PRINCIPI MOLEKULARNE I FENOTIPSKE EVOLUCIJE

Izvodi iz predavanja

BILJANA STOJKOVI I NIKOLA TUCI

2. DEO

EVOLUCIJA GENOMA

2.1. Uloga genetikog drifta i prirodne selekcije u oblikovanju genoma 2.2. Mobilni genetiki elementi kod eukariota 2.2.1. Domestikacija mobilnih genetikih elemenata 2.2.2. Mobilni genetiki elementi i retrogeni 2.2.3. Mobilni genetiki elementi i specijacija 2.3. Duplikacije genoma i gena 2.3.1. Poliploidija 2.3.2. Duplikacije pojedinanih gena 2.3.3. Mehanizmi nastanka novih gena 2.3.4. Duplikacije unutar gena 2.3.5. Postanak gena iz ncDNK 2.2.6. Postanak novih gena putem horizontalnog prenoenja 2.3.7. Gubitak gena 2.3.8. Stope sticanja i gubljenja gena 2.4. Evolucija genske regulacije kod eukariota 2.4.1. Evolucija transkripcione regulacije 2.4.2. Evolucija posttranskripcione regulacije 2.4.2.1. Alternativno iskrajanje 2.4.2.2. Mikro RNK 2.4.3. Evolucija drugih oblika genske regulacije 2.4.3.1. Poliadenilacija 2.4.3.2. Prerada RNK 2.4.3.3. Remodelovanje hromatina 2.4.4. Nasleivanje genske ekspresije - epigenetika 2.4.4.1. Genomsko utiskivanje 2.4.4.2. Epigenetike promene izazvane sredinskim iniocima

1

2. DEO

EVOLUCIJA GENOMA

Kada se uporede veliine genoma virusa, bakterija i eukariota, uoie se da

postoji korelacija izmeu veliine genoma i sloenosti organizma. Po pravilu, virusni

genomi su manji od bakterijskih, a ovi su, opet, manji od genoma ak i

najjednostavnijih, jednoelijskih eukariota. Analize veeg broja do danas prouenih

prokariota pokazale su da njihovi genomi variraju od 0,5 do oko 9 Mb, dok se broj

gena, koji kodiraju proteine, kod njih kree izmeu 350 i oko 8000. Vieelijske

ivotinje (Metazoa) i biljke (Metaphita) sadre obino vie od 13000 gena koji

kodiraju proteine, u genomima veim od 100 Mb. Pokazalo se takoe da kod DNK

virusa i prokariota izmeu 80% i 95% nukleotidnih nizova ine kodirajui nizovi, dok

vieelijski eukarioti, iji su genome vei i do 10 000 puta, imaju samo oko 100 puta

vie kodirajuih nizova nukleotida.

Pored (funkcionalnih) gena, u genomima postoje DNK nizovi koji se po

genomu mogu iriti zarad sopstvenog interesa. To su razliite klase mobilnih

genetikih elemenata (ME) koji svoje ime duguju sposobnosti da skau kroz genom

(na engl. se esto nazivaju jumping genes, to bi se moglo prevesti kao skoi geni) i

da na taj nain poveavaju broj svojih kopija. Smatra se da ME predstavljaju glavnu

determinantu poveanja genoma kod eukariota. Na primer, oko 45% genoma oveka

sainjavaju raspreni (nelokalizovani) ME, iji broj kopija moe varirati od nekoliko

stotina do nekoliko stotina hiljada. Kod nekih biljnih vrsta, i do 80% ukupne koliine

DNK pripada mobilnim elementima, dok kod vieelijskih ivotinja njihova

zastupljenost u genomu varira od oko 3% do 53%.

2

Slika 2.1. Uee kodirajue DNK, intronske i meugenske DNK u veliini genoma razliitih taksona (prema: Lynch, 2007).

Introni i intergenska DNK predstavljaju dve osnovne klase nekodirajue DNK

(ncDNK). Kod prokariota, geni sa intronima su jako retki; na njih odlazi samo oko

0,2% ukupne DNK, i pripadaju iskljuivo klasi samoiskrajajuih introna. Kod

eukariota sa malim genomima, relativno su mali i intronski delovi gena. Veliine

genoma od oko 100 Mb uglavnom su praene priblino jednakim ueem egzona i

introna u strukturi gena koji kodiraju proteine. Kada genomi dostignu veliinu od

preko 25000 Mb, kao to je sluaj sa sisarima, 95% ukupne DNK koja se nalazi u

okvirima gena ine intronski delovi! Slino je i sa nizovima nukleotida koji se nalaze

izmeu gena koji kodiraju proteine (intergenska DNK); genomi manji od 1 Mb imaju

oko 20% intergenske DNK, dok je kod genoma od preko 10 Mb proseno uee ove

klase DNK preko 80%!

Na osnovu navedenih podataka mogli bismo rei da je tokom evolucije

postojala tendencija prema poveanju sledeih komponenti genoma:

1. veliine samog genoma,

2. broja gena koji kodiraju proteine,

3. broja mobilnih genetikih elemenata,

3

4. broja i veliine introna,

5. veliine intergenske DNK.

2.1. Uloga genetikog drifta i prirodne selekcije u oblikovanju genoma

Kako savremena teorija evolucije objanjava ove trendove u evoluciji

genoma? Mada su jo uvek brojni evolucioni biolozi koji smataju da se prirodnom

selekcijom mogu objasniti svi aspekti organizacije genoma, sve je vei broj onih koji

ukazuju da je to veliko pojednostavljenje evolucionih procesa i da su mnoge

karakteristike genoma i gena nastajale delovanjem semi-neutralnih procesa i vrlo

malim, ako ga je uopte i bilo, direktnim ueem pozitivne selekcije (Lynch, 2005,

str. 450). Obilje podataka, koje nam je o genomima prokariota i eukariota dala

molekularna biologija, pokazuje da nain kako e se odvijati evolucija genoma nekog

taksona ne zavisi samo od razliitih aspekata organizacije i funkcionisanja njegovih

elija, ve i od ogranienja koje nameu procesi na nivou populacija. Prema

populaciono-genetikoj teoriji, kljuna determinanta ovih ogranienja jeste efektivna

veliina polulacije (Ne), jer od nje zavisi verovatnoa fiksacije ili eliminacije novih

genetikih entiteta. Podsetimo se da, pored stvarnog broja jedinki neke populacije (N),

na efektivnu veliinu utie mnotvo faktora od odnosa polova kod organizama sa

polnim razmnoavanjem, preko nesluajnih variranja u veliine porodice, do promena

brojnosti populacija tokom generacija. Takoe, dobro nam je poznato da je efikasnost

prirodne selekcije daleko vea u velikim nego u malim populacijama, jer sluajne

fluktuacije u uestalostima genskih alela (zbog genetikog drifta) smanjuju uticaj

prirodne selekcije na dinamiku mutacija sa malim efektima na adaptivnu vrednost.

Matematiki opis odnosa efekata prirodne selekcije i genetikog drifta na

promene uestalosti genskih alela u populaciji kroz generacije, dala je genetiarka

Ohta (1972, 1977):

Nes

21

gde je s koeficijent selekcije (kvantifikuje veliinu efekta prirodne selekcije na

promene uestalosti alela nekog gena u populaciji), i Ne je efektivna veliina

populacije (kvantifikuje efekat genetikog drifta sluajne promene uestalosti alela

nekog gena u populaciji). Ova formula na najbolji nain opisuje meuzavisnost

efekata dva evoluciona mehanizma u populacijama razliitih veliina. Pretpostavimo

4

da je varijabilnost na nekom genu selektivno prepoznatljiva, tj. da nosioci razliitih

alela u svojim genotipovima imaju razliite adaptivne vrednosti (stepen smanjenja

adaptivne vrednosti kod nosioca odreene genske varijante iznosi s). Oekujemo da

e selekcija, na osnovu razlika u adaptivnim vrednostima, oblikovati

transgeneracijske promene uestalosti alela tog gena u populaciji. Meutim, ukoliko

je populacija mala, tj. ako su efekti drifta veliki, promene uestalosti alela mogu u

veoj meri zavisiti od stohastikih procesa nego od pravaca delovanja prirodne

selekcije. Drugim reima, po nainu promena, ovaj gen e se ponaati kao da je

selektivno neutralan. Kako ukazuje kriterijum koji navodi Ohta, to su vei

koeficijenti selekcije, efektivna veliina populacije mora biti sve manja da bi

stohastike promene prevladale one selektivne. Uzimajui u obzir da koeficijenti

selekcije za razliite genetike varijante najee nisu veliki, moemo oekivati da e

u malim populacijama veliki broj mutacija biti efektivno neutralan.

Relativan doprinos stohastikih procesa (mutacija i genetikog drifta) i

prirodne selekcije u oblikovanju arhitekture gena i genoma nee biti isti kod

prokariota i eukariota. Stvarne (N) i efektivne (Ne) veliine populacija prokariota su

drastino vee u odnosu na eukariote. Samim tim, moe se oekivati da se efikasnost

prirodne selekcije dramatino smanjuje od prokariota, preko jednoelijskih eukariota

do vieelijskih eukariota. Ova pravilnost pokazana je u analizi velikog broja

empirijskih podataka koji se odnose na arhitekturu gena i genoma (Lynch, 2007).

Osnovni argument kojim se moe objasniti gore navedena tendencija, Lin je

ilustrovao na sledeem primeru. Pretpostavimo da prirodna selekcija u nekoj

evolucionoj liniji favorizuje poveanje telesnih dimenzija. Iz ekologije nam je dobro

poznato da svako znaajnije poveanje telesnih dimenzija dovodi do smanjenja broja

jedinki po jedinici povrine. Svako smanjenje veliine populacije poveava ansu da

e se mutacije sa blagim tetnim efektima akumulirati u genomima, ali i smanjuje

sposobnost prirodne selekcije da promovie neki proces koji e onemoguavati

akumulaciju tih mutacija. Drugim reima, u takvoj situaciji moe se oekivati da e

doi do poveanja veliine genoma i to ne zato to dati takson moe da tolerie

poveanje koliine DNK, ili zato to mu je iz nekog razloga potreban viak DNK, ve

jednostavno zato to je prirodna selekcija manje efikasna u eliminaciji takvog

genetikog materijala. Smanjenje veliine genoma, sa druge strane, moe se oekivati

kod organizama kod kojih selekcija ide u smeru smanjenja telesnih dimenzija, i to ne

zato to bi postojala direktna selekcija prema broj replikaciji, ve zato to bi

5

(purifikujua) selekcija efikasnije odstranjivala mutacije sa blagim tetnim efektima

u veim populacijama. Imajui u vidu procenu da prosena veliina savremenih

populacija prokariota iznosi oko 1023, uopte nije neoekivano da su prokariotski

genomi relativno mali i da su kod njih relativno male razlike izmeu najmanjih i

najveih genoma1.

Prirodna selekcija je zaista osnovni evolucioni mehanizam koji odreuje

veliinu i organizaciju genoma prokariota. Na primer, danas imamo niz

eksperimentalnih podataka o adaptivnom poveanju broja gena u genskim familijama

bakterija. Kod bakterija, tzv. genska amplifikacija, ili brza akumulacija dupliranih

gena (obino je posredovana sa aktivnou mobilnih genetikih elemenata), esto je

indukovana razliitim stresorima, kao to su toksine supstance, izloenost

antibioticima, ili sredinama sa malo hranljivih materija. Genskom amplifikacijom se

objanjava, na primer, fenomen tzv. adaptivne mutageneze. Naime, empirijske

studije su pokazale da se neke mutacije pojavljuju ee nego to se to oekuje na

bazi sluajnosti, kada se bakterije odgajaju sredini u kojoj bi te mutacije bile korisne2.

U eksperimentima sa bakterijom E coli, koja je u laktoznom operonu imala mutirani

alel LacZ, ali je ipak uspevala da raste na minimalnom medijumu sa laktozom

(bakterijski genetiari ovakve mutacije zovu leaky), pojavljivalo se vie revertanata

(LacZ+) nego to se to oekuje po principu sluajnosti, tj. procenjenoj stopi mutacija.

