cromatinaenucleolo

NNúúcleo Interfcleo Interfáásico:sico:

Cromatina e CromossomosCromatina e Cromossomos

Disciplina: Biologia CelularDisciplina: Biologia Celular

Docentes responsDocentes responsááveis: veis:

ProfaProfa. Dra. Maria . Dra. Maria TercTercíílialia Vilela de Azeredo OliveiraVilela de Azeredo Oliveira

ProfaProfa. Rosana . Rosana SilistinoSilistino de Souzade Souza

PPóóss--graduandagraduanda::

MscMsc. Priscila . Priscila PasqPasqüüettoetto MendonMendonççaa


Cromatina: estrutura e funCromatina: estrutura e funççãoão

Cromatina: estrutura e funCromatina: estrutura e funççãoãoCromatina:Cromatina:

DNA + Proteínas histônicas + Proteínas não histônicas

nos núcleos das células em interfase

+

RNA

Divisão celular:Divisão celular:

Cromatina �� Alterações em sua morfologia, composição e função

Unidades individualizadas

Cromossomos

No nNo núúcleo interfcleo interfáásico:sico:Cromatina: compactada, granulosa, filamentosa, com distribuição variada � células de um mesmo tecido / tipos celulares em diferentes estadosfisiológicos Diferentes fenótipos nucleares

No nNo núúcleo em divisão:cleo em divisão:Cromatina �� Altamente compactada

��

Cromossomos

Tipos de cromatinaTipos de cromatina

No nNo níível bioquvel bioquíímico e funcional a cromatina dividemico e funcional a cromatina divide--se:se:

Eucromatina: Eucromatina: Difusa, descompactada

Ativa na intérfase (transcrição)

Eucromatina~10% forma ativaRestante: inativa


Heterocromatina: Heterocromatina: Condensada

�� Constitutiva: é aquela de regiões centroméricas, teloméricas, ocorrendo em regiões correspondentes de ambos os cromossomoshomólogos. É geralmente rica em DNA repetitivo ou satélite e predominantemente não codificadora. Ex.: Heterocromatina

centroméricaHeterocromatina

Bandamento-C


Heterocromatina:Heterocromatina:

�� Facultativa: é considerada um estado fisiológico reprimido do DNA numa região condensada da cromatina, ocorrendo em apenas um dos cromossomos homólogos. Ex.: Heterocromatina de um dos cromossomos X de mamíferos placentários XX

Não apresenta não diferenças na composição do DNA em comparação com a eucromatina

Eucromatina Heterocromatinizada Facultativamente

Heterocromatina facultativa:Heterocromatina facultativa:

No cromossomo X �� Heterocromatinização ao acaso

Ex.: Corpúsculo de Barr

Cromossomo X em fêmeas


Em um mesmo organismo:Em um mesmo organismo:

Condensada em algumas cCondensada em algumas céélulaslulas

Descondensada em outrasDescondensada em outras


Por quê ocorre a inativação de um dos cromossomos X nas fêmeas?

A inativação dessas regiões ocorre ao acaso e ora o cromossomo provenienteda mãe pode ser inativa, ora do pai, e isso é passado às demais células

Igualar a quantidade de genes �� Quantidade de produtos gênicos

Compensação de dose

Ex.: Padrão de pelagem em gatas

Cromossomo X materno – Expressa pelagem preta

Cromossomo X paterno – Expressa pelagem laranja

Inativação aleatória do cromossomo X

HeterocromatinaHeterocromatina

VisualizaVisualizaçção da heterocromatina em ão da heterocromatina em diferentes materiais:diferentes materiais:

(a) Células de testículo de gafanhoto; (b) e (c) Cromocentros em células de Triatoma infestans; (d) Região de heterocromatina em um cromossomo politênico de Trichosiapubescen;(e) Cromocentros formados pela heterocromatina constitutiva em hepatócitos de camundongos;(f) Cromocentro em célula de Panstrongylus megistus

Cromocentros são um conjunto de porções heterocromáticas constitutivas que se associam entre si, formando corpos maiores e facilmente evidenciáveis.


Cromatina: composiCromatina: composiççãoão

Cromatina: composiCromatina: composiççãoão

�� DNA

�� RNA

�� Proteínas histônicas

�� Proteínas não histônicas

�� Enzimas nucleares

Classes de DNA:Classes de DNA:a) DNA de sequência única (10 a 80%): apresenta uma única cópia do

gene por genomaEx.: Genes estruturais � responsáveis pela codificação de proteínas com

diversas funções- Fisiológicas: hemoglobina- Nutritivas: ovalbumina- Estruturais: miosina

b) DNA de sequência medianamente repetidas (10 a 40%):constituído pelas famílias de genes codificantes

Ex.: Genes para RNAr, RNAt e histonasSequências funcionais não codificantes, como as repetições teloméricas, encontradas nos telômeros dos cromossomos

c) DNA de sequências altamente repetidas (0 a 50%): geralmente são seqüências muito curtas, compostas de poucos nucleotídeos, que se localizam, preferencialmente, nas regiões próximas ao centrômero (heterocromatina centromérica).

