1

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi

Biomedicinska analytikerprogrammet

Examensarbete, 15 hp

COMPARATIVE STUDY OF HYDROLYSIS PERFORMED WITH MODERN

MICROWAVE TECHNIQUE AND THE TRADITIONAL METHOD

Seid Hosen Seid Tahir

Ethos1 Gallenkamp

Handledare: Bo Ek

Institutionen för biokemi och organisk kemi

2

ABSTRACT

Proteins are vital to all cells in the body. They consist of long chains of amino acids. To be

able to study the amino acid composition of a protein it is necessary to hydrolyse it, followed

by separation and quantification. When the protein is hydrolysed, in this case ß-lactoglobulin,

the protein is divided into individual amino acids. The method that traditionally has been used

to hydrolyse proteins takes 24-72 hours to complete. Recently a new microwave heating

technique was introduced. With the Ethos1 microwave oven it takes less than one hour to

hydrolyse proteins. The objective of this study was to see if the result of the hydrolysis with

the new microwave oven technique had the same quality as the previously used method. If the

microwave technique can hydrolyse proteins with as good results as the old oven, then it will

significantly reduce test turnaround times. The result of this study indicates that the

microwave technique is just as reliable as the older method, and thus a good and time saving

alternative.

KEYWORDS: Hydrolysis; Amino acids; Protein; Microwave

3

1. INTRODUKTION

Proteiner utgör, efter vatten, största delen av cellens innehåll. Namnet protein kommer

från grekiskans proteios som betyder det första eller förnämsta (Nylander, 1997).

Proteiner ingår i kroppens alla celler. Ofta beskrivs protein därför som en av kroppens

byggstenar. De behövs för tillväxt och underhåll av kroppen. Proteiner är viktiga

beståndsdelar i muskler, men har även andra viktiga funktioner. Nästan alla hormoner och alla

enzymer är proteiner, vilka spelar roll i en mängd olika processer i kroppen. Flera ämnen

måste vara bundna till proteiner för att kunna transporteras i blodet. Exempel på det är

hemoglobin som transporterar syre och lipoproteiner som bär med sig fett.

Protein har således nödvändiga uppgifter i kroppen som inte kan ersättas av andra ämnen. De

kan också vara en energikälla, vid sidan av kalorier (energi) från kolhydrater och fett.

Proteiner har alltså många uppgifter i kroppen och finns i nästan alla livsmedel. Kroppen

behöver under en dag tillföras alla aminosyror den inte kan göra själv. Detta är de så kallade

essentiella aminosyrorna och de är totalt åtta stycken. Resten kan kroppen göra själv efter

behov och de kallas därför icke-essentiella.

Proteiner är uppbyggda av långa aminosyrekedjor. Aminosyror är karboxylsyror

innehållande minst en aminogrupp samt en R-grupp som ger aminosyran dess identitet.

Aminosyror kopplas samman och bildar polypeptider. Ändarna på peptider kallas N-terminal

(aminogrupp) och C-terminal (karboxylgrupp). Varje aminosyra är sammanfogad med nästa

genom en peptidbindning. Peptidbindningen uppstår då karboxylgruppen på en aminosyra

reagerar med aminogruppen på en annan aminosyra. På så vis utgörs polypeptidkedjan,

proteinets ryggrad, av en α-kol bundet till en amidgrupp bundet till nästa α-kol etc. Ett protein

består av en eller flera sådana polypeptidkedjor. För varje protein är sammansättningen av

aminosyror och ordningsföljden av dessa unik. Proteiner delas in i fiberproteiner och

4

globulära proteiner. Fiberproteinerna har en trådig form och de globulära proteinerna har en

rundare form.

Aminosyraanalys betraktas som det säkraste sättet att koncentrationsbestämma

proteiner och peptider. Det finns flera metoder t.ex. absorbansmätning inom UV-området,

men metoden kräver ett relativt rent material eftersom t.ex. även nukleinsyror absorberar UV-

ljus. Proteinets sammansättning kan också påverka vilken våglängd som måste användas.

Lowry och BCA (Bicinchoninic acid) använder sig av kopparjoner och är beroende av

mängden peptidbindningar och aromatiska aminosyror. Bradfordmetoden baseras på

proteinbindning av Coomassie Brilliant Blue till främst arginin och lysin varvid

absorbtionsmaximum ändras. För båda metoderna gäller att resultatet blir olika för varje

protein, då de innehåller olika antal av nämnda aminosyror. En standardkurva med det protein

man mäter och ett rent protein är nödvändiga för att få tillförlitliga resultat med de metoderna.

