabores diferentes, que satisfaziam as necessidades de saúde da

população nos casos em que a medicina tradicional ainda não havia alcançado,

proporcionando assim, uma associação do avanço tecnológico ao conhecimento

popular (FRANÇA et al., 2008).

No panorama contemporâneo, as plantas têm sido usadas como matéria-

prima para a fabricação de fitoterápicos e outros medicamentos. Além de seu uso

como substrato para a fabricação de medicamentos, as plantas são também

utilizadas em práticas populares e tradicionais como remédios caseiros e

comunitários, constituindo um conjunto de conhecimentos, habilidades e práticas

baseado em teorias, crenças e experiências de diferentes culturas, utilizadas na

manutenção, prevenção, diagnóstico ou tratamento de doenças físicas e mentais,

processo conhecido como medicina tradicional (WHO, 2005).

No âmbito das políticas de saúde, referência à importância das plantas

medicinais já era preocupação da Organização Mundial de Saúde quando, na

Conferência Internacional sobre Cuidados Primários de Saúde em Alma-Ata (1978),

recomendou que os governos formulassem mecanismos para incorporar os

remédios tradicionais de eficiência comprovada junto à população, em seus

diferentes níveis de cuidados primários de saúde (OMS, 1979).

26

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Anos após, oriundas de intensas discussões promovidas na 1ª. Conferência

Nacional de Vigilância Sanitária (2001), na 1ª. Conferência Nacional de Assistência

Farmacêutica (2003), na 2ª Conferência Nacional de Ciência, Tecnologia e Inovação

em Saúde (2004) e nas Conferências Nacionais de Saúde, as Práticas Integrativas e

Complementares surgiram no escopo das políticas de saúde brasileiras,

corroborando para que a atenção à saúde estivesse pautada nos princípios

doutrinários e operacionais do SUS, dando ênfase à humanização e à integralidade,

viabilizando-se pelas diferentes abordagens de prevenção, promoção e reabilitação

da saúde, cujas práticas se dão no campo da integração e da complementaridade

das demais ações já existentes (BRASIL, 2006a).

Considerando as práticas populares existentes no país e sua crescente

legitimação social, bem como as demandas emergentes das organizações

governamentais e não-governamentais brasileiras relacionadas à saúde coletiva, o

Ministério da Saúde iniciou o processo de construção de uma política que tornasse

viável desenvolver práticas de saúde já executadas em vários pontos do país e do

mundo, mas até o momento presente desprovidas de diretrizes específicas (BRASIL,

2006a).

Resultado de inúmeros estudos e diagnósticos situacionais realizados em

âmbito nacional, após 3 anos de trabalho, foi publicada, na forma das portarias

ministeriais n°971, de 3 de maio de 2006, e n°1.600, de 17 de julho de 2006, a

Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no SUS (PNPIC), cujo

documento atende também às diretrizes e recomendações de várias Conferências

Nacionais de Saúde e às recomendações da OMS (BRASIL, 2006a).

Em sua abordagem mais ampla, a PNPIC visa estimular os mecanismos

naturais de prevenção de agravos e recuperação da saúde por meio de tecnologias

eficazes e seguras, com ênfase no acolhimento, escuta ativa, estabelecimento de

vínculo terapêutico e na integração do ser humano com seu meio social, a fim de

consolidar a compreensão ampliada do processo saúde-doença e promover o

autocuidado, de forma ajustada aos hábitos e costumes da população (BRASIL,

2006a).

Por ter sido verificada como a prática integrativa de maior predominância

entre os municípios e estados brasileiros (BRASIL, 2006a), a fitoterapia merece

destaque dentre as práticas integrativas e complementares na atenção à saúde,

27

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especialmente no tocante aos achados já elucidados no Brasil nas últimas décadas,

além das potencialidades dos estudos em desenvolvimento quanto à utilização de

plantas próprias da flora brasileira na elaboração de produtos bioativos, com

propriedades farmacológicas terapêuticas, que podem contribuir para o tratamento,

prevenção e promoção da saúde coletiva.

O Brasil possui potencial e oportunidades para desenvolvimento do setor,

uma vez que além do conhecimento tradicional associado às plantas medicinais, da

tradição de uso pela população, da rica diversidade de espécies vegetais, da grande

sócio-diversidade, possui infra-estrutura tecnológica para o desenvolvimento de

produtos oriundos da biodiversidade brasileira com vistas à ampliação do acesso da

população a serviços e produtos, assim como a redução da dependência tecnológica

de insumos farmacêuticos.

Nesse sentido, o uso de plantas medicinais e de seus metabólitos como fonte

de produtos terapêuticos tem sido objeto de larga aceitação e interesse por parte

dos estudiosos da área de saúde, desencadeando uma intensa produção acadêmica

com resultados obtidos em pesquisas pré-clínicas e posteriormente clínicas,

originando diversos produtos farmacêuticos já disponíveis no mercado, com alcance

nas áreas da terapêutica, alimentos e cosmética.

Compreende-se por fitoterápico qualquer medicamento que tenha sido

produzido exclusivamente de constituintes ativos vegetais, que podem ser extratos,

tinturas, óleos, ceras, exsudatos, sucos (ALMEIDA; MORAIS; OLIVEIRA, 2011), cuja

eficácia e segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos,

documentações tecno-científicas ou evidências clínicas (BRASIL, 2010a), sendo

regulamentados no Brasil por meio de Portarias, Resoluções de Diretoria Colegiada

(RDC) e outros dispositivos regulatórios. Podem ser industrializados ou

manipulados, sendo os primeiros produzidos em indústrias farmacêuticas e com

registro na Agência Nacional de Vigilância Santitária (ANVISA) antes de serem

comercializados.

O Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, que aprova a Política Nacional

de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, tem como finalidade primordial garantir o

acesso da população a esses produtos, porém, de maneira segura, pautada no uso

racional, preservando a biodiversidade e ao mesmo tempo incrementando a

produção industrial nacional (BRASIL, 2006b). Outro dispositivo, a RDC 14/10, de 31

28

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de março de 2010, dispõe sobre o registro dos mesmos junto a ANVISA (BRASIL,

2010b), a fim de garantir os três requisitos essenciais (qualidade, eficácia e

segurança), juntamente com a RDC 17/10, de 16 de abril de 2009, que autoriza os

laboratórios farmacêuticos a produzirem os fitoterápicos.

Há ainda documentos legais relacionados à produção, testagem e

venda/disponibilização de fitoterápicos no Brasil; regulamento sobre as bibliografias

que devem ser consultadas para avaliação da segurança e eficácia dos fitoterápicos;

normas para elaboração das bulas dos produtos; aspectos da rotulagem dos

medicamentos; normas sobre a avaliação da estabilidade dos produtos; dispositivos

que regulam o processo de inspeção de órgãos fabricantes de fitoterápicos e outras

normativas que sejam oportunas para ampliar as ações de eficácia, segurança e

qualidade dos medicamentos fitoterápicos (BRASIL, 2010c).

Com todo esse aparato legal, busca-se o controle dos fitoterápicos produzidos

e comercializados no país, primando-se pela qualidade, eficácia e segurança, além

de viabilizar rápida detecção dos problemas e possíveis reações indesejáveis

relacionadas à utilização inadequada dos mesmos pela população.

Dentre os principais fitoterápicos com registro na ANVISA, alguns apresentam

efeitos sobre o Sistema Nervoso Central, exercendo grande importância sobre o

tratamento e a prevenção de algumas psicopatologias. Dentre os mais conhecidos,

pode-se citar: Ginkgo biloba L., extraído da árvore de ginkgo, que abriga

propriedades anticoagulantes, antioxidantes, neuroprotetora, sendo utilizado no

tratamento da demência, vasculopatia e Mal de Alzheimer; Hypericum perforatum L.,

conhecido como erva-de-são-joão ou hipérico, tem sido utilizado como

antidepressivo; Matricaria recutita L., que tem como nomes populares a camomila,

camomila-alemã, marcela-nobre e matricaria, que é utilizada no tratamento da

ansiedade, insônia e enjôo; Melissa officinalis L., conhecido como melissa, erva-

cidreira ou melissa-romana, possui efeito ansiolítico e sedativo; Panax ginseng C. A.

Mey., que age na doença neurodegenerativa, demência senil, mal de Parkinson,

câncer, diabetes, processos inflamatórios e deficiência imunológica, tendo ainda

demonstrado efeito antinociceptivo; Passiflora incarnata L., conhecido pelo seu fruto,

o maracujá, tem propriedades ansiolíticas, prolonga o período de sono e eleva o

limiar nociceptivo; Paullinia cupana H.B. & K, conhecido como guaraná, que produz

efeito estimulante, afrodisíaco, broncodilator e diurético; e Piper methysticum G.

29

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Forst., conhecido como kava-kava, que possui ação ansiolítica, relaxante e sedativa

(ALMEIDA; MORAIS; OLIVEIRA, 2011).

É valioso mencionar que, dentre a diversidade botânica existente no Brasil e

no mundo, algumas plantas conseguem se destacar pelo seu poder terapêutico,

verificado quando extraídas suas propriedades metabólicas. Além disso, esses

produtos, por apresentarem rápida resposta farmacológica e poucas reações

indesejáveis, fazem com que seu uso seja incentivado, em substituição à terapêutica

alopática. Desse modo, é crescente a pesquisa no campo das plantas medicinais,

buscando-se isolar constituintes ativos presentes em seus extratos para a

formulação de fitoterápicos e fitofármacos, tornando crescente o interesse nesta

área por parte da comunidade acadêmica e das companhias farmacêuticas

(CALIXTO, 2005).

Com o intuito de estabelecer a diferença entre fitoterápico e fitofármaco, a

ANVISA publicou a nova Resolução de Diretoria Colegiada (RDC Nº 24/2011), na

qual estabelece por fitofármaco a substância purificada e isolada a partir de matéria-

prima vegetal com estrutura química definida e atividade farmacológica. É utilizada

como ativo em medicamentos com propriedade profilática, paliativa ou curativa. Não

são considerados fitofármacos compostos isolados que sofram qualquer etapa de

semi-síntese ou modificação de sua estrutura química (BRASIL, 2011a). Com esta

nova RDC, a ANVISA cria a categoria de medicamentos específicos, que não era

prevista na RDC Nº 48/2004, a qual define fitoterápico o medicamento obtido

empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado

pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela

reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança são

validadas através de levantamentos etnofarmacológicos de utilização,

documentações tecno-científicas em publicações ou ensaios clínicos fase 3. Com

base nessa definição, não se considera medicamento fitoterápico aquele que, na

sua composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem as

associações destas com extratos vegetais (BRASIL, 2004), nos quais os

medicamentos a base de fitofármacos estão contemplados.

Com esta nova legislação, os fitofármacos passam a constituir uma nova

proposta para a terapêutica de doenças antes tratadas unicamente pelos

medicamentos sintéticos, pois apresentam o mesmo rigor exigido para os demais

30

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medicamentos comercializados no país, uma vez que sua indicação terapêutica

deve ser oriunda de relatório de segurança e eficácia verificadas em estudos pré-

clínicos e clínicos (BRASIL, 2011a).

Nesse contexto, considerando diversa e pouco explorada, a flora brasileira

detém inúmeras espécies vegetais que vem sendo investigadas e utilizadas para a

produção de fitofármacos. Como exemplo, as plantas aromáticas, cujas

propriedades farmacológicas são observadas destacadamente em seus óleos

essenciais, os quais são largamente utilizados na indústria cosmética, devido ao seu

agradável aroma, baixo custo e disponibilidade em diversos vegetais, porém, ainda

em pequena escala na indústria farmacêutica.

Contudo, os óleos essenciais também vêm sendo estudados quanto às suas

possíveis propriedades antiinflamatórias, analgésicas, antioxidantes e outras.

Resultantes da extração, isolamento e purificação desses óleos, seus constituintes

são objeto de estudo de variados laboratórios de farmacologia no país e no exterior,

conforme pode ser verificado através das publicações científicas realizadas pelos

cientistas destas instituições.

2 Ansiedade e ansiolíticos: dos sintéticos aos produtos naturais

Cotidianamente, a ansiedade é tida como uma manifestação natural humana

frente a situações especiais. Denominada de ansiedade fisiológica, funciona como

mecanismo biológico contra ameaças à sobrevivência, modulando o funcionamento

cognitivo. Quando ocorre de maneira extrema, persistente, clinicamente

reconhecível e com interferência em funções pessoais, classifica-se como

Transtorno de Ansiedade (TA), apresentando como manifestações clínicas os sinais

sistêmicos (sudorese, taquicardia, medo e insônia) e cognitivos (apreensão,

nervosismo, irritabilidade e desatenção) (OMS, 1993).

Os TA são subdivididos em categorias, segundo a Classificação de

Transtornos Mentais e de Comportamento da CID-10 (OMS, 1993) e o Manual

Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais - Texto revisado [DSM-IV-TR]

(AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION - APA, 2002), dentre as quais

destacam-se: fobias sociais; transtorno de pânico; transtorno de ansiedade

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generalizada (TAG); transtorno obsessivo-compulsivo e transtorno de estresse pós-

traumático, daí as denominações gerais de Transtornos neuróticos, relacionados ao

estresse e somatoformes (CID-10) ou Transtornos de ansiedade (DSM-IV-TR).

Tanto o DSM-IV-RT (2002) como a CID-10 (1993) definem os TA através de

critérios definidos, garantindo assim, a formulação de diagnósticos mais precisos e

confiáveis. Um diagnóstico adequado é importante não só para o planejamento da

intervenção terapêutica como também para a condução de pesquisas que visam

compreender melhor estas condições. O Quadro 1 expõe de maneira mais

detalhada, a classificação dos TA e suas categorias.

Quadro 1. Classificação dos Transtornos de Ansiedade.

Transtornos neuróticos, relacionados ao

estresse e somatoformes (CID - 10)

Transtornos de ansiedade

(DSM - IV - TR)

F40 Transtornos fóbico-ansiosos

F40.0 Agorafobia

F40.1 Fobias sociais

F40.2 Fobias específicas (isoladas)

F40.8 Outros transtornos fóbico-ansiosos

F40.9 Transtorno fóbico-ansioso, não

especificado

300.01 Transtorno de Pânico sem

Agorafobia

300.21 Transtorno de Pânico com

Agorafobia

300.22 Agorafobia sem Histórico de

Transtorno de Pânico

300.29 Fobia Específica

300.23 Fobia Social

300.3 Transtorno Obsessivo-

Compulsivo

309.81 Transtorno de Estresse Pós-

Traumático

308.3 Transtorno de Estresse Agudo

300.02 Transtorno de Ansiedade

Generalizada

293.83 Transtorno de Ansiedade

Devido a ... [Indicar a Condição Médica

Geral]

F 41 Outros transtornos de ansiedade

F41.0 Transtorno de pânico

F41.1 Transtorno de ansiedade generalizada

F41.2 Transtorno misto de ansiedade e

depressão

F41.3 Outros transtornos mistos de ansiedade

F41.8 Outros transtornos de ansiedade

especificados

F41.9 Transtorno de ansiedade, não especificado

Fonte: OMS, 1993; WHO, 2002.

Os transtornos de ansiedade estão entre os transtornos mentais mais

variados, gerando conseqüências diversas nos acometidos, com impacto

32

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considerável na qualidade de vida. Com uma ocorrência global de 16,6%, os TA

estão entre os transtornos mentais mais comuns e uma das principais causas de

incapacidade funcional (SOMERS et al., 2006). Dentre os TA, a TAG constitui o

grupo de maior prevalência de casos, conforme verificado nos dois únicos estudos

epidemiológicos relacionados à temática desenvolvidos no Brasil (MARI; JORGE;

KOHN, 2007).

No TAG, o aspecto essencial é a ansiedade, a qual é generalizada e

persistente, mas não restrita a circunstâncias ambientais em particular. Os sintomas

mais presentes são o nervosismo, tremores, tensão muscular, sudorese,

palpitações, tonturas e desconforto epigástrico, onde expressões de medo são

frequentemente verbalizadas, acompanhadas de pressentimentos (OMS, 1993).

Nesta condição, o indivíduo considera difícil controlar a preocupação, assim como

evitar que esta interfira nas tarefas que precisam ser realizadas (APA, 2002).

Os benzodiazepínicos e os ansiolíticos não benzodiazepínicos, tais como a

buspirona, têm sido o pilar para o tratamento dos TA. Como a ansiedade

generalizada tende a ser uma condição crônica, o tratamento farmacológico é muitas

vezes necessário e o uso pode durar muitos anos. Isto levanta a preocupação com a

utilização de benzodiazepínicos, uma vez que estes compostos podem estar

associados a riscos de abuso e dependência (SCHMITT et al., 2005).

Os benzodiazepínicos, a exemplo o diazepam e o clonazepam, possuem

efeitos colaterais como sedação, amnésia, dependência, síndrome de abstinência e

interações com agentes depressores do SNC (ANDREATINI; BOERNGEN-

LACERDA; ZORZETTO FILHO, 2001). Já a buspirona é desprovida de riscos

associados à dependência; no entanto, tem um espectro mais limitado de eficácia e

atraso no início da ação, quando comparada a outros tratamentos (SCHMITT et al.,

2005). Além disso, pode mostrar-se ineficaz em algumas situações, além da possível

demora para o início da ação e insatisfação por parte dos usuários (MARTIN, 1998).

Os antipsicóticos, outro grupo também utilizado em alguns casos de TA,

podem promover o desenvolvimento de parkinsonismo e hiperprolactinemia, além de

apresentar riscos a longo prazo, como discinesia tardia e síndromes metabólicas

(BALLENGER, 1999). Já os antidepressivos utilizados, como venlafaxina, paroxetina

e imipramina, apresentam alta prevalência de não adesão ao tratamento e podem

causar disfunção sexual (TONELLI; ANDREATINI, 2000). Por outro lado, os anti-

33

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histamínicos, fármacos inespecíficos para o controle da ansiedade, porém utilizados

em alguns casos, são fortemente relacionados com sedação (ANDREATINI;

BOERNGEN-LACERDA; ZORZETTO FILHO, 2001).

Com tais considerações, fitoterápicos e fitofármacos estão sendo cada vez

mais o alvo das pesquisas no campo da farmacoterapia da ansiedade e de outros

transtornos psiquiátricos, haja vista que um dos fatores motivadores desta

preferência tem sido a preocupação com os efeitos adversos ocasionados pelas

drogas sintéticas atuais (FAUSTINO; ALMEIDA; ANDREATINI, 2010), que são

muitas vezes consumidas de maneira abusiva ou incorreta (RATES, 2001).

Outros motivos que disparam a procura por drogas vegetais como recurso

terapêutico em substituição às drogas sintéticas disponíveis no comércio tem sido a

insatisfação com os resultados obtidos com estes medicamentos, a dificuldade de

acesso a eles e a crença de que o natural é desprovido de efeitos indesejáveis

(RATES, 2001).

Frente à dinâmica neuronal bastante complexa, diversos neurotransmissores

envolvem-se na etiopatologia dos TA. O primeiro neurotransmissor apontado como

agente primordial na ansiedade foi o ácido -aminobutírico (GABA). O GABA é o

neurotransmissor inibidor primário do SNC presente no Sistema Límbico, capaz de

atenuar as reações serotoninérgicas responsáveis pela ansiedade (Figura 1).

Figura 1. Representação esquemática do receptor GABAA. Fonte: STUART et al., 2009.

Ao se combinar com o receptor, o neurotransmissor GABA altera-lhe a

conformação e essa deformação transmite-se ao canal de Cl (Cloro), abrindo-o. Em

conseqüência, íons Cl penetram na célula, onde sua concentração é menor que no

34

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exterior. Com isso, ocorre uma hiperpolarização da membrana pós-sináptica que

inibe os disparos do neurônio pós-sináptico por dificultar a despolarização de sua

membrana, necessária à geração de impulso nervoso (STUART et al., 2009).

Ao se combinarem com seus receptores, os benzodiazepínicos produzem

uma deformação que afeta o receptor GABA, tornando-o mais apto a receber esse

neurotransmissor. Em decorrência de sua maior afinidade com seu receptor, o

neurotransmissor GABA tem sua ação ampliada, passando a ativar com mais

facilidade os canais de Cl. Assim, sob a ação de benzodiazepínicos, o GABA é

potencializado e a atividade inibitória aumentada (STUART et al., 2009), reduzindo a

ansiedade.

Entretanto, já são conhecidas outras vias envolvidas no mecanismo

ansiogênico-ansiolítico, que incluem a serotoninérgica, noradrenérgica,

glutamatérgica e neuroendócrinas [eixo hipotálamo-pituitária-adrenal e fator de

liberação de corticotrofina], daí o surgimento de novas classes de fármacos com

ação ansiolítica e mecanismos de ação diferentes dos BZD (KENT; MATHEW;

GORMAN, 2002), conforme ilustrado no Quadro 2.

Quadro 2. Mecanismos de ação e efeitos adversos de algumas drogas utilizadas no tratamento da ansiedade.

DROGA MECANISMO DE AÇÃO EFEITOS ADVERSOS

Ansiolíticos

BZD Bloqueio dos receptores GABAA sedação, dependência, abstinência

Azapirona

(Buspirona)

Bloqueio dos receptores 5-HT1A nervosismo, tontura, cefaléia

Antidepressivos

Imipramina ADT Cardiotoxicidade

Fenelzina IMAO visão turva, constipação, mania

Fluoxetina ISRS náusea, vômito, agitação

Antipsicóticos

Haloperidol Bloqueio dos receptores D2-símile Parkinsonismo,hiperprolactinemia

BZD= benzodiazepínicos; ADT= antidepressivo tricíclico; IMAO=inibidor da monoamina oxidase; ISRS=inibidor seletivo da reabsorção da serotonina Fonte: PAGE et al., 1999.

É importante ressaltar que, além do mecanismo de ação diversificado e dos

efeitos adversos gerados por cada classe de fármaco, estes ainda são mais ou

35

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


menos indicados para o tratamento de subtipos específicos de transtornos de

ansiedade, como por exemplo, a Buspirona no TAG, os ADT e os ISRS no

transtorno de pânico e os IMAO no transtorno de estresse pós-traumático. Os BZD

são mais indicados para o tratamento dos transtornos ansiosos de curta duração

(PAGE et al., 1999).

Nessa seara, estudos pré-clínicos e clínicos têm sido desenvolvidos com o

intuito de descobrir novas formulações farmacêuticas para o tratamento dos

transtornos de ansiedade, em especial, da ansiedade generalizada (FAUSTINO;

ALMEIDA; ANDREATINI, 2010), revelando-se as plantas medicinais como um

grande potencial para estas descobertas, com o intuito de que sejam desprovidas de

efeitos indesejáveis, mas que tenham igual ou melhor eficácia do que os sintéticos.

Quanto aos estudos pré-clínicos, diversas plantas aromáticas e seus

derivados já foram revelados pela comunidade científica como detentores de

atividade ansiolítica, conforme pode ser verificado ao efetuar buscas nas bases de

dados nacionais e internacionais. São resultados de experimentos que envolvem

óleos essenciais, extratos ou constituintes isolados da matéria vegetal de diversas

plantas, que serão detalhados a seguir.

A revisão sistemática da literatura na busca de estudos pré-clínicos

envolvendo plantas medicinais ou seus compostos bioativos com potencial

ansiolítico foi desenvolvida utilizando os critérios: estudos com plantas cultivadas no

Brasil e comparativos com placebo ou droga padrão e as palavras de busca

“anxiety”, “ansiolytic”, “ansiolytic effect”, “extract”, “essential oil”, “monoterpene”,

“animal models” e “rodents”. Os artigos foram localizados a partir de busca eletrônica

em bases de dados (PubMed e SciELO Brazil). Como resultados da investigação, 28

artigos científicos apresentaram plantas cujos óleos, extratos ou constituintes

secundários apresentaram atividade ansiolítica em modelos animais (Quadro 3).

Estudos com óleos essenciais apontaram atividade ansiolítica das espécies

Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (COSTA et al., 2011), Citrus sinensis (L.) Osbeck

(FATURI et al., 2010), Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt & Smith (DE ARAÚJO et al.,

2009), Citrus aurantium L. (PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006) e Lippia Alba (Mill)

N. E. Brown (HATANO et al., 2012).

Estudos com extratos hidro-alcoólicos apontaram atividade ansiolítica nas

espécies Erythrina mulungu Mart. ex Benth (ONUSIC et al., 2002; RIBEIRO et al.,

36

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2006), Achillea millefolium L. (BARETTA et al., 2012), Erythrina velutina Willd

(RAUPP et al., 2008), Passiflora quadrangularis L. (DE CASTRO et al., 2007),

Kielmeyera coriácea Mart. (AUDI et al., 2002) e Cissus sicyoides L. (DE ALMEIDA et

al., 2009).

Quadro 3. Modelos animais de ansiedade dos estudos pré-clínicos com produtos naturais.

Espécie Material

Vegetal

Modelo

Experimental

Autores

T

L

C

E

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P

P

T

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C

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C

A

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R

O

Rauvolfia ligustrina Willd. ex

Roem. & Schult.

EE X X Mendonça Neto et al.,

2009

Erythrina mulungu Mart. ex Benth EHA X X X Onusic et al., 2002;

Ribeiro et al., 2006

Bellis perennis L. EE X Marques; Melo; Freitas,

2012

Bauhinia platypetala Benth. ex

Hemsl.

EE X X Dos Santos et al., 2012

Passiflora actinia Hooker EM X Dos Santos et al., 2006

-- Florais

de Bach

X De-Souza et al., 2006

Hydrocotyle umbellata L. EE X X Rocha et al., 2011

Discaria americana Gillies & Hook EM X Da Silva et al., 2012

Hibiscus tiliaceus L. EM X Vanzella et al., 2012

Pimenta pseudocaryophyllus

(Gomes) L. R. Landrum

EE X X Fajemiroye et al., 2012

Achillea millefolium L. EHA X X X Baretta et al., 2012

Justicia pectoralis Jacq. EP X X X Venâncio et al., 2011

Erythrina velutina Willd EHA X Raupp et al., 2008

EHA=extrato hidro-alcoólico; EM=extrato metanólico; EA=extrato aquoso; EE=extrato etanólico; EP=extrato padronizado; OE=óleo essencial; CI=composto isolado; TLCE=teste do labirinto em cruz elevado; TCA=teste de campo aberto; TTCE=teste de transição claro-escuro; TPP=teste da placa perfurada. Fonte: PubMed, ScieLO (2013)

37

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Quadro 3. Modelos animais de ansiedade dos estudos pré-clínicos com produtos naturais.

(cont.)

Espécie Material

Vegetal

Modelo

Experimental

Autores

T

L

C

E

T

P

P

T

T

C

E

T

C

A

O

U

T

R

O

Passiflora quadrangularis L. EHA X X X De Castro et al., 2007

Hypericum perforatum L. EP X Beijamini; Andreatini, 2003

Kielmeyera coriacea Mart. EHA X X Audi et al., 2002

Não especificado CI

(carvacrol)

X X Melo et al., 2010

Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt &

Smith

OE X De Araújo et al., 2009

Citrus aurantium L. OE X X Pultrini;Galindo;Costa,2006


(epóxi-

limoneno)

X X De Almeida et al., 2012


(linalol)

X X Souto-Maior et al., 2011


(1,4-cineol)

X X X Gomes et al., 2010


(isopulegol)

X X X Silva et al., 2007

Lippia alba (Mill.) N.E. Brown OE + CI

(carvona)

X Hatano et al., 2012


(linalol)

X Linck et al., 2010

Citrus sinensis (L.) Osbeck OE X X Faturi et al., 2010

Cymbopogon citratus (DC) Stapf OE X X Costa et al., 2011

Cissus sicyoides L. EHA X X De Almeida et al., 2009

EHA=extrato hidro-alcoólico; EM=extrato metanólico; EA=extrato aquoso; EE=extrato etanólico; EP=extrato padronizado; OE=óleo essencial; CI=composto isolado; TLCE=teste do labirinto em cruz elevado; TCA=teste de campo aberto; TTCE=teste de transição claro-escuro; TPP=teste da placa perfurada. Fonte: PubMed, ScieLO (2013).

38

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Atividade ansiolítica de extratos etanólicos foi verificada em trabalhos que

utilizaram as espécies Rauvolfia ligustrina Willd. ex Roem. & Schult. (MENDONÇA

NETO et al., 2009), Bellis perennis L. (MARQUES; MELO; FREITAS, 2012),

Bauhinia platypetala Benth. ex Hemsl. (DOS SANTOS et al., 2012), Hydrocotyle

umbellata L. (ROCHA et al., 2011), Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) L. R.

Landrum (FAJEMIROYE et al., 2012).

Alguns estudos avaliaram a atividade ansiolítica dos extratos metanólicos

das espécies Passiflora actinia Hooker (DOS SANTOS et al., 2006), Discaria

americana Gillies & Hook (DA SILVA et al., 2012), Hibiscus tiliaceus L. (VANZELLA

et al., 2012).

Extratos padronizados também foram investigados quanto ao potencial

ansiolítico das espécies Justicia pectoralis Jacq. (VENÂNCIO et al., 2011) e

Hypericum perforatum L. (BEIJAMINI; ANDREATINI, 2003).

É importante mencionar ainda um estudo que verificou o potencial ansiolítico

dos Florais de Bach em camundongos machos da linhagem Swiss (De-SOUZA et

al., 2006). Considera-se este um achado importante, uma vez que os Florais de

Bach são largamente utilizados em mais de 50 países e aprovados pela OMS desde

o ano de 1956 (MANTLE apud De-SOUZA et al., 2006), mesmo sem elucidação

prévia quanto ao seu mecanismo de ação terapêutica ou de isolamento de

substâncias químicas que expliquem seus efeitos terapêuticos.

Quanto aos compostos bioativos, alguns estudos buscaram isolar os

componentes que poderiam estar funcionando como o principal agente ansiolítico

dos extratos que apresentaram a atividade, enquanto que outros trabalhos

resumiram-se a identificar os componentes majoritários dos extratos estudados.

Entretanto, alguns trabalhos com compostos especiais, especialmente os terpenos,

tem sido investigados e revelado potencial ansiolítico em estudos com modelos

experimentais.

Estudos com monoterpenos, diterpenos e sesquiterpenos revelaram o

potencial ansiolítico destes compostos das plantas aromáticas. Foi encontrada na

literatura pesquisada a atividade ansiolítica dos terpenos carvacrol (MELO et al.,

2010), epóxi-limoneno (DE ALMEIDA et al., 2012), óxido de linalol (SOUTO-MAIOR

et al., 2011; LINCK et al., 2010), 1,4-cineol (GOMES et al., 2010), isopulegol (SILVA

et al., 2007), entretanto, sem registros de estudos posteriores (ensaios clínicos).

39

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Contrariamente aos estudos pré-clínicos, poucos estudos clínicos

conseguiram evidenciar propriedades ansiolíticas de produtos naturais investigads.

Algumas destas, encontradas na literatura nacional e internacional, apresentam

limitações quanto ao desenho metodológico adotado, número reduzido de

participantes e outros fatores que podem deixar dúvidas quanto à validade dos

resultados apresentados, segundo crivo dos autores (FAUSTINO; ALMEIDA;

ANDREATINI, 2010).

A revisão sistemática da literatura na busca de estudos clínicos envolvendo

plantas medicinais com potencial ansiolítico foi desenvolvida (FAUSTINO; ALMEIDA;

ANDREATINI, 2010), sendo adotados os seguintes critérios: estudos randomizados,

comparativos com placebo ou droga padrão e duplo-cegos, sobre a utilização de

plantas medicinais ou medicamentos fitoterápicos. Os artigos foram localizados a

partir de busca eletrônica em bases de dados (Medline, Web of Science, Cochrane e

SciELO). Como resultados da investigação, sete artigos científicos apresentaram as

plantas Piper methysticum G. Forst (kava-kava), Passiflora incarnata L. (maracujá),

Valeriana officinalis L. (valeriana), Ginkgo biloba L., Galphimia glauca Cav. e

Matricaria recutita (camomila) como eficazes no tratamento da ansiedade.

Dois estudos utilizaram o extrato de kava-kava nas investigações, onde o

primeiro (CONNOR; DAVIDSON, 2002) apresentou melhor efeito do grupo placebo

sobre o grupo teste, além de não ter apresentado dados sobre o grupo padrão, o

que põe em dúvida os resultados apresentados. O outro estudo (BOERNER et al.,

2003), comparou o extrato com as drogas-padrão opipramol e buspirona, revelando

ausência estatística entre os grupos. A limitação deste estudo foi a ausência do

grupo placebo, o que dificulta uma melhor validação dos resultados evidenciados.

O estudo que utilizou o extrato de Passiflora incarnata L. foi comparado com

oxazepam (AKHONDZADEH et al., 2001). Os resultados apontaram ausência

estatística entre os grupos, revelando efeito ansiolítico. Entretanto, a ausência do

grupo placebo constituiu fator limitante do estudo, além do pequeno tamanho da

amostra (16 participantes por grupo).

No estudo que investigou o extrato de Valeriana officinalis L. (ANDREATINI et

al., 2002), comparou-se o extrato com o placebo e com o diazepam, onde os grupos

apresentaram resultados similares, o que não deixa claro o efeito ansiolítico do

40

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


extrato. Outro fator limitante do estudo foi o pequeno número de participantes (12

por grupo).

As investigações sobre o Ginkgo biloba L. resultaram da comparação do seu

extrato padronizado com o placebo (WOELK et al., 2007). Os resultados apontaram

melhor efeito do extrato quando comparado ao placebo, entretanto, não foi possível

comparar seu efeito com alguma droga padrão, o que torna o estudo carente de

novos testes.

Investigação com Galphimia glauca Cav. foi realizado, comparando-se o

extrato ao lorazepam (HERRERA-ARELLANO et al., 2007), onde não foram

encontradas diferenças estatísticas entre os grupos, revelando seu potencial

ansiolítico. A ausência do grupo placebo foi um aspecto limitante do estudo.

A camomila foi investigada ao comparar seu extrato padronizado com placebo

(AMSTERDAM et al., 2009). Os resultados apontaram diferenças estatísticas entre

os grupos, indicando potencial ansiolítico. Entretanto, a ausência da droga padrão e

o número de participantes (28 por grupo) foram aspectos limitantes do estudo.

Uma investigação utilizando o fitoterápico composto por CPV (extrato seco de

Crataegus oxyacantha L., Passiflora incarnata L. e Valeriana officinalis L.) em

animais de laboratório evidenciou sua atividade ansiolítica nos animais submetidos

ao teste do labirinto em cruz elevado, ratificando os efeitos manifestos por estas

plantas, quando analisadas separadamente (TABACH; MATTEI; CARLINI, 2009).

3 Considerações sobre Myrtus communis L. e o monoterpeno (-)-mirtenol

Myrtaceae (do grego Myrtus = perfume) é uma família botânica com cerca de

145 gêneros e mais de 3650 espécies de árvores e arbustos que se distribuem por

todos os continentes (DAHLGREN; THORNE, 1984 apud DONATO; DE

MORRETES, 2007).

No Brasil existem 23 gêneros e cerca de 1.000 espécies de Myrtaceae. No

Brasil, a família Myrtaceae compreende diversos gêneros de árvores e arbustos que

podem ser utilizados de forma ornamental ou na produção comercial de frutos.

Nesta classificação estão inclusas a goiaba, a pitanga e a jabuticaba (DELGADO,

2006 apud CONCEIÇÃO; ARAGÃO, 2010).

41

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Myrtus communis L. (Figura 2) é uma planta arbustiva aromática procedente

da região mediterrânica da Europa, que possui flores e frutos (Figura 3), sendo muito

cultivada mundialmente. Pertencente à família Myrtaceae, é conhecida

popularmente como “murta-comum” ou “mirta”; o seu habitat preferencial é xerofílico

(seco), podendo ser encontrada em diversas regiões do Brasil, tradicionalmente

utilizada como medicamento no sul do país, onde suas folhas são empregadas no

tratamento de problemas estomacais (SALVAGNANI et al., 2008).

Figura 2. Myrtus communis L. Fonte: ÖZKAN; GÜRAY, 2009

A mirta é amplamente utilizada em parques, jardins e vias públicas (DE

AZEREDO; RODRIGUES; CASSINO, 2004) e, por apresentar em sua composição

química monoterpenos, diterpenos, cetonas e alcoóis, pode ser considerada como

uma potencial riqueza em exploração pela indústria farmacêutica.

Figura 3. Flores (A) e frutos (B) de mirta. Fonte: http://www.florestar.net/murta/murta.html

(A) (B)

http://www.florestar.net/murta/murta.html

42

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Diversas indicações medicinais tradicionais estão atribuídas à mirta. Textos

médicos egípcios já referiam seu uso como remédio para desordens urinárias,

dores, azia, inchaços e expectorante. Na Grécia, era utilizada como contraceptivo,

através da aplicação de uma pasta no colo do útero com o intuito de bloquear a

passagem dos espermatozóides, sendo denominada de “remédio anti-fertilidade”.

Em Roma, há relatos de uso da mirta como constipante e como remédio para

diarréia, além de ser componente na confecção de vinhos. Na Turquia, era utilizada

contra queixas respiratórias, picadas de aranhas venenosas e escorpiões,

inflamações intestinais e problemas menstruais (ÖZKAN; GÜRAY, 2009).

Quanto aos estudos científicos, diversas são as atividades farmacológicas

identificadas com a mirta. Suas propriedades antibacterianas foram verificadas em

estudos in vitro contra as formas Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella aerogenes,

Salmonella typhi e Shigiella (ALEM et al., 2008); o óleo essencial contra Escherichia

coli, Staphylococcus aureus e Candida albicans (YADEGARINIA et al., 2006),

Mycobacterium tuberculosis (ZANETTI et al., 2010) e Helicobacter pylori (DERIU et

al., 2007); o extrato metanólico contra Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus,

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,

Listeria monocytogenes [bactérias Gram positivas] e Escherichia coli, Proteus

vulgaris, Pseudomonas aeruginosa e Campylobacter jejuni [bactérias Gram

negativas] (MANSOURI et al., 2001) e o extrato aquoso contra Pseudomonas

aeruginosa (AL-SAIMARY, 2002).

As propriedades antifúngicas contra Aspergillus (MOHAMMADI et al., 2008),

antiinflamatórias (AL-HINDAWI et al., 1989; FEISST et al., 2005), antioxidantes

(AMENSOUR et al., 2010; MONTORO et al., 2006; MIMICA-DUKIC et al., 2010) e

contra Trichomonas vaginallis (MAHDI; GANY; SHARIEF, 2006) também foram

verificadas.

Ainda há registros científicos do efeito protetor de mirta contra a

hipercolesterolemia (ROSA et al., 2008), hiperglicemia (ELFELLAH; AKHTER;

KHAN, 1984; SEPICI et al., 2004; SEPICI-DINCEL et al., 2007; BENKHAYAL et al.,

2009) e úlcera gástrica (SUMBUL et al., 2010) em animais de laboratório, atividades

anticancerígena (TRETIAKOVA et al., 2008) e antimutagênica (HAYDER et al.,

43

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2003; 2008), além de exercer efeito protetor contra a estomatite aftosa (BABAEE et

al., 2010) em pacientes tratados com uma pasta à base de mirta.

O óleo essencial de mirta é constituído de três grupos de metabólitos

secundários: monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanóides (DE LAURENTIS et

al., 2005; FARAH et al., 2006; BHATIA et al., 2008). A composição fitoquímica do

óleo essencial é: 1,8-cineol, α-pineno, α-terpineno, α-terpineol, acetato de α-terpinil,

acetato de mirtenil, acetato de neril, β-cariofileno, β-cimeno, β-pineno, butirato de

isobutil, cis-carveol, felandreno, geraniol, limoneno, linalol, metil-benzoato, metil-

butirato, metil-eugenol, metil-geranato, mirceno, sabineno, terpineol, trans-carveol e

mirtenol (SUMBUL et al., 2011).

Dentre esses metabólitos, os monoterpenos aparecem como componentes

majoritários, a exemplo o (-)-mirtenol, também conhecido como “cis-mirtenol” ou

simplesmente “mirtenol”, um monoterpeno representante do grupo químico dos

alcoóis monocíclicos, que pode ser obtido por hidrodestilação a partir das folhas de

mirta, sendo suas formas isoméricas (+)-mirtenol e (-)-mirtenol provavelmente as

mais versáteis.

Mirtenol pode ser encontrado em diversas espécies de plantas aromáticas,

sendo algumas delas: Cyperus articulatus L. (COUCHMAN; PINDER; BROMHAM,

1964), da família Cyperaceae; Fragaria chiloensis spp. (AHARONI et. al., 2004), da

família Rosaceae; Tanacetum vulgare L. (KESKITALO; PEHU; SIMON, 2001;

JUDZENTIENE; MOCKUTE, 2005; DICKEL; RATES; RITTER, 2007) e Achillea

ligustica All. (MAGGI et al., 2009), pertencentes à família Asteraceae; Rosmarinus

officinalis L. (USAI et al., 2011), Salvia hydrangea DC. ex Benth (KOTAN et al.,

2008), Salvia hypoleuca Benth (NICKAVAR; MOJAB; ASGARPANAH, 2005), Salvia

lanígera Poir (TENORE et al., 2011), Salvia microstegia Boiss ex. Balansa

(SENATORE et al., 2006) e Salvia multicaulis Vahl. var. simplicifolia Boiss

(SENATORE; ARNOLD; PIOZZI, 2004), pertencentes à família Lamiaceae; Myrtus

communis L. (GUARRERA; LEPORATTI, 2007), da família Myrtaceae e Paeonia

lactiflora Pall (NGAN et al., 2012), da família Paeoniaceae.

Embora inicialmente utilizado como agente flavorizante de perfumes e vinhos,

estudos com plantas que apresentam o mirtenol em sua composição têm revelado

potenciais efeitos farmacológicos.

44

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Um estudo que utilizou uma planta herbácea da Europa central que é utilizada

em tratamentos relacionados à memória e aprendizagem, a resposta imune, a

função dos órgãos e a terapia de câncer, revelou que o mirtenol é o segundo

composto majoritário na referida planta. Embora, neste estudo, o mirtenol não tenha

sido investigado isoladamente, os resultados apontam que este monoterpenóide

possui estreita relação com as propriedades terapêuticas atribuídas a essa planta

estudada (EVSTATIEVA et al., 2010).

Outro estudo, utilizando ratos, verificou o efeito do mirtenol associado ao

controle da hipertensão arterial, cujo efeito hipotensor já havia sido evidenciado por

outros monoterpenos (SANTOS et al., 2011).

Mais recentemente, o mirtenol vem sendo estudado por seu potencial efeito

antimicrobiano e antifúngico. Um estudo que investigou as propriedades bactericidas

do mirtenol utilizando bactérias gram-positivas e negativas revelou o efeito

desinfetante do mirtenol sobre ambas, sugerindo seu uso no preparo de substâncias

desinfetantes para prevenir contra a contaminação bacteriana (LEPOITTEVIN et al.,

2011).

Pesquisadores relataram também que o mirtenol inibe convulsões induzidas

por pentilenotetrazol em roedores (SALVADORI et al., 2012). Além disso, outra

investigação recente tem apresentado o mirtenol como potencial agente protetor

gástrico e antiulcerogênico, em testes realizados com ratos e camundongos com

úlcera gástrica induzida por etanol (VIANA et al., 2013).

Esses estudos, bastante promissores no campo da psicofarmacologia, abrem

novas possibilidades para investigar as propriedades farmacológicas do mirtenol

sobre o sistema nervoso central e doenças correlatas; entretanto, o que já se sabe

sobre este monoterpeno é suficiente para subsidiar a formulação de compostos

medicamentosos que substituam os já disponíveis no comércio, garantindo bons

resultados terapêuticos com menos efeitos colaterais.

46

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Objetivos

OBJETIVOS

1 OBJETIVO GERAL

Investigar a influência do mirtenol sobre o sistema nervoso central de

roedores, especialmente para verificar seus efeitos ansiolíticos, neurolépticos e

anticonvulsivantes, além do seu perfil antioxidante e potencial tóxico de forma

aguda, subaguda, subcrônica e crônica, após doses repetidas.

2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar os possíveis efeitos do mirtenol em nível do SNC de modelos

experimentais de ansiedade, catatonia e convulsão;

Estabelecer possíveis mecanismos de ação ansiolítica, neuroléptica e

anticonvulsivante do mirtenol através de metodologias farmacológicas e

neuroquímicas;

Verificar o potencial tóxico do mirtenol após tratamento agudo, subagudo,

subcrônico e crônico com doses repetidas;

Avaliar o perfil antioxidante do mirtenol, através de metodologias in vitro e in

vivo.

48

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos

MATERIAL E MÉTODOS

1 MATERIAL

1.1 Animais

Para realização dos experimentos foram utilizados camundongos da linhagem

Swiss (Mus musculus), albinos, machos, com massa corporal variando entre 25-35

gramas, com aproximadamente 3 meses de idade, e ratos da linhagem Wistar

(Rattus novergicus), machos, albinos, com massa corporal variando entre 250–300

gramas (Figura 4), com aproximadamente 3 meses de idade, provenientes do

Biotério Central do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí.

Figura 4. Animais experimentais utilizados no estudo.

(A) Camundongo Swiss e (B) Rato Wistar. Fonte: arquivo pessoal.

Os animais foram mantidos alojados em gaiolas de polipropileno, contendo

dez animais cada, mantidos sob condições monitoradas de temperatura equivalente

a 22±1°C, com livre acesso a ração tipo pellets (Purina®) e água (mamadeiras

especiais para gaiolas), em ciclo claro/escuro de 12 horas (fase clara de 6:00 - 18:00

e fase escura de 18:00 - 6:00).

Antes da realização de qualquer ensaio experimental, os animais foram

colocados sobre a bancada da sala de testes, por pelo menos 30 minutos, para que

os mesmos pudessem adaptar-se ao ambiente, evitando-se assim possíveis

interferências nos experimentos. Todos os experimentos foram realizados no

período de 8:00 às 17:00.

Os testes experimentais foram realizados no Laboratório de Pesquisas em

Neuroquímica Experimental da Universidade Federal do Piauí (LAPNEX/UFPI).

(A) (B)

49

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Previamente ao início dos experimentos in vivo, o projeto foi submetido ao

Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal do Piauí,

aprovado para execução com protocolo CEEA UFPI 013/2011 (ANEXO A).

1.2 Drogas e reagentes

O mirtenol apresenta a fórmula química C10H16O (Figura 5). Tem como

sinônimos: (-)-Mirtenol; (1R)-2-Pineno-10-ol; (1R)-6,6-Dimetilbiciclo[3.1.1]hept-2-eno-

2-metanol. Está registrado no CAS sob o número 19894-97-4. Seu peso molecular é

equivalente a 152,23 g/mol e apresenta grau de pureza de 95%. Seu ponto de

ebulição corresponde a 221-222 °C e sua densidade de vapor é 0,954 g/mL a 25 °C

(SIGMA-ALDRICH BRASIL, 2013). Com relação as suas propriedades físico-

químicas, tem aparência incolor a amarelo pálido e encontra-se naturalmente na

forma líquida com aspecto oleoso.

Figura 5. Estrutura química do mirtenol.

Nos ensaios in vitro, foram utilizadas as concentrações de 0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e

7,2µg/mL de mirtenol. Outras drogas utilizadas nos ensaios in vitro foram o 2-

desoxirribose, ácido acético, AAPH (2,2’-azobis [2 metilpropionamidina]

diidroclorido), reagente de Griess, peróxido de hidrogênio, tampão fosfato,

nitroprussiato de sódio, TBA (Ácido Tiobarbitúrico), TBARS (substâncias reativas do

ácido tiobarbitúrico) e Trolox [6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido

carboxilíco], utilizado como controle positivo.

Nos experimentos in vivo, mirtenol foi administrado nas doses de 25, 50 e

75mg/kg, por via intraperitoneal, para os testes de verificação do efeito ansiolítico e

neuroléptico, e 50, 100 e 150 mg/kg, por via oral, para os testes de verificação do

efeito anticonvulsivante. Todas as doses foram calculadas de forma a possibilitar a

50

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


injeção de 0,1mL/10g de massa de cada camundongo e 1mL/10g de massa de cada

rato. O veículo utilizado como controle negativo foi composto por solução de Tween

80 a 0,05% dissolvido em salina 0,9% e as drogas padrão utilizadas no controle

positivo (Diazepam, 5mg/kg; Haloperidol, 4mg/kg; Flumazenil, 5mg/kg) foram

diluídas em solução salina 0,9% antes da administração.

Todo o mirtenol utilizado foi adquirido da empresa Sigma Aldrich (EUA) e

gentilmente cedido pelo Laboratório de Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos

(LAPROBIO) da Universidade Federal de Sergipe (UFS).

1.3 Aparelhagem

1.3.1. Aparelho de Campo Aberto

O aparato consiste em uma caixa de acrílico, com dimensões 30 cm de

comprimento por 30 cm de largura por 15 cm de altura, com piso dividido em

quadrantes [quatro para ratos e nove para camundongos], onde o centro da caixa é

o local de posicionamento do animal para observação (ARCHER, 1973). O piso é

dividido para melhor mensurar a locomoção. A iluminação é freqüentemente intensa

para provocar aversão (RAMOS; MORMÈDE, 2007).

Figura 6. Aparelho de Campo Aberto. Fonte: Arquivo pessoal.

1.3.2. Aparelho Rota Rod

O aparelho utilizado é o modelo EFF412 da marca Insight, Brasil,

confeccionado em acrílico resistente, com 450mm de altura por 540mm de largura

por 350mm de profundidade, divididos em 4 compartimentos iguais (baias)

separados por paredes de plásticas. Possui uma barra giratória suspensa, com

velocidade regulável em rotações por minuto (r.p.m.).

51

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


As baias possuem sistema de detecção de queda do animal através de

impacto, em um circuito micro-processado que liga uma prancha ao contador digital,

para cronometragem de permanência do animal na baia e contagem de vezes em

que este caiu. Assim, por meio do impacto do animal sob a prancha (queda da

barra), o contador do tempo é imediatamente interrompido e o número de quedas é

registrado (GRUPO INSIGHT LTDA, 2013).

Figura 7. Aparelho Rota Rod.

Fonte: Arquivo pessoal.

1.3.3. Aparelho do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)

O aparelho utilizado foi fabricado conforme o modelo da marca Insight,

Brasil, que consiste de quatro braços, sendo dois com paredes laterais (braços

fechados), com 30cm de comprimento, 25cm de altura e 5cm de largura, fixados

perpendicularmente a dois sem paredes (braços abertos), com mesmo comprimento

e largura. Cada braço forma um ângulo de 90º do braço adjacente e ambos são

conectados por uma plataforma central, com 5cm de comprimento por 5cm de

largura, onde o animal é posicionado para observação. O labirinto é apoiado sob um

suporte, ficando a 45cm do solo (LISTER, 1987).

Figura 8. Labirinto em cruz elevado. Fonte: Arquivo pessoal.

52

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


1.3.4. Aparelho de Transição Claro-Escuro

O aparato, de modelo EP157C da marca Insight, Brasil, consiste em uma

caixa de acrílico, de dimensões 27cm de largura por 20cm de altura por 45cm de

comprimento, dividida em dois quadrantes, sendo um na cor branca, representando

2/3 do total da caixa e o outro em acrílico preto, representando 1/3 do total. Entre os

dois compartimentos, há uma abertura de 5cm x 5cm, que permite a passagem livre

do animal (CRAWLEY; GOODWIN, 1980).

Figura 9. Aparelho de Transição Claro - Escuro. Fonte: Arquivo pessoal.

2 MÉTODOS

O delineamento experimental para realização dos testes psicofarmcológicos

utilizados para verificar a atividade do mirtenol está detalhado em três esquemas:

- Esquema do estudo do efeito do mirtenol sobre o SNC (Figura 10)

- Esquema do estudo do potencial tóxico do mirtenol (Figura 11)

- Esquema do estudo do perfil antioxidante do mirtenol (Figura 12)

53

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 10. Esquema do estudo dos efeitos do mirtenol sobre o SNC.

54

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 11. Esquema do estudo do potencial tóxico do mirtenol.

55

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 12. Esquema do estudo do perfil antioxidante do mirtenol.

56

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.1. Avaliação geral da atividade no Sistema Nervoso Central

2.1.1 Teste de movimentação espontânea (Campo Aberto)

Este teste é baseado na metodologia descrita por Sielgel (1946) e validado

por Archer (1973). Tem como objetivo primordial avaliar a locomoção de animais ou

a reatividade emocional de roedores tratados com a substância de interesse no

estudo.

O pressuposto deste teste é que maior emocionalidade dos animais se

manifesta em ambientes amplos, nos quais os roedores, por instinto, se locomovem

perto das paredes, onde se sentem mais protegidos. Assim, agentes ansiolíticos

tendem a aumentar a movimentação dos animais, ao passo que os ansiogênicos

provocam redução dos movimentos espontâneos.

O protocolo consiste em posicionar o animal no centro do campo aberto e

registrar os comportamentos através da observação sistemática do pesquisador. Os

parâmetros avaliados (Figura 13) são o número de cruzamentos nos quadrantes

invadidos com as quatro patas pelo animal (crossing); o número de empinamentos

do animal apoiado apenas sobre as patas traseiras (rearing); e o reflexo de auto-

limpeza do animal, no qual o roedor desliza as patas dianteiras nas vibrissas,

orelhas e cabeça (grooming).

Figura 13. Parâmetros observados no Teste do Campo Aberto. (A) Animal realizando Crossing. (B) Animal efetuando Rearing. (C) Animal fazendo Grooming.


Neste estudo, camundongos foram reunidos em cinco grupos de 10 animais

(n=10), sendo um tratado com veículo, três com mirtenol e um com diazepam. Após

30 minutos dos tratamentos, cada animal foi submetido individualmente ao teste e

observado por cinco minutos (Figura 14).

(A) (B) (C)

57

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 14. Protocolo experimental do mirtenol no teste do Campo Aberto.

Após este procedimento experimental, realizou-se a avaliação da possível

participação do sítio benzodiazepínico dos receptores GABAA no efeito do mirtenol

sobre a movimentação espontânea. Para este fim, três grupos de 10 camundongos

(n=10) foram pré-tratados com flumazenil, um antagonista competitivo do receptor

central benzodiazepínico, e após 15 minutos foram tratados com o veículo, mirtenol

ou diazepam. Decorridos 30 minutos, a movimentação espontânea dos animais foi

verificada (Figura 15).

Figura 15. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol no teste do Campo Aberto.

Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza da caixa com

álcool para remover quaisquer sujeiras que pudessem atrapalhar a deambulação

espontânea e/ou observação do animal seguinte.

Tempo 0 min 45 min 50 min

Pré-tratamento

com Flumazenil

Animal mantido

na gaiola

Observação

do animal

Animal posicionado

no campo aberto Término do teste

Tratamento com

mirtenol, veículo

ou diazepam

15 min


Tratamento com mirtenol,

veículo ou diazepam

Animal mantido

na gaiola

Observação

do animal

Animal posicionado

no campo aberto Término do teste

58

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.1.2 Teste de coordenação motora (Rota Rod)

O teste do Rota Rod foi inicialmente descrito por Dunham e Miya (1957) e

validado por Carlini e Burgos (1979). Tem como objetivo verificar se a droga testada

interfere na coordenação motora dos animais [atividade neurotóxica ou

miorrelaxante] (HAMM et al., 1994).

O pressuposto deste teste é que algumas drogas podem alterar a

coordenação motora dos animais, podendo ser um indicativo de efeito indesejado da

substância investigada.

O protocolo consiste em posicionar o animal com as quatro patas sobre a

barra giratória de 2,5cm de diâmetro e registrar seu desempenho através da

observação sistemática do pesquisador. Os parâmetros avaliados (Figura 16) são o

tempo de permanência na barra giratória e o número de quedas da barra.

Figura 16. Parâmetros observados noTeste do Rota Rod. (A) Permanência do animal na barra. (B) Quedas do animal da barra.


Neste estudo, ratos foram reunidos em cinco grupos de 10 animais (n=10),

sendo um tratado com veículo, três com mirtenol e um com diazepam. Após 30

minutos dos tratamentos, cada animal foi posicionado individualmente na barra

giratória, sob velocidade de rotação de 7 r.p.m. e observado por três minutos (Figura

17).

(A) (B)

59

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 17. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do Rota Rod.



sobre a coordenação motora dos animais. Para este fim, três grupos de 10

camundongos (n=10) foram pré-tratados com flumazenil e, após 15 minutos, foram

tratados com o veículo, mirtenol ou diazepam. Decorridos 30 minutos, a

movimentação espontânea dos animais foi verificada (Figura 18).

Figura 18. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol no teste do Rota Rod.

Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza da baia com álcool,

para remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a movimentação do animal

seguinte.


Pré-tratamento

com Flumazenil

Animal mantido

na gaiola

Observação

do animal

Animal posicionado

na barra giratória Término do teste

Tratamento com

mirtenol, veículo

ou diazepam

15 min




Animal mantido

na gaiola

Observação

do animal

Animal posicionado

no Rota Rod Término do teste

60

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.2. Avaliação da atividade ansiolítica

2.2.1. Teste do Labirinto em Cruz Elevado (TLCE)

Este teste foi originalmente descrito para ratos (PELLOW et. al., 1985) e

posteriormente validado para camundongos (LISTER, 1987), sendo adequado para

verificar o comportamento ansiolítico/ansiogênico do animal com o intuito de

desvelar novos agentes ansiolíticos (PELLOW; FILE, 1986; DAWSON;

TRICKLEBANK, 1995).

O TLCE tem como princípio básico a geração de respostas comportamentais

no animal semelhantes às de humanos em situações de ansiedade. O roedor é

exposto a uma combinação de dois aspectos: ambiente aberto e altura, o que gera a

alteração do seu comportamento natural, que é refugiar-se em ambientes sombrios

e lá permanecer, esquivando-se também de lugares elevados (BRADLEY et al,

2007).

O pressuposto deste teste é que drogas ansiolíticas favorecem o aumento do

número de entradas e a permanência do animal nos braços abertos, enquanto que

as ansiogênicas induzem as mesmas alterações comportamentais nos braços

fechados.

O protocolo consiste em posicionar o animal centro da cruz (área neutra), com

a cabeça voltada para um dos braços fechados e registrar a movimentação do

animal através da observação sistemática do pesquisador. Os parâmetros avaliados

(Figura 19) são o número de entradas nos braços abertos (NEBA), a porcentagem

de entradas nos braços abertos (PEBA), o tempo de permanência nos braços

abertos (TPBA) e a porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos

(PTBA). Considera-se que o rato entra em um dos braços quando ele está com as

quatro patas fora do centro da cruz (GRUNDMANN et al., 2007; BIALA; KRUK,

2008).

61

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 19. Parâmetros observados no TLCE.

(A) Animal no braço fechado. (B) Animal no braço aberto. Fonte: Arquivo pessoal.

Neste experimento, ratos foram reunidos em cinco grupos de 10 animais cada

(n=10), sendo um grupo tratado com veículo, um com diazepam e os outros com as

doses-teste de mirtenol. Trinta minutos após os tratamentos, cada animal foi

colocado no centro do labirinto e observado por cinco minutos (Figura 20).

Figura 20. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do LCE.



sobre a movimentação dos animais nos braços abertos do labirinto. Para este fim,

três grupos de 10 camundongos (n=10) foram pré-tratados com flumazenil e, após

15 minutos, foram tratados com o veículo, mirtenol ou diazepam. Decorridos 30

minutos, os animais foram observados (Figura 21).

(A) (B)




Animal mantido

na gaiola

Observação

do animal

Animal posicionado

no LCE Término do teste

62

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 21. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol no Teste do LCE.

Após a observação de cada animal realizou-se a limpeza dos braços com

álcool, para remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a movimentação do

animal seguinte.

2.2.2. Teste da Transição Claro - Escuro

Este teste foi originalmente elaborado por Crawley e Goodwin (1980), sendo

muito utilizado para avaliar o poder ansiolítico/ansiogênico de drogas experimentais.

Tem como princípio básico o conflito natural que ocorre quando os animais são

expostos a um ambiente não familiar, que é gerado devido à tendência natural do

roedor de evitar o desconhecido.

O pressuposto deste modelo é que as drogas ansiolíticas induzem um

aumento nos comportamentos executados na parte clara. Um aumento na transição

entre o ambiente claro e escuro, sem um aumento na locomoção espontânea, é

considerado reflexo da atividade ansiolítica (BOURIN; HASCÖET, 2003; GARGANO,

2007).

O protocolo consiste em posicionar o animal no lado claro da caixa, com a

cabeça voltada para a abertura de comunicação com o lado escuro e registrar a

movimentação do animal através da observação sistemática do pesquisador. Os

parâmetros avaliados (Figura 22) são a latência para a primeira entrada no lado

escuro da caixa, o tempo total de permanência no compartimento claro e o número

de transições entre eles.


Pré-tratamento

com Flumazenil

Animal mantido

na gaiola

Observação

do animal

Animal posicionado

no LCE Término do teste

Tratamento com

mirtenol, veículo

ou diazepam

15 min

63

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 22. Parâmetros observados no Teste de Transição Claro - Escuro. (A) Animal na parte clara. (B) Animal na parte escura. (C) Animal em transição livre.


Neste teste, ratos foram reunidos em cinco grupos de 10 animais cada (n=10),

onde um grupo foi tratado com veículo, um com diazepam e os outros três com as

doses-teste de mirtenol. Trinta minutos após os tratamentos, cada animal foi

colocado na caixa e observado por um período de cinco minutos (Figura 23).

Figura 23. Protocolo experimental do mirtenol no Teste de Transição Claro - Escuro.



sobre a coordenação motora dos animais. Para este fim, três grupos de 10

camundongos (n=10) foram pré-tratados com flumazenil e, após 15 minutos, foram

tratados com o veículo, mirtenol ou diazepam. Decorridos 30 minutos, a

movimentação espontânea dos animais foi verificada (Figura 24).

(A) (B) (C)




Animal mantido

na gaiola

Observação

do animal

Animal posicionado

na caixa Término do teste

64

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 24. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol no Teste de Transição Claro - Escuro.

Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza da caixa para

remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a observação do animal seguinte.

2.3. Avaliação da atividade anticonvulsivante

2.3.1. Teste da convulsão induzida por picrotoxina (PIC), pentilenotetrazol (PTZ) ou

pilocarpina (P)

O Teste tem como princípio básico a definição de convulsão induzida no

animal, que é uma manifestação clínica caracterizada pelos episódios de tremores

irregulares e constantes, em frequência variada, podendo ter o desfecho ou não de

morte.

O pressuposto deste teste é que algumas drogas promovem episódios

convulsivos, podendo ter como desfecho a morte, sendo estes os indicativos de que

a substância apresenta efeito indesejado no animal e é então classificada como

convulsivante. Do contrário, tem-se uma substância com perfil anticonvulsivante.

O protocolo (Figura 25) consiste em colocar o animal em um recipiente após o

tratamento, para ser observado livremente pelo pesquisador. Os parâmetros

avaliados são o tempo de latência para o início das convulsões, o percentual de

convulsões e o percentual de mortes dos animais.


Pré-tratamento

com Flumazenil

Animal mantido

na gaiola

Observação

do animal

Animal posicionado

na caixa Término do teste

Tratamento com

mirtenol, veículo

ou diazepam

15 min

65

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Neste experimento, ratos foram reunidos em seis grupos de oito animais cada

(n=8), sendo um grupo tratado com veículo, um com picrotoxina, um com diazepam

e os outros com as doses-teste de mirtenol. Todos os grupos receberam picrotoxina,

pentilenotetrazol ou pilocarpina antes do início das observações. Os animais foram

observados por até 24 horas após os tratamentos.

Figura 25. Protocolo experimental do mirtenol no Teste de Convulsão induzida por PIC, PTZ ou P.



sobre a convulsão induzida. Para este fim, três grupos de oito camundongos (n=8)

foram pré-tratados com flumazenil, um antagonista competitivo do receptor central

benzodiazepínico, e após 15 minutos foram tratados com o veículo, mirtenol ou

diazepam. Decorridos 30 minutos, os animais foram observados (Figura 26).

Figura 26. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol no Teste de Convulsão induzida por PIC, PTZ ou P.

Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza do recipiente para

remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a observação seguinte.

0 min Até 24 horas

Observação

do animal

Término

do teste

Tempo

Tratamento

com controle,

DZP, mirtenol

Animal mantido

na gaiola

30 min

Tratamento com

PIC, PTZ ou P

0 min 30 min 15 min Tempo

Observação

do animal

Término

do teste

Animal mantido

na gaiola

Tratamento com

PIC, PTZ ou P

Tratamento

com controle,

DZP, mirtenol

Tratamento com

Flumazenil

Animal mantido

na gaiola

35 min

66

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.4. Avaliação da atividade neuroléptica

2.4.1. Teste da Catalepsia

Este teste foi originalmente descrito por Carlini (1973), sendo adequado para

verificar o comportamento estereotipado do animal quando está sob o efeito de

drogas antipsicóticas com poder de causar alterações motoras do tipo catatônicas.

O Teste tem como princípio básico a definição de catalepsia ou catatonia, que

é uma manifestação clínica caracterizada pela rigidez muscular, apresentando tanto

imobilidade posicional quanto dificuldade de iniciar movimentos voluntários

(CORREIA; FERNANDES; BERNARDI, 2008), levando à permanência do indivíduo

em postura prolongada. Em animais de laboratório, é definida pelo tempo em que o

animal permanece imóvel na postura que lhe é imposta, pois, por ser incômoda para

o animal, este tem a tendência natural de sair dela o mais rápido possível.

O pressuposto deste teste é que algumas drogas promovem a permanência

do animal em postura antifisiológica (incômoda), sendo este um indicativo de que a

substância apresenta efeito indesejado sobre o sistema locomotor.

O protocolo consiste em posicionar o animal sobre uma barra de madeira ou

vidro, elevada a 6,5 cm do chão, apoiado apenas pelas patas dianteiras e observado

livremente pelo pesquisador. Os parâmetros avaliados (Figura 27) são o tempo de

latência para retirada de uma ou ambas as patas da barra.

Figura 27. Parâmetros observados no Teste da Catatonia.

(A) Animal posicionado na barra em estado de latência. (B) Animal saindo da posição antifisiológica. Fonte: Arquivo pessoal.

Neste experimento, ratos foram reunidos em cinco grupos de 8 animais cada

(n=8), sendo um grupo tratado com veículo, um com haloperidol e os outros com as

doses-teste de mirtenol após o pré-tratamento com haloperidol.

(A) (B)

67

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Catatonia foi definida como a permanência do animal na postura bípede, com

apoio das patas anteriores na barra de vidro, por pelo menos 30 segundos, e seu

término quando o animal volta à postura natural, com a retirada de pelo menos uma

pata da barra. O tempo de catatonia foi registrado após 15, 60 e 90 minutos após a

administração dos tratamentos e os animais foram observados por até 5 minutos em

cada um desses momentos (Figura 28).

Figura 28. Protocolo experimental do mirtenol no Teste da Catatonia.

Após este procedimento, realizou-se a avaliação da possível participação do

sítio dopaminérgico no efeito do mirtenol sobre a catatonia induzida. Para este fim,

três grupos de 8 camundongos (n=8) foram co-tratados com haloperidol e mirtenol e,

após 15 minutos, foram observados por 5 minutos (Figura 29).

Figura 29. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol no Teste da Catatonia.

0 min 20 min 15 min Tempo

Observação

do animal

Término

do teste

Animal mantido

na gaiola

Tratamento com

Haloperidol + mirtenol

Tempo 0 min 60 min 90 min 15 min 20min 65min 95min

1ª.

observação

do animal

2ª.

observação

do animal

3ª.

observação

do animal

Animal mantido

na gaiola

Pré-tratamento

com

haloperidol Animal apoiado

na barra

Término

do teste

Tratamento com

mirtenol

Animal apoiado

na barra

Animal apoiado

na barra

68

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza da barra e do piso

com álcool para remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a movimentação

do animal seguinte.

2.5. Avaliação do potencial tóxico

2.5.1 Triagem comportamental (screening hipocrático)

O método do screening hipocrático na avaliação da toxicidade tem sido um

método bastante útil e comumente usado na triagem preliminar de plantas e/ou

compostos químicos para detectar essas atividades farmacológicas e toxicológicas

(LUCIO et al., 2000), assim, como os hábitos fisiológicos diários.

Quarenta camundongos machos foram divididos em quatro grupos de 10

animais para cada dose (n=10) e um grupo controle. Os animais foram tratados por

via oral durante 120 dias com doses repetidas de 25, 50 e 75mg/kg de mirtenol.

Durante o período de tratamento foram realizadas observações comportamentais

sistemáticas para avaliar o screening hipocrático que fornece uma estimativa geral

da toxicidade da substância sobre o estado de consciência e disposição geral,

atividade e coordenação do sistema motor, reflexos e atividades sobre os sistemas

nervoso central e autônomo (MALONE; ROBICHAUD, 1983).

Os parâmetros (atividade geral, frênito vocal, irritabilidade, resposta ao toque,

contorção, reflexo de endireitamento, tônus muscular, força para agarrar, ataxia,

reflexo auricular, reflexo corneal, tremores, convulsões, calda em straub, hipnose,

anestesia, lacrimação, ptose palpebral, micção, defecação, piloereção, hipotermia,

respiração, cianose, hiperemia, morte) foram avaliados durante o período de 30, 60,

90 e 120 dias, sendo avaliados a cada dois dias e, a partir de então, diariamente, até

o último dia de administração do mirtenol. Sinais de toxicidade, a época do seu

aparecimento, a intensidade, a duração e a progressão dos mesmos foram anotados

para posterior análise.

69

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.5.2 Toxicidade aguda (dose única e doses repetidas), subcrônica e crônica (doses

repetidas)

Para determinação da dose letal 50% (DL50) para verificar a toxicidade aguda,

mirtenol foi administrado por via intraperitoneal em doses diferentes 50, 100, 200,

300, 400, 500 e 1000mg/kg, em grupos de 10 camundongos, além do grupo

controle. Após a administração, os animais foram observados continuamente por um

período de 4 horas a fim de avaliar possíveis alterações comportamentais e, após 24

horas, foram observados uma vez ao dia durante 14 dias, a fim de registrar a

mortalidade causada pelo mirtenol.

A massa corporal e o padrão alimentar dos animais também foram

quantificados e analisados. Os camundongos foram colocados individualmente em

gaiolas metálicas e aclimatados por um período de 15 dias. Grupos de animais

(n=10) foram tratados diariamente no mesmo horário, por via oral (gavagem), nas

doses de 25, 50 e 75mg/kg de mirtenol ou com o veículo (0,1mL/100g, v.o.), durante

um período de 120 dias. Diariamente foram registrados para cada animal: o volume

de água ingerida (mL), o peso da ração consumida (g), o volume de urina excretada

(mL) e o peso das fezes produzidas (g), além de alterações comportamentais

durante todo o estudo (CUNHA et al., 2009). Em intervalos de trinta dias, os animais

foram pesados para a determinação da evolução ponderal durante o período

experimental de 30, 60, 90 e 120 dias.

2.5.3. Avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos

Quarenta camundongos divididos em quatro grupos de 10 animais (n=10)

foram tratados diariamente por via oral durante 120 dias com o veículo (Tween 80

0,05% dissolvido em solução salina 0,9%; grupo controle) e com as doses de 25, 50

e 75mg/kg de mirtenol. Após 120 dias de tratamento os animais foram anestesiados

com pentobarbital sódico (40mg/kg, i.p.) e a coleta do sangue foi realizada por

punção do plexo venoso orbital, utilizando-se agulhas e seringas e tubos de

microhematócrito. O sangue foi acondicionado em dois tipos de tubo: um com

anticoagulante HB (Laborlab®) para determinação dos parâmetros hematológicos, e

70

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


o outro, sem anticoagulante, para obtenção do soro para avaliação dos parâmetros

bioquímicos.

Os valores para eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina, hematócrito e

os índices hematimétricos volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina

corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média

(CHCM) foram determinados imediatamente após a coleta por meio de um

analisador automático de células hematológicas Advia 120/Hematology Siemens. A

contagem diferencial de leucócitos foi realizada em extensões coradas com May-

Grünwald-Giemsa. Em cada ensaio, 100 células foram analisadas e contadas.

Para análise bioquímica, o material foi centrifugado por força G durante 10

minutos e, em seguida, determinados os parâmetros glicose, uréia, creatinina,

aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), colesterol total,

triglicerídeos, bilirrubinas total e direta e ácido úrico. Os ensaios foram realizados em

aparelho automático Labmax 240 (Labtest) com sistemas comerciais da Labtest®.

2.5.4.Análise morfológica macroscópica

Após 120 dias de tratamento com doses repetidas de mirtenol nas doses de

25, 50 e 75mg/kg, os animais receberam pentobarbital sódico 40mg/kg, conforme

protocolo da Cornell University/Cornell Center for Animal Resources and Education,

conforme descrito por Flecknell (1996) e Kohn e colaboradores (1997), e foram

eutanasiados por deslocamento cervical para realizar a avaliação macroscópica.

Para tanto, foi realizada a análise morfológica macroscópica à vista desarmada dos

órgãos, além da pesagem de fígado, pulmão, coração, rim, cérebro e baço para

determinar os pesos relativos e verificar se houve ou não alteração morfológica

macroscópica nos principais órgãos avaliados.

2.5.5. Análise histopatológica

Após 120 dias de observação dos animais, estes foram eutanasiados pela

administração de pentobarbital sódico por via intraperitoneal na dose de 10-

15mg/100g de peso e os encéfalos foram rapidamente retirados e colocados sobre

papel alumínio numa placa de petri com gelo.

71

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral foi

retirada das leptomeninges com o auxílio de uma pinça reta de microdissecação, a

qual, progredindo delicadamente e tangencialmente aos ventrículos laterais,

divulsionou o cortéx em toda a sua extensão fronto-occiptal. O córtex já divulsionado

foi rebatido para os lados, expondo parte do hipocampo que, com divulsionamento,

foi descolado e retirado (Figura 30).

Figura 30. Áreas cerebrais dos animais experimentais

removidas para análise histopatológica. (A) Córtex cerebral dos animais. (B) Hipocampo dos animais.


Após o término da dissecação, a peça foi colocada em papel de alumínio,

identificada, pesada e conservada a -80°C para confecção de lâminas histológicas.

Cortes sagitais feitos em intervalos de 1mm foram obtidos a partir de um corte inicial

próximo aos corpos mamilares. Para o estudo microscópico, secções de 10 foram

feitas, coradas em Hematoxilina - Eosina (HE) e analisadas com auxílio de um

microscópio óptico.

As áreas cerebrais foram observadas e classificadas de acordo com as

descrições do Atlas de Paxinos e Watson (1986). O grau de lesão foi expresso

através de uma escala percentual de 0 (nenhum) a 100 (total) para cada hipocampo

e corpo estriado, analisados de acordo com o método descrito anteriormente

(BUREAU; PEREDERY; PERSINGER, 1994; FERREIRA; MATSUBARA, 1997). A

lesão cerebral foi definida pela presença de pelo menos 50% de alteração

histopatológica em cada hipocampo e corpo estriado.

Também foi realizada a análise do tecido hepático dos animais submetidos

aos tratamentos com mirtenol, para verificar a existência de lesão tecidual.

(A) (B)

72

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.6. Avaliação do efeito antioxidante

A atividade antioxidante do mirtenol foi avaliada, já que a ação de algumas

substâncias e o desenvolvimento de patologias no SNC pode estar relacionada ao

estresse oxidativo induzido por certas condições neurológicas. Também é

importante avaliar este potencial antioxidante, uma vez que ainda não se conhece

todos os mecanismos de ação da droga em questão. Várias evidências indicam que

o estresse oxidativo tem um papel crucial na sinalização do SNC, estando envolvido

no processo da ansiedade.

O perfil antioxidante de uma substância pode ser avaliada por meio de uma

grande variedade de testes in vitro e in vivo. Neste trabalho, três metodologias in

vitro e três in vivo foram utilizadas.

2.6.1 Efeito antioxidante in vitro

O ensaio para determinação das substâncias reativas com o ácido

tiobarbitúrico (TBARS) é um método usado para quantificar a peroxidação lipídica

que corresponde a um dano na membrana celular causado pelos radicais livres que

são formados durante o estresse oxidativo.

Nesse método, um composto azo hidrossolúvel, é utilizado como gerador de

radicais livres, uma vez que a decomposição desse composto produz nitrogênio

molecular e radicais carbonilas, os quais, por sua vez, reagem com o ácido

tiobarbitúrico, resultando na formação de substâncias reativas com ácido

tiobarbitúrico. Este método é um dos mais empregados para estudos relacionados

com a peroxidação lipídica, sendo bastante utilizado para avaliar a atividade

antioxidante de vários produtos naturais.

O grau de lipoperoxidação foi medido por meio da determinação dos níveis de

TBARS, conforme o método de DRAPER e HADLEY (1990). O ensaio TBARS foi

utilizado para quantificar a peroxidação lipídica (ESTERBAUER; CHEESEMAN,

1990) e este método foi usado para medir a capacidade antioxidante do mirtenol

usando gema de ovo homogeneizado como substrato rico em lipídio (GUIMARÃES

et al., 2010). Anteriormente, a gema de ovo foi homogeneizado (1% w/v) em 20mM

de tampão fosfato (pH 7,4), 1mL de homogenato foi sonicado e homogeneizada

73

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


com 0,1mL de mirtenol em diferentes concentrações. A peroxidação lipídica foi

induzida pela adição de 0,1mL de solução AAPH (0,12M). O controle foi apenas

veículo de mirtenol. As reações foram realizadas por 30min a 37ºC. Após o

resfriamento, as amostras (0,5mL) foram centrifugadas com 0,5mL de ácido

tricloroacético (15%) a 1.200g x por 10min. Uma alíquota de 0,5mL de sobrenadante

foi misturada com 0,5mL de TBA (0,67%) e aquecida a 95°C por 30min. Após o

resfriamento, absorbâncias da amostra foram medidas, utilizando um

espectrofotômetro a 532nm. Os resultados foram expressos em porcentagem de

TBARS formadas por AAPH sozinho (controle induzido).

Outras metodologias bastante empregadas para avaliar a atividade

antioxidante in vitro de uma substância baseiam-se na capacidade sequestrante,

que consiste na interação direta de uma substância com moléculas reativas,

convertendo os radicais livres formados em espécies menos reativas e,

consequentemente, mais estáveis.

O Ensaio de remoção do radical hidroxila (OH scavenging) mede a

capacidade de uma substância em remover o radical hidroxila e está diretamente

relacionada à sua atividade antioxidante. O radical hidroxila é uma espécie

extremamente reativa, capaz de causar danos ao DNA, proteínas e lipídios. Neste

método, o OH é gerado pela reação de Fenton, na qual o peróxido de hidrogênio

reage com o íon ferroso. Na presença do OH, o açúcar desoxirribose é degradado à

malondialdeído e ao reagir com o ácido tiobarbitúrico, é quantificado.

Para a verificação da concentração de radical hidroxila foi usado o método

com base na reação de Fenton. A formação de OH na reação de Fenton foi

quantificada usando a degradação oxidativa de 2-desoxirribose (LOPES;

SCHULMAN; HERMES-LIMA, 1999). O princípio do ensaio é a quantificação do

produto de degradação de 2-desoxirribose, malondialdeído, por sua condensação

com 2-ácido tiobarbitúrico. Resumidamente, as reações típicas foram iniciados pela

adição de Fe2+ (concentração final FeSO4 6mM) para soluções contendo 5mM de 2-

desoxirribose, 100mM de H2O2 e 20mM de tampão fosfato (pH 7,2). Para medir a

atividade antioxidante do mirtenol contra o radical hidroxila, diferentes concentrações

foram adicionados ao sistema antes da adição Fe2+. Reações foram realizadas por

15 min em temperatura ambiente e foram paradas pela adição de ácido fosfórico a

4% (v/v), seguido por TBA 1% (w/v, em 50mM de NaOH). Soluções foram aquecidos

74

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


em banho maria por 15min a 95°C, e depois resfriado à temperatura ambiente. A

absorbância foi medida em 532nm e os resultados foram expressos como

equivalentes do MDA formada por Fe2+ e H2O2.

O ensaio da atividade removedora do radical nitrito (NO scavenging) é outro

método de avaliação antioxidante in vitro. Baseia-se na produção de óxido nítrico

(NO) a partir da decomposição espontânea do nitroprussiato de sódio em solução

aquosa. O NO, por sua vez, interage com o oxigênio, produzindo íons nitrito, os

quais podem ser medidos pela reação de Griess. Estes íons nitritos têm um forte

poder oxidante, reagindo com várias moléculas biológicas, o que leva a danos

celulares severos. Substâncias com capacidade removedora de NO competem com

o oxigênio, levando à redução na produção de nitrito, caracterizando atividade

antioxidante.

Para a verificação da concentração de nitrito foi usado o método descrito

anteriormente por Green, Tannenbaum e Goldman (1981). O óxido nítrico foi gerado

a partir da decomposição espontânea de nitroprussiato de sódio em 20mM tampão

fosfato (pH 7,4). Uma vez gerado NO, ele interage com o oxigênio para produzir íons

nitrito, que foram medidos pela reação de Griess. A mistura de reação (1mL)

contendo 10mM nitroprussiato de sódio (SNP) em tampão fosfato e mirtenol em

diferentes concentrações foram incubados a 37°C por 1 hora. Uma alíquota de

0,5mL foi retirada e homogeneizada com 0,5mL de reagente de Griess. A

absorvância do cromóforo foi medida a 540nm. A porcentagem de inibição do óxido

nítrico gerado foi medida através da comparação dos valores de absorbância dos

controles negativos (apenas 10mM de nitroprussiato de sódio e veículo) e

preparações para o ensaio. Os resultados foram expressos em porcentagem de

nitrito formado por SNP sozinho.

2.6.2. Efeito antioxidante in vivo

Para avaliar os efeitos antioxidantes nos animais, os camundongos foram

tratados durante 30 dias consecutivos com mirtenol, nas doses de 25, 50 e 75mg/kg

e 24 horas após a administração da droga, foram sacrificados por decapitação e os

hipocampos dissecados. Após a dissecação, a área foi usada para estudo

75

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


neuroquímico, através das determinações do nível de peroxidação lipídica, teor de

nitrito e atividade das enzimas antioxidantes.

Os hipocampos foram homogeneizados em 1mL de tampão fosfato de sódio,

pH 7,0. A concentração de proteína foi medida pelo método de Lowry e

colaboradores (1951). Os 10% de homogenatos foram centrifugados (800×g, 20min)

e os sobrenadantes usados para os ensaios.

Para a determinação da atividade enzimática da catalase (CAT) foi usado o

método descrito por Maehly e Chance (1954). Os resultados foram expressos em

U/µg de proteína. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Lowry

et al. (1951).

A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) foi determinada através

da técnica previamente descrita por Flohé e Otting (1984). Os resultados foram

expressos em U/mg de proteína. A concentração de proteína foi determinada pelo

método de Lowry et al. (1951).

A determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) foi feita

conforme a técnica previamente descrita por Sedlak e Lindsay (1968). As

concentrações de GSH foram expressas em g de GSH/g de tecido.

3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As amostras utilizadas nos ensaios experimentais foram previamente

verificadas quanto ao padrão de normalidade através do teste de Kolmogorov-

Smirnov para então proceder-se a análise estatística.

Os resultados dos testes comportamentais gerais e específicos para

ansiedade e convulsão foram então analisados por análise de variância de uma via

(one-way ANOVA), seguido pelo teste de t-Student-Neuman-Keuls. No estudo da

catatonia experimental, os dados foram analisados também por ANOVA, de duas

vias de medidas repetidas (two-way ANOVA), com pós-teste de Bonferroni.

Todas as análises foram efetuadas utilizando-se o software GraphPad Prism

versão 5.03 (GraphPad Sotware Incorporated, San Diego, CA 92121 EUA), cujos

valores foram apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.),

considerando-se diferenças significativas quando p<0,05.

77

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Resultados e Discussão

CAPÍTULO 1

Avaliação do efeito ansiolítico do mirtenol

78

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Resultados

1. MODELOS EXPERIMENTAIS DE ANSIEDADE

No campo da neuropsicofarmacologia, as investigações apontam diversos

modelos animais desenvolvidos e padronizados para o estudo experimental da

ansiedade em humanos. Embora seja compreensível que animais apresentem

respostas comportamentais diferentes das manifestadas em humanos, parece haver

uma semelhança em relação aos estímulos neurais de ambos sob condições

ansiogênicas (CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012), possibilitando que os

estudos pré-clínicos possam sinalizar seus achados como hipóteses para os estudos

clínicos.

Os modelos experimentais para a avaliação de drogas ansiolíticas ou

ansiogênicas utilizam roedores como sujeitos experimentais na maioria dos estudos

(BRITO, 2011), sendo o labirinto em cruz elevado um dos principais modelos

utilizados e o mais adotado em estudos pré-clínicos com óleos, extratos e

metabólitos secundários de plantas com atividade sobre o SNC desenvolvidos no

Brasil (ver Quadro 3).

Outro modelo experimental de ansiedade consiste no teste do campo aberto,

que utiliza como referências ansiogênicas a preferência do animal pelos cantos do

campo, enquanto que a busca pelo centro do ambiente como um padrão

comportamental ansiolítico (JOHNSTON; FILE, 1991).

Um terceiro modelo utilizado em estudos relacionados ao potencial

ansiolítico/ansiogênico de substâncias é o teste de transição claro-escuro. Trata-se

de um modelo baseado na aversão inata dos animais a ambientes extremamente

claros e consequente preferência por ambientes escuros, onde o inverso desse

padrão reflete potencial ansiolítico da substância teste, assim como o menor número

de transições entre os dois compartimentos (BOURIN; HASCÖET, 2003).

Outros modelos são também adotados, embora em menor freqüência, em

estudos com a mesma finalidade, dente eles o teste de esconder esferas, labirinto

em T elevado, esquiva ativa e passiva, ocultação defensiva, interação social e

sobressalto intensificado pelo medo (CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012).

Nesse sentido, o propósito deste capítulo foi apresentar os resultados do

potencial ansiolítico do mirtenol, utilizando os testes do labirinto em cruz elevado e o

79

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


de transição claro-escuro, além dos testes comportamentais de campo aberto e Rota

Rod.

2. RESULTADOS

2.1. Avaliação geral da atividade do mirtenol no SNC

2.1.1. Efeito do mirtenol no teste da movimentação espontânea (Campo Aberto)

Na análise da atividade locomotora espontânea (Gráfico 1), os resultados

demonstraram que não houve diferença significativa nas médias dos animais

tratados com mirtenol (14,1 ± 1,1; 14,4 ± 1,2; 14,8 ± 0,8; respectivamente) quando

comparadas com o grupo controle (14,5 ± 1,1). Entretanto, os animais tratados com

mirtenol apresentaram ALE significativamente maior do que os do grupo diazepam

(6,1 ± 0,8).

O diazepam, usado como droga padrão ansiolítica, promoveu a redução

significativa do número de cruzamentos do animal neste parâmetro, quando

comparado ao grupo controle.

Para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol sobre a

movimentação espontânea dos animais, utilizou-se a administração do Flumazenil,

um antagonista competitivo dos receptores benzodiazepínicos, utilizado como droga

padrão neste tipo de teste. Os resultados revelaram que o mirtenol, administrado

após o pré-tratamento com o flumazenil, não alterou a movimentação espontânea

dos animais quando comparado ao grupo controle, mas foi significativamente maior

(14,4 ± 0,9) do que o grupo que recebeu somente diazepam.

De modo similar, o diazepam, após tratamento com flumazenil, promoveu o

aumento da movimentação dos animais no campo aberto (14,1 ± 0,9), sugerindo que

a atividade do mirtenol pode envolver os receptores benzodiazepínicos.

80

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Gráfico 1. Efeito do mirtenol sobre a atividade locomotora espontânea dos animais no teste do campo aberto. Controle (veículo), DZP (Diazepam, 2mg/kg), MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10).

ap<0,0001 versus Controle;

bp<0,0001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-

Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

O reflexo de auto-limpeza do animal (grooming) também foi analisado neste

teste (Tabela 1), não havendo alteração significante nos grupos tratados com

mirtenol quando comparados ao grupo controle ou a droga padrão.

Quando utilizado o pré-tratamento com flumazenil, para verificar o possível

mecanismo de ação do mirtenol, este monoterpeno, de modo similar ao diazepam,

não alterarou o número de groomings dos animais, sugerindo possível envolvimento

dos receptores benzodiazepínicos neste processo.

Tabela 1. Efeito do mirtenol sobre o grooming dos animais.

Grupos Número de groomings

Controle 3,3 ± 0,9

DZP 5,5 ± 0,6

MIR 25 5,3 ± 0,6

MIR 50 5,3 ± 0,4

MIR 75 5,3 ± 0,6

FLU 3,3 ± 0,5

FLU+DZP 3,3 ± 0,3

FLU+MIR 25 3,3 ± 0,7

Controle(veículo); DZP(diazepam, 2mg/kg); MIR(mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg); FLU(flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média± E.P.M.(n=10).

ap<0,01 versus

Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

Controle DZP FLU 5 FLU 5 + DZP MIR25 MIR50 MIR75 FLU 5 + MIR 250

5

10

15

20

b

a

bb b bb

ati

vid

ad

e l

oc

om

oto

ra e

sp

on

tân

ea

(A

LE

)

81

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


O terceiro parâmetro analisado neste teste foi o número de empinamentos

sob as patas traseiras (rearing) (Gráfico 2). Os resultados revelaram que o mirtenol

não alterou este parâmetro quando comparado ao grupo controle. Porém, nas três

doses testadas (5,2 ± 0,3; 5,2 ± 0,4; 5,2 ± 0,4; respectivamente), aumentou

significativamente o número de rearings dos animais quando comparado ao grupo

padrão (2,8 ± 0,3). O diazepam reduziu significativamente o número de rearings dos

animais quando comparado ao grupo controle.

No grupo pré-tratado com flumazenil, o mirtenol aumentou o número de

rearings (5,3 ± 0,4) quando comparado ao grupo que recebeu somente diazepam, de

modo similar ao grupo padrão pré-tratado (5,3 ± 0,6), sugerindo um possível

envolvimento dos receptores benzodiazepínicos nesse processo.

Gráfico 2. Efeito do mirtenol sobre o comportamento de empinar dos animais no teste do campo aberto. Controle (veículo), DZP (Diazepam, 2mg/kg), MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10).




2.1.1. Efeito do mirtenol no teste de coordenação motora (Rota Rod)

Neste ensaio, os animais tratados com mirtenol nas três doses testadas

(175,4 ± 2,3; 179,3 ± 0,6 e 178,1 ± 1,6; respectivamente) não apresentaram

alterações significativas no tempo de permanência na barra giratória em relação ao

controle (179,0 ± 0,6), porém, quando comparadas ao diazepam (160,4 ± 3,4) estas

foram significativamente maiores (Gráfico 3).


2

4

6

8

a

b cb b b

b

nú

me

ro d

e e

mp

ina

me

nto

s

82

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


O diazepam também alterou significativamente o tempo de permanência dos

animais sobre a barra giratória quando comparado ao grupo controle, assim como

ao grupo que recebeu pré-tratamento com flumazenil (179,0 ± 0,5), porém,

reduzindo esse tempo, o que sugere o envolvimento dos receptores

benzodiazepínicos neste processo.

Gráfico 3. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais na barra giratória do Rota Rod. Controle (veículo), DZP (Diazepam, 5mg/kg), MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10).

ap<0,0001 versus Controle,



Quanto ao número de quedas da barra giratória (Tabela 2), nas três doses

testadas (0,6 ± 0,3; 0,6 ± 0,4 e 0,6 ± 0,3; respectivamente), o mirtenol reduziu

significativamente esse parâmetro em relação ao grupo controle (1,1 ± 0,1), com

alteração significativamente melhor do que a droga de referência, neste parâmetro

(2,6 ± 0,2).

O diazepam também alterou o número de quedas dos animais da barra

giratória, porém com aumento significativo, quando em comparação ao grupo

controle.

Neste parâmetro, o flumazenil, administrado como pré-tratamento associado à

menor dose de mirtenol, promoveu um aumento significativo no número de quedas

dos animais da barra (179,0 ± 0,59) quando comparado ao grupo que recebeu

somente diazepam (160,0 ± 3,4), de modo similar ao grupo padrão pré-tratado,

sugerindo possível ação deste monoterpeno sobre os receptores benzodiazepínicos.


50

100

150

200

a

b bb b bb

Te

mp

o d

e p

erm

an

ên

cia

(s

)

83

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Tabela 2. Efeito do mirtenol sobre o número de quedas dos animais.

Grupos Número de quedas

Controle 1,1 ± 0,1

DZP 2,6 ± 0,2a

MIR 25 0,6 ± 0,3a,b

MIR 50 0,6 ± 0,4a,b

MIR 75 0,6 ± 0,3a,b

FLU 1,1 ± 0,2

FLU+DZP 1,1 ± 0,2b

FLU+MIR 25 1,1 ± 0,3b

Controle(veículo); DZP(diazepam, 2mg/kg); MIR(mirtenol 25, 50 e 75mg/kg); FLU(flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10).

ap<0,05

versus Controle; bp<0,05 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-

Keuls como post hoc teste).

2.2. Avaliação da atividade ansiolítica do mirtenol no SNC

2.2.1. Efeito do mirtenol no teste do labirinto em cruz elevado (TLCE)

Os resultados do TLCE (Gráfico 4) mostraram um aumento significante, do

tipo dose-dependente (p<0,05), do número de entradas nos braços abertos nos

grupos tratados com as três doses de mirtenol (6,8 ± 0,3; 5,7 ± 0,6 e 4,3 ± 0,3;

respectivamente), quando comparados ao grupo controle (3,1 ± 0,1). O diazepam

também promoveu aumento significativo no parâmetro avaliado (5,50 ± 0,62),

quando comparado ao grupo controle.

O grupo tratado com a menor dose de mirtenol e pré-tratado com flumazenil

obteve redução significativa do NEBA (3,2 ± 0,1) quando comparado ao grupo que

recebeu somente diazepam, de modo similar ao grupo padrão pré-tratado (3,2 ±

0,1), sugerindo um possível envolvimento dos receptores benzodiazepínicos neste

processo.

84

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Gráfico 4. Efeito do mirtenol sobre o número de entradas dos animais nos braços abertos no TLCE. NEBA (número de entradas nos braços abertos), Controle (veículo), DZP (Diazepam, 2mg/kg), MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10).


bp<0,0001

versus DZP; cp<0,01 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls

como post hoc teste).

Com relação ao tempo de permanência dos animais nos braços abertos

(Gráfico 5), os resultados obtidos demonstraram que, nas três doses testadas (116,5

± 8,3; 103,1 ± 5,4 e 100,9 ± 3,4; respectivamente), houve aumento significativo

desse parâmetro quando comparado ao grupo controle (47,5 ± 2,9). De maneira

similar ao mirtenol, o diazepam também promoveu aumento significativo deste

parâmetro quanto comparado ao grupo controle.

No grupo que recebeu a menor dose de mirtenol e pré-tratamento com

flumazenil houve redução significativa do TPBA (46,8 ± 2,9) quando comparado ao

grupo que recebeu somente diazepam, de modo semelhante ao grupo que recebeu

diazepam após tratamento com flumazenil (47,1 ± 2,3), sugerindo que este

monoterpeno exerce seu efeito, neste parâmetro, através do envolvimento com os

receptores benzodiazepínicos.


2

4

6

8a,c

b

a

b

a

c

b

NE

BA

85

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Gráfico 5. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais nos braços abertos no TLCE. TPBA (tempo de permanência do animal nos braços abertos), Controle (veículo), DZP (Diazepam, 2 mg/kg), MIR (mirtenol: 25, 50 e 75 mg/kg); FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10).


bp<0,0001 versus DZP (ANOVA

seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

2.2.1. Efeito do mirtenol no teste de transição claro – escuro (TTCE)

Os resultados do teste de transição claro-escuro (Gráfico 6) mostraram um

aumento significante do tempo de permanência do animal no compartimento claro

nos grupos tratados com mirtenol nas três doses testadas (244,6 ± 17,4; 191,6 ±

16,4 e 125,9 ± 3,7; respectivamente), do tipo dose dependente, quando comparadas

ao controle (105,1 ± 1,7). Resultado similar foi obtido com a droga de referência

(221,1 ± 6,6) quando comparada também ao grupo controle. A maior dose de

mirtenol também promoveu discreto aumento deste parâmetro (105,8 ± 16,9),

entretanto, sem significância estatística quando comparada ao controle.

No grupo que recebeu a menor dose de mirtenol e o pré-tratamento com

flumazenil os animais reduziram significativamente o tempo de permanência no

compartimento claro (107,3 ± 1,4) quando comparados aos do grupo que recebeu

somente diazepam, de modo congênere ao grupo que recebeu diazepam após

tratamento com flumazenil (105,3 ± 1,6), sugerindo o envolvimento do mirtenol sobre

os receptores benzodiazepínicos neste processo.


50

100

150

a,b

a aa

b bbTP

BA

(s

)

86

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Gráfico 6. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais no compartimento claro no TTCE. TPCC (tempo de permanência no compartimento claro); Controle (veículo); DZP (Diazepam, 2 mg/kg); MIR (mirtenol: 25, 50 e 75 mg/kg); FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10).

ap<0,0001

versus Controle; bp<0,0001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-


3. DISCUSSÃO

Uma etapa importante na investigação de uma nova substância é a

verificação de possíveis reações adversas, as quais são manifestadas por variados

fármacos disponíveis no comércio de medicamentos ansiolíticos. Os

benzodiazepínicos, por exemplo, embora sejam largamente prescritos no tratamento

de condições psíquicas, podem apresentar reações como miorrelaxamento e

sedação nos pacientes que fazem uso, sendo condições consideradas indesejáveis

para um ansiolítico (DE ALMEIDA et al., 2009; ALMEIDA et al., 2010).

Com essas considerações, alguns testes experimentais são utilizados nesta

fase da pesquisa, a fim de identificar possíveis efeitos miorrelaxantes ou sedativos

nos animais sob tratamento com a substância investigada (PULTRINI; GALINDO;

COSTA, 2006). Neste estudo, os ensaios para avaliação dos efeitos do mirtenol

sobre o comportamento motor e possível atividade miorrelaxante e sedativa dos

animais foram realizados através dos testes do campo aberto e Rota Rod.

No teste do campo aberto, buscou-se avaliar a emocionalidade e a atividade

motora do animal, visto que a ambulação e rearing estão relacionados à

coordenação motora efetiva, ao passo que o grooming ao seu estado emocional


100

200

300

a

b

a

a,b

bbTP

CC

(s

)

87

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Discussão

(ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006). Os resultados apresentados neste teste revelaram

ausência de alterações significativas nos três parâmetros observados,

demonstrando que o mirtenol não interferiu no comportamento motor ou

emocionalidade do animal, conforme observado em outros estudos que utilizaram

monoterpenos com atividade ansiolítica (GOMES et al., 2010; NOGUEIRA NETO et

al., 2012; COSTA et al., 2012). O diazepam, neste teste, reduziu o número de

cruzamentos e rearing, demonstrando sua ação sedativa sobre os animais tratados,

enquanto que o parâmetro emocionalidade não foi alterado pela droga padrão. Estes

achados serviram para validar o experimento, demonstrando que o mirtenol,

contrariamente ao diazepam, não promoveu sedação nos animais experimentais.

O teste do Rota Rod tem o intuito de analisar o comportamento motor do

animal sob efeito de substâncias ou compostos bioativos, através do equilíbrio sob a

barra giratória. Neste estudo, os animais tratados com mirtenol e posicionados na

barra não alteraram seu tempo de permanência nem o número de quedas da

mesma, portanto descartando algum efeito relaxante muscular ou mesmo

neurotoxicidade deste monoterpeno, que é comum de algumas drogas com um perfil

de depressora do SNC (DE SOUSA et al., 2007), sugerindo que o mirtenol não

alterou a coordenação motora dos animais, diferentemente da droga padrão, que

causou efeito sedativo nos animais, reduzindo o tempo de permanência destes na

barra e aumentando o número de quedas, um efeito semelhante ao observado no

teste do campo aberto.

O fato de não haver alteração na coordenação motora e emocionalidade dos

animais tratados com mirtenol nos testes de campo aberto e Rota Rod constitui dado

relevante, uma vez que, outros modelos animais específicos para avaliar potencial

ansiolítico de substâncias, como o LCE e o de transição claro-escuro, poderiam

apresentar resultados falso-positivos se a função motora dos animais fosse

comprometida pelo mirtenol (TOLARDO, 2008).

Dessa forma, os resultados dos testes comportamentais com o mirtenol

agregam-se aos estudos já desenvolvidos com outros compostos terpênicos ou

plantas que apresentaram potencial ansiolítico sem, no entanto, alterarem o

comportamento e a atividade locomotora dos animais tratados (SOUSA et al., 2008;

PASSOS et al., 2009).

88

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Os ensaios para avaliação do potencial ansiolítico do mirtenol foram

realizados por meio do teste do labirinto em cruz elevado e de transição claro-

escuro. O teste do labirinto em cruz elevado é um modelo experimental largamente

utilizado na avaliação do efeito ansiolítico de drogas (PELLOW et al., 1985;.

PELLOW; FILE, 1986). Neste experimento foi buscado verificar, através da

preferência do animal pelos braços abertos ou fechados, o potencial ansiolítico ou

ansiogênico (respectivamente) da substância em estudo.

Neste ensaio, a administração do mirtenol aumentou significativamente o

número de entradas e tempo de permanência dos animais nos braços abertos, em

comparação com o grupo controle, sugerindo atividade ansiolítica, similar ao efeito

proporcionado pelo uso da droga padrão e conforme evidenciado em outros estudos

que utilizaram roedores no LCE após administração de monoterpenos (ALMEIDA et

al., 2004; DE ALMEIDA et al., 2012; LIMA et al., 2013). Contrariamente, as doses

testadas de mirtenol promoveram significativa diminuição do número de entradas

dos animais nos braços fechados e redução do tempo de permanência dos roedores

nestes braços, também de maneira similar ao grupo padrão, ratificando o efeito

ansiolítico da substância testada. Estes achados talvez tenham ocorrido porque os

animais podem ter ficado mais seguros para explorar o labirinto, reduzindo o medo

pelo ambiente desconhecido e elevado, revelando o perfil ansiolítico do mirtenol.

O teste de transição claro-escuro é outro ensaio que visa avaliar o potencial

ansiogênico ou ansiolítico de uma planta ou composto. Sob o mesmo princípio,

drogas ansiolíticas favorecem que os animais busquem preferencialmente o

compartimento claro, contrariamente às drogas ansiogênicas, onde o animal busca o

compartimento escuro. Este paradigma experimental baseia-se na aversão inata dos

roedores por áreas iluminadas, além do fato deles possuírem um comportamento

espontâneo de exploração dos ambientes novos (HASCÖET; BOURIN;

DHONNCHADEA, 2001). O resultado da exploração do novo ambiente com a

aversão pelo ambiente iluminado pode desencadear comportamentos comparados à

ansiedade (BOURIN; HASCÖET, 2003).

Neste estudo, os animais que receberam mirtenol aumentaram

significativamente o tempo de permanência no compartimento claro em relação ao

grupo controle. Este resultado serviu para validar o experimento, mostrando que o

mirtenol foi capaz de aumentar o tempo que os animais permaneceram no

89

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


compartimento claro, tendo o diazepam apresentado efeito similar, refletindo o

potencial ansiolítico deste monoterpeno e corroborando os achados no TLCE.

90

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


CAPÍTULO 2

Avaliação do efeito anticonvulsivante do mirtenol

91

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


1. EPILEPSIA E AÇÃO ANTICONVULSIVANTE

Epilepsia é uma condição neurológica que se manifesta por alterações

crônicas e recorrentes, em consquência a anormalidades na atividade elétrica

cerebral (ALMEIDA, 2006). Na fase aguda, é denominada de crise epiléptica, que

pode apresentar-se por alterações na cognição, nos movimentos (involuntários), no

comportamento (automatismo) e outras, dependendo da área cerebral envolvida

(CHAUDHARY; DUNCAN; LEMIEUX, 2011).

O episódio mais crítico na epilepsia é a convulsão, caracterizada por um

comportamento estereotipado envolvendo alterações sensoriais e motoras, onde seu

acometimento e recorrência espontânea são as condições principais para o

diagnóstico de epilepsia em humanos (ENGEL; PEDLEY; AICARDI, 2008 apud

OSES, 2008).

Em animais de laboratório, o quadro de convulsão pode ser induzido por uma

série de metodologias experimentais, como a indução por pilocarpina, picrotoxina,

pentilenotetrazol, eletrochoque e outras (LÖSCHER, 2011).

A pilocarpina (P) é um agonista colinérgico muscarínico utilizado em modelos

experimentais para reproduzir a fisiopatologia das crises convulsivas, possibilitando

identificar novos agentes terapêuticos para o tratamento da epilepsia refratária

(JOPE; MORRISETT; SNEAD, 1986). Estudos anteriores demonstraram que a

administração de pilocarpina induz o desenvolvimento das convulsões, estado de

mal epiléptico e lesão cerebral em roedores (TURSKI et al., 1989; MARINHO et al.,

1997; DE FREITAS; VIANA; FONTELES, 2003), por isso é um método bastante

utilizado como modelo animal de convulsão.

A picrotoxina (PIC) é um estimulante paroxístico do SNC, utilizado para

induzir modelo de epilepsia focal recorrente, para crises do tipo “pequeno mal” ou

crises de ausência (AMBAVADE et al., 2009; RAZA et al., 2010). A capacidade de

reverter o efeito convulsivante induzido pela PIC é um parâmetro válido na

investigação de substâncias com potencial anticonvulsivante, direcionando para

mecanismos que envolvem o sistema GABAérgico, sendo considerada um

antagonista desses receptores (NÓBREGA, 2012).

O pentilenotetrazol (PTZ) é um fármaco com ação convulsivante e

epileptogênica largamento utilizado em estudos experimentais na triagem pré-clínica

92

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


de substâncias com potencial anticonvulsivante (LÖSCHER; SCHMIDT, 1988;

PEDERSEN et al., 2009). Seu mecanismo de ação consiste em interagir com os

canais iônicos dos receptores GABAA, estimulando a produção de glutamato na

amígdala, córtex pré-frontal e líquido céfalo-raquidiano (HALONEN et al., 1992;

ROCHA et al., 1996; WALSH et al., 1999).

O tratamento da epilepsia tem ocorrido com a utilização de diversos fármacos

de classes diferentes, sendo os mais comumente prescritos os benzodiazepínicos

(NÓBREGA, 2012). Entretanto, estas drogas possuem uma variedade de efeitos

adversos, tais como a sedação, hepatotoxicidade, depressão, bradicardia,

tolerância, dentre outros (ALMEIDA, 2006; HUNG; SHIH, 2011).

Nesse sentido, algumas plantas e seus respectivos óleos essenciais têm sido

investigados quanto às suas propriedades anticonvulsivantes (QUINTANS-JÚNIOR

et al., 2007; CAMPÊLO et al., 2011; COSTA, 2012), uma vez que podem agir sobre

os problemas epilépticos com menor ou total ausência de efeitos indesejados,

tornando-se progressivamente importantes nas diversas subcategorias desta

condição neurológica. Em outros estudos, os compostos terpênicos têm sido

preferencialmente estudados, especialmente os monoterpenos, encontrando-se

resultados promissores decorrentes de estudos pré-clínicos (HOSSEINZADEH et al.,

2005; DE SOUSA et al., 2006; DE SOUSA et al., 2007a; DE SOUSA; QUINTANS-

JÚNIOR; ALMEIDA, 2007; SILVA et al., 2009; ALMEIDA et al., 2011).

Sob estes aspectos, o objetivo deste capítulo foi investigar o possível efeito

anticonvulsivante do mirtenol em modelos experimentais de convulsão induzida por

picrotoxina, pentilenotetrazol e pilocarpina, assim como seu possível mecanismo de

ação.

2. RESULTADOS

2.1. Efeito do mirtenol no teste da convulsão induzida por Pilocarpina

Os dados deste teste estão apresentados na Tabela 3. É possível verificar

que o mirtenol, nas três doses testadas, aumentou significativamente o tempo de

latência para as crises e reduziu o percentual de convulsões (35%, 50% e 75%,

93

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


respectivamente) e de mortes (35%, 50% e 75%, respectivamente) quando

comparado com o grupo controle.

A fim de determinar se os efeitos anticonvulsivantes do mirtenol são exercidos

por meio do sistema GABAérgico, os animais foram submetidos ao co-tratamento

com flumazenil, um antagonista do receptor benzodiazepínico. No entanto, a

presença de flumazenil não reverteu totalmente o efeito anticonvulsivante do

mirtenol, que ainda reduziu o percentual de convulsões e de mortalidade dos

animais em 25% quando comparado ao grupo que recebeu somente a maior dose

de mirtenol (150mg/kg).

Tabela 3. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por pilocarpina.

Tratamentos Dose

(mg/kg)

Latência

(s)

% de

convulsões

% de

mortes

Controle - 11,9 0,9 100 100

MIR 50 13,7 0,3a 65b 65b

100 15,8 0,7a,g 50b 50b

150 34,9 0,3a,g,h 25b 25b

DZP 5 0,0 0,0 00b 00b

FLU 5 5 11,8 0,3c 100e 100e

DZP + FLU 5 5 + 5 11,7 0,2c 100e 100e

MIR + FLU 5 150 + 5 12,3 0,4d 75f 75f

Controle (veículo); MIR (mirtenol: 50, 100 e 150mg/kg), DZP (Diazepam, 5mg/kg); FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Valores representam a media ± E.P.M. (n=8).

ap<0,05 versus

Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); bp<0,01 versus Controle (teste

2);

cp<0.001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-

Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); dp<0,001 versus MIR 150mg/kg (ANOVA

seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); ep<0,01 versus

DZP(teste 2);

fp<0,01 versus MIR 150mg/kg (teste

2);

gp<0,05 versus MIR 150mg/kg

(ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); hp<0,05

versus MIR 100mg/kg (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

94

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.3. Efeito do mirtenol no teste da convulsão induzida por Pentilenotetrazol

Os dados deste teste estão apresentados na Tabela 4. É possível verificar

que o mirtenol, nas três doses testadas, aumentou significativamente o tempo de

latência para as crises e reduziu o percentual de convulsões (20%, 25% e 67%,

respectivamente) e de mortes (25%, 25% e 100%, respectivamente) quando

comparado com o grupo controle.

Tabela 4. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por pentilenotetrazol.

Tratamentos Dose

(mg/kg)

Latência

(s)

% de

convulsões

% de

mortes

Controle - 87,3 5,3 100 100

MIR 50 129,3 15,4a 80b 75b

100 123,8 29,7a 75b 75b

150 588,1 114,8a,g,h 33b 00b

DZP 5 900,0 0,0a 00b 00b

FLU 5 5 91,3 0,7 100 100

DZP + FLU 5 5 + 5 89,4 0,9c 100e 100e

MIR + FLU 5 150 + 5 92,3 0,4d 87,5f 87,5f

Controle (veículo); MIR (mirtenol: 50, 100 e 150mg/kg), DZP (Diazepam, 5mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Valores representam a media ± E.P.M. (n=8).

ap<0,05 versus

Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); bp<0,01 versus Controle (teste

2);

cp<0,001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-

Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); dp<0,001 versus MIR 150mg/kg (ANOVA

seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); ep<0,01 versus DZP

(2

test); fp<0,01 versus MIR 150mg/kg (

2 test);

gp<0,05 versus MIR 50mg/kg (ANOVA

seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); hp<0,05 versus MIR

100mg/kg (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

O co-tratamento com o flumazenil não reverteu totalmente o efeito

anticonvulsivante do mirtenol, que ainda reduziu o percentual de convulsões e de

mortalidade dos animais em 12,5% quando comparado ao grupo que recebeu

somente a maior dose de mirtenol (150mg/kg).

95

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.3. Efeito do mirtenol no teste da convulsão induzida por Picrotoxina

Os dados deste teste estão apresentados na Tabela 5. Nos animais pré-

tratados com picrotoxina, o mirtenol, nas duas maiores doses testadas, aumentou

significativamente o tempo de latência para as crises; já em relação ao percentual de

convulsões e de mortes, em todas as doses o mirtenol conseguiu reduzir

significativamente esses parâmetros (redução do percentual de convulsões em

12,5%, 25% e 62,5%, respectivamente; redução do percentual de mortes em 12,5%,

25% e 62,5%, respectivamente) quando comparado com o grupo controle.

Tabela 5. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por picrotoxina.

Tratamentos Dose

(mg/kg)

Latência

(s)

% de

convulsões

% de

mortes

Controle - 522,4 12,7 100 100

MIR 50 487,6 4,9 87,5b 87,5b

100 645,8 3,6a,c 75b 75b

150 954,7 2,3a,c,d 37,5b 37,5b

DZP 5 1.486,2 8,8a 00b 00b

Controle (veículo); MIR (mirtenol: 50, 100 e 150mg/kg), DZP (Diazepam, 5mg/kg). Valores representam a media ± E.P.M. (n=8).

ap<0,05 versus Controle (ANOVA seguido

pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); bp<0,01 versus Controle (teste

2);

cp<0,005 versus MIR 50mg/kg (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls

como post hoc teste); dp<0,001 versus MIR 100mg/kg (ANOVA seguido pelo teste t-


3. DISCUSSÃO

Descobertas seguras e eficazes para o tratamento da epilepsia têm sido uma

preocupação constante. A necessidade de introdução de novas drogas na

terapêutica desta patologia é essencial para o tratamento ou o reforço desta, sempre

buscando alternativas menos tóxicas e com igual ou superior potencial terapêutico

(COSTA, 2012).

96

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Os testes experimentais de convulsão são mecanismos úteis na investigação

de potenciais agentes terapêuticos contra as crises epilépticas, que acarretam

eventos recorrentes de convulsão.

No presente estudo, após receberem doses de mirtenol, observou-se um

significante aumento do tempo de latência para as manifestações convulsivas nos

animais sob indução com picrotoxina, pentilenotetrazol ou pilocarpina, além da

redução no percentual de episódios convulsivos e de mortes.

Os antagonistas específicos utilizados nestes ensaios para verificarem

possíveis mecanismos de ação anticonvulsiva demonstraram que o mirtenol pode

estar envolvido no sistema GABAérgico, modulando a sinalização elétrica cerebral

envolvida nos processos convulsivos. Estes resultados combinados mostraram que

o mirtenol inibe a atividade convulsiva da pilocarpina, pentilenotetrazol e picrotoxina,

e protege os animais contra a morte induzida por convulsões.

Os resultados deste ensaio demonstram que o mirtenol apresenta-se como

um potencial fármaco provavelmente capaz de agir sobre os neurotransmissores

relacionados a algumas desordens neuropsiquiátricas, a exemplo, a epilepsia e seus

subtipos.

97

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


CAPÍTULO 3

Avaliação do efeito neuroléptico do mirtenol

98

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


1. CATALEPSIA E POTENCIAL NEUROLÉPTICO DOS COMPOSTOS NATURAIS

Catalepsia é uma condição psicomotora cuja manifestação clínica caracteriza-

se pela rigidez muscular, que leva à permanência do indivíduo em postura

prolongada, fixa e estática. Quando acompanhada de alterações mentais, passa a

denominar-se catatonia (KAPLAN; SADDOCK; GREBB, 1994/1997; POMMEPUY;

JANUEL, 2002 apud SILVA; SANTOS; HOSHINO, 2010).

Em animais de laboratório, é definida como catatonia ou catatonia

experimental (CESARE; CARLINI, G.; CARLINI, E. 1967; ROGERS; SLATER, 1971),

caracterizando-se pelo tempo em que o animal permanece imóvel na postura que

lhe é imposta (SANBERG et al., 1988). É também caracterizada tanto pela

imobilidade posicional, como pela dificuldade de iniciar movimentos espontâneos

(CORREIA, FERNANDES, BERNARDI, 2008), podendo ser induzida em roedores

através de métodos como o eletrochoque convulsivo, administração de

antipsicóticos (ex. haloperidol), convulsivantes (ex. picrotoxina) e outras drogas que

alterem a neurotransmissão (SANBERG et al., 1988).

Inicialmente definida como um distúrbio motor específico associado a diversas

condições psiquiátricas, no ano de 1874 por Kahlbaum, a catatonia foi

posteriormente restrita à esquizofrenia por Kraeplelin e Bleuler, e mais

recentemente, restabeleceu-se sua correlação com outros transtornos mentais,

notadamente os transtornos de humor, tais como o transtorno bipolar (VAL et al.,

2008), que possui alta prevalência entre a população brasileira (cerca de 8%),

estimando-se que 1,8 a 15 milhões de brasileiros sejam portadores da doença

(ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE TRANSTORNO BIPOLAR – ABTB, 2013).

Algumas classes de psicofármacos (neurolépticos) que têm sido utilizados no

tratamento dessas condições psiquiátricas apresentam efeitos sobre o sistema

locomotor, dentre eles as alterações motoras, especificamente, a acinesia

(incapacidade de iniciar movimentos) e a catatonia (permanência da imobilidade),

desencadeando a necessidade de ajuste de dose, substituição do fármaco ou

associação com benzodiazepínicos (ABREU; BOLOGNESI; ROCHA, 2000).

Por outro lado, quando não é possível a retirada do medicamento que

ocasiona a catatonia, há a associação deste com outros fármacos, que possuem

propriedades inibitórias dos neurotransmissores causadores do efeito indesejado.

99

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Entretanto, essa associação medicamentosa acaba por potencializar a

farmacodependência dos seus usuários, uma vez que, em alguns casos, a

associação ocorre com benzodiazepínicos (ABREU; BOLOGNESI; ROCHA, 2000),

podendo acarretar mais efeitos indesejados para quem faz uso desta terapia.

Com vistas a minimizar possíveis efeitos adversos desses neurolépticos, a

indústria farmacêutica vem ampliando, em larga escala, estudos com novas fórmulas

ou ajustes de doses para que drogas sintéticas possam substituir as já disponíveis

no mercado, de forma a promover maior eficácia e segurança.

Concomitante, essas companhias farmacêuticas também vêm provendo

esforços no sentido de sintetizar produtos à base de compostos naturais que

detenham as mesmas propriedades farmacológicas oferecidas atualmente pelos

sintéticos disponíveis no mercado e ao mesmo tempo consigam evitar o

acometimento por estes eventos, característicos dos neurolépticos comercializados.

Nesse sentido, as plantas e seus respectivos óleos essenciais têm sido

investigados quanto às suas propriedades sobre o sistema nervoso central,

tornando-se progressivamente importantes nas diversas desordens psiquiátricas.

Alguns trabalhos publicados na literatura sobre estudos brasileiros com

plantas e seus efeitos neurolépticos tem sido relatadas, porém em quantidade

bastante incipientes. Ao buscar artigos na base de dados Pubmed, lançando os

termos “plant” and “catalepsy” and “Brazil”, somente 16 artigos foram listados, sendo

sua totalidade desenvolvida a partir de estudos pré-clínicos com extratos de plantas.

É válido mencionar que alguns desses trabalhos evidenciaram reversão dos estados

catatônicos experimentais induzidos nos animais; entretanto, outros estudos

verificaram efeito inverso.

Um estudo realizado com o óleo essencial da colônia [Alpinia speciosa Schum

e Apinia zerumbet (Pers.) Burtt & Smith] identificou propriedades antipsicóticas

através da indução da catalepsia em camundongos tratados com doses

administradas via intraperitoneal, semelhantes ao haloperidol (DE ARAÚJO et al.,

2009; MAIA, 2011). Outro estudo analisou o extrato aquoso da casca de nozes em

animais catatônicos e verificou que o extrato oferece potencial preventivo contra

distúrbios extrapiramidais, em especial, a catalepsia (TREVIZOL et al., 2011).

Outros trabalhos também evidenciaram redução da catalepsia nos animais

experimentais, a partir da utilização dos extratos das plantas investigadas (ALMEIDA

100

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


et al., 1998; FERRAZ et al., 1999; SCHWARZ et al., 2003; MILIOLI et al., 2007;

PEREIRA et al., 2011; BERGAMASCHI et al., 2011).

Em contraste, uma investigação com uma mistura de nove plantas utilizadas

por uma população quilombola do Brasil, conhecida popularmente como tira-capeta,

consumida em forma de cigarros para promover relaxamento, foi investigada quanto

ao seu potencial efeito sobre o SNC de camundongos. O extrato hidroalcoólico

revelou indução de catatonia nos animais pré-tratados, levantando hipóteses de que

o material vegetal pode acarretar reações catalépticas também em humanos

(RODRIGUES et al., 2008).

Outros estudos com extratos de plantas cultivadas e utilizadas como

medicinais no Brasil também revelaram efeito indutor de catalepsia ou

potencializador do efeito cataléptico do haloperidol em animais de experimentação

(ASSIS et al., 2001; SANTOS, K.; SANTOS, C., 2005; DE SOUSA; ALMEIDA, 2005)

Há ainda um estudo que utilizou o extrato das folhas de Ginkgo biloba L. para

verificar seu potencial neuroléptico através do teste de catalepsia em camundongos,

revelando que o extrato potencializou o efeito do haloperidol nos animais testados.

Tais achados são relevantes, uma vez que pode estar havendo uma interação

farmacológica entre o uso do vegetal e o tratamento com o haloperidol em pacientes

portadores de desordens psiquiátricas (FONTANA et al., 2005).

Nesse sentido, e considerando que a indução de catatonia em animais é

preditiva do potencial de indução de efeitos extrapiramidais, limitantes do tratamento

em humanos (ANTONIO et al., 2009), o objetivo deste capítulo foi investigar o

possível efeito neuroléptico deste composto em modelos experimentais de catatonia

induzida por haloperidol, após tratamento agudo com diferentes doses.

2. RESULTADOS

2.1. Efeito do mirtenol no teste da catatonia experimental

Os dados apresentados no Gráfico 7 evidenciam o tempo de catatonia dos

animais nos tempos 15, 60 e 90 minutos após os tratamentos. Na avaliação aos 15

minutos, o mirtenol, em todas as doses testadas, reduziu significativamente o tempo

101

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


de permanência dos animais na posição antifisiológica (2,5 ± 0,3; 3,3 ± 0,2 e 3,4 ±

0,3; respectivamente), quando comparado ao grupo que recebeu haloperidol (29,8 ±

0,3), não apresentando diferenças significativas em relação ao controle (1,4 ± 0,3).

Na avaliação dos 60 minutos, os grupos tratados com mirtenol em todas as

doses testadas (2,0 ± 0,3; 2,3 ± 0,2 e 2,5 ± 0,2; respectivamente) ficaram menos

tempo na posição antifisiológica do que os do grupo padrão (29,8 ± 0,3), não

diferindo estatisticamente em relação ao controle (1,4 ± 0,3).

Na avaliação do tempo de catatonia dos animais aos 90 minutos, o mirtenol

reduziu significativamente esse parâmetro em todas as doses testadas (1,4 ± 0,3;

1,2 ± 0,3 e 1,0 ± 0,3; respectivamente), quando comparado com o grupo padrão

(29,8 ± 0,3), de maneira similar ao grupo controle (1,4 ± 0,3).

Gráfico 7. Efeito do mirtenol sobre o tempo de catatonia induzida por haloperidol nos intervalos mensurados. Controle (veículo); HAL (haloperidol, 1mg/kg); MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg). As colunas representam as médias ± E.P.M. (n=8). ap<0,0001 versus Controle;

bp<0,0001 versus HAL (ANOVA seguido pelo teste

Bonferroni como post hoc teste).

Na avaliação do possível mecanismo de ação do mirtenol neste teste, o co-

tratamento com haloperidol foi realizado nos grupos experimentais, observando-se

que o mirtenol conseguiu reverter a catatonia induzida em todas as doses testadas e

15' 60' 90'0

10

20

30a a

a,b

a

a,b

a

HAL

HAL + MIR 25

MIR 25

HAL + MIR 50

Controle

MIR 50

HAL + MIR 75

MIR 75

a,b

a,b

a,b

a

b b bb bbb

b bb

b

Te

mp

o d

e c

ata

ton

ia (

s)

102

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


nos três intervalos de tempo observados (25mg/kg= 27,9 ± 1,3 [15min]; 27,7 ± 0,5

[60min] e 24,4 ± 1,1 [90min]; 50mg/kg= 26,0 ± 1,3 [15min]; 21,0 ± 0,5 [60min] e 19,4

± 0,8 [90min]; 75mg/kg= 22,3 ± 1,6 [15min]; 1,9 ± 0,5 [60min] e 2,2 ± 0,3 [90min]),

quando comparadas ao grupo que recebeu somente haloperidol (27,8 ± 0,3),

verificando-se que estes resultados apresentaram significância estatística do tipo

dose – tempo (p<0,0001) e sugerindo possível envolvimento dos receptores

dopaminérgicos nesse processo.

Quanto aos resultados do tempo médio total de catatonia induzida por

haloperidol (Gráfico 8), verificou-se que nos grupos que receberam mirtenol, em

todas as doses testadas (0,8 ± 0,4; 1,0 ± 0,5 e 1,1 ± 0,5; respectivamente), este

parâmetro foi similar ao grupo controle (0,5 ± 0,4); porém, houve redução

significativa desse tempo de permanência quando comparado ao grupo padrão (29,7

± 0,2).

Gráfico 8. Efeito do mirtenol sobre o tempo total de catatonia induzida por haloperidol. Controle (veículo); HAL (Haloperidol, 1mg/kg); MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg). As colunas representam as médias ± E.P.M. (n=8).

ap<0,0001 versus

Controle, bp<0,0001 versus HAL;

cp<0,0001 versus MIR 25mg/kg (ANOVA seguido pelo

teste Bonferroni como post hoc teste).

Na investigação do possível mecanismo de ação do mirtenol sobre a atividade

neuroléptica, utilizou-se o co-tratamento com o haloperidol, verificando-se que,

nestes grupos, houve aumento significativo do tempo de catalepsia dos animais

quando comparados ao grupo controle; entretanto, o mirtenol conseguiu reduzir

Controle HAL HAL + MIR25 MIR 25 HAL + MIR 50 MIR 50 HAL + MIR 75 MIR 750

10

20

30a

a,b

a,b

a

b bb

Te

mp

o d

e c

ata

lep

sia

(s

)

103

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


significativamente o tempo de catalepsia dos animais nas doses de 50mg/kg (23,1 ±

1,2) e 75mg/kg (7,8 ± 0,7) quando comparados ao haloperidol, validando os

resultados iniciais e sugerindo possível participação dos sítios dopaminérgicos neste

processo.

3. DISCUSSÃO

É sabido que o sistema dopaminérgico está envolvido com a função motora.

Nesse aspecto, os modelos animais mais empregados para avaliar a função

dopaminérgica de uma substância são a catatonia experimental induzida por

antagonistas dopaminérgicos ou a estereotipia induzida por agonistas (CORREIA;

FERNANDES; BERNARDI, 2008). Estes modelos baseiam-se no aumento da

atividade muscarínica estriatal, decorrente da hipofunção ou bloqueio exercido pelo

antipsicótico nos receptores dopaminérgicos D2-símile, que podem ser verificados

através de manifestações como catalepsia, redução da atividade motora e discinesia

(GMIRO; SERDYUK, 2007; RASMUSSEM; HSU; YANG, 2007).

O teste da catalepsia, como modelo relacionado a alterações no sistema

dopaminérgico, apresenta implicações que podem ser úteis no estudo da doença de

Parkinson e da esquizofrenia (MAIA, 2011). Neste estudo, para avaliar o mirtenol

como um neuroléptico e sua influência sobre o sistema dopaminérgico utilizou-se

este teste experimental, cuja catalepsia é induzida pelo haloperidol, um neuroléptico

utilizado como padrão ouro por antagonizar receptores dopaminérgicos do tipo D2-

símile (SANBERG et al., 1988).

No presente estudo, após receberem doses de mirtenol, observou-se uma

significante redução do tempo de permanência dos animais na posição

antifisiológica, diminuição esta mais evidente em relação ao tempo, onde o mirtenol

conseguiu reduzir o tempo de catalepsia nas três doses testadas, apresentando

melhores resultados aqueles grupos que receberam as doses de 50mg/kg e

75mg/kg, de forma contrária ao grupo somente tratado com haloperidol, o que

tornam válidos os achados obtidos neste ensaio.

É importante salientar que, logo aos 15 minutos, o mirtenol, nas três doses

testadas, conseguiu reverter o efeito catatônico causado pelo haloperidol nos

104

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


animais, embora de maneira parcial, obtendo-se melhores resultados conforme o

tempo e a dose utilizada, demonstrando bons resultados em curto espaço de tempo.

Estes achados sugerem um aumento na concentração de dopamina induzida

pelo mirtenol, possivelmente desbloqueando o haloperidol dos sítios D2-símile, com

conseqüente diminuição do tempo de catatonia, sugerindo que este composto

natural provoca estímulo ao sistema dopaminérgico. Isso sugere também que o

mirtenol estaria atuando na modulação dos neurônios dopaminérgicos, através do

sistema GABAérgico, antagonizando os efeitos extrapiramidais causados pelos

neurolépticos típicos utilizados atualmente nos transtornos psiquiátricos, a exemplo,

o haloperidol.

Os resultados deste ensaio demonstram que o mirtenol apresenta-se como

um potencial composto capaz de agir sobre os neurotransmissores relacionados a

algumas desordens neuropsiquiátricas, a exemplo, a doença de Parkinson e a

esquizofrenia catatônica, diferentemente de alguns produtos naturais já testados

para este fim, mas que, ao invés de obterem resultados favoráveis, induziram a

catalepsia nos roedores (MAIA, 2011; MEDEIROS, 2011; PINTO, 2011).

105

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


CAPÍTULO 4

Avaliação do potencial tóxico do mirtenol

106

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


1. TOXICIDADE E POTENCIAL TÓXICO

Diversas plantas aromáticas e seus respectivos compostos ativos têm sido

investigados quanto às suas propriedades bioquímicas, a fim de serem

posteriormente analisadas quanto às propriedades farmacológicas sobre o sistema

nervoso central, tornando-se progressivamente importantes à medida que

apresentam resposta farmacológica favorável e baixa toxicidade.

De acordo com a toxicologia, toda substância poderá ser considerada um

agente tóxico, variando conforme a condição de exposição, tempo e frequência de

exposição (dose única ou repetida) e via de administração (GRAFF, 2006).

Nos estudos com animais de laboratório, além dos testes para determinação

da dose letal 50% (DL50) de um composto natural, outros parâmetros toxicológicos

devem ser observados, a exemplo, os hematológicos e bioquímicos, pois nem todos

os componentes de uma planta medicinal apresentam efeitos terapêuticos e, quando

o possuem, ainda podem apresentar graus de toxicidade que comprometem a

segurança do mesmo, inviabilizando seu uso em humanos.

Estudos sobre a toxicidade de um composto natural podem verificar de forma

aguda, subcrônica ou crônica, o potencial tóxico do produto investigado. Na

toxicidade aguda, são utilizados grupos de animais com diferentes doses chegando

a 2000 mg/Kg. A dose é administrada uma única vez e o animal é observado por um

período de 14 dias. Posteriormente é verificado se houve morte. O teste tem o

objetivo de identificar se uma dose alta do produto testado têm a capacidade de

gerar efeitos tóxicos no individuo (VALADARES, 2006 apud BEDNARCZUK et al.,

2010).

Já nos testes de toxicidade sub-crônica e crônica o período de exposição é

maior (90 e 120, respectivamente), utilizando doses repetidas, cujo objetivo é

verificar se por um longo período de tempo o produto testado causa efeitos tóxicos

(VILAS BOAS, 2006 apud BEDNARCZUK et al., 2010).

Outros sinais de intoxicação sistêmica podem ser verificados a partir da

redução de massa corporal dos animais experimentais, redução no consumo de

água e ração, diminuição no volume de excretas, além de outros que podem

sinalizar, por exemplo, dano hepático (RAUBER; MELLO F.; MELLO J., 2006).

107

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


A toxicidade de substâncias químicas pode ainda ser verificada através da

análise de determinados órgãos dos animais pré-tratados, como por exemplo, o

fígado, o rim, o coração e o pulmão, uma vez que nestes órgãos as substâncias

tóxicas alteram seus parâmetros, resultando em achados anormais nas avaliações

hematológicas ou bioquímicas.

Nesse contexto, o objetivo deste capítulo foi apresentar o potencial tóxico do

mirtenol, através de parâmetros comportamentais, hematológicos, bioquímicos,

morfológicos e histopatológicos dos animais tratados com este monoterpeno.

2. RESULTADOS

2.1. Determinação da dose letal 50% (DL50)

A toxicidade aguda do mirtenol, administrada em dose única, foi avaliada por

meio do número de mortes por um período de 14 dias. A DL50 estimada para o

mirtenol no ensaio da toxicidade aguda utilizando camundongos machos foi de 296

mg/kg, i.p., com intervalo de confiança de 270,6 a 323,8 mg/kg. Nas duas menores

doses testadas de 100 e 200 mg/kg não houve mortalidade durante o período de

observação de 14 dias.

As alterações comportamentais observadas durante este período ocorreram

somente no primeiro dia e nas maiores doses, onde os animais apresentaram

diminuição da ambulação, resposta ao toque e sedação, características típicas de

drogas depressoras do SNC.

Com esse parâmetro, foi possível testar com segurança as doses testes de

25mg/kg, 50mg/kg e 75mg/kg de mirtenol nos ensaios comportamentais, visto que a

dose letal calculada ficou estimada em 10 vezes mais do que a dose inicial escolhida

para ser testada.

108

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.2. Estudo da toxicidade após doses repetidas (agudo, subagudo, subcrônico

e crônico)

2.2.1. Screening hipocrático

Uma das metodologias utilizadas para avaliar o potencial tóxico do mirtenol

administrado em doses repetidas foi a análise dos animais de acordo com o método

do screening hipocrático, que verifica os efeitos produzidos por uma substância

quanto ao estado de consciência e disposição (aparência geral, frêmito vocal,

irritabilidade), coordenação motora (atividade geral, resposta ao toque, resposta ao

aperto de cauda, contorção abdominal, marcha, reflexo de endireitamento), tônus

muscular (tônus das patas, tônus do corpo, força para agarrar, ataxia), reflexos

(auricular, corneal), atividade do sistema nervoso central (tremores, convulsões,

estimulações, fenômeno de straub, sedação, hipnose, anestesia) e atividade do

sistema nervoso autônomo (lacrimação, ptosis, micção defecação, piloereção,

hipotermia, respiração) do animal (ALVES, 2007; DOS SANTOS E SILVA, 2012).

O Screening hipocrático dos animais tratados com mirtenol de forma aguda

(30 dias), subaguda (60 dias), subcrônica (90 dias) e crônica (120 dias) após doses

repetidas estão apresentados no Quadro 4. Os sinais fisiológicos se mantiveram

constantes nas três doses administradas, com aumento discreto após os

tratamentos, não sendo evidenciados sinais clínicos significativos de toxicidade.

Observa-se nos sinais e sintomas apresentados pelos animais que houve

presença de straub, piloereção, ausência de resposta no aperto da cauda e reflexo

corneal, manifestações características de toxicidade, porém, quando ocorrem de

maneira intensa e associadas a outros parâmetros sugestivos de processos tóxicos.

Neste estudo, essas manifestações constituíram uma resposta orgânica ao

composto estudado, não sendo característica de toxicidade, uma vez que esses

eventos foram discretos e não ocasionaram mortalidade nos animais.

109

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Quadro 4. Screening hipocrático dos animais tratados com mirtenol.

Dose

(mg/kg)

Período

(dias) Sinais e Sintomas

00 30 Ausência de sinais e sintomas de intoxicação.

60 Ausência de sinais e sintomas de intoxicação.



25 30 Aumento de micção e defecação.

60 Aumento de defecação. Presença de straub e piloereção.

90 Aumento de micção e defecação. Presença de straub e

piloereção. Ausência de resposta no aperto da cauda.



50 30 Aumento de micção e defecação. Presença de piloereção.


Ausência de resposta no aperto da cauda e reflexo corneal.





75 30 Aumento de micção e defecação. Presença de straub e

piloereção.




piloereção. Ausência de resposta no aperto da cauda e

reflexo corneal.


piloereção. Ausência de resposta no aperto da cauda e

reflexo corneal.

110

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


O aumento da micção e defecação verificado no screening hipocrático, por ter

sido discreto, pode ter ocorrido apenas pela manipulação dos animais para a

administração das doses diárias, pois a ação do pesquisador pode ocasionar essas

alterações, na maioria das vezes, alterando os hábitos alimentares (CUNHA et al.,

2009), por isso dado não é considerado relevante de toxicidade quando analisado

isoladamente.

Entretanto, mesmo com este entendimento, foram mensurados os pesos dos

animais, o consumo de água e ração, além das excretas apresentadas durante os

mesmos períodos de avaliação do screening hipocrático para verificação de possível

alteração desses parâmetros com indicação de toxicidade.

2.2.2. Massa corporal e consumo de alimentos dos animais

Durante o período de tratamento, foram analisados os consumos de ração

(Gráfico 9) e água (Gráfico 10) dos animais, cujos resultados demonstraram que o

mirtenol, em nenhuma das três doses testadas, alterou significativamente o

consumo destes alimentos, havendo discreto aumento ao longo dos tratamentos e

relação com a dose administrada.

Gráfico 9. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre o consumo de ração dos animais. MIR (mirtenol: 25mg/kg, 50mg/kg e 75mg/kg).

30 60 90 1200

20

40

60

80

100

Controle

MIR25

MIR50

MIR75

Duração do tratamento (dias)

Co

ns

um

o d

e r

aç

ão

(g

)

111

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Gráfico 10. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre o consumo de água dos animais. MIR (mirtenol: 25mg/kg, 50mg/kg e 75mg/kg).

Em relação à produção de excretas, os animais tratados cronicamente com as

três doses de mirtenol não obtiveram alterações significativas em relação ao grupo

controle (Gráfico 11), apresentando oscilações discretas conforme o período de

tempo e a dose relacionada.

Gráfico 11. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre a produção de excretas pelos animais. MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg).

30 60 90 1200

20

40

60

80

Controle

MIR25

MIR50

MIR75


Pro

du

çã

o d

e e

xc

reta

s (

g)

30 60 90 1200

50

100

150

Controle

MIR25

MIR50

MIR75


Co

ns

um

o d

e á

gu

a (

mL

)

112

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Avaliando-se a massa corporal dos animais, considerando ingestão,

eliminação e pesagem dos mesmos, os resultados demonstraram que não houve

mudanças significativas neste parâmetro, mesmo após o período crônico de

tratamento ou com o aumento da dose administrada, havendo discretos aumentos

conforme esses dois aspectos (Gráfico 12).

Gráfico 12. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre a massa corporal dos animais. MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg).

2.2.3. Análise dos parâmetros hematológicos e bioquímicos

Os parâmetros hematológicos e bioquímicos são úteis para a investigação de

toxicidade sistêmica nos animais tratados por longo período de tempo com

substâncias potencialmente nocivas, que ficam alterados frente a essa exposição

(CUNHA et al., 2009).

Neste estudo, os resultados dos parâmetros hematológicos dos animais

tratados com mirtenol estão apresentados na Tabela 6. Os dados demonstram que,

mesmo após o tratamento crônico, não houve alterações significativas nos grupos

tratados com nenhuma das doses de mirtenol testadas, quando comparados aos do

grupo controle.

0 30 60 90 120 0

10

20

30

Controle

MIR25

MIR50

MIR75


Pe

so

có

rpo

reo

(g

)

113

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Tabela 6. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre os

parâmetros hematológicos dos animais.

Parâmetros Controle MIR 25 MIR 50 MIR 75

Hemácias (mm3) 9,97 ± 0,25 10,0 ± 0,73 10,7 ± 0,72 9,28 ± 0,49

Hemoglobina (g/dL) 15,39 ± 0,09 15,9 ± 0,65 15,6 ± 1,10 15,5 ± 0,46

Hematócrito (%) 43,28 ± 1,37 43,2 ± 3,96 43,5 ± 2,75 42,6 ± 2,25

VCM (fL) 49,69 ± 0,07 47,3 ± 1,07 48,1 ± 0,78 49,8 ± 1,00

HCM (pg) 17,67 ± 0,05 17,6 ± 0,37 17,2 ± 0,20 17,9 ± 0,29

CHCM (%) 38,95 ± 0,39 37,5 ± 0,53 36,1 ± 0,21 36,7 ± 0,42

Plaquetas (mm3) 447,40 ± 21,08 443,9 ± 38,85 448,8 ± 11,6 446,2 ± 31,9

Leucócitos totais (mm3) 4,92 ± 0,35 4,89 ± 0,25 4,86 ± 0,37 4,78 ± 1,14

Neutrófilos (%) 15,40 ± 0,89 15,5 ± 1,45 14,96 ± 2,42 15,46 ± 2,22

Eosinófilos (%) 0,31 ± 0,03 0,37 ± 0,16 0,36 ± 0,16 0,37 ± 0,06

Linfócitos (%) 71,19 ± 2,51 72,09 ± 3,52 69,99 ± 2,41 69,95 ± 3,21

VCM (Volume Corpuscular Médio); HCM (Hemoglobina Corpuscular Média); CHCM (Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média); Controle (veículo); MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores representam a média + E.P.M. (n=10).

ap<0,05 versus

Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student–Newman–Keuls como post hoc teste).

