Diagnostic Microbiologic

8/17/2019 Diagnostic Microbiologic

1/117

DIAGNOSTICUL PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE INTERES CLINIC – Ziua I

Exsudatnasofaringian

(2 tampoane)

Frotiu coloratie Gram

Insamantare Geloza sange

Urina

Examinare macroscopica (culoare, sediment, turbiditate, miros)

Repartizare sterila a cate 2 mlin 2 tuburi sterile

Examen citologic calitativdin sedimentul urinar (centrifugare la 12!1"

rpm#1 min$) pe preparat lama#lamela si frotiu coloratGramUrocultura

%in dilutii 1#1 si 1#1 insamantat cate $1

ml cu pipeta de sticla sau cu ansa calibrata pe

mediu &ac 'one (&') si Geloza sange

(G*)Materiifecale

Examinare macroscopica+ consistenta, paraziti, melena

*uspensie in F* Examinare microscopica

-reparat lama#lamela

Frotiu coloratie Gram

Frotiu coloratie albastru metilen (fungi)

'oproculturainsamantare direct din coprorecoltor

Insamantare pe Geloza sange(G*)

Insamantare pe Geloza simpla

Insamantare pe &ac 'one fara in.ibitor

Insamantare pe &ac 'one cu in.ibitor

Insamantare pe /ile *alts gar (/*)

Insamantare e 0io licolat 'itrat /ile *alts 0'/*


2/117

DIAGNOSTICUL PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE INTERES CLINIC – Ziua II

Frotiu din colonii .emolitice

-e geloza simpla (G)Exu!at "aringianExaminare placa Geloza

sange (aspect mono sau

polimorf, prezenta

.emolizei ti ul .emolizei

Repicare numai colonii.emolitice

(α,β .emoliza)in cazul microbiotei polimorfe

-e mediu /- /aird!-arer '.a mann

-e mediu 'etrimide gar ('0)

-e mediu ing , ing /

-e mediu Geloza sange (G*)

Repicare orice tip de colonie(in cazul microbiotei

monomorfe)

-e geloza sange (G*)

-e mediu /-, '.apmann

-e mediu '0

-e mediu ing , ing /

Urocultura Examinare aspect placi (prezenta#absentamicroorganismelor, monocultura sau

olimorfism

'restere e G* monocultura absenta e &' %eterminare 3F' coloratie Gram

'restere e G* olimorfism absenta e &' 'ontaminare eliminarea robei

'restere pe G* si &', policultura

'restere pe G* si &', monocultura %eterminare 3F' de pe &'

Identificare prin insamantare pe mediu0*I, &I3, &I4F, 'itrat

-I 2 EInsamantare pe Geloza simpla (G)

'ontaminare, eliminarea probei


3/117

DIAGNOSTICUL PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE INTERES CLINIC – Ziua II#$i

Co%rocultura Examinare Geloza simpla &icroorganisme polimorfe

Examinare Geloza sange(prezenta coloniilor

.emolitice) I!enti"icare prin insamantare pe mediu

0*I, &I3, &I4F, 'itrat-I 2 EInsamantare pe Geloza simpla (G)

Frotiu

Examinare /*(testul oxidazei din toate

tipurile de colonii dezvoltate)

I!enti"icare prin insamantare pe mediu0*I, &I3, &I4F, 'itrat si

-I 2 E pentru colonii oxidazo (!)-I 2 5E pentru colonii oxidazo (6)

*c.ema minima de teste bioc.imice pentru

identificarea vibrionilor .olerici+

fermentarea glucozei (tub %ur.am)4%', 7%', %8 6 martor pentru decarboxilaze

4actoza, za.aroza, manoza, manita, inozita, arabinoza,adonita Examinare 0'/*

(colonii galbene, de tip *) *us iciune Vibrio cholerae


4/117

DIAGNOSTICUL PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE INTERES CLINIC – Ziua III

Exu!at "aringian

0estul catalazei#oxidazei din colonii crescute pe mediu geloza simpla

Examinarea cresterii pe /-, '.apmann

Examinarea cresterii pe '0, ing , ing /

-rezenta cresterii I!enti"icare factori de virulenta printestul coagulazei libere,

coagulazei legate, termonucleazei

Urocultura'itirea rezultatelor de la testele bioc.imice+

0*I, &I3, &I4F, 'itrat, testul oxidazei de pe

geloza simpla

'itire rezultate de la testele -I 2E

I

Co%rocultura'itirea rezultatelor de la testele bioc.imice+

0*I, &I3, &I4F, 'itrat, testul oxidazei de pe

geloza simpla

'itire rezultate dela testele -I 2E,-I 2 5E

Identificar e

IDENTI&ICARE

IDENTI&ICARE


5/117


6/117

E'i!entierea caracterelor $ioc(imice ale microorganimelor

/acteriile prezint9 o mare diversitate bioc.imic9 :i nu exist9 practic un substrat pe care ele s9 nu!

l poat9 metaboliza, convertindu!l la nutien;i sau metaboli;i esen;iali$


7/117

I. TESTE BIOCHIMICE CONVENŢIONALE IN!IVI!"ALE#

Meta$olis%ul res&irator 0estele bioc.imice din aceast9 categorie determin9 capacitatea unui microorganism de a utiliza =n

mod specific un substrat de ', pe cale oxidativ9 la bacteriile aerobe stricte sau fermentativ9 la cele aero!

anaerobe facultativ :i la bacteriile strict anaerobe$ -roducerea de acizi este eviden;iat9 prin utilizarea de

indicatori de p8, cei mai frecvent utiliza;i fiind Ro:u!metil :i lbastru de /rom!timol$

*ursa de ' poate fi reprezentat9 de+

- oze + pentoze (lactoza, maltoza, za.aroza) sau .exoze (fructoza, manoza, galactoza)?

- deriva;i de oze+ alcoolii rezulta;i din reducerea ozelor (manitol, sorbitol, dulcitol, adonitol)? deriva;ii

metila;i ai pentozelor (metil pentoze), cel mai utilizat fiind 4(6)!ramnoza?

- ozide+ di.ilozide (lactoza, maltoza, za.aroza)? tri.ilozidele (rafinoza)? poliozidele (inulina, polimer

al fructozei)?

- .eterozide+ reprezentate de oze asociate la substan;e non!glucidice (esculina, amigdalina, salicina)$

Re%ira,ia aero$-

4an;ul respirator (sau lan;ul citocromic de transfer de electroni) este constituit din proteine de oxido!

reducere localizate =n membrana citoplasmatic9 care func;ioneaz9 ca transportori de electroni

(citocromi) sau ca oxidoreductaze (de.idrogenaze, citocrom!oxidaze)$

E'i!en,ierea en.imelor re%iratorii citocromice

Tetul oxi!a.ei+ %etecteaz9 citocromul c, care determin9 alb9strirea .@rtiei de filtru impregnat9 cu

oxalat de dimetil!parafenilen!diamin9 (acceptor artificial de e!)$ /anda de .@rtie de filtru

impregnat9 cu oxalat de dimetil!parafenilen!diamin9 se depune pe o lam9 microscopic9 curat9 :i se

.idrateaz9 cu ap9 fiziologic9 steril9 (evit@ndu!se excesul de lic.id)$ 3lterior, cu a>utorul ansei cu fir

de platin9 sau al unei pipete -asteur =nc.ise (se evit9 folosirea ansei cu fir metalic), se depune subform9 de spot cultura bacterian9 dezvoltat9 pe un mediu f9r9 za.aruri$ pari;ia culorii albastre =ntr!

un interval de cel mult A de secunde, indic9 o reac;ie pozitiv9$ lb9strirea tardiv9 a .@rtiei de

oxidaz9 nu se consider9 reac;ie pozitiv9$

'ontrol de calitate+ Pseudomonas aeruginosa - martor sigur (6)? Salmonella spp., Proteus sp. - martor

sigur (!)$


8/117

Tetul re.iten,ei la /CN+ %etecteaz9 citocromul d, natural rezistent la '5, prezent la E. coli :i la

alte enterobacterii$

E'i!en,ierea en.imelor re%iratorii non#citocromice (enzime de detoxifiere care prote>eaz9 celula

bacterian9 fa;9 de produ:ii de reducere par;ial9 a 72!+ ioni peroxid, superoxid etc)

Su%eroxi! !imuta.a 0SOD1 transform9 radicalul *7 =n 8272 (prezent9 la toate bacteriile, cu

excep;ia celor strict anaerobe)$

Catala.a ! converte:te 8272 =n 72 (nu este produs9 de bacteriile strict anaerobe :i aerotolerante)$

-roducerea de catalaz9 se studiaz9 prin ad9ugarea de solutie 8 272 AB peste o cultur9 bacterian9 de

2C. dezvoltat9 pe un mediu solid uzual (geloz9 simpl9), iar reac;ia pozitiv9 se vizualizeaz9 prin

apari;ia efervescentei ca urmare a bulelor de 72 dega>at$

Re%iratia aero$a*

234O4 5 465 5 4e# 464O

64O4catalaza

64O 5 234 O4

*tudiul catalazei este util =n diferen;ierea genurilor Streptococcus sp. :i Staphylococcus sp., Bacillus sp:i Clostridium sp.Peroxi!a.a 0catala.a1 converte:te 8272 =n 827 (nu este produs9 de bacteriile strict anaerobe)$

Re%ira,ia anaero$-

Respira;ia anaerob9 reprezint9 o cale energetic9 facultativ9 asociat9 =ntotdeauna cu sistemul respirator

aerob :i#sau fermentativ$

Respira;ia nitra;ilor implic9 2 enzime terminale distincte+

# nitrat re!ucta.a !e ti% A (NAR A) este o enzim9 membranar9 cu rol =n respira;ie, a c9rei sintez9 este

indus9 =n prezen;a nitra;ilor :i clora;ilor :i este reprimat9 =n prezen;a 72+

4NO76 4NO46 4N#O6 N4ON4

acid .iponitros

ClO7# ClO4#

.ipoclorit toxic ( determin9 oprirea cre:terii bacteriene)

# nitrat re!ucta.a !e ti% 8 (NAR 8) este o enzim9 solubil9, citoplasmatic9, constitutiv9, care

func;ioneaz9 at@t =n aerobioz9, c@t :i =n anaerobioz9, cu rol =n asimilarea nitra;ilor cu formare de

58C78$ Este in.ibat9 de prezen;a clora;ilor =n mediu+

4NO76 4NO46 4NO6 N64O6 N69O6

acid .iponitros surs9 de 52 pentru bacterii


9/117

E'i!en,ierea re!ucta.elor $acteriene

Re%ira,ia nitra,ilor* gelo.- %ro"un!- cu NO7 0gelo.- gelatin- Legroux1

! dezvoltarea uniform9 a culturii =n tot tubul indic9 prezen;a respira;iei nitra;ilor, =n timp ce absen;a

indic9 de dezvoltarea culturii exclusiv la suprafata mediului$

'educerea nitra(ilor la nitri(i) $ulion si%&lu cu *+ nitra(iReactivul Griess reveleaz9 prezen;a nitri;ilor =n mediu+ acid sulfanilic (Griess I) :i α!naftilamin9 (Griess

II) formeaz9 cu 572 un complex de culoare roz!ro:ie, prin formarea unui complex diazoniu (para!

sulfobenzen!azo! α !naftilamin9)$

bsen;a culorii ro:ii indic9+

- absen;a nitrat!reductazei? pentru a verifica prezen;a nitra;ilor se adaug9 Dn =n mediu$ cesta va

reduce nitra;ii la nitri;i, cu apari;ia unei culori ro:ii!brune, datorate reducerii s9rii de diazoniu =n aril!

