Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây

dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm

(Codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạch

Nguyễn Thị Thanh Nga

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn ThS. ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70

Người hướng dẫn: PGS.TS. Đinh Đoàn Long

Năm bảo vệ: 2012

Abstract. Tìm hiểu chi codonopsis; tổng quan về mã vạch AND (DNA barcode);

một mã vạch AND được sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu; ứng dụng mã

vạch AND trên thực vật. Trình bày các phương pháp nghiên cứu: tách chiết AND

tổng số; kiểm tra sản phẩm AND sau tách chiết; phương pháp nhân bản gen đích

bằng kỹ thuật PCR; tinh sạch sảm phẩm PCR và giải trình tự; phương pháp phân tích

số liệu. Kết quả nghiên cứu: tách chiết AND tổng số; khuyếch đại vùng gen nghiên

cứu bằng kỹ thuật PCR.

Keywords. Sinh học; Di truyền học; Đa dạng di truyền; Cây dược liệu; Kỹ thuật

AND mã vạch

Content

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài

nguyên thực vật phong phú và đa dạng.. Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế),

tính đến năm 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài

động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc. Trong tổng số 3948 loài cây thuốc,

gần 90 % là các cây mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là

các cây thuốc trồng. Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn

dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp

dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên

hoặc trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới hơn 20.000

tấn mỗi năm. Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được

khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược

liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con số

thống kê cụ thể. Những số liệu này cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa

dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng

trong nền kinh tế - xã hội. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được

dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc điểm

hình thái tương tự nhau.

Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ

sung và các loại thuốc thảo dược thường được xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên

La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược.

Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý

luôn bắt đầu mô tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử

dụng. Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi

nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện không

hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng các thuốc thảo

mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị tương đối phổ biến hiện nay.

Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa

trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát tiêu bản hiển vi) của

mẫu vật. Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã

qua xử lý hoặc sơ chế. Vì vậy, các phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác các loài cây

thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của chúng đã được phát triển vào cuối những năm

1990. Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất

cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA

barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng

chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc

bảo quản lâu dài.

Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài

Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần xác định các mã vạch

có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp

phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN của một gen mã

vạch như ITS, matK, trnK.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Chi Codonopsis

1.1.1. Phân loại học

Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:

Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)

Giới: Plantae (Thực vật)

Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)

Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)

Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm)

Phân lớp: Asteriades

Bộ: Asterales (Bộ Cúc)

Họ: Campanulaceae (Họ Hoa chuông; Cát kiến)

Phân họ: Campanuloideae

Chi: Codonopsis

1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Rễ

hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có nhiều vết sẹo

lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu

trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn.

Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây khác, thân

màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông. Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng

tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, mép nguyên, màu xanh hơi pha vàng, mặt trên

có lông nhung, mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có lông rải rác, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4

cm. Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài tràng hình

chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc sắp rụng trở thành màu vàng

nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nhụy hơi dẹt, bao phấn đính gốc. Quả bổ đôi, hình chùy

tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng, có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra. Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng

Hinh 1. Hinh thái loài Codonopsis pilosula

Một số loài Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm

có:

- Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): cây thảo lâu năm, thân mọc bò hay leo. Rễ hình

trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm. Lá mọc đối có khi mọc cách hay hơi vòng. Hoa (Hinh

1) mọc đơn độc ở nách lá. Đài 5, Tràng hình chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5. Bầu 5

ô, quả nang, phía trên có một núm nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ.

- Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm

(Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) còn có

tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô

(Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân leo. Rễ hình

trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít khi mọc so le hình

tim, nhẵn hoặc có ít lông, đầu lá nhọn, mép lá

nguyên hoặc có khía răng nhỏ, bấm vào lá có

nhựa mủ. Phiến lá dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm.

Hoa (Hinh 2) mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông

màu trắng hoặc hơi vàng, họng có vân tím.

Hinh 2. Hoa của loài C. javanica

- Đảng sâm hoa xanh (Codonopsis viridiflora M.xim) lá mọc đối hay mọc cách, dài 2 –

3 cm, hai mặt đều có lông gai ngắn, lá nguyên không có răng cưa, cuống lá tương đối ngắn,

Hoa mọc đơn trên ngọn, tràng hình chuông, dài khoảng 1 cm màu xanh vàng, trong có nếp

nhăn ngắn. Loài này mới chỉ tìm thấy ở khu tự trị A-pa tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc.

- Đảng sâm hoa ống (Codonopsis tubulosa Kom) cây thảo thân lá đều có lông dài, lá

hẹp dài hình bầu dục, 3-8cm, đuôi lá có răng thưa. Cánh hoa sâu, dài bằng nửa ống hoa, tràng

hình ống, dài độ 3cm, phân bố ở khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc.

- Xuyên đảng sâm (Codonopsis tangshen

Oliv); hình thái cơ bản giống loài C. pilosula

(Franch) Nannf nhưng lá hình trứng hay hình

trứng đuôi nhọn, mặt lá không có lông, chỉ rìa

lá có lông nhung. Sau khi ra hoa (Hinh 3) thì

có quả đuôi màu trắng tím, trong hoa có sọc

nhỏ màu tím, cuống dài, hình dẹt, to hơn loại

trên, ở chổ núi cao mưa nhiều về mùa thu quả

chín không nứt.

Hinh 3. Hoa Codonopsis tangsheng

- Đảng sâm mõm chó (Codonopsis nervosa Nannf) lá mọc đối, hình trứng dài 1-1,5cm, mép

nguyên, hai mặt đều có lông. Hoa (Hinh 4a) có tràng hình chuông dài độ 1,5cm, màu lam

nhạt, trong có thới màu tím đậm.