Hendrickson i sar. (2002) pokazali su da se veina tih revertanata pojavljivala nakon

dueg usporenog rasta i da je prvi korak u njihovom pojavljivanju bila znaajna

amplifikacija LacZ alela. To je omoguavalo bakterijama uspeno preivljavanje i

reprodukciju na laktozi zbog toga to je koliina enzima, iako oteenog, bila

poveana. Dakle, ekspanzija gena pruala je selektivnu prednost budui da je

amplificirana minimalna aktivnost LacZ alela poveavala adaptivnu vrednost

bakterijama. Povean broj kopija ovog alela, meutim, multiplicirao je verovatnou

pojave mutacija koje su restarurirale punu aktivnost ovog gena, tj. pojavu LacZ+ alela.

Vano je takoe rei da je, nakon pojave LacZ+ alela u samo jednoj od kopija, dolo 1 Do ove procene se dolo podelom broja prokariota koji naseljavaju Zemlju (oko 1030) i procenjenog broja vrsta savremenih prokariota (107). 2 Adaptivna mutageneza zapravo je drugo ime za ono to su Lamark i Darvin nazivali usmereni efekti ivotne sredine ili adaptivna reakcija organizama (mada se ovaj fenomen vezuje za Lamarka, on ga je eksplicitno odbacivao, a Darvin je na njemu posebno insistirao). Poto je savremena genetika nedvosmisleno pokazala da su mutacije sluajne u odnosu na potrebe organizama, problem adaptivne mutageneze dugo je bila nereiva zagonetka za molekularne biologe.

6

do brze eliminacije svih kopija LacZ alela iz populacije bakterija. Iz ovog podatka

moemo izvui zakljuak da je amplifikacija gena kod bakterija reverzibilan proces,

to, opet, ukazuje da je prirodna selekcija kod taksona sa velikim populacijama, kao

to su bakterije, mehanizam koji moe fino oblikovati veliinu genoma preko kontrole

broja kopija gena. Zanimljivo je da se kod bakterija ee amplifikuju horizontalno

preneeni geni u odnosu na one koji se prenose uobiajenim vertikalnim putem.

Pretpostavlja se da razlog lei u tome to je prirodna selekcija mogla testirati ove

gene za obavljanje specifinih adaptivnih zahteva pre nego to su oni dospeli u

nove elije domaina.

Adaptivna amplifikacija gena se veoma retko sree kod eukariota.

Najverovatniji razlog nisu razlike u stopama stvaranja i eliminacije dupliranih gena u

odnosu na prokariote, ve manje efikasna selekcija u znatno manjim eukariotskim

populacijama. Na to upuuju i podaci da je, kod eukariota, uestalost adaptivne

amplifikacije gena u negativnoj korelaciji sa dimenzijama organizama, odnosno

pozitivno je korelisana sa veliinama njihovih populacija - daleko najee se javlja

kod jednoelijskog kvasca, znatno ree kod nekih insekata, a vrlo je retka ili potpuno

odsutna kod kimenjaka.

2.2. Mobilni genetiki elementi kod eukariota

Mobilni genetiki elementi (ME) klasifikuju se u dve glavne grupe na osnovu

naina transpozicije. Prva grupa oznaava se kao klasa I (ili tip 2), ili

retrotransponzoni (retro-ME). Ovi ME se premetaju u genomima posredstvom RNK

intermedijera. U okviru ove klase postoje autonomni elementi, koji poseduju gene za

reverznu transkriptazu (RT), kao to su endogeni retrovirusi (ERV), transpozoni sa

dugim terminalnim ponovcima (LTR-retrotranspozoni) i LINE nizovi (od eng. long

interspersed nuclear elements). Neautonomni retro-ME, kao to su SINE nizovi (od

eng. short interspersed nuclear elements), nemaju gene za RT, ali su ipak u stanju da

menjaju svoje u mesto uz pomo LINE elemenata (slika 2.2)

Klasa II (ili tip 1) ili DNK transpozoni (DNK-ME) se premetaju direktno i to

uz pomo enzima transposaze ili korienjem nekog alternativnog mehanizma kao to

je tzv. kruna replikacija (engl. rolling-circle replication; unidirekcionalna replikacija

u kojoj se istovremeno sintetiu novi molekuli DNK ili RNK; prisutna je kod

plazmida, bakteriofaga i viroida).

7

Slika 2.2. Struktura klase I i klase II mobilnih genetikih elemenata (prema: Zeh i sar. 2009)

ME se mogu nai u genomima svih tipova elija, od bakterija do sisara.

Njihova iroka prisutnost posledica je njihove sposobnosti diseminacije kako unutar

genoma tako i irenja na druge genome. Neki ME mogu nastati spontano iz

nepremetajuih nizova DNK u genomima (npr. SINE), dok se drugi mogu prenositi

horozontalno izmeu razliitih vrsta. Mnogi ME eukariota vuku poreklo od

prokariota; DNK transpozoni srodni su bakterijskim insercionim nizovima, a retro-

ME srodni su intronima grupe II bakterija. Neki ME su izgleda prisutni kod eukariota

od samog njihovog nastanka, tako da se moe rei da su eukarioti koevoluirali sa

njima.

ME su vrlo mutageni zbog sposobnosti da se ugrade u egzone, promotore i

pojaavae i na taj nain dovode do naruavanje normalnog okvira itanja tokom

translacije, menjaju nivo ekspresije gena ili obrazac alternativnog iskrajanja. Osim

ovog aktivnog uticaja na ekspresiju gena, ME mogu i pasivno uticati na poveanje

stopa mutacija gena jer deluju kao homologni nizovi koji omoguavaju hromozomske

rearanmane i duplikacije/delecije gena. Naime, ME se mogu ugraditi u nehomologne

delove genoma i omoguiti da se izmeu tih delova odigra krosing-over uprkos

injenici da su nehomologni. Ove nehomologne rekombinacije dovode, ponekad, do

stvaranja dupliranih gena ili drugih genomskih rearanmana koji poveavaju

adaptivnu vrednost svojim nosiocima. Izgleda da se to desilo sa duplikacijom

8

kompletnog gena za hormon rasta u ranim fazama evolucije oveka (preko Alu-Alu

rekombinacije), ili sa duplikacijom (uz pomo L1 elemenata) koja je dovela do pojave

nekih globinskih gena. Najee, mobilni elementi, ipak, uslovljavaju pojavu tetnih

mutacija. Procenjuje se da je kod vonih muica oko 50% tetnih mutacija posledica

delovanja ME, kod mieva taj procenat je oko 10%, dok je kod oveka manje od 0,2%

poznatih naslednih oboljenja uzrokovano inaktivacijama gena u koji su ugraeni ME,

a oko 0,3% poremeaja posledica su delecija gena ili rearanmana hromozoma zbog

pasivnih efekata ME.

Nesumnjivo je da ME znaajno doprinose plastinosti genoma. Na tu

injenicu ukazuju nam i podaci da ME selektivno operiu u delovima genoma u

kojima se nalaze geni ija je varijabilnost esto kljuna za opstanak jedinki.

Poveanje brojnosti ME zapaa se, recimo, unutar ili oko gena za koje se zna da su

relativno brzo evoluirali i ije su uloge u metabolizmu takve da zahtevaju

fleksibilnost. U takvu grupu spadaju geni koji omoguavaju organizmima adekvatne

reakcije na promene u ivotnoj sredini (npr. geni koji uestvuju u imunskim

odgovorima ili signalnim putevima). Naravno, velika brojnost ME oko takvih gena

poveava i verovatnou nehomolognih rekombinacija. Postoje ak i tvrdnje da su

regioni genoma bogati ME neka vrsta genskih fabrika, jer je uoeno da se ovde

ostvaruje relativno visok nivo nejednakog krosing-overa i, posledino, sadre vei

broj multigenskih familija nego regioni koji su siromani mobilnim elementima.

Suprotno, regioni genoma oko visoko konzervisanih gena, koji imaju kljune uloge u

oblikovanju struktura elija ili kontroli razvia, imaju veoma mali broj ME.

Najdrastiniji primer su kimenjaki Hox geni (deo 3.2) oko ijih jata praktino nema

ME (izutetak su, izgleda, neke grupe gmizavaca, videti deo 3.2.1). Znaajno je

primetiti da beskimenjaci, sa oko 30 filuma, pokazuju daleko vei diverzitet telesnih

sklopova nego kimenjaci. Mogue je da je i ova razlika izmeu beskimenjaka i

kimenjaka posledica injenice da se u mnogim jatima Hox gena beskimenjaka

mogu nai ME.

Veina insercija ME, ipak, ne izaziva tetne efekte u genomima domaina; u

suprotnom, oni ne bi bili toliko zastupljeni kod eukariota. Tokom evolucije eukariota

nastao je vei broj mehanizama kontrole mutagenih efekata ME. Ovi zatitni

mehanizmi posebno su efikasni u telesnim elijama, a znatno manje tokom stvaranja

gameta i, kod nekih organizama kao to su placentalni sisari, tokom ranih faza

embrionskog razvia. Filogenetske analize su pokazale da je primarna funkcija veine

9

osnovnih mehanizama tzv. epigenetike regulacije genske aktivnosti (DNK metilacija,

modifikacije histona hromatinskih vlakana i RNK interferencija, videti deo 2.4.3.3)

odbrana genoma od mobilnih elemenata. Kod savremenih eukariota, ova odbrana se

odigrava kroz tri faze u kojima uestvuju male RNK (siRNK kod biljaka i kvasaca, i

piRNK, kod insekata i kimenjaka). U ovim fazama male RNK se: 1) proizvode kao

odgovor na prisustvo ME, 2) selektivno amplificiraju na osnovu nizova nukleotida

koje imaju ME, i 3) inkorporiraju u komplekse sa Argonaut ili Pivi proteinima koji

inaktiviraju ME putem post-transkripcione degradacije ili izlau mobilne elemente

DNK metilaciji (citozina u CpG dinukleotidima) i/ili modifikaciji histona

hromatinskih vlakana, to onemoguava transkripciju datog dela genoma. Takoe,

prema jednoj hipotezi (tzv. odbrane domaina) genomsko utiskivanje kod

viviparnih sisara nastalo je kao nusproizvod mehanizama zatite genoma od mobilnih

genetikih elementa.

Poto su ME primarni cilj metilacije citozina u CpG parovima, oni mogu

podvri epigenetikoj kontroli oblinje gene domaina, doprineti inaktivaciji itavih

hromozoma (kao u sluaju X hromozoma sisara) ili, pak, dovesti do genomskog

utiskivanja pojedinih gena. Dakle, ME ne samo da dovode do poveanja genetike

varijabilnosti populacija na osnovu kojih moe doi do stvaranja novih adaptacija, ve

su uslovili i pojavu epigenetike kontrole regulacije aktivnosti gena kod eukariota.

Poto aktivni ME poseduju brojne regulatorne signale koji su, inae, komponente

kontrole ekspresije gena elija domaina, kao to su POL II ili POL III promotori,

pojaavai, mesta za vezivanje transkripcionih faktora, signali za poliadenilaciju, itd.,

oni mogu znaajno promeniti obrasce ekspresije gena u genomima domaina. Na

primer, na osnovu prisustva ME nizova (preteno SINE familije) u promotorima gena

ljudi, procenjuje se da vie od 1000 naih gena ima cis elemente nastale od ME. Osim

uea u regulaciji aktivnosti gena na nivou transkripcije, ME su bili prisutni i u

postanku i evoluciji nekih posttranskripcionih mehanizama regulacije aktivnosti gena.

Ta njihova uloga posebno je vidljiva u sluaju miRNK, kratkih nekodirajuih

molekula RNK, koji reguliu ekspresiju gena tako to degradiraju iRNK ili im

onemoguavaju translaciju, vezujui se za 3 krajeve obraene iRNK (videti deo

2.4.2.2). Procenjuje se, na primer, da oko 12% miRNK kod ljudi potie od ME.

