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CLONADO
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La clonación puede definirse como el proceso por el que se consiguen, de forma asexual,copias idénticas de un organismo, célula o molécula.
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VECTORES DE CLONADO
Moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.
Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.
También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.
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¿QUÉ VECTOR USO?
Tamaño del inserto
Número de copias
Incompatibilidad
Marcador de selección
Sitios de clonado
Funciones especializadas
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VECTORES DE CLONADO EN E. coli
TIPO INSERTO
PLÁSMIDOS chico
BACTERIÓFAGOS medio
CÓSMIDOS medio/grande
BACs muy grande
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PLÁSMIDO
Elemento genético extracromosomalque replica autonomamente
Tamaño: < 2 kb- > 1000 kb
linealesGeometría girasas
circulares topologíatopoisomerasas
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FUNCIONES
Resistencia a antibióticos
Resistencia a metales : Pb, Zn, Hg
Funciones metabólicas para utilización de nutrientes: herbicidas, pesticidas, hidrocarburos
Sistemas de protección: restricción-anti restricción
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DNA a clonar
Vector plasmídico
Digestión con endonucleasa yseparación de fragmentos
Digestión con endonucleasa
DNA ligasaVector recombinante
Transformación de célulasde E. coli competentes
Selección de clones positivos y recuperación del plásmido
Esquema clásicode clonado en un vector plasmídico
Placa de agar con medio LB + ampicilina
Selección de bacteriasque han incorporadoel plásmido
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MARCADOR DE SELECCIÓN
SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
ORIGEN DE REPLICACIÓN
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MARCADORES DE SELECCIÓN
ANTIBIÓTICO INHIBICIÓN RESISTENCIA
Ampicilina síntesis de pared βlactamasa (usar en fase log)Carbenicilina
Cloranfenicol síntesis proteica Cl. Acetil transferasa
Kanamicina síntesis proteica aminoglucósido fosfotransferasa
Tetraciclina síntesis proteica TetA (exportación del ATB)
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Pag. 336
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NÚMERO DE COPIAS
Está determinado por el control de la replicaciónAlto clonadoBajo genes letales, construcción de BACs
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REPLICACIÓN PLASMÍDICA
Replicón: unidad genética constituída por el origen de replicación y sus elementos de control asociados
Replicón plasmídico: fragmento más pequeño de ADN plasmídico capaz de replicar autónomamente y mantener el Nº de copias.
ARN anti sentidoControl de la replicación
iterones
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Plásmido pMB1: casi todos los plásmidos usados en clonado derivan de él
Replicón pMB1/colE1: inicialmente 15-20 copias /célula. Modificaciones: >Nº de copias
Mutación TS
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REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO colE1 POR ARN ANTISENTIDO
Vida mediacorta
RNAsa H
No necesita síntesis proteica para replicarEn presencia de cloranfenicol aumenta el Nº de copias
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Mutación en ARNII TS >Nº de copias al la temp.
Otros vectores tienen mutación en rop para aumentar el nº de copias
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REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO POR ITERONES
“esposar”
RepA: ATPasahelicasa
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REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DELPLÁSMIDO R1 POR ARN ANTISENTIDO
Control de laexpresión de RepA
CopA and CopB
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VECTORES RUNAWAY
Construídos a partir del plásmido R1
Un pequeño aumento en la formación del RNAm de RepA reduce drásticamente la síntesis de CopA debido a transcripción convergente, lo que lleva a la pérdida del control de nº de copias replicación “galopante”= runaway. Hasta 1000 copias de plásmido por genoma.
Amplificación runaway ocurre en presencia de síntesis proteica
Nature Biotechnology 1992, vol. 10, Nordstrom et al.