Vid aminosyraanalys degraderas provet till aminosyror och mängden av varje komponent

bestäms m.h.a. kromatografi. Den metoden har inte de begränsningar som ovanstående

metoder har och är därför den mest noggranna metoden.

Aminosyraanalys består av tre delar, hydrolysering av proteinet man vill studera,

kromatografisk separation, samt detektion och kvantifiering av de fria aminosyrorna.

Hydrolys är en nedbrytningsprocess där proteinet bryts ner när vattenmolekyler

adderas. Den kan, när det gäller proteiner, antingen vara katalyserad av hydroxoniumjoner

(syra) eller hydroxidjoner (bas). I den här studien användes syrakatalyserad hydrolys. För att

en analys ska bli korrekt måste hydrolysen vara väl genomförd (Fountoulakis och Lahm,

1998), d.v.s. för att kunna lita på den påföljande aminosyraanalysen måste man veta att

proteinet verkligen har hydrolyserats fullständigt eller att utbytet av de frisatta enskilda

aminosyrorna är känt. Man vet t.ex. att utbytet av serin är 90% under standardbetingelser och

kan då kompensera mätvärdet i motsvarande grad.

5

Ett viktigt område för aminosyraanalyser är halt- och renhetsbestämning av

utgångsmaterial för peptidsyntes inom t. ex läkemedelsindustrin. Detta krävs i vissa fall av

FDA (Federal Drug Agency) i USA, för att godkänna en produkt baserad på aminosyraderivat

(Bo Ek, muntlig kommunikation, 2011). Ett annat användningsområde är möjligheten att mäta

andelen bindningsmedel i kött- och charkuteriprodukter. Många europeiska länder har en

gräns för hur mycket bindningsmedel kött- och charkuteriprodukter får innehålla. Proteinet

kollagen utgör en stor del i de bindningsmedel som används och kollagen innehåller en hög

halt av aminosyran hydroxyprolin. Andra muskelproteiner innehåller så gott som inget

hydroxyprolin, vilket gör att man kan bestämma andelen bindningsmedel genom att analysera

produkten för hydroxyprolin (Engelhart, 1990).

Olika hydrolysmetoder används även för att ta hand om slam på ett så effektivt sätt

som möjligt. Davidsson et al. (2008) har utvärderat olika hydrolysmetoder för ändamålet, men

kunde inte utse en enskild metod som bättre än någon annan då det fanns flera variabler som

påverkade resultatet. Olika hydrolysmetoder lämpade sig därför bäst vid olika förhållanden.

Enzymatisk hydrolys av mjölkprotein har länge använts för att framställa t.ex.

produkter för spädbarn med mjölkproteinsallergi eller medfödda metabola

funktionsnedsättningar (Abu-Tarbush och Ahmed, 2005) t. ex. fenylketonuri (PKU), som är

en medfödd metabol sjukdom orsakad av att enzymet fenylalaninhydroxylas inte fungerar.

Som ett resultat av detta kan den essentiella aminosyran fenylalanin inte konverteras till

tyrosin utan ackumuleras istället i kroppen (ten Hoedt et al., 2011). Enzymatisk hydrolys är

vanlig inom livsmedelsindustrin för att spjälka ut protein ur växter, fördelen med enzymatisk

hydrolys när det handlar om livsmedel är att det går att använda sig av enzymer som bryter

peptidkedjorna på specifika ställen. På så vis förhindrar man att peptidkedjorna bryts ner i

alltför små enheter eller blir till fria aminosyror. Små peptider kan nämligen ge en bitter smak

som inte är önskvärd för livsmedel (Hrcková, 2002). Enzym kan inte användas när man vill

6

bryta alla peptidbindningar, varför syrakatalyserad hydrolys som ger större andel fria

aminosyror användes i det beskrivna arbetet.

På Aminosyraanalyscentralen vid Uppsala Universitet görs bestämningar av mängden

eller halten av olika aminosyror i olika typer av proteinhaltiga prover. För att frigöra

aminosyrorna så att de kan analyseras hydrolyseras först provet. Hydrolys sker traditionellt

enligt en beprövad metod, i 6M HCl under 24 timmar i luftevakuerade rör för att minimera

risken för oxidation av aminosyrorna.