Imajui u vidu da pojedinani miRNK gen moe izvriti represiju brojnih iRNK,

procenjuje se da miRNK izvedene iz ME reguliu aktivnost hiljade gena u genomima

ljudi. Takoe, pokazalo se da SINE RNK mogu da uestvuju u regulaciji transkripcije

10

vezujui se za kompleks RNK polimeraze II. Dodatno, mogu stupiti u interakciju sa

proteinskom kinazom R (PKR; enzim koji fosforilie jedan od eukariotskih

inicijacionih faktora dovodei do prekida translacije) i tako uestvovati u regulaciji

translacije. Vezivanjem jedne SINE RNK kod oveka (pod oznakom BC200, sintetie

se samo u mozgu) za protein koji dovodi do sindroma lomljivog X hromozoma

(FMRP), ona moe da posreduje izmeu FMRP i informacionih RNK koje su mete

ovih proteina. Postoje podaci koji ukazuju da SINE RNK iz mozga mogu dovesti do

supresije translacije i drugih proteina.

Nekontrolisana transpozicija ME u telesnim elijama Metazoa uglavnom je

tetna za jedinke (kao to je pokazano u sluaju pojave kancera posle ugraivanja ME

u blizini onkogena) i ne doprinosi genetikoj varijabilnosti populacije. Tek

ostvarivanje mutagenih efekata ME tokom gametogeneze vieelijskih organizama

moe doprineti evolucionoj plastinosti populacije (tj. njenoj evolvabilnosti).

Pokazalo se da je kod sisara upravo to sluaj. Do globalne demetilacije DNK kod

sisara dolazi tokom ranih stupnjeva razvia polnih elija, kada se resetuju

metilacioni markeri neophodni za genomsko utiskivanje. To otvara mogunost za

transpoziciju retro-ME i, posledino, stvaranje novih mutacija u gametima koje mogu

obogatiti populacije novim varijantama gena. Kod placentalnih sisara postoji jo jedna

faza razvia u kojoj se mutageni efekti ME mogu ispoljiti zbog drastinog smanjenja

metilacije DNK. To je faza preimplantacione embriogeneze, kada, ponovo, dolazi do

velike demetilacije DNK i kada su retro-ME transkripciono vrlo aktivni. Kako su

pokazali eksperimenti na oocitama i preimplantacionim embrionima mieva,

demetilacija u ovoj fazi ima za posledicu izuzetno visoku aktivnost enzima reverzne

transkriptaze. Osim transpozicije samih ME elemenata, poveava se i reverzna

transkripcija RNK onih gena koji su aktivni u germinativnoj liniji i preimplantacionoj

embriogenezi, pri emu nastaju retro-kopije gena ugraene u genome (videti deo

2.2.2). Na primer, za neke LINE mobilne elemente placentalnih sisara (kao to je L1

potfamilija) pokazano je da mogu stvarati reverzne transkriptaze sa endonukleaznom

aktivnou koje prepoznaju bilo koju RNK sa poli(A) repiima (retro-ME sa slinim

karakteristikama naene su kod vonih muica i nekih biljaka). Imajui u vidu da

tokom ovih ranih faza razvia tek otpoinje odvajanje elija koje e uestvovati u

formiranju reproduktivnih organa i buduih gameta (germinativna elijska linija),

navedene promene mogu biti prenete u narednu generaciju i postati deo polimorfizma

populacije. Veoma malo prisustvo retrokopija kod drugih kimenjaka (npr. kod ptica,

11

koje inae imaju vrlo male genome), objanjava se odsustvom retrotranspozona, kao

to je L1 potfamilija.

Daleko najvei broj eukariota vri supresiju, a ne eliminaciju ME. Da bi se

razumeli razlozi za ovakvu evolucionu strategiju, moramo prouiti primer gljive

Neurospora crassa. Ona je u stanju da potpuno zatiti sebe od ME pomou jednog

mehanizma, poznatog pod skraenicom RIP (od engl. repeat-induced point mutation),

koji ne samo da elimine ME, ve i svaku novoformiranu gensku kopiju. Dakle, N.

crassa, titei genom od ME uz pomo RIPa, smanjila je evolucioni potencijal svojih

populacija na dva naina odsustvom eventualno korisnih mutacija do kojih mogu

dovesti ME, i odsustvom dupliranih gena, koji, kako emo kasnije videti,

predstavljaju jedan od osnovnih naina nastanka novih gena. Ovaj primer pokazuje da

bi delovanje prirodne selekcije u smeru evolucije mehanizama za potpunu eliminaciju

ME, najverovatnije, dovodilo do drastinog smanjenja varijabilnosti populacija, to

bi, opet, uzrokovalo odsustvo fenotipskih promena u vrlo dugim intervalima vremena3

i, konano, u nestabilnim ivotnim sredinama do izumiranja taksona sa takvim

mehanizmima zatite. Dakle, stavljanje pod kontrolu mobilnih elemenata putem

razliitih mehanizama supresije njihovog irenja, umesto njihove potpune eliminacije

iz genoma, predstavljalo bi adaptivnu evolucionu strategiju na due staze.

Za veinu evolucionih biologa, relativno stabilne ivotne sredine u veoma

dugim vremenskim periodima predstavlju razlog za pojavu vrsta koje je Darvin

nazivao ivim fosilima - savremene vrste koje se morfoloki uopte ne razlikuju, ili

se razlikuju veoma malo, od svojih predaka koji su iveli milionima godina ranije.

Analize SINE nizova kod dve vrste ivih fosila, ribe Latimeria (L. menadoensis i L.

chalumnae), pokazale su veoma malu promenu tokom 400 miliona godina, tj. od

vremena kada su otkriveni najstariji fosili ovih ivotinja. Slina situacija je i kod

tuatara (Sphenodon punctata i S. guntheri) sa Novog Zelanda, koje su ostale relativno

nepromenjene tokom 220 miliona godina. U genomima savremenih tuatara postoji

svega 0,11% SINE nizova i 2,59% LINE nizova (setimo se da u ljudskom genomu

postoji oko 13% SINE i oko 21% LINE nizova). Dakle, izgleda da se evolucione

staze mogu povezati sa malom aktivnou mobilnih elemenata.

3 Fenomen odsustva znaajnijih evolucionih promena nekog taksona tokom dugog perioda vremena oznaava se kao evoluciona staza.

12

2.2.1. Domestikacija mobilnih genetikih elemenata

Osim to preko svojih regulatornih signala uestvuju u regulaciji aktivnosti

gena, ME se mogu ugraivati u kodirajue delove gena i na taj nain doprinositi

pojavi novih gena domaina. Ovaj proces esto se oznaava kao molekularna

domestikacija. Kod ljudi, kako je procenjeno, u oko 4% gena koji kodiraju proteine,

nalaze se neki od mobilnih elemenata. Ovaj podatak, meutim, ne znai da se u

funkcionalnim proteinima, koje kodiraju ti geni, nalaze fragmenti (kasete) poreklom

od mobilnih elemenata (eukariotske elije poseduju vie mehanizama kontrole

kvaliteta proteina od degradacije promenjenih iRNK do degradacije polipeptida

posle translacije). Savremene procene ukazuju da svega 0,1 % funkcionalnih proteina

oveka ima fragmente poreklom od mobilnih elemenata. Jedan od njih je PTPN1 (ili

PTP1B) protein koji pripada velikoj familiji proteinskih tirozinskih fosfataza

(katalizuju defosforilizaciju proteina). U ovom proteinu nalazi se fragment koji je

poreklom od evoluciono vrlo starog LINE elementa (L3).

Smatra se da su ME imali vrlo vanu ulogu i u organizaciji eukariotskih

hromozoma. Na primer, telomere, koje su kod veine vrsta sastavljene od tandemskih

ponovaka, dodaju se na krajeve hromozoma uz pomo enzima telomeraze - jedne

reverzne transkriptaze koja, koristei RNK matricu, deluje na nain koji podsea na

integraciju retrotransponzona bez LTR u genome domaina. Zanimljivo je da razliite

vrste vonih muica nemaju telomerazu pa njenu funkciju preuzimaju dva specifina

retrotranspozona koji se smetaju na krajeve hromozoma. S obzirom na ulogu

telomera u procesu elijske deobe, izgleda da su mobilni elementi imali veliki znaaj

za evoluciju specifinih mehanizama kontrole deobe elija.

Razliite analize su pokazale da je domestikacija kodirajuih delova ME bila

kljuna u evoluciji placente kod obe grupe viviparnih sisara (Theria), koja ukljuuje

Eutheria (placentalne sisare) i Methateria (torbare). Theria su se odvojili od

evolucione linije koja je vodila prema savremenim monotrematama (grupi sisara koja

polae jaja), pre oko 210 miliona godina. Kod torbara, placenta je strukturno vrlo

jednostavan organ kratkog trajanja, ija pojava zavisi od aktivnosti gena Peg10, koji

je izveden od gag gena jednog retrotransposona (kod retrovirusa ovaj gen kodira

proteine viriona). Kako se pokazalo, kod obe grupe viviparnih sisara ispoljavaju se

samo aleli oeva usled genomskog utiskivanja Peg10 gena. Evolucija znatno sloenije

placente, koja se javlja samo kod euterija, zavisi od aktivnosti jo jednog gena, Peg11

(oznaava se i kao Rtl1), koji je takoe izveden iz gag gena jedne druge familije

13

retrotranspozona. I kod ovog gena, za kog se smatra da uslovljava odravanje

embrionskih kapilara tokom kasnijih stupnjeva embrionskog razvia, postoji

genomsko utiskivanje sa ispoljavanjem samo oevih alela4.

Pored ovih gena, euterija imaju jo dva znaajna gena za formiranje placente i

oba su, takoe, izvedena od retroelemenata. Kod primata oni se oznaavaju kao

sincicin-1 i sincicin-2, a kod glodara kao sincicin A i B. Ovi geni su nezavisno nastali

od env gena endogenih retrovirusa (ERV)5. Retrovirusni donor sincicijskih gena

euterija kontrolie sintezu glukoproteina pomou koga retrovirus ostvaruje tri

funkcije: 1) prepoznaje receptore elija koje inficira, 2) ostvaruje fuziju virusnog

omotaa sa membranom elije domaina, 3) preko jedne transmembranske oblasti

ovog glukoproteina stie imunosupresorske sposobnosti. Sve te tri funkcije

(prepoznavanje elija, fuzija elija i imunosupresija) zadravaju i sincicijski proteini

placente euterija. Placentalni sincicijum, nastao fuzijom elija, ograniava razmenu

migratornih elija izmeu embriona i tela majke, a preko imunosupresivnih svojstava

ovog proteina obezbeuje se zatita embriona od imunskog sistema majke. Dakle,

evolucija sloene placente kod Eutheria zavisila je od domestikacije gag i env gena

retrotranspozona, a poto u ovu grupu spada oko 94% svih danas ivih sisara, mogli

bismo rei da su ME klju za adaptivnu radijaciju sisara.

V(D)J rekombinacija u imunskom sistemu kimenjaka sa vilicom, verovatno

predstavlja najbolji primer uloge koju su ME imali u procesima adaptivne evolucije.

Tokom V(D)J rekombinacija u B i T elijama imunskog sistema, tri grupe

razdvojenih genskih segmenata (egzona) V (varijabilni), D (diversifikujui) i J

(vezujui) se spajaju gradei gene koji sintetiu ogroman broj povrinskih receptora

T elija i imunoglobulina neohodnih za prepoznavanje razliitih patogena. Ove

rekombinacije zavise od prisustva tzv. rekombinacionih signalnih nizovi (RSS, engl.

recombination signal sequences), koji opkoljavaju svaki genski segment, i dva

proteina kodirana genima RAG1 i RAG2 (Slika 2.3). RSS se sastoje od kratkih

4U genomima sisara je otkriveno ak 85 gena koji su izvedeni iz gag gena razliitih familija retrotransopozona. 5 Smatra se da su ERV varijante nekada bili autonomni egzovirusi, koji su se, infekcijom germinativnih elija, permanentno integrisani u genome elija domaina. Tokom trudnoe kod nekih viviparnih sisara (npr. glodara), ERV se aktiviraju i proizvode u velikom broju. Humani endogeni retrovirusi (HERV) ine oko 8% genoma savremenih ljudi. Smatra se da je u naoj evolucionoj liniji, posle razdvajanja od zajednikog pretka sa impanzama, bila aktivna samo jedna familija, HERV-K (HML2) - na koju otpada oko 1% HERVa, dok su sve ostale familije inaktivirane.