Ex.: Genes transcritos a partir do DNA satélite (região centromérica)

DNA: DNA:

RNAsRNAs::Os RNAs estão integrados de modo transitório à estrutura da cromatina,

constituindo em torno de 3% de sua composição e correspondendo às

cadeias recém transcritas em várias fases do seu processo de elongação

Tipos de Tipos de RNAsRNAs::

RNAt

RNAm

RNAr

ProteProteíínas nucleares:nas nucleares:a) Protaminas: proteínas básicas e simples, com baixo peso molecular. Ex.: SPTZ peixes

b) Histonas: são proteínas básicas nucleares e importantes componentes da estrutura da cromatina. São encontradas em grandes quantidades. As proteínas histônicas são classificadas com base em seu teor em lisina e arginina.

c) Proteínas não histônicas ou acídicas: desempenham variados papéis na cromatina, desde o estrutural até o enzimático, participando da regulação da atividade gênica

d) Enzimas nucleares: atuam nos processos de transcrição, replicação e reparo do DNA e também, nos processos de condensação e descondensação da cromatina

Classes e tipos de histonas

- H1: rica em lisina

- H2A e H2B: moderadamente ricas em lisina

- H3 e H4: ricas em arginina

FunFunçções:ões:As proteínas histônicas são importantes componentes da estrutura da

cromatina que podem estar participando como repressoras ou ativadoras durante a transcrição do DNA

Histonas: Histonas:

Tipos:Tipos:H1H2AH2BH3H4H5

Eletroforese em gel de poliacrilamina de proteínas histônicas extraídas de eritrócitos de frango

Histonas:Histonas:

� Altamente conservadas � Variam pouco em sequência de aminoácidos nas diferentes espécies

� Participam da arquitetura molecular das fibras cromatínicas

� Facilitam a ligação à molécula de DNA

� A razão de massa DNA / histona éigual a 1,0.

As molAs molééculas de histonas possuem três regiões:culas de histonas possuem três regiões:

- Região carboxiterminal;

- Região central, globular e hidrofóbica;

- Região amino-terminal

Histonas: Histonas:

Histona H1: região carboxiterminal é rica

em aminoácidos básicos, especialmente

lisina.

Outras histonas: maior quantidade de

aminoácidos básicos na região amino-

terminal e ricos em aminoácidos

hidrofóbicos nas regiões carboxiterminal

e globular

Região carboxiterminal

Região central globular hidrofóbica

Número de aminoácidos

Região amino-terminal

9

14

Não histônicas (NHC) ou Não histônicas (NHC) ou acacíídicasdicas: : FunFunçções:ões:

Apresentam inúmeras funções:- Enzimático- Estrutural- Transcrição-replicação � Regulação da expressão gênica- Condensação-descondensação

De modo geral, as proteínas não histônicas:� Têm seu aumento relacionado à alta atividade metabólica da célula;� Estão em maior concentração na cromatina ativa (eucromatina);� Ocorrem em menor concentração na cromatina inativa (heterocromatina);� Ocorrem mais em células em divisão do que em células que não estão se dividindo

Não histônicas (NHC) ou Não histônicas (NHC) ou acacíídicasdicas: :

O processo de condensação cromossômica inicia-se pela formação de um esqueleto proteico metafásico, formado por proteínas não histônicas, ao redor do qual se ligam alças de cromatina

Quando as histonas são removidas de um cromossomo metafásico, forma-se um halo de DNA não compactado. Este halo consiste de muitas alças de DNA ligadas à estrutura protéica

Principais funPrincipais funçções:ões:

Esquerda: cromossomo metafásico; Direita: cromossomo metafásico sem histonas, mostrando esqueleto de proteínas ácidas e uma nuvem formada pelas duas cadeias de DNA - uma de cada cromátide irmã (direita)

Cromatina: Cromatina: ultraestruturaultraestrutura

� Ris (1956): DNA + proteínas � Sistema de fibras de ≅ 200-250 A de

diâmetro com 4 fios em dupla hélice enrolados

� Du Praw (1965): experimentos utilizando tripsina em núcleos de células

embrionárias de abelha, observou que a fibra cromatínica exibe regiões mais

espessas (Fibra B) unidas por regiões mais finas (Fibra A)

� Du Praw / Bahr (1969):

- Fibra A, menos proteínas ligadas ao DNA

- Fibra B, filamento intacto (DNA + proteínas)

Essas observações sugeriram a existência de diferentes ordens de

compactação da estrutura nucleoprotéica

Cromatina: Cromatina: ultraestruturaultraestruturaHistHistóórico:rico:

� Olins e Olins (1974): núcleos de diferentes tecidos a um choque osmótico

com KCl a 0,2 M � Rompeu os núcleos, liberando fibras de cromatina

� Retirar as proteínas não histônicas

� Restando somente as proteínas histônicas + DNA

Ao microscópio eletrônico � Distribuição linear de pequenas unidades

aproximadamente esféricas, com um diâmetro de 7 nm, unidas entre si por

um filamento de 1,5 nm � Colar de contas


OlinsOlins e e OlinsOlins::

A) Estrutura nativa: fibra de 30 nmB) Após tratamento: cromatina em forma de contas


H2A (2) – H3 (2) – H1 (1) – H2B (2) – H4 (2)

� Kornberg et al. (1974): propuseram que a fibra cromatínica era constituída

por unidades repetitivas compostas por duas moléculas de cada uma das

histonas H2A, H2B, H3 e H4 e de cerca de 200 pares de bases (pb) de DNA.

