1
Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi
Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete, 15 hp
COMPARATIVE STUDY OF HYDROLYSIS PERFORMED WITH MODERN
MICROWAVE TECHNIQUE AND THE TRADITIONAL METHOD
Seid Hosen Seid Tahir
Ethos1 Gallenkamp
Handledare: Bo Ek
Institutionen för biokemi och organisk kemi
2
ABSTRACT
Proteins are vital to all cells in the body. They consist of long chains of amino acids. To be
able to study the amino acid composition of a protein it is necessary to hydrolyse it, followed
by separation and quantification. When the protein is hydrolysed, in this case ß-lactoglobulin,
the protein is divided into individual amino acids. The method that traditionally has been used
to hydrolyse proteins takes 24-72 hours to complete. Recently a new microwave heating
technique was introduced. With the Ethos1 microwave oven it takes less than one hour to
hydrolyse proteins. The objective of this study was to see if the result of the hydrolysis with
the new microwave oven technique had the same quality as the previously used method. If the
microwave technique can hydrolyse proteins with as good results as the old oven, then it will
significantly reduce test turnaround times. The result of this study indicates that the
microwave technique is just as reliable as the older method, and thus a good and time saving
alternative.
KEYWORDS: Hydrolysis; Amino acids; Protein; Microwave
3
1. INTRODUKTION
Proteiner utgör, efter vatten, största delen av cellens innehåll. Namnet protein kommer
från grekiskans proteios som betyder det första eller förnämsta (Nylander, 1997).
Proteiner ingår i kroppens alla celler. Ofta beskrivs protein därför som en av kroppens
byggstenar. De behövs för tillväxt och underhåll av kroppen. Proteiner är viktiga
beståndsdelar i muskler, men har även andra viktiga funktioner. Nästan alla hormoner och alla
enzymer är proteiner, vilka spelar roll i en mängd olika processer i kroppen. Flera ämnen
måste vara bundna till proteiner för att kunna transporteras i blodet. Exempel på det är
hemoglobin som transporterar syre och lipoproteiner som bär med sig fett.
Protein har således nödvändiga uppgifter i kroppen som inte kan ersättas av andra ämnen. De
kan också vara en energikälla, vid sidan av kalorier (energi) från kolhydrater och fett.
Proteiner har alltså många uppgifter i kroppen och finns i nästan alla livsmedel. Kroppen
behöver under en dag tillföras alla aminosyror den inte kan göra själv. Detta är de så kallade
essentiella aminosyrorna och de är totalt åtta stycken. Resten kan kroppen göra själv efter
behov och de kallas därför icke-essentiella.
Proteiner är uppbyggda av långa aminosyrekedjor. Aminosyror är karboxylsyror
innehållande minst en aminogrupp samt en R-grupp som ger aminosyran dess identitet.
Aminosyror kopplas samman och bildar polypeptider. Ändarna på peptider kallas N-terminal
(aminogrupp) och C-terminal (karboxylgrupp). Varje aminosyra är sammanfogad med nästa
genom en peptidbindning. Peptidbindningen uppstår då karboxylgruppen på en aminosyra
reagerar med aminogruppen på en annan aminosyra. På så vis utgörs polypeptidkedjan,
proteinets ryggrad, av en α-kol bundet till en amidgrupp bundet till nästa α-kol etc. Ett protein
består av en eller flera sådana polypeptidkedjor. För varje protein är sammansättningen av
aminosyror och ordningsföljden av dessa unik. Proteiner delas in i fiberproteiner och
4
globulära proteiner. Fiberproteinerna har en trådig form och de globulära proteinerna har en
rundare form.
Aminosyraanalys betraktas som det säkraste sättet att koncentrationsbestämma
proteiner och peptider. Det finns flera metoder t.ex. absorbansmätning inom UV-området,
men metoden kräver ett relativt rent material eftersom t.ex. även nukleinsyror absorberar UV-
ljus. Proteinets sammansättning kan också påverka vilken våglängd som måste användas.
Lowry och BCA (Bicinchoninic acid) använder sig av kopparjoner och är beroende av
mängden peptidbindningar och aromatiska aminosyror. Bradfordmetoden baseras på
proteinbindning av Coomassie Brilliant Blue till främst arginin och lysin varvid
absorbtionsmaximum ändras. För båda metoderna gäller att resultatet blir olika för varje
protein, då de innehåller olika antal av nämnda aminosyror. En standardkurva med det protein
man mäter och ett rent protein är nödvändiga för att få tillförlitliga resultat med de metoderna.