14

invertovanih ponovaka dugih 12 ili 23 nukleotida (oni su analogni terminalnim

invertovanim ponovcima DNK transpozona (slika 2.3a). RAG geni (engl.,

recombination activating genes), koji su odgovorni za formiranje jedinstvenog gena

(po principu iseci i zalepi; engl. cut-and-paste) nemaju introne i predstavljaju

imobilizirane autonomne verzije Transcib familije DNK transpozona (u osnovi, ovi

proteini su enzimi transpozaze). Mesto gde e se odigrati rekombinacija odreuje se

vezivanjem RAG1 za RSS. Kompleksi koje formiraju RAG1 i RAG2, vezuju se za

razliite kombinacije RSS nizova u svakoj od prekursorskih B i T elija i isecaju

unutranji region, to se moe smatrati analognim sa izbacivanjem neautonomnih

transpozona (Slika 2.3b). Posle isecanja uz pomo RAG proteina, stvoren je

imunoglobulinski gen sa kodirajuim regionima koji predstavljaju razliite

kombinacije elemenata (egzona) koji su postojali pre procesa V(D)J rekombinacije

(Slika 2.3c).

Slika 2.3. Postanak V(D)J rekombinacije uz pomo mobilnih genetikih elemenata (prema: Slotkin i Martienssen 2007).

Nove funkcije gena mogu nastati i putem fuzije gena, tj. spajanjem dva

prethodno odvojena gena u jednu transkripcionu jedinicu (videti deo 2.3.4). Fuzija

retrokopija nekih gena u postojee gene domaina moe dovesti do pojave vrlo

znaajnih funkcija. Jedan od najzanimljivijih takvih primera odnosi se na ubacivanje

retrokopije CypA gena (kodira protein koji se moe vezivati za kapside retrovirusa) u

TRIM5 gen, koji je deo odbramenih mehanizama nekih eukariota od virusa.

Zanimljivo je da je do ove fuzije dolo nezavisno kod majmuna tzv. novog i starog

sveta. U oba sluaja, retrokopija CypA zamenila je originalne egzone TRIM5 gena koji

su kontrolisali domene proteina odgovorne za vezivanje za kapside virusa. Protein

15

nastao posle TRIM5-CypA fuzije daleko je efikasnije eliminisao HIV-1 i druge

retroviruse u poreenju sa proteinom koji je stvarao samo TRIM5 gen. Ovaj primer

konvergentne evolucije, najverovatnije je rezultat izuzetno visoke stope

retrotranspozicije CypA gena tokom gametogeneze majmuna. Fiksacija TRIM5-CypA

fuzije u populacijama ovih majmuna posledica je, opet, daleko vee otpornosti prema

retrovirusima kod jedinki koje imaju ovu fuziju.

2.2.2. Mobilni genetiki elementi i retrogeni

Osnovni mehanizam nastanka novih kopija gena jeste nejednak krosing-over

izmeu homolognih hromozoma (videti deo 2.3.2). Meutim, nove kopije gena mogu

nastati i reverznom transkripcijom iRNK postojeih gena. Kao to smo ranije istakli,

retrotranspozicija znaajna za evoluciju mora se odigrati u germinativnoj liniji, tj. u

procesima stvaranja gameta. Pored enzima koji obezbeuju reverznu transkripciju, u

ovom procesu moraju biti aktivni i geni sa ijih se iRNK vri formiranje cDNK

kopija. Smatra se, kako smo ve rekli, da, kod svih viviparnih sisara i oveka, L1

element iz LINE familije obezbeuje enzime neophodne za retrotranspoziciju. Kljuni

enzim je reverzna transkriptaza sa endonukleaznom aktivnou, koja je u stanju da

prepozna svaku iRNK sa 3poli(A) repiem. Poto se reverzna transkripcija obavlja na

obraenim iRNK (iz kojih su uklonjeni introni), u tako nastalim kopijama gena, tj.

retrokopijama, nee biti prisutni introni, iako ih originalni gen ima. Dugo se smatralo

da su sve kopije gena nastale na ovaj nain nefunkcionalne (tj. da predstavljaju

retropseudogene), i to kako zbog velikog broja mutacija koje se pojavljuju tokom

aktivnosti enzima reverzne transkriptaze, tako i zbog odsustva cis-regulatora u

obraenim iRNK. Meutim, poslednjih godina, kod razliitih vrsta sisara (i drozofile),

otkriven je veliki broj funkcionalnih retrogena, koji su pozajmili cis-regulatore od

susednih gena. Kod sisara, retrogeni se esto mogu nai u intronima drugih gena, a

transkribuju se samo sa egzonima najbliim 5 kraju tih gena, kao jedna od iskrojenih

varijanti iRNK.

Retrogen kod paradajza (Solanum lycopersicum) koji je uslovio pojavu novog

oblika ploda (vretenastog od predakog okruglog), nastao je uz pomo specifinog

retrotranspozona u dva koraka. U prvom koraku, retrotranspozon slian copia

elementima, grekom je prepisao fragment genoma domaina duine oko 25 kb, u

kome se nalazila i kodirajua oblast IQD12 gena; ovaj gen inae uestvuje u

oblikovanju ploda kod paradajza. U drugom koraku, retrotranspozon je ovaj gen, bez

16

regulatornih elemenata, ugradio u drugi hromozom stvarajui novu kopiju (SUN).

Ovako stvorena kopija sintetisala je potpuno identian protein, jer je bila ugraena uz

5 regulatorne elemente drugog gena. Nova pozicija i novi cis-regulatorni elementi

uslovili su, meutim, da se SUN gen sintetie u znatno veoj koliini tokom ranih faza

razvia ploda, a to je rezultovalo vretenastim umesto okruglim oblikom.

Za razliku od konvencionalne duplikacije gena, prilikom retrotranspozicije

kopije gena se obino ubacuju na neki drugi hromozom u odnosu na roditeljski gen.

Od svih hromozoma u kariotipovima sisara, na X hromozomu se nalazi najvei broj

retrogena poreklom od autozomnih gena. Genomsko utiskivanje kroz koje prolaze

kopije ili originali, smatra se nainom za smanjenje potencijalne tete do koje

mogu dovesti poveane koliine proteina dupliranih gena.

Poto retrogeni obino nemaju introne, to je jedan od naina za uklanjanje

introna iz gena. Uporedne analize genoma razliitih vrsta eukariota pokazale su da

tokom evolucije ee dolazi do gubitaka nego dobitaka introna. Kod sisara, na

primer, nije zabeleen nijedan sluaj gena u koga su ugraeni novi introni, dok je kod

vie od 100 gena zabeleen gubitak introna, verovatno kao rezultat reverzne

transkripcije. Potrebno je takoe istai da ak i retropseudogeni, koji se daleko ee

javljaju nego retrogeni, ne moraju predstavljati nefunkcionalne delove genoma.

Postoje podaci da neki retropseudogeni kod sisara esto stvaraju siRNK, koje reguliu

aktivnost gena od kojih potiu.

Pokazalo se da retrogeni imaju vane funkcije u mukoj germinativnoj liniji,

ali i da su neki od njih vrlo znaajni u zatiti od virusnih infekcija, metabolizmu

hormona i feromona, kao i funkcionisanju mozga. Procenjuje se da je prosena stopa

nastanka retrogena kod primata 1 retrogen na milion godina, a da u ljudskom genomu

najmanje 120 retrokopija predstavljaju funkcionalne gene. Najpoznatiji primer

retrogena kod oveka kontrolie sintezu enzima glutamat dehidrogenza 2 (GLUD2),

koji u mozgu degradira neurotransmiter glutamat (enzim je aktivan iskljuivo u

mitohondrijama). Ovaj gen se nalazi na 10. hromozomu (region 10q23), a nastao je

pre oko 18 do 25 miliona godina reverznom transkripcijom od obraene iRNK gena

GLUD1 gena sa X hromozoma (Xq24, aktivnost je vezana kako za mitohondrije tako

i citoplazmu). GLUD2 retrogen je u naoj evolucionoj liniji stekao dve znaajne

mutacije koje su poveale njegovu enzimsku aktivnost, to je, izgleda, imalo za

posledicu i veu aktivnost neurona.

17

Fosfogliceratna kinaza (PGK) je metaboliki enzim koji konvertuje glukozu u

piruvat. Kod sisara postoje dva funkcionalna gena koji kontroliu sintezu PGK: PGK-

1 se nalazi na X hromozomu i ispoljava se u svim telesnim elijama, PGK-2 je

autozomni gen i ispoljava se samo u testisima tokom poslednjih stupnjeva

spermatogeneze. Kod ljudi, PGK-1 se sastoji od 11 egzona i 10 introna. Autozomni

homolog (PKG-2) tog gena je neobian po tome to nema introne i na 3 kraju ima

ostatke poli(A) repia, to sve ukazuje da je nastao procesom reverzne transkripcije.

Zadravanje iste funkcije i ispoljavanje retrogena PGK-2 u specifinom tkivu

objanjava se kao kompenzatorni odgovor na inaktivaciju PGK-1 gena na X

hromozomima u spermatogenim elijama pre mejoze. Prisustvo autozomnog PGK-2

omoguuje zrelim spermatozoidima da koriste fruktozu iz semene tenosti. Dakle,

ekspresija ovog retrogena u specifinim tkivima je, oigledno, razlog njegovog

opstanka sa nepromenjenom funkcijom.

Slino PGK-2, postoji jo primera autozomnih retrogena kod sisara (i kod

vonih muica) koji predstavljaju retrokopije roditeljskih gena na X-hromozomu, a

ispoljavaju se iskljuivo u testisima mujaka. Smatra se da je najverovatniji razlog za

ovu pojavu inaktivacija polnih hromozoma tokom i posle mejotikog stupnja

spermatogeneze (MSCI, od engl. meiotic sex chromosome inactivation). Prema ovoj

hipotezi, ekspresija autozomnih retrogena, koji potiu sa X hromozoma, je tokom

evolucije usmeravana prema germinativnoj liniji mujaka, jer na taj nain dolazi do

nadometanja proizvoda roditeljskih gena koje je inaktivirao MSCI. Zanimljivo je da

su skoranja prouavanja mladih retrogena primata pokazala da prirodna selekcija i

dalje favorizuje izvoz gena sa X hromozoma. Takoe, analize predstavnika tri

glavne grupe sisara ukazuju da je do selektivnog usmeravanja retrogena sa X

hromozoma na autozome dolo tek posle razdvajanja viviparnih sisara od

monotremata (pre oko 210 miliona godina). Ovaj podatak je znaajan i zbog toga to

upuuje na mogunost da su nai polni hromozomi nastali od autozoma znatno kasnije

nego to smo to do skoro mislili (prema prethodnim procenama, proces nastanka X i

Y hromozoma poklapa se sa vremenom nastanka sisara, tj. pre 310 do 240 miliona

godina). Naime, poto MSCI pojaava rekombinacionu barijeru izmeu X i Y

hromozoma tokom evolucije, neki autori su zakljuili da su se polni hromozomi

pojavili tek kod zajednikih predaka marsupialnih i euternih sisara. Ovu hipotezu

podrava i skoranja analiza genoma kljunara, koja je otkrila da su polni hromozomi

18

monotremata homologni sa onim kod ptica, a ne sa X i Y hromozomima torbara i

placentalnih sisara.