.idrazin9$- reducerea avansat9 a nitra;ilor, dincolo de stadiul de nitri;i$

Rezultate fals negative sunt generate de lectura tardiv9 cu dispari;ia culorii ro:ii prin evaporarea α!

naftilaminei, de faptul ca unele specii, de:i posed9 5R, utilizeaz9 nitri;ii pe m9sur9 ce se formeaz9,

=mpiedic@nd acumularea lor =n mediu (ex$ Salmonella sp., Pseudomonas sp., Brucella suis) sau de

ad9ugarea unei cantit9;i mari de Dn care determin9 dega>area de 8 2 gazos care reduce nitri;ii forma;i la

58A$

-entru detectarea nitrit!reductazelor se efectueaz9 reac;ia Griess, =n mod similar, dar pe un mediu ce

con;ine nitri;i$

E'i!en,ierea ti%ului !e nitrat#re!ucta.-

NAR A # Geloz9 profund9+ NAR 8 # Geloz9 profund9+F9r9 clora;i 'u clora;i F9r9 clora;i 'u clora;i're:tere uniform9 =n

toat9 masa mediului

're:tere intens9 la suprafa;9 :i

mai slab9 =n profunzime (=n

absen;a 72, 5R utilizeaz9

clora;ii gener@nd .ipoclorit cu

efect bactericid)

're:tere omogen9 =n toat9 masa

mediului, 5R / nu utilizeaz9

clora;ii :i nu este in.ibat9 de

prezen;a 72

A%lica,ii

0estele de reducere a nitra;ilor :i nitri;ilor sunt indispensabile pentru caracterizarea e nterobacteriaceelor

care, cu rare excep;ii reprezentate de mutante, posed9 nitrat!reductaze, ca :i genurile Moraxella :i

Vibrio, pentru diferen;ierea speciilor de Pseudomonas, Alcaligenes, la!obacterium, "eisseria,

Campylobacter $


10/117

Alte re!ucta.e !etectate :n %ractic-*

- Tetrationat re!ucta.a 0TTR1 catalizeaz9 reducerea tetrationatului =n tiosulfat cu acidifierea

mediului :i vira>ul culorii de la albastru la galben (ap9 peptonat9 6 0etrationat 6 albastru de brom!

timol)+

S9O;4# S4O74#

- Tioul"at re!ucta.a catalizeaz9 reducerea tiosulfatului la 82*+

S4O74# 64S

82* este detectat prin ad9ugarea =n mediu a unor s9ruri de -b sau de Fe, care interac;ioneaz9 cu 82*

:i genereaz9 sulfuri de culoare neagr9$

- &umarat re!ucta.a

METABOLISM"L ,E'MENTATIVFermenta;ia este un ansamblu de reac;ii anaerobe de oxidare :i reducere, generatoare de compu:i boga;i

=n energie, prin fosforil9ri la nivelul substratului$ Glucoza reprezint9 un substrat fermentescibil universal

care poate fi metabolizat pe diferite c9i$

4a enterobacterii exist9 4 ti%uri !e "ermenta,ie a glucozei+

- "ermenta,ia aci!- mixt-* produ:ii ma>ori de fermenta;ie sunt reprezenta;i de acetat, lactat, etanol :i

formiat, molecule acide care determin9 acidifierea mediului de cultur9 (reac,ia RM %o.iti'-)$ cesttip de fermenta;ie este caracteristic enterobacteriilor -!negative$ %ac9 bacteriile posed9 "ormiat

(i!rogen#lia.-< are loc producere de gaz (8'778 '72 6 827)$ %ac9 mediul con;ine nitra;i sau

fumarat, formiatul nu este clivat, ci va fi oxidat pe alte c9i de c9tre o formiat de.idrogenaz9 tip I (F%8

I)$

- "ermenta,ia $utan!iolic-* =n afar9 de fermenta;ia acid9 mixt9, la aceste bacterii mai exist9 o cale

specific9 care va produce un compus final neutru, 4#7 $utan!iol< ceea ce determin9 men;inerea p8!

ului mediului la un nivel ridicat (reac,ie RM negati'-

)$ ceast9 cale este caracteristic9

enterobacteriilor -!pozitive (Vibrio sp., Aeromonas sp., Bacillus sp.#

- calea acceorie !e "ermenta,ie a glicerolului 0cu "ormare !e 2#7 %ro%an!iol1 prezent9 la $lebsiella

pneumoniae, care permite reoxidarea coenzimei 5%8686 excedentare$


11/117

Studiul &ractic al %eta$olis%ului fer%entati-) atacul glucidelor Glucidele studiate trebuie s9 constituie unica surs9 fermentescibil9 prezent9 =n mediu$ ul indicatorului colorat$ %ac9

pentru bacteriile care prezint9 metabolism fermentativ se utilizeaz9 de preferin;9 lbastru de /rom!timol,

pentru bacteriile cu metabolism oxidativ se utilizeaz9 Ro:u fenol (ro:u la p8"$C, galben la p8H$")$

Testul de diferen(iere ntre c/ile de %eta$oli0are oxidati-/ 1ifer%entati-/ a gluco0ei

Me!iu 6ug( Lei"on au ME=AG 0 Milieu pour l”Etude de Voies d’Attaque de Glucose #+ mediu

gelozat care con;ine peptone 6 glucoz9 6 Ro:u fenol! se regenereaz9 2 tuburi de mediu la bain &arie timp de 2 minute :i se adaug9 glucoza =n

concentra;ie final9 de 1B$ &ediul se solidific9 prin r9cire sub >et de ap9 rece si se =ns9m@n;eaz9 prin

=n;epare cu ansa cu fir drept, utiliz@ndu!se pentru inoculare o suspensie bacterian9 dens9 realizata =n F*

( etalon 2# A &acFarland)$ -entru unul din tuburi, se acoper9 mediul cu un strat de ulei de parafin9 de 2

cm$ mbele tuburi se incubeaz9 2C de ore la temperatura corespunz9toare exigen;elor de cre:tere ale

bacteriei respective$

A%- %e%tonat- 5 u$trat "ermenteci$lil 5 tu$ Dur(am 5 Al$atru !e 8rom#timol 0%6 alcalin

> al$atru< %6 aci!> gal$en1 au rou "enol 0%6 alcalin > rou< %6 aci!> gal$en1+

&etabolizarea substratului (glucide, polialcooli) antreneaz9 acumularea de produ:i de fermenta;ie (acizi

sau nu)$ cidifierea mediului cu# f9r9 producere de gaze ('72, 82) este vizualizat9 prin vira>ul culorii

indicatorului de p8 la galben$ 0ubul %ur.am permite vizualizarea producerii de gaz (Fig$$)$

Meta$olim* "-r- ulei !e %ara"incu ulei !e %ara"in-7xidativ Galben =n partea superioar9,

ro:u =n partea inferioar9

Ro:u

7xidativ 6 fermentativ GalbenGal$en

Inert# inactiv !is a !is de

glucoz9

bsen;a culturii

Ro:u

'ultur9 dezvoltat9

Ro:u cu o u:oar9 alcalinizare la

suprafa;9 (albastru)


12/117

N8 ! bsen;a acidifierii mediului nu =nseamn9 c9 substratul nu a fost metabolizat$ &etabolismul

moleculelor reduse (inositol, adonitol) genereaz9 produ:i de fermenta;ie neutri (=n principal etanol), iar

catabolismul peptonelor antreneaz9 o realcalinizare a mediului$

- apa peptonat9 nu este adecvat9 pentru studiul bacteriilor cu metabolism oxidativ sau cele cu

metabolism fermentativ neacidifiant sau pu;in acidifiant (Staphylococcus sp.)$

&ig+?@+ &ermenta,ia car$o(i!ra,ilor+ 0A1 Rou

"enol ete ro)u :ntr#o olu,ie cu %6 neutru au

alcalin+ 081 n %re.en,a aci.ilor are loc 'iraBul

culorii in!icatorului la gal$en+ 0C1+ Pro!ucerea

!e ga.ele e e'i!en,ia.a %rin colectarea :n tu$ul

Dur(am in'erat< :n tim% ce ro)u "enol in!ic-

%ro!ucerea !e aci!+

Me!iul CTA ('istein9!0ripticar!gar) permite studiul metabolismului bacteriilor exigente, f9r9 a

necesita ad9ugarea de factori de cre:tere$

Me!iu Clar#Lu$ (pepton9, glucoz9, 28-7C) permite eviden;ierea acetoinei, precursor al 2!A

butandiolului (Reac,ia =P), precum :i m9surarea grosier9 a p8!ului mediului (Reac,ia RM1$

Reac,ia Ro)u Metil 0RM1 detecteaz9 acumularea produ:ilor de fermenta;ie acid9 mixt9 acizi (acid

lactic, acetic, succinic, formic), '72, 827 si etanol, care determin9 acidifierea mediului (apa peptonata

6glucoza 1B) (p8 JC$A) :i vira>ul culorii indicatorului de p8 (Ro:u metil 1B) la ro:u$

6COO6 "ormiat

!e(i!rogena.aCO4 5 64

A%licatii+ diferentierea bacteriilor enterice ( Escherichia sp., Salmonella ssp., Proteus sp., Aeromonas sp$)

2+;+ Reac,ia =oge Proauer 0=P # meto!a 8arritt1 permite eviden;ierea acetoinei (acetil

metil carbinolul), precursor al 2!A butandiolului, care este mai greu de detectat (Fig$1$)$ cetoina se

oxideaz9 =n prezen;a oxigenului molecular la diacetil (butandion9), care =n prezen;a 5a78 :i creatinei(con;inut9 =n peptonele din mediul 'lar!4ubs) genereaz9 un complex de culoare ro:ie (are loc o

condensare a diacetilului cu o grupare 582 a unei grup9ri guanidil proteice (reziduu arginil), a unei

arginine libere sau a creatinei)$ α!naftolul accelereaz9 formarea acestui complex de culoare ro:ie (>oac9

rol catalitic =n oxidarea acetoinei la diacetil), f9r9 a diminua specificitatea reac;iei$ &ediul 'lar!4ubs se

=ns9m@n;eaz9 cu o suspensie de densitate ,K &acFarland (sau mai mare pentru germenii fastidio:i$


13/117

&ermentarea gluco.ei+ 0a1 Prin "ermentatie %ot re.ulta aci.i organici 0ex+ aci!ul lactic1 au %ro!uii neutri 0ex+

acetoina1+ 0$1 Detectarea acetoinei e reali.ea.a %rin a!augare !e /O6 i #na"tol+

Reac;ia se efectueaz9 dup9 C". de incubare la temperaturi corespunz9toare bacteriilor respective$

*e preia 1$ ml de cultur9 bacterian9 :i se repartizeaz9 =ntr!un tub de .emoliz9 steril peste care se adaug9

=n ordine+ ,K ml α!naftol :i ,K ml 78$ *e agit9 u:or A sec!1 minut, dup9 care se las9 tubul =n repaus

1!1K minute =n pozi;ie =nclinat9, pentru a favoriza contactul cu oxigenul atmosferic$ Reac;ia pozitiv9 se

traduce prin apari;ia culorii ro:ii la suprafa;a mediului, uneori difuz@nd c.iar =n mediu$ -entru

accelerarea reac;iei, se introduc cultura :i reactivii =ntr!un tub de dimensiuni mari care permit9 agitarea

puternic9 :i =nc9lzirea tubului$

Rezultatele fals!negative pot apare =n cazul unor bacterii care metabolizeaz9 acetoina :i 2!A

butandiolul$


14/117

A&lica(iiReac;iile R& :i - sunt utilizate pentru diferen;ierea genurilor :i speciilor de enterobacterii$


15/117

0estul esculinei se utilizeaz9 =n identificarea streptococilor de grup %, %isteria monocytogenes,

Erysipelothrix rhusiopathiae esculin(6), pentru izolarea selectiv9 :i diferen;ierea speciilor de

Enterococcus, a speciilor de Streptococcus non!grupabili, %actobacillus, Pseudomonas, (anthomonas,

Aeromonas, Bacteroides, Clostridium, usobacterium$

Amig!alina 0(i!roli.at- la gento$io.- 5 $en.al!e(i!- 5 6CN1$ Gentobioza este un diza.arid

care poate fi .idrolizat la 2 molecule de glucoz9$ *e urm9re:te detectarea produ:ilor de acidifiere a

mediului, a grup9rii benzenice sau a picratului alcalin$

Utili.area u$traturilor organice imilare lacto.ei* ONPG 0orto#nitro"enil# #D#

galacto%irano.i!1 )i omologul acetuia PNPG 0%ara#nitro"enil# #D#galacto%irano.i!1$

-ermite cercetarea 75-G! si -5-G!.idrolazelor, denumite =n mod curent, de:i impropiu, beta!

galactozidaze sau lactaze$ ceste enzime sunt enzime intracelulare (endoenzime), inductibile, care

catalizeaz9 .idroliza lactozei la galactoz9 :i glucoz9$ ceste enzime nu sunt specifice pentru substratul

reprezentat de lactoz9, ci pentru leg9tura β!1!C ozidic9 :i pentru restul beta!galactozil, de aceea ele pot

ataca :i substraturi artificiale ca 75-G :i -5-G$

ONPG ONP

75- (orto!nitrofenol) rezultat sufer9 modific9ri tautomerice care stau la originea culorii galbene$

Exist9 2 tipuri de enzime care .idrolizeaz9 75-G!ul+

- /eta!galactozidaza tipic9, solubil9, inductibil9 de I-0G (isopropil tiogalactozid)?