Vid aminosyraanalys degraderas provet till aminosyror och mängden av varje komponent
bestäms m.h.a. kromatografi. Den metoden har inte de begränsningar som ovanstående
metoder har och är därför den mest noggranna metoden.
Aminosyraanalys består av tre delar, hydrolysering av proteinet man vill studera,
kromatografisk separation, samt detektion och kvantifiering av de fria aminosyrorna.
Hydrolys är en nedbrytningsprocess där proteinet bryts ner när vattenmolekyler
adderas. Den kan, när det gäller proteiner, antingen vara katalyserad av hydroxoniumjoner
(syra) eller hydroxidjoner (bas). I den här studien användes syrakatalyserad hydrolys. För att
en analys ska bli korrekt måste hydrolysen vara väl genomförd (Fountoulakis och Lahm,
1998), d.v.s. för att kunna lita på den påföljande aminosyraanalysen måste man veta att
proteinet verkligen har hydrolyserats fullständigt eller att utbytet av de frisatta enskilda
aminosyrorna är känt. Man vet t.ex. att utbytet av serin är 90% under standardbetingelser och
kan då kompensera mätvärdet i motsvarande grad.
5
Ett viktigt område för aminosyraanalyser är halt- och renhetsbestämning av
utgångsmaterial för peptidsyntes inom t. ex läkemedelsindustrin. Detta krävs i vissa fall av
FDA (Federal Drug Agency) i USA, för att godkänna en produkt baserad på aminosyraderivat
(Bo Ek, muntlig kommunikation, 2011). Ett annat användningsområde är möjligheten att mäta
andelen bindningsmedel i kött- och charkuteriprodukter. Många europeiska länder har en
gräns för hur mycket bindningsmedel kött- och charkuteriprodukter får innehålla. Proteinet
kollagen utgör en stor del i de bindningsmedel som används och kollagen innehåller en hög
halt av aminosyran hydroxyprolin. Andra muskelproteiner innehåller så gott som inget
hydroxyprolin, vilket gör att man kan bestämma andelen bindningsmedel genom att analysera
produkten för hydroxyprolin (Engelhart, 1990).
Olika hydrolysmetoder används även för att ta hand om slam på ett så effektivt sätt
som möjligt. Davidsson et al. (2008) har utvärderat olika hydrolysmetoder för ändamålet, men
kunde inte utse en enskild metod som bättre än någon annan då det fanns flera variabler som
påverkade resultatet. Olika hydrolysmetoder lämpade sig därför bäst vid olika förhållanden.
Enzymatisk hydrolys av mjölkprotein har länge använts för att framställa t.ex.
produkter för spädbarn med mjölkproteinsallergi eller medfödda metabola
funktionsnedsättningar (Abu-Tarbush och Ahmed, 2005) t. ex. fenylketonuri (PKU), som är
en medfödd metabol sjukdom orsakad av att enzymet fenylalaninhydroxylas inte fungerar.
Som ett resultat av detta kan den essentiella aminosyran fenylalanin inte konverteras till
tyrosin utan ackumuleras istället i kroppen (ten Hoedt et al., 2011). Enzymatisk hydrolys är
vanlig inom livsmedelsindustrin för att spjälka ut protein ur växter, fördelen med enzymatisk
hydrolys när det handlar om livsmedel är att det går att använda sig av enzymer som bryter
peptidkedjorna på specifika ställen. På så vis förhindrar man att peptidkedjorna bryts ner i
alltför små enheter eller blir till fria aminosyror. Små peptider kan nämligen ge en bitter smak
som inte är önskvärd för livsmedel (Hrcková, 2002). Enzym kan inte användas när man vill
6
bryta alla peptidbindningar, varför syrakatalyserad hydrolys som ger större andel fria
aminosyror användes i det beskrivna arbetet.
På Aminosyraanalyscentralen vid Uppsala Universitet görs bestämningar av mängden
eller halten av olika aminosyror i olika typer av proteinhaltiga prover. För att frigöra
aminosyrorna så att de kan analyseras hydrolyseras först provet. Hydrolys sker traditionellt
enligt en beprövad metod, i 6M HCl under 24 timmar i luftevakuerade rör för att minimera
risken för oxidation av aminosyrorna.