2.2.3. Mobilni genetiki elementi i specijacija

Barbara McClintock, dobitnica Nobelove nagrade za otkrie mobilnih

genetikih elemenata, sugerisala je, jo 1984. godine, da ME mogu igrati znaajnu

ulogu u procesima nastanka novih vrsta. Ova ideja nije naila na iru podrku

evolucionih biologa, pre svega zbog odsustva empirijskih podataka o prisustvu ME

kod veeg broja taksona. Poto danas raspolaemo mnotvom informacija o ME kod

veeg broja prokariotskih i eukariotskih organizama, vie se ne moe zanemarivati

njihova uloga u specijaciji. Uporedne analize su, na primer, pokazale da evolucione

linije kimenjaka sa velikim brojem vrsta, poseduju i mobilne elemente sa viom

aktivnou. Ovi podaci ukazuju da bi poveana plastinost genoma, zbog vie

aktivnosti ME, mogla biti jedan od inilaca intenzivnije specijacije (adaptivne

radijacije) takvih grupa. Aktivno ili pasivno, mutagene aktivnosti mobilnih

elemenata obogaivale su populacije neophodnom genetikom varijabilnou.

Sisarski red Chiroptera (ljiljci), posebno podred Michrochiroptera, ija je

specijacija poela pre 55 do 44 miliona godina, dobar je primer adaptivne radijacije

koja je mogla biti povezana sa aktivnou ME. Ljiljci danas ine vie od 22% svih

sisarskih vrsta, a najvie vrsta ima rod Myotis sa ak 103 vrste. Analize genoma

predstavnika ovog roda otkrile su izuzetno bogatstvo i visoku aktivnost ME, i to kako

retro-ME tako i DNK-ME. Posebno je interesantna aktivnost DNK-ME, jer se do

ovog otkria smatralo da su oni kod sisara inaktivirani poslednjih 37 miliona godina

(veruje se da ova klasa ME ima posebno znaajnu ulogu u duplikaciji gena i

kombinovanju egzona u genomima domaina). Slini nalazi postoje i kod drugog

velikog reda sisara - glodara (Rodentia), koji je danas zastupljen sa oko 1814 vrsta.

Kod glodara su vrlo prisutni i aktivni razliiti tipovi retro-ME ukljuujui i endogene

retroviruse (ERV), koji su, recimo, kod oveka potpuno neaktivni.

Brojni mobilni genetiki elementi bili su aktivni i tokom evolucije Primata. Na

osnovu procene starosti razliitih tipova ME u genomima savremenih primata, moglo

se zakljuiti da su tokom evolucione istorije ove grupe postojali periodi vrlo

intenzivnog stvaranja ME i da su se ovi periodi poklapali sa pojavom veeg broja

novih vrsta. Na primer, DNK transpozoni bili su veoma aktivni u vreme nastanka

primata u periodu od pre 80 do 65 miliona godina. Procenjuje se da izmeu 74000 i

19

98300 DNK transpozona primata, koji su fiksirani i u genomu oveka, potie iz tog

perioda. Aktivnost DNK transpozona prestaje pre oko 40 miliona godina, ali ne i

drugih familija ME, posebno tzv. Alu familije SINE elemenata, koja je specifina za

primate6. Smatra se da su se prvi Alu nizovi (tzv. AluJ elementi) pojavili pre oko 65

miliona godina, u periodu razdvajanja polumajmuna (Prosimii) i majmuna. Posle tog

razdvajanja, pre oko 45 miliona godina, dolo je do ekspanzije AluS elemenata, to

koincidira sa pojavom tzv. majmuna novog sveta (Ceboidea ili Plathyrrhini). Pre oko

30 miliona godina, pojavljuju se AluY elementi, to se poklapa s vremenom

razdvajanja tzv. majmuna starog sveta (Cercopethecoidea ili Catarrhini) i

Hominoidea.

Moda najbolji primer uloge koju ME mogu imati u procesima nastanka novih

vrsta, odnosi se ribe iz familije Cichlidae iz velikih jezera u Africi. Cihlide su jedna

od najveih familija kimenjaka, sa oko 3000 vrsta. Interesantno je da su prvi

predstavnici ove familije nastali pre 121 do 165 miliona godina, ali je pre samo pet

miliona godina, u jezerima Taganjika, Malavi i Viktorija, nastalo izmeu 1000 i 2000

novih vrsta. Oko 2000 vrsta koje danas naseljavaju ta jezera, pokazuje veliki

diverzitet u morfologiji, nainu ishrane i ponaanju, ali vrlo mali genetiki diverzitet.

Recimo, u analizi vie od 32000 takastih polimorfizama (SNP, single nucleotide

polimorphism) kod pet vrsta iz jezera Malavi, nije naena nijedna fiksirana razlika

izmeu vrsta. Pokazalo se, meutim, da je sklonost ka diverzifikaciji bila najizraenija

kod linije cihlida koja je evoluirala u jezeru Tanganjika, a zatim kolonizirala jezera

Malavi i Viktorija. Analiza 75 SINE elemenata kod ovih riba ukazala je na viestruke

cikluse insercija specifinih SINE elemenata za kojima su sledile pojave veeg broja

vrsta. Dodatno, geoloki podaci pokazuju da je taj deo Afrike, poslednjih 2,5 do 3

miliona godina, prolazio kroz drastine periode sue i, u poslednjih 1,1 milion godina,

kroz ekstremne fluktuacije nivoa vode od nekoliko stotina metara.

Podaci o drastinim promenama ivotne sredine, pri kojima je dolo do

pojaavanja aktivnosti ME kod cihlida, potvruju da stresni uslovi mogu predstavljati

okida za poveanu aktivnost ME. Ovo, kako smo u vie navrata isticali, moe

dovesti do poveanja genetike varijabilnosti populacija i, naravno, poveati

6U genomu oveka najzastupljeniji i jedini aktivan tip SINE niza je Alu familija koja ini oko 10% genoma (ime potie otuda to ovi nizovi sadre i mesta za restrikcioni enzim pod nazivom AluI). lanovi ove familije, Alu elementi, su nizovi duine oko 300 bp zastupljeni sa oko milion kopija u genomima ljudi.

20

verovatnou pojave novih vrsta. Odgovor ME na stres odigrava se na dva naina: 1)

stres direktno aktivira ME i njihovu mutagenost, ili 2) stres inhibira mehanizme

zatite genoma od ME. Da stres stvarno moe poveati aktivnost ME pokazali su

brojni eksperimenti kod niza taksona, kao to su gljive, biljke, insekti, rakovi i sisari.

Razliiti stresori (npr. temperaturni ekstremi, oksidativni stres, ili virusne infekcije),

dovodili su do aktivacije razliitih ME posebno SINE elemenata. Takvim stresorima

moe biti izloena svaka vrsta koja migrira u neko novo stanite, ili u ijem se stanitu

odigraju velike klimatske ili geoloke promene.

2.3. Duplikacije genoma i gena

Poveanje broja gena u genomima tokom evolucije odvijalo se na vie naina -

od duplikacije jednog ili manjih grupa gena, koja esto nastaje tokom replikacije i

rekombinacije DNK, do duplikacija itavih genoma (poliploidije). Za evolucione

genetiare, jedan od najznaajnih rezultata sekvenciranja genoma velikog broja vrsta

jeste mogunost identifikacije dupliranih gena i analize karakteristika gena koje

omoguavaju njihovim kopijama da budu fiksirane ili eliminisane iz populacija. Na

primer, funkcionalne klase dupliranih gena, koje su zadrane u genomima savremenih

organizama nakon poliploidije, pokazivale su neobino veliku slinost izmeu vrlo

razliitih taksona. U genomima kvasca Sacharomyces cerevisiae, biljke Arabidopsis

thaliana i Paramecium sp., posle poliploidije koja se odigrala kod njihovih drevnih

predaka (paleopoliploidija), najuestalije zadrane kopije gena su one koje kodiraju za

sintezu ribozomskih proteina, proteinskih kinaza i razliitih transkripcionih faktora.

Kod A. thaliana i kvasca uoene su razliite evolucione tendencije razliitih

funkcionalnih klasa gena u nekim klasama postoji tendencija da se zadre kopije

nastale duplikacijama pojedinanih gena, ali ne i kopije nastale poliploidijom, dok

druge funkcionalne klase imaju obrnutu tendenciju. Takoe, proteini dupliranih gena

posle poliploidije izgleda da stupaju u vie interakcija sa drugim proteinima nego

proteini gena nastalih duplikacijama pojedinanih gena. Postoje i podaci koji ukazuju

da je nivo ekspresije dupliranih gena posle poliploidije znatno vii nego kod gena

nastalih pojedinanim duplikacijama.

Veliki broj savremenih evolucionih biologa smatra da poliploidija ima veoma

znaajnu ulogu u specijaciji i nastanku evolucionih novina (videti deo 3.5). U

poreenju sa duplikacijama pojedinanih gena, pokazalo se da se vei broj kopija

21

gena nastalih poliploidijom ne transformie u pseudogene. Ovaj podatak u velikoj

meri podrava hipotezu po kojoj su potpune duplikacije genoma imale vrlo znaajnu

ulogu u evoluciji eukariota. Naravno, namee se i pitanje: zato bi se razlikovale

sudbine pojedinano dupliranih gena i kopija gena nastalih duplikacijama itavog

genoma?

Naime, u sluaju pojedinano dupliranih gena, proizvodi oba duplikona

interaguju sa istim (nedupliranim) genskim partnerima; to moe umanjiti ansu

sticanja novih funkcija i poveati verovatnou transformacije, jednog od njih, u

pseudogen. S druge strane, prilikom duplikacije itavih genoma, odigrava se

simultana duplikacija svih gena koji meusobno interaguju, ime se znaajno

poveava verovatnoa da itavo duplirano partnerstvo proe kroz zajednike

evolucione promene (koevoluira) i da, eventualno, neki od njih steknu nove funkcije.

Dakle, na ovaj nain bi se stekli uslovi za nastanak i evoluciju potpuno novih osobina.

Ovakvi evolucioni dogaaji mogu se ilustrovati na primeru hormona i njihovih

receptora, gde se funkcionalnost proteina koji ine taj sistem stie njihovim

meusobnim vezivanjem. Ako bi se duplirali samo geni koji kontroliu sintezu

hormona, dolo bi do kompeticije proizvoda tih gena za isti receptor. Verovatnoa

sticanja nove funkcije (pa, prema tome, i ansa da neki od njih nee postati

pseudogen) poveava se ako su duplirani i geni za hormonski receptor. Navedeni

primer pokazuje da poliploidija moe biti mehanizam evolucione diverzifikacije.

Meutim, treba imati u vidu da mnogi drugi inioci, kao to je, na primer, prisustvo

diferenciranih polnih hromozoma, odreuju da li do poliploidije uopte moe doi.

2.3.1. Poliploidija

Do potpune duplikacije genoma moe doi putem autopoliploidije, kada se

dupliraju skoro identini genomi, ili putem alopoliploidije, kada se genomi razliitih

vrsta nau u istim elijama. Ako ne bi bilo tetnih efekata koji esto prate

polipoloidiju, to bi mogao biti najplodotvorniji nain poveanja genoma tokom

evolucije, budui da se na taj nain odmah udvostruuje veliina genoma. Na primer,

ako bi poliploidija bila jedini nain poveanja genoma, tada bi bilo potrebno svega 10

ciklusa duplikacija da se od organizama slinih savremenim bakterijama postigne

1000 puta vea koliina DNK u elijama sisara (210 1.000). Poreenjem veliina genoma savremenih organizama, od bakterija do sisara, i uzimajui u obzir da se

22

bakterijska elijska organizacija pojavila pre oko 3 109 godina, procenjeno je da su se poliploidije mogle pojavljivati, u proseku, svakih 300 miliona godina. Naravno,

ova procena bi mogla biti validna kada potpune duplikacije genoma ne bi esto

dovodile do velikih smanjenja adaptivne vrednosti organizama. Otuda je pravo pitanje

koliko je poliploidija stvarno doprinela poveanju genoma tokom evolucije? Delimian odgovor na ovo pitanje dale su analize kariotipskih promena tokom

procesa specijacije. Kod nekih biljnih taksona, poliploidija se esto odigravala, dok je

kod ivotinja ovaj nain poveanja genoma relativno redak dogaaj. Na osnovu

injenice da je veina biljnih familija gena vrlo stara i visoko konzervisana, zakljuuje

se da je veina genoma suvozemnih biljaka izgraena na ostacima vrlo starih

udvostruenja genoma (Soltis i sar., 2009). U analizama fosilnih angiospermi,

korienjem podatka da je veliina elije u korelaciji sa brojem hromozomskih

garnitura, dobijena je procena da je predaki haploidni broj hromozoma bio 7 ili 9, i

da bar 70% cvetnica ima poliploidnu specijaciju u svojoj evolucionoj prolosti. Kod

mahovina i paprati ovi procenti se kreu i do 95%. Kod novijih specijacija, procenjuje

se da je izmeu 2% i 4% novih vrsta cvetnica nastalo poliploidijom (uglavnom

alopoliploidijom)7.