E uma quinta histona, H1, se localizava superficialmente a esta unidade


� Oudet et al. (1975): denominam a unidade estrutural repetitiva da

cromatina de NucleossomoNucleossomo: unidade que se repete na cromatina (todas histonas + DNA)

Core nucleossômico (nucleóide) + Filamento espaçador


Core nucleossômico: � Composto por 146 pb de DNA � 1 e ¾ de volta de uma hélice ao redor de

um octâmetro de histonas (sem H1)

Cromatina: Cromatina: ultraestruturaultraestruturaNucleossomoNucleossomo::

- 1 molécula H1

- 2 moléculas de cada histona: H2A, H2B, H3 e H4

- 200 pb (filamento espaçador – spacer ou linker)

Core nucleossômico:Octâmero de histonas

+

1 ¾ de volta de DNA

Cromatina: Cromatina: ultraestruturaultraestruturaNucleossomoNucleossomo::

Cromatina: Cromatina: ultraestruturaultraestruturaComplexo de proteComplexo de proteíínas e DNA:nas e DNA:

� Felsenfeld (1978): papel das histonas

Histonas:Histonas:H1 (rica em lisina):� Função estabilizadora da estrutura do nucleossomo levando à formação de

mini-solenóides (“super-bead”)

H2A e H2B (pobres em lisina):� Importante na compactação do DNA

H3 e H4 (ricas em arginina):� Formam dímeros quando em solução sendo essenciais ao enrolamento do

DNA � papel central na formação do nucleossomo


A histona H1 é necessária para que os complexos histona-DNA formem a fibra de 30 nm de espessura, enrolando assim o DNA de uma forma ainda mais eficaz

A H1 liga-se externamente ao centro do nucleossomo e ao DNA de ligação,

constituindo o nucleossomo

Cromatina: Cromatina: ultraestruturaultraestruturaHistona H1:Histona H1:

Importante na compactação de nucleossomosadjacentes

Cromatina: Cromatina: ultraestruturaultraestruturaModelos de Modelos de WorcelWorcel para a posipara a posiçção de H1 (1979):ão de H1 (1979):

A. Entrelaçamento contínuo de H1 (Solenóide contínuo)

� A região N-terminal de uma molécula de H1 estaria próxima à região

C-terminal de outra � As interações H1-H1 poderiam estabilizar a fibra

� Levando a formação do filamento mais grosso

� A cada 6-8 nucleossomos � Mini-solenóide

B. Entrelaçamento descontínuo de H1 (Solenóide descontínuo)

� A cada 10 unidades repetitivas da cromatina, a molécula de H1

apareça substituída pela proteína UH2A (ubiquitina ligada à H2A),

� Esse modelo dá maior flexibilidade a fibra de 200 a 300 nml

A cada 6 nucleossomos � 30 nm � Mini-solenóide


Vista lateral Vista frontal

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaççãoão

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaççãoãoNNííveis de compactaveis de compactaçção do DNA:ão do DNA:

A. Molécula de DNA – 2nm (10 pb)Grau de empacotamento: 1

B. Nucleofilamento ou filamento nucleossômico� Fibra cromatínica de 10 nm de espessura� Arranjo linear dos nucleossomos (unidades repetitivas da cromatina) Grau de empacotamento: 6-7

C. Mini-solenóide ou solenóide� Fibra mais grossa – 20 a 30 nm de espessura� Organização helicoidal do nucleofilamento com 5 a 6 unidades repetitivas da

cromatina (nucleossomos)Grau de empacotamento ≅ 40

D. Série de domínio de alças – 300 nmGrau de empacotamento: 680

E. Conjunto de domínio de alças – 700 nm� Super-solenóide = CromossomoGrau de empacotamento: 12.000

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaççãoãoNNííveis de compactaveis de compactaçção do DNA:ão do DNA:

Empacotamento do DNA com histonas

Fibras de 10 nm de espessura

Separadas por segmento de DNA de ~ 80 pb

Enrolamento em fibras de 30 nm

Mini-solenóide

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaççãoãoEsquema das fibras Esquema das fibras cromatcromatíínicasnicas::

Mantida pela associação das Histonas H1

Fibra de 30 nm

Centro do solenóide

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaççãoãoNucleossomoNucleossomo::

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaççãoãoCromatina:Cromatina:

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaççãoãoOrganizaOrganizaçção ão cromatcromatíínicanica::

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaçção do ão do filamento filamento cromatcromatííniconico

Região curta de DNA dupla-hélice

Forma de “contas de um rosário” da

cromatina

Fibra de 30 nm de cromatina, formada por nucleossomos

compactados

Secção do cromossomo numa

forma estendida

Secção do cromossomo numa

forma estendida

Cromossomo metafásico completo

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaçção do ão do filamento filamento cromatcromatííniconico

Cromatina: nCromatina: nííveis de organizaveis de organizaççãoãoCompactaCompactaçção da hão da héélice do DNA:lice do DNA:


Cromossomos Cromossomos metafmetafáásicossicos

Cromossomos Cromossomos metafmetafáásicossicosNNííveis de organizaveis de organizaçção ão cromatcromatíínicanica: Cromossomo mit: Cromossomo mitóóticotico

Condensação: acompanhada pela fosforilação da H1

Cromossomos Cromossomos metafmetafáásicossicosCromossomos autossômicos:Cromossomos autossômicos:� Ocorrem aos pares (2n � 2 lotes cromossômicos) nas células somáticas

� Meiose: redução em número

� Número de cromossomos de uma espécie: determinada na metáfase

Cromossomo Metafásico

Cromossomos Cromossomos metafmetafáásicossicosNNúúmero, tamanho e posimero, tamanho e posiçção do centrômero:ão do centrômero:� Número: constante

� Tamanho: constante � na mesma fase do processo de divisão

� Posição do centrômero: principal diferenciação morfológica

Centrômero ou constrição primária: região em que se situa o cinetócoro

Cinetócoro: estrutura organizada da polimerização das fibras cromossômicas do fuso mitótico

�

no mesmo lote cromossômico, podem apresentar variabilidade

Cromossomos Cromossomos metafmetafáásicossicosClassificaClassificaçção: ão: baseada na posibaseada na posiçção do centrômeroão do centrômero

A posição do centrômero em um determinado cromossomo é constante, permitindo que este possa ser classificado como:

� Metacêntricos: centrômero na porção mediana do cromossomo;

� Submetacêntrico: centrômero deslocado para um dos braços cromossômicos;

� Acrocêntrico: centrômero se posiciona em uma das extremidades do

cromossomo

Cromossomos Cromossomos metafmetafáásicossicosClassificaClassificaçção: ão: baseada na posibaseada na posiçção do centrômeroão do centrômero

Cromossomos Cromossomos metafmetafáásicossicosCentrômeros, constriCentrômeros, constriçções secundões secundáárias e rias e telômerostelômeros::

Principais diferenciações morfológicas dos cromossomos

CentrômeroCentrômeroSondas específicas e FISH (Fluorescence in situ hybridization) � Identificar a região centromérica de um cromossomo em especial, inclusive em núcleos interfásicos



ConstriConstriçções secundões secundááriasrias

� Região Organizadora Nucleolar



ConstriConstriçções secundões secundáárias (rias (RONsRONs))

Bandamento NORBandamento NOR

Impregnação por íons prata

��

RONs



TelômerosTelômeros

Maccaçãoespecífica

��

Sondas teloméricas

DiferenDiferençças entre Cromatina e Cromossomoas entre Cromatina e Cromossomo

Empacotamento das fibrilasEmpacotamento das fibrilas

Importante na cromatina dos Importante na cromatina dos eucariontes:eucariontes:

a) Condensaa) Condensaçção dos ão dos cromossomos facilita a cromossomos facilita a

separaseparaçção durante a divisão ão durante a divisão celularcelular

b) A maneira exata em que a b) A maneira exata em que a região do genoma região do genoma éé enrolada enrolada em uma cem uma céélula particular lula particular determina a atividade dos determina a atividade dos genes naquela regiãogenes naquela região

Fibrilas não Fibrilas não empacotadas empacotadas

((NucleofilamentosNucleofilamentos))

Cromatina:Cromatina:

1. Conjunto de 1. Conjunto de cromossomos cromossomos

descondensadosdescondensados

2. Expressão interf2. Expressão interfáásica sica dos cromossomosdos cromossomos

EstruturaEstrutura

Pouca ou ausência de Pouca ou ausência de atividade de satividade de sííntesentese

Maior atividade de Maior atividade de ssííntesentese

FisiologiaFisiologia

DNA + ProteDNA + ProteíínasnasDNA + RNA + ProteDNA + RNA + ProteíínasnasComposiComposiçção quão quíímicamica

CromossomosCromossomosCromatinaCromatina

DDúúvidas???!!vidas???!!

Priscila Priscila PasqPasqüüettoetto MendonMendonççaaDoutoranda em GenDoutoranda em Genééticatica

UNESP / IBILCEUNESP / [email protected]@gmail.com

NNNNúúúúcleo Interfcleo Interfcleo Interfcleo Interfáááásico: sico: sico: sico: NuclNuclNuclNuclééééoloolooloolo

Disciplina: Biologia CelularDocentes responsáveis:

Profa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo OliveiraProfa. Rosana Silistino de Souza

Pós-graduanda:Msc. Priscila Pasqüetto Mendonça

- Estrutura + facilmente visEstrutura + facilmente visEstrutura + facilmente visEstrutura + facilmente visíííível (sem qualquer coloravel (sem qualquer coloravel (sem qualquer coloravel (sem qualquer coloraçççção): ão): ão): ão): ↑ ííííndice de refrandice de refrandice de refrandice de refraççççãoãoãoão

---- Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin (1839)(1839)(1839)(1839)

NUCLNUCLNUCLNUCLÉÉÉÉOLOOLOOLOOLO

- Organela celular, cuja funOrganela celular, cuja funOrganela celular, cuja funOrganela celular, cuja funçççção ão ão ão éééé a de produzir ribossomosa de produzir ribossomosa de produzir ribossomosa de produzir ribossomos

- Geralmente ovaladaGeralmente ovaladaGeralmente ovaladaGeralmente ovalada

- Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)

Tamanho, forma e nTamanho, forma e nTamanho, forma e nTamanho, forma e núúúúmeromeromeromero

depende do estado funcional da cdepende do estado funcional da cdepende do estado funcional da cdepende do estado funcional da céééélulalulalulalula

---- Tamanho Tamanho Tamanho Tamanho ---- Grandes: glândulas e neurôniosGrandes: glândulas e neurôniosGrandes: glândulas e neurôniosGrandes: glândulas e neurônios

---- Pequenos: Pequenos: Pequenos: Pequenos: ccccéééélslslsls da glia e endotda glia e endotda glia e endotda glia e endotééééliolioliolio

- NNNNúúúúmeromeromeromero ---- Normalmente 1 (linfNormalmente 1 (linfNormalmente 1 (linfNormalmente 1 (linfóóóócitos humanos)citos humanos)citos humanos)citos humanos)

---- +1: +1: +1: +1: hepathepathepathepatóóóócitoscitoscitoscitos, , , , ccccéééélslslsls vegetais (tulipas: 6vegetais (tulipas: 6vegetais (tulipas: 6vegetais (tulipas: 6----13)13)13)13)

---- OvOvOvOvóóóócitos de anfcitos de anfcitos de anfcitos de anfííííbios: 3000bios: 3000bios: 3000bios: 3000

ComposiComposiComposiComposiçççção Quão Quão Quão Quíííímicamicamicamica

- RNA: 3RNA: 3RNA: 3RNA: 3----17% (pp RNAr) (RNP)17% (pp RNAr) (RNP)17% (pp RNAr) (RNP)17% (pp RNAr) (RNP)