Det gamla klassiska sättet, på vilket man utfört proteinhydrolys under de senaste 50
åren, innebär att proverna upphettas till 110 oC under 24-72 timmar i närvaro av saltsyra
(HCl), som är den vanligaste metoden. Hydrolys kan dock även utföras i närvaro av en basisk
lösning (vanligast NaOH eller KOH) eller med en enzymatisk nedbrytningsmetod
(Fountoulakis och Lahm, 1998). Efter analysens slutförande kan man jämföra mängden
faktiska aminosyror i provet med den kända sammansättningen av aminosyror och således
kan man räkna fram mängden av exempelvis ett protein eller en peptid i utgångsprovet, vilket
är det tillvägagångssätt som vi valt i den här studien.
24-timmars hydrolys är en mycket tidskrävande process och proverna hanteras
manuellt ett och ett. Därför vore en alternativ, effektivare, metod mycket värdefull. Genom att
använda sig av mikrovågor vid upphettningen av provet och dessutom hetta upp till en högre
temperatur kan man förkorta hydrolystiden från 24 timmar till under en timme, vilket skulle
spara mycket arbetstid. Proteinhydrolys för aminosyreanalys med hjälp av mikrovågsteknik
rapporterades för första gången 1987 och har utvecklats sedan dess. Mikrovågstekniken har i
tidigare studier visat sig vara jämförbar eller överlägsen den traditionella 24-timmars
hydrolystekniken (Engelhart, 1990 och Margolis et al., 1991). Andra studier visar att
mikrovågstekniken inte håller samma standard som den traditionella metoden (Weiss et al.,
7
1998). Syftet med denna studie var att undersöka om man får samma resultat med
mikrovågsteknik som med den traditionella 24-timmars proteinhydrolysen som hittills
använts vid Aminosyraanalyscentralen vid Uppsala Universitet.
För den nya mikrovågsbaserade analysen användes ett kommersiellt instrument kallat
Ethos1 som är relativt nytt på marknaden. Proteinet som valdes till analys i den jämförande
metodanalysen var ß-lactoglobulin. ß-Laktoglobulin är det vanligast förekommande
vassleproteinet i komjölk. Det tillhör lipocalin-proteinfamiljen och är en av de huvudsakliga
allergenerna i mjölk (Rytkönen et al., 2006) samtidigt som det har ett högt näringsvärde
jämfört med andra protein, eftersom det har ett högt innehåll av essentiella aminosyror och är
relativt lättsmält (Sindayikengera and Xia, 2006). ß-Laktoglobulin är dock inte helt lätt att
hydrolysera (Rytkönen et al., 2006), anledningen till valet var att dess sammansättning av
aminosyror är välkänd och man vet hur utbytet av respektive aminosyra ser ut.
8
2. MATERIAL OCH METODER
2.1 Hydrolys med den äldre metoden.
Vid analys enligt den äldre metoden började man med att rista namn på glasrören med
en tandläkarborr. Sedan vägdes 5,0 mg ß-laktoglobulin upp och fördes försiktigt över till röret
och den exakta vikten antecknades. Proteinet blandades med 2 ml 6M HCl och 1000 nmol
norleucin. Proven vortexades tills de blev grumliga, då var proven riktigt blandade med
saltsyran. En gasolbrännare användes för att smälta provrörshalsarna som sedan drogs ut som
i figur 1.
Figur 1 Figuren illustrerar hur man drar ut en provrörshals med svetslåga.
Proverna frystes till is med hjälp av kolsyreis vid - 78,5 °C, därefter inkuberades
provrören i vakuum i 10 minuter. När alla provrören var luftevakuerade slutsvetsades de utan
att luft släpptes in (figur 2).
9
Figur 2 Ett slutsvetsat provrör.
Till slut placerades de slutsvetsade provrören i ugnen för hydrolys i 24 timmar vid
110o C. Efter exakt 24 timmar öppnades rören genom att en skåra ristades ca 1 cm från toppen
(se figur 3). En glasstav värmdes och sattes mot skåran så att röret sprack.
Figur 3 Illustrerar hur man ristar en skåra runt ett provrör efter hydrolys.
10
När provröret öppnats smältes den vassa kanten på den översta delen av röret så att
den blev rund. När alla dessa moment var klara så var hydrolysen klar, men för att veta vad
man har i provröret så måste man utföra en analys i en aminosyraanalysator. Innan man kan
göra den analysen måste proverna vara totalt fria från saltsyra (HCl), och därför genomfördes
en evakuering (indunstning) av saltsyra.