- N75-G!azaO care nu fermenteaz9 lactoza, cu localizare membranar9, represat9 de I-G0$

-rincipiul utiliz9rii -5-G este similar, cu men;iunea c9 -5- rezultat nu este volatil, iar utilizarea sa este

de rpeferat =n galeriile -I 5E$

Auxanogra%a3nele bacterii pot utiliza citratul ca unic9 surs9 de carbon :i energie$ ceste bacterii posed9 =n

ec.ipamentul lor enzimatic citrat!permeaze :i enzimele implicate =n catabolismul ciratului$ -entru a se

putea dezvolta pe mediul *immons, bacteriile trebuie s9 utilizeze s9rurile de amoniu ca unic9 surs9 de

azot$ 3tilizarea citratului se realizeaz9 pe 2 c9i+ aero$- :i "ermentati'-$

Te(nica )i lectur-*

similarea citratului se evidentiaza pe me!iul Simmon # un mediu sintetic (f9r9 peptone), tamponat cu

fosfa;i :i care con;ine o surs9 de azot reprezentat9 de s9ruri de amoniu, ioni, citrat de 5a 6 :i albastru de

/rom! timol$


16/117

&ediul se =ns9m@n;eaz9 cu un inocul reprezentat de o suspensie realizat9 =n ap9 distilat9, iar

dopul tubului se =nc.ide slab, pentru a permite eliminarea '7 2$ 'itratul este un triacid care sufer9 o

decarboxilare oxidativ9 =n condi;ii de anaerobioz9$ -ierderea grup9rilor acide antreneaz9 o alcalinizare a

mediului care devine albastru, dac9 bacteria a utilizat citratul :i dac9 nu este auxotrof9 pentru citrat$

*e mai practic9 studiul utili.-rii acetatului 0me!iu intetic Tra$uli1 :i a malonatului

0me!iu intetic cu extract !e le'uri1, utilizarea galeriilor de auxanogram9 pentru studiul utili.-rii !e

car$o(i!ra,i< aci.i organici3 aminoaci.i ca unic- ur- !e C$

&ermentarea citratului 0:n anaero$io.-1

*e studiaz9 pe ap9 peptonat9 cu citrat sau pe citrat '.ristensen+ mediu complex cu Ro:u fenol :i citrat$

Fermentarea citratului duce la acidifierea mediului care devine ro:u$

A&lica(ii*e utilizeaz9 pentru diferen;ierea enterobacteriilor (specii pozitive+ Salmonella, cu excep;ia speciilor S.

typhi :i S. paratyphi A, grupul $ES ), a speciei Vibrio cholerae (6) :i Pseudomonas aeruginosa (6).

Meta$olis%ul a0otat

N64#C#C#C#C#COO6

6 6 6 6

N64666 6 6 6 6

6666

N64#C#C#C#C#N64 5 CO4 ornitin#

!ecar$oxila.a

Ornitina Putreceina purpur de bromcrezol purpur de bromcrezol

(galben) (mov)

Stu!iul !ecar$oxila.elor* li.in#!ecar$oxila.a 0LDC1< ornitin#!ecar$oxila.a 0ODC1< arginin#

!i(i!rola.a 0AD61

%ecarboxilazele sunt active =n anaerobioz9 la p8 acid, :i catalizeaz9, =n prezen;a coenzimei

fosfat de piridoxal, reac;ia de decarboxilare a lizinei :i ornitinei (aminoacizi diamino!monocarboxilici),

antren@nd formarea diaminelor corespunz9toare+

rginina este catabolizat9 prin intermediul a 2 sisteme enzimatice+ sistemul arginin!di.idrolaza (%8)

:i sistemul arginin!decarboxilaz9 (%'), care sunt foarte greu de diferen;iat$


17/117

dii care aduce aportul de piridoxal,

glucoz9 a c9rei fermenta;ie duce la acidifierea mediului :i inducerea decarboxilazelor, un aminoacid,

purpur de brom crezol, p8 H$A =n anerobioz9), 8a>na!liger, &oeller$

Fermentarea glucozei de c9tre bacteriile cu metabolism fermentativ antreneaz9 acidifierea

mediului :i virarea la galben a culorii mediului$ %ac9 bacteria nu prezint9 decarboxilaze =n ec.ipamentul

lor enzimatic, mediul r9m@ne galben, iar =n prezen;a acestor enzime, are lor o realcalinizare secundar9 amediului datorit9 form9rii diaminelor (revenirea mediului la culoarea violet)$

4%' se mai poate eviden;ia :i prin extrac;ia diaminei cu cloroform din din cultura dezvoltat9 pe

mediul 8a>na!liger$

3nele bacterii dau rezultate pozitive tardiv, dup9 K!H zile de incubare, datorit9 unei permeabilit9;i

sc9zute pentru 7rn (ex$ Salmonella gallinarum, Escherichia coli)$

/acteriile -pozitive pot genera rezultate fals!pozitive pe mediul FaloP, datorit9 accentu9rii

caracterului acid prin producerea :i acumularea de acetoin9$

A&lica(ii'ercetarea 4%', 7%' :i %8 este indispensabil9 pentru identificarea germenilor din familiile

Enterobacteriaceae, Vibrionaceae :i a bacililor Gram!negativi strict aerobi+ Pseudomonaceae,

Acinetobacter, Alteromonas.

E-iden(ierea tri&tofana0ei0riptofanaza reprezint9 de fapt un complex multienzimatic care produce indol din triptofan (0rp)$

0rp este dezaminat, gener@nd o molecul9 de indol, piruvat :i 58A$ -iruvatul rezultat =n urma acestei

reac;ii este reutilizat =n ciclul rebs, =n timp ce 58A este utilizat =n calea anabolic9 a aminoacizilor$

stfel, calea triptofanazei este o cale generatoare de energie, existent9 doar la bacteriile cu metabolism

de tip fermentativ$ -roducerea de indol este optim9 la p8 cuprins =ntre $C!$", fiind deci in.ibat9 de


18/117

produ:ii acizi rezulta;i =n urma fermenta;iei, de aceea cercetarea indolului se va efectua pe un mediu care

nu con;ine glucoz9$ %egradarea indolului este in.ibat9 de prezen;a nitri;ilor =n mediu$ &ediul nu trebuie

s9 con;in9 nici nitrati, nici nitri;i$ -roducerea de indol este favorizat9 =n prezen;a 72$ Indolul eliberat este

eviden;iat cu reactivul ovacs (paradimetilaminobenzalde.id9 6 8'l 6 alcool isolamilic) care extrage

indolul :i genereaz9 apari;ia unui inel ro:u la suprafa;a mediului$ *tructura pirolic9 a nucleului indolic

exist9 sub o form9 tautomer9 :i reac;ioneaz9 cu func;iunea alde.idic9 a paradimetilaminobenzalde.idei,

gener@nd compusul c.inoidal colorat =n ro:u$ -roducerea de indol se poate eviden;ia practic ap9

peptonat9 sau mediu 3ree!indol Ferguson$

%up9 incubare C". la temperatur9 corespunz9toare se adaug9 reactivul ovac. sau E.rlic.,

eviden;iindu!se apari;ia unui inel ro:u la suprafa;a mediului$

'ontrol de calitate+

- Escherichia coli (6)?

- $lebsiella pneumoniae (!)$

Micrometo!a !e e'i!en,iere a in!olului 0meto!a %otului1

*e depune o ans9 de cultur9 dezvoltat9 pe mediu solid bogat =n 0rp, pe o .@rtie de filtru =mbibat9 =n

%&' (paradimetilaminoacinnamalde.id9), care va forma cu indolul un compus de culoare bleu!

verde$

Rezultate fals!negative+ Pro!idencia sp. :i Clostridium sp. pot degrada indolul format (este indicat9

scurtarea perioadei de incuba;ie)$

Rezultate fals!pozitive+- pigmentul ro:u elaborat de anumite specii de Serratia pot clora reactivul (se recomand9 utilizarea de

benzi impregnate cu reactiv care permit realizarea testului, indolul fiind volatil)?

- utilizarea de medii colorate (8etoen, &ac'one) care pot simula reac;ii pozitive$


19/117

E-iden(ierea de0a%ina0elor 0riptofan!dezaminaza (0%) :i fenilalanin!dezaminaza (-%) catalizeaz9 dezaminarea oxidativ9 a 0rp

la acid indol piruvic (0%) sau la acid fenil piruvic (-%)$ cidul fenil!piruvic, =n prezen;a perclorurii

de Fier genereaz9 un compus de culoare maron$

O6N64R#C64#COO6 5 6#O6

R#C64#COO6 5 N6

7

!e.amina.e

N67 5 reacti' Neler com%lex %ortocaliu

-entru detectarea 0% se utilizeaz9 &ediu 3ree!indol care con;ine 0rp$ %up9 incubare de 2C. se

adaug9 reactivul reprezentat de Fe'lA$

cidul indol!piruvic, =n prezen;a perclorurii de Fier genereaz9 un compus de culoare verde$

%etectarea -% se realizeaz9 pe suspensii bacteriene dense realizate =n ap9 distilat9 cu fenilalanin9$

6 O

N64

C64# C # COO6 C64# CCOO65 234O4

"enilalanin#!e.amina.a 5 N67

L#P(e Aci! "enil%iru'ic 0PPA1

com%lex 'er!ePPA 5 &e45

E'i!en,ierea citein !eul"(i!ra.ei care produce 82* din cistein9$

*e utilizeaz9 bulion cu adaos de $1B cistein9Incubare+ A', 2C!C".

'itire+ banda impregnata cu acetat -b

Interpretare+ r(6) negru (-b* sau Fe*)$

plicatii+ diferentiere enterobacterii ( Proteus !ulgaris#

6SC64C6 0N641 COO6 64S 5 N67 5 C67COCOO6CD#!eul"ura.a

citeina aci! %iru'ic

64S 5 &eSO9 &eS 5 64SO9

negruUrea.a

3reea (582!'7!582) este .idrolizat9 sub ac;iunea unei enzime specifice denumite ureaza, la (58 C)2'7A

care este un compus alcalin$ -entru detectarea enzimei se utilizeaz9 mediul uree!indol (Ferguson) (0rp,

fosfat mono! :i di!potasic, 5a'l, uree, ro:u fenol), mediul '.ristensen (uree, glucoz9, peptone, agar) sau

mediu *tuart$ *e efectueaz9 o suspensie bacterian9 dens9 =n acest mediu, iar dup9 o incuba;ie variabil9


20/117

(de la c@teva minute p@n9 la 2C.) alcanilizarea mediului va determina apari;ia culorii ro:u intens, care

indic9 prezen;a ureazei$ 3reaza fiind o enzim9 constitutiv9, .idroliza substratului se va efectua foarte

rapid (c@teva minute!2. la Proteus#$ 0otu:i, =n unele cazuri, enzima poate fi inductibil9 =n prezen;a ureei,

necesit@nd prelungirea perioadei de incubare p@n9 la H zile$

Tetul ra%i! Urea.a S%ot ! detecteaz9 o ureaz9 constitutiv9 foarte activ9, utiliz@nd un mediu concentrat

=n uree, depus pe benzi de .@rtie Q.atmann, peste care se adaug9 cultur9 de cel pu;in C". dezvoltat9 pe

geloz9s@nge sau geloz9!c.ocolat, urm9rindu!se vira>ul culorii de la galben la roz!violaceu$

64N

64NC O 5 64O

urea.a4N67 5 CO4

uree

Rezultatele fals!pozitive pot fi datorate lipsei specificit9;ii reac;iei de culoare, datorate alcaliniz9rii

mediului, care poate rezulta :i =n absen;a ureazei, de exemplu =n urma activit9;ii proteolitice intense a

unor specii (ex$ Pseudomonas sp.#.