- DNArDNArDNArDNAr: at: at: at: atéééé 17% (seq17% (seq17% (seq17% (seqüüüüências altamente repetidas)ências altamente repetidas)ências altamente repetidas)ências altamente repetidas)

- ProteProteProteProteíííínas: atnas: atnas: atnas: atéééé 85% 85% 85% 85% ---- histonashistonashistonashistonas

---- acacacacíííídicas: Numatrina, Nucleolina, dicas: Numatrina, Nucleolina, dicas: Numatrina, Nucleolina, dicas: Numatrina, Nucleolina, RibogranulinaRibogranulinaRibogranulinaRibogranulina

---- enzimas: RNA polimerase I,enzimas: RNA polimerase I,enzimas: RNA polimerase I,enzimas: RNA polimerase I,DNA topoisomerase I e IIDNA topoisomerase I e IIDNA topoisomerase I e IIDNA topoisomerase I e II

MMMMéééétodos de Estudotodos de Estudotodos de Estudotodos de Estudo

Microscopia de LuzMicroscopia de LuzMicroscopia de LuzMicroscopia de Luz

- MMMMéééétodos todos todos todos citoqucitoqucitoqucitoquíííímicosmicosmicosmicos de basofilia (de basofilia (de basofilia (de basofilia (AgNORAgNORAgNORAgNOR, Azul de , Azul de , Azul de , Azul de ToluidinaToluidinaToluidinaToluidinae Variante da Concentrae Variante da Concentrae Variante da Concentrae Variante da Concentraçççção Eletrolão Eletrolão Eletrolão Eletrolíííítica Crtica Crtica Crtica Críííítica)tica)tica)tica)

D1, D2 - T. infestans ♂

←

D3 - T. infestans ♂

↓

<

*


Microscopia de LuzMicroscopia de LuzMicroscopia de LuzMicroscopia de Luz

-AcridinaAcridinaAcridinaAcridina Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado)Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado)Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado)Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado)

- Microscopia de contraste de faseMicroscopia de contraste de faseMicroscopia de contraste de faseMicroscopia de contraste de fase

MMMMéééétodos de Estudotodos de Estudotodos de Estudotodos de EstudoNuclNuclNuclNuclééééolo x olo x olo x olo x CitodiagnCitodiagnCitodiagnCitodiagnóóóósticosticosticostico

NuclNuclNuclNuclééééolo x olo x olo x olo x CitodiagnCitodiagnCitodiagnCitodiagnóóóósticosticosticostico

Parâmetros:Parâmetros:Parâmetros:Parâmetros:

• TamanhoTamanhoTamanhoTamanho

• NNNNúúúúmeromeromeromero

• FormaFormaFormaForma

• Razão Razão Razão Razão áááárea Nrea Nrea Nrea N

nunununu

Microscopia EletrônicaMicroscopia EletrônicaMicroscopia EletrônicaMicroscopia Eletrônica

---- MMMMéééétodo de Bernhardtodo de Bernhardtodo de Bernhardtodo de Bernhard →→→→ RNA + proteRNA + proteRNA + proteRNA + proteíííínas: nas: nas: nas: eleleleléééétrondensostrondensostrondensostrondensos

→→→→ DNA: DNA: DNA: DNA: eletronleletronleletronleletronlúúúúcidoscidoscidoscidos


AlAlAlAléééém de...m de...m de...m de...

- AnAnAnAnáááálises bioqulises bioqulises bioqulises bioquíííímicas e micas e micas e micas e microespectrofotometriamicroespectrofotometriamicroespectrofotometriamicroespectrofotometria

---- AutorradiografiaAutorradiografiaAutorradiografiaAutorradiografia

---- Agentes inibidores do RNArAgentes inibidores do RNArAgentes inibidores do RNArAgentes inibidores do RNAr

- AnAnAnAnáááálises moleculareslises moleculareslises moleculareslises moleculares


Experimento realizado na Experimento realizado na Experimento realizado na Experimento realizado na região região região região espaespaespaespaççççadoraadoraadoraadora ITSITSITSITS----1111

Figura 1Figura 1Figura 1Figura 1. (A) e (B)(A) e (B)(A) e (B)(A) e (B) Polimorfismo de tamanho para a região ITS-1 do DNAr de triatomíneos.Os valores aproximados em pares de base são: Ph 600 pb, Pm 800 pb, Tb 850 pb, Ti 750 pb e Tv 1000 pb, Rd e Rn 300 pb, Rr 250 pb. Letra L L L L designa os marcadores de tamanho molecular (1Kb Ladder, Gibco).

LLLL Rd R n Rr Tb Ti Tv LLLL

LLLL Ph Pm Tb Ti Tv Rd Rn Rr LLLL

AAAA

BBBB

2.036

163 6

1018

506

Tartarotti,E & Ceron, C. R, 2002

No microscNo microscNo microscNo microscóóóópio de luz: simplespio de luz: simplespio de luz: simplespio de luz: simples

---- ovalada, no movalada, no movalada, no movalada, no mááááximo alguns vacximo alguns vacximo alguns vacximo alguns vacúúúúolosolosolosolos

No microscNo microscNo microscNo microscóóóópio eletrônico: três grandes regiõespio eletrônico: três grandes regiõespio eletrônico: três grandes regiõespio eletrônico: três grandes regiões

Morfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do Nuclééééoloolooloolo

Centro Fibrilar (CF)Centro Fibrilar (CF)Centro Fibrilar (CF)Centro Fibrilar (CF)

Componente Fibrilar Denso Componente Fibrilar Denso Componente Fibrilar Denso Componente Fibrilar Denso (CFD)(CFD)(CFD)(CFD)

