CLONACIN EN HONGOSINTEGRANTES:Cristina BustosMaura Fiallos Johanna FiallosTatiana OrtizJenny Sevilla

INTRODUCCINEn estudio y anlisis de ADN eucaritico ha sido facilitado por su clonacin en procariontes mediante vectores.Secuencias que se pueden adquirir en grandes cantidades y cambiada in vivo o in vitroSecuencias reorganizadas pueden ser tomadas de fuera de las bacterias y colocadas dentro de organismos eucariontes induciendo modificaciones en la expresin de genes

El control gentico se da en ambientes eucariticoLos genes son reintroducidos en su origen.Las clulas de levaduras son ms fciles de modificar y de crecer.Su bioqumica celular es similar que en eucariontes ms complejos

Clulas se seleccionan en la superficie del medio slido.Facilidad de manipulacinLas dos tcnicas son utilizadas en un amplio rango de levaduras y hongos filamentosos.

Se puede introducir ADN en levaduras y hongos filamentososSe encontr que los plsmidos de enterobacterias como R751(INcPb) y F (IncF) puede facilitar la trasferencia de plsmidos de E. coli a S. cereviciae y Schizosaccharomyces pombe

Destino del ADN introducido en hongos

Se confirman resultados por endonucleasas de restriccinLeu 2- es digestadaAumento de la longitud del fragmento

Recombinacin ilegtima (plsmido Ti de Agrobaterium)Recombinacin ilegtima obligada con BamH1 generando fragmentos de recombinacin.Mtodo expandido a otros hongos

Vectores plsmido para uso en hongos

Plsmido episomal de lavaduraPrimer plsmido YEp construido por recombinacin de una clonacin mediante el vector de E. coli con el plsmido de 2m de levadura de origen natural. Este plsmido tiene un tamao de 6.3 kb, un nmero de copias de 50 a 100 por clula haploide y no tiene ninguna funcin conocida.

Replicacin del plsmido de levaduraSe aislaron fragmentos cromosmicos de las secuencias con ADN que permiten a los vectores de E. coli replicarse en clulas de levadura. Estos tipos de secuencias se denominan ARS (secuencia de replicacin autnoma). Una ARS es muy diferente de un centrmeroCENTRMERO: acta como un origen de replicacinARS: involucrada en la segregacin cromosmica

Centrmero de los plsmidos de levaduraClarke y Carbon (1980) aislaron un nmero de hbridos de plsmidos que contienen segmentos de ADN.La mayora de los recombinantes eran en levadura. Sin embargo, uno de ellos se mantuvo estable a travs de la mitosis y la meiosis. El segmento de estabilidad fue confinado a una regin 1,6 kb

Cromosomas artificiales de levaduraLos extremos de los cromosomas de la levadura, como las de todos los dems cromosomas eucariotas lineales, tienen estructuras nicas que son llamados telmeros. Para mantener la integridad de los extremos de molculas de ADN, la estructura de los telmeros se ha desarrollado como un dispositivo que a menudo no se puede terminar por los mecanismos convencionales de la replicacin del ADN.

Cromosomas artificiales de levaduraSzostek y Blackburn (1982) desarrollaron el primer vector que podra ser mantenido como una molcula lineal, imitando de ese modo un cromosoma, mediante la clonacin de los telmeros de levadura en un YRp. Tales vectores son conocidos como cromosomas artificiales de levadura (YAC).Su estabilidad mejora cuando el tamao de la insercin se incrementa. Por lo tanto, no hay ninguna limitacin prctica para el tamao de un YAC y son herramientas esenciales en cualquier proyecto de secuenciacin del genoma.

Retrovirus como vectoresTy secuencia de 5.9 kb en el genoma de S. cerevisiae.Que consiste en una regin central que tiene dos marcos largos abiertos de lectura (ORFs) que tiene dos terminales idnticos constituido por repeticiones llamados delta.Cada elemento delta tener un promotor con secuencias que son reconocidas por la enzima de transposicin.En la transcripcin Ty se convierte en una molcula de ADN por una transcriptasa reserva Se aplico con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH)

Eleccin del vector para clonacinHay tres razones para la clonacin de los genes en la levadura. La posibilidad de utilizar levadura como un husped de clonacin para la sobreproduccin de protenas de valor comercial. La levadura da un nmero de ventajas, tales como la capacidad de glicosilar las protenas durante la secrecin y la ausencia de toxinas.La levadura tambin se utiliza en la produccin de alimentos y bebidas.