Protea.e

-roteazele sunt enzime extra!celulare cu specificitate sc9zut9, care .idrolizeaz9 proteinele la peptide :i

aminoacizi$

-entru eviden;ierea proteazelor se utilizeaz9 diferite medii+

- Geloza nutritiv9+ bulion nutritiv solidificat prin ad9ugarea de gelatin9$ *e inoculeaz9 prin =n;epare :i

se incubeaz9 la 2o', iar dup9 incubare se vizualizeaz9 lic.efierea gelatinei$ ceast9 metod9 prezint9

dezavanta>ul c9 gelatina se lic.efiaz9 la temperaturi crescute, fiind necesar9 r9cirea mediului pentru

a diferen;ia .idroliza de fuziune$

-

Te(nica &ra.ier, este o metod9 mai sensibil9, :i const9 =n inocularea gelozei nutritive cu gelatin9 prin =ns9m@n;are =n spot :i se incubeaz9 1, 2, A zile la Ao', dup9 care se precipit9 gelatina prin

inundarea pl9cii cu sublimat$ urul coloniilor, datorit9

.idrolizei gelatinei$

- Te(nica "ilmului "otogra"ic$ *e taie un film fotografic expus :i developat =n benzi care se introduc

=n tuburi de .emoliz9 cu suspensii bacteriene foarte dense :i se incubeaz9 tuburile 2C. =n /ain &arie$

8idroliza gelatinei se manifest9 prin eliberarea particulelor negre de g din constitu;ia filmului$ 7


21/117

variant9 a acestei metode este metoda o.n care utilizeaz9 discuri de gelatin9 saturate cu particule

fin pulverizate de '$

- Me!iu cu er !e $ou coagulat se =ns9m@n;eaz9 =n striuri :i se incubeaz9 c@teva zile$ -roteazele vor

determina digestia serului =n regiunea striurilor de cultur9$ cest mediu se utilizeaz9 pentru bacteriile

serofile$

- Gelo.a cu a!ao !e la%te eviden;iaz9 .idroliza cazeinei din lapte$ Geloza nutritiv9 cu lapte este

turnat9 =n pl9ci :i inoculat9 =n striuri sau =n spot$ 8idroliza cazeinei se traduce prin clarificarea

mediului =n >urul culturii$ ceast9 metod9 nu este foarte sensibil9 deoarece .idroliza cazeinei =ncepe

prin formarea paracazeinei insolubile care nu este vizibil9 pe mediul alb, opac$ Este de preferat

utilizarea cazeinei solubile (solubilizate la p8 alcalin) incorporate =n geloz9, caz =n care mediul

r9m@ne transparent, iar =n >urul spotului de cultur9 se poate observa un inel de precipitare$

Meta$olis%ul li&idelor -oate fi abordat practic prin detectarea activit9;ii lipazelor, esterazelor :i lecitinazelor$

!etectarea li&a0elor


22/117

!etectarea estera0elor *e utilizeaz9 mediu gelozat cu adaos de 0QEE5 ", H sau C$ 'el mai utilizat =n practic9 este 0QEE5

" (monooleat de sorbitol)$ *e =ns9m@n;eaz9 mediul =n spot, iar prezen;a 0QEE5!esterazei duce la

apari;ia cristalelor de oleat de 'a26 insolubile (cristale formate =ntre acizii gra:i elibera;i :i ionii de 'a26)$

A%ila0elemidonul este poliza.arid de glucoz9 cu mas9 molecular9 mare care nu poate fi transportat prin

membran9 la interiorul celulei bacteriene, fiind necesara secre;ia de amilaze extracelulare pentru a fi

.idrolizat$

milazele se detecteaz9 utiliz@nd o geloz9 ordinar9 la care se adaug9 amidon de orez, iar .idroliza se

reveleaz9 prin inundarea pl9cii cu 8'l (.alou transparent =n >urul spotului de cultur9) sau solu;ie 4ugol

(inel galben =n >urul spotului de cultur9, =n timp ce restul mediului se coloreaz9 =n albastru)$

B. ME!II M"LTITEST

Mediile multitest permit evidenţierea simultana a mai multor caractere biochimice utile în identificare, utilizând un singur mediu complex.

Me!iul 6aBna#/liger sau gluco.-#lacto.-#"ier, este un mediu gelozat care con;ine pepton9,

glucoz9 ,1B, lactoz9 1B, tiosulfat (sau .iposulfit) :i ro:u fenol$


23/117


24/117

&ediul repartizat =n tuburi con;ine geloza 6 0rp, uree, ro:u metil :i o band9 de .@rtie de filtru

impregnat9 cu reactiv E.rlic.$

&ediul se =ns9m@n;eaz9 prin =n;eapre cu ansa cu fir drept :i se incubeaz9 la A' timp 2C., dup9 care se

vizualizeaz9+

mobilitatea+ bacteriile mobile determin9 opacizarea uniform9 a mediului, spre deosebire de bacteriile

imobile care se dezvolt9 doar pe traseul striului de =ns9m@n;are

producerea de indol (volatil) se vizualizeaz9 prin =nro:irea benzii de .@rtie de filtru

producerea de uree va determina =nro:irea mediului

Me!iul manitol mo$ilitate nitra,i! mediu semigelozat care con;ine peptone, nitra;i, manitol, 57 A

:i ro:u fenol$ cest mediu con;ine nitra;i care in.ib9 activitatea enzimei formiat!.idrogen!liaz9, =n

scopul evit9rii eliber9rii de 82$ *e cite:te mobilitatea, fermentarea manitolului :i reducerea nitra;ilor$

Me!iul IM=iC 0in!ol< rou Metil< =P< citrat1 se utilizeaz9 foarte mult =n controlul microbiologic al

apei potabile, pentru identificarea :i diferen;ierea indicatorilor microbiologici ai calit9;ii apei ( E. coli,

Enterobacter aerogenes)$

C+ SISTEME MICRO#TEST

&etodele moderne de identificare a microorganismelor utilizeaz9 galeriile microtest care permit

identificarea concomitent9 a unui num9r mare de caractere bioc.imice cu consum minim de materiale :i

inocul microbian (se lucreaz9 cu microvolume de prob9)$ ceste sisteme microtest reprezint9 de fapt

varianta modern9, simplificat9 :i standardizat9 a identific9rii microbiene bazat9 pe tabele politetice,fiecare test con;inut =n sistemul de identificare av@nd aceea:i contribu;ie la identificarea speciei$

*istemele microtest constau =n asocierea diferitelor teste individuale (=ntre 12 :i K2) care permite

identificarea unei anumite specii cu un coeficient de probabilitate ridicat$ Galeriile microtest sunt

=nsotite de cataloage de identificare a speciilor microbiene pentru care au fost concepute$ -osibilitatea de

identificare statistic9 asistat9 de calculator cu a>utorul unor programe speciale asigur9 ob;inerea de

rezultate precise :i reproductibile$ *unt disponibile la ora actual9 sisteme de identificare rapid9 foarte

sensibile care permit obtinerea rezultatelor dup9 CK. de incubare$ Exista, de asemenea, sisteme de

identificare rapida cuplate cu determinarea rezisten;ei la antibiotice, foarte utile in &icrobiologia clinic9

(ex$ sistemul ite)$ &etodologia de baz9 este aceea:i :i const9 =n =ns9m@n;area simultan9 a

microvolumelor de prob9 (inocul bacterian standardizat) =n mediile liofilizate sau .idratate con;inute

=ntr!o galerie de identificare$ %up9 o anumit9 perioad9 de incubare, care variaz9 in func;ie de

sensibilitatea testului, se citesc rezultatele conform indica;iilor de utilizare care insotesc aceste teste$

-ozitivarea testelor consta in vira>ul culorii mediilor, direct sau dup9 adaugarea de anumiti reactivi, care


25/117

respecta principiul testelor bioc.imice clasice, individuale$ 0estele pozitive primesc un anumit puncta>,

care ulterior se =nsumeaz9 pe grupe de teste rezult@nd un num9r final alc9tuit din mai multe cifre care

corespunde, =n catalogul de identificare, unei anumite specii bacteriene$ 5umele speciei este =nsotit :i de

coeficientul de probabilitate al identific9rii$ -entru asigurarea reproductibilitatii rezultatelor este

recomandabil ca identificarea unei tulpini microbiene s9 se fac9 simultan din cel putin C colonii$ In cazul

=n care coeficientul de identificare nu este satisf9c9tor sau dac9 num9rul ob;inut nu se reg9se:te =n

catalog, se repet9 testul, respect@ndu!se riguros indica;iile de realizare a testului$ %ac9 pentru num9rul

obtinut, catalogul indica 2 sau A specii posibile cu coeficien;i de probabilitate apropia;i, se realizeaz9

testele suplimentare indicate =n catalog care sa permit9 diferen;ierea respectivelor specii microbiene$

'ele mai utilizate sisteme de identificare la ora actual9 sunt reprezentate de+

! sistemele API ! cu diferite variante pentru identificarea enterobacteriilor (-I 2E), a bacililor Gram!

negativi non!enterobacterii (-I!5E, -I!4isteria, -I! Bacillus, -I!'amp, -I!Staph etc$)?

Tete %o.iti'e )i negati'e o$,inute cu aButorului )itemului API 4@E+

! sistemele MicroID 74 # pentru identificarea streptococilor (I% A2 *trep) :i stafilococilor (I% A2

*tap.)?

Sitemul MICRO#ID !e i!enti"icare a entero$acteriaceelor+

! sistemele Enterotu$e II :i Oxi3&erm tu$e ! pentru enterobacterii :i bacili Gram!negativi aerobi stricti?


26/117

Di"eren,ele !intre itemul neinoculat )i tetele %oiti'e %entru itemul Enterotu$eII+

Di"eren,ele !intre itemul neinoculat )i tetele %o.iti'e %entru itemul Oxi3&erm Tu$eII+

- 88L Crtal ID ! pentru enterobacterii :i bacili Gram!negativi non!fermentativi?

Site

mul 88L Crtal+


27/117

! sistemele de identificare automatizat9

/iolog, &icro*can :i I0E (Fig$"$),

acestea din urm9 permit@nd testarea =n

paralel :i a susceptibilit9;ii la

antibiotice a tulpinii testate$

Car! !e i!enti"icare =ite+

In ciuda multiplelor avanta>e oferite de aceste sisteme microtest, exist9 =ns9 :i limite, datorate mai

ales varia;iilor individuale de tulpin9 (de exemplu, exist9 tulpini bacteriene cu metabolism lent care nu produc cantit9;i de enzime suficiente pentru pozitivarea testelor =n intervalul de incuba;ie recomandat,

astfel c9 aceste teste :i inclusiv diagnosticul microbiologic vor fi interpretate eronat)$ %e aceea, este

recomandabil ca =n cazul =n care tabloul clinic al bolii infec;ioase, caracterele de cultur9 :i colonie sau

testele de screening nu converg cu rezultatele identific9rii cu a>utorul sistemelor multitest, s9 se repete

identificarea cu a>utorul testelor individuale care pot fi mentinute timp de zile$


28/117

Mo!ul !e lucru cu itemele API 4@E+


29/117

Mo!ul !e lucru cu itemul Enterotu$eII


30/117

Diagnoticul etiologic al in"ectiilor cu Staphylococcus

*tabilirea etiologiei unei infectii stfilococice se practica la bolnavul infectat si la purtatorul sanatos$

Etapele diagnosticului etiologic+

1$ -relevarea produsului patologic+ puroi, lic.ide purulente, sputa, urina, singe$

In momentul prelevarii produsului patologic se iau masuri de asepsie necesare prevenirii contaminarii produsului prelevat cu stafilococi de pe tegumente$

