Estudo do mecanismo de ação do monoterpeno borneol no ...§ão... · Estudo do mecanismo de...

Estudo do mecanismo de ação do monoterpeno borneol no sistema cardiovascular

2013

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

LABORATÓRIO DE FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS

NATURAIS DO SEMIÁRIDO

STEFÂNIA EVANGELISTA DOS SANTOS

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DO MONOTERPENO

BORNEOL NO SISTEMA CARDIOVASCULAR

PETROLINA

2013


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Stefânia Evangelista dos Santos

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DO MONOTERPENO

BORNEOL NO SISTEMA CARDIOVASCULAR

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Recursos Naturais do Semiárido do

Laboratório de Farmacologia da Univasf da

Universidade Federal do Vale do São Francisco,

para obtenção do grau de MESTRE EM RECURSOS

NATURAIS DO SEMIÁRIDO. Área de Concentração:

FARMACOLOGIA

ORIENTADOR: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo

Ribeiro

Petrolina

2013


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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

Stefânia Evangelista dos Santos

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DO MONOTERPENO BORNEOL

NO SISTEMA CARDIOVASCULAR

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido dos Materiais, pela Universidade Federal do Vale do São Francisco.

Aprovado em / / 2013

BANCA EXAMINADORA

__________________________________

Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro

Orientador

___________________________________________

Profa. Dr. Raimundo Campos Palheta Junior

Examinador Interno

__________________________________________

Prof. Dr. Fabrício Souza Silva

Examinador Interno

__________________________________________

Prof. Dr. Luís Alberto Valotta Suplente Externo

__________________________________________

Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima Suplente Interno


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DEDICATÓRIAS


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Dedico este trabalho a minha mãe, minha grande

incentivadora e amor maior, meu primo Alysson que

tanto me acompanha na minha jornada, ao meu amor e

amigo Diogo Barros, minha família e a todos os meus

amigos, inclusive Martapolyana, tão queridos que em

todas as fases da minha vida compartilham junto

comigo. Ao meu querido professor Luciano Augusto pela

oportunidade de um sonho concretizar-se. Ao Deus

maior pela felicidade da sua presença viva em minha

vida, luz e força em cada dia.


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AGRADECIMENTOS


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Ao Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro pela oportunidade, paciência,

dedicação, entusiasmo e conforto sempre e fundamentais nos momentos críticos, pelos

ensinamentos e amadurecimento na visão acadêmica. Muito obrigada, professor!

A Profa. Dra. Edigênia Cavalcanti Cruz por ter me apresentado a Univasf.

A Profa. Dra. Glória Isolina Duarte Pinto, por ter me iniciado no mundo da pesquisa,

meu muito obrigado.

Ao Prof. Dr. Saad Lalhou, primeira pessoa a me da oportunidade na iniciação científica,

abrindo leque para novas conquistas, como esta. E a todos que fazem o grupo de

fisiologia e farmacologia cardiovascular da UFPE. Anos saudosos vivi ali.

A minha mãe, Maria do Carmo, amor maior e incondicional, em todas as fases da

minha vida, sempre comigo, me apoiando, confortando e motivando. Te amo!

Ao meu primo-irmão Alysson por toda dedicação, correria em atender meus pedidos,

me acompanhando em todos os dias bons e ruins, nas conquistas do mestrado. Meu

muito obrigado simplesmente te amo!

A Diogo Barros, meu noivo, meu amor, por todos os dias sempre comigo, sendo meu

maior incentivador, por compartilhar todos os dias de lutas e de vitória juntos, muito

obrigada amor por ser tão único, tão para mim. Te amo, príncipe!

As minhas caras companheiras de luta de laboratório Morganna Thinesca, Pedrita

Sampaio e Yonara meu eterno obrigado, parte do meu aprendizado fez-se da autoria

de vocês. Sucesso!

As minhas companheiras de sala e de trajetória Raquel Loura, Fernanda Ribeiro, Ana

Claúdia Teixeira, Keidy Costa muito bom esses dois anos divididos com vocês.

A amiga Martapolyana Torres Menezes, pelo apoio, presença em todas as etapas

deste processo juntas, sempre, desde o processo seletivo a esse momento tão único. A

amiga Paula Matos pelo apoio nas primeiras etapas. A Dr. Salles pela oportunidade de

novo trabalho, uma vez que foi possível conciliar com o mestrado. A minhas amigas de

trabalho Mirelly Leite, Graziela Caxias, Deilla Patrícia, Marileide Lopes, e tantas outras

que contribuíram com meu trabalho para que conseguisse conciliar trabalho e

mestrado. A todos os meus queridos amigos do SAMU que tanto amo pelo apoio nas

trocas de plantão para que fosse possível que eu assistisse às aulas teóricas. A minha

eterna amiga Neylanne Lima pelo incentivo.


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Aos técnicos Euda Freire e Helenildo pela manutenção do Biotério Central da Univasf.

E a Leonardo pela disponibilidade dos animais.

A Francisca e demais funcionários por disponibilizar as chaves do laboratório.

Aos tantos amigos e colegas do Laboratório de Farmacologia da UNIVASF, por toda a

ajuda.

A instituição UNIVASF por ter disponibilizado todo arsenal de materiais e equipamentos

para que essa pesquisa concretiza-se.

A Domingos Savio por toda disponibilidade em viajar comigo levando e trazendo-me do

Piauí a Pernambuco, nos primeiros meses, para que eu assistisse às aulas. Meu muito

obrigado por se fazer tão especial.

Aos membros da Banca Examinadora, pelas correções e sugestões que ajudaram a

enriquecer este trabalho.

E a todos aqueles que fazem parte do Laboratório de Farmacologia da Univasf, dos

mais variados setores, meu mais sincero e profundo obrigado pela ajuda durante estes

quase 02 anos de convivência.

E ao Jesus da Cruz, que tanto me conforta e torna um ser humano melhor. Pela sua

sublime presença posso afirmar que sou bem melhor e mais realizada.


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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. XII

LISTA DE TABELAS ............................................................................................ XIII

LISTA DE GRÁFICOS ......................................................................................... XIV

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................ XVII

RESUMO.............................................................................................................. XIX

ABSTRACT ........................................................................................................... XX

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... ......2

2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................................ 5

2.1 Plantas Medicinais............................................................................................. .5

2.2 Sistema Cardiovascular.....................................................................................10

2.3 Doenças Cardiovasculares................................................................................11

2.4 Plantas Medicinais com atividade no Sistema Cardiovascular.......................13

2.5 Óleos Essenciais seus constituintes e suas atividades.....................................15

2.6 Borneol .............................................................................................................18

2.7 Contração e Relaxamento do Músculo Liso......................................................20

3 OBJETIVOS ....................................................................................................... 25

3.1 Geral................................................................................................................ 25

3.2 Específicos ...................................................................................................... 25

4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 24

4.1 MATERIAL ...................................................................................................... 27

4.1.1 Animais ......................................................................................................... 27


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4.1.2 Aspectos Éticos ............................................................................................ 27

4.1.3 Objeto de estudo .......................................................................................... 28

4.1.4 Substâncias e Sais ....................................................................................... 29

4.1.5 Soluções Nutritivas ....................................................................................... 31

4.1.6 Aparelhos ..................................................................................................... 32

4.2 MÉTODOS ...................................................................................................... 35

4.2.1.1 Estudo do efeito vasorelaxante do borneol em aorta isolada de rato ........ 35

4.2.1.2 Preparação dos anéis de aorta isolada de rato ......................................... 35

4.2.1.3 Investigação da participação de fatores derivados do endotélio no efeito do (-)-

borneol .................................................................................................................. 37

4.2.2 Investigação da participação do óxido nítrico no efeito do ( ) borneol .......... 37

4.2.2.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de L-NAME.....................37

4.2.3 Investigar a participação de prostanóides no efeito do ( ) borneol.................38

4.2.3.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de indometacina..............38

4.2.4. Avaliação da participação da via do óxido nítrico associado aos canais para

potássio no efeito relaxante do (-)-borneol em aorta isolada de rato.......................39

4.2.4.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de L-NAME e TEA...........39

4.2.5 Avaliação da participação de canais para potássio no efeito do ( ) borneol em

anéis sem endotélio funcional..................................................................................40

4.2.5.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de TEA............................40

4.2.5.2 Efeito vasorelaxante do borneol na presença de 4 AP................................41

4.2.5.3 Efeito vasorelaxante do borneol na presença de glibenclamida.................42

4.3 Análises de Dados ............................................................................................ 42

5 RESULTADOS .............................................................................................. .....45

5.1 Estudo do efeito vasorelaxante do (-)-borneol em aorta isolada de rato............45

5.1.1 Investigação da participação de fatores derivados do endotélio no efeito do (-)-

borneol......................................................................................................................45

5.1.2 Investigação da participação do óxido nítrico no efeito do ( ) borneol............53

5.1.2.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de L-NAME.....................53

5.1.3 Investigação da participação de prostanóides no efeito do (-)-borneol..........58

5.1.3.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de indometacina.............58


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5.1.4 Avaliação da participação da via do óxido nítrico associado aos canais para

potássio no efeito relaxante do (-)-borneol em aorta isolada de rato.......................63

5.1.5 Avaliação da participação de canais para potássio no efeito do (-)-borneol em

anéis sem endotélio funcional.................................................................................65

5.1.5.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de TEA ...........................65

5.1.5.2 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de 4-AP...........................71

5.1.5.3 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de glibenclamida.............72

6 DISCUSSÃO ............................................................................................... .......78

7 CONCLUSÕES .................................................................................................. 86

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Rattus norvegicus ................................................................................... 27

Figura 2. Estrutura química do 1,7, 7-Trimetilbiciclo [2.2.1] heptanol-2 ................. 29

Figura 3. Transdutor de força .................................................................................. 32

Figura 4. Banho de órgãos. ...................................................................................... 33

Figura 5. Fotos do sistema de aquisição de dados digitais .................................... 33

Figura 6. Amplificador de sinais ............................................................................... 33

Figura 7. Balança Semi-analítica modelo MARK300 (Bel, Brasil) ....................... 34

Figura 8. Balança Analítica modelo FA2104N (Celtac, Brasil) ........................... 34

Figura 9. Aorta de rato .......................................................................................... 36

Figura 10. Anel de aorta em haste metálica ......................................................... 36

Figura 11. Registro original representativo do efeito relaxante do borneol em anéis de

aorta na presença do endotélio. ............................................................................ 45

Figura 12. . Registro original representativo do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis

de aorta na ausência do endotélio ...........................................................................46


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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Substâncias, sais e seus fornecedores ................................................... 30

Tabela 2. Composição da solução de Krebs ........................................................... 31


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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos isolados de rato, pré-

contraídos com 10-6M de FEN, na presença e na ausência de endotélio

funcional.........................................................................................................................47

Gráfico 2. Valores CE50 obtidos para o (-)-borneol na ausência e na presença de

endotélio funcional........................................................................................................ 47

Gráfico 3. Fases do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos isolados de rato,

pré-contraídos com 10-6M de FEN, na presença e na ausência de endotélio funcional.

.....................................................................................................................................49


contraídos com 10-6M de FEN, na presença e na ausência de endotélio

funcional.........................................................................................................................50


endotélio funcional para sua 1ª fase de relaxamento. ............................................ .....51


contraídos com 10-6M de FEN, na presença e na ausência de endotélio funcional. .. 52


endotélio funcional para sua 2ª fase de relaxamento. ................................................. 53

Gráfico 8. Efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos com endotélio funcional,

pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência e na presença de L- NAME ............ 54

Gráfico 9: Valores CE50 obtidos para o (-)-borneol, em anéis aórticos com endotélio

funcional, na ausência e na presença de L NAME................... ................................... 55

Gráfico 10. Primeira fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos com

endotélio funcional, pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência e na presença de

L-NAME. ...................................................................................................................... 56

Gráfico 11. Segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos com


L-NAME ....................................................................................................................... 57

Gráfico 12. Efeito contrátil do (-)-borneol em anéis aórticos com endotélio funcional e

na presença de L-NAME. ............................................................................................ 58


pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência e na presença de Indometacina. ..... 59


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Gráfico 14. Valores CE50 obtidos para o (-)-borneol, em anéis aórticos com endotélio

funcional, na ausência e na presença de indometacina ..................................... .........60



indometacina ............................................................................................................... 61



Indometacina .............................................................................................................. 62.

Gráfico 17. Efeito contrátil do (-)-borneol em anéis aórticos com endotélio funcional e

na presença de indometacina . ................................................................................... 63


pré-contraídos com 10-6M de FEN, na presença de L-NAME e na presença de L

NAME+TEA . ............................................................................................................... 64

Gráfico 19. Efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem endotélio funcional,

pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência e na presença de 1 mM de TEA ... .. 65

Gráfico 20. Primeira fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem


TEA (1 mM).. ............................................................................................................... 67

Gráfico 21. Segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem


TEA (1 mM)...................................................................................................................68.


pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência e na presença de 10 mM de TEA

.......................................................................................................................................69

Gráfico 23. Primeira fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem


TEA (10mM)...................................................................................................................70

Gráfico 24. Segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem


TEA (10 mM)..................................................................................................................71


pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência e na presença de 1 mM de 4

AP...................................................................................................................................72


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pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência e na presença de 3 mM de

glibenclamida .................................................................................................................73


endotélio funcional, pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência de

glibenclamida..................................................................................................................74

Gráfico 28. Efeito contrátil do (-)-borneol em anéis aórticos sem endotélio funcional e

na presença de glibenclamida........................................................................................75


endotélio funcional, pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência de

glibenclamida..................................................................................................................76

Gráfico 30. . Segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos com

endotélio funcional, pré-contraídos com 10-6M de FEN, na presença de

glibenclamida..................................................................................................................76


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LISTA DE ABREVIATURAS

M micromolar (10-6 mols/L)

[Ca2+]i concentração de Ca2+ livre intracelular

4-AP 4-aminopiridina

AA ácido araquidônico

AC ciclase de adenilil

ACh acetilcolina

AMPc 3’, 5'-monofosfato cíclico de adenosina

ATP 5’-trisfosfato de adenosina

ATPase enzima 5’-trisfosfato de adenosina

AVC Acidente vascular cerebral

Born Borneol

BKCa canais de potássio de grande condutância ativados pelo Ca2+ e voltagem

Ca2+ íon cálcio

CaM calmodulina

CaV canais de cálcio abertos por voltagem

CE50 concentração de uma substância capaz de produzir 50 % de seu efeito máximo

possível

COOV Canais de cálcio operado por voltagem

COX enzima ciclooxigenase

DAG Diacilglicerol

DMSO dimetilsulfóxido

e.p.m. erro padrão da média

EDRF fator de relaxamento derivado do endotélio

Emax efeito máximo

FEN L(-)-fenilefrina

GMPc 3',5'-monofosfato cíclico de guanosina

GTP 5’-trisfosfato de guanosina

HAS Hipertensão arterial sistêmica

ICC Insuficiência Cardíaca Congestiva

IKCa canais de potássio de condutância intermediária ativados pelo Ca2+

IP3 1,4,5-trisfosfato de inositol


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K+ íon potássio

KATP canais de potássio sensíveis ao trifosfato de adenosina

Kir canais de potássio retificadores de entrada

KV canais de potássio abertos por voltagem

MLCK cinase da cadeia leve da miosina

MLCP fosfatase da cadeia leve da miosina

L-NAME Nitro L-Arginina éster metílico

M concentração molar (mols/L)

mM milimolar (10-3 mols/L)

n número de experimentos realizados

nM nanomolar (10-9 mols/L)

NO óxido nítrico

p probabilidade

Pi íon fosfato

PKA proteína cinase dependente de AMPc

PKG proteína cinase dependente de GMPc

PLC Fosfolipase C

ROK cinase ligante para resíduos de serina e treonina

RS Retículo sarcoplasmático

TEA Cloreto de tetraetilamônio

vs versus

OBS: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta

relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.