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PλpRλcI857
cI ( - )
T > 34ºC
Control de la transcripción de repA por el promotor del bacteriófago λpR
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REPLICACIÓN CÍRCULO-RODANTE
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INCOMPATIBILIDAD
Los plásmidos que llevan el mismo replicón pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad, por lo tanto no pueden coexistir en la misma bacteria
GRUPO DE ELEMENTO DE CONTROL COMENTARIOINCOMPATIBILIDAD NEGATIVO
colE1, pMB1 RNAI controla el procesamiento de pre-RNAII en primer
IncFII (RI), pT181 RNA controla la síntesis de RepA
PI, F, R6K, pSC101, p15A iterones secuestra RepA
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VECTORES CON FUNCIONES ESPECIALIZADAS
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VECTORES PLASMÍDICOS CON ORI DE BACTERIÓFAGO SIMPLE CADENA: FAGÉMIDOS
Además del ori bacteriano poseen un origen de replicación de bacteriófagos filamentosos simple cadena como M13 o f1.
El ADN sc se produce al infectar la bacteria con un bacteriófago helper que lleva los genes para generar ADN sc y empacar las partículas.
secuenciarViriones sondas
mutagénesis
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VECTORES SHUTTLE
Vector, generalmente plásmido, que puede propagarse en 2 especies diferentes
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SEGREGACIÓN PLASMÍDICA
Plásmido con alto nº de copias: difusión pasivaPlásmidos con bajo nº de copias: sistema partición activo
Sistema de partición activoPlásmido P1: genes parA, parB, secuencia en cis parSComplejo nucleoproteico: ParA, ParB, IHF (integrationhost factor) y parS “guia y posiciona” al plásmido.
Recombinación sitio específicaRecombinasas sitio-específicas para resolver dímeros
Sistema toxina-anti toxinaElimina a la bacteria libre de plásmido
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Recombinasassitio-específicastoxina antitoxina
Toxina: proteínaAntitoxina: proteína o ARN (más inestable que toxina) Codificados por plásmido
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TRANSFERENCIA PLASMÍDICA
Transformación
Transducción
Conjugación
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CONJUGACIÓN
Transferencia de material genético entre bacterias a través del contacto directo entre células. Requiere muchos genes del mismo plásmido, en gral. plásmidos chicos no conjugan, salvo que estén con un plásmido “helper”
F+ F-
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R. a ATB Información transferida Tolerancia a xenobióticospor la bacteria donante , ej. Uso de nuevos metabolitos
Plásmido F: episoma de aprox. 100 kb.Lleva oriV (replicación) y oriT (transferencia).Sólo 1 copia/célula.Locus tra y trb , aprox, 40 genes (para conjugación, gen pilin, etc.)
Plásmido libre :cepas F+
Plásmido integrado en cromosoma: cepas Hfr (high frequencyrecombination), cepas que transfieren ADN cromosómico.Sin plásmido: cepas F-
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TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
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Electroporación
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Transformación química
Tratamiento de las bacterias con cationes divalentes (CaCl2) y shock térmico
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EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
Medida cuantitativa de cuantas células incorporaron el plásmido
Se expresa en Nº de transformantes por μg ADN plasmídico
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Competencia (cfu/µg) Aplicación
>1×109 Construcción de biblioteca genómica
1×106 Clonado/ subclonado
1×103 Transformacióncon plásmido
circular
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IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS BACTERIANASQUE CONTIENEN PLÁSMIDO RECOMBINANTE
1) Análisis del ADN plasmídico: restricción y PCR
2) Complementación α
3) Inserción con inactivación
4) Hibridación
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RESTRICCIÓN Y/O PCR
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Complementación α
X-GAL: 5-bromo-4-cloro-3-indolil- beta-D-galactopiranosido
IPTG: Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido
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Complementación α
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Inactivación por inserción
Resistencia aKanamicina
Resistencia aampicilina
Origen de replicación
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HIBRIDACIÓN
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In situ colony
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BACTERIÓFAGOS
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Fago lambda
* Genoma de unos 45.000 bp* Fragmento central de unas 15 kbp no es esencial para la replicación y puede ser eliminado
* Ligación del inserto (unas 5-25 Kbp)
* Empaquetamiento del DNA “in vitro” en partículas de fago.
* Transfección de células y propagación.
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lítico (clonación)Bacteriófago λ 2 ciclos de vida
lisogénico: MI, Nut.