-rodusele patologice cu microbiota bogata (ex$ materiile fecale) trebuie refrigerate sau insamantate

imediat, pentru a preveni modificarea proportiei initiale de specii bacteriene, prin inmultirea rapida a unora

dintre ele$

4a prelevarea sangelui prin .emocultura se foloseste un antiseptic la nivelul punctiei venoase, pentru a

se evita introducerea unui stafilococ de pe tegumente$

%in produsul patologic prelevat se poate efectua un frotiu direct colorat cu albastru de metilen si care se

observa la microscop$ Examenul microscopic direct al produsului patologic ne permite sa observam prezenta

cocilor fagocitati de leucocite si are o valoare orientativa asupra etiologiei infectiei stafilococice

2$ Insamantarea produsului patologic in nvederea izolarii in cultura pura$

In functie de gradul de contaminare, produsele patologice pot fi+

! necontaminate (4'R, lic.ide de punctie, urina, sange corect recoltat)

! moderat contaminate (sputa, tesuturi)

! intens contaminate (materii fecale, alimente, voma)$

Insamantarea produselor necontaminte si moderat contaminate poate fi facuta pe medii uzuale ca

bulionul si geloza nutritiva, dar se prefera geloza!sange de oaie pe care se insamanteaza prin descarcarea ansei

pentru a obtine colonii izolate$ *angele uman nu este recomandat sa se foloseasca, deoarece contine in.ibitorinespecifici si eventual anticorpi antistafilococici care pot interfera cu izolarea in cultura pura$

-robele se termostateaza la A' timp de 1"!2 ore$ 'oloniile de stafilococ se dezvolta abundent si

caracteristic pe geloza!sange$ %iametrul coloniilor este de 1!Amm, aspectul de colonii *, bombate, lucioase,

opace, cu margini regulate, de consistenta cremoasa, de culoare galben!aurie$ 'oloniile ce se dezvolta pe mediu

cu sange poat fi incon>urate de o zona circulara de .emoliza completa$

'aracter Staphylococcus

aureus

Staphylococcus

epidermidis

Staphylococcus

saprophyticus

'oagulaza 6 ! !Rezistenta

la novobiocina

! ! 6

% !

manitol

xx

6 ! d

-igment 6 ! !


31/117

A$ Identificarea si diagnosticul diferential cu specii inrudite

%in cultura pura de 1"!2 ore in bulion gluconat se fac urmatoarele subculturi+

a)$ %e agar ange !e oaie

Insamantarea se face in spot, pentru controlul .emolizei$

&area ma>oritate a tulpinilor de S. aureus sunt .emolitice$Exista insa unele tulpini de S. aureus care nu sunt .emolitice, iar unele tulpini de S. epidermidis pot

prezenta o zona discreta de .emoliza$

8emoliza totala de tip beta este data de alfa .emolizina$

Dona de .emoliza la A' data de beta .emolizina poate fi discreta si atunci este necesara

mentinerea 2!2C ore la 6C'$

b)$ in tu$uri cu $ulion cu a!ao !e manitol i in!icator !e %6

Fermentarea manitolului este o caracteristica relativ constanta a S. aureus$

S. epidermidis nu fermenteaza manitolul

'itirea rezultatelor se face dupa C" ore, deoarece exista tulpini de S. aureus ce fermenteaza lent

manitolul$

c)$ %e me!iu electi' (i%erclorurat C(a%mann

Insamantarea se face prin descarcarea ansei pentru a obtine colonii izolate$

'itirea rezultatelor se face dupa o termostatare de 2C si C" ore$

'oloniile de S. aureus se dezvolta bine si produc vira>ul de culoare al indicatorului de p8 ce indica

fermentarea manitolului$

S. epidermidis creste greu sau este in.ibat de mediul selectiv$

d)$ tetul e'i!entierii coagula.ei

*e folosesc doua te.nici de evidentiere a coagulazei stafilococice+

! una pune in evidenta coagulaza legata sau Sclumping )actor O printr!o te.nica simpla de aglutinare

pasiva pe lama, in prezenta de .ematii sau particule de latex sensibilizate cu fibrinogen

! a doua evidentiaza coagulaza libera, difuzibila, printr!o te.nica in tuburi, cu plasma de iepure$

e)$ tetul e'i!entierii catala.ei

Evidentierea activitatii catalazei se realizeaza prin punerea in contact a culturii de

cercetat cu o picatura de per.idrol diluat 2B!AB$ 'ultivarea tulpinii de cercetat trebuie

facuta pe un mediu solid care sa nu contina sange deoarece .ematiile contin catalaza si reactia

este asfel fals pozitiva$ Reactia pozitiva consta in aparitia efervescentei si diferentiaza cocii

gram pozitivi din familia Micrococcaceae de cei din familia Streptococcaceae$ *tafilococii

sunt coagulazo!pozitivi, streptococii si pneumococii nu produc catalaza$

*e foloseste in paralel, ca martori pozitivi si negativi ai reactiei si o tulpina de enterococ si una de

stafilococ auriu$

e)$ tetul e'i!entierii "o"ata.ei

*e foloseste pentru diferentierea speciilor de stafilococ$

S. aureus poseda in ec.ipamentul sau enzimatic fosfataza, enzima ce desface molecula de fosfat de

fenolftaleina punand in libertate fenolftaleina$ -rezenta fenolftaleinei libere se evidentiaza in mediu bazic,


32/117

*e foloseste agar nutritiv cu adaos de ,1B fosfat de fenolftaleina$

-laca cu agar se imparte in sectoare$ *e insamanteaza doua tulpini de control+ una pozitiva ( S.

aureus) si una negativa (S. epidermidis) si in restul sectoarelor tulpinile de analizat$ 'ulturile se insamanteza 1"!

2 ore la A', apoi se pune pe capacul cutiei -etri un disc de .artie de filtru imbibata in amoniac$ %upa 1!2

minute coloniile ce contin fosfataza se coloreaza in roz!rosu$

Diagnoticul !e la$orator al in"ectiilor tre%tococice

I.olarea in cultura %ura

Insamantarea prelevatelor monomicrobiene se face pe medii agarizate, suplimentate cu

KB sange din berbec si#sau in bulion nutritiv suplimentat cu 2L glucoza$ 0oti streptococii

cultiva optim la Ao', iar culturile pot fi examinate dupa 2C.$

!streptococii de grup / si % tulbura omogen mediul

-cei de grup , ', G au o crestere granulara, cu sediment rapid, cu supernatant limpede sau usor

tulbure$

*treptococii piogeni de grup si / formeaza pe geloza!singe colonii alb cenusii beta!.emolitice

*treptococii de grup % (enterococii) !formeaza pe geloza!singe colonii alb cenusii cu T de circa 1mm ,

transparente initial, opace in cultura vec.e, ne.emolitice sau U .emalitice$

'oloniile de pneumococi sunt gri!opace au circa 1mm diametru, U .emolitice

asemanatoare cu ale streptococilor viridans$ %upa incubare in atmosfera cu KB '7 2 zona de

U!.emoliza se largeste$ -rogresiv uneori in cateva ore coloniile pneumococilor devine

crateriforme datorita autolizei enzimatice$ 0ulpinile virulente formeaza colonii transparente

mucoide la care autoliza este mai rapida si frecvent completa incat pe suprafata mediului se

observa numai urma coloniilor$

Tete !i"erentiale

Tetul eni$ilitatii la 'ancomicina diferentiaza genurile Staphylococcus, Enterococcus,

%actococcus care sunt sensibili la vancomicina de genurile %euconostoc si Pediococcus care sunt rezistente$

Tetul la o%toc(in

%iferentiaza prezumtiv streptococii U .emolitici in pneumococi sensibili la optoc.in si streptococi

viridans rezistenti$ 'and sensibilitatea la optoc.in nu este concludenta se impune realizarea testului de biloliza$

Tetul $iloli.ei se bazeaza pe reducerea bilei sau sarurilor biliare de catre penumococi, proces care duce

la accelerarea autolizei$ 0oate tulpinile capsulate de S. pneumoniae sunt lizate, in timp ce tulpinile necapsulate de

S. !iridans sunt rezistente$

Tetul $ila eculina 08E1 este pozitiv pentru enterococi si stafilococii de grup % care cresc pe mediu

cu CB bila si .idrolizeaza esculina determinand innegrirea mediului$

Tetul tolerantei la are este pozitiv pentru ma>oritatea speciilor de Enterococcus care se dezvolta in

bulion cu H$K 5a'l in 2C!2. la AK!Ao' in timp ce tulpinile de Streptococcus nu se dezvolta in acest mediu$


33/117

Creterea la 2@#9oC permite identificarea prezumtiva a enterococilor care se dezvolta la 1!CKo' $

0estul -MR (4! prrolidonl , V!nap.tilamida) este 1B pozitiv in exclusivitate pentru streptococii de grup ,

spre deosebire de streptococii V .emolitici non $

Tetul CAMP

&a>oritatea streptococilor de grup / produc o proteina difuzibila (factorul '&-!'.ristie tins&uenc. -eterson) care actioneaza sinergic cu V!.emolizina stafilococica si determina liza completa a .ematiilor

pe geloza!singe$

Diagnoticul imunologic ra%i! urmareste in principal evidentierea poliza.aridului capsular de Str.

pneumoniae, direct in prelevatele patologice (4'R, sange) prin te.nici imunologice rapide de aglutinare pasiva,

coaglutinare sau contraimunoelectroforeza$ Reactia de umflare a capsulei este o metoda mai specifica pentru

detectarea si identificarea microscopica a pneumococilor din diferite produse (4'R , exsudat pleural, peritoneal,

aspirat tra.eobronsic, sputa)$ Reactia anticorpilor .omologi cu poliza.aridul capsular face mai evidenta aceasta

structura mai refrigerenta mai bine conturata$ %ata fiind diversitatea serotipurilor de S. pneumoniae sunt utilizate

initial seruri polivalente$

I!enti"icarea enterococilor

Enterococii sunt coci Gram pozitivi, ovali sau cocobacili), imobili (cu cateva exceptii)

si nesporulati cresc intre 1' si CK', optim la A'? se multiplica la p8 W,H$ -ot supravietui

dupa A minute de incalzire la Hc$

*e cultiva in bulion cu H,KB 5a'l , .idrolizeaza esculina in prezenta a CB bila sau

saruri biliare $'ontin antigen specific de grup *.

Genul Enterococus a fost recunoscut in 1W"C ca avind doua specii+ Enterococcus )aecalis si Enterococcus )aecium, separate din genul Streptococcus pe baza diferentierierilor

genetice$

In prezent au fost confirmate prin .ibridare %5!%5 si prin caracterele bic.imice

1W specii de enterococi$


34/117

Diagnoticul etiologic al in"ectiilor cu E. coli # eta%e

1$ Prele'area %ro!uului %atologic+ sange, urina, materii fecale, bila, puroi, exudate, lic.id

cefalora.idian, alimente, varsaturi, organe, etc$

4+ I.olarea in cultura %ura! se face pe medii selective, solide

! pe mediu &c'one ! coloniile de E. coli sunt rosii (mediul de cultura din >urul lor devine rosu si

opalescent)

! pe mediu 4evine coloniile de E. coli au culoare rosie, cu luciu metalic

! mediile de cultura se examineaza dupa incubare 2C!C" ore

7+ I!enti"icarea tul%inilor !e E+coli # eta%e

! examen microscopic al culturilor in mediu lic.id pe preparate proaspete lama!lamela pentru

evidentierea mobilitatii

! examenul caracterelor de cultura pe medii selective solide

! examen microscopic pentru evidentierea proprietatilor morfo!tinctoriale coloratie Gram

! testarea proprietatilor bioc.imice biotipizare

sisteme conventionale+ testul oxidazei

sisteme de identificare bioc.imica multitest+ 0*I , &I3, &I4F

sisteme microtest+ -I 2E, Enterotube II, &icroI%

identificare sistem automat

9+ I!enti"icare erologica

! clasic reactii de aglutinare pe lama cu seruri aglutinante anti E$ coli ! enteroinvaziv! determinarea enterotoxigenitatii tulpiunilor de E$coli$


35/117

Diagnoticul etiologic al in"ectiilor cu Salmonella # eta%e

2+ Prele'area %ro!u %atologic

4+ I.olarea in cultura %ura

! se face pe medii selective, solide

a)$ pe medii moderat selective (cu putere in.ibitorie medie, ce permit dezvoltarea speciilor lactozo!