2.1.1 Indunstning av saltsyra med Rotavapor RE 111
Vid indunstning av saltsyra kontrollerades att vattenbehållaren var fylld med vatten,
inställd på 55 oC samt att det fanns is i isbehållaren. Provrören monterades i munstycket med
sex provrörsplatser (se figur 4).
Figur 4 Evakuering av saltsyra.
Sedan öppnades tryckluftkranen helt, vattenpumpen startades och därefter stängdes
luften långsamt så att proverna inte stötkokade. Proverna indunstades till torrhet. Nästa steg
innefattade att lösa proverna i buffert för analys i aminosyraanalysatorn.
11
2.1.2 Upplösning av proven
Proverna löses i en lämplig volym provbuffert. Provbufferten utgjordes av 0,2M
natriumcitratbuffert, pH 2,2. I de presenterade analyserna löstes proverna i 2ml buffert och
centrifugerades i 2 minuter vid 450g. Proverna överfördes till vialer och centrifugerades i 4
minuter på 16000g. Därefter laddades aminosyraanalysatorn Biochrom med prov, och det
efterföljande analyssteget tog ca 1 timme per separation.
2.2 Hydrolys med Ethos1
Ett hydrolysprotokoll för prover som är rena proteiner enligt MODDE
experimentdesign användes (se tabell 1). Programmet MODDE experimentdesign används
dels för att få en optimal körningslista och dels för att analysera resultat så att optimala
betingelser kan utvärderas och reproducerbarhet kontrolleras. De fyra viktiga faktorerna vid
aminosyraanalys är vikt (mg), temperatur (oC), volym (ml) och tid (minuter). Jag genomförde
elva analyser (N1 till N11) där värdena för volym, tid och temperatur varierades (se
körningslistan i Tabell 1). Tre av körningarna är dubbletter: N9, N10 och N11. Dubblett görs
för att se reproducerbarhet d.v.s. om ett prov som körs under samma betingelser genererar
samma resultat vid flera tillfällen har metoden hög reliabilitet.
12
Tabell 1 Schema från MODDE experimentdesign.
Numme
r Namn
Analys-
ordning
Vikt
(mg)
Temper
atur
(oC)
Tid
(mi
n)
Volym
(ml)
1 N1 10 0,2 140 20 0,2
2 N2 4 5 140 20 2
3 N3 6 0,2 180 20 2
4 N4 11 5 180 20 0,2
5 N5 2 0,2 140 45 2
6 N6 9 5 140 45 0,2
7 N7 5 0,2 180 45 0,2
8 N8 8 5 180 45 2
9 N9 7 2,6 160 32,
5 1,1
10 N10 3 2,6 160 32,
5 1,1
11 N11 1 2,6 160 32,
5 1,1
Vakuumpumpen förbereddes genom att kolsyreis tillsattes behållaren med alkohol. Ett
provrör i taget preparerades enligt schemat i tabell 1. Proteinet blandades med 2ml 6M HCl
och 1000 nmol norleucinbuffert. Proverna vortexades tills de blandats med saltsyra. Vid
användning av mikrovågsugnen Ethos1 behövde glasrören inte smältas ihop, utan korkades
bara igen. Därefter förbereddes behållare A med 3ml 6M HCl. Provrören placerades i
behållare B som har 8 platser. Därefter placerades behållare B i behållare A och monterades i
13
sin tur i behållare C (se figur 5). Sedan skruvades locket på ordentligt och termostaten
monterades på plats.
Figur 5 Ethos1s olika behållare. A är behållaren där man häller i saltsyra och sedan placeras den i behållare B. B
är behållaren för proverna och slutligen placeras behållare A+B i behållare C där själva hydrolysen sedan äger
rum.
Ethos1 har en touch screen där man kan programmera körningar efter tid och
temperatur. Vid programmering av Ethos1 ställdes starttiden in på 10 minuter och
temperaturen på 180 oC vilket innebar att temperaturen gick från rumstemperatur till 180 oC
på 10 minuter. Körningstiden programmerades till 45 minuter i 180o C. Innan hydrolysen
startades evakuerades luften.
Vakuumpumpen startades och när all luft evakuerats startades programmet. Under
hydrolysens gång kunde körningen följas genom att temperaturen och hur lång tid som var
kvar av hydrolystiden visades på displayen (se figur 14). När hydrolysen var klar kyldes
proverna snabbt ner genom att vattenkranen som fanns monterad till Ethos1 öppnades. När
14
temperaturen visade under 70 oC var det klart att öppna och ta ut proverna. Hydrolysen var
därmed klar och nästa steg var att evakuera saltsyran.