Det gamla klassiska sättet, på vilket man utfört proteinhydrolys under de senaste 50

åren, innebär att proverna upphettas till 110 oC under 24-72 timmar i närvaro av saltsyra

(HCl), som är den vanligaste metoden. Hydrolys kan dock även utföras i närvaro av en basisk

lösning (vanligast NaOH eller KOH) eller med en enzymatisk nedbrytningsmetod

(Fountoulakis och Lahm, 1998). Efter analysens slutförande kan man jämföra mängden

faktiska aminosyror i provet med den kända sammansättningen av aminosyror och således

kan man räkna fram mängden av exempelvis ett protein eller en peptid i utgångsprovet, vilket

är det tillvägagångssätt som vi valt i den här studien.

24-timmars hydrolys är en mycket tidskrävande process och proverna hanteras

manuellt ett och ett. Därför vore en alternativ, effektivare, metod mycket värdefull. Genom att

använda sig av mikrovågor vid upphettningen av provet och dessutom hetta upp till en högre

temperatur kan man förkorta hydrolystiden från 24 timmar till under en timme, vilket skulle

spara mycket arbetstid. Proteinhydrolys för aminosyreanalys med hjälp av mikrovågsteknik

rapporterades för första gången 1987 och har utvecklats sedan dess. Mikrovågstekniken har i

tidigare studier visat sig vara jämförbar eller överlägsen den traditionella 24-timmars

hydrolystekniken (Engelhart, 1990 och Margolis et al., 1991). Andra studier visar att

mikrovågstekniken inte håller samma standard som den traditionella metoden (Weiss et al.,

7

1998). Syftet med denna studie var att undersöka om man får samma resultat med

mikrovågsteknik som med den traditionella 24-timmars proteinhydrolysen som hittills

använts vid Aminosyraanalyscentralen vid Uppsala Universitet.

För den nya mikrovågsbaserade analysen användes ett kommersiellt instrument kallat

Ethos1 som är relativt nytt på marknaden. Proteinet som valdes till analys i den jämförande

metodanalysen var ß-lactoglobulin. ß-Laktoglobulin är det vanligast förekommande

vassleproteinet i komjölk. Det tillhör lipocalin-proteinfamiljen och är en av de huvudsakliga

allergenerna i mjölk (Rytkönen et al., 2006) samtidigt som det har ett högt näringsvärde

jämfört med andra protein, eftersom det har ett högt innehåll av essentiella aminosyror och är

relativt lättsmält (Sindayikengera and Xia, 2006). ß-Laktoglobulin är dock inte helt lätt att

hydrolysera (Rytkönen et al., 2006), anledningen till valet var att dess sammansättning av

aminosyror är välkänd och man vet hur utbytet av respektive aminosyra ser ut.

8

2. MATERIAL OCH METODER

2.1 Hydrolys med den äldre metoden.

Vid analys enligt den äldre metoden började man med att rista namn på glasrören med

en tandläkarborr. Sedan vägdes 5,0 mg ß-laktoglobulin upp och fördes försiktigt över till röret

och den exakta vikten antecknades. Proteinet blandades med 2 ml 6M HCl och 1000 nmol

norleucin. Proven vortexades tills de blev grumliga, då var proven riktigt blandade med

saltsyran. En gasolbrännare användes för att smälta provrörshalsarna som sedan drogs ut som

i figur 1.

Figur 1 Figuren illustrerar hur man drar ut en provrörshals med svetslåga.

Proverna frystes till is med hjälp av kolsyreis vid - 78,5 °C, därefter inkuberades

provrören i vakuum i 10 minuter. När alla provrören var luftevakuerade slutsvetsades de utan

att luft släpptes in (figur 2).

9

Figur 2 Ett slutsvetsat provrör.

Till slut placerades de slutsvetsade provrören i ugnen för hydrolys i 24 timmar vid

110o C. Efter exakt 24 timmar öppnades rören genom att en skåra ristades ca 1 cm från toppen

(se figur 3). En glasstav värmdes och sattes mot skåran så att röret sprack.

Figur 3 Illustrerar hur man ristar en skåra runt ett provrör efter hydrolys.

10

När provröret öppnats smältes den vassa kanten på den översta delen av röret så att

den blev rund. När alla dessa moment var klara så var hydrolysen klar, men för att veta vad

man har i provröret så måste man utföra en analys i en aminosyraanalysator. Innan man kan

göra den analysen måste proverna vara totalt fria från saltsyra (HCl), och därför genomfördes

en evakuering (indunstning) av saltsyra.

