Universidad Nacional ExperimentalFrancisco de Miranda

Área: Ciencias de la SaludUnidad Curricular: Microbiología II

Profesor: Licdo. Jesus A. Nuñez P. Biólogo. MSc.

Santa Ana de Coro, mayo 2014

E-mail: janp.bio@gmail.com

PRACTICA NÚMERO 1: CULTIVOS FÚNGICOS

carbohidratoscarbohidratos

Proteínas Proteínas Lípidos Lípidos

Aminoácidos Aminoácidos

Su finalidad Su finalidad

Medios de Medios de aislamientoaislamiento

Medios Medios selectivosselectivos

selectivos selectivos diferencialesdiferenciales

Utilizados para elUtilizados para elaislamiento de levaislamiento de lev

agotamientoagotamiento

Permiten la recuperación Permiten la recuperación de un hongo en especificode un hongo en especifico

con inhibición de otrocon inhibición de otro

Adición de ciloheximidaAdición de ciloheximidainhibe al inhibe al Aspergillus Aspergillus (hongo contaminante)(hongo contaminante)

Son aquellos conSon aquellos conadición de un indicadoradición de un indicador

Los medios utilizados en Micología contiene nutrientes suficientes para Los medios utilizados en Micología contiene nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de hongos .asegurar el desarrollo de hongos .

pH ligeramente acido facilita crecimiento de hongos e inhibe a otros M.O.pH ligeramente acido facilita crecimiento de hongos e inhibe a otros M.O.

ENTRE LOS MEDIOS MAS USADOS EN ENTRE LOS MEDIOS MAS USADOS EN MICOLOGIA TENEMOS:MICOLOGIA TENEMOS:

ENTRE LOS MEDIOS MAS USADOS EN ENTRE LOS MEDIOS MAS USADOS EN MICOLOGIA TENEMOS:MICOLOGIA TENEMOS:

MEDIO MEDIO SABOURAUD SABOURAUD

DEXTROSADEXTROSA

MEDIO MEDIO SABOURAUD SABOURAUD

DEXTROSADEXTROSA

Contiene 2% de glucosaContiene 2% de glucosa

Ligeramente acidoLigeramente acido

Mantiene una amplia variedad de hongosMantiene una amplia variedad de hongos

No es un medio ideal para estudiar la No es un medio ideal para estudiar la esporulación esporulación

Indistintamente se utiliza en placas o tubos y se Indistintamente se utiliza en placas o tubos y se les puede incorporar antibióticos (gentamicina y les puede incorporar antibióticos (gentamicina y

cloranfenicol)cloranfenicol)

Contiene 2% de glucosaContiene 2% de glucosa

Ligeramente acidoLigeramente acido

Mantiene una amplia variedad de hongosMantiene una amplia variedad de hongos

No es un medio ideal para estudiar la No es un medio ideal para estudiar la esporulación esporulación

Indistintamente se utiliza en placas o tubos y se Indistintamente se utiliza en placas o tubos y se les puede incorporar antibióticos (gentamicina y les puede incorporar antibióticos (gentamicina y

cloranfenicol)cloranfenicol)

AGAR AGAR LACTRIMEL DE LACTRIMEL DE

BORELLI BORELLI

Se emplea para la producción de Se emplea para la producción de pigmentos y la esporulación de la pigmentos y la esporulación de la

mayoría de los dermatofitos mayoría de los dermatofitos

Contiene: harina de trigo, leche Contiene: harina de trigo, leche descremada en polvo, miel y ATB. descremada en polvo, miel y ATB.

Pueden cultivarse en tubos o Pueden cultivarse en tubos o placas. Placas mayor superficie pero placas. Placas mayor superficie pero

mayor riesgo de contaminación.mayor riesgo de contaminación.

CONSIDERACIONES CONSIDERACIONES

Si la muestra procede de zonas presuntamente

contaminadas

RECOMENDABLERECOMENDABLE colocar en mediosbásicos sustancias inhibitorias

Manipular los tubos y placas con

BIOSEGURIDAD?