Ngoài ra còn có các loài Codonopsis lanceolata Benth. et Hook. (Hinh 4b) có rễ hình

chùy và loài Codonopsis ussuriensis Hemsl (Hinh 4c) có rễ hình củ tròn, thường được trộn

lẫn với Codonopsis để bán ở Trung Quốc. Ở Việt Nam, trong thời gian 1961 – 1985, Viện

Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm (Codonopsis spp.) tập trung ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc;

còn ở phía Nam, chỉ có ở khu vực Tây nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất là các tỉnh Lai

châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà

Nẵng và Lâm Đồng.

Hinh 4. Hoa của các loài (a) Codonopsis nervosa, (b) Codonopsis lanceolata, và (c)

C. ussuriensis.

1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ

truyền

Bộ phận chính của Codonopsis được dùng làm thuốc là rễ. Dựa vào chất lượng của rễ

sau khi thu hoạch, người ta chia ra làm 5 loại sau: Tây đảng sâm, Đông đảng sâm, Lộ đảng

sâm, Điều đảng sâm, Bạch đảng sâm.

Về thành phần hóa học, trong rễ của Codonopsis đến nay đã tìm thấy sucrose,

glucose, fructose, galactose, arabinose, mannose, xylose, rhamnose, inulin, nhiều loại

alcaloid, scutellarein glucoside, CP1 – 4, syringin, N-Hexyl b-D-glucopyranoside, ethyl a-D-

fructofuranoide, tangshenoside I, choline.

Codonopsis và các dịch chiết hoặc thành phần của chúng có các tác dụng dược lý như

sau: tác dụng tăng lực, tác dụng đối với hệ tiêu hóa, tác dụng đối với hệ tim mạch, tác dụng

đối với máu và hệ thống tạo máu, đối với điều hòa huyết áp, đối với đáp ứng miễn dịch của

cơ thể, đối với hệ thần kinh trung ương, ngoài ra Codonopsis còn có tác dụng kháng khuẩn.

Hiện nay ở Việt Nam, các loài thuộc chi Codonopsis được liệt vào Sách Đỏ Việt Nam

do bị khai thác thường xuyên, liên tục (gần như không có giới hạn), cùng với nạn tàn phá

rừng làm nương rẫy (ở Tây Bắc, Tây Nguyên) cũng làm cho vùng phân bố tự nhiên của các

loài này bị thu hẹp nhanh chóng.

1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode)

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được

một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn

diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan

trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phương pháp này cũng

gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa

ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường,

hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài.

Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp

nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân

loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và

ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu,

người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ

gen.

Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề

xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài. Mã vạch được sử

dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy

quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc

chưng của từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống

nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân

biệt được. Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau :

(i) có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;

(ii) trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;

(iii) có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài.

1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tinh hinh nghiên cứu

1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật

Mã vạch ADN locut gen CO1 ở động vật thường được dùng rộng rãi do có các tiêu

chí: đây là một gen đơn bội, được di truyền từ mẹ, gen này cho mức độ phân biệt cao. Đó là

một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào. Ở động vật, nó

có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ, hoặc thường xuyên lặp đi lặp lại đơn

nucleotide. Những đặc điểm này kết hợp với cặp mồi được thiết kế tốt, hiệu quả sử dụng gen

CO1 để phân biệt nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất

sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài. Nhiều nghiên cứu cho thấy

CO1 giúp phân biệt được khoảng 98% các loài với nhau. Trong phần còn lại, nó xác định hẹp

đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các loài có mối quan hệ gần gũi, nói chung là các loài chỉ vừa

mới tách ra hoặc các loài lai thường xuyên. Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen ti thể Cytb

(cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như ADN mã vạch trong nhận dạng

ở động vật .

1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật

Nếu như các gen ti thể như CO1 và Cytb được dùng rộng rãi cho động vật và một số

loài tảo, thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính bảo thủ

cao và vì vậy không phù hợp làm ADN mã vạch. Thay vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen

lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như các vùng exon của các gen

rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng intron của các gen trnL và trnL-F). Một vùng trình tự

thông thường khác cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS nhân

(vùng đệm của tiểu đơn vị lớn ADN ribosome). Tính đến năm 2009, đã có khoảng 8 locus

gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen

lục lạp.

1.4. Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật

1.4.1. Ứng dụng ở thực vật nói chung

Nghiên cứu mã vạch ADN thực vật đã vượt xa nhiệm vụ so sánh các vùng ADN khác

nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn. Các ứng dụng này có thể được chia thành hai

loại rộng. Một là để cung cấp cái nhìn sâu hơn vào phân loại học ở cấp độ loài và đóng góp

vào quá trình phân loại học: nhận diện và phân chia ranh giới giữa các loài. Ứng dụng thứ

hai, là hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật không nhận biết được hoặc chưa xác định được

thuộc loài nào. Mã vạch DNA thực vật có khả năng cung cấp cái nhìn sâu vào phân loại cấp

độ loài trong những nhóm có hình thái đơn giản, nhóm có phân bố rất rộng, nhóm có kích

thước nhỏ, và / hoặc những nhóm đã được phân loại nhưng không đầy đủ, chưa tương xứng

với đặc điểm đa dạng của chúng (ví dụ như một số trường hợp không thể dựa trên nguyên tắc

phân loại hình thái học để đánh giá, phân loại, hoặc đã được phân loại nhưng chưa thực sự

triệt để).

1.4.2. Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dƣợc liệu

Thực vật dùng làm thuốc thảo dược luôn cần được xác định ở cấp độ loài, vì vậy, xác

định chính xác là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng sản phẩm và có tầm

quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính của sự đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát

sinh vùng địa lý cũng như bảo vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của

thị trường thảo dược, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn

cầu. Các nguyên liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có

quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo. Việc giả mạo các nguyên

liệu thảo dược thường là do:

(i) vật liệu không phân biệt được bằng đăc điểm hình thái

(ii) những vật liệu có tên tương tự nhau, và

(iii) việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu khác

rẻ tiền hơn.

Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm thuốc theo

phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương pháp hóa học đôi khi gặp

nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một

phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy, phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính

xác và phổ biến hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã

vạch ADN có thể bảo vệ người dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc giả mạo,

đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng. Dưới đây trình bày một số

mã vạch ADN đã được nghiên cứu và ứng dụng trong các cây dược liệu.

Vùng gen ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng xử lý tốt

nhất 6 mẫu của Hedyotis L có họ với Rubiaceae. ITS đã được sử dụng thành công để phân

biệt 14 lòai Hedyotis L, bao gồm cả loài chính thống trong phương thuốc điều trị khối u

“Baihuasheshecao” có nguồn gốc từ H. diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H.

corymbosa (L.) Lam.

Maturase K trình tự này đã thành công trong việc xác định các loại thuốc thảo dược

"Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex

Regel) Maxim. ex Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi

nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định

các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau.

trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) và tỷ lệ sai khác là

83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbcL và matK. Vì vậy, trnH - psbA

được coi như 1 trình tự hữu ích để phân biệt các loài thảo mộc với loài giả mạo nó. Nó được

dùng để phân biệt loài giả mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.)Lindl. ex. Hook.f.

(Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw. với tỷ lệ sai khác trong trình tự là từ

2% đến 3,1%.

Tiểu đơn vị lớn của ribulose-bisphosphate carboxylase-rbcL trình tự này có chất

lượng cao khi làm thử nghiệm trên 7 locus. Tuy mức độ biến đổi thấp giữa các loài khác nhau

nhưng rbcL vẫn cho phép nhận biết được nguyên liệu thảo dược với loại giả mạo nó (Ví dụ,

thảo dược dương xỉ "Mianmaguanzhong" có nguồn gốc từ Dryopteris crassirhizoma Nakai

(Dryopteridaceae) có 19 nucleotide là đa hình trong trình tự rbcL khi đối chiếu với loài giả

mạo).

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Các mẫu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu do Khoa Tài nguyên Dược liệu

(Viện Dược Liệu, Bộ Y tế) cung cấp.

Bảng 1. Địa điểm thu mẫu và thông tin mẫu sử dụng trong nghiên cứu

Chi thực vật Nhóm mẫu Địa điểm thu mẫu Kí hiệu mẫu

Codonopsis

Codonopsis sp. C2

Codonopsis sp. Thị trấn Sa Pa, Lào Cai C4

Đảng Sâm vỏ trắng Thôn I, xã Hòa Bình, TP Kontum C11; C12

Codonopsis sp. Lô trồng T, Đa Sal, Lạc Dương,

Lâm Đồng

C13; C14;

C15

Codonopsis sp. Mọc hoang, Đa Sal, Lạc Dương,

Lâm Đồng

C16; C17;

C18

Đảng Sâm Xã Long Hẹ, Huyện Thuận Châu,

Sơn La

C20; C21

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt từ các hãng uy tín đảm bảo về chất

lượng và độ tin cậy như Qiagen, Fermentas, Sigma…

2.1.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Một số thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu này gồm: cân điện tử Satorius

XB 200A (Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy đo ph, máy li tâm, máy PCR.

2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Hai cặp mồi được sử dụng để nhân bản đoạn hai gen đích là gen ITS và gen matK,

trình tự và thông tin về hai cặp mồi được thể hiện ở Bảng 5..

Bảng 2. Các cặp mồi sử dựng trong nghiên cứu

Gen

đích

Tên mồi

Trinh tự mồi

Nhiệt độ

gắn mồi

Kích

thƣớc

P1f 5’-ATT GAA TGG TCC GGT GAA GTG

TTC G-3’

55oC

900bp

ITS P2r 5’-AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG

TTA C-3’

matK

matK-390f 5’-CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT

C-3’

52oC

900bp

matK-1326r 5’- TCT AGC ACA CGA AAG TCG

AAG T-3’

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số

Các mẫu thực vật được tách chiết lấy ADN tổng số bằng quy trình mini-CTAB và kit

DNeasy® Plant Mini Kit của hãng Qiagen.

2.2.2. Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết

ADN tổng số của các mẫu thực vật sau khi tách chiết sẽ được điện di trên gel agarose

1%, trong đệm TBE 1X, ở hiệu điện thế 90V với marker 1kb.

Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tổng số được kiểm tra qua phương pháp đo mật độ

quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 và 280nm. Pha loãng dịch chiết 100 lần (5µl mẫu +

450µl DDW), mỗi mẫu đo ba lần và giá trị trung bình của ba lần đo được lấy làm kết quả

cuối cùng. Độ tinh sạch của mẫu thể hiện qua thông số A260/280, thông thường A260/280=1,6-2.0

được coi là mẫu tinh sạch, nồng độ ADN của mẫu được tính thông qua giá trị

1,0A260=50µg/µl.

2.2.3. Phƣơng pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR

Thể tích mỗi phản ứng PCR của mỗi mẫu là 25µl, được thực hiện trên máy PCR 9700.

Quy trình nhiệt để nhân bản các đoạn gen được tóm tắt ở Bảng 6. Thể tích cụ thể của các

thành phần trong một phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 7 và Bảng 8.

