DNA i genska amplifikacija

“Double minutes” i homogeno bojane regije

“Double minutes”, DM su mali parovi kromatinskih struktura koji mogu biti veličinom od vrlo malih točkica do većih sferičnih struktura ili prstenova.

“Double minutes” i homogeno bojane regije

DM se repliciraju jednom u svakom mitotičkom ciklusu, za vrijeme S faze. Njihov broj je varijabilan zato što nemaju centromeru pa se njihove kromatide ne mogu razdvojiti za vrijeme anafaze. DM se stoga vezuju za centomeričke kromosome i putuju nasumce prema polovima za vrijeme anafaze. Tako jedna stanica kćer može dobiti DM a druga ih izgubiti.

“Double minutes” i homogeno bojane regije

Homogeno obojane regije, HSR su intersticijalni ili terminalni dodaci ili produljenja kromosomskih ručica koje se obično jednolično bojaju, uglavnom svjetlije svakom od tehnika pruganja kromosoma. HRS kao i DM se repliciraju u ranoj S fazi.

DM i HSR nastaju genskom amplifikacijom

Metotreksat, MTX je citostatik koji se veže i inaktivira enzim dihidrofolat reduktazu, DHFR i dovodi do stanične smrti, posebno tumorskih stanica. Razvoj rezistencije na MTX popraćen je pojačanom ekspresijom DHFR i pojavom HSR. HSR su posljedica genske amplifikacije.

Rezistencija tumorskih stanica na nekoliko citostatika povezana je sa razvojem DM ili HSR rezultirajući multiplim kopijama gena odgovornim za rezistenciju na lijek.

DM i HSR nastaju genskom amplifikacijom

Amplifikacija onkogena primjećena je u velikom broju različitih tumora. U većini slučajeva radi se o ekstrakromosomskim DM ili submikroskopskim kružnim DNA molekulama nazvanim episomi ili amplisomi. Amplificirani MYC onkogen na episomima građen svega od nekoliko stotina kb može se pokazati posebnim vrstama elektroforeze koje mogu razlučiti fragmente od 1500kb ili veće.

DM se mogu identificirati komparativnom genomskom hibridizacijom ili FISH-om.

DM i HSR nastaju genskom amplifikacijom

Normalne stanice rijetko razvijaju rezistenciju na ljekove genskom amplifikacijom. Jedno objašnjenje su geni koji suprimiraju amplifikaciju. Kada se tumorske stanice hibridiziraju s normalnim stanicama izostane amplifikacija. Predpostavlja se da tumorske stanice gube produkte gena koji suprimiraju amplifikaciju. Kandidatni gen koji bi mogao imati ulogu u tome je p53. Stanice homozigoti za nefunkcionalni TP53 alel mogu amplificirati gene dok heterozigoti ne mogu. Divlji tip p53 inhibira gensku amplifikaciju. Da bismo to razumjeli moramo prvo saznati kako dolazi do amplifikacije.

Mehanizmi genske amplifikacije

Ekstrakromosomske kopije gena mogu nastati pucanjem dvaju lanaca u dijelu replikacijskog mjehurića, popraćenom replikacijom da bi se formirala kružna molekula ili izrezivanjem petlje homolognog DNA segmenta koji uključuje gene. Točke prekida veličina amplisoma kromatinskom okruženju gena.

Točke prekida kojima nastaju DM gena za DHFR javljaju se 500kb uzvodno i 200kb nizvodno od DHFR gena vrlo blizu nemetiliranim CpG klausterima ili otocima. CpG otoci obično se pronalaze u promotorskoj regiji housekeeping gena u kromatinskoj strukturi otvorenoj za transkripcijske faktore i nukleaze.

Mehanizmi genske amplifikacije

p53 protein je neophodan u kontrolnim točkama staničnog ciklusa gdje se prepoznaje oštećenje DNA. Zato će TP53 mutacija znatno povećati vjerojatnost da se lomovi ne ponavljaju i da amplisomi mogu nastajati. Inicijalno nastaje jedna kopija gena na jednom amplisomu, ali DM sadrže dimere velikog broja gena položenih u smjeru ponavljanja glava – rep ili invertnog ponavljanja glava – glava. Buduće povećanje broja kopija dovodi do stvaranja nepravilnih nasumičnih segregacija DM u anafazi.

Mehanizmi genske amplifikacije

Intrakromosomska amplifikacija može nastati multiplim DNA replikacijama na jednom lokusu, praćenim multiplom rekombinacijom koje povezuju jedinice međusobno i za kromosome.