nefermentative)+ mediu %'4, mediu cu rosu fenol

! mediile de cultura se examineaza dupa incubare 2C!C" ore

! %'4+ coloniile de *almonella sp$ *unt semitransparente, rotunde, lucioase, la " ore devin negre

in centru, evidentiind producerea de .idrogen sulfurat

! mediu cu rosu fenol+ colonii translucide sau transparente, incolore

b)$ pe medii inalt selective (cu putere in.ibitorie mare)

! mediu Qilson!/lair+ colonii negre, plate, rugoase, incon>urate de un .alou negru, cu luciu metalic

! mediu cu verde brilliant+ colonii rosu!visiniu

! mediu Istrati!&eitert7+ I!enti"icarea tul%inilor !e Salmonella %+ # eta%e



! examenul caracterelor de cultura pe medii selective solide

! examen microscopic pentru evidentierea proprietatilor morfo!tinctoriale coloratie Gram

! testarea proprietatilor bioc.imice biotipizare

sisteme conventionale+ testul oxidazei

sisteme de identificare bioc.imica multitest+ 0*I , &I3, &I4F

sisteme microtest+ -I 2E, Enterotube II, &icroI%

9+ I!enti"icare erologica

! serotipizare

+ Li.oti%i.are

;+ Determinarea eni$ilitatii la anti$iotice

Diagnoticul etiologic al in"ectiilor cu Pseudomonas aeruginosa

! etape

1$ -relevarea produs patologic

2$ Izolarea in cultura pura

! se face pe medii selective, solide+ 'etrimide agar

A$ Identificarea tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sp$ ! etape




36/117

! examen microscopic pentru evidentierea proprietatilor morfologice+ coloratie Gram

! testarea proprietatilor bioc.imice

testul oxidazei

testul catalazei

testul reducerii nitratilor pigmentogeneza

sisteme microtest+ -I 25E

Diagnotic etiologic al !i.enteriei $acilare

1$ Prele'area %ro!uului %atologic! recoltarea materiilor fecale, pe cat posibil inainte de administrarea

de substante cu actiune antimicrobiana

4+ Inamantarea %e me!ii !e cultura electi'e au !i"erentialea) Me!ii electi'e+

! mediul 4eifson varianta recomandata de Inst$ de Epidemiologie

Experimentala din R$%$G$ X$ *edla, 8$ Risc.e+ Enterobacteriaceae

Infetionen, 1WH", E/, G$ 0.ieme, pag$ 12H$

! arianta %'4 a mediului 4eifson, livrabila de catre Insitutul

'antacuzino$

! &ediul cu bila uscata Istrati!&eitert (I&), livrabil de catre Insitutul

'antacuzino$

*e pot utiliza si alte medii selective, ca mediul *!*, variante cu

desoxc.olat!citrat ale mediului 4eifson sau ale mediului Istrati!&eitert

(I&), ca de exemplu mediul I& cu $KB desoxc.olat de sodiu (acesta din

urma cu o selectivitate moderata si o capacitate de in.ibare mai redusa

pentru germenii patogeni)$

b) Me!ii !i"erentiale+


37/117

! &ediul gar lbastru de /romtmol!4actoza (/04) livrabil de

catre Institutul 'antacuzino$

In cazul suspiciunii unei infectii cu Shigella dysenteriae tip 1 (*.iga) este

necesara utilizarea si unor medii mai putin in.ibante (ca de ex$ &ediul

&ac 'one), precum si a unui mediu diferential (/04)$

Este indicat, in special pentru diagnosticarea primelor cazuri dintr!o

epidemie, ca si in formele clinice atipice sau fruste sa se insamanteze cate

2!A placi cu mediu selectiv si mediu diferential cu cantitati diferite de

inocul (1, 2 si C picaturi respectiv anse de inocul pentru cate o placa)$ %e

asemenea, se recomanda atat pentru diagnosticul dizenteriei acute sau

cronice, cat si pentru depistarea purtatorilor, sa se utilizeze pe cat posibil,

insamantarea pe cel putin 2 medii selective, dar in care substanta activa se

afla in concentratie diferita (de ex$ mediul %'4 sau mediul I& din care

se prepara loturi cu 2$K B si respectiv KB desoxc.olat de sodiu)$

7+ Incu$area %lacilor inamantate se face la A Y' timp de 1"!2

ore$

Este recomandabil sa se efectueze si o incubare suplimentara a

acelorasi placi, de inca 1"!2C ore, care uneori evidentiaza colonii de

germeni patogeni care nu se dezvolta decat dupa o incubare prelungita$

Examinarea placilor insamantate si incubate se face in vederea

recunoasterii si repicarii coloniilor lactozo!negative, care dupa aspectul lor

morfologic pot fi suspectate ca apartinand unor specii din genul *.igella$

or fi examinate si repicate un numar cat mai mare de colonii lactozo!

negative nu sunt vizibile (putand fi eventual mascate) se recomanda

urmatoarea metoda+ se tine 2!A secunde un tampon imbibat cu amoniac


38/117

sau c.iar sticla de amoniac fara dop sau placa desc.isa, intoarsa cu

suprafata mediului in >os$ In acest fel coloniile lactozo!negative, care au

devenit galbene din pricina unui numar prea mare de colonii de b$coli isi

recapata culoarea verde si pot fi cu usurinta recunoscute$

C+ I!enti"icarea coloniilor u%ecte+

! in cazul in care in placa predomina coloniile de Shigella (de ex$ in

cazul unui bolnav acut) se pot efectua reactii de aglutinare pe lama cu

seruri neabsorbite si absorbite livrate de Institutul 'ntacuzino$

'oloniile investigate prin aglutinare vor fi intotdeauna si repicate?

! in cazul in care in placa se gasesc putine colonii suspecte se pot efectua

un nmar redus de reactii de aglutinare pe lama, incepandu!se cu serurile

corespunzatoare speciilor si serotipurilor mai frecvent intalnite la noi in

tara (Sh. )lexneri 2a, 1b, Aa, Sh. sonnei)$

Identificarea serologica pe lama este efectuata in functie de frecventa

speciilor si serotipurilor de Shigella sp$ din tara noastra cu seruri de

diagnostic neabsorbite in ordinea urmatoare+

o ser aglutinant polivalent Flexner

o ser aglutinant *onne * (faza I)

o ser aglutinant *onne R (faza II)

o ser aglutinant *c.imtz

o ser aglutinant /od '1

o ser aglutinant /od '2

o ser aglutinant /od 'A

o ser aglutinant polivalent 4arge!*ac.s


39/117

o ser aglutinant *.iga

In cazul in care se obtin reactii de aglutinare pozitive pe lama cu serul

aglutinant Flexner se trece la efectuarea de reactii de aglutinare cu seruri

absorbite Flexner de tip si de grup (in urmatoarea ordine+ serurile de tip II, I,III, I, , I si serurile de grup A, C? H si , ", W)$ *tabilirea cu a>utorul

serurilor Flexner absorbite a serotipului *.igella fexneri (conform sc.emei

din nexa nr$ 2b), constituie totodata si o confirmare a diagnosticului de

specie care va fi insa completata si cu cercetarea caracterelor bioc.imice$

! -entru tulpinile care au aglutinat cu serurile polivalente /od '1, '2, 'A

reactia rosu!metil si polivalent 4arge!*ac.s, reactiile de aglutinare cu seruri

monospecifice se efectueaza de catre 'entrul 5ational pentru tulpini si

/acteriofagi Shigella din Insitutul 'antacuzino$

0oate tulpinile posedand caractere bioc.imice de Shigella, dar inaglutinabile

cu serurile anti!Shigella, vor fi cercetate din punct de vedere al

aglutinabilitatii si dupa termoinactivare (1 ora la 1 Y') in vederea

inlaturarii unor eventuale antigene de suprafata$ *uspensia care setermoinactiveaza se prepara dintr!o cultura de 2C ore pe geloza inclinata,

suspendata in aproximativ 2 ml solutie cloruro!sodica $"KB$ 5u pot fi

utilizate decat suspensii care dupa termoinactivare nu prezinta

aglutinabilitate spontana$

E'i!entierea caracterelor $ioc(imice

*unt cercetate utilizand inocul prelevat din sectoarele cu repicari$ *c.ema

minimala de diagnostic bioc.imic cuprinde cercetarea urmatoarelor reactii

bioc.imice+

! producerea de gaz din glucoza


40/117

! comportarea fata de lactoza, manita, salicina, adonita, inozita

! reactia indol

! cresterea pe mediu *immons

! producerea de 82*

! reactia oges!-rosauer

! comportarea fata de uree si malonat

! prezenta lizindecarboxilazei

Caractere !e %atogenitate

0estul *eren (eratocon>uctivita cobaiului)$ *e recomanda pentru

diagnosticul complementar al tulpinilor de Shigella recent isolate, care

prezinta in proportie de 1B un test pozitiv$

0e.nica de lucru+ colonia suspecta de pe mediul cu bila se trece pe o

geloza simpla, inclinata$ %upa H!" ore sau a 2 a zi, daca situatia clinica sau

epidemiologica nu reclama urgenta, se incarca bine o ansa (de $HK 1 mmgrosime) cu cultura dezvoltata si se introduce sub pleoapa oc.iului unui

cobai (de orice varsta sau greutate)$ *ub pleoapa se fac cateva miscari

adecvate pentru a goli ansa de incarcatura microbiana, cu gri>a insa de a nu

leza mucoasa con>uctivala$ *e recomanda sa se faca acelasi lucru si la

celalalt oc.i$

%upa 12 ore (sau cel mult 2C de ore) in cazul cand germenii inoculati fac

parte din grupul Shigella, va aparea o congestie con>uctivala, o secretie

mucopurulenta mai mult sau mai putin abundenta si o opacifiere a corneei$

In urmatoarele ore si zile, toate aceste fenomene se accentueaza, a>ungand

pana la eratocon>uctivita$ /oala la cobai dureaza 1C!21 zile in medie si intr!


41/117

un anumit procent se cronicizeaza, putand a>unge la ulceratii corneene$ In

mod obisnuit insa, restitutia clinica si anatomica este integrala si numai

arareori animalul moare$ %upa cel putin o luna de la vindecare cobaii pot fi

refolositi in acelasi scop$

tragem atentia ca pe tot timpul bolii, cobaii fiind eliminatori de germeni,

prin secretiile oculare si uneori c.iar prin materiile fecale, sunt contagiosi,

atat pentru alti cobai, cat si pentru personalul de laborator$

cest lucru impune o gri>a deosebita pentru prevenirea contaminarii, fie a

cobailor, fie a personalului care manipuleaza animalele bolnave$ 'obaii vor

fi tinuti in borcane separate$ /orcanul va fi acoperit cu tifon pentru a preveni

patrunderea mustelor$ Ingiena personalului ingri>itor trebuie sa fie

exemplara, atat pentru protectia lui proprie, cat si pentru a nu permite

transmiterea bolii la alti cobai sau c.iar oamenilor$

2$ testul de punere in evidenta a exotoxinei *.iga (pe soarecele alb) se

efectueaza la nivelul 'entrului 5ational de Referinta Shigella din Insitutul

'antacuzino, pentru tulpinile suspectate a apartine speciei *.iga (*.igelladsentariae tip1)$

-astrarea tulpinilor de Shigella in laborator se va face pe geloza $2B

dreapta (coloana K! cm), p8 Z $H!$" fiind apoi (dupa incubare de 2C ore

la AY') inc.ise ermetic (cu dop de cauciuc sau parafinate)$ -astrarea

tulpinilor se face la temperatura camerei si la intuneric (A de zile pe

geluloza moale $2B si H luni pe mediul %orset, dupa care este nevoie de onoua trecere)$ *e atrage atentia asupra faptului ca tulpinile de Sh.

dysenteriae tip 1 (*.iga) nu pot fi pastrate pe geloza inclinata sau in placi

mai mult de 2C!C" ore$


42/117

'oprocultura

0'/*

o picatura din

agar neselectiv

Izolare si identificare tulpini E$ c.olerae 1#1AW('%'#Q87 2A)

suspensie

scaun lic.id

1"!2.

-alc

-alc

H!". # AK!A'

H!". # AK!A '

(inalt selectiv, nu necesita an[$are)

0*Ireactia oxidazei(1 sec)

0otal AH!KC ore

2C!2 ore

0imp

1"!AC ore

(A sec ! 1 min)

*er fiziologic *er polivalent 1

(!)(6) (!)