Bảng 3. Thành phần của phản ứng PCR

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)

1 dd H2O 12.75

2 Tag buffer 10X 2.5

3 MgCl2 25mM 2.0

4 DNTPs 10mM 2.5

5 Mồi xuôi 10pmol 1.0

6 Mồi ngược 10pmol 1.0

7 Tag DNA polymerase 1u/µl 0.25

8 ADN khuôn 3

9 Tổng thể tích 25

Bảng 4. Chu trinh nhiệt cho gen ITS

Bước Nhiệt

độ(oC)

Thời gian

Chu

kỳ

Khởi

động

94 4p 1

Biến tính 94 40s

35

Gắn mồi 55 1p

Kéo dài 72 1p

Ổn đinh 72 7p 1

Bảo quản 4 ∞

Bảng 5. Chu trinh nhiệt cho gen matK

Bước Nhiệt

độ(oC)

Thời gian Chu

kỳ

Khởi

động

94 60s 1

Biến tính 94 30s

35

Gắn mồi 52 20s

Kéo dài 72 50s

Ổn đinh 72 5p 1

Bảo quản 4 ∞

2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trinh tự

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gửi đi giải trình tự tại hãng Bioneer tại Hàn

Quốc

2.2.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu

Các chuỗi DNA được so sánh và liên kết với nhau bằng chương trình BioEdit trình

(phiên bản 4.1.4). Cây phát sinh được xây dựng dựa trên trình tự ADN của vùng gen ITS và

gen matK bằng phương pháp tiết kiệm tối đa (MP) và Bayesian trên phần mềm PAUP

(version 4.0 beta 10).

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tách chiết ADN tổng số

Chúng tôi đã tách chiết thành công 12 mẫu Codonopsis (xem Bảng 9)

Hinh 5. Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%,

marker 1kb

Bảng 6. Kết quả đo OD một số mẫu nghiên cứu

Mẫu A260/280 [ADN] µg/µl

C2 1,50 86,2

C4 1,63 108,9

C11 1,52 85,1

C12 1,61 121,5

C13 2,00 170,6

C14 1,96 98,8

C15 2,00 170,6

C16 2,00 229,0

C17 1,95 191,3

C18 1,9 107

C20 1,85 84,5

C21 1,87 81,0

3.2. Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR

Kết quả PCR thu được như sau: chúng tôi đã nhân thành công 11/12 mẫu Codonopsis

với gen ITS (Hinh 6), 10/12 mẫu Codonopsis với gen matK (Hinh 7).

Hinh 6. Ảnh điện di một số sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu

Codonopsis trên gel agarose 1%, M: marker 100bp

Hinh 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis trên gel

agarose 1%, M: marker 100bp

3.3. Phân tích kết quả

3.3.1. Phân tích sự đa hinh trinh tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu

3.3.1.1. Phân tích sự đa hinh trinh tự ADN trên gen ITS

Align trình tự ADN vùng gen ITS của 12 mẫu nghiên cứu cùng với 10 trình tự ADN

vùng gen ITS của các loài thuộc chi Codonopsis đã được công bố trên GenBank bằng phần

mềm Bioedit, cho thấy chiều dài vùng ITS giữa các loài dao động từ 638 đến 650 bp, GC

trong vùng này khoảng từ 60,3% đến 62,5%, có 113 điểm sai khác giữa các loài, chiếm

17,4% trên toàn bộ trình tự, trong đó có 51 sai khác được tìm thấy ở vùng ITS1, 8 điểm ở

vùng 5.8S và 53 điểm ở vùng ITS2. Trong đó sai khác trong nội loài từ 0,0-0,2%, sai khác

giữa các loài khác nhau đạt đến 15,4%. Có thể thấy sự đa hình trong trình tự nucleotid ở vùng

ITS1 và ITS2 là rất cao, tại đây xảy ra các biến đổi lớn như thêm hoặc mất một đoạn

nucleotide, hay có thể nói vùng 5.8S với chiều dài trung bình khoảng 164 bp là vùng bảo thủ

cao, với sự biến đổi rất ít trong trình tự ở tất cả các loài, điều này cũng phù hợp với các

nghiên cứu trước đó [31]. Trong các mẫu nghiên cứu, mẫu C2, C11, C12, C13, C14, C15,

C16, C17, C18, C20, C21 có trình tự tương đồng hoàn toàn 100% với trình tự ADN của loài

C. javanica trên GenBank, mẫu C4 có trình tự tương đồng hoàn toàn với trình tự ADN của

loài C. tangshen trên GenBank.

3.3.1.2. Phân tích sự đa hinh trinh tự ADN trên vùng gen matK

Theo kết quả phân tích, có 61 vị trí sai khác giữa các trình tự được so sánh, tần số xuất

hiện biến thể là 7% so với toàn bộ trình tự, có thể thấy sự đa hình trong trình tự gen matK là

thấp hơn nhiều so với vùng gen ITS. Mẫu C4 có độ tương đồng cao với trình tự ADN của loài

C. kawakamii trên Genbank với chỉ 4 điểm sai khác (0,46% so với toàn bộ trình tự), các mẫu

nghiên cứu còn lại bao gồm: C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C20, C21 trình tự có

độ tương đồng cao với nhau, trong đó các mẫu C14, C15, C16 có trình tự tương đồng 100%,

các mẫu có trình tự giống nhau đến 99,8% gồm mẫu C18 với các mẫu C12, C14, C15, C16,

và các mẫu có trình tự sai khác nhiều nhất là giữa mẫu C2 và C4, sai khác là 2,6%.

3.3.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Cây chủng loại phát sinh cho thấy mẫu nghiên cứu là C4 nằm cùng nhánh với C.

tangshen, với chỉ số bootrap là 65%, còn lại các mẫu đều nằm cùng nhánh với C. javanica

với chỉ số bootstrap rất cao 100%, điều này phù hợp với kết quả phân tích tính đa dạng trong

trình tự vùng gen ITS.

Hinh 8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp MP chạy trên

khung đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93

.