2.1.1 Indunstning av saltsyra med Rotavapor RE 111

Vid indunstning av saltsyra kontrollerades att vattenbehållaren var fylld med vatten,

inställd på 55 oC samt att det fanns is i isbehållaren. Provrören monterades i munstycket med

sex provrörsplatser (se figur 4).

Figur 4 Evakuering av saltsyra.

Sedan öppnades tryckluftkranen helt, vattenpumpen startades och därefter stängdes

luften långsamt så att proverna inte stötkokade. Proverna indunstades till torrhet. Nästa steg

innefattade att lösa proverna i buffert för analys i aminosyraanalysatorn.

11

2.1.2 Upplösning av proven

Proverna löses i en lämplig volym provbuffert. Provbufferten utgjordes av 0,2M

natriumcitratbuffert, pH 2,2. I de presenterade analyserna löstes proverna i 2ml buffert och

centrifugerades i 2 minuter vid 450g. Proverna överfördes till vialer och centrifugerades i 4

minuter på 16000g. Därefter laddades aminosyraanalysatorn Biochrom med prov, och det

efterföljande analyssteget tog ca 1 timme per separation.

2.2 Hydrolys med Ethos1

Ett hydrolysprotokoll för prover som är rena proteiner enligt MODDE

experimentdesign användes (se tabell 1). Programmet MODDE experimentdesign används

dels för att få en optimal körningslista och dels för att analysera resultat så att optimala

betingelser kan utvärderas och reproducerbarhet kontrolleras. De fyra viktiga faktorerna vid

aminosyraanalys är vikt (mg), temperatur (oC), volym (ml) och tid (minuter). Jag genomförde

elva analyser (N1 till N11) där värdena för volym, tid och temperatur varierades (se

körningslistan i Tabell 1). Tre av körningarna är dubbletter: N9, N10 och N11. Dubblett görs

för att se reproducerbarhet d.v.s. om ett prov som körs under samma betingelser genererar

samma resultat vid flera tillfällen har metoden hög reliabilitet.

12

Tabell 1 Schema från MODDE experimentdesign.

Numme

r Namn

Analys-

ordning

Vikt

(mg)

Temper

atur

(oC)

Tid

(mi

n)

Volym

(ml)

1 N1 10 0,2 140 20 0,2

2 N2 4 5 140 20 2

3 N3 6 0,2 180 20 2

4 N4 11 5 180 20 0,2

5 N5 2 0,2 140 45 2

6 N6 9 5 140 45 0,2

7 N7 5 0,2 180 45 0,2

8 N8 8 5 180 45 2

9 N9 7 2,6 160 32,

5 1,1

10 N10 3 2,6 160 32,

5 1,1

11 N11 1 2,6 160 32,

5 1,1

Vakuumpumpen förbereddes genom att kolsyreis tillsattes behållaren med alkohol. Ett

provrör i taget preparerades enligt schemat i tabell 1. Proteinet blandades med 2ml 6M HCl

och 1000 nmol norleucinbuffert. Proverna vortexades tills de blandats med saltsyra. Vid

användning av mikrovågsugnen Ethos1 behövde glasrören inte smältas ihop, utan korkades

bara igen. Därefter förbereddes behållare A med 3ml 6M HCl. Provrören placerades i

behållare B som har 8 platser. Därefter placerades behållare B i behållare A och monterades i

13

sin tur i behållare C (se figur 5). Sedan skruvades locket på ordentligt och termostaten

monterades på plats.

Figur 5 Ethos1s olika behållare. A är behållaren där man häller i saltsyra och sedan placeras den i behållare B. B

är behållaren för proverna och slutligen placeras behållare A+B i behållare C där själva hydrolysen sedan äger

rum.

Ethos1 har en touch screen där man kan programmera körningar efter tid och

temperatur. Vid programmering av Ethos1 ställdes starttiden in på 10 minuter och

temperaturen på 180 oC vilket innebar att temperaturen gick från rumstemperatur till 180 oC

på 10 minuter. Körningstiden programmerades till 45 minuter i 180o C. Innan hydrolysen

startades evakuerades luften.