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El ciclo lisogénico-lítico del bacteriofago
Unión del fago, penetración y liberación del DNA
Integración y replicación conel genoma bacteriano
Circularización delgenoma del fago(secuencias cos)
Inducción delciclo lítico
Lisis y liberación de partículas víricas
E. coli
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INFECCIÓN VIRAL
1- Adsorción: producto del genJ del fago reconoce al receptor de maltosa LamB
2- Inyección del ADN: requiere el producto del gen pstM
3- Circularización del ADN: sitios cos + ligasa
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CICLO LÍTICO
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círculo rodante
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El fago lambda como vector de clonación
gt10 gt11 (bibliotecas de expresión)
EMBL4
Vectores de inserción:
Vectores de sustitución
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El fago lambda como vector de clonación
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Extracto 2: cabezas vacías
Extracto 1: partes del fago sin cabeza
+
+
ADN
FAGO
Encapsidación
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Screening de genoteca en fago λ
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CICLO LISOGÉNICO
Sólo se expresa la proteína del gen cI: represor de los genes del ciclo lítico
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INTEGRASAHOST INTEG. F.
TECNOLOGÍA GATEWAY
INTEGRASAHOST INTEG. F.EXCISIONASA Xis
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TECNOLOGÍA GATEWAY
Emplea el sistema de recombinación del fago λpara “mover” fragmentos entre vectores que contienen los sitios para la maquinaria recombinante de λ
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Reacción BP:producto de PCR con sitios flanqueantes + vector donante + clonasa BP => entry vector (este paso puede ser reemplazado por otro método de clonado)
Reacción LR: entryVector + destinationVector + LR clonasa => expression vector
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VENTAJAS DESVENTAJAS
Eficiente ¿Precio?Diseño simple de primers Secuencias attNo ligasa ¿molestan? No enzimas de restricciónNo purificación por gelOrientación No fosfatasa
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Cósmidos
* Pequeñas moléculas de ADN circular (5-7 Kbp)* Secuencia ori* Marcadores de selección* Secuencia COS: permite el empaquetamiento como bacteriófago para la infección en E. coli pero se mantiene en la célula como un plásmido.*Permite clonar fragmentos de hasta 45 Kb.*Apropiados como vectores en fases iniciales de proyectos de secuenciación
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BACs: CROMOSOMAS BACTERIANOS ARTIFICIALES
Basado en el plásmido F (fertilidad).
Contiene oriS, repE(helicasa) y genes de partición: parA, parB y parC
Inserto: 150-350 kb. Puede llegar a 700 kb.
1-2 copias por célula
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VECTORES DE CLONADO USADOS COMUNMENTE
Plásmido Características Fuente comercial
pUC18, pUC19 Pequeño (2,7 kb) NEBAlto nº de copiasMCS, R a ampiSelección blanco/azul
pBluescript idem pUC Stratageneori SSpromotores T7 y SP6 flanq. MCS
pACYC Bajo nº de copias (15) NEBori p15A
Supercos Cósmido Stratagene2 sitios cosInserto 30-42 kbR a ampipromotores T3 y T7 flanq. MCS
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VECTORES DE CLONADO USADOS COMUNMENTE
Plásmido Características Fuente comercial
EMBL3 vector λ de reemplazo PromegaMCS: SalI, BamHI y EcoRI
λ ZAP vector λ StratageneExcisión in vivo en pBluescriptInserto hasta 10 kbSelección azul/blanco
pBeloBAC11 vector BAC NEB Inserto hasta 1 Mb Promotores T7 y SP6 flanq. MCS Sitios cos Sitio LoxP
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Escherichia coli
Aislada por el pediatra y bacteriólogo Theodor Escherich en 1885
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NOMENCLATURA DEL GENOTIPO
Propuesta por Demerec et al., 1966
GENES: 3 letras en minúscula itálica. Sugiere en gral la función:
trp síntesis de triptofano.