*er 1AW

in caz (6)

*er ads

In

*er ads

7g

confirmare

R$aglutinare

4aborator


43/117

Izolare si identificare tulpini E$ c.olerae 1#1AW#I' 2

'oprocultura4aborator 0imp

1H!2C ore,-alc (I i[$)

%irect#m$ [$$

,palc (II!a I[$)

/*,60'/*

/*,60'/*

idem

,spect colonie

oxidaze

,glutinare (Asec!1min)

(6)

*er fiziologic*er polivalent 1

*er ads

7g

*er ads

In

'5R


44/117

Schema diagnostic de certitudine Vibrio cholerae

Gl 4ac D &z &n ra d In Idc 7dc %8 &6 ! 6 6 6 ! ! ! 6 6 ! (Gl)

gaz !

tub %ur.am


45/117

&ulpini V. cholerae non +,

a$ producatoare de toxine

b$ enteroinvazive

c$ enteropatogene

d$ inerte din punct de vedere biologic

enterotoxine tip '0 (tulpini c.olera!lie)

toxina sto (*0)

.emolizinesimilare celor

de la E$ c.$ 1$$$

similare celor de la

E$ para.aemolticus


46/117

Etapele reaciei M -E%/SA pentru detectarea C&

1G&1

(receptor pentru '0)fixat pe fundul

godeului

2G&1 6

'0(din supernatant)

AG&16'06

c anti '0

CG&16'06

c capra anti '0 6c oaie (anti capra),marca;i cu fosfataz9

alcalin9

Kca la C

6substrat

[$gen careinterac;ioneaz9

cu enzima! devine colorat

'0

ccapr9anti '0

Flcc oaieanti capr9marca;i

*ubstan;acromogen9

Flc

ormula lichidului de rehidratare 0MS 1elsol#

0abel H

'l5a/icarbonat 5a'l glucoz9ap9 distilat9

A,K2,K1,K2

1 ml

[$[$[$[$[$

Rp$


47/117

E=IDENTIEREA POTENTIALULUI DE =IRULENTA SI PATOGENITATE PRIN TESTE I VIT!"

#eterminarea capacitatii !e a!erenta i in'a.ie a tul%inilor $acteriene la un u$trat celular< %rin

meto!a Cra'ioto )i cola$ 02F?F1+

&odelul utilizeaz9 ca substrat celular sensibil liniile celulare 8Ep!2 ( $ uman Epithelioma) sau 'a'o!2(linie de celule intestinale, de origine tumoral9 ! Carcinom Colonic)$ -entru cultivarea acestei ultime linii este

necesar9 ad9ugarea la mediul pentru culturi celulare a unui supliment nutritiv numit I+T+S+ – 1 I nsulin

T rans)errine S elenium#- Sigma, care permite ob;inerea unui monostrat cu confluen;9 "B pentru realizarea

testului de aderen;9 =n C" de ore, aceste celule av@nd =n mod normal o cre:tere foarte lent9 in !itro$ 'elulele sunt

cultivate =n mediu Eagle &E& (E&E&) (Gibco), cu adaos de 1B ser fetal de vi;el, glutamin9 1B, solu;ie

penicilin9!streptomicin9 1B, solu;ie fungizon 1B, I0* 1B$

*e utilizeaza culturi de 1" ore =n bulion nutritiv din care se prepara suspensii bacteriene =n 0F*, cu

densitate optic9 %$7$ Z 2 (m9surat9 spectrofotometric la λ Z H nm), care corespunde densit9;ii celulare de 1 x

1W 3$F$'$#ml$

Determinarea calitati'a a ca%acitatii !e a!erenta

*e adauga cate 1 ml de suspensie bacterian9 peste monostratul celular, dup9

=ndep9rtarea mediului de cre:tere suplimentat cu antibiotice :i spalarea (de A ori) cu mediu

f9r9 antibiotice$

%up9 repartizarea suspensiilor bacteriene peste monostratul celular, pl9cile se

incubeaza la AY', timp de 2 ore, timp =n care bacteriile ader9 la suprafa;a celulelor

substratului? se spala monostratul celular infectat, cu 0F* (Ax)$*e fixeaza cu metanol (K min)$

*e coloreaza celulele aderate cu solu;ie Giemsa! 2 min$

*e spala godeurile cu ap9 de robinet$

*e usuca :i se examineaza la microscopic cu 7$I$, determin@ndu!se pattern!ul de

aderen;9 (localizat, difuz sau agregativ) :i num9rul de celule aderate 6 invadante$

Determinarea cantitati'a a ca%acitatii !e a!erenta i in'a.ie

&iecare tul%ina !e tetat e 'a inocula in 4 go!euri%upa primele 2 ore de incubare se adaug9 c@te 1 ml de mediu cu gentamicin9 =ntr!unul din cele 2

godeuri$

d9ugarea gentamicinei are rolul de a omor= toate bacteriile aflate =n mediul

extracelular, supravie;uind doar bacteriile care au invadat celulele substratului$


48/117

*e fac dilu;ii zecimale din suspensiile din fiecare godeu (p@n9 la dilu;ia 1#1 ") =n ap9 fiziologic9 steril9 (F*),

care se =ns9m@n;eaz9, c@te 1µl din dilu;iile ob;inute, pe geloz9 nutritiv9 =n pl9ci, =n triplicat , pentru

determinarea 3$F$'$#ml (se face media nr$ de colonii)$

oac9 rol de enterotoxin9 :i a

c9rei ac;iune toxic9 a fost demonstrat9 =n teste de patogenez9 experimental9 (aceast9

enterotoxin9 determin9 acumularea de lic.id =n ansa ligaturat9 de iepure, ceea ce

demonstreaz9 inducerea de pori =n enterocite :i alterarea pattern!ului secretor al


49/117

acestor celule)$ Detectarea %ro!ucerii !e (emoli.ine s!a eviden;iat prin =ns9m@n;area

bacteriei de cercetat pe geloz9 repartizat9 =n pl9ci -etri cu adaos de KB s@nge de oaie

sau s@nge de iepure (eviden;ierea .emolizinelor anagaPa)$ %up9 incubare la A '

timp de 2C. s!a vizualizat apari;ia zonelor de .emoliz9 =n >urul coloniilor, sub forma

unui .alou transparent, clar, caracteristic pentru tulpinile beta!] .̂emolitice (care

realizeaz9 o .emoliz9 complet9, =n care .emoglobina eliberat9 din .ematii sub

ac;iunea beta!].emolizinelor este degradat9 total p@n9 la produ:i finali de metabolism)

sau verzui caracteristic tulpinilor alfa!.emolitice^ _ care realizeaz9 o .emoliz9 partial9, =n

care .emoglobina este degradata doar partial de catre bacterii la met.emoglobin9)$

Dona de .emoliz9 poate fi accentuat9 prin p9strarea pl9cilor la frigider c@teva ore

=nainte de citirea rezultatelor (4azar si colab$, 2C)$

Tetul !e e'i!en,iere a "actorului CAMP )i a "actorilor CAMP#li%e

3nele bacterii posed9 .emolizine incomplete, care pot induce formarea de pori =n membrana

eritrocitelor doar =n prezen;a unei enzime solubile denumite s)ingomielina4a C , secretat9 de tulpini de S.

aureus β−.emolitice$

-entru detectarea acestor factori '&- sau '&-!li3e, tulpinile de cercetat s!au =ns9m@n;at sub

form9 de striuri paralele pe geloz9!s@nge, iar perpendicular pe aceste striuri, la " mm distan;9, se =ns9m@n;eaz9

o tulpin9 de S. aureus β− .emolitic9$ -rezen;a factorului '&- este indicat9 de apari;ia unei zone

sinergice, m9rite, de .emoliz9 complet9 la extremitatea striurilor din vecin9tatea tulpinii de S. aureus

β−.emolitic9, cu aspect de Ns9geat9O, =n timp ce pe restul lungimii striului de cultur9 se observ9 .emoliz9

incomplet9 sau c.iar absen;a .emolizei (4azar si colab$, 2C)$

6emoli.inele ta"ilococice au o activitate biologica foarte variata, avand in principal actiune

(emolitica< letala i !ermonecrotica$ 4a S. aureus sunt descoperite C tipuri de .emolizine, distincte

antigenic+ alfa, beta, gamma si delta$ 0ulpinile de stafilococ patogene pentru om prezinta cel mai

frecvent asociatia de alfa si delta .emolizine ("2B)$ l &a to'ina (al&a hemoli)ina* are actiune

.emolitica asupra eritrocitelor de oaie si de iepure, foarte slab asupra .ematiilor umane, isi exercita

agresivitatea asupra tuturor tesuturilor organimului, inclusiv asupra macrofagelor si trombocitelor,

actiunea citolitica nu se exercita asupra monocitelor care au rezistenta fata de alfa .emolizine$ +etato'ina (,eta hemoli)ina* este o sfingomielinaza care actioneaza asupra structurilor sfingomielinice

din membrana eritrocitara la A' si .emolizeaza specific eritrocitele de oaie, dar nu si .ematiile umane si

de iepure$ ceasta enzima realizeaza o .emoliza cald! rece, manifestata prin accentuarea neta a

procesului de .emoliza la 6C', care incepe prin incubarea la A' timp de 1"!2 ore$ Gamma to'ina

(gamma hemoli)ina* exercita actiune litica asupra eritrocitelor de iepure, om, oaie, leucocitelor si

limfoblastelor umane$ #elta to'ina (delta hemoli)ina* are actiune .emolitica asupra .ematiilor umane,

de oaie, de iepure, dar si aspra altor eritrocite si actiune citolitica asupra neutrofilelor, limfocitelor,

trombocitelor si macrofagelor$ 3nele tulpini de stafilococ coagulazo! negative pot produce o enzima

citolitica denumita epsilon hemoli)ina$ Pseudomonas aeruginosa produce .emolizine termostabile silecitinaze care actioneaza local la nivelul focarului de infectie$


50/117

Detectarea %ro!ucerii !e alte toxine "ormatoare !e %ori

Lecitina.ele si li%a.ele sunt enzime implicate =n patogeneza unor tulpini bacteriene

prin capacitatea lor de a induce formarea de pori =n membrana celulelor eucariote, prin

alterarea con;inutului lipidic al acesteia$ stfel, =n cursul infec;iei aceste enzime pot

ac;iona ca toxine formatoare de pori, fiind responsabile de simptome ca diareea apoas9

caracteristic9 infec;iei .olerice$ -entru evidentierea %ro!ucerii !e lecitina.-, culturile

sunt =ns9m@n;ate =n spot pe mediu solid cu galbenu: de ou :i incubate la Ao' p@n9 la

zile$ -rezen;a unei zone opace (de precipitare) =n >urul ariei de cre:tere a indicat

producerea de lecitinaz9$ -entru evidentierea %ro!ucerii !e li%a.- culturile sunt

=ns9m@n;ate =n spot pe mediu solid cu adaos de 0Peen " =n concentra;ie final9 de 1B :i

sunt incubate la Ao' p@n9 la zile$ -rezen;a unei zone opace (de precipitare) in >urul ariei

de cre:tere a indicat producerea de lipaz9$ Li%a.ele stafiloccocice actioneaza asupra

lipidelor plasmatice si a grasimilor de pe suprafata tegumentelor$ stfel se explica

tropismul si colonizarea stafilococilor pentru zonele tegumentare unde glandele sebacee

sunt mai active (4azar si colab$, 2C)$

Protea.ele sunt enzime extra!celulare cu specificitate sc9zut9, care .idrolizeaz9

proteinele la peptide :i aminoacizi< implicate in distrugerea integritatii tesuturilor

gazdei si in progresia infectiei$ -entru evidentierea %ro!ucerii !e %rotea.e< tulpinile

sunt =ns9m@n;ate =n spot pe doua tipuri de medii solide ! cu cazein9, respectiv cu

gelatin9, :i incubate 2C. la Ao'$ -rezen;a unei zone de precipitare =n >urul ariei de

cre:tere a indicat proteoliza cazeinei#gelatinei (prezen;a ca.eina.ei3gelatina.ei)

