Espressione genica

External input

Endogenous input

Microarray per l’analisi dell’espressione genica

Diagramma di flusso operativo di un esperimento microarray

Disegno dell’esperimento

Preparazione dei campioni ed ibridazione

Sottomissione dell’esperimento a database pubblici

Analisi statistica, validazione e annotazione dei risultati

Pre-trattamento e normalizzazione dei dati

Quantizzazione dei dati grezzi

• definizione dell’ipotesi biologica indagata

• identificazione di fattori di confondimento e schema di ibridazione

• valutazione dei vincoli economici

• valutazione dei limiti di gestione

• estrazione dell’mRNA

• marcatura dell’mRNA

• ibridazione

• lavaggio

• asciugatura

• scansione

• “gridding” e quantizzazione numerica delle intensità di fluorescenza

• estrazione delle intensità di “foreground” e di “background”

• “quality control” dei dati grezzi

• sottrazione del “background”

• correzione degli errori sistematici attraverso la normalizzazione

• verifica dell’effetto del pre-trattamento dei dati

• applicazione di test statistici per determinare quali sono i geni differenzialmente espressi

• validazione dei risultati con RTq-PCR

• “pathway analysis” per l’interpretazione biologica dei risultati

• annotazione dei risultati nelle banche dati• strutturazione secondo lo standard MIAME dell’informazione contenuta nell’esperimento

• sottomissione delle informazioni a database per la pubblicazione dei dati

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Categorie di esperimenti microarray• Class comparison

• Class prediction

• Class discovery

Confrontare il livello medio di espressione fra gruppi di campioni e stabilire quali sono i geni responsabili di eventuali differenze

• identificare geni differenzialmente espressi in differenti condizioni sperimentali: - campioni da linee cellulari che contengono BRCA1 mutato vs campioni che contengono BRCA1 non mutato - campioni di cervello di ratti trattati con un farmaco vs campioni di cervello di ratti non trattati

Classi predefinite

Trovare un nuovo sistema di classificazione di campioni sulla base del profilo di espressione genica (cluster analysis)

• identificare nuove sottoclassi di tumori

Classi non predefiniteSviluppare profili di espressione genica differenziale da utilizzare come predittori dell’appartenenza di campioni a classi

• generazione di signature tumorali• generazioni di profili di espressione che sono caratteristici di determinati stadi di crescita di una cellula

Classi non predefinite

Da levare???

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• Reference Design

• Loop Design

• Balanced Block Design

Disegni sperimentali per class comparison

Il confronto fra le due classi è indiretto ed è realizzato attraverso il campione Reference (A vs R) vs (B vs R)

Il confronto fra le due classi è diretto. Per ciascun gruppo (classe) metà dei campioni sono marcati con un fluorocromo e metà con l’altro

Il confronto fra le due classi è diretto. Ciascun campione è ibridizzato due volte, con due fluorofori, su due array differenti

Non-Reference-sample (Ai, Bi,…): tutti i campioni di interesse biologico Reference-sample (R): campione senza significato biologico che serve da baseline comune per la valutazione dell’espressione relativa fra i non-reference-sample

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Obiettivo dell’esperimento microarrayPrecisione (efficienza) nella stima delle differenze fra le due classi

“Posso comprare solo 10 array (non ho problemi a reperire campioni).”

“Ho solo 10 campioni (non ho problemi a comprare array).”

Def: Efficienza ~ 1/varianza delle stime

Come disegno un esperimento efficiente?

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“Posso comprare solo 10 array “

Efficienza: stima più precisa della media delle differenze fra le due popolazioni

ibridizzazione di più campioni possibile sui microarray a disposizione

Reference Design

# sample per classe = 5

# array totali = 10

Balanced Block

# sample per classe = 10

# array totali = 10

Loop Design

# sample per classe = 5

# array totali = 10

…ma posso collezionare i campioni che mi servono

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“Posso comprare solo 10 array “

Svantaggi:

- Poca tolleranza alle variazioni (variazione nell’appartenenza alle classi, perdita di un vetrino, etc)

RD

LD

BBD

Balanced Block

# sample per classe = 10

# sample totali = 20

…ma posso collezionare i campioni che mi servono

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“Ho solo 10 campioni “

Efficienza: stima più precisa delle intensità dei singoli campioni

ibridizzazione di più array

Reference Design

# sample per classe = 5

# array totali = 10

Balanced Block

# sample per classe = 5

# array totali = 5

…ma posso comprare gli array che mi servono

10

“Ho solo 10 campioni “

RD

BBD

Svantaggi:

- Collezione di innumerevoli informazioni “inutili” sul campione di Reference

Reference Design

# sample per classe = 5

# array totali = 10

…ma posso comprare gli array che mi servono

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Come si determina la numerosità n in maniera efficiente?

Per testare l’ipotesi nulla di assenza di espressione genica differenziale bisogna fissare:

• un livello α di significatività

• un livello 1-β di potenza

• l’effect-size δ da detettare (fold change)

• i livelli di varianza σ2 o τ2 dei dati

• il disegno sperimentaleReference Design Balanced Block Design

Non conosciamo le limitazioni sul numero di array da acquistare o di campioni da collezionare

Fase “wet” di un esperimento microarray

• Estrazione mRNA• Retrotrascrizione e

Marcatura• Ibridazione• Scansione

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Scansione del vetrino

• Scanner a due laser– Lunghezze d’onda di eccitazione dei fluorocromi

•635 nm - Red•532 nm - Green

• Canali separati in acquisizione– formazione di due immagini

• Codifica su 16 bit– 2^16 = 65536 livelli di colore

• Occupazione di memoria– 130 MB c.a.

• Scatterplot• MAplot

A =½ log (R*G)

M = log (R/G)

• Imageplot• Boxplot• PCA 2D

Metodi di visualizzazione dei dati

Metodi di sottrazione del “background”

• SubtractIn = If – Ib

• MinimumIn = If – Ib se I>0

In = min(If – Ib >0) se I<0

• Normexp+offset (Ritchie et al, 2007)

Ib ~ N(μ, σ2)

If ~ exp(λ)

Risultati

Dati grezzi

Minimum Normexp+ offset

Subtract

Metodi di normalizzazioneCorrezione degli errori sistematici generati dalla procedura sperimentale

• Diversa efficienza di incorporazione dei due fluorocromi;

• Diversa efficienza di emissione dei due fluorocromi;• Diversa efficienza dello scanner nel leggere i due

canali.

Sistema di rivelazione per fluorescenza

Metodi di normalizzazione within arrayCiascun array viene normalizzato separatamente

Obiettivo: centrare su ciascun array la distribuzione dei log-fold-change ed eliminare gli errori intensità-dipendenti

- Trasformazione linlogper attenuare l’effetto della sottrazione del rumore

alle basse intensità, i dati di intensità sono presi in scala lineare alle basse intensità e in scala logaritmica alle medie e alte intensità- Metodo globale: median o centraggio della mediana

valutazione dello scostamento della mediana (o media) della distribuzione reale dei log-fold-change da quella ideale ed eliminazione- Metodo intensità-dipendente: LOESS

interpolazione di polinomi di primo e secondo grado a finestre di dati per determinare la “smoothing curve”. Tale curva viene utilizzata sulla visualizzazione MA dei dati per riportare la distribuzione reale dei dati a quella reale

Tutte le copie biologiche dello stesso gruppo vengono normalizzate insieme

Obiettivo: eliminare gli errori sistematici che possono rendere eterogenei array biologicamente simili

- Metodo scaleriscalatura della dispersione dei log-fold-change

fra array per equilibrare i valori di M fra array

- Metodo di sostituzione dei quantili: quantileriscalatura dei valori delle intensità assolute fra

array per uniformare le distribuzioni

Metodi di normalizzazione between arrays

Risultati

linlog median LOESS

Risultati

scale

Risultati

quantile

Risultati

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Esperimento ApoAI KnockoutMateriali e metodi:

- 16 topi C57BL/6 “black six”

- in 8 topi è stato “spento” il gene che codifica per l’apolipoproteina AI

- per ciascun topo è stato estratto l’RNA dal fegato, è stato isolato l’mRNA, è stato retrotrascritto in cDNA e marcato con un fluorocromo rosso Cianina Cy5

- il cDNA marcato di ciscun topo è stato mescolato con un’aliquota di un campione di riferimento, ottenuto facendo il pool degli RNA degli 8 topi di controllo e marcando il materiale così ottenuto con il fluorocromo verde Cianina Cy3

- le 16 miscele sono state ibridizzate su 16 microarray distinti

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Esperimento Swirl zebrafishMateriali e metodi:

- 2 pesci zebra

- in 1 pesce è presente una mutazione sul gene BMP2

- per ciascun pesce è stato estratto l’RNA, è stato isolato l’mRNA, è stato retrotrascritto in cDNA. Il cDNA di ogni pesce è stato diviso in quattro aliquote.

- Due aliquote di cDNA di pesce mutato sono state marcate con il fluorocromo rosso Cianina Cy5 e le altre due con il fluorocromo verde Cianina Cy3. Analogamente per il cDNA del pesce wild-type.

- il disegno sperimentale è di tipo diretto con dye-swap