Eleccin del vector para clonacin2. La clonacin de genes en la levadura es la capacidad para clonar grandes fragmentos de ADN. Aunque no hay lmite terico para el tamao del ADN que puede ser clonado en un plsmido bacteriano, los plsmidos grandes recombinantes exhiben inestabilidad estructural y segregadora. 3. Los genes clonados pueden ser analizados fcilmente

Construccin de plsmido por recombinacin homloga en levaduraEl gen clonado se mueve a un plsmido diferente.El anlisis gentico puede requerir muchos alelos diferentes de un gen clonado para estudios funcionales posteriores.Los plsmidos linealizados se reparan de manera eficiente durante la transformacin de levadura mediante recombinacin con un fragmento de restriccin de ADN homloga.

Se remueve HIS3 de pBR328 a YEp420.Fragmento de HIS3 se mezcla con YEp420 que ha sido linealizado con EcoRI y la mezcla se transform en levadura.Dos eventos cruces que se producen entre regiones homlogas que flanquean el sitio EcoRI de Yep420 resultar en la generacin de un YEp recombinante que contiene tanto los genes HIS3 y URA3.

Hubo muchos intentos fallidos para expresar genes heterlogos de eucariotas bacterianas o ms altos cuando la manipulacin gentica de los hongos se hizo posible por primera vez. Estructura de hongos tiene una estructura especial; cuatro elementos estructurales pueden ser reconocidos en el promotor de la levadura.Expresin de genes clonados.

Expresin de genes clonadosVarias secuencias de consenso se encuentran en el sitio de iniciacin de la transcripcin. Dos de estas secuencias, TC (G / A) y PuPuPyPuPu, representan ms de la mitad de los sitios de inicio de levadura conocidas. La TATA box, esta es una regin rica en AT con la secuencia cannica TATAT / AAT / A, que se encuentra 60-120 nucletidos antes del sitio de iniciacin. Tercer y cuarto elemento estructura son secuencias de activacin y secuencias represoras.

Expresin de genes clonados.La unin de protenas de control positivas a UAS aumenta la tasa de transcripcin y la supresin de la UAS suprime la transcripcin. La unin de protenas de control negativas a URS reduce la tasa de transcripcin de los genes que necesitan ser regulados negativamente.

Expresin de genes clonadosEl nivel de la transcripcin puede ser afectada por secuencias localizadas en el gen en s y que se hace referencia a secuencias de activacin DAS.Cuando se utiliza el promotor de fosfoglicerato quinasa, varias protenas heterlogas se acumulan a 1% - 2% de la protena celular total, mientras que en s fosfoglicerato quinasa acumula a ms de 50 por ciento. Estas cantidades decepcionantes de protena heterloga reflejan los niveles bajos de ARNm; La adicin de DAS en las secuencias de PGK restaur la tasa de ARNm de transcripcin.

Sobreexpresin de protenas en hongos.El primero sobre los sistemas de expresin desarrollado fueron para S. cerevisiae y utilizan los promotores de genes que codifican enzimas glucolticas abundantes, alcohol deshidrogenasa ADHI, PGK o gliceraldehdo 3 fosfato deshidrogenasa GAP. Ahora hay una gran variedad de promotores nativos y de ingeniera disponibles, que difieren en la fuerza, la regulacin y la relacin de induccin. El promotor ideal es aquel que est estrechamente regulada de modo que la fase de crecimiento se puede aislar de la fase de induccin. Esto disminuye la seleccin de clulas que no expresan y puede permitir la expresin de protenas normalmente txicos para la clula.

Sobreexpresin de protenas en hongos.El promotor ideal tambin tendr una alta relacin de induccin. Un promotor que tiene estas caractersticas y que ahora es el ms utilizado es a partir del gen GAL1. En la levadura, la regulacin galactosa es ahora muy bien estudiado y se ha convertido en un sistema modelo para la regulacin de la transcripcin eucaritica.