(4azar si colab$, 2C)$ 6ialuroni!a.a stafilococica este o enzima care difuzeaza

extracelular si actioneaza prin descompunerea acidului .ialuronic in glucosamina, acid

gluconic si acid acetic, favorizand astfel patrunderea si invadarea tesuturilor$*tafilococii patogeni sunt producatori de .ialuronidaza in proportie de WB$ Reactia

inflamatorie de la nivelul tesutului afectat de stafilococ bloc.eaza actiunea

.ialuronidazei (factor de difuziune) la fazele initiale ale infectiei, enzima fiind

considerata )actor accesoriu de patogenitate$ Ps. aeruginosa produce o serie de

%rotea.e 0colagena.e< elata.e1 cu rol in progresia infectiei$

Pro!ucerea !e DNA#.-+ tulpinile sunt =ns9m@n;ate =n spot pe geloz9 cu %5 :i incubate 2C. la A o'$

%up9 incubare, peste culturile =n spot s!a adaugat c@teva picaturi de solu;ie 8'l 15, clarificarea zonei


51/117

=n >urul ariei de cre:tere a fost =nregistrata ca reac;ie pozitiv9 (4azar si colab$, 2C)$ Nuclea.ele

ta"ilococice sunt enzime termorezistente, elaborate de tulpinile patogene coagulazo!pozitive in

proportie de W!WKB$ ceasta enzima este absenta la tulpinile coagulazo!negative si la Staphylococcus

epidermidis$ /ioc.imic, este o fosfodiesteraza care poate desface atat molecula de %5 cat si pe cea

de R5, producand fosfomononucleotizi, ce pot fi utilizati in sintezele proprii$

Mucina.a >oac9 un rol foarte important =n virulen;a unor tulpini bacteriene :i reprezint9 un complex

enzimatic care scindeaz9 mucina gastric9, favoriz@nd accesul microorganismelor la receptorii specifici de pe

suprafa;a celulelor epiteliale$ eaz9 de ac;iunea nociv9 a p8!ului acid :i a altor molecule implicate =n ap9rarea anti!infec;ioas9 la

nivelul mucoaselor (4azar si colab$, 2C)$ Pentru e'i!entierea %ro!ucerii !e mucina.- tulpinile sunt

=ns9m@n;ate =n spot pe mediu cu mucina din stomac de porc :i incubate la AKo' p@n9 la zile? activitatea

enzimatic9 a fost determinat9 prin prezenta unui .alou transparent =n >urul ariei de cre:tere$


52/117

&3'I5D

4I-D

4ecitinaza(Fosfolipaze)

8emolizine


53/117

milaza

%5!aza


54/117

%5!aza

'azeinaza


55/117

'&-


56/117

DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSI8ILITATE LA ANTI8IOTICE A SPECIILOR MICRO8IENE

%atorita specificit9;ii lor de ac;iune, antibioticele manifest9 eficien;9 diferit9 fa;9 de diferite specii

microbiene? totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic define:te spectrul de

acti-itate al antibioticului respectiv$


57/117

-e l@ng9 valoarea '$&$I$ determinat9 in !itro, =n alegerea tratamentului cu un anumit antibiotic, trebuie

s9 se ;in9 cont :i de calit9;ile farmacologice ale antibioticului respectiv (de exemplu, posibilitatea

realizarii concentra;iei active la nivelul focarului de infec;ie), de eventualele efecte secundare :i de

starea fiziologic9 a bolnavului$

0e.nica de eviden;iere a sensibilita;ii la antibiotice a unei tulpini microbiene se nume:te

anti$iograma$ ntibiograma trebuie practicat9 =n mod obligatoriu =n cazul microorganismelor patogene,

supuse fenomenului de dob@ndire a rezisten;ei, =naintea =nceperii oric9rui tratament cu antibiotice$

%up9 determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin te.nici calitati'e (=n care tulpina

microbian9 de testat este pus9 =n contact cu diferite antibiotice aflate =ntr!o anumit9 concentra;ie), se pot

practica teste cantitati'e pentru determinarea valorii '$&$I$ (=n care tulpina microbian9 este pus9 =n

contact cu concentra;ii cresc9toare ale aceluia:i antibiotic)$

2+ Meto!e calitati'e !e !eterminare a %ectrului !e eni$ilitate la anti$iotice

Metoda di)u4imetric5 1$irby-Bauer#

Este o metod9 foarte simpl9 :i rapid9, care permite determinarea concomitent9 a spectrului de

sensibilitate a microorganismului :i a valorii '$&$I$ =n vederea calcul9rii dozelor terapeutice de

antibiotice$ &etoda are mai multe variante, =n practic9 folosindu!se curent te.nica discurilor impregnate

cu antibiotice, standardizat9, recomandat9 de 5''4* # '4*I ( "ational Committee )or Clinical

%aboratory Standardisation 6 Clinical %aborator4 Standards /nstitute)$

7 serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbian9 studiat9 (densitatea inoculului, specia,

v@rsta culturii), mediul de cultur9 (compozi;ia mediului, p8!ul, densitatea :i grosimea stratului de

mediu), te.nica folosit9 :i criteriile de interpretare a rezultatelor ob;inute, pot influen;a rezultatele unei

antibiograme$ %in acest motiv, te.nica trebuie efectuat9 =n condi;ii standardizate, reproductibile,

conform indica;iilor forurilor interna;ionale =n domeniu$

-e suprafa;a unui mediu agarizat =ns9m@n;at N=n p@nz9O cu un inocul standardizat, ob;inut din tulpina

de testat, se plaseaz9 la distan;e egale discuri impregnate cu solu;ii de antibiotice de o anumit9concentra;ie care vor difuza =n mediu, realiz@nd un gradient de concentra;ie invers propor;ional cu

diametrul zonei de difuzie, deci cu distan;a fa;9 de disc$ %ac9 tulpina este sensibil9 la un anumit

antibiotic, cre:terea microbian9 va fi in.ibat9 pe o anumit9 suprafa;9 =n >urul discului impregnat cu

antibioticul respectiv, suprafa;9 denumit9 )on de inhi,i/ie a cre0terii $

'itirea rezultatelor se realizeaz9 prin masurarea diametrelor zonelor de in.ibi;ie a cre:terii

determinate de diferite antibiotice, cu a>utorul unei rigle gradate$


58/117

realiza o prim9 citire la H!" . de la incubare$ Interpretarea rezultatelor se face =n func;ie de dimensiunea

zonelor de in.ibi;ie a cre:terii, exprim@nd rezultatul cu termenii de tulpin9 sensibil5 (S ), re4istent5 ( 7)

sau intermediar sensibil5 ( / ), conform tabelelor cu puncte critice standardizate :i corespunz9toare

metodei de lucru+ tabelele 5''4* pentru metoda difuzimetric9 recomandat9 de 5''4* ( "ational

Committee )or Clinical %aboratory Standards, 8SA), in prezent '4*I (Clinical laboratory and

Standards /nstitute)$

0ermenii *, I, R definesc de fapt :i categoriile de antibiotice, =n func;ie de efectul lor clinic, dup9

cum urmeaz9+

! categoria S, =nseamn9 c9 exist9 o mare probabilitate ca antibioticul, administrat =n doze obi:nuite, s9

elimine infec;ia determinat9 de tulpina testat9 ('$&$I$ are valori net inferioare celor ale concentra;iilor

umorale ob;inute =n urma administr9rii unei doze obi:nuite)?

! categoria I, semnifica probabilitatea ca antibioticul s9 fie eficient in !i!o prin administrare local9 sau

prin realizarea =n mod fiziologic a concentra;iilor mari in organe sau ;esuturi (rinic.i, ficat, cai biliare),

la nivelul c9rora este localizat procesul infec;ios?

! categoria R =nseamn9 c9, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va determina eliminarea

din organism a agentului infec;ios, a c9rui sensibilitate a fost testat9 sau rezultatul tratamentului este

imprevizibil$

4a citirea :i interpretarea rezultatelor se iau =n considerare diametrele zonelor de in.ibi;ie, lipsite

complet de colonii vizibile cu oc.iul liber$

pari;ia coloniilor la marginea sau =n interiorul zonei de in.ibi;ie se poate datora urmatorilor factori+ cultura este mixt9 sau suprainfectat9? cultura este pur9, dar prezint9 celule .eterorezistente?

apari;ia mutantelor rezistente? dezvoltarea tardiv9 a unor celule, de fapt sensibile, :i apari;ia coloniilor

dup9 ce antibioticul s!a diluat prin difuzie =n mediu$

4+ Meto!e cantitati'e !e !eterminare a 'alorii C+M+I+

Metoda diluiilor 9n mediul lichid sau 9n agar

Principiul metodei+ un inocul standardizat al tulpinii testate este =ns9m@n;at =ntr!un gradient

discontinuu de concentra;ii ale antibioticului, fie =n pl9ci cu mediu agarizat, fie =n tuburi cu bulion

nutritiv$ %up9 incubarea adecvat9, se citeste valoarea '$&$I$ prin observarea macroscopic9 a tu$urilor+

=n primele tuburi, cu concentra;ii mari de antibiotic, cre:terea culturii nu este vizibil9, microorganismele

fiind omor@te sau in.ibate =n prezen;a antibioticului$ 'oncentra;ia de antibiotic corespunz9toare tubului


59/117

cu cea mai mic9 concentra;ie, care in.ib9 cre:terea vizibil9 a culturii microbiene, reprezint9 valorea

'$&$I$ (mcg#ml) pentru antibioticul respectiv$


60/117

A%ectul $en.ilor E#tet )i gra!ientul !econcentra,ie al anti$ioticului utili.at+

Zona !e in(i$i,ie :n eli%- )i !eterminarea'alorii C+M+I+ cu aButorul E#tet+

Dona de in.ibi;ie a cre:terii microorganismului testat are aspect de elips9, al c9rei diametru

variaz9 direct propor;ional cu gradientul de concentra;ie al antibioticului difuzat =n mediu, diminu@ndu!

se odat9 cu sc9derea concentra;iei astfel c9, la o anumit9 valoare, zona de in.ibi;ie a cre:terii va

intersecta banda, concentra;ia =nscris9 pe band9 la acest nivel reprezentand valorea '$&$I$$

Materiale neceare*

Inocul standardizat (pregatit ca =n te.nica anterioara)?

-l9ci -etri cu mediu &ueller!8inton?

-ipete gradate sau tampon de vata sterile$

Mo! !e lucru* Inoculul standardizat se repartizeaz9 pe suprafa;a mediului &ueller!8inton, prin te.nica =ns9m@n;9rii

=n panz9 cu tamponul de vat9 steril sau prin inundare cu pipeta gradat9$

%up9 uscarea suprafetei mediului, se aplic9 benzile E!test cu concentra;ia maxim9 orientat9 spre

periferia pl9cii -etri$ -entru ob;inerea de rezultate optime, pe o plac9 -etri pot fi dispuse maximum K

benzi E!test$

-l9cile sunt incubate =n condi;ii corespunz9toare microorganismului testat, timp de 1K!1".$ %up9

incubare, valorile '&I se citesc prin examinarea direct9 a benzilor$


61/117

Eta%ele !etermin-rii 'alorii C+M+I+ cu aButorul E#tetului+

Controlul !e calitate :n tetarea ei$ilt-,ii la anti$iotice

'ontrolul de calitate are drept scop s9 asigure precizia :i fiabilitatea te.nicii de testare a

sensibilit9;ii, performan;a reactivilor utiliza;i :i performan;a personalului care efectueaz9 testele ('odi;9,

2K)$ -entru a r9spunde acestor deziderate, laboratoarele care realizeaz9 antibiograma trebuie s9

dispun9 de tulpini de referin;9 pentru realizarea antibiogramei, :i anume+ Escherichia coli 0'' 2KW22,

Escherichia coli 0'' AK21W, Staphylococcus aureus 0'' 2KW2A, Staphylococcus aureus 0''

CAA, Staphylococcus aureus 0'' 2KW2A, Enterococcus )aecalis 0'' 2W212, :aemophilus

in)luen4ae 0'' CW2C, :aemophilus in)luen4ae 0'' CWHH, "eisseria gonorrhoae 00' CW22H,

"eisseria gonorrhoae 00' CW22H, *treptococcus pn

Diagnostic Microbiologic

Documents

Transcript of Diagnostic Microbiologic