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RESUMO

Os produtos naturais de plantas com atividade sobre a musculatura lisa espasmolíticas, têm uma vasta aplicação em vários processos fisiopatológicos como hipertensão e outros. O borneol é o monoterpeno da família de plantas Dipterocarpaceae, Lamiaceae, Valerianaceae, Asteraceae. O objetivo deste trabalho deu-se em investigar o efeito do (-)-borneol em aorta isolada de rato, sobre o mecanismo de ação do efeito relaxante, eficácia e potência em músculo liso vascular. Os testes foram feitos tanto na ausência quanto na presença de glibenclamida, Tetraetilamônio, 4-aminopiridina, indometacina e L-NAME. O (-)-borneol apresentou ação relaxante com forte dependência do endotélio. Feito os testes com L-NAME, inibidor do óxido nítrico sintetase, na ausência (CE50 2,1+ 1,1x10-4M, n=7) e na presença de L-NAME 10-4M (CE50 0,28 ± 0,11x10-4M N=7). Na ausência (CE50 2,3 ± 1,1X10-4M, n=11), quanto na presença de indometacina (10µM) (CE50 8,3 ± 3,3 x10-4M n=5). Na presença de L-NAME (2,4 ± 1,0x10-3M n=7), quanto na presença de L-NAME com TEA (10 mM) (CE50 1,2 ± 0.4 x10-3 M n=6). Na investigação de TEA 10 Mm, não houve participação dos canais de potássio. Como também na presença de TEA (1 mM). Também na presença dos canais Kv na concentração de 1 mM, não houve contribuição para o efeito o relaxante do (-)-borneol. Quando investigado os canais de KATP observou-se uma forte participação relaxante do (-)-borneol, sem a dependência do endotélio; na ausência (CE50 6,5+ 3,0x10-4M, n=9) e na presença de glibenclamida (10-3M) (EC50 4,9 + 1,2x10-4M, n=6). Foi observado nos resultados que o (-)-borneol tanto relaxa na presença do endotélio quanto em alguns momentos sem esta dependência, de tal forma que tal efeito pode ser devido à presença ativa dos canais de KATP. Os canais de potássio pouco contribuem na sua ação relaxante em aorta. Em

grande parte sua ação relaxante justifica-se pela presença dos fatores endoteliais com NO e fatores prostanóides. Palavras-chaves: -(-) borneol; músculo liso vascular; canais de potássio; óxido nítrico; prostanóides.


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ABSTRACT The plant natural products with activity on smooth muscle spasmolytic , have a wide application in various pathophysiological processes such as hypertension and others. The borneol is the monoterpene family Dipterocarpaceae plants, Lamiaceae , Valerianaceae , Asteraceae . The objective of this work was given to investigate the effect of ( - ) - borneol in isolated rat aorta , about the mechanism of action of the relaxing effect , efficacy and potency in vascular smooth muscle . Tests were made both in the absence and in the presence of glibenclamide, Tetraethylammonium , 4- aminopyridine , indomethacin and L- NAME. The ( - ) - borneol showed relaxant action with strong dependence on the endothelium . Tests done with L-NAME , an inhibitor of nitric oxide synthase in the absence ( EC50 2,1 x10-4M + 1.1 , n = 7) and in the presence of L -NAME 10-4M ( EC50 0.28 ± 0 11x10 -4M N = 7). In the absence ( EC50 2.3 ± 1.1 X10- 4M , n = 11) , and in the presence of indomethacin ( 10 µm ) ( EC50 8.3 ± 3.3 x10-

4M n = 5). In the presence of L-NAME (2.4 ± 1.0 x 10-3M n = 7 ) and in the presence of L -NAME with TEA ( 10 mM) ( EC50 1.2 ± 0.4 x10-3 M n = 6). In the investigation of 10 mM TEA , no participation of potassium channels . As well as in the presence of TEA (1 mM). Also in the presence of Kv channels in a concentration of 1 mM, no contribution to the relaxing effect of (-)- borneol . When investigating the KATP channel showed a strong participation relaxing (-)- borneol , without depending on the endothelium ; absence ( EC50 6,5 x10-4M + 3.0 , n = 9) and in the presence of glibenclamide ( 10-3M ) ( EC50 4,9 x10-4M + 1.2 , n = 6). It was seen from the results that the (-)- borneol relaxes both in the presence of the endothelium and in some moments without this dependence , so that this effect may be due to the presence of KATP channels active . Potassium channels contribute little in its relaxing action on the aorta . Largely its relaxing action is justified by the presence of endothelial factors with NO and prostanoids factors . Keywords: Borneol; vascular smooth muscle; potassium channels, nitric oxide prostanoids.


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INTRODUÇÃO


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1.0 INTRODUÇÃO

Dentre os vários sistemas biológicos, que podem servir de modelos

experimentais para a realização de ensaios farmacológicos pré-clínicos, com objetivo

ulterior de descobrir novos fármacos, um é de especial interesse: o sistema

cardiovascular. Alterações na homeostasia desse sistema estão envolvidas em

processos fisiopatológicos que levam ao surgimento de patologias de grande impacto

social e econômico. São exemplos dessas patologias, de grande interesse para

desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos, as doenças cardiovasculares,

como hipertensão arterial, insuficiência cardíaco-congestiva, infarto agudo do

miocárdio, coronariopatias, dentre outras. Assim sendo, a contração do músculo liso

vascular possui um papel crítico na regulação e na manutenção da pressão sanguínea,

em mamíferos, sendo que doenças como a hipertensão e a coronariopatias estão

associadas a uma regulação anormal da contratilidade do músculo liso vascular e/ou

do funcionamento cardíaco, e por consequência a autoritmicidade cardíaca e a

contração do miocárdio.

O interesse em investigar produtos de plantas com atividade relaxante sobre a

musculatura lisa ou cardíaca reside no fato de que essas substâncias espasmolíticas

têm uma vasta aplicação em vários processos fisiopatológicos. Assim sendo, o

músculo liso e o cardíaco apresentam-se como ferramentas úteis para a investigação

de atividades biológicas de substâncias de qualquer fonte, natural ou sintética, onde

através de uma triagem farmacológica preliminar podemos determinar se essas

substâncias químicas apresentam algum efeito relaxante em músculos estimulados

com diferentes agentes contráteis, simulando assim o processo fisiopatológico, por

exemplo, da vasocontração associado à hipertensão arterial ou coronariopatias, o que

o torna indispensável no processo de descoberta de novos fármacos úteis para o

tratamento dessas patologias.

Assim sendo, o músculo liso apresenta-se como uma ferramenta útil para a

investigação de atividades biológicas de substâncias de qualquer fonte, natural ou

sintética, onde se pode realizar uma triagem farmacológica preliminar para determinar

se extratos frações ou substâncias químicas isoladas apresenta algum efeito relaxante

em músculos lisos estimulados com diferentes agentes contráteis, simulando assim o

processo fisiopatológico, por exemplo, da vasocontração associado à hipertensão


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arterial (GULLO, HUGHES, 2005), o que o torna indispensável no processo de

descoberta de novos fármacos úteis para o tratamento dessas patologias. Além disso,

como os mecanismos de contração e relaxamento muscular são semelhantes nos

mamíferos em geral, envolvendo os mesmos sinalizadores endógenos, os mesmos

receptores farmacológicos, as mesmas vias de sinalização celulares, o modelo do

músculo liso, isolado de animais de laboratório, se apresenta como meio relativamente

simples para se investigar mecanismos de ação de substâncias de origem naturais

terapeuticamente promissoras (FURA, 2006).

Dentre os vários produtos naturais com potencial terapêutico podemos citar os

monoterpenos. Estes são encontrados em muitas plantas conhecidas por possuírem

atividades terapêuticas. Além disso, os monoterpenos exibem uma variedade de efeitos

farmacológicos como atividade ansiolítica, antinoceptiva, sedativa, antidepressiva e

anticonvulsivante, mas ainda são pouco registradas atividades relacionadas com o

sistema cardiovascular (MELO et al., 2010).

O 1,7,7-Trimetilbiciclo-[2.2.1]-heptanol-2, conhecido como borneol, é o

monoterpeno predominantemente encontrado em muitos óleos essenciais de plantas

da família de Dipterocarpaceae (Dipterocarpus turbinatus C. e Dryobalanops spp.),

Lamiaceae (Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L. e Lavandula officinalis Chaix

& Kitt.), Valerianaceae (Valeriana officinalis L.), Asteraceae (Matricaria chamomilla L. e

Blurnea balsamifera L. (HORVTHOV et. al., 2009), sendo o principal monoterpeno que

compõe os óleos essências de muitas plantas usadas pela Medicina Tradicional

Chinesa.

Estudos prévios têm demonstrado que o borneol é responsável por várias das

atividades biológicas atribuídas a várias plantas que o possuem na composição de

seus óleos essenciais, como por exemplo, atividades como antimicrobiana, no alívio da

dor, da ansiedade, da fadiga, ação anti-hipertensiva (SILVA FILHO, et. al.; 2012).

Assim, apesar de já haver na literatura relatos de atividade vasorelaxante do borneol,

ainda há lacunas em seu mecanismo de ação que devem ser preenchidas e desta

forma novas abordagens para o estudo de seu efeito e ação são necessárias para uma

melhor compreenção de seu potencial terapeutico.

Neste trabalho focamos na caracterização do efeito relaxante do (-)-borneol em

aorta isolada de rato, destacando alguns aspectos de seu mecanismo de ação que

justificam seu efeito relaxante.


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REVISÃO DA LITERATURA


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25

2.0 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Plantas Medicinais

Por um longo tempo, os únicos medicamentos disponíveis para a humanidade

foram os extratos de plantas medicinais, muitos dos quais permanecem como sendo o

principal meio para os cuidados em saúde para a maioria da população de muitos

países em desenvolvimento. Os relatos vêm desde as escrituras e Papiro de Éberes

que citam o uso de plantas medicinais (ARGENTA, et. al. 2011). Documentos antigos

referem também á descoberta feita por Aristóteles sobre a Papaver somniferum, planta

cujo princípio ativo é a morfina, que até hoje é utilizado como opióide potente para

analgesia. Até evidências arqueológicas demonstram o uso de drogas vegetais nas

culturas antigas (ARGENTA, et. al. 2011). Saciando a necessidade de conhecimento

sobre a natureza, na Grécia, Hipócrates, pai da medicina moderna, desenvolveu seus

estudos com foco no tratamento medicamentoso através das plantas, que muito

contribuíram para cura de várias afecções da época, mesmo que empiricamente.

Hoje a utilização da medicina tradicional está sendo largamente suplantada pelo

uso de medicamentos à base de substâncias químicas ativas (os fármacos), de origem

natural, semissintéticas ou sintética, produzidos em larga escala pelas indústrias

farmacêuticas e comercializadas em todo o mundo. Assim, a natureza tem evoluído, ao

longo do tempo, para produzir uma desconcertante diversidade de metabólitos

secundários que têm contribuído enormemente para a descoberta e o desenvolvimento

de notáveis fármacos de importância terapêutica utilizados atualmente na medicina

moderna (CRAGG, et. al., 1997; DESMET, 1997).

Entretanto, o isolamento e caracterização dos compostos ativos de plantas

medicinais continuam em alta, com a padronização de técnicas e formulações de

fitoterápicos. Desta forma surgiu a ciência que estuda os produtos naturais pelo seu

isolamento, à farmacognosia, que envolve o amplo estudo de produtos naturais a partir

de várias fontes, incluindo plantas, bactérias, fungos e organismos marinhos. (

GONZALEZ-COLOMA et. al., 2010; TIDGEWELL et. al., 2010; IMHOFF; LABES e

WIESE, 2011; NIKAPITIYA, 2012).

Assim o uso de plantas como fonte de medicamentos tem envolvido o

isolamento de compostos químicos ativos com importância terapêutica isoladas de


2013

26

fontes naturais são eles a cocaína, codeína, digitoxina, e quinino, salicilatos, onde

alguns desses ainda estão em uso atualmente (NEWMAN et. al., 2000; BUTLER, 2004;

SAMUELSSON, 2004) e mais exemplos de fármacos isolados de fontes naturais, com

grande relevância na terapêutica, surgem a cada ano, como por exemplo, o taxol, a

artemisinina, o plaunotol, a arglabina, a sinvastatina, o captopril, entre outras dezenas

de exemplos (HARVEY, 2000; 2008; FURA 2006; GANESAN, 2008).

Desta forma, no Brasil, a pesquisa por novos medicamentos com base em

fármacos de origem natural refloresceu e hoje ocupa um espaço privilegiado na

indústria fitoterápica, com a rica flora do Brasil associado ás práticas dos curandeiros,

índios, dos antepassados que muito orientam o espirito científico em busca de

descobertas. Os estudos com plantas medicinais no Brasil iniciaram com a produção

de um Tratado Descrito do Brasil, 1587, falando sobre plantas com valor medicinal

utilizado pelos índios, mas o desenvolvimento da utilização de plantas medicinais como

regime terapêutico no Brasil ganhou maior ênfase com a presença e regulamentação

dos boticários, na época da chegada da Família Real ao Brasil, em 1808. A

regulamentação da fitoterapia no Brasil ganhou um reforço significativo quando foi

elaborada a primeira edição da farmacopeia Brasileira produzida por Rodolfo Albino

(PEREIRA et. al., 1989).

Conhecimentos acumulados durante milênios sobre a fitoterapia estende-se em

muitos países como China, Brasil e outros se tornando uma fonte importante de

produtos naturais biologicamente ativos, que podem resultar em novos fármacos.

Cerca de 13.000 plantas eram usadas como fármacos ou para a síntese de moléculas

medicinais, atualmente. Utilizada das diversas formas como em tinturas, chás,

emplastros, pós e outras (SAMUELSSON, 2004). Em 2001 e 2002, cerca de um quarto

das melhores drogas em todo o mundo tratava-se de drogas fitoterápicas ou derivados

de produtos de naturais (BUTLER, 2004).

Apesar desses exemplos de sucesso muitas das grandes empresas

farmacêuticas têm diminuído progressivamente os esforços na utilização de recursos

naturais como fonte para a descoberta de novos fármacos. Isso tem sido causado

devido às desvantagens percebidas em utilizar os produtos naturais como fonte de

fármacos como as dificuldades de acesso e fornecimento, as complexidades de

química de produtos naturais, a lentidão inerente de trabalhar com produtos naturais e

preocupações sobre os direitos de propriedade intelectual (HARVEY, 2000). Embora,

nos dias atuais, essas grandes companhias farmacêuticas terem reduzido


2013

27

significativamente, ou mesmo eliminado, a busca por novos agentes terapêuticos a

partir de fontes naturais (GULLO, HUGHES, 2005), diversos trabalhos e revisões foram

escritos e descrevem a importância de substâncias de fontes naturais para tratar

doenças, bem como o papel altamente significativo que os produtos naturais possuem

no processo de descoberta e desenvolvimento de novos fármacos (NEWMAN et. al.,

2003).

A descoberta de um novo fármaco é um jogo de números. Milhares de

substâncias químicas devem ser avaliados para encontrar uma que seja

terapeuticamente promissora. Os fármacos de interesse, identificados como produtos

naturais, decorrem do fenômeno da biodiversidade, ou seja, da riqueza e da variedade

de organismos na ecosfera. Uma consequência da interação dessa rica variedade de

organismos uns com os outros e com seu meio ambiente é a evolução de diversos

complexos químicos naturais que são úteis para a sua sobrevivência e competitividade

dentro de seu bioma (WATERMAN, 1992). Há literalmente milhões de estruturas

químicas naturais desconhecidas, que são resultado do esforço comum dos

organismos em se adaptarem ao seu meio, fornecendo assim um verdadeiro

laboratório de química combinatória que é capaz de produzir uma inimaginável

diversidade química, com estruturas complexas, estereoquimicamente diversas,

contendo diferentes grupos funcionais, que podem ser as moléculas ideais para a

interação específica com receptores biológicos, fornecendo assim promissores alvos

terapêuticos para importantes doenças que acometem a população mundial. Assim, os

produtos naturais têm apontado o caminho para o futuro, fazendo renascer o interesse

em se pesquisar a atividade biológica de substâncias com origem nessa

biodiversidade, usando-as como modelo para a síntese total de novos fármacos

(MCCHESNEY et. al., 2007).