Sobreexpresin de protenas en hongos

Sobreexpresin de protenas en hongos.La transcripcin de GAL1 es limitado por la proteina GAL4.Sin embargo, la expresin GAL4 puede estar fusionado al promotor GAL10, expresin GAL4 est ahora regulada por galactosa.

VECTORES ESPECIALISTAS

VECTORES ESPECIALISTAS

VECTORES ESPECIALISTAS

VECTORES ESPECIALISTAS

DISPLIEGUE LEVADURAS EN LA SUPERFICIE

DISPLIEGUE LEVADURAS EN LA SUPERFICIE

DETECCIN DE INTERACCIONES PROTENA-PROTENAChien et al (1991) han hecho uso de las propiedades de la protena GAL 4 en un mtodo para la deteccin de interacciones protena-protenaLa protena GAL 4 posee dominios separados para la unin a ADN -UAS y para la activacin transcripcionalLos plsmidos fueron construidos con la codificacin de dos protenas hbridas

DETECCIN DE INTERACCIONES PROTENA-PROTENA

IDENTIFICANDO GENES QUE CODIFICAN ACTIVIDADES PARTICULARES CELULARES

Es conocido que las secuencias de genes codifican cada actividad bioqumica de S.cervisiae.

Martzen at al. (1999) han desarrollado un rpido y sensible mtodo para conectar actividades bioqumicas especficas con genes particulares

Punto inicial : un vector de levadura que contiene el gen glutatin S-tranferasa (GST) bajo el control del promotor CUPI.

Un largo nmero de diferentes fragmentos de ADN que lleva la levadura ORFs (seis marcos abiertos de lectura) fueron clonados en este vector para generar la fusin GST-ORF.

Los diferentes transformantes fueron dispersadas en 64 -96 placas de microtitulacin (64x 96 =6144) para correlacionar genes con actividad.

Las fusines GST-ORF son fcilmente purificados por cromatografa de afinidad usando glutatin inmovilizado.

Una vez que se identific una placa con la actividad deseada, se hicieron grupos de clones de cada sistema de 8 filas y pozos de 12 columnas y estos 20 posillos se volvieron a ensayar. (punto de interseccin identificara el clon deseado entre la columna y fila identificada)

La secuenciacin de la ORF entonces permite la identificacin del gen correspondiente a la actividad

Determinacin de funciones asociadas con un gen particularEsto consiste en la determinacin del perfil de expresin del gen, la ubicacin subcelular de la protena, y el fenotipo de una cepa nula que carezca de la protena.

Ross Macdonal (1997) desarrollo un sistema basado en la transposicin , generando de forma simultanea todos los constructos (unin ADN - plasmido) y es adecuado para la muta gnesis de cualquier gen de S.cerviciae.

Cada uno lleva un gen reportero (-galactosidasa o la protena verde fluorescente) que carece de un promotor. Que se detectan por la actividad de la enzima o por la fluorescencia.

Genes de levadura se clonan en una cepa de E.coli que sobreexpresa la Tn3 transposasa , esto es llevado sobre un derivado del factor sex F, que es introducido por apareamiento producindose la transposicin .

El ADN que contiene el transposn es escindido del vector y se transforma en parte de E.coli por la actividad del marcador URA3.

No se reporta actividad si se ve que se produce la recombinacin homloga en el lugar URA3, pero la funcin del gen se pierde.

Este reporte de actividad puede ser util para estudiar la expresin del gen clonado bajo diferentes condiciones de crecimiento.

Si los transformantes llevan un gen de fago P1, bajo el control del promotor GALL, la escisin de la mayora de las secuencias de transposones puede ser inducida por el crecimiento de la cepa husped en presencia de galactosa.

Si se emplea anticuerpos contra la hemaglutinina se restaura la actividad del gen y se puede purificar.

El anlisis mutacional a gran escala de genoma de la levadura es eliminar individualmente cada gen usando una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) metodologa basada.

Para cada gen, un casete supresor es construido que contiene un gen de resistenciaUn grupo de cepas mutantes de levadura por lo tanto se puede analizar en un solo experimento mediante la amplificacin de los cdigos de barras.

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