Windle i Wahl podržavaju tumačenje da se pojavljuju lomovi dvostrukih lanaca u dijelu replikacijskih mjehurića, slijedi amplifikacija i rekombinacija kojom nastaju ekstrakromosomski DM ili intrakromosomski HSR. Izgleda da se DM mogu nasumce integrirati u bilo koji kromosom. (N-MYC onkogen amplificiran je kao HSR u neuroblastomima a može se vidjeti na različitim kromosomima).

Mehanizmi genske amplifikacije

Drugi mehanizam intrakromosomalnih amplifikacija je nepravilna homologna izmjena između sestara kromatida, SCE odgovorna za dobro poznate varijacije u brojnim ponavljanjima gena za rRNA i satelitnu DNA. SCE je primjećen u melanomima gdje HSR sadrži amplificirane rRNA gene i druge ponavljajuće elemente.

Cowel i Miller su predložili novo objašnjenje intrakromosomalne amplifikacije – gubitak telomera dovodi do formiranja dicentričkih kromosoma koji ulaze u anafazu formiraju mostove, fuziraju se, pucaju i ponovo formiraju mostove što dovodi do amplifikacije. U prilog tome govori činjenica da tumorske stanice imaju kratke telomere.

Mehanizmi genske amplifikacije

Ako se diploidne stanice u kulturi inficiraju transformiranim DNA virusom, kao što je SV40 telomere se skrate na 1,5kb i nastaju dicentrički kromosomi, nastaje most-pucanje-fuzija-most ciklus koji dovodi do amplifikacije. Ako se aktivira telomeraza gen, duljina telomera se stabilizira i stanice postaju besmrtne. Mnoge tumorske stanice amplificiraju upravo gen za telomerazu.

Mehanizmi genske amplifikacije

Gubitak telomera može biti posljedica i kromosomskog pucanja. Postoje “vruče točke” ili mjesta pucanja kromosoma. Neki karcinogeni mogu uzrokovati pucanje na fragilnim mjestima. Ako to dovede do formiranja dicentričkih kromosoma, slijedi ciklus most-pucanje-fuzija-most koji dovodi do amplifikacije.

Protruzija jezgre ili mjehurić predstavlja amplificiranu regiju koja se može izdvojiti iz jezgre kao mikronukleus. Ovo može biti mehanizam nastanka DM iz HSR.

Kako amplifikacija gena dovodi do tumora

Amplifikacijom onkogena dolazi do prekomjerne ekspresije njihovog produkta.

Drugi mehanizam je blokiranje programirane stanične smrti. Mnoge tumorske stanice proizvode antigene koji budu prepoznati od imunog sustava. Ovo dovodi do ubijanja stanica aktivacijom T limfocita koji proizvode Fas ligand (FasL). FasL inducira apoptozu u ciljnim stanicama vežući se na receptor stanične smrti Fas.

Besmrtnost transformiranih i malignih stanica

Regulatori staničnog ciklusa sugeriraju dva mehanizma starenja: aktivacija gena za inhibitor CDK, kao što su p21 (CIP1) ili p16 (INK4A) i inaktivacija tumor supresor gena kao što je TP53 ili RB1. Izbjegavanje starenja može nastati zbog mutacija ili gubitka jedne od ovih dviju skupina gena ili inaktivacijom produkata TP53 ili RB1 gena vezanjem za viralni onkoprotein.

Besmrtnost transformiranih i malignih stanica

Gubitak ili mutacija dugog kraka kromosoma 6 često je uključena. Razni karcinomi uključujući Ca dojke, Ca ovarija i non-Hodgkin limfome imali su deleciju na 6q26-6q27 koja se pokazala kao gubitak heterozigotnosti (LOH) genetičkih markera u regiji. Ova regija nedostaje u SV40 transformiranim staničnim linijama. Izgleda da je za to odgovoran gen SEN6 (starosni inducirajući gen kromosoma 6).

Telomere- starenje – tumori. 97% tumora pokazuje povećanje broja kopija telomeraza RNA gena smještenog na 3q26.3.

Genetička osnova tumora

Tumorske stanice – numeričke i strukturne kromosomske promjene. Ovakve kariotipske promjene odgovorne su za aktivaciju, gubitak ili inaktivaciju gena koji dovode do tumorogeneze.