Depois da industrialização a sociedade tomou rumos, na qual o estilo de vida é

muito voltado para uma rotina de trabalho cansativa, associada a uma má alimentação

e sedentarismo, aumentando a faixa de morbimortalidade por doenças crônico-

degenerativas. Tanto é que agora a sociedade tenta um retorno á prática de vida

saudável com estímulo às atividades físicas, alimentação e enfrentamento aos conflitos

de forma leve. Dentre tais evoluções um estilo de vida saudável está sendo muito

associada à utilização de medicina de fitoterápicos, a “cura” pelas plantas, tanto é que

Organização Mundial de Saúde (OMS) afirmou compromisso em estimular o uso da

medicina tradicional e complementar para o período 2002-2005. No Brasil, em 2006, foi


2013

28

aprovado o decreto o nº 5.813 que formulou a Política Nacional de Plantas Medicinais e

Fitoterápicos introduzindo os medicamentos de plantas naturais, proporcionando

melhorias à população Brasileira.

O uso de fitoterápicos já tem seu uso bastante expandido, seja pela facilidade do

acesso, baixo custo, pela popularidade, principalmente em países em desenvolvimento

(OMS, 1999). Porém a produção de fitoterápicos enfrenta muitas dificuldades como na

extração do princípio ativo das plantas, uma vez que se trata de vários metabólitos

secundários, plantas que alteram sua produção de metabólitos de acordo com os

fatores ambientais e genéticos e mecanismos de ação ainda não elucidados. Além do

alto custo na produção e a concorrência desleal da indústria farmacêutica de sintéticos

e semissintéticos, como discutido antes.

Embora com inúmeras dificuldades, mas a farmacognosia tem acrescentado

bastante à saúde pública com descobertas ilustres como, por exemplo, as drogas

antitumorais vinblastina e vincristina que foram isolados a partir Catharanthus roseus

(L.), também a antimalárica como a produzida da extração de artemisina, um

sesquiterpeno lactone isolado de Artemisia annua L. (Asteraceae) (BALUNAS;

KINGHORN, 2005).

2.2 Sistema Cardiovascular

O sistema cardiovascular permite a circulação de sangue, de forma a haver

suprimento de oxigênio e remoção de dióxido de carbono no organismo (GUYTON,

2002). Todas as células de nosso corpo necessitam de oxigênio para viver. O papel do

coração é enviar sangue rico em oxigênio a todas as células que compõe o nosso

organismo. Para tanto é necessário um sistema de propulsão, no caso o coração, que

propele o volume sanguíneo para os órgãos do corpo utilizando-se de um sistema de

vasos, os quais podem ser veias ou artérias. As artérias são as vias por onde o sangue

oxigenado é enviado. A aorta é a maior de todas as artérias, e se origina no ventrículo

esquerdo. As artérias dividem-se em ramos cada vez menores, até os capilares

sistêmicos, que são vasos extremamente finos através dos quais o oxigênio sai para os

tecidos (KLABUNDE, 2005; RANDALL, BURGGREN et. al., 2000).

Após a retirada do oxigênio e o recebimento do gás carbônico que se

encontravam nos tecidos, os capilares levam o sangue até as veias. As veias


2013

29

transportam sangue com baixa quantidade de oxigênio e alto teor de gás carbônico,

desde os tecidos de volta ao coração e daí aos pulmões, chegando aos capilares

pulmonares, onde o sangue volta a receber oxigênio e a ter o gás carbônico removido,

sendo o processo reiniciado (KLABUNDE, 2005).

As artérias apresentam forma cilíndrica e são constituídas por 3 camadas

denominadas túnicas (túnica íntima, túnica média e túnica adventícia) e a uma

cavidade por onde passa o fluxo, chamada de lúmen. A túnica adventícia é a capa

externa limitante essa camada contem fibroblastos e colágeno, além disso, é onde se

liga os nervos do sistema nervoso autônomo. (RANDALL, BURGGREN et. al., 2000;

KLABUNDE, 2005).

A túnica média fica entre a adventícia e a íntima, é constituída por músculo liso

circular e longitudinal, são organizadas dessa forma para reduzir o diâmetro do vaso ao

realizar a sua contração. A túnica íntima é a camada mais interna que está em contato

com o lúmen, e é constituída por células endoteliais e fibras elásticas. Através das três

camadas forma-se a constituição da artéria com intuito de fornecer resistência e

elasticidade, mantendo o tônus vascular e manutenção da pressão arterial.

2.3 Doenças Cardiovasculares

Sabe-se que as doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e

mortalidade em todo o mundo. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS,

GENEBRA, 2006), as doenças cardiovasculares causam mais de 17 milhões de mortes

no mundo a cada ano. Além da mortalidade, muitas doenças cardiovasculares

prejudicam a capacidade de levar uma vida normal diária, resultando em enormes

custos de saúde para a sociedade e prejuízos individuais para o cidadão. Doenças

cardiovasculares são mais prevalentes que a incidência combinada de todas as formas

de câncer, diabetes, asma e leucemia (KUMAR et. al., 2007).

As doenças cardiovasculares constituem-se em um dos mais importantes

problemas de saúde da atualidade. Segundo a WHO (2002), as doenças

cardiovasculares lideram como as maiores causas de mortalidade e são responsáveis

por um terço dos óbitos no mundo. Estima-se, para o ano de 2020, que mais de 24

milhões de pessoas morrerão por estas causas, das quais 45% por doenças

isquêmicas do coração e 31% por doenças cerebrovasculares (OLIVEIRA; KLEIN;

SILVA, 2003).


2013

30

No Brasil, as doenças cardiovasculares constituem a principal causa de morte

em todas as regiões do país, em ambos os sexos (BRASIL, 2010). No ano de 2005

elas foram responsáveis por 31,5% dos óbitos em todas as faixas etárias, sendo que as

doenças cerebrovasculares foram à primeira causa de morte, com coeficiente de

mortalidade de 48,9/100.000 habitantes, seguidas pelas doenças isquêmicas do

coração, com 35 mortes por 100.000 habitantes. O padrão brasileiro de

morbimortalidade tem as doenças cerebrovasculares como a primeira causa de morte e

a principal causa de gastos com internações hospitalares (MALTA et. al., 2006).

Dentre as doenças cardiovasculares mais prevalentes temos a hipertensão

arterial, coronariopatias, acidentes vasculares cerebrais (AVC), insuficiência cardíaca

congestiva (ICC), valvulopatias, cardiopatia reumática, entre outras. Nestas as doenças

de origem vasculares são as predominantes, como as coronariopatias em que há um

prejuízo de continuidade do fluxo sanguíneo no vaso, ocasionando as obstruções no

trajeto do sangue.

A Hipertensão Arterial é um termo que se aplica a qualquer adulto com uma

pressão sanguínea sistólica superior a 140 mmHg e/ou pressão sanguínea diastólica

superior a 90 mmHg (CLARK, PYNE-GEITHMAN, 2005). A hipertensão arterial é o

ponto-chave inicial para o desenvolvimento de outras patologias associadas às

doenças cardiovasculares, tendo grande contribuição na estatística como preditora

para o desenvolvimento das coronariopatias.

Associado à hipertensão, há vários fatores de risco que facilitam o

desenvolvimento das complicações com AVC, a coronariopatia e outros como

tabagismo, dislipidemia, hipertensão, diabetes, da obesidade abdominal, do estresse,

da falta de consumo diário de frutas e verduras e da falta de pratica de exercícios

físicos. A maioria das doenças cardiovasculares está ligada a distúrbios vasculares.

Atualmente, os fármacos usados na terapêutica da HA têm três alvos: (1) o

coração, para que ele funcione com menor força de contração e com uma frequência

de contração relativamente baixa, diminuindo assim o débito cardíaco e

consequentemente a pressão arterial; (2) os rins, para aumentar o volume de líquidos

excretados na urina, com o objetivo de diminuir o volume de sangue circulante e assim

reduzir o volume bombeado pelo coração; (3) vasos sanguíneos, sobretudo as artérias

e arteríolas, induzindo o relaxamento do músculo liso vascular e assim reduzindo a

resistência à passagem do sangue por este (CLARK, PYNE-GEITHMAN, 2005).


2013

31

Embora já estabelecida, e contando com fármacos das mais variadas classes e

com os mais variados mecanismos de ação, a terapêutica da hipertensão arterial ainda

carece de alternativas outras e assim a busca por novas entidades químicas com

potencial terapêutico é uma realidade e uma tendência mundial.

2.4 Plantas medicinais com atividade no sistema cardiovascular

A percepção sobre o poder curativo de algumas plantas é uma das formas de

relação entre populações humanas e plantas. As práticas relacionadas ao uso

tradicional de plantas medicinais são o que muitas comunidades têm como alternativa

para a manutenção da saúde ou o tratamento de doenças. Muitas plantas possuem

ação primordial no sistema cardiovascular, contribuindo bastante para a reversão das

complicações cardíacas ou prevenindo-as. Uma vez que estas estão dentro das

doenças que constituem a principal causa de morte em todas as regiões do país, por

isso é tão importante à investigação de produtos naturais que propiciem um regime

terapêutico eficaz para as doenças cardiovasculares.

Dentre as plantas com atividade no sistema cardiovascular existem o trevo

(Melilotus officinalis Lam.) tradicionalmente utilizada no tratamento de afecções por

insuficiência venosa crônica, o cratego (Crataegus monogyna Jaquin emend.) ação

antiarrítmica, a dedaleira ou digitalis (Digitalis purpúrea L.) seu uso difundido com

cardiotônico e outros mais (SIMÕES et. al.; 2004). Também foi demonstrado que o

extrato de fruta de Terminalia pallida possui efeito cardioprotetor, reduzindo lesão

miocárdica em ratos (SHAIK, 2012). Há relatos na literatura da ação do resveratrol, um

polifenol extraído de uvas, tem como principais efeitos a atividade antioxidante,

cardioprotetora (GAMBINI et. al., 2013). A espécie Juniperus excelsa tem seu uso

associado à redução na pressão arterial e ação vasodilatadora, comprovada em

estudos em aorta de ratos anestesiados, e efeito cardiomodulador (KHAN et. al., 2012).

No trabalho de Gorzalczany, Moscatelli & Ferraro (2013) o extrato aquoso de

Artemísia copa foi observada ação vasorelaxante e hipotensora em anéis de aorta de

rato (in vitro) e níveis pressóricos (in vivo) por influxo de cálcio por canais de cálcio e

intracelular. Tal efeito está associado à presença de luteolina, chrysoeriol e ácido p-

cumárico encontrado nesta planta.


2013

32

Em estudos com compostos isolados de Lonchocarpus xuul da península de

Yucatán, México. O dihydrospinochalcone-A isolado desta planta demonstrou ação

vasorelaxante e hipotensora, mediada por ação do óxido nítrico via guanilato ciclase

solúvel e proteína cinase C e também dependências da abertura dos canais de

potássio (AVILA-VILARREAL et. al., 2013). Bastante comum ação vasorelaxante e

hipotensora em aorta em estudos com produtos naturais.

Vitex cienkowskii, de folha caduca, planta comum na medicina popular de

Cameroon demonstrou ação vasorelaxante, investigou-se a dependência do NO e

GCs, que foi confirmada como tais vias participantes do efeito relaxante e hipotensora

(DONGMO et. al., 2011). Os fatores endoteliais neste trabalho contribuem bastante

para tal efeito mediado pela Vitex cienkowskii.

Em trabalho com Cocos nucifera Linn. (Arecaceae), fruto utilizado comumente

na medicina tradicional para tratamento de cardiopatias avaliou-se a capacidade

vasorelaxante e anti-hipertensiva em anéis de aorta de ratos e ratos hipertensos. Os

resultados demonstraram dependência de fatores endoteliais, NO, prostaglandinas, e

também participação da GC para sua ação relaxante e anti-hipertensiva (BANKAR et.

al., 2011).

Em estudos com Euphorbia humifusa Willd. (EH) o seu extrato metanólico

produziu ação vasorelaxante em anéis de aorta de rato com dependência do endotélio

via de sinalização eNOS -NO- cGMP e abertura de canais KCa (WANG, 2013).

Em trabalhos com frutos de Nitraria sibirica Pall. estudou-se sua ação

vasorelaxante, uma vez que a mesma é utilizada popularmente na hipertensão, nos

experimentos houve redução da sua ação relaxante quando bloqueado a via do NO,

quando investigado os canais de potássio e inibidores das prostaglandinas não teve

contribuição na sua relaxante (SENEJEOUX et. al., 2012).

Estudos com Euterpe oleracea Mart (Acaí) fruto bastante consumido na

Amazônia em que demonstrou ação relaxante em leito vascular mesentérica de rato via

NO-cGMP e pode também envolver hiperpolarizante fator derivado do endotélio

(EDHF). Com potencialidades para ação no sistema cardiovascular (ROCHA et. al.,

2007).

Alpinia zerumbet (K. Schum), uma planta medicinal de origem oeste da Ásia, é

usado no nordeste e sudeste do Brasil, como infusões ou decocções como um

diurético, anti-hipertensivo. Provavelmente, o efeito vasodilatador de Alpinia zerumbet

(AZE) é dependente da activação da via NO-cGMP e independente da activação dos


2013

33

canais de ATP-dependente, dependente da voltagem, e dependente do cálcio de K +.

Receptor de bradicinina também pode participar do efeito vasodilatador do AZE.

Justificando sua ação diurétca e anti-hipertensiva (MOURA et. al., 2005).

2.5 Óleos Essenciais, seus constituintes e suas atividades.

Bastante divulgado na aromaterapia os óleos essenciais são utilizados com

função terapêutica e farmacológica (EDRIS, 2007). Os óleos essenciais são voláteis,

de origem natural, formados por componentes complexos caracterizados por um forte

odor, e são formados pelo metabolismo secundário de plantas aromáticas (JOCA,

2012; MACHADO et. al., 2011; BERG & LUBERT, 2008). Os óleos essenciais são

constituídos pelos elementos voláteis contidos em vários órgãos das plantas e assim

são classificados devido à sua composição lipofílica, que apresentam quimicamente

diferentes da composição glicerídica dos verdadeiros óleos e gorduras. Apresentam

sabor geralmente ácido e picante, coloração incolor, também tendem a serem estáveis.

Estão associados a várias funções necessárias à sobrevivência do vegetal em seu

ecossistema, exercendo papel fundamental na defesa contra microorganismos e

predadores, e também na atração de insetos e outros agentes fecundadores (WINK,

2013). Além do papel de defesa em que desempenha os metabólitos secundários

desempenham função de adaptação e como ferramenta farmacológica. Embora o

metabolismo secundário nem sempre seja necessário para que uma planta complete

seu ciclo de vida, ele desempenha um papel importante na interação das plantas com o

meio ambiente, como também atividade farmacológica. (PEREIRA & CARDOSO, 2012;

BOURGAUD et. al., 2001;).

De acordo com a família a que pertencem, as diversas espécies de plantas

acumulam esses elementos voláteis em órgãos anatômicos específicos. Do ponto de

vista de exploração da biodiversidade vegetal, quando esse órgão representa um

substrato renovável (exemplo resina, folha, flor, fruto, semente), é possível extrair-se a

essência sem eliminar a planta. (ZOGHBI et. al. 1998).