Hinh 9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp MP chạy trên khung đọc

gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93

Cùng với kết quả so sánh trình tự ở trên, có thể xác định các mẫu nghiên cứu: C2,

C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 thuộc loài C. javanica, mẫu C4 thuộc

loài C. tangshen

Các mẫu nghiên cứu có phân bố không đổi trên cây phát sinh chủng loại được xây

dựng dựa trên gen matK, với bootrap của nhánh là 98%, bao gồm các mẫu nghiên cứu: C2,

C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21, trong nhóm có sự phân nhánh nhỏ hơn

giữa các mẫu nghiên cứu, có thể nói gen matK có khả năng phân tách tốt hơn gen ITS, và có

thể có các tồn tại dưới loài của loài C. javanica. Mẫu C4 cùng nhánh với C. kawakamii với

bootstrap hơn 80%.

Hinh 10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp Bayesian trên khung

đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x106 thế hệ.

Cây phát sinh chủng loại thu được bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc gen

ITS không chỉ có 2 nhánh chính, mẫu C. clematide và C. lanceolata tách ra thành nhánh cùng

gốc với hai nhanh còn lại, với chỉ số posterior probability (PP) thấp 50%. Vị trí các loài ở các

nhánh là tương đồng với cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên phương pháp MP trên

khung đọc gen ITS, trong đó mẫu C4 cùng nhánh với mẫu C. tangshen với chỉ số PP là khá

cao 97 %, các mẫu còn lại cùng nhánh với C. javanica với PP là 87%. Điều này cho thấy, cây

phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Bayesian trên khung đọc gen ITS vẫn chỉ ra

rằng các mẫu nghiên cứu có quan hệ gần gũi với loài C. tangshen và C. javanica, tuy nhiên,

có thể dữ liệu trên vùng gen ITS chưa đủ để phương pháp Bayesian phân tách loài C.

clematide và C. lanceolata và các nhánh với chỉ số PP tin cậy hơn.

Hinh 11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp Bayesian trên khung

đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x106 thế hệ

Cây phát sinh thu được theo phương pháp Bayesian dựa trên khung đọc gen matK

hoàn toàn tương đồng với cây phân loại thu được dựa theo phương pháp MP. Cụ thể, mẫu C4

cùng nhánh với mẫu C. kawakamii với PP là 100%, các mẫu còn lại nằm ở cùng một nhánh

với chỉ số của nhánh là 100%, trong nhóm tồn tại các dưới loài với chỉ số PP cao, lần lượt là:

nhánh C11, C12, C18 là 99%; C14, C15, C16, C17 là 74%, và của nhánh C2, C21 là 100%.

Điều này khẳng định lại một lần nữa, gen matK có khả năng phân tách tốt hơn vùng gen ITS,

có thể sử dụng gen này để xác định các dưới loài.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận chính như sau:

1. Đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK, và kết quả phân tích sự đa

hình trên mỗi vùng gen cho thấy vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất hiện 113 điểm

đa hình, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình cao hơn so với gen matK

kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7% trên toàn bộ trình tự

2. Từ kết quả so sánh và phân tích trình tự ADN vùng gen ITS có thể xác định các

mẫu nghiên cứu C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 thuộc loài C.

javanica và mẫu C4 thuộc loài C. tangshen

3. Với sự tương đồng 100% trong trình tự, vùng gen ITS là rất bảo thủ ở loài C.

javanica và C. tangshen, rất có ý nghĩa trong kiểm định dược liệu.

4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên phương pháp Tiết kiệm tối đa

(Maximum Parsimony) và Bayesian dựa trên khung đọc riêng rẽ từng gen ITS và matK cho

kết quả tương đồng, cho thấy độ đáng tin cậy của cây thu được cũng như của 2 phương pháp

MP và Bayesian sử dụng để xây dựng cây chủng loại phát sinh trong chi Codonopsis. Các

cây phân loại xây dựng được một lần nữa cho kết luận xác định các mẫu nghiên cứu thuộc hai

loài C. javanica (đối với các mẫu C2 thu được ở, C11, C12 thu được ở Kon Tum, mẫu C13,

C14, C15, C16, C17, C18 thu được ở Lạc Dương, Lâm Đồng và các mẫu C20, C21 thu được

ở xã Long Hẹ, Sơn La) và C. tangsheng (đối với các mẫu C4 thu được ở Sa Pa, Lào Cai).

5. Kết quả phân tích trình tự ADN và cây phát sinh chủng loại thu được, có thể kết

luận vùng gen matK có khả năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được

sử dụng để phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis

6. Nghiên cứu này lần đầu tiên ứng dụng mã vạch ADN trong phân tích đa dạng di

truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam, và cùng các kết quả nghiên cứu trước đây trên thế

giới khẳng định vùng gen ITS và matK có thể giúp nhận diện loài và dưới loài như một mã

vạch phân tử, đồng thời công nghệ này có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến

hóa học phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược liệu quý.

Kiến nghị

1. Tiếp tục thu thập thêm các mẫu thuộc chi Codonopsis để đánh giá toàn diện hơn

nữa tính đa dạng và phân bố của chi này ở Việt Nam

2. Nghiên cứu và ứng dụng các mã vạch phân tử này cho các nguồn dược liệu quý

khác ở Việt Nam

References

Tiếng Việt

1. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học.

2. Viện Dược Liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Giáo

Dục.

3. Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Thùy Dương, Lê

Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Đặng Văn Hạnh, Lã Đình Mỡi, Lê Trần Bình,

Nông Văn Hải (2003), “Tách dòng và xác định trình tự gen 18S rRNA của cây Bình

vôi”, Tạp chí Công nghệ SInh học, 1, pp. 203-209.

4. Đỗ Bích Huy (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật.

5. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.

6. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB

Đại học Quốc Gia Hà Nội.

7. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Quốc Trọng (2007), “Kết quả sử dụng

một số chuỗi gen lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ cây lâm

nghiệp”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5, pp. 77-83.

Tiếng Anh

8. A., H.R. (2005), “Medicinall plants: historical and cross-cultural usage patterns”,

AEP, 15, pp. 686-699.

9. Albach D. C., L.H.Q., Zhao N., Jensen S. R. (2007), “Molecular systematics and

phyotchemistry of Rehmannia (Scrophulariaceae)”, Biochem Syst Ecol, 35, pp. 293-

300.

10. Alvarez I., W.J.F. (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic

inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, pp. 417-434.

11. B., H.M. (1999), “Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic

regions with intraspecific variation”, Molecular Ecology, 8, pp. 513-525.

12. Bailey C. D., C.T.G., Harris S. A., Hughes C. E. (2003), “Characterization of

angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes”, Molecular

Phylogenetics and Evolution, 29, pp. 435-455.

13. Bartlett J, S.D. (2003), “A short history of the polymerase chain reaction”, Humana

Press Inc., pp. 1-6.

14. Bruni I., D.M.F., Galimberti A., Galasso G., Banfi E., Et Al. (2010), “Identification of

poisonous plants by DNA barcoding approach”, International Journal of Legal

Medicine 124, pp. 595-603.

15. Chen F., C.H.Y., Wong K. L. ,Wang J., Yu M. T., but P. P. H., Shaw P. C. and

(2008), “Authentication of Saussurea lappa, an endangered medicinal material, by

ITS DNA and 5S rRNA sequencing.”, Planta Medica, 74, pp. 889–892.

16. Chen S., Y.H., Han J., Liu C., Song J., Et Al. (2010), “Validation of the ITS2 region

as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PLoS ONE 5:

e8613.

17. Chiou S. J., Y.J.H., Fang C. L., Chen H. L., Lin T. Y. (2007), “Authentication of

medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers”, Planta Medica,

1421-1426.

18. Chun-Feng Qiao, Q.-B.H., Zhi-Li Zhao, Zheng-Tao Wang, Luo-Shan Xu and Hong-

Xi Xu (2009), “Sequence Analysis Based on ITS1 Region of Nuclear Ribosomal

DNA of Amomum villosum and Ten Species of Alpinia”, Journal of Food and Drug

Analysis, 17, pp. 142-145.

19. Cuenoud P., S.V., Chatrou L. W., Et Al. (2002), “Molecular phylogenetics of

Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA

sequences”, American Journal of Botany, 89, pp. 132-144.

20. Dj., C. (2000), “Plant macromolecular systematics in the past 50 years: one view”,

Taxon, 49, pp. 479-501.

21. E., E. (2006), “Herbal medicines-they are popular, but are they also safe?”, Eur J Clin

Pharmacol, 62, pp. 1-2.

22. Fay M. F., S.S.M., Chase M. W. (1997), “Taxonomic affinities of Medusagyne

oppositifolia (Medusagynaceae)”, Kew Bulletin, 52, pp. 111-120.

23. Fazekas A. J., S.R., Newmaster S. G., Hollingsworth P. M. (2010), “Stopping the

stutter: Improvements in sequence quality from regions with mononucleotide repeats

can increase the usefulness of non-coding regions for DNA barcoding”, Taãon, 59,

pp. 694-697.

24. Gao T., S.Z., Yao H., Song J., Zhu Y., Et Al. (2011), “ Identification of Fabaceae

plants using the DNA barcode matK”, Planta Medica, 77, pp. 92-94.

25. Gao T., Y.H., Song J., Liu C., Zhu Y., Et Al. (2010), “ Identification of medicinal

plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2”, Journal of

Ethnopharmacology, 130, pp. 116-121.

26. Ge Y. F., H.Y.Y., Xia B., Wei Y. L. (2007), “Sequencing of trnL-F and analysis of

interspecific genetic relationship of five medicinal species in Atractylodes DC.”,

Journal of Plant Resources and Environment, 16, pp. 12-16.

27. Gonzalez M. A., B.C., Engel J., Mori S. A., Pe ´Tronelli P., Et Al. (2009),

“Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE, 4: e7483.

28. Group, C.P.W. (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National

Academy of Sciences, 106, pp. 2794-12797.

29. Hebert P. D. N. , C.A., Ball S. L. , De Waard J. R. (2003), “Biological indentification

through DNA barcodes”, Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270, pp. 313-321.

30. Hilu K. W., L.H. (1997), “The matK gene: sequence variation and application in plant

systematics”, American Journal of Botany, 84, pp. 830-839.

31. Hollingsworth Pm, G.S., Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA

Barcode”, PLoS ONE, 6(5).

32. Hu Y, Z.Q., Xin H, Qin Lp, Lu Br, Rahman K Et Al. (2007), “Associtation between

chemical and genetic variation of Vitex rotundifolia populations from different

locations in China: ITS implication for quality control of medicinal plants”, Biomed

Chromatogr, 21, pp. 967-975.

33. Huson, D. (2007), Algorithms in Bioinformatics I, ZBIT pp.175-182.

34. J., S. (2001), “Biogcographic patterns and cryptic speciation in bryophytes”, Journal

of Biogcography, 28, pp. 253-261.

35. Jaakola L., S.M., Haggman H. (2010), “Novel approaches based on DNA barcoding

and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species”,

Food Chemistry, 123, pp. 494-500.

36. Jarman, S.N., Elliott, N. G. (2000), “DNA evidence for morphological àn cryptic

Cenozoic speciations in the Anaspididae, "living fossils" from the Triassic”, J. Evol.

Biol., 13, pp. 624-633.