Enligt tillverkaren skall man kunna torka proverna till torrhet i Ethos1 genom att
programmera ett tredje steg för torkning. I denna studie torkades dock inte proverna i Ethos1,
utan alla prover indunstades som beskrivs i stycke 2.1.1.
2.3 Separation av aminosyror i Biochrom
Biochrom 3a användes för att analysera samtliga prov, både de som hydrolyserats med
den äldre metoden och de som hydrolyserats med mikrovågstekniken. Aminosyranalysen
utfördes med postkolumnderivering av aminosyrorna med hjälp av ninhydrin, vilket är en
pålitlig metod (Klotz och Higgins, 1991). Metoden bygger på katjonbyteskromatografi och
absorbansen mättes vid två våglängder, 440 nm och 570 nm då prolin detekteras bäst vid 440
nm medan övriga aminosyror detekterades vid 570 nm.
Jonbytaren i aminosyraanalysatorn regenerererades genom att 0,4 molar NaOH i 90˚ C
pumpades igenom så att hela systemet tvättades rent.
Steg två kallas för jämviktning då buffert 1 (startbuffert) fylldes på i alla buffertbehållare och
analysatorn kördes med bara buffert, så att systemet nollställdes.
Här blandas nivåerna. 0,4M NaOH körs vid varje kromatografi för att säkerställa att kolonnen
är ren. Varje set av analyser innehåller en blankkörning, en standard och sedan prover.
Vid steg tre kördes analysatorn med en standard för att kalibrera systemet. I standarden
ingår en känd koncentration av alla aminosyror. Slutligen analyserades β-
laktoglobulinproverna från de båda olika hydrolysmetoderna.
3. RESULTAT
Vid jämförelsen mellan mikrovågstekniken och den äldre metoden för bestämning av
aminosyrakonposition i β-laktoglobulin visade den äldre hydrolysmetoden förväntade resultat,
vilket ses i Tabell 2, där aminosyrorna som detekterades i provet presenteras, samt jämförs
med mängden av respektive aminosyra som angetts av tillverkaren som ska leda till/bli en
databas typ SwissProt. Aspargin hydrolyserades totalt till asparaginsyra och glutamin till
glutaminsyra men aminosyrorna isoleucin, valin och några till blev inte hydrolyserade till
100%. Dessa kräver upp till 72 timmar när man använder den äldre 24-timmars metoden
(Irvine, 1994) (se även figurerna 6-8).
Figur 6 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 570nm detektion, 24 timmars hydrolys med
äldre metod.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
mV
olts
0
100
200
300
400
500
600
700
800
mV
olts
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Cys A
3.8
66
1
0.0
66
Asp
11
.29
9(M
es0
2)
T
hr
13
.43
2
Se
r
14
.43
2
Glu
17
.49
9
Pro
19
.03
2
Gly
24
.13
2 Ala
25
.66
5
Cys
26
.99
8
Va
l
27
.63
2
Me
t
29
.33
1
2
9.8
98
Ile
30
.86
5
Le
u
31
.89
8
Nle
33
.09
8
Tyr
36
.63
1
Ph
e
37
.99
8
4
1.1
97
Glu
ko
sa
min
/B-a
la
41
.86
4
4
2.3
31
Ga
lakto
sa
min
43
.23
1S
-Bzl-C
ys
44
.03
1
Hy-L
ys
44
.86
4
4
6.3
64
4
7.2
30
His
48
.19
7
4
8.7
30
Lys
49
.93
0
Trp
51
.39
7
5
2.3
63
NH
3
54
.59
7
Arg
61
.86
3
570 nm
N5 B-lac Seid
Name
Retention T ime
Figur 7 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 440nm detektion, 24-timmars hydrolys med äldre
metod.