Vakuumpumpen startades och när all luft evakuerats startades programmet. Under

hydrolysens gång kunde körningen följas genom att temperaturen och hur lång tid som var

kvar av hydrolystiden visades på displayen (se figur 14). När hydrolysen var klar kyldes

proverna snabbt ner genom att vattenkranen som fanns monterad till Ethos1 öppnades. När

14

temperaturen visade under 70 oC var det klart att öppna och ta ut proverna. Hydrolysen var

därmed klar och nästa steg var att evakuera saltsyran.

Enligt tillverkaren skall man kunna torka proverna till torrhet i Ethos1 genom att

programmera ett tredje steg för torkning. I denna studie torkades dock inte proverna i Ethos1,

utan alla prover indunstades som beskrivs i stycke 2.1.1.

2.3 Separation av aminosyror i Biochrom

Biochrom 3a användes för att analysera samtliga prov, både de som hydrolyserats med

den äldre metoden och de som hydrolyserats med mikrovågstekniken. Aminosyranalysen

utfördes med postkolumnderivering av aminosyrorna med hjälp av ninhydrin, vilket är en

pålitlig metod (Klotz och Higgins, 1991). Metoden bygger på katjonbyteskromatografi och

absorbansen mättes vid två våglängder, 440 nm och 570 nm då prolin detekteras bäst vid 440

nm medan övriga aminosyror detekterades vid 570 nm.

Jonbytaren i aminosyraanalysatorn regenerererades genom att 0,4 molar NaOH i 90˚ C

pumpades igenom så att hela systemet tvättades rent.

Steg två kallas för jämviktning då buffert 1 (startbuffert) fylldes på i alla buffertbehållare och

analysatorn kördes med bara buffert, så att systemet nollställdes.

Här blandas nivåerna. 0,4M NaOH körs vid varje kromatografi för att säkerställa att kolonnen

är ren. Varje set av analyser innehåller en blankkörning, en standard och sedan prover.

Vid steg tre kördes analysatorn med en standard för att kalibrera systemet. I standarden

ingår en känd koncentration av alla aminosyror. Slutligen analyserades β-

laktoglobulinproverna från de båda olika hydrolysmetoderna.

3. RESULTAT

Vid jämförelsen mellan mikrovågstekniken och den äldre metoden för bestämning av

aminosyrakonposition i β-laktoglobulin visade den äldre hydrolysmetoden förväntade resultat,

vilket ses i Tabell 2, där aminosyrorna som detekterades i provet presenteras, samt jämförs

med mängden av respektive aminosyra som angetts av tillverkaren som ska leda till/bli en

databas typ SwissProt. Aspargin hydrolyserades totalt till asparaginsyra och glutamin till

glutaminsyra men aminosyrorna isoleucin, valin och några till blev inte hydrolyserade till

100%. Dessa kräver upp till 72 timmar när man använder den äldre 24-timmars metoden

(Irvine, 1994) (se även figurerna 6-8).

Figur 6 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 570nm detektion, 24 timmars hydrolys med

äldre metod.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

mV

olts

0

100

200

300

400

500

600

700

800

mV

olts

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Cys A

3.8

66

1

0.0

66

Asp

11

.29

9(M

es0

2)

T

hr

13

.43

2

Se

r

14

.43

2

Glu

17

.49

9

Pro

19

.03

2

Gly

24

.13

2 Ala

25

.66

5

Cys

26

.99

8

Va

l

27

.63

2

Me

t

29

.33

1

2

9.8

98

Ile

30

.86

5

Le

u

31

.89

8

Nle

33

.09

8

Tyr

36

.63

1

Ph

e

37

.99

8

4

1.1

97

Glu

ko

sa

min

/B-a

la

41

.86

4

4

2.3

31

Ga

lakto

sa

min

43

.23

1S

-Bzl-C

ys

44

.03

1

Hy-L

ys

44

.86

4

4

6.3

64

4

7.2

30

His

48

.19

7

4

8.7

30

Lys

49

.93

0

Trp

51

.39

7

5

2.3

63

NH

3

54

.59

7

Arg

61

.86

3

570 nm

N5 B-lac Seid

Name

Retention T ime

Figur 7 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 440nm detektion, 24-timmars hydrolys med äldre

metod.