Componente Granular (CG)Componente Granular (CG)Componente Granular (CG)Componente Granular (CG)

1)1)1)1) Centro Fibrilar (CF)Centro Fibrilar (CF)Centro Fibrilar (CF)Centro Fibrilar (CF)

- Conjunto de finas fibrilas (4Conjunto de finas fibrilas (4Conjunto de finas fibrilas (4Conjunto de finas fibrilas (4----8nm)8nm)8nm)8nm)

- ↑↑↑↑ atividade atividade atividade atividade transcricionaltranscricionaltranscricionaltranscricional �� ↑↑↑↑ nnnn°°°° e tamanho dose tamanho dose tamanho dose tamanho dos CFsCFsCFsCFs

- ComposiComposiComposiComposiçççção Quão Quão Quão Quíííímica: mica: mica: mica: DNArDNArDNArDNAr, , , , DNA topoisomerase I, RNA DNA topoisomerase I, RNA DNA topoisomerase I, RNA DNA topoisomerase I, RNA polimerase I, RNP, Nucleolina, polimerase I, RNP, Nucleolina, polimerase I, RNP, Nucleolina, polimerase I, RNP, Nucleolina, Numatrina, FibrilarinaNumatrina, FibrilarinaNumatrina, FibrilarinaNumatrina, Fibrilarina

Morfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do Nuclééééolo (MET)olo (MET)olo (MET)olo (MET)


2) Componente Fibrilar Denso (CFD)2) Componente Fibrilar Denso (CFD)2) Componente Fibrilar Denso (CFD)2) Componente Fibrilar Denso (CFD)

- Ao redor dos Ao redor dos Ao redor dos Ao redor dos CFsCFsCFsCFs

- Fibrilas densamente empacotadas em redesFibrilas densamente empacotadas em redesFibrilas densamente empacotadas em redesFibrilas densamente empacotadas em redes

- ComposiComposiComposiComposiçççção Quão Quão Quão Quíííímica: mica: mica: mica: DNArDNArDNArDNAr , RNA polimerase I, Fibrilarina, , RNA polimerase I, Fibrilarina, , RNA polimerase I, Fibrilarina, , RNA polimerase I, Fibrilarina, Nucleolina, NumatrinaNucleolina, NumatrinaNucleolina, NumatrinaNucleolina, Numatrina

Morfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do Nuclééééolo (MET)olo (MET)olo (MET)olo (MET)3) Componente Granular (CG)3) Componente Granular (CG)3) Componente Granular (CG)3) Componente Granular (CG)

- Periferia, ao redor do CFDPeriferia, ao redor do CFDPeriferia, ao redor do CFDPeriferia, ao redor do CFD

- Estruturas granulares de 10 a 15nm de diâmetroEstruturas granulares de 10 a 15nm de diâmetroEstruturas granulares de 10 a 15nm de diâmetroEstruturas granulares de 10 a 15nm de diâmetro

- Local de armazenamento das prLocal de armazenamento das prLocal de armazenamento das prLocal de armazenamento das préééé unidades ribossômicasunidades ribossômicasunidades ribossômicasunidades ribossômicas

- ComposiComposiComposiComposiçççção Quão Quão Quão Quíííímica: RNP, Fibrilarina, Nucleolina, mica: RNP, Fibrilarina, Nucleolina, mica: RNP, Fibrilarina, Nucleolina, mica: RNP, Fibrilarina, Nucleolina, RibogranulinaRibogranulinaRibogranulinaRibogranulina

Morfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do Nuclééééoloolooloolo


4) Esqueleto Nucleolar4) Esqueleto Nucleolar4) Esqueleto Nucleolar4) Esqueleto Nucleolar

- Região amorfa relacionada com o esqueleto nuclearRegião amorfa relacionada com o esqueleto nuclearRegião amorfa relacionada com o esqueleto nuclearRegião amorfa relacionada com o esqueleto nuclear

- ComposiComposiComposiComposiçççção Quão Quão Quão Quíííímica: Protemica: Protemica: Protemica: Proteíííínas acnas acnas acnas acíííídicasdicasdicasdicas

5) Vac5) Vac5) Vac5) Vacúúúúolos Nucleolaresolos Nucleolaresolos Nucleolaresolos Nucleolares- ÁÁÁÁreas reas reas reas ““““vaziasvaziasvaziasvazias””””????????????????- DDDDúúúúvidas... Artefatos??? vidas... Artefatos??? vidas... Artefatos??? vidas... Artefatos???

ÁÁÁÁreas menos densas???reas menos densas???reas menos densas???reas menos densas???

Morfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do NuclMorfologia do Nuclééééolo (MET)olo (MET)olo (MET)olo (MET)6) Cromatina associada ao Nucl6) Cromatina associada ao Nucl6) Cromatina associada ao Nucl6) Cromatina associada ao Nuclééééoloolooloolo

- Ao redor Ao redor Ao redor Ao redor –––– envia ramificaenvia ramificaenvia ramificaenvia ramificaçççções intranucleolaresões intranucleolaresões intranucleolaresões intranucleolares

- Cromatina Cromatina Cromatina Cromatina perinucleolarperinucleolarperinucleolarperinucleolar –––– não faz parte do nuclnão faz parte do nuclnão faz parte do nuclnão faz parte do nuclééééoloolooloolo

- Segmentos cromossômicos especSegmentos cromossômicos especSegmentos cromossômicos especSegmentos cromossômicos especííííficos ficos ficos ficos ---- RONsRONsRONsRONs

a) Nucla) Nucla) Nucla) Nuclééééolos Reticulados olos Reticulados olos Reticulados olos Reticulados (nucleolonemas)(nucleolonemas)(nucleolonemas)(nucleolonemas)