37. Jhi., C. (2002), “Challenges and opportunities confronting the botanical dietary

supplement industry”, J Nat Prod, 65, pp. 1073-1084.

38. Jones W. P., C.Y.-W., Kinghorn A. D. (2006), “The role of pharmacognosy in

modern medicine and pharmacy”, Current Drug Targets, 7, pp. 247-264.

39. Karehed J., G.I., Dessein S., Motley T. J., Bremer B. (2008), “The phylogenetic utility

of chloroplast and nuclear DNA markers and the phylogeny of the Rubiaceae tribe

Spermacoceae”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 49, pp. 843-866.

40. Kesanakurthi R. P., F.a.J., Burgess K. S., Percy D. M., Newmaster S. G., Et Al.

(2011), “ Spatial patterns of plant diversity below ground as revealed by DNA

barcoding”, Molecular Ecology, 20, pp. 1289-1302.

41. Koehn Fe, C.G. (2005), “The evolving role of natural products in drug discovery”,

Nat Rev Drug Discov, 4, pp. 206-220.

42. Kojoma M., K.K., Yamada K., Sekita S., Satake M., Iida O. (2002), “Genetic

identification of cinnamon (Cinnamomum spp.) based on the trnL–trnF chloroplast

DNA”, Planta Medica, 68, pp. 94-96.

43. Kress J., E.D.L. (2007), “A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding

rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region”, PLoS One, 6, pp.

1-10.

44. Kress, J.W., Wurdack, K . J. ,Zimmer, E. A. ,Weigt, L. A. & Janzen, D. H. (2005),

“Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 102,

pp. 8369-8374.

45. Kress W. J., E.D.L. (2007), “A two-locus global DNA barcode for land plants: the

coding rbcL gene complements the noncoding trnH–psbA spacer region”, PLoS One,

2: e508.

46. L., H. Rare flowers and common herbal supplements get unmasked with plant DNA

barcoding (reporting unpublished data of Damon Little and David Baker). 2010

[cited; Available from: http://www.scientificamerican.com/blog/post.cfm?id = rare-

flowers-and-common-herbal-supp-2010-04-18.

47. L., H.B. (2005), “The evolution of herbal medicine: behavioral perspectives”, Anim

Behav, 70, pp. 975-989.

48. Lahaye R., V.D.B.M., Bogarin D., Warner J., Pupulin F., Et Al. (2008), “DNA

barcoding the floras of biodiversity hotspots”, Proceedings of the National Academy

of Sciences 105, pp. 2923–2928.

49. Lau D. T., S.P.C., Wang J., but P. P. H. (2001), “Authentication of medicinal

Dendrobium species by the internal transcribed spacer of ribosomal DNA”, Planta

Medica, 67, pp. 456-460.

50. Le, M., W.P. Mccord, and J.B. Iverson (2007), “On the paraphyly of the genus

Kachuga (Testudines: Geoemydidae)”, Mol Phylogenet Evolution, 45(1), pp. 398-404.

51. Le, M., C.J. Raxworthy, W.P. Mccord, and L. Mertz (2006), “A molecular phylogeny

of tortoises (Testudines: Testudinidae) based on mitochondrial and nuclear genes”,

Mol Phylogenet Evolution, 40(2), pp. 517-531.

52. Li, M., H. Cao, P.P.-H. But, and P.-C. Shaw (2011), “Identification of herbal

medicinal materials using DNA barcodes”, Journal of Systematics and Evolution,

49(3), pp. 271-283.

53. Li M., J.R.W., Hon P. M., Cheng L., Li L. L., Zhou J. R., Shaw P. C., but P. P. H

(2010), “ Authentication of the anti-tumor herb Baihuasheshecao with

bioactivemarker compounds andmolecular sequences”, Food Chemistry, 119, pp.

1239-1245.

54. Li M., L.K.H., Lam H., Shaw P. C., Cheng L., Techen N., Khan I. A., Chang Y. S.,

but P. P. H. (2010), “Cardiocrinum seedsasa replacement forAristolochia fruITS in

treating cough”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp. 429-432.

55. Li P., C.Z.H., Xing J. B. (2001), “Preliminary attempt to identify geoherbalism of

Flos Lonicerae by sequence divergence of 5S-rRNA gene spacer region”,

ChineseTraditional and Herbal Drugs 322, pp. 834-837.

56. Liu Jie, M.M., Gao L-M, Zhang D-Q, Li D-Z (2010), “DNA barcoding for the

discrimination of Eurasian yews (Taxus L., Taxaceae) and the discovery of cryptic

species”, Molecular Ecology Resources, 11, pp. 89–100.

57. M. Sanderson, B.B., G. Bharathan, C. Campbell, D. Ferguson, J. M. Porter, C. V.

Dohlen, M.Wojciechowski, and M. Donoghue. (1993), “The growth of phylogenetic

information and the need for a phylogenetic database.”, Syst. Biol., 42, pp. 562-568.

58. Ma., H. (2001), “Self-medicative behavior in the African great apes: an evolutionary

perspective into the origins of human traditional medicine”, Bioscience, 51, pp. 651-

661.

59. Mark Y. S., H.P.D.N. (2008), “Barcode of life”, Scientific American, pp. 82-88.

60. Miwa H, O.I., Matsui a, Hascgawa M, Akiyama H, Et Al. (2009), “Adaptive

evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes).”, Gene, 441, pp. 169-

175.

61. Miwa H., O.I.J., Matsui A., Hasegawa M., Akiyama H., Et Al. (2009), “Adaptive

evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)”, Gene, 441(169-175).

62. Mizukami H., O.K., Kitamura Y., Ikenaga T. (1993), “Restriction fragment length

polymorphism (RFLPs) of medicinal plants and crude drugs.l.RFLP probes allow

clear identification of Duboisia interspecific hybrid genotypes in both fresh and dried

tissues”, Biol Pharm Bull, 16, pp. 388-390.

