Cinética de Reacciones Catalizadas por Enzimas

� Las enzimas son biomoleculas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones químicas en los sistemas biológicos.

�Una enzima es una proteína con una bien definida estructura primaria y secundaria.

�La estructura primaria está determinada por la secuencia de los aminoácidos, en tanto que la estructura secundaria tiene que ver con el arreglo en el espacio, el cual depende en gran manerade los puentes de hidrógeno.

� Éstas biomoléculas son estables y funcionan en condiciones muy suaves, ambiente acuoso, bajas temperaturas y en muchas ocasiones pH neutro.

� La catálisis enzimática es esencial para los organismos vivos, ya que hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones químicas, las que en ausencia de catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH.

�La actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa.

� Si se desnaturaliza o disocia en subunidadespierde su actividad

En 1890s, Emil Fischer propuso un modelo de llave cerradura para explicar la especificidad de las enzimas.

Muchas enzimas poseen estereo-especificidad, catalizan reacciones de sustratos en una configuración, pero no en otra.

� Una enzima puede contener uno o más sitios activos. El sitio activo consiste solamente de unos cuantos residuos de aminoácidos y el resto de la proteína se requiere para mantener su integridad tridimensional.

Carboxipeptidasa A en la hidrólisis de uniones peptídicas

Grafica de la velocidad de una reacción catalizada por enzima vs. concentración de sustrato

][][

0 Sb

Sav

+=

Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas.Cinética de Michaelis-Menten

E = enzimaS = sustrato, ES = complejo enzima sustrato

Para derivar una expresión de velocidad. Michaelis and Menteninicialmente asumieron que el paso lento es la formación de P a partir del complejo enzima-sustrato, ES. La formación de ES, se considerada como un proceso de equilibrio rápido.

][][

20

0 ESkdt

Pdv =

=

E + S ⇄ ES → P + Ek1

k-1

k2

][][

20

0 ESkdt

Pdv =

=

][]][[

1

1

ES

SE

k

kK s == −La constante de disociación

( )][

][][][ 0

ES

SESEK s

−= ][][][

][ 0

SK

SEES

s +=

][][][][ 02

00 SK

SEk

dt

Pdv

s +=

=

E + S ⇄ ES → P + Ek1

k-1

k2

Cuando k-1 >> k2

Cinética de Michaelis-Menten

A un tiempo corto después del comienzo de la reacción, la concentración total de enzima [E]0 = [E] + [ES]

⇒

Sustituyendo en la expresión de velocidad:

][][][][ 02

00 SK

SEk

dt

Pdv

s +=

= ][][

0 Sb

Sav

+=

Cinética de Michaelis- Menten

a = k2[E] 0 y b = Ks

Tiene la forma de la ecuación de la hipérbola

A baja concentración de sustrato, [S] << Ks

][][][

02

00 SE

K

k

dt

Pdv

s

=

= La velocidad depende de la [S]

Esta ley de velocidad corresponde a la porción lineal de la gráfica de v0 vs. [S]

A alta concentración de sustrato, [S] >> Ks

max020

0 ][][

VEkdt

Pdv ==

=

Bajo estas condiciones, todas las moléculas de enzima están en la forma del complejo ES. Consecuentemente, la velocidad es de orden cero en [S]

Representa la transición de baja a alta concentración

Cinética de Michaelis-Menten

Cuando todas las moléculas de enzima están complejadas con el sustrato, formando ES, la velocidad alcanza su máximo

max020 ][ VEkv ==

Mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas.Cinética del estado estacionario.

E + S ⇄ ES → P + Ek1

k-1

k2

En 1925 Briggs y Haldane postularon que tan pronto como la enzima y el sustrato se mezclaban, la concentración del complejo ES alcanzaba un valor constante, de tal manera que la aproximación del estado estacionario podía aplicarse.

tiempo

conc

ent

raci

ón

Cinética del estado estacionario

E + S ⇄ ES → P + Ek1

k-1

k2

0][][]][[][

211 =−−= − ESkESkSEkdt

ESd

211

01

][][][

][kkSk

SEkES

++=

−

[E]0 = [E] + [ES]

211

0212

00 ][

][][][

][kkSk

SEkkESk

dt

Pdv

++==

=−

( ) ][/][][

121

020 Skkk

SEkv

++=

−

[E] = [E]0 - [ES]

