Cósmidos clonación vectorial

Cósmidos

José David Navarro Jiménez; Iván Kerguelén; Mario ChadidMedicina

Universidad de Sucre

2014

Introducción

Conceptos

• El término DNA recombinante hace referencia a segmentos omoléculas de DNA que no se encuentran juntas de maneranatural.

• Este término se reserva a las moléculas de DNA producidas porla unión de segmentos que provienen de diferentes fuentesbiológicas.

• La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas queprovienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas ametodologías genéricas desarrolladas originalmente para lainvestigación de bacterias y de virus.

Procedimientos

• La utilización del DNA recombinante es una herramientapoderosa para el aislamiento de poblaciones puras desecuencias específicas de DNA a partir de una población desecuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen unaserie de pasos:

Procedimientos

1- Las endonucleasas de restricción,

cortan el DNA por secuencias

nucleotídicas específicas.

2- Los fragmentos productos de las

enzimas de restricción se unen a DNA

vectorial.

Los vectores pueden replicarse

autónomamente en la célula

huésped y facilitan la

manipulación

3. La molécula de DNA

recombinante, se transfiere

a una célula huésped.

4- Al replicarse las

células huésped, las

células descendientes

heredan el DNA

recombinante clones.

5-Los segmentos de

DNA clonados se

recuperarse, purifican y

analizan.

Fabricación de DNA recombinante

El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrecenuevas oportunidades para la investigación, ya quesimplifica la obtención de grandes cantidades de DNA quecodifican genes específicos, y facilita las investigaciones dela organización, estructura y expresión génicas.

Procedimiento


Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollode la naciente industria biotecnológica, que estásuministrando un número creciente de productos almercado.

Procedimiento


La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipode enzimas denominadas endonucleasas de restricción.

Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica denucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula deDNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia.

Procedimiento

Enzimas de restricción


El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber, Hamilton Smith yDaniel Nathans por su investigación sobre las enzimas de restricción.Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimasde restricción diferentes.

Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a quelimitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleicoinvasor

Procedimiento



Las enzimas de restricción se denominan según el organismoen el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico.

La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII sedescubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos deenzimas de restricción:

Procedimiento



• Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA enuna posición aleatoria a cierta distancia del sitio derestricción. No se utilizan normalmente en la investigación deDNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.

Procedimiento



• Las enzimas de Tipo II: reconocen una secuenciaespecífica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNAcon absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida.

• Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinantepuesto que cortan en sitios específicos.

• Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II sonsimétricas es decir, la secuencia de una de las cadenas leídaen dirección 5' Ö 3' es la misma que la secuencia de lacadena complementaria leída también en dirección 5' Ö 3'.

Procedimiento



Procedimiento



Otras tipo dos

Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partirDNA cortado con enzimas que dejan extremos romos.

En este método se utiliza la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal para crear colas complementariasmediante la adición de fragmentos de poli-dA y de poli-dT.

Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes ypara crear moléculas de DNA recombinante, que son unidascovalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.

Procedimiento



Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, unsegmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huéspedy replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente,moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, unamolécula de DNA debe tener unas determinadascaracterísticas:

Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores:

- los plásmidos

- los bacteriófagos

- los cósmidos

Procedimiento

Vectores


Características

1. Debe poder replicarse independientemente junto con elsegmento de DNA que transporta.

2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas derestricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios derestricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizanpara insertar segmentos de DNA cortados con la mismaenzima.

3. Debe tener algún marcador de selección (normalmentegenes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas quela célula huésped no tiene) para poder distinguir las célulashuésped que transportan el vector de las que no lo contienen.

4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.

Procedimiento

Vectores


• Plásmidos.

- Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadenaextracromosómicas de origen natural que tienen un origen dereplicación (ori+).

- Se replican autónomamente en las células bacterianas.

- Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se hanmodificado o diseñado plásmidos de manera que contengan unnúmero limitado de sitios de restricción y genes deresistencia a antibiótico s específicos.

Procedimiento

Vectores


• Plásmidos.

Procedimiento

Vectores


• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13

- Se extrae el DNA de una preparación de fago lambda y seelimina el grupo central de genes por tratamiento con unaenzima de restricción.

- El DNA a clonar se corta con la misma enzima y se liga entrelos brazos del cromosoma de lambda.

- Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de lasproteínas del fago para formar un virus recombinante.

- Este virus puede infectar células bacterianas y replicar sucromosoma, incluido el inserto de DNA.

Procedimiento

Vectores


• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13

Procedimiento

Vectores

Cósmidos

Descritos por primera vez por Collins y Hohn en 1978.

Son vectores híbridos construidos utilizando partes delcromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico.

Contienen la secuencia “cos” del fago lambda.

Secuencias plasmídicas de replicación y de genes deresistencia a antibióticos.

Cósmidos

Su DNA, que contiene DNA insertado, se empaqueta en lacápside proteica de lambda para formar partículas fágicasinfectivas.

Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replicacomo un plásmido.

Los cósmidos pueden transportar insertos de DNA muchomás grandes que los que lambda puede llevar.

Cósmidos

Características

Características

Cósmidos: 37-52 kb de ADN.

Vectores fágicos: 15 kb.

Plásmidos: 1- 10kb (limitados).

Cósmidos

Características

Cósmidos

Sitios de restricción

para la clonación

Características

Pueden replicarse como plásmidos si tienen un origen dereplicación adecuados.

Generalmente contienen marcadores genéticos que permitensu selección en los dos sistemas huésped.

SV40 ori en células de mamífero.

ColE1 ori para la replicación del ADN de doble cadena.

f1 ori para la replicación de ADN de cadena sencilla enprocariotas.

Cósmidos

Cósmidos

Pasos en la clonación usando cósmidos como vectores

Aplicación

Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

• Sacarosa

• PTS

• SACAROSA 6-fostato

Hidrólisis

• D-glucosa -6-fosfato

• D-fructosa

Fosforilación• Fructokinasa

dependiente de ATP

Vías metabólicas


OBJETIVOS:

• Determinar la capacidad de nueve cepas de E. colienteropatógenas.

• Aislar y caracterizar los genes involucrados.


9 cepas de E. coli

MackScr0.2%

M9Scr0.2%


Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena.

pCP13

E.Coli

W3110Scr-

W3110

Sacarosa +

Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena.

• Las nueve cepas de E. coli crecen en medios deM9Scr0.2% y producen colonias rojas en MackScr0.2%.

Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatogena

Resultados y Discusión

• Las nueve cepas utilizadas son capaces de crecer en presencia de sacarosa pero su capacidad de emplear esta azúcar es diferente.

• La utilización de un procedimiento de selección positiva nos permitió aislar los genes involucrados en el catabolismo de esta azúcar.

Clonación y caracterización de genes involucrados en la utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatogena

Conclusiones

Gracias

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• Características de un vector

• ¿Qué es un cósmido?

• Diferencias entre cósmido, plásmido y bacteriófago

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