Si la misma función es afectada por varios genes, se agregan letras itálicas en mayúscula:
recA, recB, recC y recD recombinación
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Por convención, en el genotipo de E. coli sólo se mencionan los genes defectuosos
A veces se usan los superíndices + o – para aclarar o para enfatizar el locus WT
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Fenotipos: 3 letras, empieza en mayúscula, seguidas por superíndice + o –, a veces r (resistente) o s (sensible).
En ciertas ocasiones se incluye el fenotipo en el genotipo
rpsL (Strr): mutación en el gen de la ribosomalprotein small subunit 12 que da resistencia a streptomycin
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MUTACIONES ESPECÍFICAS
Alelo: número del alelo en itálica: hsdR17
Si no se conoce el locus exacto se reemplaza la letra por un guión : arg-3
Mutación:
ámbar: am depués del gen
Sensible a la temperatura (gen inactivo a alta temperatura): ts
Constitutiva: superíndice q. lacIq
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Deleción: Δ. Δ(lac-pro)
Inserción: “::” trpC22::Tn10.
La posición de la inserción se puede dar con 3 letras, la 1ª siempre es z, la 2ª 10 min, la 3ª 1 min (letras a - i): zhg::Tn10 inserción de Tn10 a 87 min.
Fusión: Φ seguido por los genes fusionados en paréntesis. “ ´ ” gen fusionado incompleto (antes del gen: deleción en 5´, después del gen: deleción en 3´) Superíndice +: la fusión involucra a un operón.
Φ (ompC´-lacZ+): fusión entre ompC (delecionado en 3´) y el operón lac.
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F+ cepa de coli que lleva el episoma F o factor de fertilidad (plásmido de 1 copia).F´ : plásmido F con genes adicionales. Al final del genotipo con los genes del plásmido entre corchetes.
Plásmidos que se transmiten a células F-El factor F se necesita para infección con vectores basados en fagos filamentosos.
Si no está indicado se asume que la cepa es F-.
Cepas Hfr (high frequency chromosome donation): el factor F está integrado en el cromosoma bacteriano y puede causar transferencia de cromosoma.
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Mutaciones sin sentido: codones de terminación
AMBAR: UAG
OCRE: UAA
OPALO: UGA
Vectores con mutaciones sin sentido en genes esenciales para prevenir la diseminación en bacterias.
Esos vectores sólo pueden propagarse en cepas de E. coli que contengan el supresor adecuado.
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Supresor ambar
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Hay varios sistemas de restricción y modificación que deben ser eliminados de las cepas de E.coli K12 para que puedan ser usadas para clonar
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SISTEMAS DE RESTRICCIÓN Y MODIFICACIÓN
Para reconocer y destruir ADN “extranjero”
Muchas cepas de E. coli de laboratorio son deficientes en 1 o más de los sistemas de restricción-modificación .
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METILACIÓN Dam y Dcm
E. coli K-12 metilasas: Dam, Dcm y EcoK
Dam: DNA adenina metilasa, gen dam, metila GATC
Dcm: DNA citosina metilasa, gen dcm, metila CC(A/T)GG
La mayoría de las cepas que se usan para clonar son Dam+ Dcm+. Las cepas recA- son siempre dam+
La metilación Dam o Dcm puede afectar la eficiencia de transformación plasmídica ….ADN hemimetilado no replica
Pag. 206
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Cepas Dam- Dcm-son mutagénicas
(sistema de reparación mismatch)
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SISTEMA EcoK
EcoK metilasa: AACN6GTGC y GCACN6GTT
EcoK endonucleasa: AACN6GTGC y GCACN6GTT NO metilado
Locus hsdRMS: hsdR…endonucleasahsdM…metilasahsdS…subunidad de reconocimiento del sitio
En gral. se usan cepas hsdR- (rk-mk
+) o hsdS- (rk-mk
-)
Pag. 206
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RESTRICCIÓN McrA, McrBC y Mrr
McrA y McrBC: corta en metil C
Mrr: corta en metil A
Cuando se clona ADN muy metilado mejor usar cepas mutantes.
Deleción simple: Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) “immigration control locus”
Pag. 206
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RECOMBINACIÓN
Problema cuando se clona ADN con secuencias repetidas.
Sensibilidad a agentes que dañan al ADNCepas Rec- Problemas en reparar roturas en las 2 hebras
Taza de crecimiento
Dependiendo de la aplicación es preferible usar cepas Rec+
Cepas recA- tienen bloqueada la recombinación casi completamente.
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Allows cloning of genomic DNA or methylated cDNA
Mutations in these genes prevents methylated DNA from other organisms frombeing recognized as foreign
mcrA, mcrBC,ormrr
Propagation of DNA for cleavagewith methylation-sensitiverestriction enzymes e.g. Ava II, Bcl I
Mutations in dam/damabolish adenine andcytosine methylation at specific recognitionsequences.
dam/dcm
Efficient transformation of DNA generated from PCR reactions
Mutations in hsdR preventsrestriction of unmethylatedEcoKI sites
hsdR
Improved plasmid yield/quality
Knock-out mutation in non-specific endonuclease(Endonuclease I). Eliminates non-specificendonuclease activity.
endA
BenefitDescriptionGenotype
MANTENIMIENTO DE LA INTEGRIDAD DEL PLÁSMIDO TRANSFORMADO
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Increasedplasmid DNA stability
Involved in the UV and SOS DNA repair systemsrespectively. The inactivation of these genes increases the stability of plasmids carrying invertedrepeats
uvcR/umuC
Increasedplasmid DNA stability
Also involved in DNA recombination. Inactivationincreases plasmid DNA stability
recJ/sbcC
Increasedplasmid DNA stability
recBCD encodes exonuclease V. Mutation in RecBor RecC reduces DNA recombination by a factor of100.
recBCD
Increasedplasmid DNA stability
Mutation in recA reduces DNA recombinationrecA
MANTENIMIENTO DE LA INTEGRIDAD DEL PLÁSMIDO TRANSFORMADO
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A functional lacI is required forblue/white screening
The lac repressor. Inhibitsexpression from the Lacpromoter in the absence oflactose/IPTG
lacI
Used for blue/white screening ofrecombinant plasmids carryingthe lacZ-α fragment
Deletion of the N-terminal alpha-fragment from theLacZ gene, making β-galactosidase functiondependent on expresion forthe lacZ-α fragment fromanother source (e.g. a plasmid)
lacZ-delta-M15
BenefitDescriptionGenotype
IDENTIFICACIÓN DE CLONES POSITIVOS
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High transformationefficiency.
Stands for “high transformation efficiency”.hte
High transformationefficiency
Stands for “high electroporation efficiency”. Increases survival rate of cells during electroporation, leading to higher transformation efficiency.
hee
Increases thetransformation efficiencyfor large plasmids
Deletion of a regulatory gene, allowing constitutive expression ofdeoxyribose synthesis gene
deoR
BenefitDescriptionGenotype
AUMENTO DE LA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
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Mach1Fast cloning (due to quick cell growth)
OrigamiImproved disulphide bond formation
BL21 codon plus, RosettaExpression from T7 promoter with codon biascorrection
BL21 (DE3) pLysSExpression from T7 promoter, tight regulation
BL21 (DE3)Expression from T7 promoter
Sure, Stbl4Cloning of unstable plasmids
JM110, INV110Production of unmethylated DNA
XL1-Blue MRCloning of unmethylated DNA
XL10-Gold, MegaXDH10b
Very high efficiency cloning e.g. for libraryconstruction
XLI-Blue, DH5-alpha, top10Routine Cloning/Sub-cloning, Blue/white screening
StrainApplication
ALGUNAS CEPAS MUY USADAS
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Zero Blunt TOPO cloning kit
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Eliminate high background
Lethal ccdB (control of cell death) gene enables high-efficiency cloning, yielding nearly100% recombinants. The ccdB protein poisons bacterial DNA gyrase, causing degradationof the host chromosome and cell death.1,2 When an insert is ligated into the vector, theccdB gene is disrupted, enabling only recombinant colonies to grow