Crecimiento de hongos Crecimiento de hongos patógenos patógenos

Condiciones de incubación

Hongos miceliales (Temp. Amb) y Levaduras (2-4 dias)

Características Macroscópicas

Características Microscópicas

TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN

COLOR

TAMAÑO DE LA COLONIA

ASPECTO

HONGO FILAMENTOSO / LEVADURIFORME

Aterciopelada, algodonosa, pulverulenta /cremosa

HIFASSEPTADASASEPTADASPRODUCCIÓNTAMAÑODISPOSICIÓN DE LAS CONIDIAS

HONGO FILAMENTOSO / LEVADURIFORME

OBSERVACIÓN DE BLASTOCONIDIAS, SEUDOHIFAS Y CLAMIDOSPORAS

Preparación en fresco

Que se necesita?Que se necesita?

Un cultivo con colonia aislada

Asa de siembra Azul de Lactofenol Porta y cubreobjetos

Esterilizo el asa de siembra frente al mechero

Selecciono la colonia (superficie)

Coloco en portaobjetos

Coloco cubreobjetos

Observo 40X.

BLASTOCONIDIAS, SEUDOHIFAS Y CLAMIDOSPORAS

PRUEBAS DIAGNÓSTICAS DE LABORATORIO

Citología

Cultivo

Examen microscópico

Pruebas cutáneas

MECANISMOS DE DEFENSA FRENTE A

HONGOS PATOGENOS

INMUNIDAD

Protección contra enfermedad, específicamente infecciosa.

Capacidad del organismo para combatir de forma específica la

enfermedad infecciosa.

Sustancias extrañas (Ag)M. O.ProteínasPolisacáridos

SISTEMA INMUNITARIOFormado por células y

moléculas responsables de la inmunidad.

RESPUESTA INMUNE

Consecuencia fisiológica o patológica.

Barrera cutáneaMocoCilios respiratoriosAcido gástrico Antagonismo bacterianoLágrimas Reacción inflamatoriaSistema de complementoFagocitos.

TIPOS DE RESPUESTA INMUNITARIA

Acción de los linfocitos T (CD4+) Citoquinas:

(IL-1…..10),TNF, IFN

Acción de los linfocitos B Anticuerpos

(Inmunoglobulinas)

INMUNIDAD NATURAL(Inespecífica)

INMUNIDAD ADQUIRIDA(Especifica)

MECANISMOS DE RESISTENCIA NATURAL A HONGOS PATÓGENOS

Barreras físicas, mecánicas y químicas

Transferrina/Metaloproteina

DEFENSA QUÍMICA

Histoplasma capsulatum Candida albicans Cryptococcus neoformans

Mecanismos de resistencia celular

EVASIÓN DE BARRERAS MECÁNICAS, FÍSICAS Y QUÍMICAS

Defensas celulares comienzan a actuar

Leucocitos polimorfonucleares (PMNL) Macrófagos

Monocitos

FAGOCÍTICAS PROFESIONALES

CÉLULAS EFECTORAS NO FAGOCÍTICAS

Asesinas naturales (NK)

TNF, IL2

RESPUESTA INMUNITARIA

CD4+

IL-12: IL-4

1 . Capacidad de Adherencia a los tejidos (adhesinas)

2 . Penetración y multiplicación en los tejidos: Enzimas Proteolíticas: Proteasas, Lipasas, Fosfolipasas. Tropismo Celular. Capacidad de Multiplicarse a 37 ºC (dimorfismo)

FACTORES DEPENDIENTES DEL HONGO

Agente Enfermedad Factor de virulencia EfectoAspergillus sp. Aspergilosis hidrofobinas Inhibición de la fagocitosis

Aspergillus sp. Aspergilosis pulmonar GliotoxinaAlteran el movimiento ciliar y lesionan el epitelio de vías respiratorias altas.

Dermatofitos Tiñas Queratinasas Destrucción del estrato córneoDermatofitos Ides Toxinas Hipersensibilidad

Cryptococcus Criptococosis CápsulaInhibición de respuesta inmune (impide migración de células de la inmunidad y propiedades antifagocíticas)

Cryptococcus Criptococosis Producción de melanina Anti-oxidante, resistencia a anfotericina B

Sporothrix spp.Esporotricosis linfangítica

Producción de melanina Inhibe la fagocitosis por macrófagos.

Mucorales Mucormicosis Ceto-reductasaDegradan los cuerpos cetónicos presentes en sangre, favoreciendo el crecimiento y diseminación del hongo.

Malassezia spp.Pitiriasis versicolor hipocrómica

Ácidos dicarboxílicos

Inhibición de la tirosinasa y de la producción de melanina conllevando una menor protección contra los rayos UV y el establecimiento de agentes microbianos dañinos.