Figur 8 Ett kromatogram av standardblandning av aminosyror, 24-timmars hydrolys med äldre metod.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
mV
olts
10
20
30
40
50
mV
olts
10
20
30
40
50C
ys A
Asp
MeS
O2
Th
r
Ser
Glu
Pro
Gly
Ala
Cy
sV
al
Met
Ile
Leu
Nle
Ty
r
Ph
e
His
Ly
s
NH
3
Arg
440 nm
std
Name
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
mV
olts
0
20
40
60
80
100
120
mV
olts
0
20
40
60
80
100
120
Cys A
3.8
66
Asp
11
.16
6
Me
s0
2
12
.33
3
Th
r
13
.39
9
Se
r
14
.43
2
Glu
17
.39
9
Pro
18
.93
2
Gly
24
.13
2
Ala
25
.56
5
Cys
26
.89
8
Va
l
27
.53
2
Me
t
29
.19
8
Ile
30
.73
1
Le
u
31
.76
5
Nle
32
.96
5
Tyr
36
.56
4
Ph
e
37
.89
8
(Glu
ko
sa
min
/B-a
la)
(Ga
lakto
sa
min
)
(S-B
zl-C
ys)
(Hy-L
ys)
His
48
.13
0
Lys
49
.79
7
(Trp
)
NH
3
54
.33
0 Arg
61
.66
3
570 nm
std1
Name
Retention T ime
Tabell 2 Analysresultatet från Biochrom för β-laktoglobulin, 24-timmars hydrolys med äldre metod
Analyserade
aminosyror
β-laktoglobulin
5 mg
Norleucin
Normaliserat
Värde (mg)
Tillverkarens
värde
(mg)
Avvikelse
(mg)
Aspargin 9,51 15,64 15 0,64
Treornin 4,90 8,06 8 0,06
Serin 4,12 6,77 7 -0,23
Glutamin 16,40 26,98 25 1,98
Glycin 2,54 4,17 4 0,17
Alanin 9,73 16,00 15 1,00
Cystein 0,15 0,25 5 4,75
Valin 5,55 9,12 9 0,12
Metionin 2,43 4,00 4 0,00
Isoleucin 5,41 8,89 10 -1,11
Leucin 14,20 23,35 22 1,35
Tyrosin 2,47 4,07 4 0,07
Fenylalanin 2,55 4,20 4 0,20
Histidin 1,20 1,98 2 -0,02
Lysin 9,43 15,50 15 0,50
Arginin 1,82 3,00 3 0,00
Antal aminosyror i nmol, korrekt värde enligt proteinets tillverkare och, i de två sista kolumnerna, den uträknade
skillnaden mellan analysvärdet och tillverkarens uppgivna värde.
Ethos1 mikrovågsmetod gav likvärdiga resultat, vilket visas i Tabell 3. Där kan man se vilka
aminosyror som finns och hur mycket av dem man har. Figur 9 visar topparna på de flesta av
aminosyrorna vid 570 nm och figur 10 visar topparna på prolin vid 440 nm. Figur 11 visar
standarden. Ju högre toppar det blev desto större andel av den aminosyran fanns i proteinet
som hydrolyserats.
Figur 9 Kromatogram av β-laktoglobulin med 570 nm detektion, efter hydrolys med Ethos1.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
mV
olts
0
200
400
600
800
1000
mV
olts
0
200
400
600
800
1000
Cy
s A
3.7
33
Asp
10
.93
3
Th
r
13
.26
6
Ser
14
.26
6 Glu
16
.93
2
Pro
18
.56
5
Gly
23
.96
5
Ala
25
.36
5
Cy
s
26
.33
2
Val
27
.09
8
Met
28
.83
1
Ile
30
.29
8 Leu
31
.36
5
Nle
32
.43
1
Ty
r
35
.43
1
Ph
e
36
.79
8
3
8.8
98
3
9.5
64
4
0.1
31
4
0.5
31
Glu
ko
sam
in
/B
-A
la
41
.13
1
Galacto
sam
in
42
.09
7
4
5.2
97
His
46
.73
0
4
7.4
64
Ly
s
48
.36
4
Trp
50
.39
7
5
1.2
63
NH
3
53
.43
0 Arg
60
.12
9
6
3.5
29
6
4.5
63
570nm
N6 B-lac2 Seidd871.dat
Name
Retention Time
570nm
buffertD494.dat
Figur 10 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 440nm detektion, med Ethos1.
Figur 11 Ett kromatogram av standardblandning av aminosyror, med Ethos1.