Dentre as funções biológicas que desempenham, já foram relatadas a atividade

anti-inflamatória, antifúngica, antibacteriana, antioxidante, analgésica,

anticarcinogênica, entre outras (FREIRE, et. al., 2005; KARKABOUNAS et. al., 2006;


2013

34

MATOS, 2007). Como também ação larvicida, atividade antioxidante, ação analgésica

e anti-inflamatória, fungicida e atividade antitumoral. (CARMO et. al., 2008; SILVA,

2008; MENDES et. al.; 2010; RAJKUMAR et. al., 2010; WANNES et. al., 2010;).

Também são descritos efeitos antidepressivos, sedativos, relaxantes

musculares e anestésicos. Alguns produtos secundários exercem suas funções pela

semelhança com metabólitos endógenos, receptores, hormônios, moléculas da

transdução de sinais ou neurotransmissores, e por isso possuem efeito benéfico nos

homens graças a sua similaridade com moléculas do sistema nervoso central, sistema

endócrino, etc. (BRISKIN, 2000).

Pelissari et. al. (2010) relatam como resultados a atividade antibacteriana in vitro

do óleo essencial de Melampodium divaricatum (Rich) DC., com total inibição do

crescimento de cepas Gram positivas, como S. aureus e B. subtillis.

Em estudos com óleo essencial de Croton argyrophylloides os resultados

demonstraram forte atividade vasorelaxante em anéis de aorta quanto em mesentérica

(FRANÇA-NETO et. al., 2012). Magalhães et. al. (2008) relata o efeito vasorelaxante do

óleo essencial de Croton nepetaefolius em aorta de rato e leito de mesentérica com

dependência parcial do endotélio. A administração do óleo essencial Mentha x villosa

em ratos promove uma redução na pressão arterial (LAHLOU et. al., 2002). A

administração intravenosa de óleo essencial da Aniba canelilla (EOAC) e seu principal

constituinte 1-nitro-2-feniletano (NP) em artéria mesentérica superior isolada de ratos

espontaneamente hipertensos (SHR) levou a um efeito vasorelaxante, que não foi

relacionado com a participação do óxido nítrico (NO), mas com a participação dos

canais iônicos (INTERAMINENSE et. al., 2013). Em estudos com ratos normotensos foi

avaliada a participação do metileugenol no efeito relaxante nos níveis pressóricos

causando hipotensão (LAHLOU et. al., 2004). Pires et. al. (2012) demonstrou que o

óleo essencial de Ocimum gratissimum teve sua ação vasorelaxante, dependente da

presença do endotélio vascular, em aorta e mesentérica isoladas de ratos. Em

trabalhos em que se testou a leptina em artéria mesentérica, foi observado o efeito

vasorelaxante dependente na participação do NO (MOHAMMED et. al., 2007).

Quanto a sua composição, os óleos essenciais são ricos em constituintes

terpênicos, fenilpropanóides, acrescidos de moléculas menores, como álcoois, ésteres,

aldeídos e cetonas de cadeia curta. Como também alcalóides, terpenos, compostos

fenólicos, flavonóides, tantos outros (FRANZ, 2010). É possível ressaltar que as

substâncias majoritárias encontradas nos óleos essenciais nem sempre são os


2013

35

componentes responsáveis pelas propriedades que estes demonstram. (BANDONI;

CZEPAK, 2008).

Terpenos (ou isoprenóides, ou terpenóides) formam uma subdivisão de classe

dos prenil-lipídios (terpenos, prenilquinonas, e esteróis) também definidos como um

grupo de moléculas cuja estrutura está baseada em um número definido de unidades

de isoprênicas. Terpenóides podem ser descritos como terpenos modificados onde

grupos metila são rearranjados ou removidos, ou são adicionados átomos de oxigênio,

oxidados (BOHLMANN; MEYER-GAUEN & CROTEAU, 1998). Estes são distribuídos

em plantas superiores, fungos, organismos marinhos e ferormônios de insetos.

Dentre os constituintes terpênicos dos óleos essenciais, os mais prevalentes são

os monoterpenos, principalmente dentre os com atividade sobre o sistema

cardiovascular (SANTOS et. al., 2011). Monoterpenos e sesquiterpenos são os

principais componentes dos óleos essenciais, enquanto os outros terpenos são

componentes de bálsamos, resinas, ceras e borrachas (BOHLMANN; MEYER-GAUEN

& CROTEAU, 1998).

Os terpenos são descritos como possuidores de uma diversidade considerável

de propriedades biológicas entre estas inúmeras têm a ação antimicrobiana, fungicida,

antiviral, anti-hiperglicêmica, anti-inflamatória, atividade antiparasitária e vasorelaxante.

(PADUCH et. al., 2007; SILVA-FILHO et. al. 2012). A literatura cita como um deles o

timol, um óleo com ação vasorelaxante e carvacrol ação hipotensora e relaxante

(PEIXOTO-NEVES et. al., 2010).

Em estudos in vivo com ratos foi avaliada a atividade antioxidante,

antiinflamatória, anticancerígena e antibacteriana do óleo essencial de sementes de

Nigella sativa e seus principais terpenos (p-cimeno, γ-terpineno, thymoquinone, β-

pineno, carvacrol, terpinen-4-ol e longifolene), em que a atividade anticancerígena,

antioxidante e antibacteriana destacaram-se e pode ser principalmente devido à ação

dos terpenos thymoquinone e longifolene (BORGOU et.al., 2010).

O óleo essencial de Pectis brevipedunculata (EOPB), um erva aromática

brasileira, que é caracterizada pelo seu alto teor de citral (81,9 %; 32,7 % e neral

geranial 49,2%), limoneno (4,7%) e α - pineno (3,4%). Esta mistura de terpenos são

responsáveis, EOPB e citral, por uma vasodilatação em anéis de aorta de rato com

dependência do NO/GMPC ativando influxo de cálcio pelos canais operados por

voltagem (PEREIRA, 2013).


2013

36

Alpinia zerumbet (K. Schum) planta utiizada no nordeste do Brasil com ação anti-

hipertensiva, diurética e antiulcerogênica. A ação vasoreaxante é mediada pela

ativação do NO-GMPc, com dependência dos canais de ATP, de cálcio, canais de K

operados por voltagem e receptores de bradicinina propiciando atividade anti-

hipertensiva (MOURA et. al., 2005).

2.6 Borneol

O borneol , 1, 7,7-Trimetilbiciclo [2.2.1] heptanol-2, é o monoterpeno

predominantemente encontrado em muitos óleos essenciais de plantas da família de

Dipterocarpaceae, Lamiaceae, Valerianaceae, Asteraceae (HORVTHOV et. al., 2009).

Borneol, um álcool monoterpenóide bicíclico, é um componente de muitas plantas com

atividades antimicrobianas, antioxidantes e anti-inflamatórias. Este monoterpeno é uma

substância, valiosa, presente em compostos aromáticos, divulgado pelo uso em

especiarias, materiais químicos. . Bastante utilizado na aromaterapia, na indústria de

cosméticos em fragrância, de forma decorativa, perfumes finos, shampoo, sabonetes e

outros produtos de higiene pessoal, bem como em produtos não cosméticos, como

produtos de limpeza e detergentes (BHATIA, MCGINTY, LETIZIA & API, 2008).

O borneol tem seu uso bastante difundido na China e em países do Sudeste

Asiático. Utilizado dentre suas inúmeras funções, para prevenção de doenças

cardiovasculares e atividade antitrombótica conferido no trabalho de Li (2008).

Presente na Farmacopéia da República Popular da China e tido com um dos principais

componentes dentre as ervas dos 63 produtos inclusos nela (CHEN et. al., 2011).

Existem dois tipos diferentes de borneol, borneol sintético que é uma mistura de

(+) / (-)-borneol (ou D/L-borneol) e isoborneol, em que o teor de (+) / (-)-borneol deve

ser de pelo menos 55,0%, e o borneol natural (extraído da matéria prima), cujo principal

componente é o (+)-borneol (D-borneol), o qual deve ter um teor maior que 95,0% de

(+)-borneol na mistura (SILVA-FILHO et. al., 2012).

Muitos dos efeitos biológicos são atribuídos ao borneol são de ação sedativa,

anti-inflamatórios, analgésicos, anti-nociceptiva e vasorelaxante (ALMEIDA et. al. De

2013, BUCHBAUER, JAGER, JIROVETZ, MEYER & DIETRICH, 1992; EHRNHOFER-

RESSLER et. al., 2013, SILVA-FILHO et. al., 2011), porém pouco se sabe sobre o


2013

37

mecanismo de ação do monoterpeno que determina muitos desses efeitos. Também

contribuem na analgesia, insônia, no tratamento de problemas gastrointestinais, em

uso como cicatrizante, para dores reumáticas, hemorróidas, doenças de pele e úlceras

(SVOBODA; HAMPSON, 1999; ZHENG et. al., 2008). Em estudos percebe-se sua

ação inibitória em gram-positivos e gram-negativos, atividade antifúngica, ação

antioxidante, imunomodulador, antitrombótico e antiplaquetário (KNOBLOCH, 1989;

TABANCA, 2001; KORDALI, 2005; CANDAN, 2003; JUHA, 2008; LI et. a., 2008). Tem

também ação como inibidor eficaz de reabsorção óssea in vivo e in vitro,

provavelmente através de um efeito direto sobre a formação de osteoclastos,

principalmente em células hematopoiético (HORVTHOV, 2009).

Dentre estas atividades temos também as exercidas no sistema cardiovascular,

atividade vasorelaxante em músculo liso de aorta (GUIMARÃES et. al., 2013; ALMEIDA

et. al., 2013; SANTOS et. al., 2011; SILVA-FILHO; 2012).

Assim, apesar de já haver na literatura relatos de atividade vasorelaxante do

borneol, ainda há lacunas em seu mecanismo de ação que devem ser preenchidas e

desta forma novas abordagens para o estudo de seu efeito e ação são necessárias

para uma melhor compreenção de seu potencial terapeutico.

2.7 Contração e Relaxamento do Músculo liso

A contração do músculo liso vascular possui um papel crítico na regulação e na

manutenção da pressão sanguínea (SONKUSARE et. al., 2006). Sendo que doenças

como a hipertensão e a asma estão associadas a uma regulação anormal da

contratilidade do músculo liso, tanto nos vasos sanguíneos como na traquéia (LEI et.

al., 1993; BARNES, 1998; OGUT, BROZOVICH, 2003; SALAMANCA, KHALIL, 2005;

BARNES, 2006).

Fisiologicamente, a contração do músculo liso é, em última

instância, dependente do aumento na [Ca2+]i(SOMLYO, SOMLYO, 1994), seja

pela liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares ou por sua entrada através de

canais de Ca2+ na membrana plásmatica. (THORNELOE, NELSON, 2005). Enquanto a

liberação de Ca2+dos estoques intracelulares, mediado por ativação por agonistas,

contribui para o inicio do desenvolvimento da força de contração, a manutenção desta


2013

38

contração depende absolutamente do influxo sustentado de Ca2+ através de canais na

membrana plasmática (SOMLYO, SOMLYO, 1994).

O retículo sarcoplasmático (R.S.) representa a principal fonte de Ca2+

intracelular, onde a liberação de Ca2+ desta organela é principalmente decorrente da

ativação de receptores de 1, 4,5 trifosfato de inositol (IP3R), que são canais de Ca2+

ativados pelo IP3, e também pelos receptores de ryanodina (Rur.), que são canais de

Ca2+ que são ativados pelo próprio Ca2+. Ambos receptores permitem a liberação de

Ca2+ do R.S. para o citosol aumentando a [Ca2+]i (DELLIS et. al., 2006). O IP3

responsável pelo aumento na [Ca2+]i ativa a fosfolipase C (PLC) e consequentemente

promovem hidrólise de fosfolipídios presentes na membrana produzindo o IP3 e

diacilglicerol (DAG) (PAYNE et al., 1986; BERRIDGE, 2005). A principal porta de

entrada para o Ca2+ que vem do meio extracelular são os CaV (CATTERALL, 2000), e

como a abertura de tais canais é controlada por variações no Vm das células da

musculatura lisa, a contração no músculo liso está intimamente relacionada com o Vm

dessas células, onde eventos de despolarização levam à contração, enquanto eventos

de repolarização ou hiperpolarização levam ao relaxamento deste músculo (NELSON

et. al., 1990; KNOT et. al., 1996; THORNELOE; NELSON, 2005). Uma das vias que

podem também contribuir na contração do músculo liso é a inibição da fosfatase da

cadeia leve da miosina (MLCP) (SOMLYO; SOMLYO, 2000). A MLCP é inibida

principalmente pela pequena proteína ligante de GTP, a RhoA, e por uma cinase

associada, a ROK, que é uma proteína cinase específica para resíduos de serina e

treonina (SOMLYO; SOMLYO, 2000).

Não importando a fonte, o Ca2+ quando em quantidades elevadas no meio

intracelular liga-se a uma proteína reguladora chamada calmodulina formando um

complexo [(Ca2+)4-CaM] que ativa a cinase da cadeia leve da miosina (MLCK). O

complexo [(Ca2+)4-CaM-MLCK] constitui a forma ativa da MLCK, que tem como função

fosforilar a cadeia leve da miosina (MLC), e esta adição do grupo fosfato permite o

desencadeamento do mecanismo de ciclização das pontes cruzadas entre os

filamentos de actina e miosina favorecendo um deslizamento entre esses filamentos,

com o consequente desenvolvimento da contração. (SOMLYO, SOMLYO, 1994;

SOMLYO, SOMLYO, 2003). A energia liberada pela hidrólise da adenosina trifosfato

(ATP) em adenosina difosfato (ADP) e fosfato inorgânico (Pi). A contração é regulada

diretamente na miosina, pois seu aparato contrátil, diferente do músculo esquelético,

não possui troponina (BERNE et al., 2004).


2013

39

Se o aumento na [Ca2+]i é o sinal que leva à contração, o relaxamento do

músculo liso se dá pelo retorno dos níveis de Ca2+ livre no citosol aos níveis basais

(SOMLYO et. al., 2004). Esta diminuição na [Ca2+]i pode ocorrer pelo mecanismo

eletromecânico de relaxamento, que é a repolarização (ou hiperpolarização) de

membrana, ou pelo mecanismo fármaco-mecânico, que se dá pela ativação de

receptores de membrana e inibição das vias bioquímicas que levam a contração

(WOODRUM, BROPHY, 2001).

O mecanismo envolvido no acoplamento eletromecânico de relaxamento envolve

a abertura de canais de K+, que neste contexto, desempenham um papel chave na

regulação do potencial de membrana e na excitabilidade celular, sendo que a

contração no músculo liso depende do balanço entre o aumento da condutância ao K+,

levando a uma hiperpolarização, enquanto a diminuição de sua condutância levaria a

uma despolarização (KNOT et. al., 1996).

Os canais de K+ conduzem íons K+ através da membrana plasmática a favor de seu

gradiente eletroquímico, que normalmente constitui uma corrente de saída (positiva),

no sentido do meio intracelular para o meio extracelular. A condução ao K+ determina

vários processos celulares incluindo controle do volume celular, secreção hormonal e

controle da formação e propagação de sinais elétricos em células excitáveis

(MACKINNON, 2003).

Sabe-se, até o momento, que em células da musculatura lisa, há pelo menos

quatro diferentes famílias de canais de K+ identificados. Esses incluem os KATP, os KCa,

os KV e os Kir (NELSON, QUAYLE, 1995). Dentre estas famílias de canais de K+, a

repolarização ou hiperpolarização de membrana ocorre devido, principalmente, a

ativação dos KV, em decorrência à despolarização de membrana, e a ativação dos KCa,

que são ativados quando a [Ca2+]i se eleva na ordem de M (LEDOUX et. al., 2006),

onde a ativação de ambos causa uma redução no influxo de Ca2+ através dos CaV por

sua inibição e consequentemente leva a uma redução das. [Ca2+]i(LEDOUX et. al.,

2006; LIN et. al., 2006).