Familijarni tumor dojke i ovarija nastaje zbog mutacije BRCA1 gena. Postoji preko 20 tumora koji se povezuju s nasljednim mutacijama. To je oko 1% ukupno nastalih tumora, ostalih 99% nastaju somatskim mutacijama.

Većina tumora posljedica je većeg broja genetičkih promjena.

Genetička osnova tumora

Tri glavne skupine gena igraju ulogu u nastanku tumora:

1. Oni koji zaustavljaju starenje, povećavju broj mutacija i dovode do kromosomsk nestabilnosti.

2. Geni koji stimuliraju rast – onkogeni ili protoonkogeni.

3. Tumor supresor geni ili antionkogni – reguliraju staničnu poliferaciju.

Klonalni početak, slekcija i multistep progresija tumora

Monoklonalno i poliklonalno porijeklo tumora Neki tumori kao npr. obiteljska adenomatozna

polipoza mogu biti mozaik X0/XY sto govori o njihovom poliklonalno porijeklu.

Kronična mijeloična leukemija (CML) započinje t(9q;22q), druge promjene događaju se za vrijeme progresije bolesti 22q-, trisomija 8, inverzija 17q.

Osobito kompleksna bolest je karcinom kolona.

Aberacija diobenog vreten i nestabilnost broja kromosoma

Abnormalnosti diobenog vretena – varijacije u broju kromosoma u stanicama kćerima (mixoploidija).

Abnormalnosti mogu dovesti do centriranja kromosoma (C-mitoza). Također sestre kromatide se konačno razdvajaju i formiraju tetraploidne jezgre ili brojne mikronukleuse različitih veličina. Mikronukleusi se više ne mogu dijeliti.

Aberacija diobenog vreten i nestabilnost broja kromosoma

Centromera je glavni organizacijski centar mikrotubula pa aberacije centromera dovode do produljenja niti diobenog vretena i njihovu multipolarnost u tumorskim stanicama.

Nedostatak proteina p53 dovodi do multiplih kopija funkcionalno kompetentnih kromosoma. Drugi uzrok je amplifikacija i prekomjerna ekspresija STK15 gena koji kodira kinaze ovisne o centromerama i uzrokuje duplikaciju centrosoma i aneuploidiju.

Glavni mehanizmi aberacija diobenog vretena i heteroploidija

Integritet genoma ovisi o mehanizmima u kontrolnim točkama staničnog ciklusa. Stanice u kojima se niti diobenog vretena ne vežu bipolarno na kinetohore diobenog vretena ne mogu ući u anafazu. P53 je odgovoran u ovoj kontrolnoj točki.

Nekoliko drugih gena: MAD2 je smanjeno izražen u tumorima dojke sa greškama u kontrolnim točkama. Mutacija BUB1 je česta kod nekih tumora sa greškama u kontrolnim točkama. Sarkomi pokazuju prekomjernu ekspresiju MDM2 koji se veže za p53 protein i uzrokuje njegovu brzu degradaciju.

Kontrolne točke koje prepoznaju oštečenu DNA

Oštećena DNA prepoznaje se u G1 kontrolnoj točki. Spontana pucanja DNA mogu biti inducirana oksidansima koji su proizvod metabolizma. Stanica se normalno zaustavlja u G1 fazi dok se DNA ne popravi. Ako se greška ne popravi rezultat je mutacija ili prekid oba lanca koji dovodi do preraspodjele kromosoma. Mutacije p53 onesposobljavaju kontrolne točke.

P53 je mutiran u preko 50%tumora – dovoljna je mutacija jednog alela da se ispolji, također p53 ima nekoliko “vručih točaka” pojave mutacija. Njihova promjena inducira se različitim faktorima okoline (tumori kože – UV zrake; pluća – benzipireni iz dima cigareta).

Utjecaj vanjskih fktora na nastanak tumora

X zrake, zračenje, kemikalije, virusi. DNA tumorski virusi: SV40,humani papiloma virusi

(HPV) i adenovirusi. Virusi induciraju transformaciju stanice u nekoliko

koraka. Normalni p53 protein je polimorfan – ponekad ima prolin na 72 poziciji ponekad arginin. Oba alela su funkcionalna, arg72-p53 se brže razgrađuje od pro72-p53. Bolesnici sa HPV uzrokovanim karcinomom cerviksa uterusa su češće homozigoti za arg72-p53. Takvi homozigoti imaju sedam puta veću šansu da obole od Ca cerviksa uterusa.