Malassezia spp. Dermatitis seborréica FosfolipasasDestrucción de los ácidos grasos esenciales en la piel causando sequedad

Coccidioides spp. Coccidioidiomicosis Elastasas Destruyen las fibras elásticas de los tejidos.

Algunos ejemplos de factores de virulencia estudiados en hongos

INMUNOMODULACIÓN DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA DEL HUÉSPED

Cápsula

Biosíntesis de MelaninaProducción de

Toxinas

Matriz extracelular cementante

FACTORES DEPENDIENTES DEL HUESPED

OTRAS:

Carencias nutricionales

Quemaduras

Traumatismos extensos

Irradiaciones

Alcoholismo

Toxicomanía

Uso de prótesis

Catéteres

Tratamientos con: antibióticos,

corticoesteroides, radioterapia,

inmunosupresores

Edades extremas

ENFERMEDADES: oncohematológicas, hepáticas, renales, diabetes,

infecciones virales

Genéticos Hormonales

Alteraciones Metabólicas

Transplantes y deficiencias

inmunes: HIV

FACTORES DE SUSCEPTIBILIDAD DEL HUESPED

Onicomicosis.  Micetoma.

Queilitis

Coccidioidomicosis.

INMUNODIAGNOSTICO DE LAS MICOSIS

Hipersensi. Tipo I

Hipersensi. Tipo II

Hipersensi. TipoIII

Hipersensi. Tipo I

Hipersensi. Tipo II

Hipersensi. TipoIII

RETARDADA

Hipersensi. Tipo IV

RETARDADA

Hipersensi. Tipo IV

INMUNODIAGNOSTICO DE LAS MICOSIS

IDRIDR

INTRADERMOREACCIÓN

Reacción de hipersensibilidad retardada

CandidinaEsporotriquinaHistoplasminaParacoccidioidinaCoccidioidina0.1 cc de antígenos fúngicosVía intradermica48 h

INMUNIDAD CELULAR

Estudios EpidemiológicosOrientación Diagnóstica Seguimiento del curso de la enfermedad

INMUNIDAD CELULAR

1 1

2 2 2

3 3 3

4 4 4

5 5 5

666

1

Diagrama para Inmunodifusión Doble con sueros de referencia . 1,4: Suero control positivo para el antígeno a evaluar. 2,3,5 y 6: Suero de paciente. O antígeno a evaluar.

INMUNIDAD HUMORAL

Suero P

Ag Pb

Anti Pb

Prueba de inmunodifusión doblePrueba de inmunodifusión doble

INMUNIDAD HUMORAL

Suero Problema

Suero Control

Interpretación de las Pruebas de Inmunodiagnóstico Micológico

ESTUDIO

MICOLÓGICO

IDR IDD RESULTADO

Directo y cultivo:

POSITIVO

Positivo:

Estuvo en contacto con el hongo

Positivo:

Presenta anticuerpos precipitantes frente

a los antígenos fúngicos

Presenta la enfermedad

Directo y cultivo:

Positivo

Negativo:

No estuvo en contacto con el hongo o se

encuentra en estado anérgico

(inmunosuprimido).

Positivo:

Presenta anticuerpos frente a los

antígenos fúngicos

Presenta la enfermedad

Directo y cultivo:

Positivo

Positivo:

Estuvo en contacto con el hogo

Negativo:

No presenta anticuerpos frente a los

antígenos fúngicos

Estuvo expuesto al hongo. Presenta la

micosis puesto que se hizo la observación

microscópica del hongo y aislamiento del

mismo en el medio de cultivo

Directo y cultivo:

Negativo

Positivo:

Estuvo en contacto con el hogo

Negativo:

No presenta anticuerpos frente a los

antígenos fúngicos

Estuvo expuesto al hongo más no

presenta la enfermedad.

Directo y cultivo:

Negativo

Negativo:

No estuvo en contacto con el hongo o se

encuentra en estado anérgico

(inmunosuprimido).

Negativo:

No presenta anticuerpos frente a los

antígenos fúngicos

El paciente puede:

1.No presentar enfermedad micótica.

2.Estar inmunosuprimido y presentar

enfermedad por otro agente.

CORRELACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LA IDR E IDD EN EL INMUNODIAGNÓSTICO MICOLÓGICO.

Hasta la próxima clase y no se olviden de revisar el portal

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