Já os mecanismos de relaxamento envolvidos no acoplamento fármaco-mecânico

incluem a adição do grupo fosfato via PKG (proteína cinase dependente de GMPc) ou

PKA de vários substratos, podendo promover: (1) o aumento na atividade da Ca2+

ATPase tanto do R.S. (SERCA) como da membrana plasmática (PMCA), levando a um

aumento do seqüestro e da extrusão de Ca2+, respectivamente, diminuindo assim a

[Ca2+]i; (2) a inativação dos IP3R, reduzindo assim a sua capacidade de liberar de Ca2+


2013

40

do R.S.; (3) a diminuição da formação do IP3 e consequente diminuição da liberação de

Ca2+ do R.S.; (4) a inibição da MLCK, reduzindo sua afinidade pelo [(Ca2+)4-CaM], e a

adição do grupo fosfato na teloquina, que por sua vez ativa a MLCP, ambos os

processos causando uma redução nos níveis de MLC fosforilada e assim da própria

contração; (5) a inibição dos CaV, causando uma redução da [Ca2+]i por diminuir o

influxo de Ca2+; (6) a ativação de canais de K+, que indiretamente, por repolarização ou

hiperpolarização, causam a desativação dos CaV (WOODRUM; BROPHY, 2001;

DUTTA et al., 2002; DANILA; HAMILTON, 2004).

Outro caminho de vasorelaxamento mediado no músculo liso dá-se pela

presença do endotélio nos vasos sanguíneos. Este desempenha um papel fundamental

no mecanismo no músculo liso, de tal forma que na sua ausência o percentual é

abolido consideravelmente. Sua ação é dependente de fatores como o fator de

relaxamento derivado do endotélio (EDRF) tido como óxido nítrico (NO) mais tarde

(IGNARRO et. al., 1987), como também os fatores prostanóides.

De posse desses conhecimentos, e relembrando que o músculo liso é o principal

tipo de músculo que controla ou regula o funcionamento da maioria dos órgãos do

corpo, possuindo assim um papel importante na maioria dos sistemas biológicos,

estudos in vitro envolvendo a mensuração da contração e do relaxamento do músculo

liso são relevantes na tentativa de se descobrir novos fármacos terapeuticamente úteis.

.

Assim, com base nas premissas supracitadas em relação aos efeitos do

borneol em vários músculos lisos, foi proposto um aprofundamento no estudo do

mecanismo de ação pelo qual o borneol exerce efeito relaxante em aorta isolada de

rato.


2013

41

OBJETIVOS


2013

42

3.0 OBJETIVOS

3.1 Geral

Investigar o mecanismo de ação relaxante do (-)-borneol, um monoterpeno

presente em muitos óleos essenciais de diversas espécies de plantas aromáticas, em

aorta isolada de rato, com intuito de fornecer novas perspectivas sobre o efeito e a

ação farmacológica desse monoterpeno.

3.2 Específicos

3.1. Investigar a participação de fatores derivados do endotélio no efeito do

(-)-borneol;

3.2. Investigar a participação do óxido nítrico no efeito do (-)-borneol;

3.3. Investigar a participação de prostanóides no efeito do (-)-borneol;

3.4. Avaliar a participação de canais para potássio no efeito do (-)-borneol;


2013

43

MATERIAIS E MÉTODOS


2013

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4.0 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 MATERIAL

4.1.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos (Rattus norvegicus) pesando entre 250 e

350 g do, todos procedentes do Biotério Setorial da Universidade Federal do Vale do

São Francisco (UNIVASF). Os animais foram mantidos sob rigoroso controle alimentar

com uma dieta balanceada a base de ração tipo “pellets” com livre acesso a água, com

temperatura controlada e constante (22 1C), exaustão continua, submetidos

diariamente a um ciclo claro-escuro de 12 h, sendo o período claro das 06:00 às

18:00 h. Todos os experimentos foram realizados no período de 07:00 às 20:00 h.

4.1.2 Aspectos éticos

Todos os experimentos previstos foram executados de acordo com os princípios

éticos de experimentação animal do Comitê de Ética em Experimentação Animal da

UNIVASF aprovado pelo protocolo 0005/17092012 e da Sociedade Brasileira de

Ciência em Animais de Laboratório.

As drogas e substâncias utilizadas nos procedimentos experimentais bem como

algum material de consumo e outros materiais (seringas, agulhas, luvas de látex

descartáveis, restos de vísceras de animais, lâminas de bisturi, etc.) receberam o

mesmo tratamento do lixo hospitalar do município de Petrolina-PE, segundo a RDC 306

Figura 1. Rattus norvegicus


2013

45

de 07 de dezembro de 2004 da ANVISA, que dispõe sobre o regulamento técnico para

o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde, sendo recolhidos semanalmente

por empresa especializada, de acordo com contrato específicos.

4.1.3 Objeto de estudo

Neste trabalho foi utilizado um monoterpeno predominantemente encontrado em

muitos óleos essenciais de plantas da família de Dipterocarpaceae (Dipterocarpus

turbinatus C. e Dryobalanops spp.), Lamiaceae (Rosmarinus officinalis L., Salvia

officinalis L. e Lavandula officinalis Chaix & Kitt.), Valerianaceae (Valeriana officinalis

L.), Asteraceae (Matricaria chamomilla L. e Blurnea balsamifera L.), o

1,7,7-trimetilbiciclo-[2.2.1]-heptanol-2, conhecido como borneol.

Existem dois tipos diferentes de borneol: (1) borneol sintético, que é uma mistura

de (+)/(-)-borneol e isoborneol, em que o teor de (+)/(-)-borneol deve ser de pelo menos

55,0%; e o borneol natural (extraído da matéria prima), cujo principal componente é o

(+)-borneol (D borneol), o qual deve ter um teor maior que 95,0% de (+)-borneol na

mistura.

Neste trabalho, o borneol utilizado foi o (-)-borneol (ou L-borneol), que foi

fornecido pelos nossos colaboradores do Laboratório de Farmacologia Pré-Clínica

(LAPEC) da Universidade Federal de Sergipe (UFS), adquirido da Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA).

Figure 2. 1,7,7-trimetilbiciclo [2.2.1]-heptanol-2


2013

46

4.1.4 Substâncias e Sais

Foram utilizadas as seguintes substâncias, cloridrato de acetilcolina (ACh),

cloridrato de L(-)-fenilefrina (FEN), glibenclamida, cloreto de tetraetilamônio (TEA),

indometacina, N-(G)-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), 4-aminopiridina (4-AP),

cloreto de sódio (NaCl), bicarbonato de sódio (NaHCO3), glicose anidra (C6H12O6),

cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2.6H2O), cloreto de cálcio di-hidratado

(CaCl2. 2H2O), sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O), ácido clorídrico

(HCl), cloreto de potássio (KCl), fosfato diácido de potássio monohidratado

(KH2PO4.H2O), álcool etílico absoluto (C2H5OH).


2013

47

Tabela 1. Substâncias, sais e seus fornecedores

Substância Fabricante

Bicarbonato de sódio (NaHCO3) Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Cloridrato de Acetilcolina (ACh) Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Cloreto de L(-)-Fenilefrina (FEN) Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Cloridrato de glibenclamida Cloreto de Sódio (NaCl) Cloreto de Tetraetilamônio (TEA)

Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Glicose Anidra Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Indometacina Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Nitro L-Arginina éster metílico (L-NAME) Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, EUA)

Fosfato diácido de potássio monohidratado (KH2PO4.H2O) ISOFAR (Duque de

Caxias, RJ, Brasil)

Cloreto de cálcio bi-hidratado (CaCl2.2H2O) ISOFAR (Duque de

Caxias, RJ, Brasil)

Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4 7H2O) PROQUIMIOS

(RJ,BRASIL)

Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)

Etanol Absoluto C2H5OH

PROQUIMIOS

(RJ,BRASIL)

PROQUIMIOS

(RJ,BRASIL)

Cloreto de Magnésio hexahidratado (MgCl2.6H2O) Dinâmica ind. Brasil)

Cloreto de potássio (KCl) Dinâmica (ind. Brasil)

4-aminopiridina (4-AP) Fluka and Riedel-de

Haën (Seelze,


2013

48

Alemanha)

Todos os sais e substâncias apresentadas foram dissolvidas e/ou diluídas em

solventes indicados pelos fabricantes.

4.1.5 Soluções Nutritivas

Foi utilizada a solução nutritiva de Krebs, aerada com mistura carbogênica (95%

de O2 e 5% de CO2), com seu pH ajustado para 7,4 e cuja composição é apresentada

na Tabela 2.

Tabela 2. Composição da Solução de Krebs

Substância Concentração (mM)

NaCl 118

KCl 4,6

MgSO4.7H2O 5.7

KH2PO4.H2O 1,1

CaCl2.2H2O 2,5

NaHCO3 25

Glicose 11


2013

49

4.1.6 Aparelhos

Para o registro das contrações isométricas e isotônicas os segmentos dos

órgãos isolados foram suspensos em cubas (10 mL) de um sistema de banho para

órgãos isolados modelo EFF-321 (InsightInstruments, Brasil). Para o monitoramento

das contrações isométricas e isotônicas foram utilizados transdutores de força modelo

TRO015 (Panlab, S.L., Espanha) acoplados a um amplificador de força do tipo “bridge

system” (InsightInstruments, Brasil), conectado a um computador, onde foram

observados e armazenados os registros de contração e relaxamento através do

software WinDaq© (DATAQ Instruments, Inc., Akron, Ohio, EUA).

Para aferição do pH das soluções nutritivas foi utilizado um pHmetro digital de

bancada modelo pH250 (Policontrol, Brasil). Todas as substâncias foram pesada em

balança analítica, modelo FA2104N (Celtac, São Paulo, Brasil) ou semi-analítica

modelo MARK300 (Bel, São Paulo, Brasil) e os animais em balança comum modelo

9094C/4 (Toledo, São Paulo, Brasil).

Figura 3. Transdutor de força


2013

50

Figura 4. Banho para órgão isolados

Figura 5. Sistema de aquisição de dados digitais

Figura 6. Amplificador de sinais


2013

51

Figura 7. Balança Semi-analítica

Figura 8. Balança Analítica


2013

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4.2 MÉTODOS

4.2.1 Estudo do efeito vasorelaxante do borneol em aorta isolada de

rato

4.2.1.2 Preparação de anéis de aorta isolada de ratos

Os ratos foram anestesiados com tiopental sódico na dose de 40mg/Kg, após

anestesia – para que a nocepção e o estresse sejam suprimidos, bem como

conduzindo a inconsciência, para que o método de eutanásia seja indolor – foram

sacrificados por deslocamento cervical seguido por secção dos vasos cervicais. O tórax

do animal foi aberto e dissecado, a aorta torácica foi retirada cuidadosamente, limpa de

tecido conectivo e adiposo, seccionada em anéis medindo de 3 a 5 mm, sendo obtidos

anéis aórticos.

Para obtenção das respostas isométricas, os anéis foram suspensos

individualmente por hastes de aço inoxidável presas através de fios de algodão a

transdutores de força, em cubas de vidro (10 mL) contendo solução de Krebs a 37ºC e

aerados com mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2).

Os anéis aórticos foram deixados por um período de 60 min de estabilização,

durante o qual foram mantidos sob uma tensão inicial de 1 gF. Durante esse período, a

solução nutritiva foi trocada a cada 15 min, para prevenir a interferência devido ao

acúmulo de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).

Após o período de estabilização, foi induzida uma contração com FEN (10-6 M).

A integridade do endotélio vascular foi verificada pela adição de ACh (10-6 M) à cuba

durante a fase tônica da primeira contração induzida por FEN (FURCHGOTT;

ZAWADZKI, 1980).

Anéis sem endotélio funcional foram obtidos pela remoção mecânica da camada

endotelial, através do atrito provocado pela haste metálica em contato com a parede

interna do vaso. A retirada do endotélio foi confirmada pela ausência de relaxamento

induzido por ACh, o mesmo será considerado íntegro quando os anéis aórticos

apresentarem relaxamento induzido por ACh igual ou superior a 50% (em relação à

força máxima da contração inicial) e, ou quando esse for inferior a 10%.


2013

53

Após a verificação da presença, ou não, do endotélio, as soluções de banho

foram trocadas, sendo as preparações lavadas a cada 15 min com solução de Krebs

durante um período total de 30 min. Decorrido este tempo, uma segunda contração foi

induzida pela adição de 10-6 M de FEN e durante a fase tônica e sustentada dessa

segunda contração, o (-)-borneol foi adicionado a cuba de maneira cumulativa e seu

efeito foi avaliado.

Todos os relaxamentos estão expressos como a percentagem reversa da tensão

máxima obtida pela adição da FEN a cuba, onde o relaxamento máximo foi obtido

quando a tensão registrada era reduzida aos níveis basais iniciais.

Figura 9. Aorta de rato

Figura 10. Anel de aorta em haste metálica


2013

54

4.2.1.3 Investigação da participação de fatores derivados do endotélio

no efeito do (-)-borneol

Os anéis aórticos foram montados de acordo com os procedimentos citados no

item 4.2.1.2. Após 60 minutos de estabilização e verificado a presença ou ausência do

endotélio funcional, as preparações foram lavadas a cada 15 minutos, durante um

período de total de 30 min e então uma segunda contração foi induzida pela adição de

FEN. Durante a fase tônica dessa segunda contração, o (-)-borneol foi adicionado a

cuba de maneira cumulativa, de 3x10-8 a 3x10-4 M, em anéis aórticos com e sem

endotélio funcional, sendo os dados obtidos comparados entre si.

4.2.2 Investigação da participação do óxido nítrico no efeito do

(-)-borneol

4.2.2.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de L-NAME


protocolo 4.6.1.2, onde após 60 minutos de estabilização, foi induzida uma contração

com FEN (10-6 M) e a integridade do endotélio vascular foi verificada pela adição de

ACh (10-6 M) à cuba, após ser estabelecida a fase tônica e sustentada da primeira

contração induzida por FEN (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Só foram usados neste

experimento anéis aórticos com endotélio funcional, onde o relaxamento induzido por

ACh foi igual ou superior a 50% (em relação à força máxima da contração inicial).

Antes da segunda contração induzida por FEN, foi adicionado às cubas um

inibidor da enzima Sintase do Óxido Nítrico (eNOS), o L-NAME, na concentração de

100 μM, que permaneceu pré-incubados por 20 minutos antes da indução da contração

(OLIVEIRA et. al. 2012; KANG, Y. H, 2012; PINTO et. al., 2009). Durante a fase tônica

dessa segunda contração, o (-)-borneol foi adicionado a cuba, de maneira cumulativa,

em concentrações que foram de 3x10-8 a 3x10-4 M, contendo anéis aórticos com

endotélio funcional, tanto na ausência como na presença de L-NAME, sendo os dados

obtidos nas diferentes situações comparados.


2013

55

4.2.3 Investigar a participação de prostanóides no efeito do

(-)-borneol

4.2.3.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de indometacina








Antes da segunda contração induzida por FEN, foi adicionado às cubas um

inibidor não seletivo da enzima Ciclooxigenase (COX), a indometacina, na

concentração de 10 μM (OLIVEIRA et. al., 2012; PINTO et. al.; 2009; SKIKER et. al.,

2010), que permaneceu pré-incubados por 20 minutos antes da indução da contração.

Durante a fase tônica dessa segunda contração, o (-)-borneol foi adicionado a

cuba, de maneira cumulativa, em concentrações que foram de 3x10-8 a 3x10-4 M,

contendo anéis aórticos com endotélio funcional, tanto na ausência como na presença

de indometacina, sendo os dados obtidos nas diferentes situações comparados.