E + S ⇄ ES → Pk1

k-1

k2

][][][ 02

0 SK

SEkv

M +=

1

21

k

kkKM

+= −

Este tratamiento define la velocidad máxima exactamente como el modelo de Michaelis –Menten, Vmax= k2[E]0

][][max

0 SK

SVv

M +=

][][][ 02

0 SK

SEkv

s +=

1

1

k

kK s

−=

KM ≠ Ks

Cinética de Reacciones Catalizadas por Enzimas

Estado estacionario: Equilibrio:

( ) ][/][][

121

020 Skkk

SEkv

++=

−

][][

2maxmax

0 SK

SVVv

M +==

� Cuando la velocidad inicial es la mitad del máximo de la velocidad

KM = [S]

][2][ SKS M =+

Vmax y KM pueden determinarse a partir de la gráfica de v0 vs [S]

[S]

v0

Cinética de Reacciones Catalizadas por Enzimas

][

][max0 SK

SVv

M +=

Muchas veces resulta complicado localizar el valor de Vmax a altas concentraciones de sustrato. Lineweaver y Burk, propusieron un método mas fácil que consiste en hacer una gráfica de 1/v0 vs. 1/[S].

maxmax0

1

][

1

VSV

K

vM +=

MK

1− maxV

Km M=

0

1

v

][

1

S

Gráfica Linewaver-Burk

max

1

V

Eadie-Hofstee propusieron otro método para graficar los datos cinéticos, éste método consiste en multiplicar ambos lados de la ecuación del recíproco por v0Vmax

maxmax0

1

][

1

VSV

K

vM += maxV

MKm −=

0v

][0

S

v

00

max ][v

S

KvV M +=

][0

max0 S

KvVv M−=

Gráfica Eadie-Hofstee

Rearreglando:MK

Vmax

Significado de KM

� KM Es un parámetro de afinidad con el sustrato. Mientras mayor sea KM la unión es más débil.

�Representa la concentración de sustrato a la cual la mitad de los sitios activos de la enzima están ocupados por moléculas de sustrato.

� El valor de KM varía considerablemente de una enzima a otra.

� KM depende de la temperatura, la naturaleza del sustrato, pH, fuerza iónica. Por lo tanto su valor sirve para caracterizar sistema enzima-sustrato en particular.

� Para la mayoría de las enzimas, KM está entre 10-1 M y 10-7 M

Significado de Vmax y k2

� Como su nombre lo indica, Vmax representa la máxima velocidad que puede alcanzarse.

� De acuerdo con la ecuación, Vmax = k2[E]0, si se conoce la concentración de enzima, se puede determinar también la constante k2.

� k2 es una constante de primer orden y tiene unidades de tiempo-1. En cinética enzimáticak2 se conoce también como número de recambiode la enzima óconstante catalítica, kcat.

� El número de recambiode una enzima se define como el número máximo de moléculas (o moles) de sustrato que se converten a producto por unidad de tiempo. La mayoría de las enzimas tienen números de recambio entre 1 y 105 s-1 en condiciones fisiológicas.

AnhídrasaCarbónica

CO2 + H2O HCO3– + H+

A 25 oC la anhídrasa carbónica tiene uno de los números de recambio mas altos que se conocen, k2 = 1×106 s-1.

Esto indica que una solución 1×10-6 M de enzima puede catalizar la formación de 1 M de HCO3

‒ a partir de CO2(producido por metabolismo) y H2O por segundo.

Vmax = k2[E]0

Vmax = (1×106 s-1)(1×10-6 M) = 1 M s-1

En ausencia de la enzima, la constante de pseudo-primer orden es 0.03 s-1

AnhídrasaCarbónica

CO2 + H2O HCO3– + H+

Ejercicio:

De Voe y Kistiakowsky (J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 274) estudiaron la cinética de hidratación de CO2 catalizada por la enzima anhidrasa carbónica

En esta reacción, el CO2 se convierte en ión bicarbonato. El bicarbonato es transportado por el flujo sanguíneo y se vuelve a convertir en CO2 en los pulmones, ésta reacción también está catalizada por la anhidrasa carbonica. Cuando la concentración de enzima es 2.3 nM y T = 0.5 oC se midieron las siguientes velocidades iniciales.