- Região granular perifRegião granular perifRegião granular perifRegião granular periféééérica + Região rica + Região rica + Região rica + Região fibrilar centralfibrilar centralfibrilar centralfibrilar central

b) Compactosb) Compactosb) Compactosb) Compactos---- Essencialmente granulosos (massa Essencialmente granulosos (massa Essencialmente granulosos (massa Essencialmente granulosos (massa

celular compacta)celular compacta)celular compacta)celular compacta)

c) Em anelc) Em anelc) Em anelc) Em anelCamadas concêntricas:Camadas concêntricas:Camadas concêntricas:Camadas concêntricas:

---- central filamentosacentral filamentosacentral filamentosacentral filamentosa---- cortical granulosacortical granulosacortical granulosacortical granulosa

Tipos de NuclTipos de NuclTipos de NuclTipos de Nuclééééoloolooloolo

Ex.: Ex.: Ex.: Ex.: TriatomaTriatomaTriatomaTriatoma infestansinfestansinfestansinfestans

Ex.: AnfEx.: AnfEx.: AnfEx.: Anfííííbiosbiosbiosbios

Ex.: Ex.: Ex.: Ex.: AlliumAlliumAlliumAllium cepacepacepacepa

Fisiologia do NuclFisiologia do NuclFisiologia do NuclFisiologia do Nuclééééoloolooloolo

---- Biogênese dos RIBOSSOMOSBiogênese dos RIBOSSOMOSBiogênese dos RIBOSSOMOSBiogênese dos RIBOSSOMOS

---- FunFunFunFunçççção bem estabelecida com observaão bem estabelecida com observaão bem estabelecida com observaão bem estabelecida com observaçççções de Brown em 1964 ões de Brown em 1964 ões de Brown em 1964 ões de Brown em 1964 ((((XenopusXenopusXenopusXenopus llllaevisaevisaevisaevis))))

---- Defeito cromossômico: formaDefeito cromossômico: formaDefeito cromossômico: formaDefeito cromossômico: formaçççção dos nuclão dos nuclão dos nuclão dos nuclééééolos (perda de olos (perda de olos (perda de olos (perda de DNArDNArDNArDNAr))))

---- NNNNúúúúmero de nuclmero de nuclmero de nuclmero de nuclééééolos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa)olos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa)olos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa)olos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa)

Aa X AaAa X AaAa X AaAa X Aa

¼¼¼¼ AA: AA: AA: AA: ½½½½ Aa: Aa: Aa: Aa: ¼¼¼¼ aaaaaaaa

Experimento de Miller e Experimento de Miller e Experimento de Miller e Experimento de Miller e BeattyBeattyBeattyBeatty (1967)(1967)(1967)(1967)

- OvOvOvOvóóóócitos de citos de citos de citos de TriturusTriturusTriturusTriturus viridescensviridescensviridescensviridescens

- Choque osmChoque osmChoque osmChoque osmóóóótico tico tico tico –––– separaseparaseparaseparaçççção das regiões nucleolaresão das regiões nucleolaresão das regiões nucleolaresão das regiões nucleolares

- CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares, CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares, CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares, CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares, por RNA 45S transcritopor RNA 45S transcritopor RNA 45S transcritopor RNA 45S transcrito

- CG: molCG: molCG: molCG: molééééculas de RNA precursor da grande subunidade 32Sculas de RNA precursor da grande subunidade 32Sculas de RNA precursor da grande subunidade 32Sculas de RNA precursor da grande subunidade 32S


- DNArDNArDNArDNAr em tandemem tandemem tandemem tandem

- Muitas molMuitas molMuitas molMuitas molééééculas de RNAr transcritasculas de RNAr transcritasculas de RNAr transcritasculas de RNAr transcritas

- Regiões de DNA espaRegiões de DNA espaRegiões de DNA espaRegiões de DNA espaççççadoradoradorador

- “Á“Á“Á“Árvore de Natalrvore de Natalrvore de Natalrvore de Natal””””


---- Cada RNA polimerase se associa ao promotor , e se move ao Cada RNA polimerase se associa ao promotor , e se move ao Cada RNA polimerase se associa ao promotor , e se move ao Cada RNA polimerase se associa ao promotor , e se move ao longo do longo do longo do longo do DNArDNArDNArDNAr

Metabolismo NucleolarMetabolismo NucleolarMetabolismo NucleolarMetabolismo Nucleolar

Subunidade maior (60S): Subunidade maior (60S): Subunidade maior (60S): Subunidade maior (60S): RNAr 28S + RNAr 5,8S RNAr 28S + RNAr 5,8S RNAr 28S + RNAr 5,8S RNAr 28S + RNAr 5,8S + RNAr 5S + prote+ RNAr 5S + prote+ RNAr 5S + prote+ RNAr 5S + proteíííínas nas nas nas

nucleolaresnucleolaresnucleolaresnucleolares

Subunidade menor (40S): Subunidade menor (40S): Subunidade menor (40S): Subunidade menor (40S): RNAr 18S + proteRNAr 18S + proteRNAr 18S + proteRNAr 18S + proteíííínas nas nas nas

nucleolaresnucleolaresnucleolaresnucleolares

ProteProteProteProteíííínas: Importadas do citoplasmanas: Importadas do citoplasmanas: Importadas do citoplasmanas: Importadas do citoplasma

Metabolismo NucleolarMetabolismo NucleolarMetabolismo NucleolarMetabolismo Nucleolar