2013

56

4.2.4. Avaliação da participação da via do óxido nítrico associado aos

canais para potássio no efeito relaxante do (-)-borneol em aorta

isolada de rato

4.2.4.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de L-NAME e

TEA








Antes da segunda contração induzida por FEN, foi adicionado em algumas

cubas um inibidor da eNOS, o L-NAME, na concentração de 100 μM, e um inibidor não

seletivo de canais para potássio, o TEA+, na concentração de 3 mM, que

permaneceram pré-incubados por 20 minutos antes da indução da contração.



contendo anéis aórticos com endotélio funcional, tanto na ausência como na presença

da mistura de L-NAME e TEA+, sendo os dados obtidos nas diferentes situações

comparados.


2013

57

4.2.5 Avaliação da participação de canais para potássio no efeito do

(-)-borneol em anéis sem endotélio funcional

4.2.5.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de TEA



com FEN (10-6 M) e a ausência do endotélio vascular foi verificada pela adição de ACh

(10-6 M) à cuba, após ser estabelecida a fase tônica e sustentada da primeira contração

induzida por FEN (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Só foram usados neste

experimento anéis aórticos sem endotélio funcional, onde o relaxamento induzido por

ACh foi ausente ou inferior a 10% (em relação à força máxima da contração inicial).

Antes da segunda contração induzida por FEN, foi adicionado em cubas distintas

diferentes bloqueadores de canais para potássio, como: TEA (1 mM), nesta

concentração específica, um bloqueador dos canais para potássio de grande

condutância ativados por cálcio e voltagem (BKCa) e canais para potássio de

intermediaria condutância ativados por cálcio e voltagem (IKCa) (HANNER et al., 1997;

DOUGHTY et al., 1999); TEA (10 mM), nesta concentração, um bloqueador não

selectivo de canais para potássio (ROCHA, 2009; SILVA-FILHO et. al., 2012), que

permaneceu pré-incubado por 20 minutos antes da indução da segunda contração.



contendo anéis aórticos sem endotélio funcional, tanto na ausência como na presença

de TEA+, nas concentrações de 1 e 10 mM, sendo os dados obtidos nas diferentes

situações comparados.


2013

58

4.2.5.2 Efeito vasorelaxante do borneol na presença de 4-AP









cubas um bloqueador não seletivo de canais para potassio abertos por voltagem (KV), a

4-AP, na concentração de 1 mM (COLE et al., 1996; BERG, 2002; SILVA-FILHO et al.

2012), que permaneceu pré-incubado por 20 minutos antes da indução da segunda

contração.




de 4-AP, sendo os dados obtidos nas diferentes situações comparados.


2013

59

4.2.5.3 Efeito vasorelaxante do borneol na presença de glibenclamida









cubas um bloqueador seletivo de canais para potassio sensíveis ao ATP (KATP), a

glibenclamida, na concentração de 3 mM (SKIKER et. al., 2010;. MISHRA;

AARONSON, 1999 ), que permaneceu pré-incubado por 20 minutos antes da indução

da segunda contração.




de glibenclamida, sendo os dados obtidos nas diferentes situações comparados.

4.3 Análises dos Dados

Todos os dados obtidos foram expressos como média ± erro padrão da média

(SEM). O valor de “n” se refere ao número animais utilizados em cada experimento em

um dado protocolo.

Para os experimentos in vitro, usando órgãos isolados, as curvas mostrando a

relação concentração-resposta de uma substância foram ajustadas por uma regressão

não-linear (MOTULSKY; CHRISTOPOULOS, 2003), quando possível, ou são

mostradas como segmentos de reta ponto-a-ponto.

Através da regressão não-linear, calculada pela equação

Y=100/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope)), onde X é o log da concentração de (-)-borneol,

Y é a resposta relaxante em percentagem e o Slope de Hill é a inclinação do segmento


2013

60

reto da curva, foram calculados os valores de CE50 (concentração molar de uma

substância em que ela é capaz de causar 50% de seu efeito máximo), servindo como

parâmetro de potência relativa de uma substância, e o Emax (valor médio, em

percentagem, do efeito máximo obtido por uma substância em relação ao maior valor

possível num dado tecido) servindo como parâmetro de eficácia relativa de duas

substâncias (NEUBIG et al., 2003).

Diferenças entre as médias foram comparadas estatisticamente usando o teste

“t” de Student não-pareado, onde essas diferenças foram consideradas significantes

quando o valor calculado de “p” for menor que 0,05.

As análises estatísticas foram realizadas usando o programa Graph-PadPrism

5.0 (GraphPad Software Inc. San Diego, CA, EUA).


2013

61

RESULTADOS


2013

62

FEN

5.0 RESULTADOS

5.1 Estudo do efeito vasorelaxante do (-)-borneol em aorta isolada de rato

5.1.1 Investigação da participação de fatores derivados do endotélio no

efeito do (-)-borneol

O (-)-borneol relaxou os anéis aórticos isolados de rato, pré-contraídos com FEN

(10-6 M), de maneira dependente da concentração (de 3x10-8 a 3x10-4 M), tanto na

presença (n=11) como na ausência (n=9) de endotélio funcional (Figuras 11 e 12).

Figura 11. Registro original representativo do efeito relaxante do borneol em anéis de aorta na

presença do endotélio (n=11), em doses cumulativas pré-contraídos com 10-6M de FEN. Os

números e representam os pontos, durante o curso temporal do efeito vasorelaxante, onde o

borneol foi adicionado nas seguintes concentrações: () 10-7 () 3 x 10-7, () 10-6, () 3 x 10-6,

() 10-5, () 3 x 10-5, () 10-4 e () 3x10-4 M.

Figura 12. Registro original representativo do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis de aorta

na ausência do endotélio (n=9), em doses cumulativas pré-contraídos com 10-6M de FEN. Os

números e representam os pontos, durante o curso temporal do efeito vasorelaxante, onde o (-

)-borneol foi adicionado nas seguintes concentrações (M): () 10-7, () 3 x 10-7, () 10-6,

() 3 x 10-6, () 10-5, () 3 x 10-5, () 10-4 e () 3x10-4 M.

FEN


2013

63

Na presença do endotélio funcional o (-)-borneol apresentou um Emax de

74,7±5,9%, atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor estimado de CE50 de

1,3±0,5x10-4 M. Já na ausencia de endotélio, o (-)-borneol apresentou um Emax de

63,7±9,7%, atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor de estimado de CE50 de

6,6±3,0x10-4 M (Grafico 1).

Comparando-se as curvas concentração resposta, pode-se observar um

deslocamento para a direira da curva na ausência de endotélio, em relação a curva na

presença de endotétio funcional, o que pode ser confirmado comparando-se os valores

de CE50, onde na presença de endotélio temos um valor aproximadamente cinco vezes

maior que na sua ausência, mas que apesar disso, não apresentou diferença

estatisticamente significante quando caomparado ao valor de CE50 na ausência de

endotélio, utilizando-se o teste t de Student não-pareado como teste estatistico padrão

(Grafico 2).

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

0

20

40

60

80

100

**

**

**

*

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 1. Efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos isolados de rato, pré-contraídos

com 10-6M de FEN, na presença (, n=11) e na ausência (, n=9) de endotélio funcional. Os

símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da média,

respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: sem endotélio vs endotélio).


2013

64

Com endotélio Sem endotélio0

2.0×10-4

4.0×10-4

6.0×10-4

8.0×10-4

1.0×10-3

CE

50(M

)

Gráfico 2. Valores CE50 obtidos para o (-)-borneol na ausência e na presença de endotélio

funcional. As colunas e as barras verticais representam a média e o erro padrão da média,

respectivamente.

Neste ponto, foram enfrentadas as seguintes dificuldades no entendimento e na

escolha da metodologia adequanda para o tratamento dos dados obtidos: (1) apesar

de, no geral, o (-)-borneol apresentar um efeito relaxante dependente de concentração,

esse monoterpeno, numa certa faixa de concentrações (de 10-6 a 10-5 M), apresenta

efeito contrátil transitório (Gráfico 3); (2) observando a representação gráfica do efeito

do (-)-borneol percebe-se um padrão típico de resposta composta (ou

multicomponente), onde, a despeito da influência da presença do endotélio funcional, o

(-)-borneol apresenta uma primeira fase de seu efeito relaxante (que vai de 3x10-8 até

3x10-6 M), uma fase de efeito contrátil (de 10-6 M a 10-5 M) e uma segunda fase de

relaxamento (que vai de 3x10-5 até 3x10-4 M); (3) o fato dos dados representarem uma

resposta composta por relaxamento-contração-relaxamento (Gráfico 3), impede a

utilização de quaisquer ajustes de curva baseados em equações não-lineares ou

lineares, bem como ajustes para respostas bifásicas, que são apresentadas em

softwares estatísticos convencionais, forçando a apresentação dos dados do efeito do

(-)-borneol como segmentos de reta ponto-a-ponto e a calculos de valores de CE50, por

extrapolação matemática, não condizentes com a realidade. Para solucionar essas

dificuldades, decidiu-se por segmetar as fases do efeito do (-)-borneol e tratá-las em

separado, aplicando o tratamento estatístico correto.


2013

65

Gráfico 3. Fases do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos isolados de rato, pré-

contraídos com 10-6M de FEN, na presença (, n=11) e na ausência (, n=9) de endotélio

funcional. Os retângulos e descritores representam 1ª, 2ª e 3ª fases do efeito do (-)-borneol,

respectivamente. Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da

média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: sem endotélio vs

endotélio).

Assim, de 3x10-8 até 3x10-6 M o (-)-borneol relaxou os aneis aórticos isolados de

rato, pré-contraídos com FEN (10-6M), de maneira dependente da concentração, tanto

na presença (n=11) como na ausência (n=9) de endotélio funcional (Gráfico 4). Na

concentração de 3x10-5 M, na presença do endotélio funcional, o (-)-borneol apresentou

um Emax de 41,7±4,8% e um valor de CE50 de 2,8±0,9x10-7 M. Já na ausencia de

endotélio, o (-)-borneol apresentou um Emax de 20,7±4,8%, atingido também na

concentração de 3x10-5 M, e um valor de CE50 de 7,3±1,7x10-7 M.


2013

66

-8 -7 -6 -5

-10

0

10

20

30

40

50

* *

**

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)





Comparando os valores de Emax e CE50 do (-)-borneol (Gráfico 5), na presença e

na ausência de endotélio funcional, percebe-se que houveram diferenças significativas

para ambos os parametros, onde na presença de endotélio o borneol foi mais potente e

mais eficaz em relaxar os anéis de aórticos em relação a ausência do endotélio nesta

primeira fase de seu efeito.


2013

67


2.0×10-7

4.0×10-7

6.0×10-7

8.0×10-7

1.0×10-6

*

1ª Fase do relaxamento

CE

50(M

)


funcional para sua 1ª fase de relaxamento. As colunas e as barras verticais representam a

média e o erro padrão da média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado:

sem endotélio vs endotélio).

De maneira semelhante, de 10-5 até 3x10-4 M, o (-)-borneol relaxou os aneis

aórticos isolados de rato, de maneira dependente da concentração, tanto na presença

(CE50=1,1±0,2x10-4 M) como na ausência de endotélio funcional (CE50=1,0±0,1x10-

4 M). Na presença do endotélio funcional o (-)-borneol apresentou um Emax de

74,7±5,9%, atingido na concentração de 3x10-4 M e na ausencia de endotélio um Emax

de 63,7±9,7% atingido na mesma concentração (Gráfico 6).


2013

68

-5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0

0

20

40

60

80

100

**

*

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)





Comparando os valores de Emax e CE50 do (-)-borneol, na presença e na

ausência de endotélio funcional, percebe-se que não houveram diferenças

significativas para ambos os parametros nesta segunda fase de seu efeito relaxante

(Grafico 7).


2013

69


5.0×10-5

1.0×10-4

1.5×10-4

2ª Fase do relaxamento

CE

50(M

)


funcional para sua 2ª fase de relaxamento. As colunas e as barras verticais representam a

média e o erro padrão da média, respectivamente.

5.1.2 Investigação da participação do óxido nítrico no efeito do

(-)-borneol

5.1.2.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de L-NAME

O (-)-borneol relaxou os anéis aórticos isolados de rato, com endotélio funcional,

pré-contraídos com FEN (10-6M), de maneira dependente da concentração (de 3x10-8 a

3x10-4 M), na ausência (n=11) de L-NAME, apresentando um Emax de 74,7±5,6%,

atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor de CE50 estimado de 2,3±1,1x10-4 M.

Já em anéis aórticos com endotélio funcional e na presença de L-NAME (n=7), o

(-)-borneol teve o seu efeito relaxante abolido na faixa de concentrções que vai de

3x10-7 M até 3x10-6 M, apresentando um marcante efeito contrátil de 3x10-6 M até 3x10-

5 M, e somente a partir de 10-4 M apresentando maio uma vez efeito relaxante, sendo o

Emax de 55,8±8,1% alcançado em 3x10-4 M, e um um valor de CE50 estimado de

2,4±1,0x10-3 M (Gráfico 8).


2013

70

-8 -7 -6 -5 -4 -3

-20

0

20

40

60

80

100

* * * *

* **

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 8. Efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos com endotélio funcional, pré-

contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=11) e na presença (, n=7) de L-NAME. Os


respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: com endotélio vs com endotélio+L-

NAME).

Comparando as curvas concentração resposta para o (-)-borneol, pode-se

observar um deslocamento para a direira da curva na precença de L-NAME, em

relação a curva controle, o que pode ser confirmado comparando-se os valores de

CE50, onde na presença de L-NAME temos um valor aproximadamente dez vezes

maior que na sua ausência, apresentando diferença significante quando caomparado

ao valor de CE50 do controle (Gráfico 9).


2013

71

Controle L-NAME0

1.0×10-3

2.0×10-3

3.0×10-3

4.0×10-3

*

CE

50 (

M)

Gráfico 9. Valores CE50 obtidos para o (-)-borneol, em anéis aórticos com endotélio funcional,

na ausência e na presença de L-NAME. As colunas e as barras verticais representam a média

e o erro padrão da média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: com

endotélio (controle) vs com endotélio+L-NAME).

Decompondo o efeito do (-)-borneol em duas fases, temos que, na primeira fase

do seu efeito, o monoterpeno, na ausência de L-NAME, promove um relaxamento

dependente de concentração (de 3x10-8 até 3x10-6 M), com um Emax de 41,7±4,8% e

um valor de CE50 de 2,8±0,9x10-7 M, na presença de L-NAME, o (-)-borneol apresentou

um discreto efeito relaxante (aproximadamente 6,7%) na mesma faixa de

concentrações (Gráfico 10).


2013

72

-8 -7 -6 -5

0

10

20

30

40

50

* * * *

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 10. Primeira fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos com endotélio

funcional, pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=11) e na presença (, n=7) de

L-NAME. Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da média,


NAME).

Já na segunda fase do efeito relaxante, o (-)-borneol relaxou os aneis aórticos

isolados de rato, pré-contraídos com FEN, de maneira dependente da concentração

(de 10-5 a 3x10-4 M), tanto na ausência, com Emax de 74,7±5,8% e CE50 de 1,1±0,1x10-

4 M, como na presença de L-NAME, com Emax de 55,8±8,1% e CE50 de 1,0±0,1x10-4 M.

Comparando os valores de Emax e CE50 não hoveram diferenças significantes.


2013

73

-5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0

-20

0

20

40

60

80

100

* **

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 11. Segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos com endotélio


L-NAME. Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da média,


NAME).

Além do efeito relxante bifáico, o (-)-borneol também apresentou um efeito

contrátil, entre as concentrações 3x10-5 M a 3x10-4 M, com um Emax de 19,8±3,9% e

CE50 de 4,4±0,6x10-6 M, entretano esse efeito contrátil só ocorreu na presença de L-

NAME (Gráfico 12).