63. Newman D. J., C.G.M., Snader K. M. (2000), “The influence of natural products upon

drug discovery”, Nat Prod Rep, 17, pp. 215-234.

64. Ogden R., M.H.N., Cowan R. S., Chua L., Groves M., Et Al. (2008), “SNP-based

method for the genetic identification of ramin Gonystylus spp. timber and products:

applied research meeting CITES enforcement needs”, Endangered Species Research,

9, pp. 255-261.

65. Organization, W.H. Traditional Medicine. 2008 [cited; Fact Sheet N134]. Available

from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/.

66. Ratnasingham S., H.P.D.N. (2007), “BOLD: the barcode of life data system”, Mol

Ecol Notes, 7, pp. 355-364.

67. Ren B. Q., X.X.G., Chen Z. D. (2010), “Species identification of Alnus (Betulaceae)

using nrDNA and cpDNA genetic markers”, Molecular Ecology Resources, 10, pp.

594-605.

68. Saunders, G.W. (2005), “Applying DNA barcoding to red macroalgae: a preliminary

appraisal holds promise for future applications”, Phil. Trans. R. Soc. B, 360, pp. 1879-

1888.

69. Shaw J., L.E.B., Schilling E. E., Small R. L. (2007), “Comparison of whole

chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies

in angiosperms: the tortoise and the hare III”, American Journal of Botany 94, pp.

275-288.

70. Song J., Y.H., Li Y., Li X., Lin Y., Et Al. (2009), “Authentication of the family

Polygonaceae in Chinese pharmacopoeia by DNA barcoding technique”, Journal of

Ethnopharmacology, 124, pp. 434-439.

71. Srirama R., S.U., Sreejayan N., Ravikanth G., Gurumurthy Br., Et Al. (2010),

“Assessing species admixtures in raw drug trade of Phyllanthus, a hepato-protective

plant using molecular tools”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp. 208-215.

72. Stech M., K.E., Loonen Mjje, Vrieling K., Kruijer J. D. (2011), “ Bryophyte DNA

sequences from faeces of an arctic herbivore, barnacle goose (Branta leucopsis)”,

Molecular Ecology Resources, 11, pp. 404-408.

73. Sucher, N.J. and M.C. Carles (2008), “Genome-based approaches to the

authentication of medicinal plants”, Planta Med, 74(6), pp. 603-623.

74. Tautz, D., Arctander, P., Minelli, A., Thomas, R. H. & Vogler, A. P. (2003), “A plea

for DNA taxanomy”, Trends Ecol. Evol., 18, pp. 70-74.

75. Tzu-Chao Lin, C.-C.H., Dinesh Chandra Agrawal, Chao-Lin Kuo, Fu-Shin Chueh,

Hsin-Sheng Tsay (2007), “ITS Sequence Based Phylogenetic Relationship of

Dangshen Radix”, Journal of Food and Drug Analysis, 15, pp. 428-432.

76. Von Crautlein M., K.H., Pietilainen M., Rikkinen J. (2011), “DNA barcoding: a tool

for improved taxon identification and detection of species diversity”, Biodiversity and

Conservation, 20, pp. 373-389.

77. Wang X., T.Y., Yoshimaru H., Nagasaka K., Szmidt A. E. (1999), “Phylogenetic

relationships of Eurasian pines (Pinus, Pinaceae) based on chloroplast rbcL, matK,

rpl20-rps18 spacer, and trnV intron sequences”, American Journal of Botany 86, pp.

1742-1753.

78. Wilson, K.H. (1995), “Molecular biology as a tool for taxonomy”, Clin. Infect. Dí. ,

20, pp. 192-208.

79. Yamaji H., F.T., Yokoyama J., Pak J-H., Zhou C., Yang C. Et Al. (2007), “Reticulate

evolution and phylogeography in Asarum sect. asiasarum (Aristolochiaceae)

documented in internal transcribed spacer sequences (ITS) of nuclear ribosomal

DNA”, Mol Phylogenet Evol, 44, pp. 863-884.

80. Yan P., P.Q.H., Jiao X. W., Zhao X., Shen Y. J., Zhao S. J. (2008), “Genetic variation

and identification of cultivated Fallopia multiflora and ITS wild relatives by using

chloroplast matK and 18S rRNA gene sequences”, Planta Medica, 74(1504-1509).

81. Yang D. Y., F.H., Cai S. Q., Komatsu K. (2004), “Molecular analysis of Rheum

species used as Rhei Rhizoma based on the chloroplast matK gene sequence and ITS

application for identification”, Biological & Pharmaceutical Bulletin, 27, pp. 375-

383.

82. Yang Z. Y., C.Z., Huo K. K., Xie H., Tian Z. P., Pan S. L. (2007), “ITS sequence

analysis used for molecular identification of the Bupleurum species from northwestern

China”, Phytomedicine, 14, pp. 416-423.

83. Yao H., S.J.Y., Ma X. Y., Liu C., Li Y., Xu H. X., Han J. P., Duan L. S., Chen S. L.

(2009), “Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence:

the chloroplast psbA–trnH intergenic region”, Planta Medica, 75, pp. 667-669.

84. Zhang Y., Z.J.C., Huang M. H., Yang M. S., Cao H. (2006), “Detection of genetic

homogeneity of Panax notoginseng cultivars by sequencing nuclear 18S rRNA and

plastid matK genes”, Planta Medica, 72, pp. 860-862.

85. Zhao Z. L., L.C.H., Wang Z. T. (2007), “Identification of Dryopteris crassirhizoma

and the adulterant species based on cpDNA rbcL and translated amino acid

sequences”, Planta Medica, 73, pp. 1230-1233.