20.01.67 × 10-45.08.33 × 10-52.55.00 × 10-51.252.78 × 10-5

[CO2] / mMVelocidad (M s-1)

Determina KM y k2 para la enzima a esta temperatura

s V

Km M 40

max

==

0

1

v

][

1

S

s MV

1−= 40001

max

Vmax = 2.5 × 10-4 M s-1

Vmax = k2[E]0

Respuesta:

159

14

0

max2 101.1

103.2105.2

][−

−

−−

×=×

×== sM

s M

E

Vk

( ) ( )( ) mM s Ms Vs KM 10105.24040 14max =×== −−

maxmax0

1

][

1

VSV

K

vM +=

Inhibición de las enzimas

La inhibición de algunas enzimas por metabolitos específicos constituye un elemento importante en la regulación del metabolismo intermediario.

Los tres tipos principales de inhibición reversible de las enzimas son:

� Competitiva. � Acompetitiva� No competitiva

Los tres tipos de inhibición se pueden distinguir experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en la cinética de reacción.

Inhibición Competitiva.

Tanto el sustrato, S, como el inhibidor, I, compiten por el mismo sitio activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor, EI, análogo al complejo enzima sustrato.

E + S ⇄ ES → Pk1

k-1

k2

+I

⇄

EI

KI

Mecanismo:

El complejo EI no forma productos

ES

EI

E

Excepto que el término KM está modificado por:

ésta ecuación tiene la misma forma que la ec. de Michaelis-Menten

][][

1

][max0

SK

IK

SVv

IM +

+

=

Inhibición Competitiva.

E + S ⇄ ES → Pk1

k-1

k2

+I⇄

EIKI

Aplicando la aproximación del estado estacionario y considerando que la concentración total de enzima está dada por: [E]0 = [E] + [EI] + [ES]

][

][max0 SK

SVv

M +=

EI

IEK I ][

]][[=

+

IK

I ][1

Inhibición Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk

maxmax0

1

][

1][1

1

VSK

I

V

K

v I

M +

+=

+−=

][1

IK

K

K intercepto

I

I

M

0

1

v

][

1

S

max

1

V

[I] = 0

[I]

][][

1

][max0

SK

IK

SVv

IM +

+

=

m

Inhibición Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk

+=

I

M

K

I

V

Km

][1

max

maxV

KM-KI

I

MM

KV

IK

V

Km

maxmax

][+=

[I]

m

I

M

KV

Km

max

'=

Debido a que la interacción del inhibidor con la enzima es reversible:

� Una disminución en la concentración del inhibidor desplazará el equilibrio hacia la regeneración de la enzima libre.

� Dado que tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio de unión, un aumento en la concentración de sustrato, provee una segunda manera de revertir la inhibición competitiva. Mientras mayor sea la concentración de sustrato mayor será la cantidad de complejo ES.

Inhibición Competitiva.E + S ⇄ ES → P+I⇄

EI

Inhibición No Competitiva.

Un inhibidor no competitivo no se une al sitio activo de la enzima.

E + S ⇄ ES → Pk1

k-1

k2

+I

⇄

EI

KI

Mecanismo:

+I

⇄

ESI

KI

+ S ⇄

EI y ESI no forman productos

ES

EI

E

ESI

ESI

][

][][

1

max

0 SK

S

K

I

V

vM

I

+

+

=

Inhibición No Competitiva.

Aplicando la aproximación del estado estacionario y considerando que la concentración total de enzima está dada por: [E]0 = [E] + [EI] + [ES] + [ESI]

E + S ⇄ ES → Pk1

k-1

k2

+I

⇄

EI

KI

+I

⇄

ESI

KI

+ S ⇄

Inhibición No Competitiva. Ecuación de Linewaver-Burk

MK

1−

0

1

v

][

1

S

[I] = 0

[I]

++

+=

II

M

K

I

VSK

I

V

K

v

][1

1

][

1][1

1

maxmax0

][

][][

1

max

0 SK

S

K

I

V

vM

I

+

+

=

+=

IK

I

Vintercepto

][1

1

max

� Debido a que el sustrato y el inhibidor no compiten por el mismo sitio de unión, un incremento en la concentración de sustrato no puede revertir la unión porque también se incrementaría el número de complejos que contienen inhibidor (ESI).