2013

74

-6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0

0

5

10

15

20

25

30

log [Borneol] (M)

Co

ntr

ação

(%

)

Gráfico 12. Efeito contrátil do (-)-borneol em anéis aórticos com endotélio funcional e na

presença de L-NAME (, n=7). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro

padrão da média, respectivamente.

5.1.3 Investigação da participação de prostanóides no efeito do (-)-

borneol

5.1.3.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de indometacina

O (-)-borneol relaxou os anéis aórticos isolados de rato, com endotélio funcional,

pré-contraídos com FEN (10-6M), de maneira dependente da concentração (de 3x10-8 a

3x10-4 M), na ausência (n=11) de indometacina, apresentando um Emax de 74,7±5,6%,

atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor de CE50 estimado de 2,3±1,1x10-4 M.

Já em anéis aórticos com endotélio funcional e na presença de indometacina (n=5), o

(-)-borneol teve o seu efeito relaxante abolido na faixa de concentrações que vai de

3x10-7 M até 10-6 M, apresentando um marcante efeito contrátil de 3x10-6 M até 10-5 M,

e somente a partir de 3x10-5 M apresentando mais uma vez efeito relaxante, sendo o

Emax de 36,8±3,7% alcançado em 3x10-4 M, e um um valor de CE50 estimado de

8,3±3,2x10-4 M (Gráfico 13).


2013

75

-8 -7 -6 -5 -4 -3

-20

0

20

40

60

80

100

* * * **

**

*

log [borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)


contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=11) e na presença (, n=5) de

indometacina. Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da

média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: com endotélio vs com

endotélio+Indometacina).

Comparando as curvas concentração resposta para o (-)-borneol, pode-se

observar um deslocamento para a direira da curva na precença de indometacina, em

relação a curva controle, o que pode ser confirmado comparando-se os valores de

CE50, onde na presença de indometacina temos um valor aproximadamente cinco

vezes maior que na sua ausência, apresentando diferença significante quando

comparado ao valor de CE50 do controle (Gráfico 14).


2013

76

Controle Indometacina0

5.0×10-4

1.0×10-3

1.5×10-3

*

CE

50(M

)

Gráfico 14. Valores CE50 obtidos para o (-)-borneol, em anéis aórticos com endotélio funcional,

na ausência e na presença de indometacina. As colunas e as barras verticais representam a

média e o erro padrão da média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado:

com endotélio (controle) vs com endotélio+indometacina).


do seu efeito, o monoterpeno, na ausência de indomatacina, promove um relaxamento


um valor de CE50 de 2,8±0,9x10-7 M, já na presença de indometacina, o (-)-borneol

apresentou um discreto efeito relaxante (aproximadamente 6,9%) na mesma faixa de

concentrações (Gráfico 15).


2013

77

-8 -7 -6 -5

-20

0

20

40

60

* **

*

log [borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)



indometacina. Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da

média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: com endotélio (controle) vs

com endotélio+indometacina).



(de 10-5 a 3x10-4 M), tanto na ausência, com Emax de 74,7±5,8% e CE50 de 1,1±0,1x10-

4 M, como na presença de L-NAME, com Emax de 36,0±3,7% e CE50 de 1,0±0,1x10-4 M.

Comparando os valores de Emax e CE50 não hoveram diferenças significantes (Gráfico

16).


2013

78

-5 -4 -3

-20

0

20

40

60

80

100

**

*

*

log [borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)



Indometacina. Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da

média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: com endotélio vs com

endotélio+indometacina).

Além do efeito relxante bifáico, o (-)-borneol também apresentou um efeito

contrátil, entre as concentrações 10-7 M a 10-5 M, com um Emax de 18,9±4,0% e CE50 de

1,0±0,1x10-6 M, entretano esse efeito contrátil só ocorreu na presença de indoetacina

(Gráfico 17).


2013

79

-8 -7 -6 -5 -4

0

5

10

15

20

25

log [borneol] (M)

Co

ntr

ação

(%

)

Gráfico 17. Efeito contrátil do (-)-borneol em anéis aórticos com endotélio funcional e na

presença de indometacina (, n=5). Os símbolos e as barras verticais representam a média e

o erro padrão da média, respectivamente.

5.1.4 Avaliação da participação da via do óxido nítrico associado aos

canais para potássio no efeito relaxante do (-)-borneol em aorta

isolada de rato

5.1.4.1 Efeito vasorelaxante do borneol na presença de L-NAME e TEA


(10-6 M), de maneira dependente da concentração (de 3x10-8 a 3x10-4 M), tanto na

presença de L-NAME (n=7) como na presença de L-NAME e TEA (n=6). Na presença

somente de L-NAME o (-)-borneol apresentou um Emax de 55,8±8,1%, atingido na

concentração de 3x10-4 M, e um valor de CE50 de 2,4±1,0x10-3 M. Já na presença de L-

NAME e TEA, o (-)-borneol apresentou um Emax de 80,1±5,5%, atingido na

concentração de 3x10-4 M, e um valor de estimado de CE50 de 1,2±0,4x10-3 M

(Grafico 18). Comparando os valores de CE50 nas duas situações experimentais, não


2013

80

foi detectada diferença estatisticamente significante, entretanto ao compararmos os

valores de Emax verificou-se um aumento significante da eficácia na presença

simutânea de L-NAME e TEA.

-8 -7 -6 -5 -4 -3

-20

0

20

40

60

80

100

*

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)


contraídos com 10-6M de FEN, na presença de L-NAME (, n=7) e na presença de

L-NAME+TEA (, n=6). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro

padrão da média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: L-NAME vs L-

NAME+TEA).


2013

81

5.1.5 Avaliação da participação de canais para potássio no efeito do (-

)-borneol em anéis sem endotélio funcional

5.1.5.1 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de TEA


(10-6 M), na ausência de endotélio funcional, de maneira dependente da concentração

(de 3x10-8 a 3x10-4 M), tanto na ausência (n=9) como na presença de 1 mM de TEA

(n=7).

Na ausência de TEA (1 mM), o (-)-borneol apresentou um Emax de 63,7±9,7%,

atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor estimado de CE50 de 6,6±3,0x10-4 M,

apresentando um efeito relaxante bifásico.

Já na presença de TEA (1 mM), o (-)-borneol apresentou um Emax de

60,8±11,6%, atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor de de CE50 de

5,7±2,7x10-4 M (Gráfico 19). Comparando os valores de Emax e CE50 nas duas

situações experimentais, não foi detectada diferença estatisticamente significante.


2013

82

-8 -7 -6 -5 -4 -3

-20

0

20

40

60

80

100

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 19. Efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem endotélio funcional, pré-

contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=9) e na presença de 1 mM de TEA (,

n=7). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da média,

respectivamente.


do seu efeito, o monoterpeno, tanto na ausência como na presença de TEA (1 mM),

promove um relaxamento dependente de concentração (de 3x10-8 até 3x10-6 M), com

um Emax de 20,7±4,8% e um valor de CE50 de 2,8±0,9x10-7 M, na ausência de TEA (1

mM), e um Emax de 44,9±10,3% e um valor de CE50 de 4,9±1,3x10-7 M na presença de

TEA (1 mM). Comparando os valores de Emax e CE50 nas duas situações

experimentais, não foi detectada diferença estatisticamente significante (Gráfico 20).


2013

83

-8 -7 -6 -5

0

10

20

30

40

50

60

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 20. Primeira fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem endotélio


TEA (1 mM). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da média,

respectivamente.

Na segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol, o monoterpeno, tanto na

ausência como na presença de TEA (1 mM), promoveu um relaxamento dependente de

concentração (de 10-5 até 10-3 M), com um Emax de 63,7±9,7% e um valor de CE50 de

1,7±0,5x10-4 M, na ausência de TEA (1 mM), e um Emax de 60,8±11,6% e um valor de

CE50 de 1,1±0,7x10-4 M na presença de TEA (1 mM). Comparando os valores de Emax e

CE50 nas duas situações experimentais, não foi detectada diferença estatisticamente

significante (Gráfico 21).


2013

84

-5 -4 -3

0

20

40

60

80

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 21. Segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem endotélio


TEA (1 mM). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da média,

respectivamente.

O (-)-borneol também relaxou os anéis aórticos isolados de rato, pré-contraídos

com FEN (10-6 M), na ausência de endotélio funcional, de maneira dependente da

concentração (de 3x10-8 a 3x10-4 M), tanto na ausência (n=9) como na presença de 10

mM de TEA (n=9).

Na ausência de TEA (10 mM), o (-)-borneol apresentou um Emax de 63,7±9,7%,



Já na presença de TEA (10 mM), o (-)-borneol apresentou um Emax de

79,8±4,7%, atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor de de CE50 de

1,8±0,5x10-4 M (Gráfico 22). Comparando os valores de Emax e CE50 nas duas

situações experimentais, não foi detectada diferença estatisticamente significante.


2013

85

-8 -7 -6 -5 -4 -3

0

20

40

60

80

100

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)


contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=9) e na presença de 10 mM de TEA (,


respectivamente.


do seu efeito, o monoterpeno, tanto na ausência como na presença de TEA (10 mM),

promove um relaxamento dependente de concentração (de 10-8 até 3x10-6 M), com um

Emax de 20,7±4,8% e um valor de CE50 de 7,4±2,1x10-7 M, na ausência de TEA (10

mM), e um Emax de 18,2±3,5% e um valor de CE50 de 5,0±1,4x10-7 M na presença de

TEA (10 mM). Comparando os valores de Emax e CE50 nas duas situações

experimentais, não foi detectada diferença estatisticamente significante (Gráfico 23).


2013

86

-8 -7 -6 -5

0

5

10

15

20

25

30

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 23. Primeira fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem endotélio


TEA (10 mM). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da

média, respectivamente.

Na segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol, o monoterpeno, tanto na

ausência como na presença de TEA (10 mM), promoveu um relaxamento dependente

de concentração (de 10-5 até 10-3 M), com um Emax de 63,7±9,7% e um valor de CE50

de 1,7±0,5x10-4 M, na ausência de TEA (10 mM), e um Emax de 79,8±4,7% e um valor

de CE50 de 2,0±0,4x10-4 M na presença de TEA (10 mM). Comparando os valores de

Emax e CE50 nas duas situações experimentais, não foi detectada diferença

estatisticamente significante (Gráfico 24).


2013

87

-5 -4 -3

0

20

40

60

80

100

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)

Gráfico 24. Segunda fase do efeito relaxante do (-)-borneol em anéis aórticos sem endotélio


TEA (10 mM). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro padrão da

média, respectivamente.

5.1.5.2 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de 4-AP



(de 3x10-8 a 3x10-4 M), tanto na ausência (n=9) como na presença de 1 mM de 4-AP

(n=6).

Na ausência de 4-AP, o (-)-borneol apresentou um Emax de 63,7±9,7%, atingido

na concentração de 3x10-4 M, e um valor estimado de CE50 de 6,6±3,0x10-4 M,


Já na presença de 4-AP, o (-)-borneol apresentou um Emax de 62,7±9,3%,

atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor de de CE50 de 4,4±2,6x10-4 M

(Gráfico 25). Comparando os valores de Emax e CE50 nas duas situações experimentais,

não foi detectada diferença estatisticamente significante.


2013

88

-8 -7 -6 -5 -4 -3

0

20

40

60

80

100

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)


contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=9) e na presença de 1 mM de 4-AP (,


respectivamente.

5.1.5.3 Efeito vasorelaxante do (-)-borneol na presença de glibenclamida



(de 3x10-8 a 3x10-4 M), tanto na ausência (n=9) como na presença de 3 mM de

glibenclamida (n=6).

Na ausência de glibenclamida, o (-)-borneol apresentou um Emax de 63,7±9,7%,


apresentando um efeito relaxante bifásico (Gráfico 26).

Já na presença de glibenclamida, o (-)-borneol apresentou um Emax de

68,5±4,3%, atingido na concentração de 3x10-4 M, e um valor de de CE50 de estimado

de 4,8±1,2x10-4 M, apresentando um marcante efeito contrátil na faixa de

concentrações que foram de 3x10-8 até 3x10-5 M (Gráfico 26). Comparando os valores

de Emax e CE50 nas duas situações experimentais, não foi detectada diferença

estatisticamente significante.


2013

89

-8 -7 -6 -5 -4 -3

-50

-25

0

25

50

75

100

* ** *

*

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)


contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=9) e na presença de 3 mM de

glibenclamida (, n=9). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o erro

padrão da média, respectivamente. *p<0,05 (teste “t” de Student não-pareado: controle vs

glibenclamida).


do seu efeito, o monoterpeno, na ausência de glibenclamida, promove um relaxamento


um valor de CE50 de 2,7±2,7x10-3 M (Gráfico 27). Já na presença de glibenclamida, o

(-)-borneol apresentou um discreto efeito relaxante (aproximadamente 2,9%) na faixa

de concentrações de 3x10-8 até 10-7 M e apartir de 3x10-7 M até 3x10-5 M apresentou

um marcante efeito contrátil, com um Emax de 20,6±5,3% e uma CE50 de 9,3±4,7x10-6 M

(Gráfico 28).


2013

90

-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0

0

5

10

15

20

25

30

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)


funcional, pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=9) de glibenclamida. Os


respectivamente.

-8 -7 -6 -5 -4

0

5

10

15

20

25

30

log [Borneol] (M)

Co

ntr

ação

(%

)

Gráfico 28. Efeito contrátil do (-)-borneol em anéis aórticos sem endotélio funcional e na

presença de glibenclamida (, n=9). Os símbolos e as barras verticais representam a média e

o erro padrão da média, respectivamente.


2013

91



(de 10-5 a 3x10-4 M), com Emax de 74,7±5,8% e CE50 de 2,5±1,3x10-4 M (Gráfico 29). Na

presença da glibenclamida, o (-)-borneol relaxou os aneis aórticos isolados de rato

apenas nas maiores concentrações (de 3x10-4 M a 3x10-3 M), obtendo um Emax de

69,5±4,3% e uma CE50 de 1,5±1,1x10-5 M (Gráfico 30).

-5 -4 -3

0

20

40

60

80

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)


funcional, pré-contraídos com 10-6M de FEN, na ausência (, n=9) de glibenclamida. Os


respectivamente.


2013

92

-5 -4 -3

-50

-25

0

25

50

75

100

log [Borneol] (M)

Rela

xam

en

to (

%)


funcional, pré-contraídos com 10-6M de FEN, na presença (, n=9) de glibenclamida. Os


respectivamente.


2013

93

DISCUSSÃO


2013

94

6.0 DISCUSSÃO

Neste trabalho foram reunidas evidências farmacológicas que dão suporte a

hipótese de que o 1,7,7-trimetilbiciclo-[2,2,1]-heptanol-2, conhecido por (-)-borneol, tem

um efeito vasorelaxante bifásico, onde parte desse efeito depende de ação de fatores

derivados do endotélio vascular, com o óxido nítrico e prostanóides, e parte desse

efeito depende da ação do monoterpeno diretamente no musculo liso vascular,

envolvendo os canais para potássio sensíveis ao ATP, os KATP, contudo sem a

aparentemente participação dos canais para potássio abertos por voltagem, os Kv,

nem tão pouco dos canais para potássio de grande condutância abertos pelo cálcio e

voltagem, os BKCa e outros canais sensíveis ao bloquei de TEA.

Sabe-se que muitas substâncias biologicamente ativas no sistema vascular

possuem suas ações relaxantes dependentes da produção e ação de fatores

relaxantes derivados do endotélio, conhecidos como EDRF, e que a retirada, por atrito

mecânico, dessa camada de células endoteliais reduz marcantemente tal efeito

relaxante (FURCHGOTT, 1984; SILVA et al., 1994).