Figur 8 Ett kromatogram av standardblandning av aminosyror, 24-timmars hydrolys med äldre metod.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

mV

olts

10

20

30

40

50

mV

olts

10

20

30

40

50C

ys A

Asp

MeS

O2

Th

r

Ser

Glu

Pro

Gly

Ala

Cy

sV

al

Met

Ile

Leu

Nle

Ty

r

Ph

e

His

Ly

s

NH

3

Arg

440 nm

std

Name

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

mV

olts

0

20

40

60

80

100

120

mV

olts

0

20

40

60

80

100

120

Cys A

3.8

66

Asp

11

.16

6

Me

s0

2

12

.33

3

Th

r

13

.39

9

Se

r

14

.43

2

Glu

17

.39

9

Pro

18

.93

2

Gly

24

.13

2

Ala

25

.56

5

Cys

26

.89

8

Va

l

27

.53

2

Me

t

29

.19

8

Ile

30

.73

1

Le

u

31

.76

5

Nle

32

.96

5

Tyr

36

.56

4

Ph

e

37

.89

8

(Glu

ko

sa

min

/B-a

la)

(Ga

lakto

sa

min

)

(S-B

zl-C

ys)

(Hy-L

ys)

His

48

.13

0

Lys

49

.79

7

(Trp

)

NH

3

54

.33

0 Arg

61

.66

3

570 nm

std1

Name

Retention T ime

Tabell 2 Analysresultatet från Biochrom för β-laktoglobulin, 24-timmars hydrolys med äldre metod

Analyserade

aminosyror

β-laktoglobulin

5 mg

Norleucin

Normaliserat

Värde (mg)

Tillverkarens

värde

(mg)

Avvikelse

(mg)

Aspargin 9,51 15,64 15 0,64

Treornin 4,90 8,06 8 0,06

Serin 4,12 6,77 7 -0,23

Glutamin 16,40 26,98 25 1,98

Glycin 2,54 4,17 4 0,17

Alanin 9,73 16,00 15 1,00

Cystein 0,15 0,25 5 4,75

Valin 5,55 9,12 9 0,12

Metionin 2,43 4,00 4 0,00

Isoleucin 5,41 8,89 10 -1,11

Leucin 14,20 23,35 22 1,35

Tyrosin 2,47 4,07 4 0,07

Fenylalanin 2,55 4,20 4 0,20

Histidin 1,20 1,98 2 -0,02

Lysin 9,43 15,50 15 0,50

Arginin 1,82 3,00 3 0,00

Antal aminosyror i nmol, korrekt värde enligt proteinets tillverkare och, i de två sista kolumnerna, den uträknade

skillnaden mellan analysvärdet och tillverkarens uppgivna värde.

Ethos1 mikrovågsmetod gav likvärdiga resultat, vilket visas i Tabell 3. Där kan man se vilka

aminosyror som finns och hur mycket av dem man har. Figur 9 visar topparna på de flesta av

aminosyrorna vid 570 nm och figur 10 visar topparna på prolin vid 440 nm. Figur 11 visar

standarden. Ju högre toppar det blev desto större andel av den aminosyran fanns i proteinet

som hydrolyserats.

Figur 9 Kromatogram av β-laktoglobulin med 570 nm detektion, efter hydrolys med Ethos1.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

mV

olts

0

200

400

600

800

1000

mV

olts

0

200

400

600

800

1000

Cy

s A

3.7

33

Asp

10

.93

3

Th

r

13

.26

6

Ser

14

.26

6 Glu

16

.93

2

Pro

18

.56

5

Gly

23

.96

5

Ala

25

.36

5

Cy

s

26

.33

2

Val

27

.09

8

Met

28

.83

1

Ile

30

.29

8 Leu

31

.36

5

Nle

32

.43

1

Ty

r

35

.43

1

Ph

e

36

.79

8

3

8.8

98

3

9.5

64

4

0.1

31

4

0.5

31

Glu

ko

sam

in

/B

-A

la

41

.13

1

Galacto

sam

in

42

.09

7

4

5.2

97

His

46

.73

0

4

7.4

64

Ly

s

48

.36

4

Trp

50

.39

7

5

1.2

63

NH

3

53

.43

0 Arg

60

.12

9

6

3.5

29

6

4.5

63

570nm

N6 B-lac2 Seidd871.dat

Name

Retention Time

570nm

buffertD494.dat

Figur 10 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 440nm detektion, med Ethos1.