Na osnovu analize paranoma, tj. kolekcije dupliranih gena, u oko 7000

multigenskih familija kod biljke Arabidopsis thaliana (danas spada u diploidne vrste)

izveden je zakljuak da je kod njenih predaka dolo do potpune duplikacije genoma u

tri navrata (ovi dogaaji se oznaavaju kao 1R, 2R i 3R; R potie od engl. round)

tokom poslednjih 250 miliona godina. Takoe, nainjen je evolucioni model pomou

kog je simulirana populaciona dinamika dupliranih gena u razliitim funkcionalnim

klasama. Model se zasniva na raspodeli sinonimnih zamena po mestu u genomu

(Maere i sar., 2005)8. Ova analaza je pokazala da su se posle tri poliploidna dogaaja

7 Alopoliploidna specijacija je ea od autopoliploidne. Naime, kod hibrida dve vrste, tj. jedinki u kojima su prisutni genomi dve vrste, empirijski podaci su pokazali da je verovatnoa nerazdvajanja hromozoma u gametogenezi 50 puta vea nego kod pripadnika svake od vrsta. Autopoliploidija nastaje kada tokom gametogeneze kod jedinki jedne vrste ne doe do razdvajanja hromozoma usled ega se formiraju diploidni gameti, a spajanjem takvih gameta dobija se tetraploidno potomstvo. 8 Poto sinonimne zamene nukleotida ne dovode do aminokiselinskih zamena u proteinima, oekuje se da njihove stope budu relativno konstantne kod razliitih proteina i da zavise samo od stopa mutacija. U tom sluaju moe se primeniti molekulski sat i proceniti vreme (T) potrebno za divergenciju dva nukleotna niza u kojima su se javljale sinonimne mutacije (KS), T = KS/2, gde je prosena stopa sinonimnih zamena (Maere sar., 2005 su uzimali dve vrednosti: 1,5 10-8 zamena po mestu po godini, i 6,1 10-9 zamena po mestu po godini). Na osnovu KS paranoma arabidopsisa, procene starosti vremena kada su se odigrale tri poliploidije u evoluciji angiospermi bile su sledee: 1R = 101-168 miliona godina, 2R = 66-109 mil. god., 3R = 24-40 mil. god.

23

kod predaka, u genomu arabidopsisa preferencijalno zadravali geni odgovorni za

transkripcione faktore, transdukciju signala i razvie; preko 90% tih gena stvoreno je

tokom 250000 godina, posebno u periodima koji su sledili dve najstarije polipolidije

(1R i 2R).

Analiza paranoma kod aradopsisa je takoe pokazala da se geni ukljueni u

sekundarni metabolizam ili odgovore angiospermi na napade patogena ili herbivora

(biotiki stresori) zadravaju u genomima bez obzira na to kako su nastali

poliploidijom ili duplikacijama pojedinanih gena. Zanimljivo je, meutim, da su se

geni ukljueni u odbranu biljaka od abiotikih stresora, kao to su sua, niske

temperature ili slanost zemljita, preteno zadravali posle poliploidija. Ovi podaci se

mogu povezati sa velikim fizikim promenama abiotike sredine u vreme velikih

duplikacija genoma - procenjeno vreme za 1R i 2R poklapa se sa velikim tektonskim

poremeajima i porastom CO2 u atmosferi (npr. u periodu pre 120 i 80 miliona godina

dolo je do raspada superkontinenta Pangee).

Studije na genomima drugih angiospermi, koje su uraene nakon analize

paranoma A. thaliana, nisu potvrdile sve gore navedene nalaze. Pored A. thaliana,

poznati su kompletni genomi sledeih cvetnica (Soltis i sar., 2009): Oryza sativa

(pirina), Populus trichocarpa (kalifornijska topola), Vitis vingifera (vinova loza),

Carica papaya (papaja). Analize genoma ovih vrsta ukazale su da je tokom evolucije

angiospermi stvarno dolazilo do poliploidija, ali je njihov broj varirao od vrste do

vrste tako da se ne moe sa sigurnou rei koliko je tano bilo paleopoliploidija kod

biljaka cvetnica. Kod drugih biljaka sa semenom, izuzev Gnatales, postoji veoma

malo podataka o drevnim poliploidijama.

Duplikacije nekoliko gena sa MADS blokovima (to su razliite klase

transkripcionih faktora), koji imaju znaajnu ulogu u razviu cveta, takoe ukazuju na

polipolidiju tokom rane evolucione istorije angiospermi9. Na primer, gimnosperme

imaju aktivnu samo jednu B-funkciju, dok angiosperme imaju dve, koje su se, 9 Obrazac ekspresije gena sa MADS blokovima poznat je pod nazivom ABC model determinacije organa cveta. Prema ovom modelu, odgovarajua diferencijacija etiri cvetna organa (krunice, aice, pranika i karpela) tipinog biseksualnog (hermafroditnog) cveta, predstavlja rezultat delovanja tri transkripciona faktora (A, B, i C), ije se aktivnosti delimino preklapaju, a koje su zasnovane na razliitim brojevima MADS gena. Aktivnost iskljuivo faktora A, odreuje aine listie; A plus B faktori daju krunine listie; A plus C faktori odreuju pranike, a aktivnost samo C faktora dae karpele. Zanimljivo je, takoe, da naruavanje normalne funkcije ABC proizvoda dovodi do pojave cvetova, koji zadravaju svoj osnovni oblik, ali imaju niz karakteristika lista biljnog organa ijom su transformacijom tokom evolucije i nastali. Dodatna zanimljost je da je poznati nemaki pesnik Gete prvi govorio o cvetu kao metaformoziranom listu.

24

najverovatnije, pojavile pre njihovog nastanka (starost tih duplikacija se procenjuje na

oko 260 miliona godina). Slino je i sa C-funkcijom. Kod angiospermi, za razliku od

gimnospermi, postoje dve grupe tih gena, jedna koja ima ulogu u razviu pranika i

karpele i druga sa kljunom ulogom u formiranju ovula. Poto su duplikacije nekih od

gena sa MADS blokovima vrlo stare, dok su druge znatno mlae, ti podaci, opet,

ukazuju da je tokom evolucije angiospermi bilo nekoliko poliploidija.

Najubedljiviji pokazatelji potpunih duplikacija genoma tokom filogenije

kimenjaka odnose se na skupove (jata) tzv. Hox gena (deo 3.2.2). Amphioxus

(Cephalochordata) ima jedan skup Hox gena, kolouste imaju dva do tri, a kimenjaci

sa vilicom, od riba do oveka, imaju najmanje etiri odvojene grupe Hox gena, koji se

nalaze na razliitim hromozomima. Na osnovu uporedne analize Hox gena

postavljena je hipoteza prema kojoj su se, tokom filogenije kimenjaka, odigrale dve

velike duplikacije gena (1R i 2R). Ranije se pretpostavljalo da se prva duplikacija

desila u liniji koja se odvojila od cefalohordata, a druga nakon divergencije predaka

savremenih kimenjaka sa vilicom (pre 395 do 345 miliona godina). Prema toj

hipotezi, prva duplikacija obuhvatala je itav genom, dok bi se druga odnosila na

viestruke tandemske duplikacije gena. Nedavno obavljena analiza na 55 genskih

familija (sa ukupno 150 gena koji su se nalazili na 22 autozoma i X hromozomu), gde

su, pored gena sa homeo domenima, ukljuene i druge familije iji se bar jedan lan

(gen) nalazi i kod kolousta, potvrdile su da su svi kimenjaci, ukljuujui i ribe

kolouste, doiveli dve runde (1R i 2R) potpune duplikaciju genoma (Kuraku i sar.,

2009). Prisustvo primitivnih morfolokih osobina kod kolousta (Agnatha)

objanjava se sekundarnim modifikacijama njihovih genetikih arhitektura. U

evolucionoj liniji koljoriba (Teleostei) pojavila se jo jedna runda potpune

duplikacije genoma (3R), koja se odigrala pre 236 do 350 mil. godina, priblino u

vreme masovnog izumiranja na granici Perma i Trijasa (250 mil. god.). Savremene

procene 2R potpune duplikacije genoma vertebrata kreu se od 520 do 550 mil.

godina, to je poetak tzv. kambrijske eksplozije (videti i deo 3.5.2). Mnogi

istraivai smatraju da je poslednja potpuna duplikacija genoma razlog za vrlo

intenzivnu specijaciju koljoriba; u ovu grupu se svrstava preko 20000 danas ivih

vrsta. Samo u okviru roda Barbus, filogenetska analiza pokazuje da je poliploidija

inicirala specijaciju najmanje 3 puta. Jedan od moguih razloga za poveanje

diverziteta vrsta koljoriba mogao je biti gubitak razliitih kopija gena u odvojenim

populacijama (to se esto naziva recipronim gubitkom gena, RGL, engl. reciprocal

25

gene loss). Naime, u izolovanim populacijama poveava se verovatnoa da e meu

hiljadama dupliranih gena i regulatornih RNK doi do diferencijalnog gubitka

njihovih kopija. U tom sluaju, ako se jedinke razliitih populacija eventualno ukrste,

postoji velika verovatnoa da, zbog genetike inkompatibilnosti, iz takvog ukrtanja

nee nastati vijabilno i fertilno potomstvo. Drugim reima, dolazi do uspostavljanja

post-zigotske reproduktivne izolacije. Da je RGL stvarno mogao biti uzrok

specijacije, pokazuje i poreenje genoma dve vrste koljoriba Tetraodon nigroviridis i

Danio rerio (zebrica), kod kojih je oko 1700 (ili 8%) predakih gena doivelo

reciproni gubitak (Semon i Wolfe, 2007).

Takoe, poliploidne klade biljaka cvetnica znatno su bogatije vrstama u

poreenju sa kladama kod kojih se ne javlja poliploidija. Kod trava (Poacaee), koje

danas imaju 658 rodova sa oko 10000 vrsta, procenjuje se da je do potpune

duplikacija genoma dolo u periodu od pre 70 do 50 miliona godina, to je blizu

vremena kada su, najverovatnije, trave i nastale (najstariji fosili ove grupe datiraju se

na oko 55 miliona godina). Pretpostavlja se da je kod leguminoza (Fabaceae) do

poliploidije dolo neposredno pre adaptivne radijacije koja je dovela do pojave oko

19000 vrsta. Takoe, kod Solanaceae (koje su nastale pre 49 do 68 mil. god.)

poliploidija se datira na vreme od pre 50 do 52 miliona godina.

Prouavanje ostrvske flore, posebno one koju nalazimo na vulkanskim

ostvima, moe nam pomoi u razumevanju razloga koji su doveli do poliploidije za

kojom je sledila adaptivna radijacija niza cvetnica. Disperzija na vulkanske arhipelage

podrazumeva naseljavanje novih stanita koja su drastino drugaija i dinamino se

menjaju u relativno kratkom vremenu. Ciklusi velike nestabilnosti u ovakvim

ivotnim sredinama mogu se ponavljati s pojavom svakog novog ostrva u arhipelagu.

Smatra se da su i preci savremenih angiospermi naseljavali takve ivotne sredine na

prelazu iz Krede u Tercijar (pre oko 65 mil. god.).

Jedna od najbolje prouenih flora smetena je u havajskom aripelagu,

udaljenom od June Amerike oko 3500 km. Ostrva ovog arhipelaga pokazuju

gradijent starosti od zapada prema istoku (najstarije ostvo je Kauai 5 mil. god., a

najmlae je Havaji 500000 god.). Cvetnice koje naseljavaju Havajska ostrva imaju

najveu uestalost poliploidije, pri emu najvei broj havajskih vrsta predstavlja

paleopoliploide pre naseljavanja ovih ostrva njihovi preci su ve bili poliploidni. Na

primer, endemine metlice sa ovih ostrva (svrstavaju se u tri roda i 60 vrsta) su

poliploidne (2n = 64, 66), i sve vode poreklo od roda Stachus sa pacifike obale

26

Severne Amerike. Ovaj rod je alopoliploid nastao ukrtanjem dve vrste jedne sa

cvetovima koje su opraivale ptice i druge koje su opraivali insekti. Morfoloka i

ekoloka diverzifikacija metlica na Havajima je izuzetno velika nalaze se na velikim

visinama, ali i u kinim umama, sa cvetovima koje oprauju ptice ili insekti.

Molekularno bioloka istraivanja su pokazala da ovako velikoj evolucionoj

plastinosti jesu doprinosili veliki intergenomski rearanmani, promene naina

regulacije aktivnosti gena i, kod alopoliploida, veliki broj fiksirani heterozigota.

Heteroza i brze genetike i epigenetike promene predstavljaju osnovu

prilagoavanja poliploida na ekstremne uslove ivotne sredine. Kod poliploida,

posebno alopoliploida, poveanje heterozigotnosti gena moe dovesti do porasta

varijabilnosti u ekspresiji gena i regulatornim vezama, to, kao posledicu, moe imati

poveanje vijabilnosti i brih adaptacija na nove uslove. Nekoliko studija na

cvetnicama je pokazalo da su poliploidne forme tolerantnije na iri spektar sredinskih

uslova nego diploidne forme, kao i da su poliploidi znantno invazivniji i mogu

kolonizovati ivotne sredine u kojima diplodi uopte ne uspevaju. Poliploidni insekti

takoe imaju iru geografsku raspodelu nego njihovi diploidni preci. Relativno novo

nastala tetraploidna aba, Xenopus laevis, je vrlo invazivna vrsta i esto naseljava

stanita koje je ovek naruio. Ova vrsta aba je daleko otpornija na slanost stanita,

suu, hladnou, izgladnjivanje i niz patogena i parazita od svog diploidnog srodnika,

abe Silurana tropicalis.

Biljka Arabidopsis thaliana ne samo da je paleopoliploid ve je, zajedno sa

vrstom A. arenosa, ukljuena u stvaranje relativno novog prirodnog aloploida

Arabidopsis suecica (Ni i sar., 2009). Poto se ovaj prirodni aloploid moe iznova

napraviti u laboratoriji, mogue je analizirati genetike i fenotipske promene koje se

javljaju u prvim generacijama posle formiranja alopoliploida. Jedna od osobenosti

ovog aloploida, kao i mnogih drugih do sada analiziranih, jeste njegova vea biomasa

u odnosu na obe roditeljske vrste. Istraivanje uzroka poveanja biomase pokazalo je

da je od 128 gena sa poveanom ekspresijom kod aloploida, 67% je pokazivalo

povezanost sa dva gena (CCA1 i LHY) koji reguliu cirkadijalni ritam (oba gena su

odgovorna za supresiju fiksacije ugljen dioksida preko noi). Zanimljivo je takoe da

su oba gena kod alopoliploida bili epigenetiki suprimirani i da je ta supresija bila u

korelaciji sa poveanom sintezom skroba i sadraja hlorofila. Ovaj eksperiment je

znaajan jer pokazuje da bitna fenotipska promena, koja sledi posle alopolipolidije,

nije posledica genetikih ve epigenetikih promena, koje se odigravaju u

27

vremenskom pomaku u ekspresiji regulatornih gena. Eksperiment sa neopoliploidijom

kod arabidopsisa u skladu je i sa jednim principom koji je uoen kada su analizirane

genetike promene nakon potpune duplikacije genoma. Prema tom principu, duplirani

geni najee divergiraju u mehanizmima genske regulacije, a najree u svojim

biohemijskim funkcijama.

2.3.2. Duplikacije pojedinanih gena

Osnovni mehanizam dupliranja pojedinanih gena jeste nejednak krosing-

over. Nejednak krosing-over nastaje kao posledica pogrenog postavljanja delova

homolognih hromozoma i njihove rekombinacije. Rekombinacija izmeu pogreno

sparenih regiona dovodi, s jedne strane, do delecije, a s druge strane, do duplikacije

odreenih delova homolognih hromozoma. Ako duplirani nizovi DNK zadre isti

smer (to se naziva glava-rep vezivanjem), dobijaju se tandemski ponovci. Na

osnovu analize paralognih gena veeg broja eukariota, procenjena stopa pojave novih

kopija gena iznosi od 0,001 do 0,017 po genu na milion godina (Lynch i Conery,

2003).

Prva znaajna posledica tandemskih duplikacija jeste dodatno poveanje

verovatnoe nejednakog krosing-overa sa porastom broja tandemskih kopija budui

da se kopija gena jednog lanca moe sparivati sa bilo kojom kopijom na drugom lancu

DNK. Na ovaj nain moe doi do brze ekspanzije tandemskih ponovaka, odnosno do

formiranja velikih familija gena. Druga znaajna posledica je homogenizacija lanova

multigenske familije i usporavanje njihove divergencije usled estog odigravanja

krosing-overa. Ova tendencija gena unutar multigenskih familija da evoluiraju na

slian nain naziva se zajednikom evolucijom (sin. horizontalna ili koincidentna

evolucija; engl. concerted evolution). Pored nejednakog krosing-overa, drugi

mehanizam koji obezbeuje horizontalno premetanje mutacija izmeu lanova jedne

multigenske familije jeste konverzija gena - proces jednosmernog transfera DNK

informacije sa jednog gena na drugi. Konverzija gena se najee odigrava tako to

neki alel, ili njegov deo, dobije niz nukleotida od drugog alela istog gena (intraalelska

ili intralokusna konverzija). Taj proces se najee odvija tokom rekombinacije i

reparacije pogreno vezanih baza (engl. DNA mismatch repair). U klasinom primeru,

u procesu rekombinacije, nastali heterodupleks moe sadrati jednu ili vie pogreno

vezanih baza. Mehanizmi reparacije popravljaju pogreno sparene baze, pri emu kao

28

matricu za popravku mogu koristiti lanac sa drugog DNK molekula to dovodi do

zamene jedne sekvence drugom (slika 2.4).

Slika 2.4. Poreklo genske konverzije. a) Shematski prikaz razmenjenih delova u heterodupleksu. b) Genska konverzija: niz oznaen sa e koristi se kao matrica za reparaciju pogreno vezanih baza (e je niz suprotnog pravca). Posledica ovog procesa je odstupanje od oekivanih mendelovskih proporcija u potomstvu. c) Popravka bez genske konverzije: obe DNK koriste svoje sekvence kao matricu za popravku pogreno vezanih baza.

Interlokusna genska konverzija (konverzija izmeu lokusa na istom ili

razliitim hromozomima) odvija se izmeu nizova sa visokim stepenom slinosti, kao

to su paralogni nizovi (npr. lanovi MGF) ili pseudogeni. I u ovom sluaju, pogreno

sparivanje slinih nizova i korienje jedne matrice rezultuje nerecipronim

transferom izmeu donorske i primajue sekvence (slika 2.5). Takoe, kako se

pokazalo, do ovog fenomena moe doi i u procesu popravke prekida duplog heliksa;

pokazano je da postoji vei stepen genske konverzije nakon izlaganja organizama

nekim mutagenim agensima koji izazivaju prekid DNK npr. radijacija. U irem

smislu, i ugradnja retrotranskipata na druga mesta u genomu, moe se smatrati

genskom konverzijom.

Slika 2.5. Genska konverzija izmeu lanova multigenske familije. Donorski niz, koji se prepisuje u familiji gena, obeleen je crvenom bojom.

29

Vano je jo jednom naglasiti da navedeni mehanizmi ne dovode do

usporavanja evolucionih promena paralognih nizova, ve poveavaju verovatnou da

e se oni menjati na slian nain. Ovaj fenomen pokazan je u uporednim analizama

multigenskih familija kod pripadnika iste vrste i izmeu razliitih vrsta. Ustanovljeno

je da su paralogni lanovi mnogih multigenskih familija meusobno vrlo slini unutar

vrste, ali da se izmeu vrsta, ak i srodnih, ortologni lanovi iste familije gena esto

bitno razlikuju. Ako je genetiki drift bio populacioni mehanizam fiksacija slinih

promena lanova multigenskih familija, onda se to naziva molekulskim voenjem

(engl. molecular drive).

Dakle, sve dok su duplirani geni blisko vezani jedan uz drugi i sve dok su

njihovi nizovi dovoljno slini, oni e evoluirati na slian nain. U tom, obino ranom,

periodu postojanja multigenskih familija, divergencija njenih lanova je usporena to,

opet, smanjuje verovatnou da se kopije gena transformiu u pseudogene. Savremeni

podaci opovrgli su ranija oekivanja molekularnih biologa da preko 99% dupliranih

gena evoluira u pseudogene. Na primer, procenjuje se da je oko 8% dupliranih gena

kod kvasca, ostalo funkcionalno u periodu od preko 100 miliona godina; kod

kukuruza, aba iz roda Xenopus i salamandri, taj procenat prevazilazi 70% za vreme

koje varira od oko 11 do 100 miliona godina.

Osim gore opisanih mehanizama zajednike evolucije, slinim evolucionim

promenama paralognih gena mogu doprineti i neki oblici prirodne selekcije. Na

primer, ukoliko duplirani geni zajedniki kodiraju proteine sa veim brojem domena,

tetna mutacija u jednoj kopiji gena (koja kodira za jedan domen) moe dovesti do

sinteze nefunkcionalnog proteina u interakcijama sa domenima drugih gena. U takvoj

situaciji, selekcija e eliminisati tetne mutacije i odravati multidomenski protein

(odnosno multigensku familiju) u funkcionalnom stanju. Takoe, duplirani geni mogu

zadravati svoju funkcionalnost ukoliko postoji selektivna prednost visokog nivoa

njihove ekspresije. Takva situacija uoena je, na primer, kod niza enzima koji

uestvuju u zatiti insekata od razliitih insekticida. U sluaju pojave mutacija u

promotorskim regionima gena, koje dovode do divergencije lanova multigenske

familije u odnosu na vreme i/ili tkivo u kome se oni ispoljavaju, a ukoliko su takve

promene ekspresije povoljne, selekcija moe dovesti do njihovog odravanja u

funkcionalnom stanju.

30

Od 9990 analiziranih genskih familija sisara (ovek, impanza, mi, pacov i

pas), 164 (tj. 1, 6%) familije su pokazivale bre promene u broju lanova nego to se

oekuje u neutralnoj evoluciji (Demuth i Hahn, 2009). Drugim reima, kod ovih

familija, promene u broju lanova najverovatnije se nalaze pod kontrolom prirodne

selekcije. U ovu grupu spadaju familije gena koji uestvuju u imunim odgovorima,

transkripciji, translaciji, razviu neurona i mozga, meuelijskoj komunikaciji i

transportu, reprodukciji i hemorecepciji. Kod velikog broja eukariotskih genoma

postoje velike multigenske familije za rRNK, tRNK i histone, sa desetinama

identinih kopija gena (npr. kod oveka postoji po 50 do 70 kopija gena za razliite

rRNK na 5 hromozoma: 13, 14, 15, 21, 22). Ovim masivnim duplikacijama gena

obezbeuje se sinteza ogromnih koliina proizvoda koji su neophodni prilikom

intenzivnih deoba elija (npr. tokom ranih faza razvia embriona). Smatra se da

ovakve duplikacije gena predstavljaju evoluciono stariji nain poveanja koliine

vanih proteina u poreenju sa regulacijom ekspresije pojedinanih kopija gena koja,

takoe, moe obezbediti visoku produkciju odreenih proteina u specijalizovanim

elijama. Analize nekih genskih familija pokazale su da ekspanzije njihovog broja

mogu biti specifine za evolucionu liniju kod sisara, od ukupnog broja familija gena

koje pokazuju promene u veliini, u oko 56% promene se uoavaju u samo jednoj

evolucionoj liniji.