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
mV
olts
0
20
40
60
80
100
120
mV
olts
0
20
40
60
80
100
120
Cys A
3.8
66
Asp
11
.16
6
Me
s0
2
12
.33
3
Th
r
13
.39
9
Se
r
14
.43
2
Glu
17
.39
9
Pro
18
.93
2
Gly
24
.13
2
Ala
25
.56
5
Cys
26
.89
8
Va
l
27
.53
2
Me
t
29
.19
8
Ile
30
.73
1
Le
u
31
.76
5
Nle
32
.96
5
Tyr
36
.56
4
Ph
e
37
.89
8
(Glu
ko
sa
min
/B-a
la)
(Ga
lakto
sa
min
)
(S-B
zl-C
ys)
(Hy-L
ys)
His
48
.13
0
Lys
49
.79
7
(Trp
)
NH
3
54
.33
0 Arg
61
.66
3
570 nm
std1
Name
Retention T ime
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
mV
olts
100
200
300
mV
olts
100
200
300
Cys A
Asp
(M
eS
O2)
Thr
Ser
Glu
Pro
Gly
Ala
Cys
Val
Met
Ile
Leu
Nle
Tyr
Phe
(G
lukosam
in/B
-A
la)
(G
alactosam
in)
(S
-B
zl-C
ys)
(H
y-Lys)
His
Lys
(T
rp)
NH
3
Arg
440nm
N6 B-lac2 Seidd871.dat
Name
Tabell 3 Analysresultatet från Biochrom för hydrolys av β-laktoglobulin med mikrovågsteknik
Analyserade
aminosyror
β-laktoglobulin
5 mg
Norleucin
Normaliserat
Värde (mg)
Tillverkar
ens värde
(mg)
Avvikelse
(mg)
Aspargin 9,55 15,92 15 0,92
Treonin 4,42 7,37 8 -0,63
Serin 3,51 5,86 7 -1,14
Glutamin 15,34 25,57 25 0,57
Glycin 1,78 2,97 4 -1,03
Alanin 8,51 14,18 15 -0,82
Cystein 1,75 2,91 5 -2,09
Valin 5,44 9,06 9 0,06
Metionin 2,40 4,00 4 0,00
Isoleucin 4,81 8,03 10 -1,97
Leucin 13,18 21,97 22 -0,03
Tyrosin 2,28 3,80 4 -0,2
Fenylalanin 2,34 3,90 4 -0,1
Histidin 1,08 1,79 2 -0,21
Lysin 8,80 14,67 15 -0,33
Arginin 1,62 2,71 3 -0,29
Antal aminosyror i nmol, korrekt värde enligt proteinets tillverkare och, i de två sista kolumnerna den uträknade
skillnaden mellan analysvärdet och tillverkarens uppgivna värde.
Stapeldiagrammet i figur 12 visar en jämförelse mellan värdena från respektive
hydrolysmetod; den äldre metoden och den nya mikrovågstekniken, samt de värden som
enligt tillverkaren är korrekta. De olika metoderna visar att mikrovågsugnen Ethos1 har
hydrolyserat proteinet lika bra – eller bättre – än den äldre 24-timmarsmetoden.
Figur 12 Stapeldiagrammet som visar resultatet efter hydrolys av β-laktoglobulin med rutinmetoden (blå),
Ethos1 (röd) och tillverkarens angivna värde (grön).
4. DISKUSSION
Under de senaste 50 åren har aminosyraanalys varit en tidskrävande process med
många manuella moment samt en lång hydrolys om 24 timmar. Med mikrovågstekniken kan
processen förenklas betydligt, både genom att vissa av de manuella momenten inte behöver
genomföras samt att hydrolysen endast tar en timme med mikrovågsteknik.
Målet med studien var att utvärdera effektivitet för mikrovågsugnen Ethos1 jämfört
med den äldre 24-timmarsmetoden. Bedömningskriterierna var om Ethos1 uppfyller
kvalitetskraven för hydrolysen och om tidsvinsten var tillräckligt stor. Resultatet från
aminosyraanalys efter hydrolys med den äldre metoden, se tabell 2, visade låg variation
mellan korrekt värde enligt proteintillverkaren och norleucin-normaliserat värde för de flesta
aminosyrorna. Hydrolys med Ethos1 visade lika bra resultat som med den äldre metoden, se
figur 12, och uppvisade också god överensstämmelse med värdet som proteinets tillverkare
angivit.
Mikrovågsmetoden resulterade dock i betydligt högre värden av cystein än den äldre
24-timmars metoden (figur 12). Cystein har ansetts vara alltför instabil under syrahydrolys för
att kunna haltbestämmas genom automatisk aminosyraanalys (Inglis och Teh-Yung Liu,
1970). Den kortare hydrolystiden med mikrovågstekniken förhindrar att cystein sönderfaller i
samma utsträckning som när hydrolysen tar 24 timmar, med den äldre metodiken, sannolikt är
cystein känsligt för värme under en längre tid vilket kan förklara skillnaden i resultat mellan
de olika metoderna.