Figur 11 Ett kromatogram av standardblandning av aminosyror, med Ethos1.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

mV

olts

0

20

40

60

80

100

120

mV

olts

0

20

40

60

80

100

120

Cys A

3.8

66

Asp

11

.16

6

Me

s0

2

12

.33

3

Th

r

13

.39

9

Se

r

14

.43

2

Glu

17

.39

9

Pro

18

.93

2

Gly

24

.13

2

Ala

25

.56

5

Cys

26

.89

8

Va

l

27

.53

2

Me

t

29

.19

8

Ile

30

.73

1

Le

u

31

.76

5

Nle

32

.96

5

Tyr

36

.56

4

Ph

e

37

.89

8

(Glu

ko

sa

min

/B-a

la)

(Ga

lakto

sa

min

)

(S-B

zl-C

ys)

(Hy-L

ys)

His

48

.13

0

Lys

49

.79

7

(Trp

)

NH

3

54

.33

0 Arg

61

.66

3

570 nm

std1

Name

Retention T ime

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

mV

olts

100

200

300

mV

olts

100

200

300

Cys A

Asp

(M

eS

O2)

Thr

Ser

Glu

Pro

Gly

Ala

Cys

Val

Met

Ile

Leu

Nle

Tyr

Phe

(G

lukosam

in/B

-A

la)

(G

alactosam

in)

(S

-B

zl-C

ys)

(H

y-Lys)

His

Lys

(T

rp)

NH

3

Arg

440nm

N6 B-lac2 Seidd871.dat

Name

Tabell 3 Analysresultatet från Biochrom för hydrolys av β-laktoglobulin med mikrovågsteknik

Analyserade

aminosyror

β-laktoglobulin

5 mg

Norleucin

Normaliserat

Värde (mg)

Tillverkar

ens värde

(mg)

Avvikelse

(mg)

Aspargin 9,55 15,92 15 0,92

Treonin 4,42 7,37 8 -0,63

Serin 3,51 5,86 7 -1,14

Glutamin 15,34 25,57 25 0,57

Glycin 1,78 2,97 4 -1,03

Alanin 8,51 14,18 15 -0,82

Cystein 1,75 2,91 5 -2,09

Valin 5,44 9,06 9 0,06

Metionin 2,40 4,00 4 0,00

Isoleucin 4,81 8,03 10 -1,97

Leucin 13,18 21,97 22 -0,03

Tyrosin 2,28 3,80 4 -0,2

Fenylalanin 2,34 3,90 4 -0,1

Histidin 1,08 1,79 2 -0,21

Lysin 8,80 14,67 15 -0,33

Arginin 1,62 2,71 3 -0,29

Antal aminosyror i nmol, korrekt värde enligt proteinets tillverkare och, i de två sista kolumnerna den uträknade

skillnaden mellan analysvärdet och tillverkarens uppgivna värde.

Stapeldiagrammet i figur 12 visar en jämförelse mellan värdena från respektive

hydrolysmetod; den äldre metoden och den nya mikrovågstekniken, samt de värden som

enligt tillverkaren är korrekta. De olika metoderna visar att mikrovågsugnen Ethos1 har

hydrolyserat proteinet lika bra – eller bättre – än den äldre 24-timmarsmetoden.

Figur 12 Stapeldiagrammet som visar resultatet efter hydrolys av β-laktoglobulin med rutinmetoden (blå),

Ethos1 (röd) och tillverkarens angivna värde (grön).

4. DISKUSSION

Under de senaste 50 åren har aminosyraanalys varit en tidskrävande process med

många manuella moment samt en lång hydrolys om 24 timmar. Med mikrovågstekniken kan

processen förenklas betydligt, både genom att vissa av de manuella momenten inte behöver

genomföras samt att hydrolysen endast tar en timme med mikrovågsteknik.

Målet med studien var att utvärdera effektivitet för mikrovågsugnen Ethos1 jämfört

med den äldre 24-timmarsmetoden. Bedömningskriterierna var om Ethos1 uppfyller

kvalitetskraven för hydrolysen och om tidsvinsten var tillräckligt stor. Resultatet från

aminosyraanalys efter hydrolys med den äldre metoden, se tabell 2, visade låg variation

mellan korrekt värde enligt proteintillverkaren och norleucin-normaliserat värde för de flesta

aminosyrorna. Hydrolys med Ethos1 visade lika bra resultat som med den äldre metoden, se

figur 12, och uppvisade också god överensstämmelse med värdet som proteinets tillverkare

angivit.

Mikrovågsmetoden resulterade dock i betydligt högre värden av cystein än den äldre

24-timmars metoden (figur 12). Cystein har ansetts vara alltför instabil under syrahydrolys för

att kunna haltbestämmas genom automatisk aminosyraanalys (Inglis och Teh-Yung Liu,

1970). Den kortare hydrolystiden med mikrovågstekniken förhindrar att cystein sönderfaller i

samma utsträckning som när hydrolysen tar 24 timmar, med den äldre metodiken, sannolikt är

cystein känsligt för värme under en längre tid vilket kan förklara skillnaden i resultat mellan

de olika metoderna.