Os dados relacionados aos parâmetros bioquímicos dos animais tratados com

mirtenol estão apresentados na Tabela 7. As enzimas hepáticas foram mensuradas

com o intuito de verificar possíveis danos hepáticos ou renais nos animais

experimentais.

Os resultados demonstram que houve uma redução estatisticamente

significativa nos níveis séricos de ácido úrico, triglicerídeos e colesterol total dos

animais tratados, nas três doses de mirtenol, quando comparados com os do grupo

controle. Nos demais parâmetros, nenhuma alteração importante foi verificada.

114

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Tabela 7. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre os

parâmetros bioquímicos de animais.

Parâmetros Controle MIR 25 MIR 50 MIR 75

Glicose (mg dL-1) 90,14 ± 1,43 91,2 ± 4,33 90,4 ± 1,85 89,4 ± 2,07

Uréia (mg dL-1) 50,67 ± 0,31 49,4 ± 1,18 51,7 ± 0,83 48,9 ± 2,03

Creatinina (mg dL-1) 0,37 ± 0,41 0,36 ± 0,03 0,36 ± 0,02 0,37 ± 0,02

Ácido úrico (mg dL-1) 2,41 ± 0,04 2,21 ± 0,17a 2,13 ± 0,21a 2,07 ± 0,23a

Triglicerídeos (mg dL-1) 96,7 ± 0,03 81,1 ± 1,58a 81,2 ± 1,12a 78,6 ± 1,82a

CT (mg dL-1) 85,35 ± 2,41 80,3 ± 2,17a 80,8 ± 2,14a 80,9 ± 2,91a

AST (U mL-1) 85,33 ± 2,05 80,8 ± 4,55 84,3 ± 5,16 87,6 ± 3,87

ALT (U mL-1) 50,34 ± 1,43 50,5 ± 2,10 49,8 ± 2,64 50,3 ± 1,99

Bilirrubina total (mg dL-1) 0,21 ± 0,02 0,21 ± 0,04 0,29 ± 0,01 0,27 ± 0,03

Bilirrubina direta (mg dL-1) 0,11 ± 0,01 0,11 ± 0,02 0,12 ± 0,02 0,10 ± 0,03

CT (Colesterol Total); AST (Aspartato Aminotransferase); ALT (Alanina aminotransferase); Controle (veículo); MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores representam a média + E.P.M. (n=10).

ap<0,05 versus Controle (ANOVA seguido pelo

teste t-Student–Newman–Keuls como post hoc teste).

2.2.4. Análise morfológica macroscópica

Nos estudos de toxicidade de doses repetidas um dos principais parâmetros

avaliados são os sinais tóxicos gerais, alterações alimentares, aspectos laboratoriais

e avaliação anatomopatológica e comportamental (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO,

2008).

Na avaliação anatomomacroscópica dos órgãos removidos dos animais

submetidos a tratamento crônico com mirtenol (Tabela 8), não foram observadas

alterações visuais significativas quando comparados ao grupo controle.

Adicionalmente, não ocorreu variação estatisticamente significante nos pesos

dos órgãos dos animais tratados com diferentes doses de mirtenol em relação ao

grupo controle, após tratamento crônico. A dose administrada também não exerceu

efeito deletério sobre os órgãos analisados após tratamento crônico.

115

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Tabela 8. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre o

peso dos órgãos dos animais.

Órgãos Controle MIR 25 MIR 50 MIR 75

Coração 0,11 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,12 ± 0,02 0,11 ± 0,02

Fígado 0,87 ± 0,01 0,86 ± 0,02 0,86 ± 0,01 0,85 ± 0,01

Baço 0,09 ± 0,00 0,09 ± 0,01 0,08 ± 0,02 0,08 ± 0,03

Rim 0,13 ± 0,00 0,10 ± 0,03 0,12 ± 0,03 0,12 ± 0,01

Cérebro 0,16 ± 0,02 0,16 ± 0,01 0,16 ± 0,03 0,16 ± 0,02

Pulmão 0,15 ± 0,00 0,14 ± 0,01 0,15 ± 0,01 0,15 ± 0,01

Controle (veículo), MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores representam a média + E.P.M. (n=10).

ap<0,05 versus Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student–Newman–


2.2.5. Análise histopatológica

A principal finalidade da análise histopatológica é avaliar a integridade

tecidual dos órgãos extirpados. Dentre os principais parâmetros investigados estão

lesões celulares reversíveis (degenerações) e irreversíveis (necrose e apoptose),

infiltração de leucócitos, congestão, extravasamento de sangue e fibrose (CUNHA et

al., 2009).

Conforme esses parâmetros foram investigados o hipocampo, o corpo

estriado e o fígado dos animais tratados com mirtenol. O grau de lesão foi expresso

através de uma escala percentual de 0 (nenhum) a 100 (total) para cada tecido

examinado. Os animais foram definidos como tendo lesão cerebral quando havia

pelo menos 50% de alteração no tecido investigado.

Na análise histológica hipocampal (Figura 31), os resultados não

evidenciaram nenhuma lesão cerebral na área investigada, após o tratamento agudo

com mirtenol nas três doses testadas quando comparadas com o grupo controle.

A análise do corpo estriado (Figura 32) também revelou a ausência de lesão

após o tratamento com mirtenol quando comparado ao grupo controle.

O tecido hepático dos animais tratados com mirtenol (Figura 33) também

demonstrou a ausência de dano tecidual quando comparados com o grupo controle.

116

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 31. Efeito do tratamento agudo com mirtenol

sobre o hipocampo dos animais experimentais.

(A) Ausência de alterações histopatológicas no hipocampo de camundongos observados por 24 h após administração do Controle (Tween 80 0,05% dissolvido em solução salina 0,9%, i.p.; n=8, Controle; Hematoxilina – Eosina (HE) X100; Barra de Escala = 10 µm); (B, C e D) Ausência de alterações histopatológicas no hipocampo de camundongos tratados com mirtenol nas doses de 25, 50 e 75mg/kg (i.p.; n=8; HE X100; Barra de Escala = 10 µm), respectivamente.


sobre o corpo estriado dos animais experimentais.

(A) Ausência de alterações histopatológicas no corpo estriado de camundongos observados por 24 h após administração do veículo - (Tween 80 0,05% dissolvido em solução salina 0,9%, i.p.; n=8, Controle; Hematoxilina – Eosina (HE) X100; Barra de Escala = 10 µm); (B, C e D) Ausência de alterações histopatológicas no corpo estriado de camundongos tratados com mirtenol nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg (i.p.; n=8; HE X100; Barra de Escala = 10 µm), respectivamente.

117

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________



sobre o tecido hepático dos animais experimentais.

(A) Ausência de alterações histopatológicas no fígado de camundongos observados por 24 h após administração do veículo - (Tween 80 0,05% dissolvido em solução salina 0,9%, i.p.; n=8, Controle; Hematoxilina – Eosina (HE) X40; Barra de Escala = 10 µm); (B, C e D) Ausência de alterações histopatológicas no fígado de camundongos tratados com mirtenol nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg (i.p.; n=8; HE X40; Barra de Escala = 10 µm), respectivamente.

3. DISCUSSÃO

A investigação de efeitos tóxicos, sejam eles agudos ou crônicos, provocados

por substâncias possivelmente farmacológicas, é de grande relevância, visto que

podem interferir em vários mecanismos biológicos, inclusive na produção de células

sanguíneas ou na lesão de órgãos nobres, que revelam papel importante nas

funções vitais do organismo (OLSON et al., 2000; TAN et al., 2008; BRANCO, 2009).

Os estudos de toxicidade aguda objetivam caracterizar a relação

dose/resposta de uma substância que conduz ao cálculo da DL50, ou seja, a dose

que tem efeito letal em 50% dos animais de uma população. Apesar da

impossibilidade de calcular esta dose nos animais tratados com mirtenol, já que essa

se encontra superior a 1.000 mg/kg, isso não indica que o mesmo não apresenta

toxicidade, uma vez que qualquer substância química pode ser tóxica, se a dose ou

118

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


a exposição se tornar suficientemente alta, de modo que as alterações observadas

forem atribuídas às altas doses utilizadas (VASCONCELOS et al., 2007).

Em estudos anteriores de investigação da DL50 do mirtenol, esta foi

determinada em ratos, após administração por via oral, onde os machos

apresentaram 2,45 g/kg, as fêmeas 0,63 g/kg e no geral, a DL50 nesses roedores foi

determinada em 1,4 g/kg (RESEARCH INSTITUTE FOR FRAGRANCE

MATERIALS, 2001; BHATIA et al., 2008). No entanto, não há relatos na literatura de

determinação da DL50 em camundongos, por nenhuma via de administração.

No presente estudo, complementando os ensaios sobre as propriedades

farmacológicas do mirtenol, foi imprescindível investigar também a toxicidade aguda,

subaguda, subcrônica e crônica em doses repetidas, com o propósito de reforçar

seu uso clínico com segurança, pois os estudos toxicológicos crônicos objetivam

descobrir os efeitos qualitativos e quantitativos de uma substância por um longo

período de tempo de exposição, possibilitando a latência para a instalação dos

efeitos tóxicos e seu conseqüente aparecimento após o acúmulo da substância no

organismo (BARROS; DAVINO, 2003; OGA; CAMARGO; BASTITUZZO, 2008;

BRANCO, 2009).

Nesse sentido, foi realizada a avaliação do potencial tóxico por meio do

screening hipocrático. Além disso, foi mensurado o consumo alimentar, o volume de

excretas produzido e a massa corporal dos animais, assim como foram investigados

os parâmetros bioquímicos e hematológicos, efetuada a análise macroscópica

morfológica dos órgãos nobres e os estudos histopatológicos dos hipocampos dos

animais de cada grupo experimental, após os 120 dias dos protocolos.

Na avaliação geral da toxicidade, os sinais de toxicidade sistêmica são

definidos verificando-se as reduções na massa corporal dos animais experimentais

(RAZA et al., 2002), a redução nos consumos de água e ração, a alterações de

comportamento, a presença de piloereção, dentre outros (CUNHA et al., 2009). O

screening hipocrático tem sido um método bastante útil e comumente usado nessa

triagem preliminar de plantas e/ou compostos químicos para detectar essas

atividades farmacológicas e toxicológicas (LUCIO et al., 2000), assim, como os

hábitos fisiológicos diários (ingestão de ração e água e volume de excretas).

Neste estudo, os resultados do screening hipocrático revelaram boa

tolerabilidade do mirtenol em roedores, embora alguns sinais clínicos de toxicidade

119

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


tenham sido apresentados ao longo dos dias observados, como a presença de

straub e piloereção. Além disso, a baixa mortalidade dos animais também foi

considerada um dado positivo no estudo, por conferir segurança no uso desta

substância em animais, gerando expectativas promissoras para estudos clínicos

futuros.

Na toxicidade subaguda, os sinais de toxicidade sistêmica podem ser

verificados pela redução na massa corporal dos animais experimentais (RAZA et al.,

2002; TEO et al., 2002). Além desse parâmetro, a toxicidade sistêmica também pode

se manifestar com a redução nos consumos de água e ração, alterações de

comportamento, apatia ou condição da pelagem, como a piloereção (CUNHA et al.,

2009).

Quanto aos estudos de toxicidade sub-crônica e crônica, estes se diferenciam

pelo período de exposição dos animais à substância testada, onde o objetivo é

verificar se por um longo período de tempo de exposição o produto testado causa

efeitos tóxicos (VILAS BOAS, 2006 apud BEDNARCZUK et al., 2010).

Em relação ao consumo de ração e água, não houve diferenças significativas

desses parâmetros ao longo dos dias observados, bem como o volume de excretas

foi proporcional ao ingerido, o que confere ausência de interferência do mirtenol

sobre esses parâmetros.

O acompanhamento da massa corporal do animal, outro importante indicador

para a avaliação da toxicidade de uma substância administrada (DA SILVA et al.,

2012), possibilitou verificar que, após administração de doses repetidas, o mirtenol

inicialmente aumentou a massa corporal dos animais, com discreta redução ao

longo dos tratamentos, o que indica ausência ou mínimo grau de toxicidade deste

composto, visto que esta perda não ultrapassou 10% do peso inicial do animal

(FÉRES et al., 2006).

Na avaliação dos parâmetros hematológicos, nem hepatotoxicidade, nem

quaisquer outros efeitos toxicológicos foram observados nos roedores tratados com

mirtenol. Nos parâmetros bioquímicos, as enzimas que denunciam lesão hepática

quando estão aumentadas, não tiveram alteração significativa neste estudo.

Contrariamente, a redução pequena, porém estatisticamente significativa, dos níveis

séricos de colesterol total, triglicerídeos e ácido úrico dos animais tratados com

mirtenol, sugere uma possível utilização deste monoterpeno para o tratamento de

120

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


dislipidemias, gota ou outras patologias nos quais estes parâmetros respondam pela

fisiopatologia inerente.

Quanto ao estudo morfológico macroscópico, não houve alteração na forma

ou no peso dos órgãos estudados (coração, rins, fígado, baço, cérebro e pulmão)

dos animais tratados com as doses de mirtenol, o que reforça os achados nos

demais parâmetros quanto à baixa toxicidade deste monoterpeno.

Estudos da ação de compostos isolados ainda são incipientes, entretanto a

avaliação de outros monoterpenos, de modo semelhante ao mirtenol, em roedores,

demonstrou que as substâncias não causaram efeitos colaterais ou tóxicos (COSTA

et al., 2012; SOUTO-MAIOR et al., 2011). Desse modo, os resultados aqui

apresentados corroboram a literatura encontrada no que se refere aos estudos de

toxicidade utilizando compostos naturais.

Entretanto, apesar do conhecimento de que os monoterpenos são muitas

vezes considerados como tendo baixa toxicidade (DE SOUSA et al., 2007; TANAKA

et al., 1996 apud CAMPÊLO, 2011), sugere-se que estudos adicionais sejam

realizados para avançar na avaliação da segurança do uso do mirtenol em futuros

estudos clínicos.

121

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


CAPÍTULO 5

Avaliação da atividade antioxidante do mirtenol

122

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


1 ESTRESSE OXIDATIVO E AÇÃO ANTIOXIDANTE

O estresse oxidativo ocorre quando radicais livres de oxigênio são gerados

em excesso pela redução do oxigênio. As espécies reativas do oxigênio (ROS)

consistem radicais livres de oxigênio e entidades associadas que incluem

superóxido, peróxido de hidrogênio e óxido nítrico (CHONG; LI; MAIESE, 2005).

Muitas dessas espécies são geradas durante condições fisiológicas normais,

em resposta a estímulos internos e externos. Baixos níveis de ROS podem ser

fundamentais em diversos processos, incluindo apoptose, imunidade e defesa contra

microorganismos. Por outro lado, altas concentrações ou remoção inadequada das

ROS por sistemas antioxidantes endógenos resultam em estresse oxidativo, que

pode causar disfunções metabólicas severas e danos a macromoléculas biológicas.

Assim, o estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio gerado pelo excesso

de ROS e/ou pela depleção das defesas antioxidantes (MATÉS; SÁNCHEZ-

JIMÉNEZ, 1999 apud ABREU, 2009).

O estresse oxidativo no cérebro ocorre quando a geração de ROS supera a

habilidade dos sistemas antioxidantes endógenos em remover o excesso de ROS,

acarretando dano celular (ABREU, 2009). Além disso, representa uma via

significativa que leva à destruição de células neuronais e vasculares no SNC. Com

isso, a produção de ROS pode levar à injúria, através da destruição da membrana

lipídica e quebra do DNA (CHONG; LI; MAIESE, 2005).

Nesse processo, o sistema de defesa antioxidante inicia sua ação para inibir

e/ou reduzir danos causados pelas ROS. Tais ações podem ser alcançadas por

meio de diferentes mecanismos: impedindo sua formação [sistema de prevenção],

impedindo sua ação [sistemas varredores] ou reparando as estruturas biológicas

lesadas [sistemas de reparo] (CLARKSON; THOMPSON, 2000; KOURY;

DONANGELO, 2003 apud BARBOSA et al., 2010).

Esse sistema de defesa é operacionalmente dividido em não-enzimático e

enzimático, onde o primeiro é constituído por grande variedade de substâncias que

podem ter origem endógena ou dietética, a exemplo, a vitamina C, enquanto que o

segundo inclui as enzimas Superóxido Dismutase (SOD), Catalase (CAT) e

Glutationa Peroxidase (GPx), que agem por meio de mecanismos de prevenção,

123

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


impedindo e/ou controlando a formação de radicais livres e, consequentemente,

evitando o dano oxidativo (BARBOSA et al., 2010).

Frente a esse contexto, o objetivo deste capítulo foi apresentar o possível

efeito antioxidante do mirtenol sobre as ROS e as enzimas antioxidantes, através de

metodologias in vitro e in vivo, assim como o seu possível mecanismo de ação

antioxidante.

2. RESULTADOS

2.1. Efeito antioxidante in vitro do mirtenol

2.1.1. Efeito do mirtenol sobre a produção de espécies reativas com o ácido

tiobarbitúrico (TBARS)

A peroxidação lipídica foi analisada inicialmente pelo método de quantificação

de TBARS, que é um ensaio largamente utilizado para estimar a peroxidação dos

lipidios nas membranas e sistemas biológicos. Para realizar essa quantificação, foi

necessário inicialmente utilizar o AAPH, um composto hidrossolúvel cuja

decomposição produz nitrogênio molecular, o qual reage com o ácido tiobarbitúrico,

formando TBARS. Neste método, a verificação de inibição de TBARS significa a

redução de radicais livres por diminuição da peroxidação lipídica sobre a membrana

celular (Gráfico 13).

Por este método, observou-se que o mirtenol conseguiu inibir, de modo

estatisticamente significante, a quantidade de TBARS formado em aproximadamente

60%, e consequentemente, preveniu a peroxidação lipídica em todas as

concentrações adotadas, permitindo destacar que a menor concentração utilizada

(0,9 µg/ml) conseguiu exercer efeito semelhante ao das concentrações maiores (1,8;

µg/ml; 3,6µg/ml; 5,4µg/ml e 7,2µg/ml), com inibições de 55,4%; 60,3%; 60,7%;

60,3% e 63,6%; respectivamente, quando comparadas ao AAPH.

124

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Gráfico 13. Efeito do mirtenol sobre a produção de TBARS. Controle (veículo); AAPH (100% de dano oxidativo); (concentrações de mirtenol: 0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e 7,2µg/mL); Trolox 140 µg/mL (controle positivo). Valores representam média ± E.P.M, (n=5), experimentos em duplicata.

ap<0,001 versus AAPH (ANOVA seguido do teste t-Student-

Neuman-Keuls como post hoc teste).

O mirtenol também conseguiu inibir a quantidade de TBARS em maior escala

do que a concentração de Trolox (aproximadamente 45%), um análogo sintético da

vitamina E que protege as membranas do dano oxidativo in vivo, sendo utilizado

como padrão antioxidante neste tipo de ensaio.

Verificou-se ainda que o mirtenol, além de diminuir os níveis de peroxidação

lipídica, promoveu a inibição de 50% da produção de TBARS com um valor de CI50

de aproximadamente 0,61µg/mL, variando de 0,31 a 1,18µg/mL (IC=95%).

2.1.2. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical nitrito (NO scavenging)

O método de remoção do radical nitrito baseia-se na produção de óxido nítrico

(NO) pela decomposição espontânea de nitroprussiato de sódio em solução aquosa

e de seu desdobramento em íons nitrito, resultante da interação com o oxigênio.

Estes íons, que possuem forte poder oxidante, podem ser medidos pela reação de

Griess (BASU; HAZRA, 2006).

Com este método, uma substância que tenha afinidade com o NO é

competitiva do oxigênio, o que resulta na diminuição da produção de nitritos,

caracterizando a atividade antioxidante desta substância (SERAFINI et al., 2011;

AHMADI et al., 2010).

ControlAAPH0,9 ng/ml1,8 ng/ml3,6 ng/ml5,4 ng/ml7,2 ng/mlTrolox0

25

50

75

100

125Controle

AAPH

0,9 µg/ml

1,8 µg/ml

3,6 µg/ml

5,4 µg/ml

7,2 µg/ml

Trolox

aa a a a

a

_________________________

mirtenol

Nív

el

de

TB

AR

S (

% A

AP

H)

60% 45%

125

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Neste ensaio (Gráfico 14), o mirtenol apresentou efeito positivo significante na

atividade sequestrante do radical nitrito em todas as concentrações testadas,

reduzindo 41,5%; 47,1%; 49%; 48,8% e 55,2% (respectivamente) da produção de

nitritos do grupo NPS. O Trolox, um análogo sintético do α-tocoferol, usado como

padrão antioxidante, também apresentou redução significativa de íons nitrito em

torno de 59,8%. Este resultado permite verificar a atividade antioxidante

demonstrada pelo mirtenol, que foi similar à efetuada pelo Trolox.

Gráfico 14. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical nitrito. NPS (produção de nitrito por meio da decomposição espontânea do nitroprussiato de sódio, considerada 100% da produção de óxido nítrico); (concentrações de mirtenol: 0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e 7,2µg/mL); Trolox 140µg/mL (controle positivo). Valores representam a média ± E.P.M. (n = 5), experimentos em duplicata.

ap<0,001 versus NPS (ANOVA seguida pelo teste t-


A concentração inibitória 50% (CI50), que expressa a concentração do mirtenol

que é capaz de remover 50% do radical nitrito livre formado, foi de 0,086µg/mL,

variando de 0,04 a 0,17µg/mL (IC=95%).

2.1.3. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical hidroxila (OH scavenging)

No método de remoção do radical hidroxila, verifica-se que a capacidade de

uma substância remover este radical está diretamente relacionada à sua atividade

antioxidante (COSTA et al., 2012). Neste método, o radical hidroxila é obtido pela

reação de Fenton, que por sua vez degrada a desoxirribose em malondialdeído,

ControlSNP 0,9 ng/ml1,8 ng/ml3,6 ng/ml5,4 ng/ml7,2 ng/mlTrolox0

25

50

75

100

125Controle

NPS

0,9 µg/ml

1,8 µg/ml

3,6 µg/ml

5,4 µg/ml

7,2 µg/ml

Trolox

a

a aaa

a

____________________________

mirtenol

Pro

du

çã

o d

e n

itri

to

(% d

e i

nd

uç

ão

pe

lo N

PS

)

59,8%

48,3%

126

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


tornando possível sua quantificação (SERAFINI et al., 2011; PRIOR; WU; SCHAICH,

2005).

Neste ensaio (Gráfico 15), verificou-se que o mirtenol foi capaz de remover o

radical hidroxila de maneira significante somente na maior concentração testada

(redução de 7,2%), porém esta atividade antioxidante foi menor do que a droga

padrão, que demonstrou melhor resposta antioxidante do que a substância em

estudo, reduzindo aproximadamente 78% do radical formado.