S = Unidade de S = Unidade de S = Unidade de S = Unidade de SweedbergSweedbergSweedbergSweedberg –––– éééé a unidade que se utiliza na medida da velocidade com a unidade que se utiliza na medida da velocidade com a unidade que se utiliza na medida da velocidade com a unidade que se utiliza na medida da velocidade com a qual se sedimentam as parta qual se sedimentam as parta qual se sedimentam as parta qual se sedimentam as partíííículas no campo de centrifugaculas no campo de centrifugaculas no campo de centrifugaculas no campo de centrifugaçççção. Ocorre influência do ão. Ocorre influência do ão. Ocorre influência do ão. Ocorre influência do

tamanho,tamanho,tamanho,tamanho, densidade e forma da partdensidade e forma da partdensidade e forma da partdensidade e forma da partíííícula e tambcula e tambcula e tambcula e tambéééém do meio no qual as partm do meio no qual as partm do meio no qual as partm do meio no qual as partíííículas estão culas estão culas estão culas estão suspensas.suspensas.suspensas.suspensas.

Metabolismo NucleolarMetabolismo NucleolarMetabolismo NucleolarMetabolismo NucleolarProcessamento do RNA:Processamento do RNA:Processamento do RNA:Processamento do RNA:

RNA 45 SRNA 45 SRNA 45 SRNA 45 S

RNA 5,8 SRNA 5,8 SRNA 5,8 SRNA 5,8 S

RNA 32 S RNA 20 SRNA 32 S RNA 20 SRNA 32 S RNA 20 SRNA 32 S RNA 20 S

RNA 28 S RNA 18 SRNA 28 S RNA 18 SRNA 28 S RNA 18 SRNA 28 S RNA 18 S++++

++++ RNA 5 SRNA 5 SRNA 5 SRNA 5 S

Subunidade Subunidade Subunidade Subunidade menormenormenormenor

Subunidade Subunidade Subunidade Subunidade maiormaiormaiormaior

Regiões Organizadoras Nucleolares (Regiões Organizadoras Nucleolares (Regiões Organizadoras Nucleolares (Regiões Organizadoras Nucleolares (RONsRONsRONsRONs))))- Moldes de DNA relacionados com a sMoldes de DNA relacionados com a sMoldes de DNA relacionados com a sMoldes de DNA relacionados com a sííííntese de estruturas ntese de estruturas ntese de estruturas ntese de estruturas

nucleolares nucleolares nucleolares nucleolares �� Visualizadas como Visualizadas como Visualizadas como Visualizadas como zonas de constriczonas de constriczonas de constriczonas de constricçççções ões ões ões secundsecundsecundsecundáááárias nos cromossomos que apresentam regiões satrias nos cromossomos que apresentam regiões satrias nos cromossomos que apresentam regiões satrias nos cromossomos que apresentam regiões satééééliteslitesliteslites

- RONsRONsRONsRONs: local do cromossomo respons: local do cromossomo respons: local do cromossomo respons: local do cromossomo responsáááável pela codificavel pela codificavel pela codificavel pela codificaçççção do ão do ão do ão do RNA 45SRNA 45SRNA 45SRNA 45S

Cromossomos HumanosCromossomos HumanosCromossomos HumanosCromossomos Humanos

-RONsRONsRONsRONs: zonas de constric: zonas de constric: zonas de constric: zonas de constricçççções secundões secundões secundões secundáááárias rias rias rias ---- regiões satregiões satregiões satregiões satééééliteslitesliteslites

RepresentaRepresentaRepresentaRepresentaçççção esquemão esquemão esquemão esquemáááática da metade tica da metade tica da metade tica da metade do carido carido carido carióóóótipotipotipotipo

- Divisão celular: intDivisão celular: intDivisão celular: intDivisão celular: intéééérfase e inrfase e inrfase e inrfase e iníííício da prcio da prcio da prcio da próóóófasefasefasefase

- ““““DesapareceDesapareceDesapareceDesaparece””””: final da pr: final da pr: final da pr: final da próóóófase (mitose) e no fase (mitose) e no fase (mitose) e no fase (mitose) e no dipldipldipldiplóóóóteno (meiose)teno (meiose)teno (meiose)teno (meiose)

- ““““ReapareceReapareceReapareceReaparece”””” na telna telna telna telóóóófasefasefasefase

-Como o nuclComo o nuclComo o nuclComo o nuclééééolo de reorganiza?!olo de reorganiza?!olo de reorganiza?!olo de reorganiza?!

Biogênese do NuclBiogênese do NuclBiogênese do NuclBiogênese do Nuclééééoloolooloolo

1)1)1)1) ReconstruReconstruReconstruReconstruçççção a partir dos corpão a partir dos corpão a partir dos corpão a partir dos corpúúúúsculos prsculos prsculos prsculos préééé----nucleolares nucleolares nucleolares nucleolares agrupados nas agrupados nas agrupados nas agrupados nas RONsRONsRONsRONs

2) Reconstru2) Reconstru2) Reconstru2) Reconstruçççção a partir de Matriz prão a partir de Matriz prão a partir de Matriz prão a partir de Matriz préééé----existenteexistenteexistenteexistente

3) Forma3) Forma3) Forma3) Formaçççção de estrutura totalmente nova a partir da RONão de estrutura totalmente nova a partir da RONão de estrutura totalmente nova a partir da RONão de estrutura totalmente nova a partir da RON

Biogênese do NuclBiogênese do NuclBiogênese do NuclBiogênese do Nuclééééoloolooloolo

Três hipTrês hipTrês hipTrês hipóóóóteses:teses:teses:teses:

Fim!

Priscila Pasqüetto MendonçaDoutoranda em Genética

UNESP / [email protected]

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