Så här långt är resultatet alltså positivt, särskilt med tanke på att man kör hydrolys med
Ethos1 på 45 minuter medan samma hydrolys tar 24 timmar med den äldre metoden. Utöver
hydrolystidsvinsten så är det en hel del tidskrävande och riskfyllda arbetsmoment som inte
behövs när man använder sig av Ethos1, som dem illustrerade i figur 1-4.
En annan fördel med Ethos1 är att man kan följa hydrolysen under processens gång
(figur 13), en funktion som saknas vid användande av den äldre metoden.
Figur 13 Skärmdump från displayen på Ethos1, där man kan följa hydrolysen.
Det fanns flera moment som jag kunde ha utfört för att få ett exaktare resultat enligt
tillverkaren av Ethos1 rekommendationer, men tid saknades. Trots detta producerade hydrolys
med Ethos1 resultat som var lika bra som de vi fick med den äldre hydrolysmetoden. Allt talar
för att Ethos1 är en klart användbar metod för hydrolys - snabb, enkel och säker.
5. REFERENSER
Abu-Tarbush, H.M. och Ahmed, S.B. (2005). Characterization of hydrolysates produced by
enzymatic hydrolysis of camel casein and protein isolates of Al-Ban (Moringa
peregrina) and Karkade (Hibiscus sabderiffa) Seeds. Journal of Saudi Society for
Agricultural Science, Vol. 4(2), pp 61-82.
Davidsson, Å., Jönsson, K., la Cour Jansen, J. och Särner, E. (2008) Metoder för
slamhydrolys, Svenskt Vatten Utveckling Rapport, Vol. 09, pp 1-39.
Engelhart, W. G. (1990). Microwave hydrolysis of peptides and proteins for amino acid
analysis. American Biotechnology Laboratory, Vol. 8(15), pp 30-34.
Fountoulakis, M. och Lahm, H-W, (1998). Hydrolysis and amino acid composition
analysis of proteins. Journal of Chromatography A, Vol. 826, pp 109-134.
Hrcková, M., Rusnáková, M. och Zemanovic, J. (2002) Enzymatic hydrolysis of defatted soy
flour by three different proteases and their effect on the functional properties of
resulting protein hydrolysates. Czech Journal of Food Science, Vol. 20, pp 7–14.
Inglis, A. S. och Teh-Yung Liu. (1970). The stability of cysteine and cystine during acid
hydrolysis of proteins and peptides. Journal of Biological Chemistry, Vol. 245(1), pp
112-116.
Klotz, A.V. och Higgins, B.M. (1991). Deamidation and succinimide formation by gamma-N-
methylasparagine: potential pitfalls of amino acid analysis. Archives of Biochemistry
Biophysics, Vol. 291(1), pp 113-20.
Margolis, S. A., Jassie, L. och Kingston, H. M. (1991). The hydrolysis of proteins by
microwave technology, Journal of Automatic Chemistry, Vol. 13(3), pp 93-95.
Rytkönen J, Valkonen K, Virtanen V, Foxwell RA, Kyd JM, Cripps AW och Karttunen
TJ. (2006) Enterocyte and M-cell transport of native and heat-denatured bovine
β-Lactoglobulin: Significance of heat denaturation, Journal of Agricultural and Food
Chemistry, Vol. 54, pp 1500-1507.
Sindayikengera, S. och Xia, W-S. (2006). Nutritional evaluation of caseins and whey proteins
and their hydrolysates from Protamex, Journal of Zhejiang University SCIENCE B,
Vol. 7(2), pp 90-98.
ten Hoedt, A. E., Maurice-Stam, H., Boelen, C. C. A., Rubio-Gozalbo, M. E.,
van Spronsen, F. J., Wijburg, F. A., Bosch, A. M. och Grootenhuis, M. A. (2011)
Parenting a child with phenylketonuria or galactosemia: implications for health-related
quality of life, Journal of Inherited Metabolic Disease, Vol. 34 (2), pp 391-398.
Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J-F, Lahm, H-W och Fountoulakis, M. (1998). Effect
of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of
proteins, Journal of Chromatography A, Vol. 795(2), pp 263-275.
Top Related