Så här långt är resultatet alltså positivt, särskilt med tanke på att man kör hydrolys med

Ethos1 på 45 minuter medan samma hydrolys tar 24 timmar med den äldre metoden. Utöver

hydrolystidsvinsten så är det en hel del tidskrävande och riskfyllda arbetsmoment som inte

behövs när man använder sig av Ethos1, som dem illustrerade i figur 1-4.

En annan fördel med Ethos1 är att man kan följa hydrolysen under processens gång

(figur 13), en funktion som saknas vid användande av den äldre metoden.

Figur 13 Skärmdump från displayen på Ethos1, där man kan följa hydrolysen.

Det fanns flera moment som jag kunde ha utfört för att få ett exaktare resultat enligt

tillverkaren av Ethos1 rekommendationer, men tid saknades. Trots detta producerade hydrolys

med Ethos1 resultat som var lika bra som de vi fick med den äldre hydrolysmetoden. Allt talar

för att Ethos1 är en klart användbar metod för hydrolys - snabb, enkel och säker.

5. REFERENSER

Abu-Tarbush, H.M. och Ahmed, S.B. (2005). Characterization of hydrolysates produced by

enzymatic hydrolysis of camel casein and protein isolates of Al-Ban (Moringa

peregrina) and Karkade (Hibiscus sabderiffa) Seeds. Journal of Saudi Society for

Agricultural Science, Vol. 4(2), pp 61-82.

Davidsson, Å., Jönsson, K., la Cour Jansen, J. och Särner, E. (2008) Metoder för

slamhydrolys, Svenskt Vatten Utveckling Rapport, Vol. 09, pp 1-39.

Engelhart, W. G. (1990). Microwave hydrolysis of peptides and proteins for amino acid

analysis. American Biotechnology Laboratory, Vol. 8(15), pp 30-34.

Fountoulakis, M. och Lahm, H-W, (1998). Hydrolysis and amino acid composition

analysis of proteins. Journal of Chromatography A, Vol. 826, pp 109-134.

Hrcková, M., Rusnáková, M. och Zemanovic, J. (2002) Enzymatic hydrolysis of defatted soy

flour by three different proteases and their effect on the functional properties of

resulting protein hydrolysates. Czech Journal of Food Science, Vol. 20, pp 7–14.

Inglis, A. S. och Teh-Yung Liu. (1970). The stability of cysteine and cystine during acid

hydrolysis of proteins and peptides. Journal of Biological Chemistry, Vol. 245(1), pp

112-116.

Klotz, A.V. och Higgins, B.M. (1991). Deamidation and succinimide formation by gamma-N-

methylasparagine: potential pitfalls of amino acid analysis. Archives of Biochemistry

Biophysics, Vol. 291(1), pp 113-20.

Margolis, S. A., Jassie, L. och Kingston, H. M. (1991). The hydrolysis of proteins by

microwave technology, Journal of Automatic Chemistry, Vol. 13(3), pp 93-95.

Rytkönen J, Valkonen K, Virtanen V, Foxwell RA, Kyd JM, Cripps AW och Karttunen

TJ. (2006) Enterocyte and M-cell transport of native and heat-denatured bovine

β-Lactoglobulin: Significance of heat denaturation, Journal of Agricultural and Food

Chemistry, Vol. 54, pp 1500-1507.

Sindayikengera, S. och Xia, W-S. (2006). Nutritional evaluation of caseins and whey proteins

and their hydrolysates from Protamex, Journal of Zhejiang University SCIENCE B,

Vol. 7(2), pp 90-98.

ten Hoedt, A. E., Maurice-Stam, H., Boelen, C. C. A., Rubio-Gozalbo, M. E.,

van Spronsen, F. J., Wijburg, F. A., Bosch, A. M. och Grootenhuis, M. A. (2011)

Parenting a child with phenylketonuria or galactosemia: implications for health-related

quality of life, Journal of Inherited Metabolic Disease, Vol. 34 (2), pp 391-398.

Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J-F, Lahm, H-W och Fountoulakis, M. (1998). Effect

of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of

proteins, Journal of Chromatography A, Vol. 795(2), pp 263-275.