Clonarea Genica
-
Upload
andreea-pinzaru -
Category
Documents
-
view
169 -
download
8
description
Transcript of Clonarea Genica
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 1/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Investeşte în oameni! Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Axa prioritară 1 „Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere” Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale şi post-doctorale în sprijinul cercetării” Titlul proiectului „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară ” Contract POSDRU/21/1.5/G/36154
Raport ştiinţific
Expert ştiinţific: LUPAN Iulia
Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională pentru obţinerea
de proteine
1. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot
ADN în sine are doar 2 funcţii importante şi anume păstrarea informaţiei genetice şi furnizarea
acesteia pentru sinteza de proteine. Păstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o
generaţie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN şi împărţirea egală din timpul diviziunii
celulare. A doua funcţie este legată de descifrarea informaţiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul
informaţiei între ADN şi proteine este ARN care este sintetizat în procesul de transcriere a ADN de către o
enzimă numită ARN polimerază. ARNm rezultat serveşte ca matriţă în procesul de traducere a ADN (sinteza
proteinelor) care are loc în ribosomi. Practic ARN este cărăuşul informaţiei din nucleu în citoplasmă unde
are loc sinteza proteinelor. Dogma centrală a biologiei presupune transmiterea unidirecţională a informaţiei
de la ADN la proteine prin intermediul ARN (Figura 1). Informaţia genetică nu poate fi transmisă invers de
la proteine la ADN. Informaţia genetică poate fi transmisă de la ARN la ADN în cazul retrovirusurilor la
care materialul genetic este ARN. Nu există cazuri de transmitere a informaţiei de la ADN direct la proteine.
Figura 1. Dogma centrală a biologiei.
Replicare
Transcriere
Traducere
Proteină
ADN
ARNm
Nucleu
Citoplasmă
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 2/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Clonarea genelor constă în izolarea unei gene dintr-un genom şi introducerea ei în alte celule gazdă
pentru multiplicare şi în unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot
obţine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar procesul clonării constă din următoarele etape:
- amplificarea genei de interes
- introducerea genei de interes într-un vector de clonare
- introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă
- selecţia celulelor transformate (purtătoare ale moleculei recombinate)
- verificarea moleculelor recombinate
Amplificarea genei de interes. O genă este considerat orice fragment de ADN care se transcrie într-
o moleculă de ARN. Moleculele de ARN rezultate în urma transcrierii pot fi împărţite în 2 categorii:
- ARN funcţional
- ARN informaţional
ARN funcţional este ARN care nu se traduce, îndeplineşte anumite funcţii în celulă (în cea mai mare
parte participă la procesul de traducere) şi ocupă cea mai mare parte din ARN total din celulă ARN
ribosomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt).
ARN informaţional este ARN mesager (ARNm) care codifică un polipeptid şi serveşte ca matriţă în
procesul de traducere (sinteză a proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonării
codifică un polipeptid. În alte cazuri scopul clonării nu este obligatoriu o genă, ci un fragment de ADN care
nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mărime. Din această cauză în
continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile.
Deoarece fragmentul ADN de interes sau ţintă se află într-un genom este necesară extragerea
acestuia. Există 2 modalităţi de a obţine fragmentul dorit, fie prin tăierea acestuia din genom, fie prin
copierea acestuia. Tăierea fragmentului din genom este mai dificilă deoarece necesită prezenţa unor situsuri
(secvenţe specifice) la capetele fragmentului, care necesită apoi o izolare din amestecul de fragmente
generate, iar numărul moleculelor deci şi cantitatea de ADN este mică.
A doua opţiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des utilizată. În acest scop se
utilizează tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Această tehnică poate fi considerată un adevărat
copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizată, este rapidă şi sensibilă deoarece necesită cantităţi foarte mici
de ADN matriţă. O condiţie obligatorie pentru o amplificare reuşită este cunoaşterea secvenţei ţintă, în
special la capetele acesteia. Dacă secvenţa este necunoscută, atunci se vor analiza cel puţin secvenţe ADN
omoloage de la alte specii sau secvenţa de aminoacizi a proteinei dacă este vorba despre o genă. Principiul
tehnicii PCR este o imitaţie a procesului de replicare a ADN care are loc în celule. Dacă în celule pentru
replicare se foloseşte o întreagă serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici,
cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN. Denaturarea ADN presupune separarea celor două catene.
Procesul este reversibil, catenele complementare formând molecula dublu catenară după înlăturarea
agentului de denaturare. Reacţia de amplificare este una ciclică, fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 etape:
- denaturarea ADN
- alinierea amorselor
- sinteza catenei complementare de către ADN polimerază
După fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dublează, iar după 35-40 de cicluri se obţin milioane
de copii ale fragmentului ţintă pornind de la o singură copie.
Denaturarea ADN este necesară pentru separarea celor 2 catene. Ca agent denaturant se utilizează
temperaturi înalte de 94-98ºC. Denaturarea din primul ciclu durează câteva minute (2-6) deoarece pentru
denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de
denaturare după primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec.
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 3/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Amorsele (termenul englezesc este primer), denumite şi oligonucleotide, sunt secvenţe scurte de
ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complementare cu extremităţile secvenţei ţintă şi formează porţiuni
scurte dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenţele complementare, temperatura este coborâtă la
40-60ºC timp de câteva zeci de sec. Această etapă este numită de aliniere sau hibridizare. Temperatura de
aliniere se stabileşte la câteva grade (2-5) mai puţin decât temperatura de topire (Tm) a amorsei. Temperatura
de topire se calculează în dependenţă de lungimea amorsei şi de compoziţia ei. Există mai multe formule de
calcul, cea mai simplă formulă de calcul pentru o amorsă de până în 25 de nucleotide este:
Unde G, C, A şi T sunt numărul de nucleotide ce conţin aceste baze azotate. Numărul de G şi C se
înmulţeşte dublu faţă de A şi T deoarece între acestea există 3 legături de hidrogen, în consecinţă moleculele
bogate în G şi C au o temperatură mai mare topire.
Există câteva reguli pentru construirea amorselor şi anume:
- numărul de nucleotide este de 15-35
- temperatura de topire a amorselor trebuie să fie între 40 şi 70ºC
- conţinutul de G şi C nu trebuie să depăşească 50-55%
- la capătul 3' al amorsei este de dorit să fie o G sau C, deoarece oferă o stabilitate mai mare
- amorsele nu trebuie să prezinte complementaritate internă, în caz contrar amorsa poate forma
secvenţe interne dublu catenare care au aspect de buclă
- cele două amorse sens (forward) şi antisens (reverse) nu trebuie sa fie complementare între ele,
altfel se vor forma porţiuni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica
porţiunile scurte rămase monocatenare.
De la aceste porţiuni dublu catenare formate între catena matriţă şi amorsa ADN, polimeraza poate
iniţia sinteza catenei complementare. ADN polimeraza catalizează sinteza catenei complementare în direcţia
5'→3' (Figura 2). Amorsele servesc în primul rând la delimitarea fragmentului amplificat, dar şi ca punct
start pentru ADN polimerază care nu poate porni sinteza de la zero şi are nevoie de un capăt liber 3'.
Iniţial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolată de la bacteria Escherichia coli
care are activitatea optimă de sinteză la 37°C. Cel mai mare dezavantaj al utilizării acestei enzime era
inactivarea termică în timpul denaturării ADN. În acest fel tuburile de reacţie trebuiau schimbate de la o
temperatură la alta şi după fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimerază. Astfel amplificarea
fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. Salvarea acestei metode a venit după descoperirea şi
descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluţionară în acest sens, pe larg utilizată
şi astăzi este Taq polimeraza. Această enzimă este o ADN polimerază, izolată de la o bacterie termofilă
Thermococcus aquaticus (de unde şi denumirea ei), care sintetizează polimerizarea nucleotidelor trifosfat
într-un lanţ polinucleotidic în direcţia 5′→3′. Taq polimeraza are activitatea optimă la 72°C şi nu se
denaturează la temperaturi ridicate de peste 90°C foarte repede, astfel după câteva ore la 95°C pierderea de
activitate este nesemnificativă. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de aproximativ 1000 de
nucleotide per minut. Durata elongării necesare sintezei va fi în dependenţă de mărimea fragmentului ţintă.
Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000 de
nucleotide – 2minute.
Tm = 4 (G + C) + 2(A + T)
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 4/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5' 3'
3'
5'
5' 3'
3' 5'
5'
3'
3'
3'
5' 3'
5'
5' 3'
3'
3'
5' 3'
5'
5' 3'
3'
ADN genomic cu
fragmentul ţintă
Etapa iniţială de
denaturare
Alinierea amorselor
la capetele
fragmentului ţintă
Etapa de elongare sau
sinteză a catenei
complementare de către
ADN polimerază
Sfârşitul
primului ciclu
Ciclu
II
Ciclu I
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 5/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Figura 2. Reprezentarea schematică a primelor cicluri de PCR.
Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere inversă. Acest tip este asemănător PCR
obişnuit, doar că foloseşte o matriţă de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabilă de această sinteză
este transcriptaza inversă, care este de fapt o ADN polimerază ARN-dependentă. Taq polimeraza este o
ADN polimerază deoarece sintetizează ADN şi este ADN dependentă deoarece utilizează o matriţă ADN
pentru sinteză. Transcriptaza inversă a fost izolată de la virusurile care au material genetic ARN şi în
momementul intrării în celulă necesită sinteza unei copii a materialului său genetic. RT-PCR se utilizează
pentru obţinerea copiilor de gene eucariote care nu conţin introni şi analiza exprimării de gene. În ambele
cazuri se porneşte de la ARNm (informaţional care codifică proteine). Exprimarea genelor sau transcrierea
este etapa intermediară între ADN şi proteine. ADN codifică informaţie genetică despre sinteza proteinelor,
calea de la ADN la proteine constituie dogma centrală a biologiei.
Enzime de restricţie. Enzimele de restricţie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule monocatenare sau dublu
catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevărate foarfece de ADN.
Restrictazele recunosc doar anumite secvenţe scurte numite situsuri specifice de recunoaştere, se fixează de
acestea şi taie legăturile fosfoesterice între nucleotide.
Aceste enzime au fost descoperite la bacterii şi se presupune că funcţia lor este de apărare contra
bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). În momentul intrării ADN fagic în bacterii, enzimele de restricţie
digeră aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restricţie prin metilarea
unor baze azotate, enzimele de restricţie, în general, nu taie ADN metilat. Până acum au fost descrie 4000 de
enzime de restricţie de la câteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se împart în 3 clase: I, II şi III.
Această clasificare este în dependenţă de cofactorul utilizat şi de secvenţa de recunoaştere. Enzimele cele
mai utilizate în tehnicile moleculare sunt cele de tip II, care au secvenţa de recunoaştere un palindrom şi
utilizează ioni de Mg2+
ca şi cofactor. Secvenţa palindrom este alcătuită din 4-6 nucleotide şi citită pe ambele
catene în direcţia 5′→3′ este identică.
5' 3'
5' 3'
3'
3'
5'
5'
5' 3'
5' 3'
3'
3'
5'
5'
5' 5'
3'
3'
3'
3'
3' 5'
5' 3' 3' 5'
3'
Ciclu
III
Taq polimeraza
amorsă
amorsă ce indică direcţia de sinteză
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 6/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Nomenclatura enzimelor de restricţie porneşte de la denumirea bacteriei de la care a fost izolată.
Astfel, HindIII este izolată de Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina
RY13.
Figura 3. Secvenţele de recunoaştere pentru enzimele EcoRI (A) şi SmaI (B) şi capetele libere
după tăiere. Locurile de tăiere sunt indicate cu săgeţi.
Capetele libere după tăierea de către enzimele de restricţie pot fi de 2 feluri: coezive sau drepte.
Enzima BamHI şi EcoRI generează capete coezive după tăiere, iar enzimele SmaI şi EcoRV generează capete
drepte sau netede (Figura 3).
Cu ajutorul unor programe speciale se pot alcătui hărţi de restricţie care reprezintă situsurile de
recunoaştere pentru diferite restrictaze într-o secvenţă (Figura 4).
Figura 4. Harta de restricţie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre în
paranteze sunt indicate situsurile enzimelor de restricţie.
Ligarea fragmentelor de ADN
Deşi moleculele de ADN pot fi asemănate cu nişte fire, acestea nu pot fi legate prin creare de noduri
sau nu există nici un lipici special. Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizează o enzimă numită ADN
ligază. Această enzimă reface legăturile fosfoesterice între gruparea hidroxil a unui nucleotid (capătul 3′) şi
gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (capătul 5′) (Figura 5). Funcţia ligazei în celule vii este
legarea fragmentelor în timpul replicării, recombinării şi după repararea ADN. Cea mai des utilizată este
ADN ligaza T4 izolată de la bacteriofagul T4. ADN ligaza T4 utilizează ATP ca şi cofactor.
GGGCCC
CCCGGG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
5′
5′ 3′
3′
SmaI
5′
5′ 3′
3′
A B
GGG
CCC
G
CTTAA
AATTC
G 5′
3′ 5′
3′
CCC
GGG 3′
5′
5′
3′
YLR377C
1047 bp
NcoI (7 77)
EcoRV (58)
BamHI (533)
BamHI (773)
EcoRI (605)
EcoRI (633)H infI (32)
H infI (7 5)
H infI (461)
H infI (616)
H infI (942)
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 7/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Figura 5. Reprezentarea schematică de legare de către ADN ligază a două fragmente ADN
care au capete netede.
Vectori de clonare
Prin vectori de clonare subînţelegem molecule de ADN transportatoare ale fragmentului de ADN
străin în celulele gazdă. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide şi vectori
artificiali. Aceşti vectori sunt utilizaţi în dependenţă de scopul clonării. Cele mai pe larg utilizate sunt
plasmidele. Un plasmid este o moleculă dublu catenară de ADN, care este circulară, închisă şi capabilă de
replicare autonomă în celule gazdă. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izolate de
la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nişte secvenţe specifice necesare replicării, clonării,
selecţiei şi uneori exprimării genelor. Pentru replicarea autonomă în celule gazdă plasmidele conţin secvenţa
ori, care este originea de replicare. Nicio moleculă de ADN nu poate fi replicată fără o origine de replicare.
Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate începe replicare şi care este
recunoscută de anumite proteinele care iniţiază replicarea.
O regiune foarte importantă într-un vector de clonare este Situsul Multiplu de Clonare (termenul
englezesc este Multiple Cloning Site). În această regiune se introduce fragmentul ţintă de ADN cu ajutorul
enzimelor de restricţie şi a ligazei. Atât vectorul cât şi fragmentul ADN este tăiat cu aceleaşi enzime de
restricţie şi legate împreună cu ajutorul ligazei. SMC conţine secvenţele de recunoaştere pentru mai multe
enzime de restricţie şi care nu se conţin în altă regiune a vectorului. O altă componentă foarte importantă a
plasmidelor sunt markerii de selecţie care sunt de obicei nişte gene a căror produs (enzimă) fac posibilă
selectarea celulelor cu plasmid de cele fără plasmid care sunt mai numeroase. Cei mai des utilizaţi markeri
sunt genele ce conferă rezistenţă la antibiotice, mai corect spus produsul genei conferă rezistenţă. Spre
exemplu, β-lactamaza conferă rezistenţă la ampicilină. Plasmidele care conţin gena pentru această enzimă
vor proteja celulele bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dacă un amestec de celule transformate cu
plasmide care vor conţine atât celule cu cât şi fără plasmid, se însămânţează pe un mediu cu ampicilină, vor
supraveţui doar celulele care conţin plasmidul.
Un alt fel de selecţie este selecţia celulelor transformate cu plasmid recombinat adică cu insert de
cele cu plasmid fără insert. Insert se referă la fragmentul de ADN ţintă clonat. În acest scop situsul multiplu
de clonare se află într-o genă ce codifică o enzimă. Dacă în SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN
atunci gena este intactă, produsul ei este o proteină activă. Dacă în SMC a fost introdus un fragment ADN
atunci gena este modificată şi produsul ei este inactiv. Spre exemplu dacă SMC se află în gena lacZ′ care
codifică subunitatea α a enzimei β-galactozidază, atunci produsul acestei gene împreună cu subunităţile
codificate din genomul celulei gazdă bacteriene vor forma o enzimă activă capabilă să metabolizeze un
derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adăugat în mediu şi este
incolor. Dacă β-galactozidaza este activă atunci va metaboliza acest substrat iar produsul format în urma
reacţiei va avea o culoare albastră. În acest fel coloniile rezultate după transformare care conţin vectorul fără
insert vor fi albastre, iar cele ce conţin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzimă activă
G G A T
C C T A
C G C A A
G C C T T
5′
3′
3′
5′
OH
HO
P
OH
O
OH
OH
O P
OH
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 8/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
capabilă de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecţie utilizează o enzimă toxică pentru celulele
bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid fără insert au gena funcţională care va provoca moartea celulelor.
Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncţională şi vor supraveţui.
Vectorii de clonare au de obicei mărime mică, doar de câteva mii de pb şi în care pot fi inserate
fragmente de ADN de la 100 pb până la 2000-3000 pb (Figura 6: A, B). O caracteristică importantă pentru
plasmide este numărul de copii per celulă. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un număr mai mare de
copii per celulă. Acest fapt permite obţinerea unei cantităţi mari de ADN plasmidic dintr-o cultură mică de
bacterii (din 3-5ml de cultură se pot obţine câteva μg de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari numărul
copiilor per celulă este mai mic, în consecinţă şi pentru a obţine o cantitate mai mare de ADN este necesară o
cantitate mai mare de cultură.
Figura 6. Hărţile unor vectori plasmidici. A – harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezistenţă la
antibiotice: Apr conferă rezistenţă la ampicilină, iar TC
r rezistenţă la tetraciclină, situsul multiplu de clonare îl
poate constitui oricare dintre cele două gene de rezistenţă, în dependenţă de gena selectată pentru inserare,
rezistenţa la antibioticul respectiv se va pierde . B – harta plasmidului de clonare pTZ57R comercializat de
firma Fermentas. Plasmidul are rezistenţă la ampicilină iar situsul multiplu de clonare se află în gena lacZ' care
oferă selecţia alb-albastră a clonelor pozitive. C – harta vector de exprimare pET21a de la Novagen care
include gena bla care conferă rezistenţă la ampicilină, situsul multiplu de clonare care conţine un codon
START şi un codon STOP după eticheta de 6 histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.
pBR322
4361 bp
TC r
AP r
ORI
BamHI (376)
Cla I (25)
EcoRI (4360) HindIII (30)
Pst I (3612)
EcoRV (188)
Bst Z17I (2247)
Pvu I (3737)
SalI (652)
Sca I (3847)
Sph I (567)
pTZ57R
2886 bp
LacZ
bla(AmR)
MCS
T7 promoter
Ori
BamHI (655)
EcoRI (616)
HindIII (691)
Pst I (677)
Xba I (645)
Sac I (626)
SalI (668)
Kpn I (632)
Apa I (666)
A B
pET-21a
5443 bp
bla (Ap)
lacI
M CS
T7 promoter
His tag
ColE1 pBR322 origin
f1 origin
T7 terminator
BamHI (199)
BglII (343)
EcoRI (193)
HindIII (174)
NdeI (239)
Not I (167)
Sac I (191)
SalI (180)
XhoI (159)
C
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 9/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care mai oferă în plus posibilitatea
exprimării genei clonate(Figura 6 C). Plasmidele de exprimare trebuie să mai conţină câteva elemente în plus
faţă de vectorii de clonare. Aceste elemente sunt cele care se găsesc şi în genom şi fac parte dintr-o genă:
promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START şi STOP care delimitează cadrul deschis de
citire (termenul englezesc este Open Reading Frame). Promotorul este o secvenţă care se află în amonte de
genă şi este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixează la nivelul promotorului şi iniţiază
transcrierea. Numai în prezenţa promotorului exprimarea va fi foarte scăzută, de aceea situsul de legare al
ribozomilor (termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secvenţă care se transcrie dar care nu se
traduce şi care este recunoscută de ribosomi. Ribosomii se leagă la acest situs şi se deplasează de-a lungul
ARNm până întâlnesc primul codon START de unde începe traducerea. Codonul START la procariote este
în cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei inclus în situsul multiplu de clonare, în caz contrar
acesta se poate introduce în fragmentul ţintă cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus şi el de obicei
în situsul de clonare. În unele cazuri acesta este prezent după regiuni care codifică anumite aşa-zise etichete.
Etichetele facilitează purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des
utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza (GST) şi proteina de legare a maltozei
(Maltose Binding Protein, MBP este termenul în engleză). Aceste etichete vor fi parte integrantă a
proteinelor la capătul ei C-terminal sau N-terminal dacă secvenţa ce codifică eticheta este prezentă după sau
înainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate faţă de
anumite răşini cromatografice.
Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă
Introducerea plasmidelor recombinate în celule gazdă se numeşte transformare dacă sunt utilizate
celule bacteriene sau transfecţie dacă sunt celule eucariote. În continuare se va detalia doar transformarea
celulelor procariote, acestea având cea mai mare aplicabilitate şi simplitate în scopul obţinerii clonelor şi
proteinelor recombinate. Există două tipuri de transformare a celulelor bacteriene pe larg utilizate în
laboratoarele de biologie moleculară:
- transformarea chimică
- transformare sub influenţa câmpului electric.
Ambele tipuri de transformare necesită inducerea unei competenţe de transformare, deoarece E. coli
nu are proprietăţi de transformare naturală.
Această competenţă în cazul transformării chimice este indusă cu CaCl2. În acest scop se realizează o
cultură de E. coli şi prin tratarea celulelor cu clorură de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor
bacteriene (Figura 7 A). Celulele sunt şocate termic foarte scurt, timp de maxim 2 minute, la 42°C. Acest
timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate în celulele bacteriene.
Transformarea în câmp electric este mai eficientă decât transformarea chimică. Prepararea celulelor
competente presupune doar creşterea lor până în faza logaritmică (D=600nm = 0,6-0,8) şi înlăturarea prin
spălări repetate a mediului de cultură. Aceste spălări repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta
transformarea. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va crea
câmpul electric între doi electrozi. Amestecul de celule competente şi plasmide recombinate vor fi depuse
într-o cuvă specială de electroporare, ai cărei pereţii laterali sunt electrozii. Transformarea are loc la o
tensiune de 1800 sau 2500 V timp de câteva msec (Figura 7 B). După transformare celulele şocate sunt
preluate în mediu de cultură şi apoi însămânţate pe mediu selectiv cu antibiotice.
Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte dintre ele fiind netransformate
adică fără plasmid. Eficienţa de transformare a celulelor se poate măsura efectuând o transformare cu o
cantitate de 1ng de ADN plasmidic şi apoi numărând coloniile rezultate. Numărul de colonii va corespunde
numărului de celulele transformate deoarece fiecare colonie ia naştere dintr-o singură celulă. Numărul
obţinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se raportează la 1 μg de ADN (înmulţind valoarea la
1000). O eficienţă bună de transformare este 106, ceea ce înseamnă ca la transformarea unui μg de plasmid s-
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 10/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
ar obţine 1 milion de colonii, o valoare foarte mare ţinând cont de faptul că avem nevoie de o singură colonie
sau de câteva când avem un amestec eterogen de molecule ţintă. Desigur în amestecul de ligare numărul de
molecule recombinate este mic şi din această cauză este de dorit o eficienţă cât mai mare a celulelor
competente.
Fiecare dintre cele două metode de transformare prezintă avantaje şi dezavantaje legate de eficienţa
de transformare şi de costuri. Transformarea chimică este mai puţin eficientă decât electroporarea, dar mai
ieftină deoarece nu necesită aparatură şi cuve costisitoare.
Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A – transformarea chimică cu
CaCl2; B – electroporarea celulelor bacteriene.
Electroforeza acizilor nucleici
Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcină într-un câmp electric. Migrarea
moleculelor se realizează printr-o matrice specifică. Metoda este aplicată pentru analiza proteinelor şi a
acizilor nucleici. Pentru proteine se aplică cel mai des electroforeza proteinelor în condiţii denaturante în gel
de poliacrilamidă (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice şi pentru
electroforeza acizilor nucleici care oferă o rezoluţie foarte bună a separării fragmentelor de ADN, mai ales în
cazul fragmentelor mici. Această matrice este folosită mai rar în laboratoarele de analize genetice, deoarece
este mai laborioasă. Primul loc în utilizarea vizualizării acizilor nucleici aparţine electroforezei în gel de
agaroză. Deşi metoda oferă o rezoluţie inferioară celei din poliacrilamidă, ea este utilizată cu succes deoarece
este mai simplă.
Moleculele de acizi nucleici sunt încărcate negativ datorită grupărilor fosfat. Această sarcină face
posibilă migrarea moleculelor de ADN şi ARN într-un câmp electric de la catod la anod. Amestecul de
molecule nu se va deplasa în câmp electric cu aceeaşi viteză. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin
porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi în dependenţă de
masa lor moleculară. Pentru estimarea aproximativă a mărimii fragmentelor în acelaşi gel dar în godeu
separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest amestec de
molecule se numeşte marker molecular.
Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roşii. Gelurile de agaroză se realizează prin
încălzirea agarozei într-un tampon specific. Concentraţia agarozei în gel poate fi între 1 şi 3% în dependenţă
de scopul urmărit. Cu cât concentraţia agarozei este mai mare, cu atât mărimea porilor va fi mai mică. La
concentraţii mai mici de agaroză, porii vor fi mai mari şi migrarea moleculelor mai rapidă. În concluzie
concentraţii mai mici se folosesc pentru fragmente mari (câteva mii de pb), iar concentraţii mari pentru
Spălarea celulelor
bacteriene
A
B Celule de
E.coli
CaCl2 2 min
42ºC
1800 V
5 msec
Celule transformate
de E.coli
Însămânţarea
celulelor
transformate pe
mediu selectiv
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 11/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
fragmente mici. Gelurile de agaroză de 1% sunt cel mai des utilizate oferind separarea moleculelor între 0,1
şi 10 kpb. Gelurile de agaroză sunt plasate între cei doi electrozi în cuve speciale care conţin tampon de
migrare. Acest tampon este acelaşi folosit şi pentru realizarea gelului. Cele mai folosite tampoane sunt TAE
(Tris/Acetat/EDTA) şi TBE (Tris/Borat/EDTA).
Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesară utilizarea unui colorant. Cel mai
des folosită în acest scop este bromura de etidiu, care fixată de ADN în lumină ultravioletă devine
fluorescentă şi are o culoare portocalie (Figura 8). Bromura de etidiu se intercalează între bazele azotate din
molecula dublu catenară de ADN. Lungimea de undă a luminii ultraviolete la care este expus gelul trebuie să
fie cuprinsă între 260 şi 300 nm.
Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză. A – imaginea gelului la expunerea în UV; B – fotografia aceluiaşi gel.
Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru vizualizarea şi purificarea ADN. Vizualizarea ne
oferă informaţii despre integritatea ADN (ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor
enzimatice, estimarea cantităţii de ADN obţinută în reacţiile PCR sau de extracţie. ADN poate fi purificat din
gel de agaroză după migrare prin excizarea fragmentului ţintă şi purificarea din gel cu kituri special
predestinate acestui tip de purificări.
Verificarea moleculelor recombinate
Rezultatul ligării şi transformării se poate vedea doar după 12-18 ore de la transformare când apar
coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariţia coloniilor nu indică neapărat şi o reuşită deplină a clonării,
deoarece acestea pot conţine un amestec de colonii pozitive şi colonii cu plasmid fără insert. Chiar dacă se
foloseşte un sistem alb-albastru de selecţie a coloniilor pozitive, acestea necesită totuşi o dovadă în plus a
prezenţei plasmidului recombinat. În acest scop se va efectua o cultură lichidă de 3-5 ml de mediu cu
antibiotic care se va însămânţa cu o singură colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu agitare la 37°C.
Ziua următoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu
ajutorul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmează a fi analizat iniţial prin digestie enzimatică şi apoi prin
secvenţializare. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricţie cu care acesta a fost introdus
în vector sau care se află la extremele situsului multiplu de clonare. Această digestie va confirma prezenţa
insertului în plasmid şi aproximativ mărimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaţie despre secvenţa
fragmentului clonat.
Secvenţializarea fragmentului ţintă este verificarea definitivă a clonării. Această verificare este
necesară deoarece ADN polimeraza utilizată pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de
sinteză. Pentru a evita erorile în produşii PCR se poate utiliza o ADN polimerază care are proprietatea de a
corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza ş.
a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigură de obicei randamente de sinteză mai
mari. În unele cazuri se utilizează un amestec de 2 polimeraze (3 părţi de Taq polimerază şi o parte Pfu
polimerază) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescută.
A B
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 12/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
În cadrul Centrului de Biologie Moleculară există 2 secvenţiatoare: Analizorul Genetic ABI Prism
310, Applied Biosystems, SUA (laser cu detecţie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ™ 8800
Genetic Analysis System (laser cu detecţie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizează principiul
Sanger de secvenţiere. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secve nţiere.
Matriţa ADN ce urmează a fi secvenţiată este denaturată, apoi la unul din capetele sale are loc
ataşarea unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei complementare. Amestecul
PCR conţine dezoxiribonucleotide trifosfat (dNTP) dar şi didezoxiribonucleotide trifosfat (ddNTP)
care nu conţin gruparea OH în poziţia 3' a dezoxi ribozei. Lipsa acestei grupări va face imposibilă
continuarea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate adăuga următorul nucleotide.
Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se fooseşte o singură amorsă) de
diferite mărimi. Numărul de cicluri este de 40 ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se
opresc în toate punctele matriţei de ADN. Pentru detecţia fragmentelor, fiecare ddNTP este marcat cu
un fluorcrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care
presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinal micrometrilor. O cantitate de câţiva
microlitri vor fi separaţi în gelul din capilar. Migrarea fragmentelor în gel este în dependenţă de
mărimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. În ultima parte a capilarului
există o fereastră transparent prin care un fascicol laser va excita frluorocromii, iar fluores cenţa emisă
va fi captată şi prezentată sub forma unei cromatograme (Figura 9). Cromatogramele sunt apoi
analizate şi comparate cu secvenţa existentă în bazele de date. Mărimea fragmentelor de ADN care pot
fi secvenţializate variază între 600 şi 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matriţe dificile (cu
secvenţe repetitive) este necesară utilzarea unor kituri speciale.
Figura 9. Cromatograma unei secvenţe obţinută cu ajutorul analizorului ABI Prism 310.
Exprimarea genelor în sistem procariot
Clonarea genelor vizează în principal două obiective posibile: multiplicarea unui fragment ADN sau
exprimarea genei clonate. Clonarea în scopul multiplicării fragmentului este utilizată atunci când ADN supus
analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei şi la care se
urmăreşte cunoaşterea secvenţei. În acest scop amestecul de fragmente se clonează într-un vector de clonare,
iar clonele pozitive sunt apoi secvenţializate.
Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg în obţinerea de proteine recombinate. Ele pot fi numite
adevărate fabrici de proteine la comandă, care însă câteodată „refuză” să sintetizeze proteinele comandate şi
de ce cele mai dese ori străine celulei bacteriene. Clonarea în scopul exprimării genei şi obţinerii de proteină
recombinată include câteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate fi
clonată direct în vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conţin neapărat un promotor recunoscut de
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 13/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
ARN polimeraza celulei gazdă, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START şi unul STOP la
capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important în acest caz este păstrarea cadrului deschis de citire,
adică împărţirea exactă pe codoni a genei de la primul codon tradus până la ultimul. Promotorii din aceste
tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropil-tio-galactozid),
care este un analog al galactozei. Spre exemplu vectorii de tip pET de la Novagen asigură de obicei o
supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conţine promotorul de la fagul T7, situsul de
recunoaştere a ribosomilor, codonul START în situsul multiplu de clonare şi codonul STOP după o etichetă
de 6 histidine. Dacă se optează pentru prezenţa unei etichete 6His la capătul C-terminal a proteinei pentru
facilitarea purificării atunci din genă se va înlătura codonul STOP. Dacă această etichetă nu este necesară,
atunci în genă se păstra codonul STOP şi traducerea se va opri înainte de etichetă. Promotorul T7 nu este
recunoscut de către ARN polimeraza de la E. coli şi simpla prezenţă a plasmidului în celulele bacteriene nu
va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesită tulpini de E. coli care conţin gena pentru ARN
polimeraza de la fagul T7. Această genă se află sub controlul promotorului lacUV5 şi a operatorului lac
(Figura 10).
Figura 10. Inhibiţia exprimării genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 şi a genei ţintă în
celulele gazdă de E. coli în lipsa inductorului.
Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină numită represorul lac. Atunci când în
mediu nu există lactoză (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi împiedică
transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este gena pentru T7 ARN polimeraza. În absenţa T7
ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei ţintă din plasmid. Represorul lac este codificat de gena
lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât şi în plasmidul de exprimare. Agentul care induce
exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul lac şi cauzează
disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E.
coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va recunoaşte promotorul T7 din
plamsid şi va transcrie gena ţintă. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic şi care poate asigura o
producţie de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale bacteriene.
pET21
lacI
lac
lac
lacI
P lac Lac O
Lac O
P T7
represorul lac
gena lacI
promotorul lac
operatorul lac
gena pentru T7 ARN polimerază
promotorul T7
gena ţintă
ADN genomic
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 14/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
Purificarea proteinelor recombinate
Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice. Pentru o purificare cât mai bună
din amestecul total de proteine este necesară purificarea în cel puţin 2 etape prin metode cromatografice
diferite. Ataşarea unor etichete la proteinele recombinate asigură purificarea proteinelor într-o singură etapă,
ceea ce reduce timpul necesar şi asigură randamente de purificare mai mari (Figura 11). Dacă eticheta
deranjează în analiza ulterioară a proteinei, atunci se poate recurge la înlăturarea acesteia prin digestie cu
peptidaze. În acest scop pentru clonare şi exprimare se va alege un plasmid care conţin situsul pentru
peptidază, cum este spre exemplu situsul pentru trombină în cazul plasmidului pET28.
Figura 11. Reprezentarea schematică a purificării de proteine recombinate prin cromatografie
de afinitate. A – încărcarea amestecului total de proteine pe coloana cu răşină; B – spălarea coloanei cu
tampon şi fixarea proteinei ţintă de răşină; C – eluarea proteinei ţintă de pe coloană.
2. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii
interdisciplinare
Clonarea genelor în ultimii ani a devenit o tehnică indispensabilă în laboratoarele de biologie
moleculară. Una dintre aplicaţiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar şi pentru studii
interdisciplinare este utilizarea ei în scopul obţinerii de proteine recombinate. Clonarea genelor şi exprimarea
lor în celule gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă de proteine. În cele mai multe cazuri purificare unei
proteine din celulele în care aceasta se exprimă în mod firesc natural prezintă mai multe dificultăţi:
- cantitatea de proteine în ţesuturi este foarte mică, spre exemplu pentru purificarea unei proteine
din bacterii este necesară o cantitate de zeci de litri de cultură bacteriană, iar rezultatul
purificărilor în câteva etape pot fi sub 1g de proteină;
- obţinerea unei cantităţi mari de ţesut pentru purificare este aproape imposibil, spre exemplu cum
este cazul unor bacterii pe care nu putem să le cultivăm în condiţii de laborator;
- obţinerea materialului pentru purificare implică probleme etice, cum ar fi spre exemplu cazul
unor proteine umane, obţinerea de proteine din celule umane ar fi imposibilă;
A B C
5'
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 15/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
- purificarea se face în mai multe etape care necesită timp, consumabile şi are randamente mai
mici.
Aceste dezavantaje ale purificării direct din material biologic sunt eliminate în cazul exprimării
genelor în celule gazdă. Un mare avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaţii care pot
dezvălui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari în activitatea proteinei. Prin intermediul tehnicilor de
mutageneză pot fi introduse mai multe tipuri de mutaţii:
- mutaţii missens care schimbă un aminoacid cu altul;
- deleţii în care porţiuni întregi din lanţul polipeptidic pot fi înlăturate;
- inserţii care constau în introducerea de fragmente noi în gena codificatoare şi respectiv în
proteina recombinată;
- fuzionării, se pot fuziona proteine între ele sau regiuni ale unei proteine cu regiuni ale altei
proteine, spre exemplu regiunea N-terminală a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu
capătul C-terminal al aceleiaşi proteine de la o specie înrudită;
- proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate cu anumite molecule care sunt
introduse în proteine în procesul lor de sinteză sau pot fi fuziuni. Un exemplu în acest sens este
marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, în mod specific sau randomic. Un alt
exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi
facilitează detecţia lor.
Clonarea genelor şi exprimarea lor în sistem procariot este tehnica la care se apelează cel mai des,
deoarece este mai rapidă şi mai puţin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare,
astfel o proteină are structură: primară, secundară, terţiară şi cuaternară. Exprimarea genelor şi sinteza
proteinelor în celulele procariote asigură doar structura primară exactă a polipeptidului sintetizat. În unele
cazuri proteinele adoptă structura secundară independent după sinteză, în alte cazuri este nevoie de condiţii
speciale şi alte proteine care contribuie la adoptarea conformaţiei proteinei active. Unele proteine atât de la
eucariote cât şi de la procariote sintetizate în celule gazdă de E. coli nu reuşesc să adopte o structură
secundară corectă, iar ca rezultat polipeptidele acumulate în citoplasma formează corpi de incluziune. Există
cazuri când acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune oferă
posibilitatea unei purificări printr-o singură etapă în condiţii denaturante. Proteinele denaturate purificate în
acest mod pot fi utilizate pentru imunizarea de animale în scopul producerii de anticorpi. Cel mai important
aspect pentru imunizare este secvenţa de aminoacizi a proteinei şi nu structura ei secundară sau terţiară.
Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezisă pe baza apartenenţei genei sau
pe baza analizei structurii primare. O altă problemă care poate apărea este neexprimarea genei. Cauzele
neexprimării pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazdă. Un alt dezavantaj (deşi în unele cazuri este un
avantaj) este lipsa modificărilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate în celule bacteriene. Majoritatea
proteinelor de la eucariote necesită nu numai adaptări conformaţionale dar şi modificări post-traducere cum
ar fi fosforilări, glicozilări ş. a. Dacă prezenţa acestor modificări este absolut necesară, atunci se va recurge la
clonarea genei în sistem procariot şi exprimarea ei în celule gazdă eucariote. Lipsa modificărilor post-
traducere este un avantaj atunci când este cunoscută funcţia proteinei active şi se doreşte să se cunoască rolul
grupărilor care sunt adăugate după sinteză. În acest fel proteina recombinată nu va fi modificată şi se va
putea deduce rolul acestor grupări în activitatea proteinei.
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 16/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
3. Infrastructura existentă în cadrul Centrului de Biologie Moleculară
Denumire echipament Caracteristici
Instalaţie de preluare şi prelucrare a imaginilor
Ced Limited, Marea Britanie
Achizitia şi interpretarea imaginilor de pe geluri de poliacrilamidă sau
geluri de agaroză
Instalaţie de apă ultrapură, Elga-Lab Water,
Marea Britanie Purificarea apei până la o rezistivitate de 18,2 MΩ/cm (apa MilliQ)
Centrifugă cu răcire Sigma 3K18 (4 rotoare),
Sigma, Germania
Centrifugarea probelor, de la 0,2ml la 1 litru, maximum 28000xg,
răcire de la temperatura camerei la 0°C, rotor Eppendorf (24 tuburi), rotor
6x30ml, rotor 8x50ml si rotor 4x250ml
Centrifugă de masă Sigma 1-13, Sigma, Germania Fără răcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi, 13000xg)
“Thermocycler”, Eppendorf, Germania Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de 0,2ml, 0,5ml si
placi ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatură în tub
“Thermocycler”, Corbett Research, Australia Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de 0,2ml şi plăci
ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatură
Electroporator Eppendorf, Germania Transformarea celulelor electrocompetente – bacterii şi drojdii
Spectrofotometru UV-Vis monofascicul M301,
CamSpec, Marea Britanie Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluţie 1 nm
Spectrofotometru Jasco V-530 dublu-fascicul cu
termostatare, Jasco, Japonia
Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluţie 1 nm, cu termostatare,
pentru cinetică enzimatică
Patru instalaţii electroforeză proteine, Consort,
Belgia Electroforeză verticală în gel de poliacrilamidă, max. 32 probe
Şase instalaţii electroforeza acizi nucleici,
Consort, Belgia Electroforeza orizontală în gel de agaroză, max. 48 probe
pH-metru P901 (două bucăţi), Consort, Belgia Masurarea pH-ului, electrod combinat prevăzut cu senzor de temperatură
Congelator temperaturi foarte scăzute, 70 litri,
Sanyo, Japonia Congelare probe biologice la -82ºC
Congelator temperaturi foarte scăzute, 100 litri,
Snijders Scientific, Olanda Congelare probe biologice la -82ºC
Două balanţe analitice, Scaltec, Germania Domeniul de măsurare de la 0,1mg la 160g, autocalibrare, interfaţă pentru
calculator şi imprimantă
Două incubatoare bacteriologice, Memmert,
Germania
Incubarea culturilor bacteriene şi a probelor moleculare de la
temperatura camerei la 70ºC
Doua bai de apa cu agitare, Memmert, Germania Incubarea probelor biologice pana la 100ºC, (3%)
Analizor Genetic ABI Prism 310, Applied
Biosystems, SUA laser cu detecţie pentru 5
fluorocromi Secvenţierea fragmentelor de ADN, identificare umană şi
determinarea polimorfismelor genetice; electroforeza capilară la
15kV; soft-uri speciale pentru secvenţiere şi genotipare; Analizor Genetic CEQ™ 8800 Genetic Analysis
System laser cu detecţie pentru 4 fluorocromi
Instalaţie Real Time PCR, Corbett Research,
Australia
Amplificarea ADN-ului în timp real; detecţia simultană a 4
fluorocromi
Instalaţie HPLC, Jasco, Japonia Separarea probelor prin cromatografie de înaltă performanţă; gradient
binar de înaltă presiune şi gradient cuaternar de joasă presiune
Microscop inversat NIKON Eclipse TE2000S,
Nikon, Japonia
Studiul preparatelor celulare şi tisulare în lumina normală, contrast de
fază şi fluorescenţă
Autoclav 80l, Selecta, Spania Sterilizarea umedă sau uscată a mediilor de cultură, materialelor şi
instrumentelor Autoclav AE-75-DRY Raypa, Spania
Ultrasonicator cu patru sonde, Sonics & Materials Dezintegrarea celulelor bacteriene, ţesuturilor animale şi vegetale în
volume de la 1ml până la 1 litru
Hota PCR cu flux laminar steril, Telstar, Spania Flux laminar vertical, filtru bacteriologic HEPA, iluminare, preparare
probe PCR (4%
Hota flux laminar biohazard 100, Coreea de Sud Filtru exahustare HEPA (0,3 um 99,97%), filtru HEPA (0,3 µm 99,97%),
prefiltru reciclabil (3-30 µm); flux de aer reglabil în 9 trepte (0,35-0,5 m/s);
UNIUNEA EUROPEANĂ GUVERNUL ROMÂNIEI
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI ŞI PROTECŢIEI SOCIALE
AMPOSDRU
Fondul Social European
POSDRU 2007-2013
Instrumente Structurale
2007-2013
OIPOSDRU UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI
CLUJ-NAPOCA
Pag. 17/17
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Investeşte în
OAMENI
ROMÂNIA UNIVERSITATEA BABEŞ-BOLYAI CLUJ-NAPOCA
Str. Mihail Kogălniceanu, nr. 1, 400084 Cluj-Napoca Tel. (00) 40 - 264 - 40.53.00*; int. 5482
Fax: 40 - 264 - 40.53.79 E-mail: [email protected] Web: http://icei.ubbcluj.ro/bionanostiinte/
Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea
ştiinţifică interdiciplinară
POSDRU/21/1.5/G/36154 Proiect cofinanţat din Fondul Social European
prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea
Resurselor Umane 2007-2013
4. BIBLIOGRAFIE
Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., (2002). Molecular Biology of the Cell,
4th edition, New York: Garland Science.
Berg J.M., Tymoczko J.L., and Stryer L., (2002). Biochemistry, 5th edition New York: W. H. Freeman
Company.
Brown T.A., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 5th edition, Wiley-Blackwell
Publishing.
Carson S., and Robertson D., (2005). Manipulation and Expression of Recombinant DNA, 2nd Edition,
Academic Press.
Glick B.R., Pasternak J.J., Patten C.L., (2009). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of
Recombinant DNA, 4th edition, ASM Press.
Glover D.M., Hames B.D., (1995). DNA Cloning: A Practical Approach: Expression Systems (The Practical
Approach Series), 2d edition, Oxford University Press.
Griffiths A., Gelbart W.M., Miller J., and Lewontin R.C., (1999). Modern Genetic Analysis, New York: W.
H. Freeman Company.
Griffiths A., Miller J., Suzuki D.T., Lewontin R.C., and Gelbart W.M., (2000). An Introduction to Genetic
Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman Company.
Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., (2000). Molecular Cell Biology,
4th edition, New York: W. H. Freeman Company.
McPherson M.J., and. Mǿller S.G., (2000). PCR, Basics: from Background to Bench, 1st edition, Springer-
Verlag Telos.
Metzenberg S., (2007). Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)), 1 edition, Taylor & Francis.
Popescu O., 1990. Electroforeza proteinelor in geluri de poliacrilamidă, Editura Tehnică, Bucureşti.
Watson J.D., Myers R.M., Caudy A.A., Witkowski J.A., (2006). Recombinant DNA: Genes and Genomes -
A Short Course, 3rd Edition, W. H. Freeman Company.