Usando a aorta isolada de rato como ferramenta de bioprospecção da ação do

(-)-borneol, nota-se que esse monoterpeno possui um efeito vasorelaxante

notoriamente bifásico e com forte dependência da presença do endotélio vascular, pelo

menos no que tange aos dados aqui mostrados (Gráfico 1).

Outra característica dessa dependência de endotélio para o efeito relaxante do

(-)-borneol é que ela é mais evidente em concentrações menores, até a ordem de

micromolar, com diferenças na eficácia relativa como na potência quando comparamos

seu efeito na presença e ausência de endotélio vascular (vide Gráficos 4 e 5), mas à

medida que nas concentrações se aproximam da ordem de milimolar, essa

dependência do endotélio passa a não ser mais notória, o que pode ser evidenciado

pela ausência de diferenças entre a eficácia máxima e a potência relaxante do

monoterpeno, independentemente da presença ou não de endotélio (vide Gráficos 6 e

7).

É conhecido que, entre os EDRF, o óxido nítrico (NO) figura como o principal

fator produzido e liberado pelo endotélio, que através de uma ação parácrina no

musculo liso vascular induz o seu relaxamento (IGNARRO et al., 1987). Esse EDRF é

produzido pela enzima oxido nítrico síntase endotelial, a eNOS, a qual converte L-


2013

95

arginina e oxigênio molecular em L-citrulina e NO, e que pode ser inibida

competitivamente por falsos substratos como o L-NAME (FELETOU; VANHOUTTE,

2006).

Neste trabalho, a presença de L-NAME aboliu o efeito relaxante do (-)-borneol

em anéis aórticos, justamente na faixa de concentração em que havia uma maior

dependência da presença de endotélio para o efeito relaxante desse monoterpeno, na

ordem de micromolar, a primeira fase de seu efeito relaxante (vide Gráficos 8 e 10).

Além de abolir o efeito relaxante do (-)-borneol, a presença de L-NAME permitiu a

observância de um efeito contrátil marcante induzido por esse monoterpeno (vide

Gráficos 8 e 12).

Alguns mediadores endógenos, que agem sobre o endotélio vascular,

estimulando a síntese de NO, e consequentemente possuindo um efeito relaxante

indireto, como por exemplo a acetilcolina, a noradenalina, a histamina e a bradicinina, o

fazem através da ativação de seus respectivos receptores e ativação da via de

sinalização celular dependente de PLC-IP3/DAG-PKC-Ca2+, onde esse último

componente, o íon cálcio, uma vez complexado com a proteína calmodulina, é

responsável por ativar a eNOS e estimular a síntese de NO (DONG et al., 1998).

Além disso, o aumento dos níveis de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) no endotélio,

decorrente da ativação de receptores ligados a proteína G para vários mediadores,

como descrito acima, também estão implicados no estimulo para a produção de

prostanóides derivados do metabolismo do ácido araquidônico pelos dois tipos de

ciclooxigenases, sendo elas a COX-1 e COX-2. Além disso, sabe-se que alguns dos

prostanóides produzidos pelas COX endoteliais possuem efeitos relaxantes, como a

PGE2 e PGI2, enquanto outros efeito contráteis, como a PGH2, PGG2 e TXA2 (WANG et

al., 2005; ZHOU et al., 2013).

Somado aos prostanóides, o aumento dos níveis de [Ca2+]i endotelial, bem como

a ação autócrina de prostanóides, também estimula a produção e liberação de

endotelinas, sobretudo a ET-1, que possui efeito dual sobre o musculo liso vascular,

ora induzindo relaxamento, através da ação autócrina no endotélio em receptores ETB

e estimulo da síntese de NO, ora efeito contrátil direto no músculo, através da ação

parácrina sobre receptores ETA (RAPOPORT; ZUCCARELLO, 2012).

Se seguirmos essa linha de pensamento, que vários mediadores podem causar

um efeito dual, ora contrátil ora relaxante, de maneira dependente da presença do

endotélio, e de forma direta ou indireta sobre o musculo liso vascular, podemos tecer a


2013

96

hipótese de que o (-)-borneol teria o seu efeito dual, dependente de endotélio, devido a

estimulação da produção de fatores endoteliais relaxantes e contráteis, e que na

presença de um inibidor da síntese de um dos mais importantes fatores relaxantes

derivados do endotélio, o NO, os efeitos contráteis do (-)-borneol sejam destacados.

Outro dado deste trabalho que corrobora com a hipótese apresentada acima, do

efeito dual do (-)-borneol ser dependente de fatores relaxantes e contráteis derivados

do endotélio, é o fato de a presença de um inibidor da síntese de prostanóides, a

indometacina, ter abolido seu efeito relaxante em concentrações menores (vide

Gráficos 13 e 15), também permitindo a observância de um efeito contrátil marcante

induzido por esse monoterpeno (vide Gráficos 13 e 17) de maneira semelhante ao

apresentado quando na presença de L-NAME. Neste último caso, a inibição da síntese

de prostanóides reduziria a ação de fatores relaxantes e contráteis, mas não impediria

a produção e a ação de endotelinas, mantendo assim um forte componente contrátil do

efeito deste monoterpeno.

Há relatos de outras substâncias que possuem uma dualidade de efeitos, com

efeito relaxante e contractuantes, como por exemplo a citocalasina-B e floretina

(DRESEL, 1987). Outro exemplo é o da cafeína, que tem ocupado posição de

destaque, sendo utilizada como ferramenta farmacológica, em que proporcionou

descobertas sobre o retículo sarcoplasmático (RS). Vários estudos indicaram ação da

cafeína em músculo liso dá-se de forma contrátil e também ação relaxante, variando de

acordo com as preparações em estudo. Em estudo com aorta de coelho demonstrou

ação contrátil (LEIJTEN; VAN BREEMEN, 1984). Por outro lado, a cafeína relaxa

várias espécies de músculos lisos, incluindo músculos vasculares, brônquios e liso das

vias biliares e gastrointestinais (ARNAUD, 1986). Em estudos de Watanabe et. al.

(1992) a cafeína demonstrou ação vasorelaxante e contractuante, de acordo com os

estímulos utilizados.

Como as variações na [Ca2+]i, em vários tipos celulares, implicam na ativação de

várias enzimas dependentes de Ca2+, bem como no controle da própria excitabilidade

celular, muito se passou a entender sobre a dinâmica de controle das funções

celulares após a descoberta dos “sparks” de Ca2+. Os “sparks” de Ca2+ são eventos de

liberação de Ca2+ do reticulo endoplasmático via ativação de receptores para rianodina

(RyR), que podem ser ativados pelo próprio Ca2+, proveniente da via PLC-IP3/DAG-

PKC-Ca2+, que é comum a vários mediadores endógenos (CHENG; LEDERER, 2008).


2013

97

Sabe-se que os “sparks” de Ca2+ podem ativar a síntese de NO, prostanóides,

endotelinas, entre outros fatores derivados do endotélio (BOLTON, 2006), bem como

os canais para potássio ativados pelo Ca2+ (KCa), que modulam o potencial de

membrana e a própria excitabilidade celular (JACKSON-WEAVER et al., 2013) e são

apontados como um dos componentes do fator hiperpolarizante derivado do endotélio

(EDHF), que é um importante fator relaxante derivado do endotélio (SCHMIDT et al.,

2010). Também há relatos na literatura de que o TEA, que é um bloqueador

relativamente efetivo para os KCa (LANGTON et al., 1991), podendo reduzir a ação do

EDHF sobre o músculo liso vascular (CHUNG et al., 2012).

Neste trabalho, usando uma mistura de L-NAME e TEA, foi possível observar

que o (-)-borneol teve o seu efeito relaxante em concentrações menores abolido, mas

manteve o efeito relaxante em concentrações maiores, sem haver qualquer

modificações marcantes no padrão de resposta do monoterpeno comparando-se

apenas a inibição da eNOS com a inibição da síntese de NO conjuntamente com o

bloqueio dos KCa (vide Gráfico 18), indicando que, possivelmente, o EDHF não faria

parte dos fatores relaxantes derivados do endotélio de importância para o efeito

vasorelaxante do (-)-borneol.

Até esse ponto, foram mostradas evidências da participação do NO e de

prostanóides no efeito vasorelaxante do (-)-borneol em aorta isolada de rato, sobretudo

na primeira fase de seu efeito relaxante, mas também ficou claro que mesmo na

presença de L-NAME, indometacina ou até na presença simultânea de L-NAME e TEA,

o (-)-borneol apresenta um efeito relaxante em concentrações na ordem de milimolar,

que se caracteriza por ser a segunda fase de seu efeito relaxante, denotando que,

além do efeito relaxante dependente do endotélio vascular, há um possível efeito

relaxante direto do monoterpeno, cuja ação residiria no músculo liso vascular. Além

disso, com a inibição da síntese de dois dos principais EDRF, o NO e a PGI2, foi

evidenciado um marcante efeito contrátil induzido pelo (-)-borneol, dentro da mesma

faixa de concentrações relativas ao seu efeito dependente de endotélio (primeira fase),

o que poderia indicar que esse monoterpeno também poderia estimular as células

endoteliais a produzir e liberar fatores contraturantes, como por exemplo as

endotelinas.

Fisiologicamente, a contração do músculo liso é, em última instância,

dependente do aumento nos níveis intracelulares dos íons Ca2+ (SOMLYO; SOMLYO,

1994). A contração no músculo liso vascular está intimamente relacionada com o


2013

98

potencial de membrana dessas células, onde eventos que levam a uma despolarização

levam à contração, enquanto eventos que levam a uma repolarização, ou

hiperpolarização, levam ao relaxamento deste músculo (LAWSON, 2000). A

musculatura lisa tem como o principal representante dos CaV o subtipo CaV1.2, que é

um dos membros da subfamília dos CaV, presente em vários músculos lisos, incluindo

a aorta de rato (CATTERALL et al., 2005).

Neste contexto, os canais de potássio desempenham um papel chave na

regulação do potencial de membrana e na excitabilidade celular, sendo a contração no

músculo liso depende do balanço entre o aumento da condutância ao íon K+, levando a

uma hiperpolarização, e a diminuição da condutância ao K+, levando a uma

despolarização (KNOT et al., 1996). O movimento dos íons K+ através de canais

localizados na membrana regulam o influxo de Ca2+ através dos CaV (THORNELOE;

NELSON, 2005).

Sabe-se, até o momento, que em células da musculatura lisa, há pelo menos

quatro diferentes famílias de canais para K+ identificados. Esses incluem os KATP, os

KCa, os KV e os Kir (NELSON; QUAYLE, 1995). Dentre estas famílias de canais de K+, a

repolarização ou hiperpolarização de membrana ocorre devido, principalmente, a

ativação dos KV, em decorrência à despolarização de membrana, e a ativação dos KCa,

que são ativados quando a [Ca2+]i se eleva na ordem de µM, onde a ativação de ambos

causa uma redução no influxo de Ca2+ através dos CaV por sua inibição e

conseqüentemente leva a uma redução das [Ca2+]i (LEDOUX et al., 2006).

Dada a importância dos canais para K+ no controle do tônus vascular, neste

trabalho foram utilizadas algumas ferramentas farmacológicas, como bloqueadores

desses canais, para testar a hipótese de se o efeito vasorelaxante, independente da

participação de EDRF, induzido por (-)-borneol, sobretudo em concentrações mais

altas, era dependente da participação desses canais.

Dentre os bloqueadores de canais para K+ de importância farmacológica

destaca-se o TEA, que pode bloquear uma vasta gama de tipos diferentes de canais

para K+ em concentrações próximas a 10 mM, mas que na concentração de até 1 mM

é seletivo para bloquear apenas os BKCa. Os dados aqui apresentados mostram que o

(-)-borneol manteve o seu efeito vasorelaxante na presença tanto de 1 mM como de 10

mM de TEA (Gráficos 19 e 22), sugerindo que os canais para K+ sensíveis ao bloqueio

pelo TEA, incluindo os BKCa, não estariam envolvidos neste efeito relaxante.


2013

99

Vários tipos de canais para K+, de importância para os processos que levam ao

relaxamento do musculo liso vascular, não são bloqueados pelo TEA (NELSON et al.,

1990) como os KV e os KATP. Aqui foi mostrado que (-)-borneol não teve o seu efeito

relaxante alterado na presença de um conhecido bloqueador dos KV, a 4-AP, sugerindo

que esses canais também não estariam envolvidos no feito vasorelaxante exibido pelo

monoterpeno (Gráfico 25).

Contudo, na presença de glibenclamida, um bloqueador dos KATP, o (-)-borneol

teve seu efeito relaxante abolido em quase toda a faixa de concentrações utilizadas,

apenas apresentado efeito relaxante na mais alta concentração utilizada neste trabalho

(Gráfico 26). Além disso, na presença de glibenclamida, o (-)-borneol teve um efeito

contrátil bastante acentuado (Gráfico 28), indicando que, a despeito da presença do

endotélio e de fatores contrateis produzidos por este, o mototerpeno aparentemente

age diretamente no músculo liso para induzir seu efeito contrátil. Em concordância,

Silva-Filho et. al. (2012) mostram que o (-)-borneol teve como um dos responsáveis

pela sua ação relaxante os canais de KATP.

Sabe-se que os KATP estão envolvidos no efeito relaxante de uma grande

variedade de substâncias, como por exemplo a adenosina (FURIAN, 2009), PGI2

(JACKSON et. al.,1993), da própria ACh, cuja a ação vasorelaxante é dependente da

produção endotelial de NO (GARLAND; MCPHERSON, 1992), mas apenas poucas

substâncias vasorelaxantes têm como característica uma ação direta sobre esses

canais, como por exemplo o nicorandil, pinacidil e a levocromacalina (LUCKHOFF;

BUSSE, 1990; GOJKOVIC-BUKARICA; KAZIC, 1999; SATO, 2000). A maior dessas

substâncias relaxantes agem atraves de mecanismos moleculares que modulam a

abertura dos KATP, como a fosforilação desse canal em decorrência da ativação da via

do AMPc/PKA, no caso da adenosina e PGI2 (EGUCHI et al., 2007), ou GMPc/PKG, no

caso do NO (SOUZA; BOUSKELA, 2013).

Apesar de haver relatos na literatura do feito vasorelaxante do (-)-borneol,

inclusive em aorta de ratos (SIVA-FILHO et. al., 2012), esses dados conflitam com

dados apresentados neste trabalho, sobretudo quanto à dependência do endotélio

vascular para o efeito relaxante do monoterpeno e seu efeito dual (ora relaxante ora

contrátil).

Entretanto, foi demonstrado que o borneol tem um efeito modulatório positivo no

receptor de GABAA (GRANGER; CAMPBELL; JOHNSTON, 2005) ao passo que pode

inibir os receptores nicotínicos da acetilcolina (nAChR) (PARK et al., 2003). Além disso,


2013

100

alguns autores salientam que o borneol tem efeitos duais também no sistema nervoso

central (SNC), ora aumentando os níveis de neurotransmissores excitatórios ora os

níveis de neurotransmissores inibitórios (LI et al., 2012), se esse tipo de efeito dual for

comum aos sítios de ação periféricos eles podem explicar as inconsistências de dados

apresentados neste trabalho em relação à literatura.


2013

101

CONCLUSÕES


2013

102

7.0 CONCLUSÃO

Em aorta de rato, o efeito relaxante do (-)-borneol, o 1,7,7-trimetilbiciclo [2.2.1]-

heptanol-2, parece ser devido, pelo menos em parte, a produção endotelial do

óxido nítrico e prostagladinas;

Nas nossas condições experimentais foi observado um efeito dual para o (-)-

borneol, ora causando relaxamento ora contração;

O efeito independente de endotélio vascular do (-)-borneol parece depender

fortemente dos KATP;

O (-)-borneol parece ter múltiplos sítios de ligação, explicando assim sua gama

de diferentes efeitos apresentados e ações propostas.


2013

103

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS


2013

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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