2.3.3. Mehanizmi nastanka novih gena

Do divergencije nizova nukleotida u sastavu gena koji kodiraju proteine,

odnosno do pojave novih funkcija, moe doi i bez duplikacije gena. Tokom

evolucije, ortologni geni u razliitim taksonima akumuliraju razliite mutacije. Ovaj

proces moe uzrokovati promenu funkcije gena, tj. pojavu da geni sa zajednikim

poreklom kodiraju za proteine sa razliitom aktivnou kod razliitih organizama. To

se posebno odnosi na gene ije funkcije nisu deo osnovnih metabolikih procesa.

Ukoliko prirodna selekcija favorizuje neke od tih mutacija, fiksirae se divergentne

varijante ortolognih gena kod razliitih vrsta.

Meu brojnim primerima ovog procesa, naveemo nekoliko koji se odnose na

globinske gene i ilustruju kako odreene mutacije u ovim genima mogu dovesti do

adaptacija ivotinja na specifine uslove ivotne sredine. Kod nekih ivotinja koje

mogu iveti pod hipoksinim uslovima (na visokim nadmorskim visinama), kao to su

lame (Lama glama), alpake (L. pacos), guanake (L. guannacoe) i vikunje (L.

31

vicugna), na drugom mestu lanca hemoglobina nalazi se asparaginska kiselina umesto histidina. Histidin se inae nalazi kod kamila, najbliih srodnika lama.

Potpuno ista zamena aminokiselina postoji i kod indijskih i afrikih slonova, koji

mogu da se penju i do 4500 m nadmorske visine. Ovakva iroka prisutnost iste

mutacije kod razliitih vrsta, a koja je u svakoj od ovih evolucionih linija

favorizovana prirodnom selekcijom zbog delovanja istih selekcionih reima (tj.

ivota pod hipoksinim uslovima) predstavlja primer konvergentne evolucije. Kod

dve vrste gusaka, takoe je utvreno da samo jedna zamena aminokiselina u

hemoglobinskim lancima moe promeniti njihov afinitet prema kiseoniku. Kod guske

Anser indicus, koja leto provodi na Tibetanskim jezerima (4 000 do 6 000 m

nadmorske visine) i koja tokom svojih zimskih migracija prelee Mont Everest (9200

m n.v.), zamena alanina prolinom na 119 mestu lanca odgovorna je za visok afinitet hemoglobina prema kiseoniku. Kod andske guske (Chloephaga melanoptera), koja

stalno ivi na nadmorskim visinama od 5.000 do 6.000 m, adaptacija hemoglobina na

hipoksine uslove postignuta je zamenom leucina serinom na 55 mestu lanca. Stariji modeli koji su se bavili nastankom novih funkcija gena, uglavnom su

pretpostavljali da se nove funkcije u okviru jedne evolucione linije mogu pojaviti

nakon nastanka nove kopije, tj. posle potpune duplikacije pojedinanih gena. Prema

tzv. klasinom modelu, koji je dat jo sedamdesetih godina XX veka (Ohno, 1970;

Kimura i Ota, 1974), duplikacija gena je neutralan dogaaj tako da kopija nekog gena

akumulira mutacije bez nadzora prirodne selekcije. Sluajno nastale mutacije mogu

pod odreenim okolnostima (promenom ivotne sredine ili novim interakcijama sa

proizvodima drugih gena) dovesti do nove funkcije, koju, naravno, poinje da

prepoznaje prirodna selekcija. Ovaj model, meutim, nije danas iroko prihvaen

budui da su empirijska istraivanja pokazala da geni koji evoluiraju samo putem

genetikog drifta, najee akumuliraju tzv. destabilizujue mutacije, koje dovode do

agregacije proteina, to, opet, smanjuje adaptivnu vrednost organizama (tj. nisu

neutralne). Takoe, esto su obe kopije gena izloene delovanju tzv. purifikujue

selekcije selekcije koja eliminie mutacije koje destabilizuju biohemijske puteve u

kojima dati geni uestvuju. Najvei problem sa klasinim modelom nastanka novih

gena jeste to to se model zasniva na ideji jedan gen (jedna struktura) jedna

funkcija. Ova koncepcija o genima (tj. njihovim proteinima) kao specijalistima, je u

savremenoj biologiji potpuno odbaena. Danas postoje razliiti modeli nastanka novih

32

funkcija gena, koji se zasnivaju na tzv. zajednikim genima (engl. gene sharing),

odnosno na ideji da geni i njihovi proteini uglavnom obavljaju vie od jedne funkcije.

Ideja da se geni mogu tretirati kao generalisti inspirisana je otkriima prvih

zajednikih gena kod nekih proteina (kristalina) iz soiva oka kimenjaka. Ovi

proteini imaju identinu, ili skoro identinu, strukturu nekim metabolikim

enzimima10. Posle kristalina otkriveni su brojni primeri vrbovanja gena da obavljaju

vie funkcija, bez promena aminokiselinskog sastava proteina ili duplikacije samog

gena. Dakle, pokazano je da se isti polipeptid moe koristiti i kao enzim i kao

strukturni protein, naravno u razliitim tkivima. Mnogi proteini obavljaju funkcije za

koje nisu tokom evolucije bili pripremani. Ta tzv. funkcionalna plejotropija zasniva

se, izmeu ostalog, na postojanju razliitih proteinskih konformacija na osnovu istog

niza aminokiselina. Ova plastinost proteina moe biti polazite za evoluciju novih

funkcija, odnosno novih gena koji e ih kontrolisati. Do pojave kooptiranja gena za

nove funkcije, moe doi kada mutacije u regulatornim elementima dovode gen pod

kontrolu transkripcionih faktora specifinih za odreena tkiva (fenomen poznat pod

nazivom genetika piraterija). Na primer, BMP familije gena kod kimenjaka imaju

mnotvo funkcija u procesu razvia razliitih organa (npr. BMP4 uestvuje u

formiranju onog soiva, razviu skeleta i dorzalnog CNSa, apoptozi vorita zubne

glei, itd). Zanimljiv je primer BMP2 gena koji se, zajedno sa Shh genom, u novom

kontekstu razvia u evolucionoj liniji ptica eksprimira u distalnom epitelu pupoljka

pera. Ovi geni, koji imaju svoje ortologe i kod beskimenjaka, i uestvuju u razviu

brojnih tkiva kimenjaka, kooptirani su za funkciju razvia pera kod ptica.

Postoji mogunost da tokom evolucije doe do sukoba interesa dve funkcije

istog gena. Takav scenario se moe oekivati kada odreeni alel nekog gena daje

svojim nosiocima viu adaptivnu vrednost zbog njegove efikasnije, na primer,

strukturne uloge, ali istovremeno uslovljava manju aktivnost enzima. U takvoj

situaciji, duplikacija gena za kojom sledi funkcionalna specijalizacija nastalih kopija

predstavlja jedno od moguih reenja. Ovaj proces je poznat pod imenom

izbegavanje adaptivnog sukoba (EAC; engl. escape from adaptive conflict). Da je

tokom evolucije dolazilo do izbegavanja adaptivnog sukoba pokazuju geni za enzim

10 Na primer, kristalin (nalazi se kod nekih ptica i gmizavaca) i enzim argininosukcinat lijaza (ASL, katalizuje konverziju argininosukcinata u aminokiselinu arginin) imaju identine nizove aminokiselina i kodirani su istim genom! Inae, kod razliitih vrsta kimenjaka naeno je desetak gena koji istovremeno kodiraju razliite kristaline i enzime.

33

argininosukcinat lijazu (ASL) i kristaline. Jedan od dva blisko locirana ASL/ gena za kristalin kod kokoaka, 1, specijalizovan je za soivo oka (proizvodi vie od 95% kristalinske iRNK) a drugi, 2 gen, kodira preteno enzimski aktivan ASL u drugim tkivima. Interesantan primer je i duplikacija gena za alkoholnu dehidrogenazu (ADH)

kod kvasca S. cerevisiae. Ovde, jedna kopija gena je ukljuena u konverziju

acetaldehida u etanol, a druga u obrnutu reakciju. Rekonstrukcijom predake funkcije

Adh gena pokazano je da je prva funkcija predaka (Thomson i sar., 2005). Takoe je

pokazano da je proizvodnja etanola prvobitno bila koriena za regeneraciju

enzimskih kofaktora kada se kvasac nalazio u sredinama sa malo kiseonika, a da je

duplikacija Adh gena omoguila pojavu novog fenotipa unoenje umesto

izbacivanja etanola.

Slika 2.6. Razliiti modeli nastanka gena, tj. nove funkcije (prema: Soskine i Tawfik, 2010).

Nastanak gena procesom izbegavanja adaptivnog sukoba teko se moe

razlikovati od nastanka gena putem neofunkcionalizacije. U sluaju

neofunkcionalizacije, nova funkcija se stie delovanjem direkcione selekcije na jednu

kopiju, dok se originalna funkcija zadrava u drugoj kopiji gena. Poto je jo uvek

teko u eksperimentima jasno razdvojiti efekte prirodne selekcije i genetikog drifta

na fiksaciju novog oblika gena, ne postoje adekvatne procene relativnog znaaja

adaptivnih i neutralnih procesa u nastanku novih gena posle potpune duplikacije (Des

Marais i Rausher, 2006). Primer funkcionalnih promena i direkcione selekcije na

jednu od kopija gena nalazimo kod himernog jingwei gena vonih muica, koji kodira

za enzim alkoholnu dehidrogenazu. Ovaj enzim pokazuje preferenciju prema

dugolananim alkoholima, a smanjenu sposobnost katalize etanola to je sasvim

34

suprotno od roditeljskog Adh gena (Zhang i sar., 2004)11. Smatra se da je familija

gena terpenske sintaze, koja je kod smre (Picea abies) ukljuena je u modifikaciju

sekundarnih metabolita, prola nekoliko rundi neofunkcionalizacije. Kod te familije,

mali broj kljunih aminokiselinskih zamena kod dupliranih gena dovodio je do

radikalno promenjene supstratne specifinosti i terpenoidnog profila.

Neofunkcionalizacije putem ovakvih malih promena, veruje se takoe, dovele su kod

konifera do pojave irokog spektra sekundarnih metabolita, koji imaju kljunu

funkciju u zatiti od patogena i herbivora.

U procesima koji se opisuju kao duplikacijadegeneracijakomplementacija

(DDC, engl. duplication, degradation, comlementation) dolazi do podele dve ili vie

funkcija predakog gena na novonastale kopije. U sluaju subfunkcionalizacije, kako

se jo naziva ovaj fenomen, duplirani geni opstaju u genomu zbog mutacija koje u

svakoj kopiji inaktiviraju drugu originalnu funkciju. Svaka od tih mutacija je

neutralna, a ne tetna, jer nedostajuu funkciju jedne kopije nadoknauje druga

kopija. Mnogi evolucioni genetiari smatraju da subfunkcionalizacija najbolje

objanjava veliko prisustvo dupliranih gena kod eukariota, jer se ovde pretpostavlja

najmanji broj evolucionih dogaaja, tj. samo postojanje roditeljskog gena sa vie od

jedne funkcije i malog broja degenerativnih mutacija.

2.3.4. Duplikacije unutar gena

Proizvodi mnogih gena su proteini sa veim brojem domena ili oblasti.

Proteinski domen ili oblast (engl. domain, oblast, podruje, domen) predstavlja dobro

definisan region unutar proteina, koji ili obavlja specifinu funkciju, kao to je

vezivanje liganda, ili konstituie kompaktnu strukturnu jedinicu koja se moe jasno

razlikovati od drugih delova proteina. Ako oblast obavlja specifinu funkciju, tada se

naziva funkcionalni domen, a u drugom sluaju naziva se strukturni domen ili modul.

Odreivanje granica funkcionalne oblasti esto je veoma teko jer se funkcionalnost u

mn