Gráfico 15. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical hidroxila. Sistema (produção de MDA gerado pela degradação da 2-desoxirribose na presença do FeSO4 e H2O2); (concentrações de mirtenol: 0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e 7,2 µg/mL); Trolox 140 µg/mL (controle positivo). Valores representam a média ± E.P.M. (n=5), experimentos em duplicata.

ap<0,001 versus Sistema (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls

como post hoc teste).

Estes resultados demonstram que, embora o mirtenol não tenha removido o

radical hidroxila em todas as concentrações testadas, na concentração maior houve

atividade antioxidante significante.

Contudo, é válido ressaltar que este método possui uma desvantagem em

relação ao método de remoção do radical nitrito, porque muitos antioxidantes

também têm propriedade quelante de metais. Assim, é impossível distinguir se a

ação do mirtenol poderia ser a de remover radical hidroxila ou apenas funcionar

como quelante (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005), o que torna menos significante o

resultado apresentado neste ensaio.

ControlSystem0,9 ng/ml1,8 ng/ml3,6 ng/ml5,4 ng/ml7,2 ng/mlTrolox0

25

50

75

100

125Controle

Sistema

0,9 µg/ml

1,8 µg/ml

3,6 µg/ml

5,4 µg/ml

7,2 µg/ml

Trolox

a

a

________________________

mirtenol

de

gra

da

çã

o d

a 2

-de

ox

irri

bo

se

(%

)

78%

7,2%

127

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


A concentração inibitória de 50% (CI50), que expressa a concentração do

mirtenol que é capaz de remover 50% do radical hidroxila livre formado, foi de

1,51µg/mL, variando de 0,95 a 2,40µg/mL (IC=95%).

2.2. Efeito antioxidante in vivo do mirtenol

2.2.1.Efeito do mirtenol sobre a peroxidação lipídica

A lipoperoxidação acarreta alterações na estrutura e na permeabilidade das

membranas celulares, com conseqüente perda da seletividade na troca iônica e

liberação do conteúdo de organelas celulares, como as enzimas hidrolíticas dos

lisossomos, e formação de produtos citotóxicos, culminando em morte celular

(ABREU, 2009).

O efeito do mirtenol sobre os níveis de peroxidação lipídica está apresentado

no Gráfico 16. Foi possível verificar que o mirtenol, nas três doses testadas (25, 50 e

75mg/kg), reduziu de maneira significante (84,5%; 87,3% e 88,7%, respectivamente)

os níveis de lipoperoxidação quando comparado ao grupo controle, obtendo

melhores resultados do que a vitamina C (redução de 56%), que é usada como

padrão antioxidante.

Gráfico 16. Efeito do mirtenol sobre o nível de peroxidação lipídica em hipocampo dos animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M (n=8).

ap<0,001 versus

Controle; bp<0,001 versus AC (ANOVA seguido do teste t-Student-Neuman-Keuls como

post hoc teste).

Controle AC 250 MIR25 MIR50 MIR750.0

0.5

1.0

1.5

a,ba,ba,b

a

Nív

el

de

pe

rox

ida

çã

o l

ipíd

ica

(nm

ol

de

MD

A/g

de

te

cid

o)

56%

86%

128

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2.2.2. Efeito do mirtenol sobre a concentração de nitrito

A avaliação da concentração de nitrito possibilita verificar o processo de

formação de radicais livres de nitrogênio, que estão presentes em variados

processos de estresse oxidativo.

Neste ensaio (Gráfico 17), o mirtenol, nas três doses testadas (25, 50 e 75

mg/kg), reduziu de maneira significante 84,1%, 85,1% e 86,6% (respectivamente) o

teor de nitrito quando comparado ao grupo controle, obtendo melhores resultados do

que a vitamina C (redução de 24,5%).

Gráfico 17. Efeito do mirtenol sobre o teor de nitrito no hipocampo dos animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M. (n=8).

ap<0,0001 versus

Controle; ap<0,0001 versus Controle;

bp<0,0001 versus AC (ANOVA seguido do teste t-


2.2.3. Efeito do mirtenol sobre a atividade da catalase (CAT)

A catalase é uma enzima encontrada em todos os organismos conhecidos e

está envolvida em processos nos quais as células estão expostas a processos de

estresse oxidativo (MICHELS et al., 1994 apud FRAGOSO, 2007).

Neste ensaio (Gráfico 18), o mirtenol, nas três doses testadas (25, 50 e

75mg/kg), aumentou de maneira significante (88%, 94% e 125%, respectivamente) a

Controle AC 250 MIR25 MIR50 MIR750

40

80

120

a

a,b a,b a,bCo

nte

úd

o d

e n

itri

to (

nM

)

24,5%

85,3%

129

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


atividade da catalase quando comparado ao grupo controle; entretanto, esse

aumento foi inferior ao efetuado pela vitamina C (aumento de 144%).

Gráfico 18. Efeito do mirtenol sobre a atividade da catalase no hipocampo dos animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M. (n=8).

ap<0,0001 versus

Controle; ap<0,001 versus Controle;

bp<0,01 versus AC (ANOVA seguido do teste t-


2.2.4. Efeito do mirtenol sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD)

Esta enzima é necessária para manter a vida em condições aeróbicas e

parece ser a primeira envolvida na linha de defesa contra radicais livres derivados

de oxigênio e pode ser rapidamente induzida em condições de exposição das

células orgânicas ao estresse oxidativo (MICHIELS et al., 1994 apud FRAGOSO,

2007).

Neste ensaio (Gráfico 19), o mirtenol, em todas as doses testadas (25, 50 e

75mg/kg), aumentou a atividade da SOD, sendo significante nas duas maiores

doses (35% e 44%, respectivamente) quando comparado ao controle. Todas as

doses aumentaram a atividade da SOD em percentual maior do que a vitamina C

(aumento de 17%).


25

50

a

a,ba,b

a

Ca

tala

se

(mm

ol/

min

/mg

de

pro

teín

a)

144% 102,3%

130

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Gráfico 19. Efeito do mirtenol sobre a atividade da superóxido dismutase no hipocampo dos animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M. (n=8). ap<0,05 versus Controle (ANOVA seguido do teste t-Student-Neuman-Keuls como post

hoc teste).

2.2.5. Efeito do mirtenol sobre a atividade da glutationa reduzida (GSH)

A glutationa reduzida é uma enzima considerada das mais importantes no

sistema de defesa antioxidante da célula, protegendo-a contra a lesão resultante da

exposição a agentes como íon ferro, radiação e luz ultravioleta (DENEKE;

FANBURG, 1989 apud ABREU, 2009).

Neste ensaio (Gráfico 20), o mirtenol, em todas as doses testadas (25, 50 e

75 mg/kg), aumentou de maneira significante a atividade da GSH (8,9%; 12,8% e

14,9%; respectivamente) quando comparado ao grupo controle. Todas as doses

aumentaram a atividade da GSH em percentual significativamente maior do que a

vitamina C (aumento de 6,2%).


1

2

3

4a

a

Su

pe

róx

ido

dis

mu

tas

e

(U/m

g d

e p

rote

ína

) 17%

39,5%

131

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Gráfico 20. Efeito do mirtenol sobre a atividade da glutationa reduzida no hipocampo dos animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M. (n=8). ap<0,001 versus Controle;

bp<0,01 versus AC (ANOVA seguido do teste t-Student-

Neuman-Keuls como post hoc teste).

3. DISCUSSÃO

Neste estudo foi possível investigar a atividade antioxidante do mirtenol, por

meio de ensaios in vitro e in vivo. Quanto aos estudos in vitro, investigou-se sua

capacidade de reduzir a peroxidação lipídica, empregando-se o método de produção

de espécies reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS assay), remoção do radical

nitrito (NO-scavenging assay) e remoção do radical hidroxila (OH-scavenging assay)

(ZIN; ABDUL-HAMID; OSMAN, 2002; FITÓ; LA TORRE; COVAS, 2007; MOON;

SHIBAMOTO, 2009; SERAFINI, et al., 2011).

Os achados do ensaio de TBARS sugerem que o mirtenol pode proteger dos

processos oxidativos as biomoléculas essenciais ao funcionamento de órgãos

nobres, como o cérebro e o coração, de modo semelhante aos observados em

outros estudos utilizando monoterpenos (GUIMARÃES et al., 2010; COSTA, 2012).

Na avaliação da produção de íons nitrito, houve uma diminuição significativa

na sua produção pelo mirtenol, o que demonstra a propriedade antioxidante deste


300

600

900a,ba,b

a

Nív

el

de

Glu

tati

on

a r

ed

uzid

a

(ng

/g d

e t

ec

ido

)

6,2%

12,2%

132

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


monoterpeno, favorecendo a proteção das biomoléculas contra danos causados

pelos radicais livres derivados do nitrogênio.

O óxido nítrico desempenha um papel importante em vários tipos de

processos inflamatórios. É produzido por macrófagos no processo de resposta

orgânica inflamatória. Alguns estudos conferem propriedades mutagênicas, pois

interfere no reparo do DNA de maneira negativa (OKOKO, 2009). Além disso,

acredita-se que o NO pode estar implicado na gênese de doenças do sistema

nervoso central (COSTA, 2012), conferindo a necessidade de mais pesquisas

relacionadas ao desenvolvimento de novos compostos antioxidantes,

preferencialmente de origem natural, que confiram segurança e eficácia.

O radical hidroxila, de modo similar ao radical nitrito, é altamente reativo e

pode causar dano oxidativo ao DNA, lipídios e proteínas, apresentando efeitos

citotóxicos, mutagênicos e carcinogênicos (SHUKLA et al., 2009). O mirtenol,

embora não tenha removido o radical hidroxila em todas as concentrações testadas,

conseguiu removê-lo na maior concentração utilizada, apresentando-se como

agente protetor das membranas celulares contra os danos oxidativos provenientes

deste radical e potencial agente terapêutico nas patologias de origem oncogênica

(EVSTATIEVA et al., 2010; MEDINA-HOLGUÍN et al., 2008), necessitando de

posteriores investigações que melhor explorem esta questão.

Adicionalmente, para ampliar as evidências acerca do potencial antioxidante

do mirtenol, foram realizados testes in vivo, utilizando as metodologias que

investigaram a lipoperoxidação, o teor de nitrito e as atividades das enzimas

antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa reduzida nos tecidos

cerebrais dos animais tratados com este monoterpeno.

Um importante efeito demonstrado pelo mirtenol neste estudo foi a diminuição

dos níveis de peroxidação de lipídios e de nitrito no tecido cerebral dos animais

tratados com este monoterpeno, pois estudiosos acreditam que o NO pode estar

implicado na neurogênese de doenças do sistema nervoso central (COSTA, 2012),

sendo desta forma de fundamental importância a busca por novos compostos

naturais que tenham propriedades antioxidantes para espécies reativas ao oxigênio

e ao nitrogênio.

Também foi verificado o aumento da atividade das enzimas antioxidantes

investigadas, onde o mirtenol conseguiu promover esse aumento de maneira

133

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significativa em todas as doses testadas e em todas as enzimas analisadas, sendo

melhor do que o efeito antioxidante promovido pela vitamina C, considerada

substância de referências em estudos desta natureza. Assim, os resultados obtidos

nesses ensaios in vivo ratificam os já evidenciados no estudos in vitro quanto à

atividade antioxidante do mirtenol.

Os resultados obtidos com os testes para avaliação do potencial antioxidante

de substâncias demonstraram um efeito benéfico do mirtenol sobre a modulação

antioxidante enzimática no SNC dos roedores, confirmando os achados nos ensaios

in vitro, o que o torna um composto capaz de aumentar a proteção do cérebro contra

danos oxidativos, contribuindo assim para o retardamento de sua deterioração, já

que diminuiu a peroxidação lipídica e a produção de nitrito e aumentou as

concentrações de glutationa reduzida, catalase e superóxido dismutase, agindo

como um potencial composto antioxidante.

134

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CAPÍTULO 6

Prospecção do mirtenol no tratamento da ansiedade

135

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1. APLICAÇÕES DO MIRTENOL E GERAÇÃO DE PROPRIEDADE INTELECTUAL

As desordens que afetam o sistema nervoso central configuram crescente

interesse dos pesquisadores da área, sobretudo quando se pretende o

desenvolvimento de psicofármacos que consigam exercer suas propriedades

terapêuticas com o mínimo de reações indesejáveis e/ou adversas.

Os óleos essenciais e seus compostos aromáticos, em geral, apresentam tais

características e por isso têm sido alvo de diversos estudos no sentido de verificar

suas atividades farmacológicas sobre o SNC, onde alguns deles já se encontram

elucidados como agentes antiinflamatórios, analgésicos e anticonvulsivantes,

conforme pode ser verificado através dos estudos científicos publicados no âmbito

nacional e internacional, desencadeando a necessidade de também identificar

aqueles que apresentem atividade ansiolítica, capazes de exercer efeitos similares

às drogas disponíveis no comércio, mas com menores efeitos indesejáveis.

O mirtenol é um álcool natural primário com larga utilização na composição de

produtos de limpeza, detergentes, xampus, sabonetes e outros artigos de higiene.

Entretanto, seu uso na indústria farmacêutica tem sido incipiente, devido à ausência

de estudos que verificassem a existência de propriedades terapêuticas, tais como a

antioxidante, ansiolítica, sedativa e outras com influência sobre o sistema nervoso

central.

Entretanto, testes in vitro já comprovaram a atividade antioxidante do mirtenol,

quando experimentado em protocolos experimentais específicos, que apontaram sua

ação sobre a peroxidação lipídica com a remoção de radicais livres, indo atuar

diretamente contra o estresse oxidativo e conseqüente dano celular.

Quanto aos estudos in vivo, realizados com ratos e camundongos sobre os

efeitos ansiolíticos do mirtenol, estes revelaram que baixas doses são capazes de

alterar significativamente o comportamento dos roedores em diversos testes

experimentais, dentre eles, o Campo aberto, Rota Rod, Labirinto em cruz elevado e

Transição claro-escuro, tendo, em todos eles, resultados melhores ou similares as

drogas consideradas padrão ouro no tratamento da ansiedade, a exemplo o

diazepam. Além disso, diferentes vias de administração também foram testadas nos

modelos animais de ansiedade (via oral - gavagem, via intraperitoneal), conferindo-

se ao mirtenol boa absorção e resposta farmacológica em todas elas.

136

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Com estes resultados, pretende-se ampliar os testes para uso clínico, o que

corresponderá às fases II, III e IV, findando-se na comercialização deste bioproduto

para os diversos públicos, cuja reivindicação de propriedade intelectual já foi

solicitada.

2. REGISTRO DE PATENTES DO MIRTENOL

A fim de verificar o histórico de registros de patentes relacionadas ao mirtenol,

efetuou-se uma pesquisa de prospecção durante o mês de junho de 2013, a partir

de consulta aos bancos de dados Espacenet (EP), Instituto Nacional de Propriedade

Intelectual (INPI) e United States Trademark Office (USPTO). Inicialmente, foram

analisados nos bancos de dados do INPI, USPTO e EP as palavras-chave

“mirtenol”, “ansiedade”, “neuroléptico”, “antioxidante”, “mirtenol and ansiedade”,

“mirtenol and neuroléptico”, “mirtenol and antioxidante”, nos idiomas português e

inglês, conforme apresentado na Tabela 9.

Tabela 9. Patentes encontradas nas bases de dados.

Palavras-chave INPI USPTO EP

Mirtenol (Myrtenol) 1 152 15

Ansiedade (Anxiety) 527 20.766 14.749

Mirtenol and ansiedade (Myrtenol and anxiety) 0 0 0

Neuroléptico (Neuroleptic) 10 3.205 1.229

Mirtenol and neuroléptico (Myrtenol and neuroleptic) 0 0 0

Antioxidante (Antioxidant) 460 60.322 37.787

Mirtenol and antioxidante (Myrtenol and antioxidant) 0 0 0

TOTAL 998 236.293 53.780

Fonte: INPI, USPTO, EP (Junho/2013).

Usando somente a palavra “mirtenol (myrtenol)” foram encontradas 168

patentes nas bases investigadas; entretanto, para verificar quais destas patentes

possuíam relação com propriedades farmacológicas, optou-se por realizar a leitura

de todos os resumos, classificando-as conforme suas aplicações mencionadas ou

137

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nos resumos ou nas reivindicações (Tabela 10). Estas patentes foram analisadas

também no que diz respeito aos detentores das patentes concedidas (Tabela 11),

bem como os países depositantes (Tabela 12).

Sobre as aplicações das invenções em relação ao mirtenol, observou-se que

a maioria dos registros referiu-se à biossíntese de compostos químicos que utilizam

o mirtenol ou outro monoterpeno álcool em sua formulação, com 4% do total de

patentes encontradas. Entretanto, embora um elevado percentual de patentes tenha

sido encontrado na busca com o termo “mirtenol” (93%), estas não apresentaram,

em seu título ou resumo, alguma correlação específica deste monoterpeno com a

invenção patenteada, havendo menção do mirtenol somente nos detalhes da

invenção, como referência de apoio.

Tabela 10. Aplicações das patentes relacionadas ao mirtenol.

Aplicações INPI USPTO EP

Biossíntese 1 0 5

Produto agrícola 0 1 0

Reações químicas 0 1 0

Produtos de limpeza 0 1 0

Cosméticos 0 0 0

Antioxidante para alimentos 0 0 1

Farmacologia* 0 0 1

Ausência de aplicação específica do mirtenol 0 149 8

TOTAL 1 152 15

* composição de produto para tratar problemas respiratórios e formulação de produto acaricida. Fonte: INPI, USPTO, EP (Junho/2013).

Ainda em relação à pesquisa de prospecção, foi possível observar que, em

relação aos depositários de patentes, as empresas são as maiores detentoras, com

91%, seguidas da pessoa física, com 5% e universidades, representando 4%.

138

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Tabela 11. Categorias de detentores das patentes concedidas

relacionadas ao mirtenol.

Detentores das patentes INPI USPTO EP

Empresa 0 140 12

Pessoa física 0 6 3

Universidade 1 6 0

TOTAL 1 152 15


Esses resultados refletem que as empresas ainda são as maiores detentoras

de patentes no cenário atual, por isso, os processos de aproximação entre a

universidade e a indústria têm sido intensamente encorajados, buscando incentivar a

comercialização do conhecimento gerado nas universidades para benefício da

sociedade, posto que esta aproximação favorece a geração de novos empregos,

forma nova mentalidade e mantém a cultura do país (SIMÕES; SCHENKEL, 2002).

Quanto à pesquisa de patentes por países depositários, observou-se que há

um domínio de patentes para países ricos ou desenvolvidos. Estas patentes foram

depositadas em sua maioria pelos Estados Unidos (54%), seguido por Japão (14%).

Entretanto, para o tema pesquisado, o Brasil somente apresentou uma patente com

o termo “mirtenol”, demonstrando o déficit de pesquisas com este monoterpeno.

Tabela 12. Patentes relacionadas ao mirtenol depositadas por país.

País depositante INPI USPTO EP

Estados Unidos 0 89 4

Japão 0 19 6

Israel 0 12 0

França 0 11 3

Holanda do Norte 0 11 0

Alemanha 0 5 2

Grã-Bretanha 0 5 0

Brasil 1 0 0

TOTAL 1 152 15


139

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Quanto ao único registro de patente nacional encontrado na busca

(PI0401374-3 A2), trata-se de um processo de obtenção de derivados oxigenados

do beta-pineno pela sua oxidação catalisada por óxidos de metais de transição, a

exemplo, o mirtenal, mirtenol, pinocarveol e pinocarvona, que foi depositado pela

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) no ano de 2004 (INPI, 2013).

Um levantamento envolvendo 278 plantas nativas brasileiras revelou que

66,9% delas são sujeitas à aplicação ou à concessão de patentes. De 738

documentos de patentes analisados, apenas 5,8% foram aplicações brasileiras

(MOREIRA et al., 2006), confirmando os poucos achados encontrados nesta busca

em relação ao mirtenol.

Considerando esse cenário, o mirtenol e suas aplicações farmacêuticas

encontram-se com o pedido de depósito de patente efetuado no INPI, aguardando o

período legal para que haja seu registro definitivo.

3. PROTEÇÃO PATENTÁRIA DO MIRTENOL

Aplicações farmacêuticas do (-)-mirtenol para o tratamento da ansiedade

(Pedido de patente depositado). A presente invenção, sob pedido nº BR 10 2012

021831 3 A2, diz respeito ao desenvolvimento de formulações farmacêuticas à base

de cis-mirtenol [6,6-Dimetilbiciclo[3,1,1]hepta-2-eno-2-metanol], um derivado

sintético do mirtenol, para tratamento da ansiedade. Mais especificamente, a

presente invenção refere-se ao potencial ansiolítico do cis-mirtenol e sua utilização

na formulação de produto(s) farmacêutico(s) para tratamento de patologias

relacionadas com o sistema nervoso central (ANEXO B).

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_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Conclusões

CONCLUSÕES

Este estudo teve o objetivo de avaliar o efeito do mirtenol sobre o sistema

nervoso central, cujos resultados possibilitaram as seguintes inferências:

este monoterpeno apresenta potencial ansiolítico, sem causar efeitos

sedativos, cujo mecanismo de ação possivelmente envolve os receptores

benzodiazepínicos;

possui atividade neuroléptica, pois reverteu os efeitos catatônicos causados

pelo haloperidol, cujo mecanismo de ação possivelmente envolve os receptores

dopaminérgicos do tipo D2-símile;

apresenta atividade anticonvulsivante, uma vez que reverteu os efeitos

tóxicos causados pelas drogas convulsivantes padrão utilizadas;

possui baixa toxicidade, verificada na avaliação da DL50, na manutenção da

massa e do padrão alimentar dos animais, na inalteração dos parâmetros

hematológicos e bioquímicos e na preservação dos aspectos morfológicos dos

órgãos nobres avaliados, mesmo após administração de doses repetidas na

avaliação crônica (após 120 dias);

revela-se como um composto antioxidante, verificado nos testes in vitro e in

vivo, sendo considerado uma substância neuroprotetora contra possíveis danos

degenerativos celulares geralmente ocasionados por doenças

neurodegenerativas.

143

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Perspectivas

PERSPECTIVAS

O mirtenol apresenta-se como um produto com baixa toxicidade, alto poder

antioxidante, apresentando ainda efeito ansiolítico, neuroléptico e anticonvulsivante,

derivado de produto natural, conferindo menores efeitos colaterais que a droga de

maior capacidade comercial destinada ao tratamento da ansiedade disponível no

mercado brasileiro. Com isto, pretende-se encapsular o mirtenol, a fim de elaborar

um novo fitofármaco, para ser testado em humanos e posteriormente

comercializado.

Sob outro prisma, devido a potencial versatilidade deste futuro

fitomedicamento quanto as suas formas de apresentação (comprimido, xarope,

solução) e sua eficácia terapêutica utilizando baixas dosagens, maior será a

possibilidade de adequação das posologias prescritas, podendo ser melhor aceito

pelos usuários e as formas de uso seguidas corretamente.

Quanto aos estudos experimentais, pretende-se continuar a testar o mirtenol,

tanto por outras vias de administração que não as utilizadas nos experimentos

realizados neste trabalho, bem como em modelos animais diferentes, a fim de

desvelar outras atividades deste monoterpeno sobre condições que afetam o SNC e

demais sistemas orgânicos, assim como elucidar melhor seus mecanismos de ação.

145

____________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Referências

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_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ MOREIRA, M.R.C. Anexos

ANEXO A – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal

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ANEXO B – Depósito de pedido de patente do mirtenol

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ANEXO C – Produção científica e intelectual relacionada à tese

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