� El efecto de un inhibidor no competitivo es reducir la concentración de complejos ES que pueden dar lugar a producto.

� Puesto que Vmax = k2[E]0 y la concentración de enzima total disminuye debido a la formación de ESI, se espera que un inhibidor no competitivo disminuya la Vmax.

Inhibición No Competitiva.

Inhibición Acompetitiva.

Un inhibidor acompetitivo no se une a la enzima libre, sino al complejo enzima-sustrato, ES. La unión del sustrato modifica la estructura de la enzima, de tal manera que la unión del inhibidor es posible.

E + S ⇄ ES → Pk1

k-1

k2Mecanismo:

+I

⇄

ESI

KIESI no forman producto

ESE ESI

La adición de más sustrato no revierte el efecto inhibitorio

][][

1

][][

1

max

0

S

K

I

K

S

K

I

V

v

I

M

I

+

+

+

=

Inhibición Acompetitiva.

Aplicando la aproximación del estado estacionario y considerando que la concentración total de enzima está dada por: [E]0 = [E] + [ES] + [ESI]

E + S ⇄ ES → Pk1

k-1

k2

+I

⇄

ESI

KI

Inhibición Acompetitiva. Ecuación de Linewaver-Burk

MK

1−

0

1

v

][

1

S

[I] = 0

[I]

+=

IK

I

Vintercepto

][1

1

max

][][

1

][][

1

max

0

S

K

I

K

S

K

I

V

v

I

M

I

+

+

+

=

++=

I

M

K

I

VSV

K

v

][1

1

][

11

maxmax0

maxV

Km M=

maxmax0

1

][

1][1

1

VSK

I

V

K

v I

M +

+=

++

+=

II

M

K

I

VSK

I

V

K

v

][1

1

][

1][1

1

maxmax0

++=

I

M

K

I

VSV

K

v

][1

1

][

11

maxmax0

Inhibición competitiva

Inhibición no competitiva

Inhibición acompetitiva

maxmax0

1

][

1

VSV

K

vM +=Sin inhibición

Tipo de Inhibidor Efecto cinético

Vmax no se modifica y KM incrementa con [I]

Vmax disminuye con [I] y KM no se modifica

Vmax y KM ambas disminuyen

Efecto en la gráfica Linewaver-Burk

La pendiente incrementa cuando [I] ↑ y la ordenada se mantiene constante

Ambas, la pendiente y la ordenada incrementan cuando [I] ↑

La pendiente se mantiene constante y la ordenada incrementa cuando [I] ↑

Ejercicio:

Un químico midió la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima tanto en ausencia como en presencia de inhibidor A, en un experimento separado estudio el efecto del inhibidor B. En ambos casos la concentración del inhibidor fue 8.0 mM

1.43 × 10-63.57 × 10-64.55 × 10-61.0 × 10-21.25 × 10-62.78 × 10-63.85 × 10-65.0 × 10-31.00 × 10-62.00 × 10-63.13 × 10-62.5 × 10-36.30 × 10-71.04 × 10-62.00 × 10-61.0 × 10-33.80 × 10-75.80 × 10-71.25 × 10-65.0 × 10-4

vo / M s-1

Inhibidor Bvo / M s-1

Inhibidor Avo / M s-1

No inhibidor[S]/ M

a) Determina los valores de KM y Vmax de la enzima. b) Para cada uno de los inhibidores ( A y B ), determina el tipo de inhibición y calcula el valor de KI en cada caso.

� La mayoría de las enzimas tienen un pHcaracterístico al cual su actividad es máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye.� El pH óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de la curva. Por eso la relación pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

� Al igual que sucede con la mayoría de las reacciones químicas, las reacciones enzimáticas incrementan su velocidad con la temperatura.

� La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica, aproximadamente por cada 10 ºC de aumento de la temperatura.

� El pico de la gráfica al representar la actividad catalítica respecto a la temperatura se debe a que las enzimas, al ser proteínas, se desnaturalizan por acción del calor y se inactivan a partir de cierto punto.

� A partir de los 55-60 ºC la mayor parte de las enzimas se inactivan. Sin embargo, las enzimas de bacterias termofílicas siguen siendo activas a temperaturas superiores a los 85 ºC.

Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimáticas