CELOSTÁTNÍ P EHLÍDKY SÝR - vscht.cz

CELOSTÁTNÍ P EHLÍDKY SÝR 2007

Výsledky p ehlídeka

sborník p ednášek seminá e

Mléko a sýry

Praha – leden 2007

Editor: Št tina J., urda L.

Vydavatel: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5; 166 28 Praha 6

Rok vydání: 2007

ISBN 978-80-7080-661-6

3

OBSAH

Výsledky 11. ro níku Celostátních p ehlídek sýrurda Ladislav, Št tina Ji í................................................................................................................ 13

Mikrobiologické kritériá pre hodnotenie kvality surového kravského mlieka Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír ............................................................................................. 21

Vliv ranního a ve erního nádoje na vybrané mlé né ukazatele. Skýpala Martin, Chládek Gustav ....................................................................................................... 26

Protektivní kultury pro výrobu polotvrdých sýrT ma Št pán, Plocková Milada ......................................................................................................... 31

Vliv doby a teploty skladování na konzistenci sterilovaných tavených sýrBu ka František, Št tina Ji í, Hrab Jan ............................................................................................ 37

P íprava enzymových hydrolyzát v membránovém reaktoru urda Ladislav, Vaverková Ivana, Mišún Daniel.............................................................................. 43

Dynamika mikrobiálnych interakcií po as kysnutia mlieka Valík ubomír, Medve ová Alžbeta, Bajúsová Barbora, Liptáková Denisa.................................... 48

Utilizácia glukózy a laktózy rôznymi kme mi laktobacilov Greif Gabriel, Greifová Mária, Karovi ová Jolana, Kohajdová Zlatica, Kraj ová Eva .................... 53

Aplikace p ímé a nep ímé impedan ní metody p i studiu vlastností MKa kontaminující mikroflóry mléka

erný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasni ková Eva, Vylet lová Marcela ..................................... 59

Žin ica ako probiotická biodiverzifikovaná potravina Keresteš Jan........................................................................................................................................ 64

Protektivné vlastnosti vybraných kme ov rodu LactobacillusHudá ek Jaroslav, Zalán Zsolt, Chumchalová Jana, Halász Anna .................................................... 67

Plakátová sd lení:

Základní charakteristika a bun ná lyse kmen Lactococcus lactisAbrlová Magdaléna, Šviráková Eva, Hlavsová Barbora, Plocková Milada ...................................... 77

Charakteristika rastu Lactobacillus rhamnosus GG v mlieku Medve ová Alžbeta, Valík ubomír, Liptáková Denisa, Bajúsová Barbora.................................... 81

Výb r jogurtové kultury pro sójové výrobky Pavlasová Marcela, Dvo ák Milan, Dvo áková Eva, Chumchalová Jana ......................................... 86

Skríning vybraných startovacích kultur na p ítomnost DNA sekvencí kódujících dekarboxylázy ú astnící se tvorby biogenních aminBurdychová Radka, Komprda Tomáš ............................................................................................... 91

Vplyv baktérií mlie neho kysnutia na rast Staphylococcus aureus v mlieku Bajúsová Barbora, Valík ubomír, Liptáková Denisa, Medve ová Alžbeta.................................... 95

Vliv kombinace lysozymu a laktokok produkujících nisin na r st Bacillus cereusDMF 2001 v modelovém systému mléka UHT Šviráková Eva, Ostap uk Radek, Plocková Milada........................................................................... 99

Vplyv Lactobacillus rhamnosus GG na rast Candida maltosa v mlieku Liptáková Denisa, Valík ubomír, Bajúsová Barbora, Medve ová Alžbeta.................................. 104

4

Extrakce bakteriocinu kmene Enterococcus mundtii EN3 organickým rozpoušt dlema pomocí adsorpce bakteriocinu na bun nou st nuMiller Petr, Bakir Hatice Eda, Ku erová Kate ina, Chumchalová Jana, Míková Kamila............... 108

Výskyt Bacillus cereus a Bacillus licheniformis v pr b hu výroby sterilované smetany a termizovaného dezertu N me ková Irena, Roubal Petr, Pecha ová Marta, Vylet lová Marcela, Nejeschlebová Ludmila . 113

Mikrobiologická a molekulárn -biologická detekce bakterie Clostridium tyrobutyricumv polotvrdých sýrech Sládková Pavla, Burdychová Radka ............................................................................................... 118

Izolácia a PCR-typizácia kme ov baktérií mlie neho kysnutia z bryndze Bertaová Gabriela, Kuchta Tomáš, Valík ubomír, Pangallo Domenico ....................................... 122

Monitoring a identifikácia potenciálnych bakteriálnych kontaminantov ov iarskych výrobkov vo výrobnom procese Kostolníková Mária, Kore ová Janka, Lopašovská Janka .............................................................. 126

Sledování zm n kyselosti mléka b hem výroby kozích sýrKou imská Lenka, Ková ová Eva, Dragounová Hedvika, Babi ka Luboš ..................................... 131

Vliv po adí laktace na chemické složení ov ího mléka Novotná Lenka, Kuchtík Jan, Zajícová Pavlína............................................................................... 134

Obsah a složení syrovátkových bílkovin kozího a ov ího mléka Jansová Blanka, Hejtmánková Alena, Dragounová Hedvika ......................................................... 139

Vliv stadia laktace na mlé nou užitkovost holštýnského skotu Skýpala Martin, Chládek Gustav ..................................................................................................... 144

Variabilita dusíkatých látek v mléce Šustová Kv toslava, Kopunecz Pavel.............................................................................................. 149

Vliv koncentrace mo oviny na sýra ské vlastnosti kravského mléka ejna Vladimír, Chládek Gustav ..................................................................................................... 155

Mlieko so zvýšeným obsahom selénu, ako surovina pre výrobu funk ných potravín v prevencii proti nádorovým ochoreniam Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína, Bob ek Rastislav.............................................................. 159

Vliv dotace krmné dávky dojnic chrán nými esenciálními aminokyselinami na techno-logické vlastnosti mléka

erný Vladimír, T ináctý Ji í, Havlíková Šárka, Kvasni ková Eva, Hadrová Sylvie..................... 164

Obsah hydroxymethylfurfuralu a p íbuzných látek v mléce Bartáková Klára, Borkovcová Ivana, Vorlová Lenka, Kr ková Lucie, Chocholá ová Markéta .... 170

HPLC analýza sacharidov a organických kyselín v mlie nych produktoch Greifová Mária, Greif Gabriel, Kraj ová Eva, Karovi ová Jolana, Schmidt Štefan ...................... 175

Hodnocení fyzikáln -chemických vlastností sýr s nízkodoh ívanou sý eninoupomocí FT-NIR Dra ková Michaela, e uchová Mirka, Hadra Luboš, P idalová Hana, Navrátilová Pavlína, Janštová Bohumíra, Vorlová Lenka................................................................................................. 180

Využití NIR spektroskopie p i sledování pr b hu zrání eidamských sýr r zných výrobcKrálíková Marcela, Lužová Tá a, Ml ek Ji í, Šustová Kv toslava................................................. 185

Využití NIR spektroskopie p i analýze sušeného mléka R ži ková Jana, Šustová Kv toslava............................................................................................... 190

5

Stanovení jakostních ukazatel erstvých kozích sýr pomocí NIR spektroskopie. Lužová Tá a, Šustová Kv toslava, Horáková Ruth ........................................................................ 195

Sledování jakosti jedlých roztíratelných a sm sných roztíratelných tukPanovská Zde ka, Dostálová Jana, Doležal Marek, Culková Jana, Šedivá Alena .......................... 198

Senzorické hodnocení mražených krémJarošová Alžbeta, Šulcerová Hana, o ková Dana ......................................................................... 202

Sledování zm n senzorických vlastností bílých jogurt po dobu jejich minimální trvanlivostiŠulcerová Hana, Šustová Kv toslava, Vaculínová Hana................................................................. 208

Virtuální realita v elektronických potraviná ských databázích Uvíra Roman, Pudil František, Maryška Martin.............................................................................. 213

Houbové aroma v tavených sýrech Pudil František, Uvíra Roman, Janda Václav .................................................................................. 217

Vliv genetických variant kaseinu na výt žnost p i výrob sýrLegarová Veronika, Kou imská Lenka............................................................................................ 221

Varianty sýr s mletou sý eninou a jejich poloprovozní výroba Mrázek Josef, Tykvartová Dagmar, Vráblíková Eva....................................................................... 227

Využití plísn Penicillium nalgiovense k výrob plís ového sýra Mrázek Josef, Pospíšil Michal, Korbelová Marie, Heraltová Veronika .......................................... 232

Vliv p ídavku kappa- a iota-karagenanu na viskoelastické a organoleptické vlastnosti tavených sýr

erníková Michaela, Bu ka František, Pavlínek Vladimír, echová Leona, B ezina Pavel, Hrab Jan.......................................................................................................................................... 237

Vliv vybraných hydrokoloid na mechanické vlastnosti gelu kapa-karagenanu v mléce Šilhavá Jaroslava, Št tina Ji í, Loužecký Tomáš ............................................................................ 243

Texturní vlastnosti gel -karagenanu s vybranými hydrokoloidy v mlé ných a sójových substrátechLoužecký Tomáš, Dvo ák Milan, Dvo áková Eva, Šilhavá Jaroslava, Št tina Ji í ......................... 249

Antifungální vlastnosti acylglykosid a jejich využití Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ..................................................... 255

Mikrobiologické a reologické vlastnosti vybraných probiotických sójových výrobkDvo áková Eva, Dvo ák Milan, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela, Chumchalová Jana, Št tina Ji í ....................................................................................................... 259

P íprava galaktooligosacharid a jejich aplikace do mlé ných a sójových médií Dvo ák Milan, Dvo áková Eva, Hinková Andrea, Chumchalová Jana, urda Ladislav, Hellerová Klára, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela .................................................................. 263

7

CONTENS

Results of 11th National Quality Competition for Cheese. urda Ladislav, Št tina Ji í................................................................................................................ 13

Microbilogical paramaters for evaluation of raw cow milk. Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír ............................................................................................. 21

The influence of morning and evening milking on chosen milk parameters. Skýpala Martin, Chládek Gustav ....................................................................................................... 26

Protective cultures for semi-hard cheese production. T ma Št pán, Plocková Milada ......................................................................................................... 31

Effect of storage time and temperature on consistency of sterilized processed cheese. Bu ka František, Št tina Ji í, Hrab Jan ............................................................................................ 37

Preparation of enzyme hydrolysates in membrane reactor. urda Ladislav, Vaverková Ivana, Mišún Daniel.............................................................................. 43

Dynamics of microbial interactions during fermentation of milk. Valík ubomír, Medve ová Alžbeta, Bajúsová Barbora, Liptáková Denisa.................................... 48

Utilization of glucose and lactose by some strains of lactobacilli. Greif Gabriel, Greifová Mária, Karovi ová Jolana, Kohajdová Zlatica, Kraj ová Eva .................... 53

Application of direct and indirect impedance method for studying a pure dairy culture and milk contaminated culture.

erný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasni ková Eva, Vylet lová Marcela ..................................... 59

Žin ica – probiotic biological diversified food.Keresteš Jan........................................................................................................................................ 64

Protective properties of selected Lactobacillus strains. Hudá ek Jaroslav, Zalán Zsolt, Chumchalová Jana, Halász Anna .................................................... 67

Posters:

Basic characterization and cell lysis of Lactococcus lactis strains. Abrlová Magdaléna, Šviráková Eva, Hlavsová Barbora, Plocková Milada ...................................... 77

Characterization of growth of the Lactobacillus rhamnosus GG in milk. Medve ová Alžbeta, Valík ubomír, Liptáková Denisa, Bajúsová Barbora.................................... 81

Selection of a yoghurt culture for soy products. Pavlasová Marcela, Dvo ák Milan, Dvo áková Eva, Chumchalová Jana ......................................... 86

Screening of selected starter cultures for the presence of DNA sequences coding for decarboxylases causing biogenic amine production. Burdychová Radka, Komprda Tomáš ............................................................................................... 91

Effect of lactic acid bacteria on growth of Staphylococcus aureus in milk. Bajúsová Barbora, Valík ubomír, Liptáková Denisa, Medve ová Alžbeta.................................... 95

Influence of combination of lysozyme and nisin-producing lactococci on the growth of Bacillus cereus DMF 2001 in the model UHT milk system. Šviráková Eva, Ostap uk Radek, Plocková Milada........................................................................... 99

8

Effect of Lactobacillus rhamnosus GG on the growth dynamics of Candida maltosa in milk. Liptáková Denisa, Valík ubomír, Bajúsová Barbora, Medve ová Alžbeta.................................. 104

Purification of bacteriocin produced by Enterococcus mundtii EN3 using a organic solvent and the adsorption on the cell surface method. Miller Petr, Bakir Hatice Eda, Ku erová Kate ina, Chumchalová Jana, Míková Kamila............... 108

Occurrence of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis during the manufacturing of sterilized cream and thermized dessert. N me ková Irena, Roubal Petr, Pecha ová Marta, Vylet lová Marcela, Nejeschlebová Ludmila . 113

Detection of Clostridium tyrobutyricum in semi-hard cheeses using microbiological and PCR methods. Sládková Pavla, Burdychová Radka ............................................................................................... 118

Isolation and PCR-typing of lactic acid bacteria from bryndza cheese. Bertaová Gabriela, Kuchta Tomáš, Valík ubomír, Pangallo Domenico ....................................... 122

Monitoring and identification of bacterial contaminants in production process of sheep products.Kostolníková Mária, Kore ová Janka, Lopašovská Janka .............................................................. 126

Monitoring of milk acidity changes during goat cheesemaking. Kou imská Lenka, Ková ová Eva, Dragounová Hedvika, Babi ka Luboš ..................................... 131

Influence of parity on the chemical composition of sheep milk. Novotná Lenka, Kuchtík Jan, Zajícová Pavlína............................................................................... 134

Content and constituion of goat and sheep whey proteins. Jansová Blanka, Hejtmánková Alena, Dragounová Hedvika ......................................................... 139

The influence of stage of lactation on milk efficiency of holstein cattle. Skýpala Martin, Chládek Gustav ..................................................................................................... 144

Variability of nitrogenous matter in milk. Šustová Kv toslava, Kopunecz Pavel.............................................................................................. 149

Effect of milk urea level on cheese-making properties of cow’s milk. ejna Vladimír, Chládek Gustav ..................................................................................................... 155

Milk with higher Selenium content as the raw material for functional food production in the prevention of tumour disease. Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína, Bob ek Rastislav.............................................................. 159

The influence of milk cow feeding ration with protected essential amino acids on the technological properties of milk.

erný Vladimír, T ináctý Ji í, Havlíková Šárka, Kvasni ková Eva, Hadrová Sylvie..................... 164

Content of hydroxymethylfurfural and related compounds in milk. Bartáková Klára, Borkovcová Ivana, Vorlová Lenka, Kr ková Lucie, Chocholá ová Markéta .... 170

HPLC estimation of saccharides and organic acids in milk products. Greifová Mária, Greif Gabriel, Kraj ová Eva, Karovi ová Jolana, Schmidt Štefan ...................... 175

Determination of physical and chemical properties in low scalded cheese by FT-NIR. Dra ková Michaela, e uchová Mirka, Hadra Luboš, P idalová Hana, Navrátilová Pavlína, Janštová Bohumíra, Vorlová Lenka................................................................................................. 180

9

The use of NIR spectroscopy by monitoring rippening eidam s cheeses from different producers.Králíková Marcela, Lužová Tá a, Ml ek Ji í, Šustová Kv toslava................................................. 185

Application of the FT NIR spectroscopy for analysis of milk powder. R ži ková Jana, Šustová Kv toslava............................................................................................... 190

The determination of quality indexes fresh goat s cheeses with used NIR spectroscopy. Lužová Tá a, Šustová Kv toslava, Horáková Ruth ........................................................................ 195

Monitoring of quality of margarines and spreads.Panovská Zde ka, Dostálová Jana, Doležal Marek, Culková Jana, Šedivá Alena .......................... 198

Sensorial assessment of frozen creams. Jarošová Alžbeta, Šulcerová Hana, o ková Dana ......................................................................... 202

Changes monitoring of white yoghurts sensorial characteristics during their minimal endurance time. Šulcerová Hana, Šustová Kv toslava, Vaculínová Hana................................................................. 208

Virtual reality in electronic food databases. Uvíra Roman, Pudil František, Maryška Martin.............................................................................. 213

Mushroom flavour in processed cheese. Pudil František, Uvíra Roman, Janda Václav .................................................................................. 217

The effect of casein genetic varieties on the yield during cheesemaking. Legarová Veronika, Kou imská Lenka............................................................................................ 221

Variaties of milled curd cheese and their pilot plant production. Mrázek Josef, Tykvartová Dagmar, Vráblíková Eva....................................................................... 227

Use of Penicillium nalgiovense for production of cheese covered by white mould. Mrázek Josef, Pospíšil Michal, Korbelová Marie, Heraltová Veronika .......................................... 232

The effect of addition of kappa- and iota-carrageenans on viscoelastic and organoleptic properties of processed cheeses.

erníková Michaela, Bu ka František, Pavlínek Vladimír, echová Leona, B ezina Pavel, Hrab Jan.......................................................................................................................................... 237

Influence of selected hydrocoloids on mechanical properties of kappa-carrageenan gel in milk.Šilhavá Jaroslava, Št tina Ji í, Loužecký Tomáš ............................................................................ 243

Textural properties of -carrageenan gels with chosen hydrocolloids in milk and soya mixtures.Loužecký Tomáš, Dvo ák Milan, Dvo áková Eva, Šilhavá Jaroslava, Št tina Ji í ......................... 249

Antifungal properties of acylglycosides and their usage. Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ..................................................... 255

Microbial and rheological properties of probiotic soy products. Dvo áková Eva, Dvo ák Milan, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela, Chumchalová Jana, Št tina Ji í ....................................................................................................... 259

Preparation of galactooligosaccharides and their application into milk and soy media. Dvo ák Milan, Dvo áková Eva, Hinková Andrea, Chumchalová Jana, urda Ladislav, Hellerová Klára, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela .................................................................. 263

Celostátní p ehl ídky sýr

13

VÝSLEDKY 11. RO NÍKU CELOSTÁTNÍCH P EHLÍDEK SÝRurda Ladislav, Št tina Ji í

Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha

Results of 11th National Quality Competition for Cheese

Summary:The 11th National Quality Competition for Cheese was organized traditionally by Department of Dairy and Fat Technology (ICT Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 18 and 24 of January 2007 in Prague. 67 hard, semi-hard, mould, white, fresh and processed cheeses of 18 producers competed in this year’s show. Competitive samples of cheeses were divided into 10 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from three members assessed each cheese. Altogether 110 evaluators worked in public commissions. The cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (including Slovakian cheeses) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the show. The National Cheese Show was accompanied by a seminar called „Milk and Cheeses“ with a scientific programme involving 13 lectures and 40 poster presentations.

Tradi ní p ehlídky sýr , které se konají každoro n koncem ledna, dosp ly letos již ke svému jedenáctému ro níku. Podobn jako p edchozí ro níky i ten letošní byl organizován Ústavem technologie mléka a tuk Vysoké školy chemicko-technologické v Praze ve spolupráci s eskomoravským svazem mlékárenským a Odbornou skupinou pro potraviná skou a agrikulturní chemii eské spole nosti chemické. P ejímka vzork a odborné hodnocení se konalo 18. ledna. Do hodnocení bylo za azeno 67 vzorkod 18 tuzemských výrobc a 11 vzork zahrani ních, které poskytlo 6 dovozc sýr . Sýry byly rozd leny do 10 kategorií. P ehled zú astn ných výrobc a rozd lení vzork do kategorií je uvedeno v tabulce I. Nejsiln ji byla obsazena kategorie eidamských sýr se 40 – 50 % tuku v sušin(10 vzork ), 9 vzork pak bylo hodnoceno ve specialitách (vedle sýr s mazem na povrchu p edevším ochucené sýry a bílé sýry) a v kategorii neochucených tavených sýr . Nov vyhlášenými kategoriemi byly sýry s mazem na povrchu a erstvé a termizované sýry ochucené. Sýry s mazem na povrchu byly ovšem nakonec za azeny do specialit pro nedostate ný po et p ihlášených vzork .D íve samostatné kategorie sýr s tvorbou ok a sýr typu moravský bochník musely být rovn žslou eny do jedné kategorie.

P i odborném hodnocení posuzují každý sýr 2 paralelní komise expert , každá má nezávislého p edsedu a t i zástupce výrobc . V p ípad kategorií erstvých a termizovaných neochucených sýr a tavených neochucených sýr , které se hodnotí neanonymn , je posílena ástkomise z nezávislých odborník , komise je tedy celkem p ti lenná. Sýry se posuzují ve dvou znacích: vzhled a konzistence (ve výsledném hodnocení tvo í 40 %) a chu a v n (60 %). Výsledné hodnocení je dáno aritmetickým pr m rem hodnocení všech len obou komisí. Ve ejné hodnocení se konalo 24. ledna poprvé v d stojném prost edí kongresového sálu Masarykovy koleje. P ehlídky osobn zahájil rektor VŠCHT Prof. Ing. Vlastimil R ži ka, CSc., pod jehož záštitou se p ehlídky konají. Za átek p ehlídek byl poznamenán nep ízní po así, kv likteré se ást hodnotitel nemohla dostavit. Sýry tak posuzovalo celkem 110 hodnotitel . Zp sobhodnocení je podobný jako v p edchozím p ípad , ale neuplat uje se zde podmínka shody v rámci komise ani mezi komisemi. Po adí sýr v jednotlivých kategoriích je pak získáno neparametrickým po adovým testem. Ve výsledcích se uvádí i pr m rné hodnoty, které však poskytují shodné po adím.Výsledky z obou hodnocení jsou uvedeny v tabulkách II a III.

Tuzemským sýr m bylo na základ odborného hodnocení ud leno celkem 19 diplom .Po et diplom v jednotlivých kategoriích závisí na po tu p ihlášených vzork (jeden diplom p ipadne minimáln na 3 vzorky). Nejvíce diplom (celkem 4) získala MADETA a. s., která m lataké nevyšší po et p ihlášených vzork (17). K nejúsp šn jším sýrárnám na letošních p ehlídkách pat í Mlékárna Polná, s. r. o. - za ty i p ihlášené sýry obdržela t i diplomy. Stejn úsp šná byla i Jarom ická mlékárna, pokud se slou í výsledky z jejích t í samostatn p ihlašovaných st edisek.

14

Tabulka I P ehled p ihlašovatel sýr a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích.

Kategorie

1. E

idam

ské

sýry

30%

t.v.

s.

2. E

idam

ské

sýry

40

- 50%

t.v.

s.

3. S

ýry

s tvo

rbou

ok

a M

orav

ský

blok

4. U

zené

sýry

5. S

ýry

s plís

ní n

a po

vrch

u

6. S

ýry

s plís

ní v

tst

7. S

peci

ality

8.

erst

vé a

term

izov

ané

sýry

neo

chuc

ené

9.

erst

vé a

term

izov

ané

sýry

och

ucen

é

10. T

aven

é sý

ry n

eoch

ucen

é

eská republika

BEL Sýry esko, a.s., Želetava 3 3

Jarom ická mlékárna, a.s. 4 1 2 1

KROMILK, s.r.o., Krom íž 1 1

Lactalis KS, s.r.o. 2 1 1

MADETA, a.s. 17 2 1 2 1 3 3 1 3 1

MILTRA B, s.r.o., M ste ko Trnávka 4 1 1 1 1

Mlékárna Klatovy, a.s. 4 1 1 1 1

Mlékárna Otínoves, s.r.o. 1 1

Mlékárna Polná, s.r.o. 4 1 1 1 1

Mlékárna Varnsdorf, s.r.o. 1 1

Moravia Lacto, a.s. 5 2 1 2

Niva, s.r.o., Dolní P ím 1 1

PLASTCOM, a.s., mlékárna P íšovice 5 1 2 1 1

Povltavské mlékárny, a.s., Sedl any 8 3 1 2 2

Pribina, s.r.o., P ibyslav 1 1

Sýrárna Brat í Brunner s.r.o. 1 1

TANY, s.r.o., Nýrsko 3 3TPK, s.r.o., Hodonín 2 2

Vzorky z R celkem 67 7 10 8 5 5 5 9 4 5 9

Dovozce zahrani ních sýr

NIKA s.r.o. 5

Bongrain 1

Fruit´s de France 1

IMCO s.r.o. 1

Lactalis CZ, s.r.o. 2SEAFOOD s.r.o. 1

Sýry z dovozu celkem 11

Po et sýrP ihlašovatel

15

Tabulka II Výsledky Celostátních p ehlídek sýr (kategorie 1 – 5)

tvs suš

[%] [%]

1 3 Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o. 30 50 88,75 2,96 18,00 70,48 5,19

2 2 Eidamský sýr Mlékárna Polná, spol. s.r.o. 30 52 78,75 3,31 19,03 72,48 4,36

3 7 Eidamská cihla I MADETA a.s. 30 50 76,75 6,54 13,10 65,15 4,18

4 4 Eidamská cihla MADETA a.s. 30 50 74,00 8,58 17,39 70,30 3,99

5 1 Sýr eidam Mlékárna Klatovy a.s. 30 50 70,50 7,25 19,76 73,58 3,39

6 5 Eidamský sýr Jarom ická mlékárna a.s., st edisko M. Bud jovice 30 50 69,00 * 14,86 66,48 4,97

7 6 Eidamská cihla PLASTCOM a.s., Mlékárna P íšovice 30 50 66,75 2,86 13,86 66,73 3,48

1 1 Eidamský blok 45% Jarom ická mlékárna a.s., st edisko Jarom ice 45 55 86,75 3,77 24,22 76,88 3,80

2 4 Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o. 40 53 83,00 4,44 20,44 72,35 4,35

3 5 Eidamský sýr 45% t.v.s. Jarom ická mlékárna a.s., st edisko M. Bud jovice 45 55 78,75 2,45 19,12 71,12 3,15

4 6 Gouda MADETA a.s. 48 57 72,75 6,79 17,85 69,59 4,32

5 2 Eidamský sýr 45% Mlékárna Polná, spol. s.r.o. 45 57 72,50 3,37 22,39 75,12 3,35

6 3 Sýr Jasan 50% Mlékárna Klatovy a.s. 50 60 72,00 11,38 20,68 73,59 3,76


8 9 Mandava - Bio sýr Mlékárna Varnsdorf s.r.o. 40 54 58,50 3,03 9,49 59,65 2,97

9 7 Krkonošský eidam 45% t.vs. Lactalis KS s.r.o. 45 55 56,75 3,47 16,16 67,65 3,87


1 8 Zámecký sýr 45% Jarom ická mlékárna a.s., st edisko Želetava 45 59 87,50 * 8,95 69,25 5,84

2 5 Goldenburg Lactalis KS s.r.o. 45 62 85,50 6,82 12,30 76,75 4,63

3 6 Madeland light MADETA a.s. 30 53 84,00 1,81 10,76 73,33 4,84

4 4 Moravský blok Moravia Lacto a.s. 45 60 82,00 3,92 13,00 77,25 5,04

5 7 Montana Moravia Lacto a.s. 45 60 81,75 4,94 9,47 70,33 5,96

6 1 Sýr Moravský blok 45% Mlékárna Klatovy a.s. 45 62 80,75 3,77 14,82 80,67 5,12

7 2 Madeland MADETA a.s. 45 57 66,75 3,77 14,16 80,83 4,70

8 3 Artuš - p írodní salámový polotvrdý sýr s tvorbou ok MILTRA B s.r.o. 40 53 57,00 2,22 13,04 78,25 4,66

1 4 Eidam uzený 45% Mlékárna Polná, spol. s.r.o. 45 57 82,00 2,57 7,69 67,83 5,06

2 2 Uzený sýr eidam 40% Mlékárna Klatovy a.s. 40 55 75,75 5,76 11,90 77,83 6,14

3 5 Uzený sýr eidamský blok PLASTCOM a.s., Mlékárna P íšovice 45 56 71,25 6,28 ** 67,13 5,59

4 3 Eidamský salámový polotvrdý sýr uzený MILTRA B s.r.o. 40 53 68,75 5,97 11,34 76,09 5,78

5 1 Excelent s esnekem uzený Moravia Lacto a.s. 45 55 63,50 2,06 15,23 84,96 3,99

5 1 4 Sedl anský hermelín smetanový 100g Povltavské mlékárny a.s. 64 50 79,50 5,68 11,68 78,42 5,50

2 1 Sedl anský vltavín 120g Povltavské mlékárny a.s. 57 53 78,25 2,91 15,32 85,42 4,28

3 5 Král sýr Camembert Grand Caractere PRIBINA spol. s r.o. 45 45 76,75 3,92 8,14 69,33 6,83

4 2 Sedl anský hermelín 100g Povltavské mlékárny a.s. 53 47 75,50 1,92 12,98 79,75 6,23

5 3 Kamadet Královský sýr MADETA a.s. 48 51 73,00 4,69 12,38 80,25 4,41

Tu n ozna ené vzorky splnily kritéria pro ud lení diplomu.Kategorie: 1. Eidamské sýry 30% t.v.s. Poznámky: * hodnoceno departážní komisí

2. Eidamské sýry 40 - 50% t.v.s. ** nebylo možno vyhodnotit neparametrickým testem3. Sýry s tvorbou ok a sýry typu Moravský blok (neúplné výsledky)4. Uzené sýry5. Sýry s plísní na povrchu

1

2

3

4

Nepa

ram

etric

ké

hodn

ocen

í

Prm

rné

hodn

ocen

í

Ve ejné hodnocení

Inte

rval

spol

ehliv

osti

Kate

gorie

Poad

í odb

orné

ho

hodn

ocen

í

Poad

í ve

ejnéh

o ho

dnoc

ení

Sýr Výrobce (p ihlašovatel)

Odborné hodnocení

Prm

rné

hodn

ocen

í

Inte

rval

spol

ehliv

osti

16

Tabulka III Výsledky Celostátních p ehlídek sýr (kategorie 6 – 10)

tvs suš

[%] [%]

1 2 Niva MADETA a.s. 50 52 74,75 5,08 13,37 82,75 4,52

2 3 Caesar Bleu MADETA a.s. 50 52 70,50 4,61 12,60 79,50 6,67

3 1 Niva Premium MADETA a.s. 60 52 69,75 2,15 17,60 90,33 3,05

4 5 Sýr Niva Mlékárna Otínoves s.r.o. 52 53 52,50 5,82 6,75 69,17 4,69

5 4 Niva - sýr s plísní uvnit hmoty Niva s.r.o. 50 52 49,25 3,92 10,17 75,83 6,02

Jarošovský dezertní pivní sýr Sýrárna Brat í Brunner s.r.o. 40 40 51,75 2,91 71,42 6,51

Excelent s kmínem Moravia Lacto a.s. 45 55 80,75 5,97 81,42 6,28

Bla ácké Zlato s pep em MADETA a.s. 48 51 70,50 9,68 81,75 5,36

Sedl anský Pepin Povltavské mlékárny a.s. 53 45 67,00 3,39 74,33 6,16

Monastére MADETA a.s. 48 51 80,50 6,23 84,17 5,02

Excelent mix Moravia Lacto a.s. 45 55 71,00 9,01 79,17 4,22

Romadur MADETA a.s. 40 44 64,00 6,11 82,50 4,62

Balkánský sýr Mlékárna Polná, spol. s.r.o. 50 42 80,50 0,98 80,08 4,78

Gaston PLASTCOM a.s., Mlékárna P íšovice 50 60 74,50 0,64 78,67 4,78

1 2 Krajanka - termizovaný smetanový sýr KROMILK s.r.o. 50 29 83,40 5,82 15,27 77,93 3,88

2 1 Cottage MADETA a.s. 23 21 82,00 4,85 15,65 78,36 5,70

3 4 Lu ina -Biaktiv 100g Povltavské mlékárny a.s. 46 28 80,40 2,79 11,96 73,00 4,04

4 3 Lu ina sametová 100g Povltavské mlékárny a.s. 70 37 71,00 2,28 13,62 76,00 4,24

1 1 Tartare - chu Francie 80g Povltavské mlékárny a.s. 71 34 80,00 4,05 15,59 79,36 4,37

2 4 Cottage jahoda MADETA a.s. 19 22 78,00 3,25 13,45 76,57 3,57

3 2 Cottage bor vka MADETA a.s. 19 22 73,80 6,09 14,28 77,07 4,16

4 3 Lu ina sv ží zelenina 100g Povltavské mlékárny a.s. 67 35 73,80 2,64 13,79 76,93 2,82

5 5 Cottage pažitka MADETA a.s. 23 21 73,00 5,14 13,39 75,64 5,49

1 1 Jiho eské Lipno - tavený lah dkový sýr MADETA a.s. 64 44 87,40 2,92 19,83 86,36 2,79

2 5 Matador smetanový BEL Sýry esko a.s. 50 38 86,40 1,92 15,47 80,57 3,21

3 2 Smetanito - smetanové BEL Sýry esko a.s. 65 47 85,80 1,80 18,09 84,00 3,37

4 3 TANY smetanový, 150g TANY, spol. s.r.o., Nýrsko 65 45 84,80 3,56 16,81 82,57 3,60

5 4 TANY Delicato, 150g TANY, spol. s.r.o., Nýrsko 70 48 80,20 4,03 15,90 81,00 3,09

6 7 TANY nový smetanový, 140g TANY, spol. s.r.o., Nýrsko 50 40 79,60 4,21 12,57 76,86 3,41

7 6 Smetanito active BEL Sýry esko a.s. 28 31 79,20 4,46 13,63 78,29 3,24

8 9 Apetito SuperCremo TPK spol. s r.o., Mlékárna Hodonín 60 40 73,60 3,08 5,65 62,71 4,99

9 8 Maratonec TPK spol. s r.o., Mlékárna Hodonín 53 41 70,40 4,63 8,57 68,50 4,99

Tu n ozna ené vzorky splnily kritéria pro ud lení diplomu.Katego 6. Sýry s plísní v t st Poznámky: * v kategorii se nehodnotí po adí

7. Speciality (ochucené, bílé a sýry zrající pod mazem) ** nebylo možno vyhodnotit neparametrickým testem8. erstvé a termizované sýry neochucené (v kategorii se nehodnotí po adí)9. erstvé a termizované sýry ochucené10. Tavené sýry neochucené

10

* * **

6

7

8

9

Kate

gorie

Poad

í odb

orné

ho

hodn

ocen

í

Poad

í ve

ejnéh

o ho

dnoc

ení

Sýr Výrobce (p ihlašovatel)

Odborné hodnocení Ve ejné hodnocení

Prm

rné

hodn

ocen

í

Inte

rval

spol

ehliv

osti

Nepa

ram

etric

ké

hodn

ocen

í

Prm

rné

hodn

ocen

í

Inte

rval

spol

ehliv

osti

17

Shoda mezi odborným a ve ejným hodnocením je pom rn dobrá, ve v tšin kategorií sýry s diplomem z odborného hodnocení se umístily v první polovin po adí ve ejného hodnocení. Nejv tší rozdíly byly zaznamenány v kategorii sýr s tvorbou ok a typu moravský blok.

Na rozdíl od lo ského ro níku nebyl žádný sýr hodnocen jako výborný, t. j. v rozmezí 90 až 100 bod (tabulka IV). Nejblíže k této kvalit m l „Eidamský salámový polotvrdý sýr 30 % t. v s.“ (MILTRA B s. r. o.). Pouze jeden sýr byl hodnocen jako podpr m rný.

Porovnání etností hodnocení je uvedeno na obr. 1. Podobn jako v lo ském roce se v obou komisích nej ast ji objevilo hodnocení 75-80 body. Pr m rné hodnocení se lišilo nepatrn (74,6 a 74,9 bodu), bylo tak cca o 1,5 bodu nižší než loni. Ší ka distribuce hodnocení je však u ve ejného hodnocení širší. Ojedin le se zde vyskytovaly hodnocení podpr m rné i nevyhovující a sou asn se zde více objevovalo hodnocení nad 80 bod .

Tabulka IV Rozd lení hodnocených sýr do kvalitativních kategorií

po et vzork % po et vzork %

Výborný (ideální typ) 90 - 100 1 1,5 0 0

Velmi dobrý 75 - 89 39 58,2 33 49,3

Pr m rný (standardní kvalita) 50 - 74 27 40,3 33 49,3

Podpr m rný (min. 30 bod od každé komise) 30 - 49 0 0 1 1,5

Nevyhovující < 30 0 0 0 0

Kvalitativní kategorie Bodové hodnoceníVe ejné hodnocení Odborné hodnocení

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

Bodové hodnocení

Rel

ativ

ní

etno

st [%

]

Hodnocení expertVe ejné hodnocení

Obr. 1. Porovnání relativních etností hodnocení expert a p i ve ejném hodnocení.

18

Také v letošním ro níku bylo hodnocení tuzemských sýr , p edevším zásluhou pana Liklera, dopln no zajímavými sýry z dovozu. Krom šesti p evážn francouzských sýr bylo hodnoceno také p t výrobk ze Slovenska spole nosti NIKA. Tyto sýry jsou posuzovány odd len , hodnotí je všichni lenové odborných komisí i departážní komise. Každý hodnotitel sýr za azujedo kvalitativních kategorií a navíc má právo 3 vzorky, které považuje za nejlepší, navrhnout na diplom. Výsledky jsou uvedeny v tabulce V. Jednozna n nejlépe byl hodnocen dvouplís ový sýr „Bluetta“ spole nosti Lactalis CZ s.r.o., který získal 31 návrh na diplom ze 44 možných. Diplomem byl dále ocen n sýr „Tete de Moine“ (SEAFOOD s. r. o.) a ov í sýr „Etorki“ (Bongrain). Ze slovenských sýr byla ocen na „Tradi ná slovenská bryndza“.

Tabulka V Výsledky Celostátních p ehlídek sýr – zahrani ní vzorky

Mod

us

Med

ián

Tradi ná slovenská bryndza Ov í sýr ze syrového mléka NIKA spol. s r.o. 48% 44% 2 2 12

Bryndziarka Brynzová pomazánka NIKA spol. s r.o. 48% 45% 4 3 1

Koziarka Pomazánka s obsahem kozího mléka NIKA spol. s r.o. 48% 45% 4 4 0

Bryndzauer Tavený sýrový výrobek NIKA spol. s r.o. 3 3 0

Goatauer Tavený sýrový výrobek NIKA spol. s r.o. 3 3 0

Etorki Ov í sýr z pasterovaného mléka Bongrain 50% 1 1 23

Explorateur Smetanový m kký sýr Fruit´s de France 75% 2 2 18

Saint Albray M kký sýr s mazem a plísní na povrchu IMCO s.r.o. 50% 52% 2 2 16

Bluetta Douplís ový sýr Lactalis CZ, s.r.o. 50% 50% 1 1 31

Camembert Président Sýr s plísní na povrchu Lactalis CZ, s.r.o. 45% 45% 2 2 3

Tete de Moine Polotvrdý A.O.C. sýr ze syrového mléka SEAFOOD s.r.o. 51% 60% 1 1 23

Kvalitativní kategorie: Tu n ozna ené vzorky splnily kritéria pro ud lení diplomu.1. Vynikající2. Výborný3. Velmi dobrý4. Pr m rný5. Podpr m rný

Kvalitativní kategorie Návrhy na

diplomySýr Popis Dovozce tvs suš.

Jako v p edchozích ro nících i letos byl program p ehlídek byl dopln n p ednáškami. Bohužel se nemohla uskute nit p ednáška Ing. J. Kopá ka, CSc. ( eskomoravský svaz mlékárenský) s informacemi z posledního Mezinárodního mlékárenského kongresu. Pohotov ho v improvizované p ednášce zastoupil prof. P. Jelen (University of Alberta, Kanada). O perspektivpotraviná ského výzkumu v 7. rámcovém programu hovo il dr. Ch. Patermann z European Commission, DG Research. Na navazujícím seminá i bylo prezentováno 13 p ednášek a trojnásobný po et poster . Obou akcí se dále ú astnilo 16 firem, jejichž innost se dotýká laboratorního vybavení a pot eb pro zpracování mléka.

Kontaktní adresa:Doc. Ing. Ladislav urda, CSc., Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko technologická v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6 e-mail: [email protected]

MLÉKO a SÝRY

P ednášky

21

MIKROBIOLOGICKÉ KRITÉRIÁ PRE HODNOTENIE KVALITY SUROVÉHO KRAVSKÉHO MLIEKA

Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Slovenské centrum po nohospodárskeho výskumu, Výskumný ústav živo íšnej výroby, Nitra

Microbilogical paramaters for evaluation of raw cow milk

Summary:This study deals with characteristics of microbiological contamination in milk within the year round inquiry aiming at supplementary traits of mesophilic and psychrotrophic spore-forming aerobic microflora. It evaluates relations to technologically important groups of microorganisms, proposes limit criterion and a method of cultivation as a means to decrease riskness and prolong the durability of milk foodstuffs. During the time of one year we took samples of raw tank milk 21 times from 14 milk farms (294 samples completely). There were 90,8 % samples with convenient total count of microoganisms, however, after the supplementary traits of mesophilic, psychrotrophic, coliform and spore forming contamination of milk were evaluated, remained only 43,9 % samples, that confirm with limits of the standard STN 57 0529. Introduction of supplementary traits for the selection of raw material would improve the quality and prolong time of durability in milk products. With none of these parameters were observed significant influence of seasons. The proposed limit 200 CFU/ml for mesophilic and psychrotrophic aerobe spore-forming bacteria count (MPAS) is realisable in the studied sphere. We observed 3,1 % cases exceeding this value.

ÚvodNariadenie vlády Slovenskej republiky z 9. júla 2003 . 312/2003 o zdravotných požiadavkách

na výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mlie nych výrobkov vychádza zo smernice Európskeho spolo enstva . 92/46 Hygienické predpisy pre výrobu a predaj mlieka a mlie nych výrobkov. Pod a neho je pri kontrole akosti surového kravského mlieka hlavným mikrobiologickým kritériom celkový po et mezofilných mikroorganizmov (CPM).

alšie mikrobiologické požiadavky (Tab. I) nie sú pre mliekarne záväzné a uplat ujú ich iba výnimo ne. Psychrotrofné mikroorganizmy produkujú zvä ša termostabilné lipolytické a proteolytické extracelulárne enzýmy, ktoré prechádzajú pasterizáciou v aktívnej forme a spôsobujú senzorické chyby mlieka (lipolýza má za následok mydlovitú vô u a horkastú chu ,proteolýza spôsobuje šedú farbu a horkú chu ) a technologické škody tým, že zhoršujú jeho syrárske vlastnosti [12]. Koliformné baktérie sú indikátorom fekálneho zne istenia a možným zdrojom zoonóz. Ich prienik do mlieka sa zamedzuje sanitáciou pri dojení [3].

Vzh adom na najvyššiu schopnos preži pasterizáciu mlieka a následne sa pomnožovavo finálnych výrobkoch, majú zvláštne postavenie v celkovej mikroflóre mlieka spórotvorné mikroorganizmy. Nedajú sa odstráni šetrnou ani vysokou pasterizáciou, prenikajú technológiou UHT [14] i HTST [8]. Prežívajú i 15 sekúnd trvajúci var [1]. Spórotvorné mikroorganizmy sú jednak striktne anaeróbne (SPAN), - prevažne rod Clostridium, naj astejšie Cl. butyricum, Cl. sporogenes, Cl. botulinum, ktoré spôsobujú pri dlhodobom zrení syrov tzv. neskoré nadúvanie tvorbou plynu. Pre výrobu konzumného mlieka a mlie nych výrobkov majú význam baktérie rodu Bacillus, naj astejšie B. cereus, B. licheniformis, B. subtilis, ktorý sa množí v anaeróbnom, aj v aeróbnom prostredí, a je charakteristický širokým okruhom fyziologických variantov, o sa odráža v rozmanitosti mezofilných, termofilných a psychrofilných druhov (MPAS). Rod Bacillus je rizikový potravný patogén so schopnos ou znehodnoti lipo- a proteolytickou enzymatickou aktivitou konzumné mlieko a produkova termolabilný diarhogénny a termostabilný emetický toxín. Tvorba toxínov nie je vždy spojená so známkami pokazenia potraviny, o je nebezpe né pre spotrebite a [2, 10].

Pri prvovýrobe mlieka môžu spórotvorné mikroorganizmy pochádza zo siláže, pôdy a vody. Z tráviaceho traktu dojníc, kde sú schopné sa pomnoži až 10 násobne, sa výkalmi dostávajú na podstielku, na plochy stojiska, výbehu, a na telo dojnice [13]. Štúdium výskytu aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov ukázalo, že najvyšší po et bacilov sa nachádzal vo výkaloch a v siláži, kde hodnoty presahovali 106.g-1. V mlieku bol zistený zvýšený po et sporulátov pri zmene krmiva, ke sa u dojníc prejavovali hna ky [10]. Významné korelácie medzi výskytom

22

spórotvorných baktérií rodu Bacillus v surovom mlieku a výkaloch (r = 0,28, P = 0,05), resp. v krmive a výkaloch (r = 0,35, P = 0,01) sa zistili pri h adaní spôsobov redukcie ich prieniku do mlieka [11]. Štatistická korela ná analýza celkového po tu mikroorganizmov a po tu spór v surovom mlieku od 5882 belgických dodávate ov mlieka ukázala signifikantnú (P 0,01) pozitívnu, avšak slabú (r = 0,3) koreláciu, pri om priemerný CPM bol 104.5 a priemerný po etspórotvorných mikroorganizmov (PSM) bol 102.7 v 1ml mlieka. To znamená, že pre zabezpe enienízkeho po tu spór v dodávanom mlieku sú okrem bežných hygienických postupov potrebné i alšie špecifické h adiská a opatrenia v prvovýrobe [9].

Starostlivos o mikrobiologickú kvalitu kravského mlieka ako suroviny pre výrobu mliekarskych produktov za posledných 15 rokov, odkedy sa zis uje priamymi mikrobiologickými metódami, umožnila významné zlepšenie kvality mlieka - pokles limitu celkového po tu mezofilných mikroorganizmov z 20 000 tis. ml-1 na 50 - 100 tis. ml-1 (trieda kvality Q a I.). Niektorým mliekar am to umožnilo prejs na náro né technologické zameranie v oblasti výroby syrov, ako aj v oblasti predlžovania trvanlivosti erstvých mliekarskych produktov.

Požiadavky spotrebite ov na erstvú chu mlieka a jeho trvanlivos sa snaží sk bi nová technológia PURE-LAC [5]. Ide o ošetrenie mlieka ohrevom na 135°C trvajúce 0,2 sekundy, ktoré zlikviduje 99,9 % kontaminujúcej mikroflóry. Pre dodávate ov suroviny na takéto spracovanie bol zavedený nový ukazovate kvality surového mlieka – po et mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulátov (MPAS), ku ktorému sa uvádza nasledovná definícia a vymedzenie pojmu: Požiadavky na kvalitu surového kravského mlieka zahr ujú jednak pojem spórotvorné anaeróbne mikroorganizmy, ktoré sa po inaktivácii vzoriek pri 85°C po dobu 10 min. kultivujú v anaeróbnych podmienkach, o zahr uje prevažne anaeróbny rod Clostridium. Skúška na ich prítomnos v 0.1ml mlieka musí by negatívna. Druhý ukazovate , ktorý sa ur uje po tepelnej inaktivácii vzoriek mlieka, avšak pri 72 °C po dobu 20 min., je po ettermorezistentných mikroorganizmov, ktoré sa kultivujú v aeróbnych podmienkach, a ich prípustný po et je najviac 2000 v 1 ml mlieka. Pri tomto spôsobe tepelnej inaktivácie prežívajú i niektoré termofilné druhy mikroorganizmov, ktoré však pri pasterizácii odumierajú a ich vitálne formy sa nedostávajú do mlie nych výrobkov. Tepelná inaktivácia pri stanovení MPAS, a to 82°C po as30 min., a kultivácia pri aeróbnych podmienkach umož uje užšie sa zamera na pasterizáciu prežívajúce spóry spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov, prevažne rod Bacillus. Použitímdvoch inkuba ných teplôt, 30°C a 7°C, zistíme po et mezofilných i psychrofilných druhov. Zúženie pojmu oproti termorezistentným mikroorganizmom umož uje i sprísnenie tohto kritéria na navrhovaný po et max. 200 KTJ v 1 ml mlieka. [6].

Predpokladáme, že lokalizácia zdrojov mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulátov a zavedenie tohto kritéria do výberu suroviny by mohlo prinies efekt stability v trvanlivosti a skladovate nosti a zvýšenie bezpe nosti mlie nych potravín, hlavne všetkých typov konzumného mlieka, mlieka a smotany s pred ženou trvanlivos ou a erstvých mlie nych výrobkov. Cie om práce bol celoro ný monitoring bakteriálnej kontaminácie mlieka so zameraním na hodnotenie doplnkových ukazovate ov mezofilnej, psychrotrofnej, a spórotvornej mikrobiálnej kontaminácie mlieka ako suroviny pre zníženie rizikovosti mlie nych potravín.

Materiál a metódyV priebehu jedného roka sme na 14 po nohospodárskych podnikoch vykonali 21 odberov

bazénových vzoriek (celkom 294 vzoriek) surového kravského mlieka v zmysle Metodických pokynov skúšania kvality nakupovaného mlieka MP SR, na konzerváciu bolo použité Heeschenovo inidlo [7]. Vo vzorkách sme stanovili CPM pod a STN ISO 48 33 (1997), PKB pod a STN ISO 48

32 (1997), CPP pod a STN ISO 67 30 (2000). SPAN nao kovaním 1 ml mlieka inaktivovaného pri 85 °C po dobu 10 minút do skúmavky so živnou pôdou mäsopeptónový agar s glukózou (MPAG), a po zaliatí parafínom anaeróbnou kultiváciou pri teplote 37 °C 7 dní. MPAS pod a predpisu TEI 118; Methods in food science microbiology; Psychrotrophic and mesophilic aerobic bacterial spores in milk, ktorý bol dodaný a zavedený v súvislosti so zavedením technológie PURE-LAC v mliekárni PMV Záb eh [6]. Základom postupu je inaktivácia vzorky mlieka pri teplote 80-82 °C

23

po dobu 30 min., nao kovanie 1 ml na kultiva nú Petriho misku a zaliatie živnou pôdou agar s glukózou, tryptónom a kvasni ným extraktom (GTK), obohatenou o 0,1 % škrobu a inkubácia pri 30 °C 72 hod. a následne pri 7 °C 10 dní.

Výsledky a diskusiaCelkový po et mezofilných mikroorganizmov (CPM) v sledovaných vzorkách v priemere

za celé ro né obdobie bol 38 170 KTJ.ml-1, v rozmedzí od 500 do 500 tis. KTJ.ml-1 (Tab I). 90,8 % vzoriek bolo v kategóriách do 100 tis. KTJ.ml-1 (Tab II).

Tabu ka I Kritériá STN 57 0529 a výsledky mikrobiologickej charakteristiky saledovaných vzoriek mlieka

Maximálna povolená hodnota

Záväznosukazovate a

Priemer (KTJ/ml)

Štand.odchylka

Celkový po et mezofilných mikroorganizmov CPM 100 tis. KTJ/ml povinný 38170 7,66.104

Celkový po et psychrotrofných mikroorg. CPP 50 tis. KTJ/ml doplnkový 12536 6,42.108

Po et koliformných baktérií PKB 1000 KTJ/ml doplnkový 698 2,60.106

Spórotvorné anaeróbne baktérie SPAN neg. v 0.1 ml doplnkový 6.3 22

Mezofilné a psychrotrofné aeróbne sporuláty MPAS 200 KTJ/ml navrhovaný 59.4 3052

Tabu ka II Relatívna po etnos výsledkov v jednotlivých kategóriách po tu KTJ.ml-1 [%] KTJ.ml-1 (a) a<=1 1<a<=10 10<a<=102 102<a<=103 103<a<=104 104<a<=105 a>105

CPM - - - 3,74 40,14 46,94 9,18 CPP - - - 40,82 54,08 5,10 - PKB - 1,36 29,93 52,38 15,65 0,68 - MPAS - 8,16 76,87 14,97 - - - SPAN 8,50 73,13 18,37 - - - -

Po et koliformných baktérií (PKB) mal v sledovanom súbore najvyšší varia ný koeficient Vk = 231 %. Výsledky jednotlivých vzoriek boli v rozpätí 5 – 13 000 KTJ.ml-1. Priemerná hodnota celého súboru - 698 KTJ.ml-1, ako aj geometrický priemer - 219 KTJ.ml-1, sved ia o dobrej úrovni v sledovaných chovoch. Zavádzaný systém HACCP a s tým spojené nároky na školených pracovníkov v prvovýrobe zrejme prináša potrebný efekt. 83,7 % vzoriek je v kategóriách do 1000 KTJ.ml-1. Avšak práve tento, prevažne dobre zvládnutý ukazovate môže pri nedostato nejpozornosti obsluhy pri získavaní mlieka zaznamena prudké výnimo né zvýšenie až na hodnoty vo vyšších kategóriách, kde sa zaznamenalo 16,3 % vzoriek.

Znižovanie po tu mezofilných mikroorganizmov v nadojenom mlieku a skladovanie chladeného mlieka dáva priestor pre rozmnožovanie psychrotrofných mikroorganizmov (CPP). Zistený rozsah od 25 až do 150 tis. KTJ.ml-1 poukazuje na nevyrovnanos hodnôt tohto ukazovate a. Predpísaný limit do 50 tis. KTJ ml-1 nesplnilo 5,8 % vzoriek.

Celkový po et mezofilných a psychrotrofných aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov (MPAS) sa pohyboval v rozpätí 2,5 - 340 KTJ.ml-1. Priemerná hodnota bola 59,4 KTJ/ml. 55,4 % vzoriek bolo s po tom do 50 KTJ.ml-1, 85 % nemalo hodnotu vyššiu ako 100, a iba 3,1 % vzoriek malo po et MPAS vä ší ako 200. Vzh adom na to, že táto skupina mikroorganizmov sa tepelným ošetrením mlieka pred spracovaním na mlie ne potraviny neeliminuje, majú aj zdanlivo nízke po tyzávažné negatívne dôsledky pre kvalitu a skladovate nos mlie nych potravín. [4, 15].

24

Zavedenie sledovania tohto ukazovate a do kritérií pre nákup mlieka na spracovanie na erstvé mlie ne potraviny s pred ženou trvanlivos ou by pomohlo zvýši kvalitu týchto potravín, podobne ako v mliekarni PMV Záb eh na Morave [6]. Na základe týchto výsledkov môžeme skonštatova , že po iato ný navrhovaný limit pre po et mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulujúcich baktérií (MPAS) maximálne 200 KTJ.ml-1 je pre sledovanú oblas splnite ný.Spórotvorné anaeróbne mikroorganizmy (SPAN), ktoré sú nežiaduce najmä v mlieku na trvanlivé výrobky a dlhozrejúce syry, boli v rozmedzí 0 - 23, v priemere 6,3 KTJ.ml-1. 49 % vzoriek bolo v kategórii do 5 KTJ.ml-1, o s polovi nou pravdepodobnos ou (P = 0,5) znamená negatívny výsledok pri o kovaní 0,1 ml vzorky mlieka pri zis ovaní splnenia limitu STN.

Pri žiadnom zo sledovaných ukazovate ov sa nepozorovali významné sezónne vplyvy. Analýzou rozptylu sme zistili nízku pravdepodobnos (P < 0,001) zhodnosti priemerov za jednotlivé odbery. Testovaním výsledkov za celé ro né obdobie sme však nezistili štatisticky významný vplyv na stredné hodnoty jednotlivých mikrobiologických ukazovate ov. To znamená, že sa nepreukázal vplyv ro ného obdobia. Hygiena dojenia je zrejme už na takej úrovni, že dokáže eliminova prirodzený vplyv rozdielnej teploty v ro ných obdobiach na schopnos rozmnožovania mikroorganizmov v prostredí maštale. Jednotlivé pozorované zvýšenia niektorých parametrov sa javia skôr ako sporadicky sa vyskytujúce chyby v hygiene dojenia.

Variabilita hodnôt mikrobiologických ukazovate ov u jednotlivých dodávate ov surového kravského mlieka vyjadruje prevádzkovú istotu chovate a z h adiska spe ažovania mlieka [13]. Medzi priemernými hodnotami za sledované farmy a ich štandardnou odchýlkou sme zaznamenali tesné korela né závislosti (pre CPM r = 0,92, pre CPP r = 0,96, pre PKB r = 0,91, pre MPAS r = 0,83). Vyššia štandardná odchýlka pri farmách s vyšším priemerom daného ukazovate a sved ío nevyrovnanosti výsledkov týchto producentov, a o tom, že dosahujú aj nízke hodnoty. Každý zo sledovaných producentov je schopný dosiahnu dobré výsledky, musí sa ale zamerana sústavnos v precíznosti hygieny dojenia.

Tabu ka III Po et vzoriek, ktoré v jednotlivých ukazovate och nesplnili požiadavky kvality. CPM PKB CPP MPAS SPAN Limit [KTJ.ml-1] >100 tis >1 tis. >50 tis. >200 >5

celkovo 27 47 17 9 140 Po etnevyhovujúcichvzoriek

nové prípady(v predošlých uk. vyhovujúce) 29 5 4 100

Po et vyhovujúcich vzoriek. 267 238 233 229 129 % z pôvodného po tu 294 vzoriek 90,8 81,0 79,3 77,9 43,9

V tabu ke III vidíme po et prípadov, ke neboli splnené požiadavky na kvalitu surového kravského mlieka. 267 vzoriek, t.j. 90,8 % z celkového po tu vyhovovalo po stránke CPM. Keodpo ítame vzorky ktoré pri vyhovujúcom CPM nesplnili limit pre PKB, o je 29 vzoriek, ostáva nám 238, t.j. 81 % vzoriek. Nesplnenie požiadavky na CPP vyradí alších 5 vzoriek a limit pre MPAS vyradí ešte 4 vzorky, takže z pôvodného po tu zostáva 229, t.j. 77,9 % vzoriek. SPAN je ukazovate o ividne nesúvisiaci s predošlými požiadavkami, pretože vyra uje alších 100 vzoriek, takže po vyhodnotení všetkých ukazovate ov ostáva 129, t.j. 43,9 % vzoriek, ktoré sú pod amikrobiologických ukazovate ov bezchybné.

25

Záver:Takýto súhrnný poh ad na nakupované surové mlieko by bol žiadúci z h adiska

zachovania pôvodných vlastností, mlie nej chuti a trvanlivosti výrobkov. Doplnkové ukazovatele mikrobiologickej kvality tak môžu ma významnú úlohu pri zvyšovaní kvality surového kravského mlieka a tým i bezpe nosti a funk nosti mlie nych potravín, zvláš pre mliekárne so spracovaním mlieka na náro né produkty z h adiska trvanlivosti, alebo použitia špecifických kultúr, prípadne pre detskú výživu. V nadväznosti na nové kritériá a požiadavky na kvalitu surového kravského mlieka je potrebné prispôsobi im hygienický program v prvovýrobe.

Použitá literatura:1. Abo-Elnaga, H.I. – Hegazi, F.Z. – Abo-Elnaga, I.G.: Spore-forming rods surviving boiling the raw milk

and implicated in later spoilage of the product. In: Arch. Lebensm. - Hyg., 53, 2002, s. 86–89. 2. Beattie, S.H. – Williams, A.G: Growth and diarhoeagenic enterotoxin formation by strains of Bacillus

cereus in vitro in controlled fermentations and in situ in food products and a model food system. In: Food Microbiol., 19, 2002, s. 329–340.

3. Binderová, E. – Ryšánek, D.: Microbial contaminants of milk processed by high-temperature short-time pasteurization. In: Vet. Med. – Czech, 44, 1999, s. 301–307.

4. Greifová, M. – Valík, . – Görner, F. – Petríková, J.: Predikcia trvanlivosti pasterizovaného mlieka z h adiska rastu Bacillus cereus pri (5±1)°C. Bull. potrav. Výsk., 38, 1999, s. 243–250.

5. Hanuš, O. – Kolá , A. – Vylet lová, M. – Pur, I.: erstvé konzumní mléko s prodlouženou trvanlivostí – nová kvalitní potravina pro lidskou výživu. In: Nové trendy v organiza ních, technologických a hygienických postupech nákupu syrového mléka v kontextu podmínek EU (zbor. z medzinár. konf.). Šumperk, Okresní agrární komora, 2001, s. 81–104.

6. Hanuš, O. – Kolá , A. – Pur, I. – Vylet lová, M.: Rozší ení spot ebního potravinového mlé néhosortimentu v R a lokální kvalita suroviny. In: Den mléka 2002 (zbor. z medzinár. konf.). Praha, ZU, 2002, s. 44–48. ISBN 80-213-0900-8

7. Heeschen, W. – Reichmuth, J. – Tolle, A. – Ziedler, H.: Preservation of milk samples for bacteriologic and cytologic examinations and examinations for inhibitors. Milchwissenschaft, 24, 1969, s. 729–734.

8. Mayr, R. – Eppert, I. – Scherer, S.: Incidence and identification of psychrotrophic Bacillus spp. in German HTST pasteurized milk. Milchwissenschaft, 54, 1999, s. 29-30.

9. Rombaut, R. – Dewettinck, K. – de Mangelaere, G. – van Vooren, L. – Huyghebaert, A.: Raw milk microbial quality and production scale of Belgian dairy farms. Milchwissenschaft, 57, 2002, s. 625–628.

10. Lukášová, J. – Vyhnálková, J. – Pá ová, Z.: Bacillus species in raw milk and in the farm environment. In: Milchwissenschaft, 56, 2001, s. 609–611.

11. Vylet lová, M.: Potravní patogeny rodu Bacillus v mléce, metoda odhadu a redukce jejich pr niku do potravního et zce. Výzk. Chovu Skotu, 2002, . 1, s. 24–27.

12. Vylet lová, M. – Hanuš, O. – Urbanová, E. – Kopunecz, P.: Výskyt a identifikace psychrotrofních bakterií s proteolytickou a lipolytickou aktivitou v bazénových vzorcích mléka v podmínkách technologií prvovýrobního uskladn ní. Czech J. Anim. Sci., 45, 2000, s. 373–383.

13. Vylet lová, M. – Hanuš, O. – Pá ová, Z. – Roubal, P. – Kopunecz, P.: Výskyt bakterií rodu Bacillusv syrovém kravském mléce a jejich vztah k ostatním hygienickým ukazatel m. Czech J. Anim. Sci., 46, 2001, s. 260–267.

14. Vylet lová, M. – Švec, P. – Pá ová, Z. – Sedlá ek, I. – Roubal, P.: Výskyt kmen Bacillus cereus aBacillus licheniformis v procesu výroby UHT mléka. Czech J. Anim. Sci., 47, 2002, s. 200–205

15. Valík, . – Lauková, D. – Görner, F.: Obsah Bacillus cereus a celkový po et mikroorganizmov v pasterizovanej smotane. In: Bull. potrav. Výsk., ro . 40, 2001, . 3, s. 209–219.

Kontaktná adresa:Ing. Katarína Kirchnerová, PhD., Slovenské centrum po nohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, [email protected]

26

VLIV RANNÍHO A VE ERNÍHO NÁDOJE NA VYBRANÉ MLÉ NÉ UKAZATELE Skýpala Martin, Chládek Gustav

Ústav chovu a šlecht ní zví at, AF, MZLU Brno

The influence of morning and evening milking on chosen milk parameters

Summary:The aim of this study was efficient influence of morning and evening milking on chosen milk parameters. The samples of milk from Holstein cattle (n = 12) on the first lactation breed on the school farm Žab ice, were analyzed. The dairy cows were bred in the same conditions, i.e. they were in the same stable and they were fed with the same feeding ration. The samples of morning and evening milking were obtained from June to October 2006. The interval between morning and evening milking was (12 + 12 h ± 15 min). We evaluated milk yield (kg), milk protein yield (kg), milk fat yield (kg), milk protein content (%), milk fat content (%), somatic cell count (tis./ml), titratable acidity (SH), rennet coagulation time (s), quality of curd (class). We found high significantly influence (P<0,01) in milk yield (morning 14.2 kg; evening 12.5 kg), milk protein yield (morning 0.46 kg; evening 0.40 kg) and significantly influence (P<0,05) in milk fat yield (morning 0.56 kg; evening 0.52 kg). No significant influence was found in milk protein content, milk fat content, somatic cell count, titratable acidity, rennet coagulation time and quality of curd.

ÚvodMléko p edstavuje složitý biologický systém, ve kterém se nacházejí jednotlivé složky

r zném pom ru a vzájemné vazb (CHLÁDEK, 1993). Jak uvádí ŽIŽLAVSKÝ a MIKŠÍK (2005) lze z vemene získat jednak i sáním teletem a jednak dojením. Moderní strojní dojení vyžaduje úplné a rychlé vydojení mléka za optimálních hygienických podmínek k udržení vysoké mlé néužitkovosti, kvalitního produktu a zdraví zví at za nízkou cenu (BRUCKMAIER, 2001).

Produkce mléka se m ní v pr b hu laktace a je znázor ována lakta ní k ivkou(LANDETE-CASTILLEJOS a GALLEGO, 2000). Produkce mléka a obsah jeho složek vykazuje v pr b hu laktace avšak i v pr b hu dne ur ité zm ny (ŽIŽLAVSKÝ a MIKŠÍK, 1988). TEPLÝ et al. (1979) uvádí p i stabilních podmínkách chovu denní kolísání u množství mléka ± 1,10 kg, u obsahu tuku ±0,75 %, u obsahu bílkovin ± 0,20 %.

Materiál a metodikaV našem pokuse byly analyzovány vzorky mléka dojnic holštýnského plemene (n = 12) na

první laktaci chovaných na ŠZP Žab ice. Dojnice byly chovány ve stejných podmínkách, tj. ve stejné stáji a krmeny shodnou krmnou dávkou. Vzorky z ranního a ve erního dojení byly odebírány pomocí Tru-testu v m sí ních intervalech od ervna do íjna 2006. Interval mezi ranním a ve erním dojením inil (12 + 12 h. ± 15 min). Nádoj byl zjiš ován na dojírn p i odb ru vzork ,obsah tuku a bílkovin a po et somatických bun k byl stanoven ve Výzkumném ústavu pro chov skotu v Rapotín , bílkovina a tuk na p ístroji Milko-scan 133 B a somatické bu ky na SB fossomatic 90. Ostatní ukazatele byly zjišt ny v laborato i Ústavu chovu a šlecht ní zví at MZLU v Brn . Sý itelnost mléka byla stanovena pomocí "Nefelo-turbidimetrického sníma e koagulace mléka" m ící principem popsaným v EJNA a CHLÁDEK (2005). Bylo použito sy idloLaktochym 1:5000 (Milcom Tábor) v množství 1 ml na 50 ml mléka po z ed ní sy idla 1:4. Kvalita byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 50 ml zasý eného mléka p i 35 0C a posouzena dle známé tabulky (GAJD ŠEK, 1999) hodnotící vzhled sý eniny a syrovátky (t ída 1 = nejlepší, t ída 5 = nejhorší). Titra ní kyselost byla provád na dle SN 57 0530 l. 58.

Výsledky a diskuzeMnožství mléka u dojených krav je ovliv ováno adou faktor jako genetika, životní

prost edí, hormonální hladina, úrove výživy a frekvence dojení (LOLLIVIER a MARNET, 2005). Mlé ná výt žnost krav m že být vyjád ena mnoha odlišnými zp soby, nap íklad v kilogramech za laktaci nebo v kilogramech za den. V praxi je realizována mlé ná produkce za dojení. Celková produkce za laktaci je sou et všech produkcí v pr b hu laktace (OUWELTJES, 1998). U ranního vzorku jsme zjistili 14,2 kg mléka, což je množství vysoce statisticky pr kazn vyšší (P<0,01)

27

než u nádoje ve erního (12,5 kg). ŽIŽLAVKÝ a MIKŠÍK (1988) uvádí o 0,8 kg vyšší nádoj ráno než ve er. Nepr kazn nižší množství mléka ve er než ráno uvádí také BRAUNER a HANUŠ (1984). I OUWELTJES (1998) zjistil v tší množství ráno než ve er. SEMJAN et al. (1987) tvrdí, že p i stejném intervalu dojení (12 + 12 hodin) je nádoj mléka stejný. Dojící interval je definován jako as od za átku jednoho dojení do za átku dojení dalšího (LEE et al., 1995). Pokud krávy jsou dojeny v nestejných intervalech, obvykle delší no ní a kratší denní, je pak menší množství mléka (HARGROVE, 1994).

Mlé né bílkoviny jsou z nutri ního hlediska považovány za nejvýznamn jší složku mléka (CHLÁDEK, 1993). Podle HANUŠE (2001) jsou významné i pro zpracovatelskou technologii a také pro možnost kontroly výživy dojnic a tím i zdravotního stavu. Našli jsme vysoce statisticky pr kazný rozdíl (P<0,01) mezi produkcí ráno (0,46 kg) a ve er (0,40 kg). Naopak KLOP I et al. (2003) zjistil ob hodnoty stejné. Co se tý e obsahu bílkovin byla ranní i ve erní hodnota stejná (3,24 %). ŽIŽLAVSKÝ a MIKŠÍK (1988) zjistili ranní obsah bílkovin nepatrn vyšší. Jelikož obsah bílkovin byl statisticky nepr kazný narozdíl od produkce bílkovin, m žeme z toho usoudit, že produkce bílkovin byla ovlivn na nádojem.

Tuk se v mléce vyskytuje v kulovitých globulích v pr m ru od 0,1 m do 15 m. Jejich po et je od 1010 do 1011a ze 100 g mléka by zaujímaly plochu 5 - 11 m2 (GOUDÉDRANCHE et al., 2000). Jak uvádí KLOP I et al. (2003) obsah tuku je nejvíce prom nlivou složkou mléka a závisí na výživ , stádiu laktace, v ku zví ete, ro ním období, klimatických podmínkách, systému dojení, dob dojení, zdraví mlé né žlázy, atd. Zjistili jsme statisticky pr kazn vyšší (P<0,05) množství tuku ráno (0,56) kg než ve er (0,52) kg. Obsah tuku byl nepr kazn vyšší u ve erního dojení (4,18 %) oproti rannímu (4,02 %), což je ve shod se SEDLÁKOVOU (1969) i MIKŠÍKEM (1980). Naopak KLOP I et al. (2003) uvádí ob hodnoty shodné. Stejn jako u bílkovin byla i produkce tuku ovlivn na nádojem.

Po et somatických bun k (PSB) v mléce je p edevším zdravotním ukazatelem vemene, nebo se zvyšuje s výskytem a vzr stem intenzity p edevším infek ního zán tlivého procesu (mastitidy) (GAJD ŠEK, 2003). Obsah somatických bun k v mléce má své fyziologické opodstatn ní. Jedná se o kolostrální a epiteliální t líska, bu ky z krve a mlé né žlázy (ŽIŽLAVSKÝ et al., 1992). Ve zdravé mlé né žláze p evládajícím typem jsou mikrofágy (35-79 %), následují lymfocyty (16-28 %), polymorfonukleární neutrolily (3-26 %) a epiteliální bu ky (2-15 %) (LINDMARK-MÅNSSON et al., 2006). V mnoha zemích je po et somatických bun k používán jako indikátor hygienické kvality mléka a zpen žování syrového mléka (SURIYASATHAPORN et al., 2006). Nalezli jsme statisticky nepr kazn vyšší po et somatických bun k u ve erního nádoje (170 tis./ml), oproti rannímu (147 tis./ml), což je ve shods HARGROVE (1994).

P irozená kyselost mléka je dána obsahem organických kyselin (p evážn kyselina mlé náa kyselina citrónová), obsahem a složením minerálních látek a bílkovin (fosfore nany, kasein). Kyselost vyjad ujeme jako celkovou - titra ní (TK), nebo aktivní - aktuální (POLAHÁR, et al., 1991). Princip m ení je jednotný a je k p ídavku mléka se p idává nezbytné množství alkalického roztoku (hydroxid sodný) o p esné koncentraci až k dosažení bodu ekvivalence, který je ur en pomocí indikátoru, v tšinou fenolftaleinu, který m ní zabarvení roztoku na r žovou p i pH 8,4 (FABRO et al., 2006). Podle SN 57 0529 se u nás považuje za normální mléko o titra ní kyselosti v rozmezí 6,2 až 7,8 (GAJD ŠEK, 2003). V našem sledování vyšla ve erní hodnota nepr kaznvyšší (7,67 SH) oproti ranní hodnot (7,43 SH). Naopak BRAUNER a HANUŠ (1984) uvádí vysoce pr kazné hodnoty u ranního výdojku.

Sy itelnost mléka je základním krokem p i výrob sýr (LÓPEZ et al., 1998). Jsou t id ležité fáze u rychlosti enzymatického srážení mléka: 1. destabilizace koloidního mlé néhosystému pomocí enzymatické hydrolýzy -kaseinu; 2. agregace parakaseinových micel, pozorovaných jako vlo kování a 3. tvorba a rozvoj sí ového gelu, zahajující koagulaci (LAGAUDE et al., 2004). Naše výsledky ukazují tém totožné hodnoty sý itelnosti u ve erního vzorku (249 s.) a u ranního (246 s.). Naopak BRAUNER a HANUŠ (1984) uvádí vysoce pr kazné ranní hodnoty oproti ve erním.

28

Kvalita sý eniny byla hodnocena dle tabulky, kterou uvádí GAJD ŠEK (1999). Z našich výsledk vyplývá, že sý enina z mléka odebraného ráno byla kvalitn jší (t . 1,60), oproti ve erní(t . 1,73). Kv li chyb jící literatu e uvádíme pouze námi zjišt né hodnoty.

Tabulka I Pr m rné hodnoty, jejich sm rodatné odchylky a varia ní koeficienty u ukazatel produkce

Ráno Ve erUkazatel x min. max. Sx Vx x min. max. Sx Vx SP

nádoj (kg) 14,2 6,3 19,7 2,36 16,65 12,5 1,6 17,6 2,47 19,75 ** bílkoviny (kg) 0,46 0,19 0,63 0,08 16,67 0,40 0,05 0,57 0,08 19,67 ** tuk (kg) 0,56 0,3 0,81 0,1 18,21 0,52 0,08 0,82 0,11 20,97 *

**vysoce statisticky pr kazný vliv (P<0,01), *statisticky pr kazný vliv (P<0,05), NS - statisticky nepr kazný vliv

Tabulka II Pr m rné hodnoty, jejich sm rodatné odchylky a varia ní koeficienty u obsahových složek a ukazatele zdravotního stavu


bílkoviny (%) 3,24 2,83 3,99 0,22 6,93 3,24 2,81 4,00 0,23 7,16 NS tuk (%) 4,02 2,63 5,30 0,63 15,71 4,18 3,00 5,78 0,60 14,36 NS PSB (tis./ml) 147 24,0 676 127,4 86,37 170 26,00 791 149,3 87,62 NS


Tabulka III Pr m rné hodnoty, jejich sm rodatné odchylky a varia ní koeficienty u technologických ukazatel


titr. kyselost (SH) 7,43 5,5 9,42 0,79 10,68 7,67 5,72 12,04 1,12 14,66 NS sy itelnost (s) 246 122 688 105,7 43,05 249 89 495 85,52 34,32 NS t ída sý eniny 1,60 1,00 3,00 0,66 41,46 1,73 1,00 3,00 0,81 46,95 NS


10

11

12

13

14

15

16

erven ervenec srpen zá í íjen

nádo

j (kg

)

ranní nádoj (kg) ve erní nádoj (kg)

Graf 1. Zm na množství mléka (kg) u ranního a ve erního nádoje

29

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65


bílk

ovin

y (k

g)

bílkoviny ráno (kg) bílkoviny ve er (kg)

Graf 2. Zm na produkce bílkovin (kg) u ranního a ve erního nádoje

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50


tuk

(kg)

tuk ráno (kg) tuk ve er (kg)

Graf 3. Zm na produkce tuku (kg) u ranního a ve erního nádoje

Záv rZjistili jsme, že produkce mléka se liší nejen v pr b hu laktace, ale i v pr b hu dne. Z

našeho experimentu vyplývá, že více byly ovlivn ny parametry týkající se produkce, oproti ostatním ukazatel m mléka, které jsme sledovali. Vysoce statisticky pr kazný rozdíl jsme nalezli u ranní a ve erní produkce mléka a u produkce mlé ných bílkovin, statisticky pr kazný rozdíl u produkce tuku. Statisticky nepr kazné byly rozdíly u obsahu bílkovin a tuku, po tu somatických bun k, titra ní kyselosti, sy itelnosti a t ídy sý eniny.

Pod kování:P ísp vek byl vypracován s podporou projektu QF 4005.

Použitá literatura:BRAUNER, J., HANUŠ, O.: Technologické vlastnosti mléka a jeho chemické složky u ve erního, ranního a celkového výdojku. Výzkum v chovu skotu, 1984, 3:5-9 BRUCKMAIER, R. M.: Milk ejection during machine milking in dairy cows. Livestock Production Science, 2001, 70:121-124

EJNA, V., CHLÁDEK, G.: A coagulation time of individua milk symplex and its relationship with a number and phase of lactation in Holstein cows. [in Czech] Sborník: Mléko a sýry. 1. vyd. Praha: eská spole nost chemická, 2005, s. 3

30

FABRO, M. A., MILANESIO, H. V., ROBERT, L. M., SPERANZA, J. L., MURPHY, M., RODRÍGUEZ, G., CASTAÑEDA, R.: Technical Note: Determination oj acidity in Whole Raw Milk: Comparison of Results Obtained by Two Different Analytical Methods. J. Dairy Sci., 2006, 89:859-861 GAJD ŠEK, S.: Mléka ství II (cvi ení). Brno: MZLU. 1999, 92 s. GAJD ŠEK, S.: Laktologie. Brno: MZLU. 2003, 84 s. GOUDÉDRANCHE, H., FAQUANT, J., MAUBOIS, J-L.: Fractionation of glibular milk fat by membrane microfiltration. Lait, 2000, 80:93-98 HANUŠ, O.: variabilita a vlivy p sobící na kompozici a relace dusíkatých složek kravského mléka. Sborník: Den mléka 2001, 2001, s. 16-20 HARGROVE, G. L.: Bias in composite milk sampleswith unequal milking intervals. J. Dairy Sci., 1994, 77:1917-1921 CHLÁDEK, G.: Milk yield and level of individual constituents in the milk from dairy cows in the south moravia region. [in Czech] Acta univ. Agric. (Brno), fac.agron., XXXXI, 1993 (3-4), s. 305-311 KLOP I , M., MALOVRH, Š., GORJANC, G., KOVÁ , M., OSTERC, J.: Prediction of daily milk fat and protein cotent using alternating (AT) recordin - g scheme. Czech. J. Anim. Sci., 48, 2003, (11):449-458 LAGAUDE, A., FERNANDEZ, L., CUQ, J-L., MARCHESSEAU, S.: Characterization of curd formation during the renet coagulation of milk by an optical microscopic metod. Inernational Dairy Journal, 2004, 14:1033-1039 LANDETE-CASTILLEJOS, T., GALLEGO, L.: Technical note: The ability of mathematical models to describe the shape of lactation curves. J. Anim. Sci. 2000, 78:3010-3013 LEE, C., POLLAK, E.J., EVERETT, R.W.: Multiplicative factors for estimation of daily milk and component yields from single morning or afternoon tests. J. Dairy Sci., 1995, 78:221-235 LINDMARK-MÅNSSON, H., BRÄNNING, C., ALDÉN, G., PAULSSON, M.: Relatioship between somatic cell count, individua leukocyte populations and milk components in bovine udder quarter milk. International Dairy Journal, 2006, 16:717-727 LOLLIVIER, V., MARNET, P-G.: Galactopoietic effect of milking in lactating Holstein cows: Role of physiological doses of oxytocin. Livestock Production Science, 2005, 95:131-142 LÓPEZ, M. B., LOMHOLT, S. B., QVIST, K. B.: Rheological Properties and Cutting Time of Rennet Gels. Fffects of pH and Enzyme Concentration. International Dairy Journal, 1998, 8: 289-293 MIKŠÍK, J.: Posouzení p esnosti alternativní kontroly mlé né užitkovosti. Acta Universitasis Agriculrirae, 28, 1980, 2:175-181 MIKŠÍK, J., ŽIŽLAVSKÝ, J.: Chov skotu - p ednášky. Brno: MZLU, 2005, 162 s. OUWELTJES, W.: The relationship between milk yield and milking interval in dairy cows. Livestoíck Production Science, 1998, 56:193-201 POLAHÁR, P., BESEDA, I., URIŠOVÁ, E., ŠMIDRIAKOVÁ, M., STANKO, P., VÁL´KA, J.: Hodnotenie niektorých parametrov mlieka pii jeho zníženej a nrmálnej titra nej kyselosti viacrozmernou štatistickou analýzou. Živo . Výr., 36, 1991, 4:329-335 SEDLÁKOVÁ, L.: Kvalita a množství ranního a ve erního mléka u dojnic p i stejném intervalu dojení v souvislosti se systémy krmení. Živo . Výr., 14, 1969, (62):573-582 SEMJAN, Š. et al.: Výroba kvalitného mlieka. Bratislava: Príroda, 1987, 304 s SURYIASATHAPORN, W., VINITKETKUMNUEN, U., CHEWONARIN, T., BOONYAYATRA, S., KREAUSUKON, K., SCHUKKEN, Y.H.: Higher somatic cell counts resulted in higher malondialdehyde concentrations in raw cows' milk. International Dairy Journal, 2006, 16: 1088-1091 TEPLÝ, M. et al.: Mléko a jeho produkce k pr myslovému zpracování. Praha: SNTL, 1979, 376 s. ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J.: Variabilita složek kravského mléka ve ve erním a ranním nádoji p i rozdílné technologii dojení. Živo . Výr., 1988, 33(61):1079-1085 ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J., GAJD ŠEK, S., KUCHTÍK, J.: Somatické bu ky v mléce krav v prvních 100 dnech laktace. Živo . Výr., 34, 1992, 1:359-363

Kontaktní adresa:[email protected], [email protected]

31

PROTEKTIVNÍ KULTURY PRO VÝROBU POLOTVRDÝCH SÝRT ma Št pán, Plocková Milada


Protective cultures for semi-hard cheese production

Summary:In order to suppress the undesirable microorganisms in cheese, different protective techniques can be used. The promising possibility would be the use of lactic acid bacteria, especially lactobacilli as protective cultures.Non-starter lactobacilli constitute the majority of the NSLAB population in semi-hard cheese varieties during ripening and many strains are able to inhibit food spoiling bacteria, moulds, pathogens due to the production of antimicrobial compounds (lactic acid, carbon dioxide, bacteriocin, diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol, organic acid, etc.). In past some of lactobacilli strains isolated from different origin were proved to inhibit broad spectrum of bacteria (E. coli, Bacillus cereus, Candida albicans, Clostridium spp., Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Helicobacter pylori, Salmonella spp., Listeria monocytogenes).The application of protective lactobacilli as adjunct cultures in semi-hard cheese production is however often limited due to its narrow activity spectrum and its inactivation due to the interaction with cheese ingredients. The inhibition activity can be also limited by the occurrence and resistance of the other NSLAB. Investigation the growth-rate, antimicrobial, proteolytic, enzymatic and acidification activities of protective cultures in milk and cheese, as well as production of biogenic amines, production of flavour compounds and the reduction of allergenic milk proteins, is necessary for successful implementation in semi-hard cheese production.

Úvod

V sýrech se mohou vyskytovat nejen žádoucí mikroorganismy, které pozitivn ovliv ujívlastnosti sýra a hrají významnou roli p i výrob a zrání, ale i nežádoucí mikroorganismy, které mohou negativn ovlivnit vlastnosti sýra pop ípad ho naprosto znehodnotit. (4). Mezi žádoucí mikroorganismy pat í bakterie mlé ného kvašení (BMK), tvo ící dominantní mikroflóru u všech typ sýr a hrající významnou roli p i vytvá ení požadovaných vlastností sýra. Zvláštní skupinu BMK tvo í tzv. NSLAB (non-starter lactic acid bacteria = nezákysové bakterie mlé ného kvašení), které se do sýra dostávají z jiných zdroj než ze zákysových kultur (13).

Nej ast jšími nežádoucími mikroorganismy vyskytujícími se v sýrech jsou koliformní bakterie, sporulující bakterie zvlášt Clostridium spp., n které kvasinky, plísn a NSLAB (32).

Bakterie mlé ného kvašení uplat ující se p i výrob a zrání sýr s nízkodoh ívanousý eninou lze rozd lit do t í skupin na zákysové kultury, dopl kové nebo též p ídatné kultury a na NSLAB.

Role zákysových kultur spo ívá p edevším v produkci kyseliny mlé né, ímž se zajiš ujevhodné pH pro srážení mléka. Dále se tyto bakterie ú astní proteolýzy a lipolýzy b hem zrání sýra a v neposlední ad chrání sýr p ed r znými patogeny (pomocí snižování pH a p ípadné produkce bakteriocin a dalších metabolit s antimikrobiálními ú inky) (5). V sýrech jsou z této skupiny zastoupeny nej ast ji druhy z rodu Lactococcus (1)

Dopl kové kultury se p idávají do r zných druh sýr pro dosažení jejich specifických vlastností. Tato skupina se též m že ú astnit procesu zrání nebo m že p sobit bioprotektivn .Jako dopl kové kultury se u polotvrdých sýr asto používají druhy z rodu Lactobacillus (2).

NSLAB mohou negativn i pozitivn ovlivnit kvalitu sýra a vyskytují se p irozen v mléce a okolí. P ispívají p edevším k rozvoji chut a v mnoha p ípadech jsou považovány za žádoucí složku mléka a sýra. Mezi NSLAB pat í nap . Lb casei, Lb. paracasei, Lb. curvatus, Lb. plantarum (1, 2).

V sýra ství se používají laktobacily jako startovací i dopl kové kultury velmi asto a jejich role je rozmanitá (produkce kys. mlé né, protektivní a probiotický ú inek) (17).

Využití NSLAB jako dopl kových kultur v sýra ství musí spl ovat dva základní p edpoklady. Použitý kmen nebo sm s kmen (11) nesm jí negativn ovliv ovat proces zrání a reakce související s proteolýzou bílkovin (2). Za druhé dopl ková kultura by m la inhibovat r st a ú inky ostatních NSLAB a po celou dobu zrání by m la z stat dominantní kulturou v sýru.

32

Krom t chto dvou základních p edpoklad , by se NSLAB nem ly podílet b hem výroby na fermentaci laktosy, m ly by rychle dosáhnout po t (cca 107 KTJ.g-1) na po átku zrání, tento po et by se nem l v pr b hu zrání m nit (11). M ly by disponovat vhodnými proteolytickými enzymy, produkovat volné aminokyseliny se žádanými organoleptickými vlastnostmi (2) a neprodukovat biogenní aminy (7) a pokud možno vykazovat antimikrobiální (antifungální a antiklostridiální vlastnosti) (9 26). Výb r vhodného kmene je velmi náro ný a vyžaduje mnoho testování, než se m že použít pro výrobu sýr (4).

Antimikrobiální vlastnosti laktobacil

BMK používané v potraviná ství jsou schopny inhibovat r st nežádoucích mikroorganism(21, 28) v etn , patogen a mikroorganism zp sobujících kažení potravin, produkcí r zných druhantimikrobiálních látek a tím zvýšit mikrobiální bezpe nost potravin (15, 28). Antimikrobiální vlastnosti mohou mít krom zákysových kultur též laktobacily a další BMK, které jsou sou ástí NSLAB, nebo laktobacily, které se p idávají jako dopl kové kultury (19).

Krom produkce kys. mlé né a CO2, jsou n které BMK (8, 21) schopny produkovat i jiné antimikrobiální látky (bakteriociny, diacetyl, peroxid vodíku, ethanol, organické kys.) (3, 8, 19, 20).

BMK mají p esto r znou schopnost inhibovat r znou škálu mikroorganism (3, 20). Jejich ú inek závisí, na p ítomnosti ostatních mikroorganism (27) a na stavu v kterém se nacházejí (14). Míra r stu a kompetitivita kultury je dále dána adaptací na substrát a adou vn jších i vnit ních faktor v etn redox potenciálu, aktivity vody, pH a teploty. Inhibice jiného mikroorganismu je zp sobená bu sout žením mikroorganism o živiny nebo produkcí antimikrobiálních metabolit(19).

V minulosti byla již identifikována celá ada laktobacil (Lb. acidophilus, Lb. curvatus, Lb. delbrueckii, Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus a Lb. sake) produkujících bakteriociny, které inhibovaly široké spektrum mikroorganism (E. coli, Bacillus cereus, Candida albicans, Clostridium, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Helicobacter pylori, Salmonella, Listeria monocytogenes) (8).

Kysací schopnosti laktobacil

P i výrob sýr se asto krom zákysových bakterií používají dopl kové kultury Lactobacillus spp.. Použití dané dopl kové kultury závisí zejména na kysací schopnosti, r stu v mléce, proteolytické aktivit a odolnosti v i bakteriofág m (16). Schopnost r st a p ežívatv médiu nebo mléce je d ležitá p edevším u zákysových bakterií. P esto i u dopl kových kultur je t eba znát, do jaké míry jsou schopny r st v mléce a fermentovat laktosu a další sacharidy vyskytující se v mléce, a jak se tedy mohou podílet na procesu fermentace spole n se zákysovými bakteriemi (17). Je t eba i vylou it riziko nežádoucího p ekysávání b hem výroby sýra a zpracování mléka (23).

Druhy Lb. casei a Lb. paracasei rostou dob e nejen v mléce, ale i v sýru kde je zvýšená koncentrace NaCl, nízké pH. Díky svým vlastnostem jsou schopny p evážit nad ostatními nežádoucími NSLAB (10).

Dopl kové kultury by m ly co nejrychleji r st v sýru již b hem prvních týdn a dosáhnout max. po t , aby se zabránilo r stu nežádoucích NSLAB (11).

Proteolytické vlastnosti laktobacil

Proteolytický systém laktobacil a NSLAB se skládá ze dvou skupin proteolytických enzym : proteas, které jsou schopny hydrolyzovat bílkoviny a peptidas št pících peptidy vzniklé z bílkovin (31). Proteolytické enzymy hrají významnou roli p i rozkladu kaseinu a peptidza vzniku volných aminokyselin. N které enzymy mají schopnost hydrolyzovat peptidy zodpov dné za ho kou chut sýr (6).

33

Bylo zjišt no, že mnoho laktobacil má lepší proteolytické schopnosti (25) než laktokoky, zejména aminopeptidasovou aktivitu, a tvo í tak lépe volné aminokyseliny. P edpokládá se, že aminopeptidasy jsou zodpov dné za redukci ho kosti v sýrech, nebo št pí tzv. ho ké peptidy (12).

Produkce biogenních amin u laktobacil

Proteolytická aktivita u laktobacil používaných jako dopl kové kultury m že být doprovázena i zvýšenou tvorbou amin (22). Biogenní aminy jsou organické slou eniny vyskytující se v mnoha potravinách a mohou mít toxický ú inek na organismus (7). Biogenní aminy vznikají dekarboxylací aminokyselin pomocí enzym produkovaných BMK. Nej ast ji byl sledován výskyt histaminu, tyraminu a diamin jako prekurzor karcinogenních nitrosamin (22). Negativní produkce biogenních amin je jedním z d ležitých kritérií p i rozhodování, zda daný kmen m žebýt využit pro aplikace p i výrob sýr .

V sýru typu Gouda se mohou vyskytovat laktobacily se zvýšenou proteolytickou aktivitou a produkující biogenní aminy, až v koncentracích 107 KTJ.g-1. Tato koncentrace p esto nemusí zp sobovat zdravotní rizika (22).

Z testovaných BMK (Lactococcus, Enterococcus, Lactobacillus) izolovaných z potravin byla u mnoha kmen prokázána tvorba amin , taktéž u Lactobacillus spp. (7).

Vliv vybraných laktobacil na snižování alergenicity mlé ných bílkovin

Bílkoviny mléka, zejména -laktoglobulin (24) a imunoglobuliny, pat í mezi nej ast jšíalergeny v kravském mléce. P estože jejich koncentrace není p íliš vysoká, mohou zp sobovatalergické reakce p edevším u malých d tí (29). Krom samotných bílkovin mohou vyvolávat alergii i n které peptidy. Zejména u peptid o molekulové hmotnosti nižší než 3000 byla prokázána alergenicita (30).

Schopnost snižovat alergenicitu mlé ných bílkovin byla prokázána i u laktobacil .Probiotický kmene Lb. casei 911 snižoval alergenicitu u ovalbumin – specifických IgE, IgA a IgG1. Schopnost snižovat alergenicitu bílkovin je významná a pat í mezi kriteria pro ozna ování BMK jako probiotické kultury (29).

Protektivní kmen Lb. paracasei ST68

V pr b hu zrání sýra typu Eidam 30% tvs., vyrobeného bez p ídavku dopl kové kultury, bylo izolováno 322 laktobacil ze skupiny NSLAB. U všech laktobacil byla provedena základní fenotypová charakteristika a kmeny byly otestovány na antimikrobiální aktivitu. Bylo vybráno 7 kmen s nejvyšším inhibi ním ú inkem. Tyto kmeny byly dále testovány na antifungální a antiklostridiální aktivitu. Jako potenciální dopl ková protektivní kultura byl vybrán kmen Lb. paracasei ST 68. U tohoto kmene byly stanoveny všechny vlastnosti, které musí spl ovatdopl ková protektivní kultura.

Živé bu ky Lb. paracasei ST68 inhibovaly všechny testované kmeny Clostridium tyrobutyricum 2637, 194, Clostridium butyricum 10702 a Clostridium sporogenes 795.U Lb. paracasei ST68 se ov ila produkce bakteriocinu. Kmen neprodukoval bakteriocin a inhibi ní ú inek je zp soben zatím blíže neidentifikovanou látkou.

Antifungální aktivita Lb. paracasei ST68 se testovala proti Penicillium sp. DMF 0006, Aspergillus niger DMF 0801 a Fusarium proliferatum M 5689 a porovnala se s aktivitou Lactobacillus rhamnosus VT1 a Lactobacillus plantarum DC1246 (popsáno Danisco, Germany). Nejlépe inhibovaly laktobacily r st Fusarium proliferatum M 5689, následn Penicillium sp. DMF 0006. Inhibi ní ú inek proti Aspergillus niger DMF 0801 byl detekovatelný, nicmén byl mnohem slabší ve srovnání s ú inkem proti Fusarium a Penicillium.

34

V mléce rostl Lb. paracasei ST68 h e než v MRS. V pr b hu stacionární fáze byl celkový po et laktobacil již konstantní, a pohyboval se kolem 1. 109 KTJ.ml-1 . V mléce byla kysací schopnost velmi slabá a pH kleslo pouze nepatrn . Lb. paracasei ST68 postrádal výrazn jší schopnost zkvašovat laktosu, jež je hlavním zdrojem sacharid v mléce, na laktát, nebo pokles pH i r st SH b hem r stu tohoto kmene v mléce byl jen velmi pozvolný. Pomalý r st a slabá kysací aktivita byla typická pro mnoho kmen Lb. paracasei a Lb. casei (18, 23).

Proteolytická aktivita u Lb. paracasei ST68 byla srovnatelná s ostatními testovanými kmeny Lb. paracasei izolovaných ze sýr . V porovnání s komer ními kmeny Lb. delbrueckii subsp. lactis 125 a Lb. helveticus 121 vykazoval kmen dvakrát nižší proteolytickou aktivitu. Naopak m laktivitu p ibližn stejnou s komer ním kmenem Lb. casei 163 (17).

Dopl kové kultury s antimikrobiální aktivitou se mohou uplatnit ve sm si s jinými kulturami, které zajistí technologicky nezbytné aktivity (proteolýzu, rychlý rozklad laktosy, proteolytickou aktivitu atd.). D ležité je, aby nem ly aktivity spojené se vznikem vad sýr .

U kmene Lb. paracasei ST68 se testovala produkce amin z histidinu, tyrosinu, ornithinu a lysinu. Kmen neprodukoval po p esn jším m ení ani jeden z amin . Bez znalosti o produkci biogenních amin , by tento, ale i jiné kmeny nem ly být použity p i výrob sýr a i jiných potravin (7).

P i testování alergenicity kaseinu, kmen Lb. paracasei ST 68 snižoval významnalergenicitu kaseinu, po kultivaci v mléce zbylo pouze 27,1% bílkovin které mohou zp sobitalergické reakce. V mléce po kultivaci bez zao kování laktobacilama z stalo 62,5% bílkovin, které mohou zp sobit alergické reakce.

Záv r

Použití protektivních kultur je velice zajímavé, tím spíše že se jedná a p írodní charakter ochrany potravin. Nicmén aplikace p i výrob sýr a dalších produkt je zatím velice komplikovaná, vzhledem k nestabilit kultur v prost edí sýra (15). asto dochází ke ztrátantimikrobiální aktivity v dané potravin . Kultury mají obvykle úzké inhibi ní spektrum proti nežádoucím bakteriím. Jejich r st a inhibi ní ú inek m že být navíc ovlivn n p ítomností NSLAB v sýrech.

Aby mohly být kultury úsp šn použity, je t eba znát jejich r stové schopnosti, antimikrobiální vlastnosti v i bakteriím p irozen se vyskytujících v sýru, proteolytické vlastnosti a schopnost tvo it degradací bílkovin a aminokyselin látky pozitivn ovliv ující v ni a chu .V poslední dob se sleduje produkce biogenních amin , které zp sobují vážné zdravotní problémy.

N které kmeny laktobacil izolovaných ze sýr typu Eidam, vykazovaly antimikrobiální ú inky a jejich další vlastnosti d ležité pro použití jako dopl kové protektivní kultury byly porovnány s vlastnostmi komer ních dopl kových kultur a mají potenciální využití jako protektivníkultury pro výrobu sýr .

Použitá literatura:1. AYAD E.H.E., VERHEUL A., WOUTERS J.T.M., SMIT G.: Population dynamics of

lactococci from industrial, artisanal and non-dairy origins in defined strain strters for Gouda-type cheese. Int. Dairy J., 11, 51-61 (2001)

2. ANTONSSON M., ARDÖ Y.,NILSSON B.F., MOLIN G.: Screening and selection of Lactobacillus strains for use as a adjunct cultures in production of semi-hard cheese. J. of Dairy Research, 69, 457-472 (2002)

3. ATANASSOVA M.R., CHIPEVA V., IVANOVA I., HAERTLÉ T.: Determination of the growth stages of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei M3 from Bulgarian yellow cheese by electroconductivity. J. of Microbiological Methods, 46, 227-233 (2001)

4. BERESFORD T.P., FITZIMONS N.A., N. L. BRENNAN., COGAN T.M.:Recent advances in cheese Microbiol.. Int. Dairy J. 11, 259-274 (2001)

35

5. BERESFORD T., WILLIAMS A.: The Microbiol. of Cheese Ripening. V knize: Cheese:Chemistry, Physics and Microbiol. I-General Aspects (P.F. Fox, ed. ), s. 287-310. Elsevier Applied Sci. Publishers, Ltd., London 2004.

6. BOCKELMANN W.: The proteolytic system of starter and non-starter bacteria components and their importance for cheese ripening. Int. Dairy J. 5, 977-994 (1995)

7. BOVER_CID S., HOLZAPFEL W.H.: Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. of Food Microbiol. 53, 33-41 (1999)

8. CARIDI A.: Selection of Escherichia coli inhibiting strains of Lactobacillus paracasei subsp.paracasei. J. of Industrial Microbiol. and Biotechnology 29, 303-308 (2002)

9. CHRISTIANSEN P., PETERSEN M.H., KASK S., MØLLER P.L., PETERSEN M., NIELSEN E.W., VOGENSEN F.K., ARDÖ Y.: Anticlostridial activity of Lactobacillus isolated from semi-hard cheeses. Int. Dairy J. 15, 901-909 (2005)

10. CURRY B., CROW V.: Lactobacillus spp. V knize: Encyclopedia of Dairy Sci.s (Roginski H., Fuquay J., Fox P.F., ed.), s. 1479-1484, 1488-1501. Academic Press, London 2002

11. CROW V., CURRY B., HAYES M.: The ecology of non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) and their use as adjuncts in New Zealand Cheddar. Int. Dairy J. 11, 275-283 (2001)

12. DAKO E., EL-SODA M., VUILLEMARD J.C., SIMARD R.E.: Autolytic properties and aminopeptidase activities of lactic acid bacteria. Food Research Int. Vol.28, No.5, 503-509 (1995)

13. DEPOUILLY A., DUFRENE F., BEUVIER E., BERTHIER F.: Genotypic characterisation of the dynamics of the lactic acid bacterial population of Comté cheese. Lait, 84, 155-167 (2004)

14. DESMOND C., FITZGERALD G.F., STANTON C., ROSS R.P.: Improved stress tolerance of GroESL-overproducing Lactococcus lactis and Probiotic Lactobacillus paracasei NFBC 338. Applied and environmental Microbiol. 70, 5929-5936 (2004)

15. DEVLIEGHERE F., VERMEIREN L., DEBEVERE J.: New preservation technologies: Possibilities and limitations. Int. Dairy J. 14, 273-285 (2004)

16. GIRAFFA G., ANDRIGHETTO C., ANTONELLO C., GATTI M., LAZZI C., MARCAZZAN G., LOMBARDI A., NEVIANI E.: Genotypic and phenotypic diversity of Lactobacillusdelbrueckii subsp. lactis of dairy origin. Int. J. of Food Microbiol. 91,129-139 (2004)

17. HEBERT E.M., RAYA R.R., TAILLIEZ P., DE GIORI G.S.: Characterization of natural isolates of Lactobacillus strains to be used as starter cultures in dairy fementation. Int. J. of Food Microbiol. 59: 19-27 (2000)

18. HERREROS M.A., FRESNO J.M., PRIETO M.J.G., TORNADIJOM.E.: Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a Spanish goat´s milk cheese). Int. Dairy J. 13, 469-479 (2003)

19. HOLZAPFEL W.H., GEISEN R., SCHILLINGER U.: Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes. Int. J. of Food Microbiol.24, 343-362 (1995)

20. HUTTUNEN E., NORO K., YANG Z.: Purification and identification of antimicrobial substances produced by two Lactobacillus casei strains. Int. Dairy J. 5, 503-513 (1995)

21. JACK R.W., TAGG J.K., RAY B.: Bacteriocins of Gram positive bacteria. Microbiological Reviews 59, 171-200 (1995)

22. JOOSTEN H.M.L.J, NORTHOLT M.D.: Detection, growth, an amine-producing kapacity of lactobacilli in cheese. Applied and Environmental Mikrobiology 55, 2356-2359 (1989)

23. KASK S., ADAMBERG K., ORLOWSKI A., VOGENSEN F.K., MØLLER P.L., ARDO Y., PAALME T.: Physiological properties of Lactobacillus paracasei, Lactobacillus danicus and Lactobacillus curvatus strains isolated from Estonian semi-hard cheese. Food Research Int., 36, 1037-1046 (2003)

24. KLEBER N., WEYRICH U., HINRICHS J.: Screening for lactic acid bakteria with potential to redukce antigenic response of -lactoglobulin in bovine skim milk and sweet whey. InnovativeFood Sci. and Emerging Technologies 7, 233-238 (2006)

36

25. LAAN H., TAN S.E., BRUINENBERG P., LIMSOWTIN G., BROOME M.: Aminopeptidase activities of starter and Non-starter lactic acid bacteria under simulated Cheddar cheese ripening conditions. Int. Dairy J, 8, 267-274 (1998)

26. MAGNUSSON J., STRÖM K., ROSS S., SJÖRGEN J., SCHNÜRER J.: Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Letters 219, 129-135 (2003)

27. NIKU-PAAVOLA M.L., LAITILA A., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A.: New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J. of Apllied Microbiol. 86, 29-35 (1999)

28. PLOCKOVÁ M., CHUMCHALOVA J., GIESOVÁ M., BOUŠKOVÁ O.: Antifungal effectiveness of Lactobacillus rhamnosus VT1 at different temperatures. Advances in Food Sci.s, Vol 26, No.2, 64-68 (2004)

29. PRIOULT G., PECQUET S., FLISS I.: Allergenicity of acidit peptides from bovine -lactoglobulin is reduced by hydrolysis with Bifidobacterium lactis NCC362 enzymes. Int. Dairy J. 15, 439-448 (2005)

30. PUERTA A., DIEZ-MASA J.C., FRUTOS M.: Immunochromatographic determination of -lactoglobulin and its antigenic peptides in hypoallergenic formulas. Int. Dairy J. 16, 406-414 (2006)

31. SASAKI M., BOSMAN B.W., TAN P.S.T.: Comparison of proteolytic activities in various lactobacilli. J. of Dairy Research 62, 601-610 (1995)

32. VAN DEN BERG: Dutch type cheese. In: Roginsky H. (Ed.), Encyclopedia of Dairy Sci., vol.1. Academic Press, London 371-377 (2003)

Kontaktní adresa:Št pán T ma, VŠCHT Praha, Ústav Technologie mléka a tuk , Technická 3, Praha 6, 166 28, [email protected], tel: 220 44 32 74

37

VLIV DOBY A TEPLOTY SKLADOVÁNÍ NA KONZISTENCI STERILOVANÝCH TAVENÝCH SÝR

Bu ka František1, Št tina Ji í2, Hrab Jan1

1Ústav potraviná ského inženýrství, FT UTB ve Zlín ,2Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha

Effect of storage time and temperature on consistency of sterilized processed cheese

Summary:The influence of 2-years storage period at temperatures of 8 2 °C and 23 2 °C on consistency of sterilized processed cheese was evaluated. The change of consistency was observed by instrumental methods (puncture test and dynamic oscillating rheometry) and also by sensory analysis (scale method and paired comparison test). The firmness of sterilized processed cheeses stored at 8 °C kept increasing within the 24 months. The rise in firmness achieved in the products stored at 23 °C was followed by its decrease in the second year. Therefore the cheeses stored at a higher temperature were first firmer than the products stored at 8°C but they became softer during a longer storage period. The increasing in firmness of processed cheeses and worsening of spreadability was caused by an increased proportion of elasticity. Different trends were observed for processed cheese with whey powder in formulation.

Úvod

Sterilované tavené sýry jsou obvyklou sou ástí bojových dávek potravin, které jsou vydávány voják m v situacích, kdy jim není možné zabezpe it teplou stravu (odlou ení od jednotky, bojové nasazení aj.). V sou asnosti bojové dávky potravin rovn ž využívány k zabezpe ení len m Integrovaného záchranného systému p i jejich opera ním nasazení. Jednotlivé potravinové komponenty by m ly mít dobu minimální trvanlivosti nejmén 2 roky p i okolní teplot (požadavek Standardization Agreement – STANAG 2937)1. Jednou z možností, jak v sou asné dob dosáhnout u taveného sýra doby minimální trvanlivosti 2 let, je jeho termosterilace.

V roce 2003 byly provedeny experimenty, které zkoumaly vliv definovaného sterila níhozáh evu (117 °C po dobu 20 minut) na konzistenci tavených sýr . Sterilované tavené sýry m lytužší konzistenci než odpovídající vzorky nesterilované2. N kolikaleté skladování p i vyšších než chladírenských teplotách mohou rovn ž zap í init významné zm ny jakosti tavených sýr .V dostupné literatu e se však o procesech probíhajících ve sterilovaných tavených sýrech p i dlouhodobém skladování mnoho informací nevyskytuje.

Diskutovaným jevem p i skladování tavených sýr je hydrolýza tavicích solí – zejména polyfosfát , p i které vznikají slou eniny s nižší molekulovou hmotností. Snižování po tu monomer v lineární et zci polyfosfátu má pravd podobn za následek pokles afinity t chto hydrolyzovaných polyfosfát k vápenatým iont m a tím jejich postupné uvol ování3. Vápenaté ionty uvoln né z tavicích solí se mohou zapojovat do dodate ného zesí ování proteinové matrice, v d sledku ehož m že docházet ke zvyšování tuhosti tavených sýr b hem skladování. Nejen vápenaté ionty, ale i hydrolýzou vzniklé nižší polyfosfáty se pravd podobn mohou zapojit do interakcí s bílkovinami, což m že rovn ž vést k jejich dalšímu zesí ování. Hydrolyza ní reakce polyfosfát probíhají intenzivn ji v kyselé oblasti pH a za p sobení vyšších teplot3-7.

Naopak skladování p i nižších teplotách m že vést k tvorb krystal tavicích solí5. Podle UHLMANNa8 et al. se krystaly citrát viditeln projevují daleko ast ji než krystaly fosfáta polyfosfát . Krystalizaci však mohou podléhat i další složky tavených sýr , nap íklad n kteréaminokyseliny (zejména tyrozin) a jejich soli, laktóza a laktáty.

Cílem práce posoudit zm ny konzistence sterilovaných tavených sýr b hem jejich skladování po dobu 24 m síc p i dvou r zných teplotách: chladírenské teplot (8 2 °C) a okolní – pokojové – teplot (23 2 °C).

38

Materiál a metody

Skladovací pokus byl založen se 4 adami sterilovaných tavených sýr (sušina 40 % w/w, tuk v sušin 45 % w/w), z nichž první dv byly vyrobeny v roce 2002 v tehdejší Želetavské sýrárn , a. s. ( ady I a II) a další dv v roce 2003 ve spole nosti MADETA, a. s. ( ady III a IV). K výrob tavených sýr byla použita sm s p írodních sýr , máslo, tvaroh, voda a tavicí soli (fosfátové a polyfosfátové tavicí soli, u ad I a II byly použity rovn ž citrátové tavicí soli). Je t eba zmínit odlišnost u tvrté (poslední) výroby, kde byla do surovinové skladby použita sušená syrovátka v množství 0,5 % w/w. Celková doba tavení byla 5 minut a tavicí teplota 91 oC ( ady I a II), resp. 94 °C( ady III a IV). Tavenina byla pln na do 100-gramových obal z taženého hliníku uzav ených p iva itelným hliníkovým ví kem. Následoval sterila ní záh ev, který byl proveden ve sterilátoru LUBECA p i teplot 117 °C s výdrží 20 minut, po té byly vzorky ve sterilátoru zchlazeny na 25 °C a odebrány ke skladovacím pokus m p i r zných teplotách. Sterilované tavené sýry skladované p i chladírenské teplot 8 2 °C, jsou ozna ovány jako „L“ a ty, které byly skladování p i teplot 23 2 °C, jsou v této práci pod kódy „S“. Arabská íslice za mezerou pak ozna uje dobu skladování v m sících. Ozna ení „LII_24“ tedy znamená sterilovaný tavený sýr II. ady skladovaný 24 m síc p i teplot 8 2 °C.

Hodnocení konzistence tavených sýr bylo provedeno p i pokojové teplot (23 2 oC) po temperaci vzorku v obalu po dobu cca 3 hodin. Tuhost tavených sýr byla hodnocena penetrometricky pomocí Instron Universal testing machine Series 5500 (Instron Ltd, High Wycombe, UK). Byla sledována síla pot ebná na vtla ování válcové sondy o pr m ru 6 mm rychlostí 1 mm/s do spodní strany vzorku po odstran ní obalu. Tuhost vzorku pak vyjad uje plocha pod tzv. zat žovací k ivkou, tzn. práce vynaložená na vtla ení sondy do hloubky 10 mm (N.mm).

Viskoelastické vlastnosti v oblasti malých nedestruktivních deformací byly hodnoceny dynamickou oscila ní reometrií na reometru RS80 (Haake, N mecko) v systému deska – deska (pr m r 35 mm, vzdálenost desek 1 mm). Byla sledována amplituda a úhel fázového posunu smykové deformace v závislosti na amplitud smykového nap tí (5 – 10 000 Pa, m ení bylo ukon eno p i p ekro ení smykové deformace 50 s-1) p i frekvenci oscilace 1 Hz. Pro srovnání vzork byly použity hodnoty p i amplitud nap tí 100 Pa, která byla vždy v lineární viskoelastické oblasti. Tuhost vzorku pak vyjad uje komplexní modul pružnosti ve smyku zahrnující elastickou (pam ový modul G´) a viskózní složku (ztrátový modul G“). Podíl elastické složky na reologických vlastnostech vzorku pak vyjad uje tangens úhlu fázového posunu tan = G´´/G´ (pro ist elastickou látku tan = 0). Komplexní modul pružnosti i pam ový modul vykazovaly vysokou korelaci (r=0,952) s tuhostí taveného sýra stanovenou penetrometricky. Proto jsou dále diskutovány pouze hodnoty tan vyjad ující podíl elasticity.

V rámci senzorické analýzy byl sledován vliv doby a teploty skladování na konzistenci sterilovaných tavených sýr . Hodnocení bylo provedeno pomocí p tibodových jakostních ordinálních stupnic s charakteristikou každého stupn . První stupe byl vyhrazen úrovni „vynikající“ a pátý stupe úrovni „nevyhovující“. Stupnicové metody byly dopln ny párovou porovnávací zkouškou (srovnávaným znakem byla tuhost sterilovaného taveného sýra), která dovoluje zachytit mezi srovnávanými vzorky menší odchylky ve srovnání se stupnicovými metodami. Statistické vyhodnocení bylo provedeno u stupnicových metod jednofaktorovou neparametrickou analýzou rozptylu (Kruskal-Wallis v test) a u párových porovnávacích zkoušek testem o parametru binomického rozd lení9.

Výsledky a diskuze

V pr b hu dvouletého skladování sterilovaných tavených sýr se m nila jejich konzistence. Z penetrometrického hodnocení vyplývá (viz obrázek 1), že u sterilovaných výrobkady I a II uložených 2 roky p i 8 2 °C dochází po po áte ním poklesu tuhosti (6. m síc) k jejímu

neustálému zvyšování až do 24. m síce skladování. U III. ady hodnoty v jednotlivých m sících

39

kolísají, celkov se však tuhost s nar stající dobou uložení p i 8 2oC zvyšuje oproti vstupnímu m ení. U ady IV dochází naopak ve druhém roce skladování p i 8 2 °C ke snižování tuhosti. Z oscila ní dynamické reometrie (viz obrázek 2) lze pak posoudit jak se na tuhosti sýr podílela elasticita. Výsledky penetrometrické analýzy byly dopln ny prost ednictvím hodnot tan , které byly získány metodou dynamické oscila ní reometrie (viz obrázek 2). U sterilovaných tavených sýr ady I a II uložených p i 8 2 °C se se podíl elasticity zvyšoval v pr b hu dvouletého skladování. Hodnoty tan se snižovaly, tzn. že více p evažovaly hodnoty elastického modulu pružnosti G´ nad ztrátovým modulem pružnosti G´´. Zvýšení tuhosti a zhoršení roztíratelnosti je tedy zap í in né zvýšením elasticity produktu. Naopak u ady IV bylo snížení tuhosti zjišt népenetrometickým m ením doprovázeno postupným snižováním podílu elasticity (zvýšení tan )v pr b hu dvouletého skladování p i 8 2 °C. Nutno poznamenat, že sýry výroby IV vykazovaly celkov podstatn menší tuhost a menší podíl elasticity než ostatní vzorky (obrázky 1 a 2).

A

0

5

10

15

0 5 10 15 20 25doba skladování (m síce)

tuho

st (N

.mm

)

B

0

5

10

15


tuho

st (N

.mm

)

C

0

5

10

15


tuho

st (N

.mm

)

D

0

5

10

15


tuho

st (N

.mm

)

Obr. 1. Vývoj hodnot tuhosti ur ované penetrometricky (N.mm) b hem skladování sterilovaných tavených sýr uchovávaných p i teplot 8 2 °C ( , regresní trend erchovanou arou) a 23 2 °C ( , regresní trend plnou arou) u 4 posuzovaných ad; A – ada I, B – ada II, C – ada III, D – ada IV

40

A

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 6 12 18 24doba skladování (m síce)

tan

(-)

B

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5


tan

(-)

C

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5


tan

(-)

D

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


tan

(-)

Obr. 2. Vývoj hodnot tangentu úhlu fázového posunu (tan ) b hem skladování sterilovaných tavených sýr uchovávaných p i teplot 8 2 °C ( , regresní trend erchovanou arou) a 23 2 °C ( , regresní trend plnou arou) u 4 posuzovaných ad; A – ada I, B – ada II, C – ada III, D – ada IV

Vývoj konzistence výrobk byl p i vyšší skladovací teplot odlišný, což vyplývá z porovnání konzisten ních charakteristik u produkt skladovaných p i 8 2 °C a 23 2 °C (obrázek 1). U sterilovaných tavených sýr ady I, II a III došlo u výrobk skladovaných p i 23 2 °C nejprve ke zvýšení tuhosti pozd ji ale následované poklesem až pod po áte ní úrove .Sýry skladované p i vyšší teplot byly tedy nejprve tužší než produkty uložené p i 8 2 °C, ale p i delším skladování naopak m k í. U jednotlivých ad ale k poklesu tuhosti a ke snížení pod tuhost sterilovaných tavených sýr skladovaných p i 8 2 °C došlo po jiné dob skladování. U ady III tato zm na nastala již 6 m síci skladování, u ady I po 12. m síci a u ady II až na konci skladování (24 m síc ). Výsledky dynamické oscila ní reometrie (hodnoty tan , obrázek 2) ukazují, že zm ny tuhosti byly op t v tšinou doprovázeny zm nou podílu elasticity, i když v n kterých p ípadech došlo k jistému asovému posunu . V ad p ípad potvrdilo tyto zm ny i senzorické hodnocení párovou porovnávací zkouškou (nap . ada I na hladin významnosti P < 0.05). Ovšem u ady III sice instrumentální metody ukazují na rozdíly ve sterilovaných tavených sýrech uložených p i dvou r zných teplotách, senzoricky (párová porovnávací zkouška) však rozdíly mezi produkty skladovanými p i 8 2 °C a 23 2 °C prokázány nebyly (P 0.05).

41

U ady II byly sterilované tavené sýry uložené p i 8 2 °C tužší než produkty skladované p i 23 2 °C až po 18. m síci, což ukazují jak výsledky penetrometrie a dynamické oscila níreometrie tak i párové porovnávací zkoušky (P < 0.05). Celkov odlišný vývoj byl zaznamenán u sterilovaných tavených sýr ady IV. Penetrometrie i párová porovnávací zkouška (P < 0.05) ukazuje, že po 12. m síci skladování se výrobky uložené p i 23 2 °C stávají tužšími než produkty skladované p i 8 2 °C. Hodnoty tan indikují zm nu až po 18. m síci skladování. Vysv tlení odlišnosti vzhledem k adám I, II a III lze op t hledat ve zm n tavicích solí a p ídavku sušené syrovátky. Hédonicky byla konzistence výrobk všech ad v pr b hu skladování p i 8 2 °C hodnocena lépe nebo stejn ve srovnání s produkty uloženými p i 23 2 °C (viz tabulka I).

Tabulka I Výsledky senzorického hodnocení konzistence sterilovaných tavených sýr 5ti bodovou hédonickou stupnicí* (uveden medián zjišt ných hodnot).

adaTeplotaskladování

Dobaskladování I II III IV 0 m síc 3 3 3 3 6 m síc 3 3 3 2 12 m síc 3 4 3 2 18 m síc 3 4 2 2

8 2oC

24 m síc 2 3 3 2 6 m síc 3 4 4 4 12 m síc 4 4 3 3 18 m síc 3 4 3 3 23 2oC

24 m síc 3 3 3 3 * 1 – vynikající, 2 – výborný, 3 – dobrý, 4 – mén dobrý, 5 – nevyhovující

Vysv tlení konzisten ních zm n sterilovaných tavených sýr lze nalézt nap íkladv hydrolýze polyfosfátových tavicích solí, která byla zapo ata již p i procesu tavení a pokra ovalai p i sterila ním záh evu. Zde se mohly do zesí ování proteinové matrice pravd podobn uplatnit nejen uvoln né vápenaté ionty, ale jak nazna ují n které publikace3,5 i samotné fosfáty a difosfáty. Vyšší nár st tuhosti u tavených sýr skladovaných 3 m síce p i vyšších teplotách oproti produktskladovaným chladírensky publikovali i TAMIME et al.6 a AWAD et al.10. Podle FRIEDMANa11

a KRISTENSENa et al.12 se do zesí ování proteinové matrice mohou b hem skladování zapojit i meziprodukty a produkty reakcí bílkovin (nap . Maillardovy reakce). Je rovn ž možné p edpokládat, že vlivem sterilace i v pr b hu skladování dojde ke snížení molekulové hmotnosti p ítomných protein a peptid , což rovn ž m že ovlivnit konzistenci.

Ze zjišt ných zm n konzistence sterilovaných tavených sýr lze tedy usuzovat, že v pr b hu skladování dochází sou asn ke dv ma jev m. Na jedné stran se vytvá í nové vazby mezi bílkovinami, což vede ke zvyšování tuhosti a podílu elasticity. Sou asn ale z ejm m žedocházet též k degradaci, resp. hydrolýze, bílkovin, nap . zbytkovou aktivitou termostabilních proteáz. Když tento proces p eváží nad tvorbou nových vazeb, což mohlo nastat p i vyšší teplotskladování, resp. d íve než by tomu bylo nižší teplot , dojde k poklesu tuhosti a elasticity. Hypotézu o degradaci bílkovin podporuje i zhoršení chuti a v n výrobk b hem skladování. Pro potvrzení této domn nky je však pot eba dalších experiment , které by sledovaly i možnou proteolýzu bílkovin.

42

Záv r

V práci byl zkoumán vliv teploty a doby skladování sterilovaných tavených sýr na jejich konzistenci. Konzistence sterilovaných tavených sýr se v pr b hu dvouletého skladování m ní.U v tšiny výrobk skladovaných p i 8 2 °C se v pr b hu 2 let tuhost postupn zvyšuje. Sterilované tavené sýry uložené p i teplot 23 2 °C ( ada I, II a IV) se ve 2. roce skladování stávají mén tuhými než výrobky uchovávané p i 8 2 °C. D ležitou roli ve vývoji konzistence sterilovaných tavených sýr sehrává i vhodná volba tavicích solí.

Pod kováníPráce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101.

Použitá literatura:1. Standarditation Agreement (STANAG) 2937. Survival, Emergency and Individual Combat

Ration - Nutritional Values and Packaging., 3. ed., NATO/MAS, Brussels 2001. 2. BU KA, F., ŠT TINA, J., HRAB , J. Vliv sterila ního záh evu na konzistenci a barvu

taveného sýra. In: Sborník Celostátní p ehlídky sýr 2003., s. 60 – 65, eská spole nostchemická, Praha 2003.

3. MOLINS, R.A. Phosphates in food., s.261, CRC Press, Boca Raton 1991.4. SCHÄR, W a BOSSET, J.O. Chemical and Physico-chemical Changes in Processed Cheese and

Ready-made Fondue During Storage - A Review. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 35, 2002, 15 – 20.

5. CARI , M., KALÁB, M. Processed cheese products. In Fox, P.F. (ed.) Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2. Major Cheese Groups, s. 467 – 505, 2. ed. Elsevier Applied Science, London and New York 1997.

6. TAMIME, A. Y., KALAB, M. DAVIES, G., YOUNIS, M. F. Microstructure and firmness of processed cheese manufactured from Cheddar cheese and skim milk powder cheese base. Food Structure, 9, 1990, 23 – 37.

7. NEY, K. H. Gerät zur Messung des Biegebruchverhaltens von Schmelzkäsescheiben. Alimenta, 2, 1988, 31 – 36.

8. UHLMANN, G., KLOSTERMEYER, H., MERKENICH, K. Kristallisations-erscheinungen in Schmelzkäseprodukten - I. Phänomen und Ursachen. Milchwissenschaft, 38, 1983, 582 – 585.

9. HRAB , J., K ÍŽ, O., BU KA, F. Statistické metody v senzorické analýze potravin, s. 114, 1. vyd., VVŠ PV, Vyškov 2001.

10. AWAD, R.A., ABDEL-HAMID, L.B., EL-SHABRAWY, S.A., SINGH, R.K. Texture and Microstructure of Block Type Processed Cheese with Formulated Emulsifying Salt Mixtures. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 35, 2002, 54 – 61.

11. FRIEDMAN, M. Food Browning and Its prevention: An Overview. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44, 1996, 631 – 653.

12. KRISTENSEN, D., HANSEN, E., ARNDAL, A., TRINDERUP, R.A., SKIBSTED, L.H. Influence of light and temperature on the colour and oxidative stability of processed cheese. International Dairy Journal, 11, 2001, 837 – 843.

Kontaktní adresa:Ing. František Bu ka, Ph.D., Ústav potraviná ského inženýrství a chemie, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. 576 031 528, e-mail: [email protected]

43

P ÍPRAVA ENZYMOVÝCH HYDROLYZÁT V MEMBRÁNOVÉM REAKTORU. urda Ladislav, Vaverková Ivana, Mišún Daniel

Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

Preparation of enzyme hydrolysates in membrane reactor.

Summary:Functional and sensory properties of whey proteins can be modified by enzymic hydrolysis. Batch processes are usually used for this purpose, higher process productivity is achieved in membrane reactor operated in continuous mode. Whey protein concentrate solution containing 2 % of proteins was hydrolyzed by enzyme Promod 439L (Biocatalyst, UK) at 40 °C, initial pH 6.5, at different enzyme – substrate ratio and with different residence times. Degree of hydrolysis and capacity of the reactor could be controlled by these parameters. More steady composition of hydrolysate is achieved by the prehydrolysis of the whey protein solution for the same time as the mean residence time. We can obtain at least seven times more of hydrolysate in continuous membrane reactor in comparison with batch mode.

ÚvodPro hydrolýzu bílkovin nebo sacharid lze s výhodou využít enzymových reakcí,

protože jsou pro potraviná ské aplikace relativn bezpe né a probíhají za mírných podmínek. Jednou z nevýhod této technologie je obvykle vysoká cena enzymu. Náklady na enzym se mohou snížit jeho opakovaným využitím prost ednictvím imobilizace na vhodný nosi nebo membrá-nového reaktoru. Oba postupy p inášejí výhodu možné kontinualizace procesu. Imobilizace enzymu vyžaduje obvykle náro nou p ípravu, dochází ke ztrát ásti aktivity enzymu, ne ve všech p ípadech je imobilizovaný enzym stabilní. Enzymový reaktor je naproti tomu zejména pro hydrolytické reakce vhodný, protože enzym je zadržován ultrafiltra ní membránou, zatímco produkty hydrolýzy procházejí membránou do permeátu. Odstra ování produktu z reak ní sm si posouvá reak nírovnováhu žádoucím sm rem a omezuje pom rn astou inhibici enzymu produkty reakce. V membránovém reaktoru rovn ž odpadá nutnost inaktivace enzymu. Techniky imobilizace a membránového reaktoru mohou být spojeny, pokud je enzym imobilizován na membrán 1.

V závislosti na typu aplikace m že mít membránový reaktor další výhody. Pokud substrát neprochází membránou, jako tomu je nap . p i hydrolýze bílkovin, z stává zadržen v reak ní sm si,dokud není hydrolyzován, a nekontaminuje tak produkt. V hydrolyzátu pak m žeme navíc pomocí zvolené membrány ídit maximální velikost peptid podle požadovaných vlastností hydrolyzátu2.

P i zpracování syrovátky lze MBR využít nap . pro hydrolýzu laktosy nebo bílkovin. O hydrolýze laktosy, respektive o kontinuální p íprav galakto-oligosacharid v membránovém reaktoru již bylo na seminá i Mléko a sýry referováno3.

Cílem enzymové hydrolýzy bílkovin je ovlivnit jejich funk ní vlastnosti (emulgace, rozpustnost i p i vyšších teplotách, tvorba gelu a p ny, reologické vlastnosti) nebo nutri nívlastnosti (stravitelnost a vst ebatelnost, alergenicita, vznik biologicky aktivních peptid jako jsou inhibitory ACE a peptidy s bakteriostatickým p sobením). Znalosti o pr b hu reakce v membránovém reaktoru a možnostech jeho regulace jsou d ležité pro kvalitu výsledného produktu, nadm rná hydrolýza bílkovin vede ke špatným senzorickým vlastnostem a vysoké osmolalit , p i nedostate né hydrolýze nejsou rozšt peny sekvence s antigenními vlastnostmi2.Obecn lze konstatovat, že enzymová modifikace v membránovém reaktoru zna n rozši ujeaplika ní možnosti syrovátky.

Použité materiály a metody Jako substrát byl použit obnovený koncentrát syrovátkových bílkovin (PML, a.s., Nový

Bydžov) s výslednou koncentrací bílkovin 20 mg·ml-1. Substrát byl hydrolyzován enzymem Promod 439L (Biocatalyst, UK), alkalickou peptidasou serinového typu, která je produkovaná kmenem Bacillus licheniformis. Podmínky enzymové hydrolýzy byly následující: pom renzym/substrát (E/S) 1:100 a 1:500, teplota 40 °C, pH – bez úpravy (6,5). Reaktor byl pro vsádkové pokusy sklen ný s temperovaným plášt m a magnetickým mícháním o objemu 200 ml.

44

Jako membránový reaktor sloužila jednotka Arno 700 (Mikropur, s.r.o., Hradec Králové) s keramickou membránou (TAMI Industries, N mecko) s d lící mezí 8 kDa, doba zdržení v reaktoru byla 15, 30, 60, 120 min, výchozí objem v reaktoru byl 1,5 l.

Pr b h hydrolýzy byl sledován prost ednictvím nár stu primárních aminoskupin uvoln ných z peptidových vazeb. Primární aminoskupiny aminokyselin reagují s o-ftaldialdehydem (OPA) za p ítomnosti látky s thiolovou skupinou vzniká 1-alkylthio-2-alkylisoindol,který absorbuje p i vlnové délce 335 nm. Jako thiolová slou enina byl použit N-acetyl-L-cystein (NAC), jehož deriváty jsou stabilní a bez zápachu4,5,6. D íve publikovaná metoda5 byla modifikována na základ test stability absorbance a lepší opakovatelnosti výsledk úpravou pom ru vzorku a inidla na 1:1 a prodloužením doby reakce na 12 min. Po této dob se zm ilaabsorbance p i 335 nm proti slepému vzorku, který místo roztoku vzorku obsahoval destilovanou vodu. Pro kvantitativní vyhodnocení byla využita kalibrace s kyselinou glutamovou v koncentraci 0 až 150 mol l-1.

Hydrolyzáty byly charakterizovány chromatograficky na reverzní fázi7. Vzorky byly nejprve tepeln inaktivovány p i 90 °C po dobu 10 minut a p efiltrovány p es filtry Porafil (0,2 m). Pro separaci byla použita kolona PLRP-S (30 nm, 150 x 4,6 mm, 8 m) s náplní kopolymeru polystyrendivinylbenzenu. Na kolonu bylo nast ikováno 20 l vzorku. Vzorek byl analyzován gradientovou elucí s eluentem A – roztok 0,1% kyseliny trifluoroctové (TFA) ve vod a eluentem B – 0,1% roztok TFA ve sm si acetonitril:voda (80:20). Gradient za ínal na 5 % eluentu B s postupným nár stem na 55 % b hem 50 min. V záv ru analýzy byl podíl eluentu B skokov zvýšen na 100 %. Kolona byla temperována na 40 °C. Eluované peptidy byly detekovány p i 220 nm. Obsah bílkovin byl stanoven metodou podle Kjeldahla8.

Kapacita reaktoru byla vyjád ena podle vztahu, který použili Perea a Ugalde 9. Kapacita reaktoru K (min-1) je definována jako:

VEJPK

kde P je koncentrace produktu v permeátu (mg ml-1), J pr tok permeátu (ml min-1),E po áte ní koncentrace enzymu (mg ml-1) a V je objem reak ní sm si (ml). Vyjad uje množství produktu získaného na jednotku množství enzymu za minutu.

Výsledky a diskuse. Pr b h vsádkové hydrolýzy je zachycen na obr. 1, kde je uveden stupe hydrolýzy,

vyjád ený jako podíl hydrolyzovaných peptidových vazeb a odpovídající množství uvoln nýchprimárních aminoskupin. Na obr. 2 je pokus za stejných podmínek v kontinuálním uspo ádánís dobou zdržení 30 min. Stupe hydrolýzy je vhodný pro vyjád ení pr b hu vsádkové reakce, u kontinuálního uspo ádání vzhledem k možnému kolísání obsahu bílkovin a k rozdíl m mezi bílkovinami premeátu a retentátu je vhodn jší pro popis použít obsah aminoskupin. Z obr. 2 je rovn ž vid t, že k ustálení procesu dojde po 30 – 45 min. V produktu (permeátu) b hem této doby postupn nar stá obsah peptid , nár st odpovídá rostoucímu stupni hydrolýzy na stran retentátu. Ustálení je oddalováno p idáváním nehydrolyzovaného substrátu. Byla proto zavedena p edhydrolýza vsádkovým zp sobem, kdy se permeát v této dob vrací zp t do reaktoru a není p idáván erstvý substrát. Doba p edhydrolýzy byla zvolena stejná jako st ední doba zdržení. Teprve po p edhydrolýze byl spušt n kontinuální proces (obr. 3 a 4). Nejd ležit jšími parametry pro ízení kontinuální hydrolýzy je pom r E/S a st ední doba zdržení. Vliv r zného pom ru E/S je vid t z obr. 3. Na stabilit procesu se u t chto experiment negativn projevilo ucpávání membrán a ne zcela dokonalá regulace p ítoku erstvého substrátu. V d sledku toho se prodloužila st ední doba zdržení p ibližn o 30 % a dochází k mírnému zvyšování koncentrace primárních NH2skupin, která by za optimálních podmínek a p i správné regulaci m la být konstantní. Možnosti dlouhodobého provozu reaktoru jsou demonstrovány na obr. 4. Z pr b hu reakce vyplývá, že lze hydrolyzovat sedminásobné množství substrátu ve srovnání se vsádkovým procesem. Po 220 min lze zaznamenat pokles aktivity enzymu, pokud akceptujeme snížení stupn hydrolýzy, dosáhneme t ináctinásobného využití enzymu.

45

0

10

20

30

40

0 50 100 150 200

as [m in]

c(N

H2)

[mm

ol.L

-1]

0

5

10

15

20

DH

[%]

c (N H 2) D H

Obr. 1. Pr b h vsádkové hydrolýzy vyjád ený pomocí koncentrace NH2 skupin a stupnhydrolýzy (DH). Enzym - Promod 439L, substrát – koncentrát syrovátkových bílkovin s výslednou koncetrací bílkovin 20 mg·ml-1, pom r E/S 1:100, teplota 40 °C, pH 6,5.

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150

as [m in]

c(N

H2)

[mm

ol.L

-1]

perm eát retentát

Obr. 2. Pr b h kontinuální hydrolýzy v membránovém reaktoru. Doba zdržení 30 min, ostatní podmínky experimentu – viz legenda k obr. 1.

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150as [m in ]

c(N

H2)

[mm

ol.L

-1]

vsádková p edhy drolý za E/S 1:100permeát E/S 1:100retentát E /S 1:100vsádková p edhy drolý za E/S 1:500permeát E/S 1:500retentát E /S 1:500

Obr. 3. Kontinuální hydrolýza s p edhydrolýzou 30 min a pom rem E/S 1:100 nebo 1:500, ostatní podmínky experimentu – viz legenda k obr. 1 a 2.

46

0

5

10

15

20

25

0 100 200 300 400 500

as [m in]

c(N

H2)

[mm

ol.L

-1]

vsádková p edhydro lýza permeát retentát

Obr. 4. Kontinuální hydrolýza s p edhydrolýzou 30 min a pom rem E/S 1:100, ostatní podmínky experimentu – viz legenda k obr. 1 a 2.

0

0 ,1

0 ,2

0 ,3

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0

P o á te n í d o b a zd rže n í [m in ]

Kap

acita

[min

-1]

0 ,0

3 ,0

6 ,0

9 ,0

1 2 ,0

DH

[%]

K a p a c ita (E /S 1 :1 0 0 )K a p a c ita (E /S 1 :5 0 0 )D H (E /S 1 :1 0 0 )D H (E /S 1 :5 0 0 )

Obr. 5. Vliv po áte ní doby zdržení na kapacitu reaktoru a stupe hydrolýzy (DH).

Obr. 6. Analýza suroviny (nehydrolyzovaný WPC) a retentátu a permeátu z kontinuálního membránového reaktoru metodou RP-HPLC.

47

Nejvyšší kapacita reaktoru byla dosažena p i nízkém pom ru E/S a krátké dob zdržení (obr. 5). Za t chto podmínek je ovšem dosahován také nejnižší stupe hydrolýzy. Limitovaná hydrolýza m že být v n kterých aplikacích žádoucí pro ur itou zm nu funk ních vlastností nebo omezení ho ké chuti. Peptidový profil (obr. 6) i p i 6% stupni hydrolýzy, který odpovídá pr m rnédélce peptidového et zce 17 aminokyselin) je výrazn zm n n.

Záv rem lze konstatovat, že hydrolýza bílkovin v membránovém reaktoru je velmi efektivní proces, který m že být ízen pomocí st ední doby zdržení v reaktoru a pom rem enzym – substrát. Pro ustálené složení hydrolyzátu od po átku kontinuálního procesu je vhodné za aditvsádkovou p edhydrolýzu po stejnou dobu, jaká bude st ední doba zdržení v kontinuálním provozu.

Práce byla podpo ená MŠMT R (MSM 6046137305).

Použitá literatura:1. Giorno L., Drioli E.: Biocatalytic membrane reactors: applications and perspectives. Trends

Biotechnol. 18, 339-349 (2000). 2. Guadix A., Camacho F., Guadix E. M.: Production of whey protein hydrolysates with reduced

allergenicity in a stable membrane reactor. J. Food Eng. 72, 398 - 405 (2006). 3. Mišún D., urda L., Šípalová O.: Kontinuálna príprava galaktooligosacharidov v

membránovom enzýmovom reaktore. Celostátní p ehlídky sýr – Výsledky p ehlídek a sborník seminá e Mléko a sýry, s. 181 - 185, VŠCHT Praha 2006. ISBN 80-7080-620-6.

4. Hernandez M. J., Domingo E. B., Camanas R. M., Alvarez-Cogme M. C.: Use of the o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cysteine reagent in the evaluation of milk proteins. J. Dairy Sci. 74, 1779-1785 (1991).

5. urda L., Dryáková A.: Modifikace spektrofotometrické metody pro stanovení primárních aminoskupin v mlé ných bílkovinách. Celostátní p ehlídky sýr – Výsledky p ehlídek a sborník seminá e Mléko a sýry 2003, s. 124 - 128, SCH Praha 2003.

6. Spellman D., McEvoy E., O’Cuinn G., FitzGerald R. J.: Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein: Comparison of the TNBS, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis. Int. Dairy J. 13, 447-453 (2003).

7. Jane ková L.: Analytické metody hodnocení syrovátkových bílkovin a jejich hydrolyzát .Diplomová práce. VŠCHT Praha.

8. AOAC, 1990. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists, Helrich K. (Ed.), 15th ed.. IDF-ISO-AOAC Method 920.105: Nitrogen in Milk. Arlington, AOAC, pp. 807-808.

9. Perea A., Ugalde U.: Continuous hydrolysis of whey proteins in a membrane recycle reactor. Enzyme and Microbial Technology 18, 29-34 (1996).

Kontaktní adresa:Ladislav urda, Ústav technologie mléka a tuk , FPBT, VŠCHT, Technická 5, 166 28 Praha 6 e-mail: [email protected]

48

DYNAMIKA MIKROBIÁLNYCH INTERAKCIÍ PO AS KYSNUTIA MLIEKA Valík ubomír, Medve ová Alžbeta, Bajúsová Barbora, Liptáková Denisa

Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave

Dynamics of microbial interactions during fermentation of milk

Summary:This contribution was aimed at quantitative description of Staphylococcus aureus behaviour in milk in co-culture with lactic acid bacteria (LAB). Temperature and initial number of LAB were the main independent variables within the model trials. Other factors as pH and titratable acidity reflecting changes during milk fermentation were also monitored. Results confirmed that in order to control of S. aureus growth the reduction of LAB lag-phase and thus the time to start LAB metabolism were crucial together with temperature of fermentation. Based on laboratory experiments and in connection with artisanal cheese production, the conditions of fermentation were proposed for S. aureus not to reach hygienically relevant numbers.

Syry zo surového mlieka vyrobené remeselne sa tešia v Európe zna nej ob ube kvôli výnimo ným senzorickým vlastnostiam. Známe sú ako špeciality, produkty s originálnymi vlastnos ami, geografickým ozna ením alebo pôvodom. Viaceré krajiny si takéto syry chránia a venujú im zna nú pozornos z h adiska zachovania ich výroby, propagácie krajiny a zachovania biodiverzity. Oproti štandardnej priemyselnej ve kovýrobe syrov z pasterizovaného mlieka sa originálnym syrom zo surového mlieka venuje nezanedbate ná pozornos aj kvôli vzácnym mikrobiálnym spolo enstvám, ktoré sa zú ast ujú na ich zretí1.

Syry zo surového mlieka na druhej strane môžu za ur itých nepriaznivých podmienok predstavova zdravotné riziko. Surové mlieko môže obsahova choroboplodné mikroorganizmy schopné vyvola infek né ochorenie alebo mikroorganizmy, ktoré sa môžu pomnoži , vytvorimnožstvo sekundárnych toxických metabolitov a spôsobi intoxikácie2.

Zdravotná neškodnos syrov remeselne vyrobených zo surového mlieka je založená na spolo nom pôsobení viacerých vnútorných a vonkajších faktorov ich prostredia, vrátane technologických podmienok výroby. Hlavnými inhibi ne pôsobiacimi faktormi vo ichoroboplodným mikroorganizmom sú všeobecne hodnota pH a s ou spojená koncentrácia kyseliny mlie nej, aktivita vody (hodnota av), redoxný potenciál, kompetícia baktérií mlie nehokysnutia a koncentrácia alších metabolitov vznikajúcich napríklad po as zretia a iné faktory3.Biochemické procesy prebiehajúce po as primárneho a sekundárneho zretia sú uskuto ovanésacharolytickými, proteolytickými a lipolytickými enzýmami príslušných technologicky potrebných mikroorganizmov. Empiricky je pritom zrejmé, že uplatnenie bariérovej funkcie horeuvedených faktorov vo i nežiadúcim/choroboplodným mikroorganizmom musí pôsobi ur itý as.

Z h adiska ochrany zdravia konzumentov, požiadaviek legislatívy ale aj na základe horeuvedených poznatkov musí by hygienická bezchybnos výroby syrov pod prísnym dozorom po núc od požiadaviek na zdravotný stav zvierat a podmienkami konzumácie kon iac.Pri remeselnej výrobe krátko zrejúcich mäkkých syrov majú zvláš významné miesto opatrenia a postupy správnej výrobnej praxe (SVP), správnej hygienickej praxe (SHP) a HACCP4.

Originálnym slovenským krátko zrejúcim syrom vyrábaným zo surového ov ieho mlieka je bryndza. Polotovarom pre jej výrobu je ov í hrudkový syr, ktorý sa oby ajne remeselne vyrába v horských podmienkach na salašoch. Tento syr podlieha prirodzenej fermentácii natívnymi, najprv baktériami mlie neho kysnutia, neskoršie proteolytickými baktériami a vláknitými hubami a ich enzýmami5. Proteolytické (sekundárne zretie) prebieha na salaši a v bryndziarni a pôvodne trvalo spolu desa až štrnás dní, neskoršie osem až dvanás dní, pri om sa sušina zvýšila na 54 až 57 %. V sú asnosti tento syr (bryndza) je podrobený iba krátkemu zretiu trvajúcemu maximálne pä až sedem dní (spolu as na salaši a v bryndziarenskom závode).

V horských oblastiach v prípade nepriaznivých meteorologickým podmienok je ažkézabezpe i vhodné podmienky pre rýchlu fermentáciu baktériami mlie neho kysnutia (BMK). Pomalý pokles hodnoty pH môže v praxi by nedostato nou prekážkou pre rast patogénnych baktérií, napr. aj toxinogénneho Staphylococcus aureus6,7. Pod a vlastných vyšetrení môže tento

49

mikroorganizmus, ktorého toxíny sú termostabilné, za krátky as po as nieko kých hodín prekro ipo ty 106 KTJ/g8. Pri takýchto po toch je možné, že koncentrácia toxínov v syre dosiahne úrove ,ktorá môže spôsobi intoxikáciu konzumentov, a to aj u potravín alebo jedál teplotne opracovaných9.

Pre výrobcov syrov vyrábajúcich syry zo surového mlieka je dôležité zabezpe ioptimálny rast baktérií mlie neho kysnutia a pozna správanie sa nežiadúcich mikroorganizmov ako aj ich vzájomné vz ahy. Ma k dispozícii aktuálne informácie o po toch zú astnených mikroorganizmov po as prebiehajúcej fermentácie mlieka alebo mladého syra v praxi nie je možné ani nevyhnutné. Nevyhnutné je však ma kontrolu nad prebiehajúcimi procesmi a technologickými podmienkami výroby. Cie om našej práce bolo preto zisti , i a kvantitatívne popísa , ako sa baktérie mlie neho kysnutia vysporiadajú s kontaminantami mlieku. Zamerali sme sa pritom na sledovanie interakcií medzi baktériami mlie neho kysnutia mezofilnej kultúry Fresco 1010 (Chr. Hansen, Hørsholm, Dánsko) a S. aureus (kme om 2064), ktorý bol izolovaný z ov iehohrudkového syra MVDr. Hanzelyovou (ŠVPÚ Prešov).

Výsledky a diskusia Na obr.1 je znázornená dynamika rastu kme a S. aureus 2064 nao kovaného spolo ne

s baktériami mlie neho kysnutia kultúry Fresco 1010 do mlieka pri 18 °C. Obdobne boli vykonané pokusy pri teplote 12°C, 15°C, 21°C a 25°C. Tento interval teplôt bol zvolený tak, aby reprezentoval teploty, pri ktorých môže prebieha kysnutie mlieka a zretie mladého ov iehohrudkového syra v horských podmienkach. Pri teplote 18°C, ktorú odborníci pokladajú za hrani núvzh adom na rýchle kysnutie syra, je vidie , aký vplyv má po iato ný po et baktérií mlie nehokysnutia (BMK) na rast S. aureus. Ak sa BMK nenachádzajú v nadbytku, existuje riziko, že S. aureus dosiahne po ty blížiace sa k hrani nej koncentrácii 106 KTJ/ml. Pri takomto po te sa predpokladá, že ak by boli toxinogénne kmene prítomné, koncentrácie ich enterotoxínov by mohli vyvola stafylokokové enterotoxikózy9. V našom prípade, (obr. v avo hore), S. aureus dosiaholpo ty v stacionárnej fáze poriadkovo 105 KTJ/ml a oproti po iato nému po tu narástol o dva logaritmické poriadky, pri om zo smerníc rastových iar je vidie , že rastová rýchlos BMK (GrBMK = 0,18 h-1) bola vyššia ako rastová rýchlos S. aureus (GrSa = 0,15 h-1).

Na druhej strane, ak boli BMK už len v nepatrnom nadbytku (N0 BMK = 3,3 log KTJ/ml), rástli bez lag fázy a po et S. aureus nedosiahol v stacionárnej fáze ani denzitu 105 KTJ/ml, pri om jeho rastová rýchlos bola nižšia (GrSa = 0,07 h-1, GrBMK = 0,19 h-1; index GRSa/GrBMK = 0,37). Nárast S. aureus (Nmax-N0) bol v tomto prípade (obr. vpravo hore) už o 0,5 log nižší (NmaxSa = 1,7 log oproti 2,2 log v predchádzajúcom prípade). Podobný a ešte výraznejší vplyv na rast S. aureus mali alšie vyššie inokulácie kultúry Fresco, pri om v ostatnom prezentovanom prípade vpravo dole pri po iato nom po te BMK N0BMK = 5,18 došlo síce k nepatrnému rastu v rozsahu 0,5 log, ale sa za krátky as dosiahla významná inhibícia rastu S. aureus.

Z pokusov zobrazených na obr. 1, je zrete ne tiež vidie , že S. aureus dokázal rás po askysnutia mlieka len v ase, kedy nedošlo k zníženiu hodnoty pH, t.j. po as lag fázy metabolizmu BMK, resp. lag fázy tvorby kyseliny mlie nej, po as tzv. lagpH. Táto lag fáza, v závislosti od po iato ného po tu BMK a ich aktivity trvala pri 18°C od 30 do 20 h. Prirodzene v praxi je možné tento as skráti ešte vyššou inokuláciou kultúry BMK alebo aj vyššou teplotou fermentácie.

Pri zvýšení teploty kysnutia mlieka je však treba po íta aj s tým, že vyššia teplota môže urýchli tiež rast S. aureus. Túto skuto nos sme zistili napríklad pri teplote 25°C, pri ktorej pri prakticky rovnakých po iato ných po toch BMK a S. aureus (N0 BMK = 3,0 a N0 Sa = 2,7 KTJ/ml), S.aureus o 0,5 log prekro il hrani nú hodnotu 106 KTJ/ml. Rastové rýchlosti zú astnených BMK a S.aureus sa navzájom odlišovali menej ako pri teplote 18°C. Rastová rýchlos S. aureus dosahovalapri tejto teplote už približne 72% z rastovej rýchlosti BMK (GrBMK = 0,43 a GrSa = 0,31; index GRSa/GrBMK = 0,72).

50

Obr. 1 Dynamika rastu mezofilnej kultúry Fresco 1110 a S. aureus 2064 po as spolo nej kultivácie v mlieku pri 18 °C.

Nmax_Sa-N0_Sa = 1.792+0,00975*T2-0,06637*T*N0_LAB+0,06764*N0_LAB2 (R = 0,968)

Obr. 2 Vplyv teploty a po iato ného po tu kultúry Fresco na „nárast“ S. aureus (NmaxSa-N0Sa) v mlieku.

51

Na obr. 2 je graficky znázornený vplyv teploty a po iato ného po tu baktérií mlie nehokysnutia kultúry Fresco na nárast po tu S. aureus (NmaxSa-N0Sa) po as ich spolo ného rastu v mlieku. Toto znázornenie reprezentuje všetky opakovane vykonané pokusy pri 12°C, 15°C, 18°C, 21°C a 25°C. Príslušná rovnica lineárnej regresie s dostato nou presnos ou umož uje výrobcovi syra v sledovanom intervale teplôt a po iato ných po tov baktérií vypo íta nevyhnutné po iato népo ty BMK a zvoli správnu teplotu fermentácie aj pri vyšších po iato ných po toch S. aureus v mlieku ur enom na výrobu syrov, napríklad aj 1000 KTJ/ml. Na druhej strane Valík a kol. (2004)10 zistili, že prirodzený obsah S. aureus vo vzorkách ov ieho surového mlieka odobratých na salašoch v ase od nadojenia až po zasyrenie v putere, (vrátane kontaminácie z príslušných nádob pri prelievaní a filtrácii mlieka), nepresiahol 200 KTJ/ml.

Na základe výsledkov znázornených na obr. 2 a pri zabezpe ení hygienických podmienok výroby odporú ame pre výrobu ov ieho hrudkového syra upravi po iato ný po et BMK v mlieku na koncentráciu vyššiu ako 104 KTJ/ml. v takomto prípade, aktívne baktérie mlie neho kysnutia príslušne rýchlym rastom a tvorbou kyseliny mlie nej nedovolia S. aureus zvýši jeho po iato népo ty o viac ako 2 log poriadky, o by bolo v súlade s platnými limitmi sú asnej legislatívy11.Pri východzích prirodzených po toch S. aureus v surovom ov om mlieku, poriadkovo 102 KTJ/ml a okamžitom spracovaní na syr je možné udrža rast S. aureus pod kontrolou. Navyše pod aviacerých autorov5,6,7 k inhibícii S. aureus dochádza už po as zretia ov ieho hrudkového syra na salaši a pokra uje alej v bryndziarni. V súlade s týmito zisteniami je potrebné tiež zdôrazni ,že baktérie mlie neho kysnutia môžu zlepši mikrobiologickú kvalitu remeselne vyrábaných potravín, avšak len v kombinácii so Správnu hygienickou praxou12.

Záver Horeuvedené zistenia a po etné opakovane vykonané experimenty sú podkladom pre naše

nasledovné závery:Poznanie vzájomných vz ahov medzi baktériami mlie neho kysnutia a nežiadúcimi mikroorganizmami prispieva k riešeniu praktických problémov v praxi. BMK sú schopné nešpecificky potla i rozvoj patogénnej mikroflóry po as kysnutia a zretia mlie nych produktov, vrátane krátko zrejúcich syrov. Nešpecifická ú innos BMK súvisí s po iato ným po tom, resp. s ich nadbytkom v porovnaní s mikrobiálnou zá ažou choroboplodných baktérií. V prípade ov ieho hrudkového syra a bryndze sa odporú a vytvori predpoklady pre úspešnú kompetíciu BMK vo i nežiadúcim mikroorganizmom. Tieto predpoklady súvisia s o najkratšou lag fázou rastu a metabolizmu BMK(lagpH)a s vytvorením vhodných vonkajších podmienok fermentácie zameraných na optimálnu teplotu a podporu rastu natívne prítomných BMK. V súvislosti s touto podporou odporú ame aj aplikáciu komer ných kultúr BMK ako aj zásad správnej hygienickej praxe.

Po akovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy

. APVV-20-005605.

Použitá literatura:1. IDF. Symposium on Cheese: Ripening, Characterization & Technology. Book of Abstracts. 1st

edition. Prague: Nakladatelství Galén, 2004, 153 p.2. COGAN T.M. Public Health Aspects. In ROGINSKI H., FUQUAY J.W., FOX P.F.

Encyclopedia of Dairy Sciences. San Diego: Academic Press, 2003, vol. 1, p. 314-320. 3. GÖRNER F., VALÍK . Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1, vyd. Bratislava: Malé

Centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7.

52

4. ZOTTOLA, E.A., SMITH, L.B. Growth and Survival of Undesirable Bacteria in Cheese. In FOX, P.F Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Gaithersburg: Aspen Publishers, 1999, vol.1, p. 471-492.

5. GÖRNER, F. Der Brinsekäse aus Schafmilch (Brimsen). Ernährung/Nutrition, 4 (4), 1980, s.157-162.

6. GRIEGER, C., BEDNAR ÍKOVÁ E., VERDON F. Vplyv zrenia ov ieho hrudkového syra na rastovú krivku Staphylococcus aureus. Veteriná ství, 29, 1979, s. 407-409.

7. PAŽÁKOVÁ, J., PIPOVÁ, M., TUREK, P., NAGY, J. Changes in some microbiological and chemical parameters during the ripening of sheep cheese at different temperatures. Czech J. Food Sci., 19, 2001, p.121-124.

8. VALÍK, ., SONNEVELD, K., GÖRNER, F. The Lump Cheese from Raw Sheep Milk: Pre-Bryndza Cheese. In: IDF Symposium on Cheese: Ripening, Characterization & Technology,Book of Abstracts. Prague: Nakladatelství Galén, 2004. p.112.

9. ASPERGER, H., ZANGERL, P. Staphylococcus aureus. In ROGINSKI H., FUQUAY J.W., FOX P.F. Encyclopedia of Dairy Sciences. San Diego: Academic Press, 2003, vol. 4, p. 2563-2509.

10. VALÍK, ., SONNEVELD, K., GÖRNER, F., BARTO, J. Niektoré mikrobiologické aspekty fermentácie ov ieho hrudkového syra. In: SSM Mikrobiologie potravin, Sborník ze seminá e.Praha: VŠCHT, 2004, s.72-77. ISBN 80-7080-556-0.

11. NARIADENIE ES 2073/2005 z 15. novembra 2005, o mikrobiologických kritériách pre potraviny. Úradný vestník Európskej únie, 22.12.2005. L338, 25 s. Dostupné na internete: http://www.svps.sk/sk/pdf/legislativa/nk_2073_2005.pdf.

12. ADAMS, M.R., NICOLAIDES, L. Review of the sensitivity of different foodborne pathogens to fermentation. Food Control, 8, 1997, p. 227-239.

Kontaktní adresa:ubomír Valík, Doc. Ing. PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave,

Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

53

UTILIZÁCIA GLUKÓZY A LAKTÓZY RÔZNYMI KME MI LAKTOBACILOVGreif Gabriel, Greifová Mária, Karovi ová Jolana, Kohajdová Zlatica, Kraj ová Eva

Ústav biotechnológie a potravinárstva, STU v Bratislave

Utilization of glucose and lactose by some strains of lactobacilli

Summary:The influence of glucose and lactose on lactic acid formation in MRS broth and milk by lactobacilli strains Lactobacillus rhamnosus VT 1, Lactobacillus rhamnosus LC 705 and Bifidobacterium longum CCM 4990 was investigated. Sterilized MRS broth and semi-skimmed milk were inoculated with 107 CFU/ml of respective strains and stationary incubated at 37 °C. The saccharides (glucose, lactose) and organic acids (lactic acid, acetic acid) were determined by HPLC – RI method. The values of LA (specific rate of production of lactic acid), and MLA (time, at which LA is maximal) were calculated from parameters obtained by fitting the function cLA = f( ). The characteristics of growth m (specific growth rate) and lag phase) were calculated from parameters obtained by fitting the funcion OD = f( ). The yield of lactic acid from glucose during lactic acid fermentation in MRS broth for L. rhamnosus LC 705, L. rhamnosus VT1 and B. longumwere 74.3, 92.2 and 93.2, respectively

Kyselina mlie na patrí medzi organické kyseliny, ktoré vo významnej miere ovplyv ujúorganoleptické a technologické vlastnosti ako aj kvalitu výrobkov. Priaznivo pôsobí na senzorické vlastnosti mlie nych výrobkov. Dodáva im jemne kyslú a osviežujúcu chu , chráni a predlžuje ich údržnos a strávite nos . Vzniká pôsobením baktérií mlie neho kvasenia (BMK) na laktózu, z ktorej sa pri fermenta ných procesoch premení 20 – 30% na kyselinu mlie nu [1]. Využíva sa innos baktérií mlie neho kvasenia, ktorých významným zástupcami sú rody Lactobacillus

a Bifidobacterium. Baktérie mlie neho kvasenia nachádzajú v posledných rokoch využitie okrem mlie nych výrobkov aj v iných odvetviach potravinárskeho priemyslu ako napríklad pri výrobe mlie ne fermentovaných mäsových výrobkov, spracovaní zeleniny a v pekárenskom priemysle [2-7].

Cie práceVyužite HPLC RID metódy pre sledovanie utilizácie sacharidov a produkcii organických

kyselín vybranými kme mi baktérií v rôznych kultiva ných médiách pri teplote 37 °C

Materiál a metódyKultiva né médiá: MRS bujón, mlieko polotu né

Mikroorganizmy: Lactobacillus rhamnosus VT 1 a Lactobacillus rhamnosus LC 705 (ÚTMT, VSCHT Praha, CZ), Bifidobacterim longum CCM 4990 (Masarykova univerzita v Brne, CZ)

Meranie aktívnej kyslosti: stanovenie pH - pH meter InoLab pH Level 2 (WTW Weilheim, Germany)

Predanalytická úprava vzorky: MRS bujón s testovanými mikroorganizmami sa odstredil pri 9000 ot.min-1. Supernatant sa zmiešal v alikvotnom pomere s mobilnou fázou, prefiltroval cez mikrofilter (0,2 m) a následne aplikoval na kolónu.

5 cm3 vzorky mlieka s testovaným mikroorganizmom sa zmiešalo s 30 cm3 deionizovanej vody v 50 cm3 odmernej banke. Po pridaní íriacich roztokov (3 cm3 Carrez I a 3 cm3 Carrez II), premiešaní a doplnení po zna ku sa vzorka prefiltrovala cez skladaný filter a mikrofilter (0,2 m) a následne aplikoval na kolónu.

Podmienky analýzy: Vysokotlaková pumpa DeltaChrom™ SDS 030, dávkova LCI 30, dávkovacia slu ka 20 l, kolóna: Polymer IEX H+ (250 x 8 mm), DelkaChrom™ Temperature Control Unit (40±0,1 °C), mobilná fáza: 9 mM H2SO4, prietok mobilnej fázy: 1 cm3.min-1, detektor: RI K-2301, zbera dát a vyhodnotenie v programe Clarity

54

Výsledky a diskusia

Rast baktérií mlie neho kvasenia (BMK) v MRS bujóne pri 37 °C sa sledoval meraním optickej denzity (OD) v nami zvolených asových intervaloch a bol hodnotený na základe rastových parametrov m (špecifická rýchlos rastu) a (lag fáza) a taktiež rýchlos ou poklesu aktívnej kyslosti (pH). Výsledky sú uvedené v tab. I. a obr. 1.

Tabu ka I Charakteristiky rastu BMK a rýchlos poklesu aktívnej kyslosti

MRS bujón Mikroorganizmus

m (DOD.h-1) (h) pH (pH.h-1)L. rhamnosus VT 1 0,22 2,2 -0,20 B. longum CCM 4990 0,26 2,4 -0,21 L. rhamnosus LC 705 0,21 3,4 -0,18

0 10 20 30 40 50

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

pH

as (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

ODL. rhamnosus LC 705

L. rhamnosus VT 1B. longum

Obr. 1. Rast BMK v MRS bujóne a zmeny pH pri 37 °C

Hlavným kritériom pri výbere BMK ako štartovacích kultúr je schopnos rastu v komplexnom médiu a rýchlos prekvášania substrátu s ím je spojená produkcia kyselín (predovšetkým kyseliny mlie nej) a pokles pH (aktívnej kyslosti). Antimikrobiálna aktivita laktobacilov a bifidobaktérií je daná predovšetkým produkciou organických kyselín (mlie nej,octovej, propionovej, valérovej) a iných inhibi ných látok H2O2, CO2, diacetylu, bakteriocínov – nízkomolekulárnych látok na báze aminokyselín. Dôležitým kritériom sa zdá by aj produkcia amínov (histamín, tyramín a 2-fenyletylamín) [3,5,6,7]. Utilizácia glukózy rôznymi kme mi laktobacilov

Analýza štandardov sacharidov a organických kyselín pomocou HPLC – RID metódy je uvedená na obr. 2.

55

Obr. 2. Chromatogramy sacharidov laktóza (1), glukóza (3), galaktóza (4), a organických kyselín citrónová (2), mlie na (5), octová (6), propiónová (7)

Obr. 3. Chromatogramy glukózy, kyseliny mlie nej a octovej v MRS bujóne v 0. a 48. hodine kultivácie Lactobacillus rhamnosus VT 1 pri 37 °C

Použité kmene BMK (Lactobacillus rhamnosus VT 1, Lactobacillus rhamnosus LC 705 a Bifidobacterim longum CCM 4990) tvorili z glukózy len kyselinu mlie nu (obr. 3-5.). Z nameraných výsledkov vyplýva, že ide o homofermentatívne kmene BMK. Kyselina octová, ktorá bola detekovaná v 8,480 min. (obr. 3-5.) pochádza z kultiva ného média (MRS bujón), kde je pridávaná vo forme octanu sodného.

56

Obr. 4. Chromatogramy glukózy, kyseliny mlie nej a octovej v MRS bujóne v 0. a 48. hodine kultivácie Lactobacillus rhamnosus LC 705 pri 37 °C

Obr. 5. Chromatogramy glukózy, kyseliny mlie nej a octovej v MRS bujóne v 0. a 48. hodine kultivácie Bifidobacterim longum CCM 4990 pri 37 °C

Výsledky (obr. 2. – 5.) ukázali, že nami použité kmene BMK sú homefermentatívne (v MRS bujóne neprodukovali kyselinu octovú). Pík kyseliny octovej, ktorý sa objavuje v chromatogramoch je zo živnej pôdy, do ktorej je kyselina octová pridávaná vo forme octanu sodného (5 g.dm-3) (obr. 2. – 5.). Utilizácia glukózy a produkcia kyseliny mlie nej použitými kme mi BMK v MRS bujóne je na obr. 6. Vý ažnos kyseliny mlie nej bola pre Lactobacillus rhamnosus VT 1, Lactobacillus rhamnosus LC 705 a Bifidobacterim longum (92,2; 74,3 a 93,2%). Špecifická rýchlos utilizácie glukózy sa signifikantne nelelíšila u kme ov Lactobacillusrhamnosus VT 1 a Bifidobacterim longum (-0,00699 a 0,00701 mol.dm-3.h-1) a taktiež špecifická

57

rýchlos produkcie kyseliny mlie nej (0,01197 a 0,01210 mol.dm-3.h-1). Tieto hodnoty boli významne nižšie boli u Lactobacillus rhamnosus LC 705 (-0,0062; 0,0085 mol.dm-3.h-1), o je možné dedukova z obr. 6. Charakteristiky utilizácie glukózy, resp. produkcie kyseliny mlie nej boli vypo ítané z parametrov krivky definovanej ako funkcia koncentrácie produktu (cP) od asu( ):

PMBeP Cec

eBC

P

kde cP je koncentrácia produktu v ase , C - maximálna koncentrácia produktu v stacionárnej fáze (horná asymptota), B - smernica priamky v bode M, MP - as, v ktorom je špecifická rýchlosprodukcie amínumaximálna, Glu - špecifická rýchlos utilizácie glukózy, resp. KM - špecifická rýchlos produkcie kyseliny mlie nej. Bod M je definovaný vz ahom

02

2

dcd p .

0 10 20 30 40 50

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18 L. rhamnosus LC 705L. rhamnosus VT 1B. longum

c Glu;

C KM (m

ol.d

m-3)

as (h)

Obr. 6. Utilizácia glukózy a produkcia kyseliny mlie nej použitými kme mi BMK v MRS bujóne pri 37 °C

Obsah laktózy v mlieku inokulovanom L. rhamnosus LC 705 poklesol z 0,1239 mol.dm-3

po 48 h kultivácie na 0,0837 mol.dm-3, o predstavuje 32,5%. Obsah kyseliny mlie nej bol 13,34 g.dm-3. Pri inokulácii mlieka kme mi Lactobacillus rhamnosus VT 1 a Bifidobacterim longumCCM 4990 obsah laktózy poklesol za 48 h kultivácie o cca 11,9% a obsah kyseliny mlie nej bol 5, 4 resp. 5,7 g.dm-3. Týmto výsledkom odpovedali aj pH-hodnoty substrátov v 48. h kultivácie (3,512; 4,559 a 4,385).

58

Obr. 7. Chromatogramy laktózy, kyseliny mlie nej a octovej v mlieku v 48. hodine kultivácie L. rhamnosus LC 705 a Bifidobacterium longum CCM 4990 pri 37 °C

Po akovanie Táto práca bola podporená grantom VEGA 1/3546/06

Literatúra1. Hylmar B.: Analýza mlé ných kysaných výrobk . Praha, SNTL 1986, 320 s. 2. Carr F.J., Chill D., Maida N.: The lactic acid bacteria: A literature survey. Critical Reviews in

Microbiology, 28 (4), 281-370 (2002). 3. Karovi ová J., Drdák M., Greif G., Hybenová E.: The choice of strains of Lactobacillus species

for the lactic acid fermentation of vegetable juices. Eur. Food Res. Technol., 210 (1), 53-56 (1999).

4. Karovi ová J., Kohajdová Z., Greifová M., Luká ová D., Greif G.: Porovnanie fermentácií zeleninových štiav. Bull. PV, 41(3), 197-213 (2002).

5. Ross R.P., Morgan S., Hill C.: Preservation and fermentation: past, present and future. International Journal of Food Microbiology, 79 (1-2), 3-16 (2002).

6. Künsch U., Schärer, H., Temperli A.: Study on the formation of biogenic amines during sauerkraut fermentation. Food Biotechnol., 4, 192 – 204 (1990).

7. Greif G., Greifová M., Karovi ová J., Hybenová E., Drdák M.: Biogenic amines in the process of lactic acid fermentation of vegetables. In: Book of abstract. 1st Meeting on Chemistry & Life. The Brno, Sep. 9-10. 10. 1999. CZ. p. 35-36 (1999).

Kontaktná adresa:Ing. Gabriel Greif, PhD., FCHPT STUv Bratislave, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovensko, e-mail: [email protected]

59

APLIKACE P ÍMÉ A NEP ÍMÉ IMPEDAN NÍ METODY P I STUDIU VLASTNOSTÍ MK A KONTAMINUJÍCÍ MIKROFLÓRY MLÉKA.

erný Vladimír1, Havlíková Šárka1, Kvasni ková Eva1, Vylet lová Marcela2

1Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o. Praha; 2Výzkumný ústav pro chov skotu Rapotín

Application of direct and indirect impedance method for studying a pure dairy culture and milk contaminated culture.

Summary:Direct microbiological methods using Rabit apparatus were implemented for studying the resistance of Str. salivarius subsp. thermophilus strains against the temperature between 30-50 °C. Indirect methods were used for properties comparison of group strains Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus and Bacillus licheniformis.Achieved and presented results confirm the suitability of using the Rabit apparatus and impedance microbiology method for studying properties of individual strains of microorganisms.

Úvod :Aplikace impedan ních m ení v mikrobiologii není novou záležitostí, první zprávy jsou

z p elomu 19. a 20. století. Vývoj t chto metod pokra oval a v 70. letech 20. století byly vyvinuty jednoú elové systémy Malthus (Malthus Instruments Ltd. GB) a Bactometr (bioMérieux Vitek Inc., USA). Od té doby ud laly metody impedan ní mikrobiologie další významný pokrok, zejména v oblasti aplikací zam ených na detekci patogenních mikroorganism .Výhody a nevýhody impedan ních m ení shrnuje nap . urda (1) - mnohostranné využití pro široké spektrum mikroorganism , rychlost stanovení, vysoké po izovací náklady a nízké provozní náklady, automatický záznam dat, citlivost a reprodukovatelnost i možnost soub žného hodnocení v tšího množství vzork i p ehled aplikací impedan ních metod v mlékárenské mikrobiologii.

Pro testování metod impedan ní mikrobiologie byl v této práci použit p ístroj RABIT (Don Whitley Scientific Ltd, GB), který umož uje zjiš ovat r st bakterií pomocí zm n impedance p i jejich kultivaci v mléce nebo ve speciálních živných médiích. Pozornost byla v nována jak možnostem p ímé impedan ní metody (založené na m ení zm ny impedance použitého kultiva ního média jako výsledku zm n jeho složení b hem r stu testovaného mikroorganismu), tak i možnostem využití nep ímé impedan ní techniky (založené na m ení zm n impedance vyvolaných absorpcí CO2 (vytvo eného b hem r stu mikroorganismu) v roztoku KOH).

Materiál a metody :Pro metody p ímé impedance byly použity isoláty kmen : - Latobacillus helveticus- Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis- Streptococcus salivarius subsp. thermophilus- Kultiva ní médium – obnovené sušené mléko z jedné výrobní šarže - Teplota kultivace 30°C až 50°C - Dávka inokula – 0,01 %- Pro zpracování nam ených dat a definování vztahu mezi dobou kultivace a k ivkouimpedan ního záznamu byl použit modifikovaný Gompertz v model ve tvaru :

ln( )( )

*exp( exp((max) *

* ( ) ))X tX

Ae

At

01

kde : A ........... hodnota horní asymptoty k ivky e ........... exp(1) μ(max)... maximální rychlost zm ny impedance ........... as lag fáze impedan ní zm ny t ........... as

60

Pro metody nep ímé impedance bylo použito : - 10 kmen Bacillus licheniformis- 10 kmen Bacillus cereus- 10 kmen Pseudomonas fluorescens- Tryptone soya broth (Oxoid 0129) obohacený p ídavkem 1 % sušeného mléka. 5 ml bujónu zao kovaného istou kulturou a jejím desítkovým ed ním bylo dávkováno do sklen né zkumavky a bylo vloženo do kultiva ní cely s hydroxidem draselným, uzav eno zátkou a vloženo do kultiva ního bloku p ístroje.- Teplota kultivace : 21 °C pro Pseudomonas ssp. a 30 °C pro Bacillus ssp. - ed ní kultury : až do 5. ed ní. Soub žn byly odebrány vzorky na stanovení po áte ních po tbun k i spór klasickou plotnovou metodou.

Všechny kultivace p ímou i nep ímou metodou byly provedeny dvojmo a soub žn byl vždy kultivován kontrolní vzorek.

P ímé impedan ní metody.

P i použití p ímé metody m ení se zao kované mléko ve sterilních m ících celách vloží do p ístroje a b hem kultivace, p i p edem zvolené teplot , jsou m eny a zaznamenávány zm nyimpedance kultiva ního média. Tyto zm ny odpovídají zm nám ve složení kultiva ního média a i zm nám v po tu mikroorganism . Použití této metody je výhodné pro typy kultivací spojených s tvorbou kyselin z p ítomné málo vodivé složky substrátu. Zvyšující se koncentrace vznikajících kyselin vyvolává významnou odezvu v nam ených hodnotách impedance kultiva ního média.

Jako p íklady aplikace p ímé metody m ení je uveden zpracovaný soubor kultivací kmene Streptococcus salivarius subsp. thermophilus v obnoveném mléce p i teplotách 30 – 50 °C (Obr. .1)

9000

9500

10000

10500

11000

11500

12000

12500

13000

13500

0 300 600 900 1200 1500 1800

doba kultivace (minuty)

impe

danc

e (u

S) G0-21-30

G0-21-37

G0-21-43

G0-21-47

G0-21-50

Obr. . 1 Str. salivarius ssp. thermophillus - vliv teploty kultivace, obnovené mléko

V rámci ov ování metod byla testována i opakovatelnost m ení použité p ímé impedan ní metody. Na obr. . 2 je uveden p íklad vyhodnocení opakované kultivace isolátu Lb. helveticus auvedené výsledky dokumentují dobrou stabilitu a opakovatelnost m ení.

61

55,15,25,35,45,55,65,75,85,9

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 13 14 15 16 17 18 19 20 21

m ení .

lag

fáze

(hod

)

b3

Obr. . 2 stanovení doby lag-fáze, Lb. helveticus, 43°C, n=17, pr m r=5,46 hod, SmOdch=0,65%

Nep ímé impedan ní metody.

Vývoj a ov ování metody nep ímé impedance byl spojen s orienta ním testováním vlastností vybraných kontaminant potraviná ských výrobk které jsou i p i výrob sýrpovažovány za nežádoucí až nebezpe nou mikroflóru.

Jako zástupce psychrotrofní mikroflóry byl vybrán Pseudomonas flurescens. Jeho technologicky nežádoucí vliv na výslednou jakost zralých sýr byl jednozna n prokázán i ve VÚM v rámci výzkumného projektu NAZV IE5027. B žn se vyskytuje i ve zkažené potrav , asto je izolovan z klinických vzork .

Druhou skupinou jsou termorezistentní aerobní mikroorganismy které p ežívají tepelné ošet ení 85 °C po dobu 10 minut ( SN 570101). Z této skupiny mikroorganism byly k testování vybrány Bacillus cereus a Bacillus licheniformis. Jsou schopny produkovat toxiny.

Ve spolupráci s VÚCHS Rapotín byl pro ú ely testování vybrán soubor kmen ,který zahrnoval 10 kmen Bacillus licheniformis, 10 kmen Bacillus cereus a 10 kmenPseudomonas fluorescens.

Testování bylo zam eno na ur ení vztah mezi po áte ní denzitou spór nebo bun kjednotlivého testovaného kmene a dobou do dosažení požadované odezvy na p ístroji (TTD).

Z takto získaných hodnot je možno následn získat lineární vztah mezi logaritmem po áte ních po t bun k (spór) a odezvou p ístroje (TTD).

Pro testování byl použit Tryptone soya broth (Oxoid 0129) obohacený p ídavkem 1 % sušeného mléka a teplota kultivace byla 21 °C pro Pseudomonas ssp. a 30 °C pro Bacillus ssp.

Pro vyhodnocení závislosti mezi po tem mikroorganism a TTD byla použita ta ed ní,p i kterých byl logaritmus po tu zárodk v tší jak nula.

Vyhodnocení výsledk : Každé stanovení bylo provád no dvojmo, soub žn byl kultivován slepý pokus

s nezao kovaným bujónem. Z výsledk m ení byla pro každý kmen ur ena lineární závislost mezi log CFU a TTD a její koeficienty ( TTD = A*log CFU + B ).

Pro zevšeobecn ní výsledk m ení a získání dat popisujících chování jednotlivých druhtestovaných mikroorganism byla vypo ítána pr m rná hodnota a sm rodatná odchylka jak sm rnice p ímky (A) tak i konstantního lenu (B) a jsou uvedeny v následující tabulce.

62

Tab. I: Koeficienty regresní p ímky pro jednotlivé skupiny mikroorganism .

koeficient "A" "B" "A" "B" "A" "B"npr m r -4,24 42,00 -2,70 24,32 -1,40 12,35SmOdch 0,25 3,53 0,21 2,45 0,08 0,59% 5,81 8,40 7,67 10,07 5,81 4,77max -3,89 46,54 -2,49 28,14 -1,29 13,34min -4,67 35,20 -2,97 23,33 -1,55 11,57rozdíl 11,34 9,11 1,77

8

Ps. Fluorescens B. licheniformis B. cereus

9 10

Z t chto hodnot byly vyhodnoceny a následn graficky zpracovány intervaly o ekávaných hodnot pro hladinu významnosti a < 0,95. Pro každý rod byly zkonstruovány 3 p ímky :

TTD = (pr m r „A“) * log CFU + (pr m r „B“) (1) s mezemi : TTD = (pr m r „A“) * log CFU + (pr m r „B“+ SmOdch) (2)

TTD = (pr m r „A“) * log CFU + (pr m r „B“- SmOdch) (3) Výsledky m ení jsou zpracovány v obrázcích .3 (Bacillus ssp.) a .4 (Pseudomonas ssp.).

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6log (CFU/ml)

as d

o TT

D (h

od)

B.licheniformis Mean

B.licheniformis Mean+STD

B.licheniformis Mean-STD

B. cereus Mean

B. cereus Mean+STD

B. cereus Mean-STD

Obr. . 3 Porovnání r stové charakteristiky kmen B. cereus a B.licheniformis

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2 3 4 5 6

log (CFU/mL)

as d

o TT

D (h

odin

y)

8 strains Mean

8 strains Mean+STD

8 strains Mean - STD

2 strains Mean

Obr. . 4 Pr m r závislosti log(CFU/ml) a TTD pro 8 kmen Ps. fluorescens a porovnánís dalšími 2 kmeny

63

Z výsledk byl spo ítán také pr m rný as do zdvojení, který byl pro B. Licheniformis49 minut a pro B. cereus 25 minut. Z výsledk plyne, že se testované mikroorganismy od sebe liší jak v rychlosti r stu tak i v dob trvání lag fáze.

P i vyhodnocování výsledk kultivací Ps. fluorescens bylo nutno dva kmeny vy aditze zpracovávaného souboru, protože se výrazn lišily od dalších osmi kmen . Zejména jejich koeficient „B“ byl výrazn v tší. Z tohoto d vodu byly tyto kmeny vyhodnoceny samostatn .Pr m rné hodnoty jsou uvedeny v p íslušném grafu ( ervená p ímka ).

Z vyhodnocení kultivací plyne to, že všechny kmeny Pseudomonas fluorescens mají prakticky stejnou dobu do rozdvojení (76,3 min pro soubor 8 kmen proti 75,7 min pro dva vy azené kmeny a rozdíl je v dob trvání lag fáze.

Záv r :

Metody p ímé impedan ní mikrobiologie s využitím p ístroje RABIT byly využity p i studiu odolnosti kmen Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis a Streptococcussalivarius subsp. thermophilus v i teplot v rozsahu 30 – 50 °C.Metody nep ímé impedan ní s využitím p ístroje RABIT byly použity pro porovnání vlastností soubor kmen Ps. fluorescens, B. cereus a B. licheniformis.

Dosažené a presentované výsledky potvrzují vhodnost použití p ístroje RABIT i metod impedan nímikrobiologie pro studium vlastností jednotlivých kmen mikroorganism .

Literatura : Holubová J., urda L. : Impedan ní metoda a její využití v mlékárenské mikrobiologii, sborník seminá e Mléko a sýry 2003, VŠCHT Praha 2003, 145-151

Práce vznikla za finan ní podpory grantu MSM2672286101 .

Kontaktní adresa:Ing. Vladimír erný, VÚM s.r.o. Praha, e-mail : v.cerny @vum-tabor.cz

64

ŽIN ICA AKO PROBIOTICKÁ BIODIVERZIFIKOVANÁ POTRAVINA. Keresteš Ján

NIKA s r. o., Považská Bystrica, Slovensko

Žin ica je tradi ný salašnícky výrobok naturálneho ov ieho hospodárstva. V procese koncentrácie výroby v druhej polovici 20. storo ia a hlavne ako predmet výskumu upadol do zabudnutia, ale ústne podanie technológie výroby a blahodárne ú inky na zdravie konzumenta sa zachovali.

V posledných dekádach vplyvom poklesu výroby kravského mlieka na Slovensku oproti roku 1989 až o 45 % existen né podmienky pôdohospodárov napomohli iasto nému rozvoju chovu oviec, produkcie ov ieho mlieka a ov ích mlie nych výrobkov, hlavne Slovenskej bryndze. Práve ochrana tohto výrobku, žia ktorý v Bruseli doteraz nie je právne kodifikovaný napomohla širšiemu hlavne biotechnologickému a mikrobiálnemu výskumu a rozpornosti hygienických poh adov oproti probiotickým ú inkom.

Pre výrobu žin ice, podobne Slovenskej bryndze platí zásada, že je potrebné dodržiavavšetky hygienické normy a technologické postupy a nieje možná výroba v provizórnych podmienkach. Vyrába z tepelne neošetreného mlieka môže len ten, kto zvládne technológie a tie sú náro nejšie ako vyrába z pasterizovaného mlieka.

Záujem našej spolo nosti sa sústredil na možnosti vytvorenia priemyselnej formy výroby žin ice. Ur ením rozhodujúcich fáz bola vytvorená technologická osnova v algoritme: - príprava separátu znížením obsahu kazeinu za použitia nízkych teplôt pri sýrení a zrážaní - príprava mate ných zákysov v množstve 3 % celkovo použitého separátu metodikou

spracovanou Olšanským a Kn zom - kultiváciou zakysaného separátu pri dodržaní tepelného režimu kysania, zrenia a dozrievania.

Je to rozhodujúca fáza priemyselnej výroby, pretože presne kopíruje salašnícky spôsob s cie om dosiahnutia 1 miliardy celkového po tu mikroorganizmov na 1 gr.

Žin ica je širokospektrálny mikrobiálny výrobok s obsahom asi 1700 druhov mikroorganizmov. Identifikáciu celkového po tu v 70- ich rokoch minulého storo ia stanovila Prekopová – Porubjaková ( 1976 ) a vychádzala z prác Laxu, Šveca, Olšanského a Kneza. V poslednom období dobieha identifikácia na báze DNA, ktoré vykonáva Ústav bunkovej biológie Prírodovedeckej fakulty v Bratislave vedenej Prof. Ebringerom ( 2005 ). Postup prác vychádza evolu no - filogenetickej teórie symbiózy a antagonizmu zachovania pamäti genetickej postupnosti a asovej závislosti.

V jednom grame produktu bola zistená doteraz celá škála rodového zastúpenia Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostor, Bifidobacterium, Enterococcus, Sacharomyces, Kluyveromices, mnoho alších, tak ako boli deklarované pri hodnotení výskumnej úlohy zo d a 10. 1. 2007. Pod a Ebringera je žin ica sú as ou funk ných potravín so široko diverzifikovanými ú inkami, podie ajúcimi sa na regulácii biologických procesov cicavcov.

Použitie probiotických druhov vo výrobe mlie nych produktov v po te jeden až tri, má zdravotný a výživový význam, ale nie probiotický ú inok. Potvrdzujú to doterajšie zistenia pilotných porovnávacích pokusov.

Priemyselná výroba žin ice je typickým produktom fermenta nej aktivity baktérií mlie neho kysnutia z laktózy a vznik kyseliny mlie nej, ktorá znižuje pH v reve a to je jav dôležitý z h adiska inhibície premnoženia nežiadúcich patogénov. Tento antimikrobiálny efekt je zvyšovaný produkciou špecifických inhibítorov typu baktoriocínov.

Probiotické baktérie v druhej fáze zrenia a teda produkcie bakteriocínov znižujú obsah prokarcinogénnych enzýmov v reve hlavne -glukoronidázy, nitroreduktázy, azoreduktázy a oproti tomu zvyšuje obsah -galaktozidázy, o je významné pri prevencii dôsledkov laktózovej intolerancie.( uriš 2005 )

65

Fermentáciou vzniká v procesoch zrenia a dozrievania celá rada metabolitov ako sú bioaktívne peptidy, vitamíny B – komplexu, hlavne vitamnín B –12, kyseliny listovej a produkcia esencialnej konjugovanej kyseliny linolovej. ( Soják 2005 )

Malé peptidy s obsahom 3 – 20 druhov aminokyselín spolupôsobia na aktivitu angiotensimu I. a vzniku angiotensimu II., ktorý ú inne s ahuje cievy. Laktorfíny, – kazein – exorfíny majú opiátové ú inky, kazeinofosfopeptidy. zvyšujú využite nos vápnika v zásaditom prostredí, alebo peptidy navodzujúce programovú smr buniek ( apoptózu).

Fermentáciou hlavne v tretej fáze vznikajú produkty znižujúce sérový cholesterol a to tým, že GIT v hrubom reve rozkladajú potravinovú vlákninu. Zvýšenou mikrobiálnou aktivitou vzniká dekonjugácia žl ových kyselín.

Vplyvom hlavne enterococcovej aktivity je usmer ovaný celý proces selénoproteínov s ú innos ou glutatioperoidázy ako predpokladu vylú enia vzniku prokurzoru rakoviny hrubého reva tvorbou nitrózaminov.

Mikeš a Ebringer zistili pri dlhodobom teste na 24 dobrovo níkoch štatisticky významný pokles celkového ako aj LDL cholesterolu. Prekvapivým nálezom bol pokles hladiny glykémie, sérového kreatinu, C – reaktívneho proteínu a hodnôt krvného tlaku. Oproti tomu zistenia, že v 100 gr žin ice sa nachádza až 600 mg ionizovaného vápnika je významným benefitom ( pri nižšej pH) v prevencii civiliza ných chorôb vrátane osteoporózy a spolu s vitamínom D chráni pred vznikom kolorektálneho karcionómu hlavne zvýšením vstrebávania v hrubom reve.

Hygienická hypotéza ale aj mnohí odborníci sa priklá ajú k názoru, že mnohé alergické ale aj iné ochorenia sú dôsledkom nedostato ného osídlenia makroorganizmu v priebehu ontogenézy ako aj výsledky porovnávacích štatistík mestských a vidieckych osídlení. V minulosti bola potrava bohatšia na prospešné mikroorganizmy a organizmus bol nimi intenzívnejšie osíd ovaný.Ide o akýsi kolobeh mikroflóry v prírode a práve probiotické, mikrobiálne širokospektrálne potraviny ako sú Slovenská bryndza, žin ica, parenica, oštiepky tento deficit môžu napráva .Probiotiká ako sú as funk ných potravín nám v pilotných a klinických pokusoch túto skuto nospotvrdili.

Z množstva názorov a posledných mikrobiálnych kongresov sa stabilizovala definícia probiotík takto:- Probiotiká sú živé organizmy, podávané v dostato nom množstve, zdraviu prospešnými

ú inkami gastrointestinálneho traktu (GIT) a inom anatomickom mieste hostila. - Obsadzujú receptory enterocytov, produkujú inhibi né substancie, zabra ujú lipnutiu patogénov

k revnej sliznici a spúš ajú mechanizmus syntézy cytokínov.

Využitie probiotík má v sú asnosti viac smerov a prevládajúce sú dva: - izolácie jednotlivých druhov až do molekulárnych a submolekulárnych štruktúr - symbiiotické pôsobenie v biodiverzifikovaných formách.

Pre priblíženie zložitosti problematiky uvádzame niektoré probiotické a terapeutické výsledky: - Gastroenterotídy a hna kové ochorenia - sú spôsobené zmenou revnej mikroflóry ( II. klinika

FNUK ) zodpovednej za koloniza nú rezistenciu a je sprevádzaná úbytkom mlie nych baktérií, následnou dehydratáciou a straty elektrolytov.

Pri lie ení postantibiotických hna iek sa osved ili baktérie: Lactobacillus (L ) acidophilus, L. rhamnosus, Bifidobacteriu lomgum, Enterococcus faecium a niektoré druhy Sacharomyces, ale aj infekcií Clostridium defficile.( nové zistenia )

- Zápalové ochorenia a infekcie Helicobacter pilori. Klinicky boli otestované viaceré kmene a druhy mlie nych baktérií napríklad

Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, L dulbrueckií , L. helveticus, L. acidophilus, ktoré modulujú kolonizáciu žalúdo nej mukózy helicobacterom a to vylu ovaním anti – helicobaktériovými bakteriocínmi. S ubné sú výsledky získané na CHTF v Bratislave kde Greifová zistila izoláciou supernatantov inhibi né ú inky vo i niektorým plesniam.

66

- Terapia reumatoidnej atritídy - kde ide o zmiernenie zápalových ochorení hlavne ú inkom vegetariánskej stravy a zvýšenia syntézy krátkore azcových masných kyselín v hrubom reve. V Ústave reumatických chorôb v Pieš anoch pri použití preparátu „ Metotrexát“. Baktérie rodu Enterococcus priaznivo ovplyv oval enterokolitidu.

- Terapia hepatálnej encelopatie – mlie ne baktérie fermenta nou aktivitou utvárajú podmienky na potla enie mikroflóry s prokolytickou a ureázovou aktivitou a znižovania amoniaku v krvi. Pokusy na 16 pacientoch v kombinácii so selénom boli aplikované na I. internej klinike LF UK.

- v chirurgii - pri operáciách brušnej dutiny ako probiotickú clonu namiesto antibiologickej. Vysvetlenie je v podpore produkcie krátkore azcových masných kyselín. Pozitívne ú inky boli zistené aj aplikáciou L. plantarum s kore om akanky ( obsahuje inulín ) a v terapii akútnej pankreatitídy.

- Imunomodula né a antialergické ú inkyaž 80 % imunitného systému loveka sa nachádza GIT o poskytuje možnos modulovaimunitnú odpove konzumáciou probiotickej potravy. Probiotiká regulujú imunitnú elimináciu antigénov patogénnych mikroorganizmov, ako aj imunologickú toleranciu na potravinové antigény ( Ebringer ).

Potvrdzuje sa názor, že zvýšený výskyt alergických ochorení detí v priemyselne vyspelých krajinách je dôsledkom nedostato ného osíd ovania reva mikroflórou zavineného malým konzumom fermentovaných produktov, sprísnenými hygienickými pravidlami, zvýšenou zdravotníckou starostlivos ou a chemizáciou životného prostredia. Slizni ný imunitný systém detí je po narodení vystavený iným antigenným stimulom, než na aké bol cez stáro iav priebehu mnohých generácií adaptovaný.

Žin ica je z h adiska po etnosti mikroflóry biotechnologickým výskumom na za iatku svojho probiotického uplatnenia v mliekárenskej potravinovej štruktúre a o to sa pokúsila naša spolo nos so svojím vedeckým potenciálom. Na alej budeme túto pestrú skupinu identifikovapo stránke taxonomiky, jej génového vybavenia a rozsahu biologickej aktivity. Nabáda nás k tomu, už doteraz známych vyše 100 druhov rodu Lactobacillus alebo novú štruktúru druhov Enterococcus.

Cielene chceme rozšíri naturálne syrárstvo na vyšší obsah druhovej skládky mikroflóry. Mlieko stálo a je pri zrode loveka ako prvá potravina, kyslomlie ne výrobky a multimikrobiálne syry ako forma prežitia. ( Keresteš, 2006 )

Posilnenie postavenia spotreby biodiverzifikovaných mlie nych výrobkov a zvýšenie ich spotreby je hlavnou úlohou v prevencii a terapii naj astejších ochorení ako sú kardiovaskulárne ochorenia, hyperchlosterolémia, rakovina, osteoporóza, diabetes, imunodeficiencia a infek néochorenia. K tomu by nám mali napomôc doteraz neuskuto nené zámery vytvárania národných mikrobiologických bánk a ich zachovania pre budúce generácie.

Kontaktní adresa:Ing. Ján Keresteš, NIKA spol. s r.o., Nová 135, 017 01 Povážská Bystrica, Slovenská Republika e-mail: [email protected]

67

PROTEKTÍVNE VLASTNOSTI VYBRANÝCH KME OV RODU LACTOBACILLUSHudá ek Jaroslav, *Zalán Zsolt, Chumchalová Jana, *Halász Anna

Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha,*Central Food Research Institute, Budapest

Protective properties of selected Lactobacillus strains

Summary:Ten identified lactobacilli of species Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. plantarum, Lb. paracasei and Lb. curvatuswere chosen after cultivation in skim milk, MRS broth and Jerusalem Artichoke (JA) for a determination of active acidity, titratable activity, organic acids, hydrogen peroxide and histamine. Antifungal activity was examined after cultivation of the strains in MRS broth. Antifungal activity against Fusarium spp. and Aspergillus spp. detected by agar diffusion method in two versions. In the version 1, monitoring of cells activity was investigated after cultivation in MRS broth. In version 2, inhibition of neutralized and heat treated supernatant of culture broth was retrieved. In the following step inhibitory effect of lactobacilli on growth and mycotoxin production of Asp. flavus and Asp. parasiticus was determinated by cultivation in liquid media. Mycelium mass was and production of aflatoxin B1 was determined during cultivation.

ÚvodBaktérie mlie neho kysnutia (BMK) koexistujú s vláknitými hubami a kvasinkami

v mnohých ekosystémoch, napr. v rôznych fermentovaných potravinách, kde môžu inhibova rast plesní a tým je možné ich využite ako bioochrany1. Prv sa antifungálny ú inok pripisoval naprodukovanej kyseline mlie nej a kyseline octovej. Potom sa záujem zameral na mlie nebaktérie, ktoré vykazovali produkciu zmesi organických kyselín octovej, kaprónovej, mrav ej, butyrovej a valérovej, ktoré pri pokuse javili vzájomný synergistický ú inok v inhibícií plesní. Z baktérií mlie neho kysnutia sa najviac štúdií, na potla enie rastu plesní, zabýva kme mi rodu Lactobacillus a rodu Lactococcus. Nedávno boli objavené nové antimikrobiálne aktivity vo filtráte kultúry Lbc. plantarum aktívny i proti plesniam ako F. avenaceum. alšie pokusy boli uskuto nené s baktériou Lbc. coryniformis subsp. coryniformis. Kde autori pripisujú ochranný ú inok kyseline mlie nej, octovej, peroxidu vodíka a produkcii bakteriocínov. Baktérie mlie neho kysnutia taktiež produkujú nízkomolekulárne zlú eniny2, peptidy3 a proteíny4 s antifungálnymi vlastnos ami. V sú asnosti sa mnoho nevie o tom ako tieto látky pôsobia na rast plesní. Niektoré baktérie produkujú prchajúce metabolity, ktoré môžu pôsobi na rast a sporuláciu plesní5.

Ciele práceCie om práce je príprava doplnkových zmesných laktobacilových kultúr pri výrobe

výrobkov obsahujúcich mlie nu a cereálnu zložku. Snaha je vyrobi výrobok obsahujúci protektívnu kultúru, ktorá by inhibovala ú inok možných vyskytujúcich sa plesní. Bolo vybraných desa bakteriálnych kme ov kme ov izolovaných z rôznych zdrojov, pä pochádzalo od eskéhoriešite a a pä od ma arského spoluriešite a. U týchto kme ov bola sledovaná fermentácia troch médií (MRS bujón, obnovené odstredené mlieko a arti okové médium) metódou merania aktívnej a titra nej kyslosti, produkcia organických kyselín pomocou izotachoforézy, produkcia peroxidu vodíka a produkcia histamínu ELISA metódou. alej sa sledovala antifungálna aktivita kme ovrodu Lactobacillus proti plesniam rodu Fusarium a Aspergillus metódou dvojitých agarových platní a to použitím živých bakteriálnych buniek alebo supernatantu po kultivácii laktobacilových kme ovv MRS bujóne. V alšej asti práce sme sledovali vplyv laktobacilov na rast plesní a tvorbu aflatoxínu B1 v tekutom médiu pri spolo nej kultivácii po dobu 20-tich dní pri 30 °C. Boli použité dva kmene plesní, Asp. flavus DMF 0802 a Asp. parasiticus DMF 0805. Rast plesní bol sledovaný metódou váženia mycélia. Získané hodnoty hmotnosti mycélia sa prepo ítali ako prírastok, resp. úbytok, hmotnosti mycélia vzh adom ku kontrole. Z filtrátu získaného po kultivácií sa následne izoloval, pomocou imunoafinitnej kolóny, aflatoxín B1 a jeho koncentrácia sa stanovila metódou HPLC.

68

Mikroorganizmybakteriálne kmene

Bakteriálne kmene Lbc. plantarum 01, Lbc. paracasei 05, Lbc. casei 154, Lbc. paracasei SF1, Lbc. rhamnosus VT1 použité v práci pochádzajú zo Zbierky baktérií, plesní a kvasiniek z Ústavu technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha, eská republika. Bakteriálne kmene Lbc. plantarum 2142, Lbc. casei 2750, Lbc. curvatus 2768, Lbc. curvatus 2775, Lbc. casei Shirotapoužité v práci pochádzajú od ma arského spoluriešite a Central Food Research Institute, Budapest, Hungary.

kmene plesní Kmene plesní F. proliferatum M 5689, Asp. flavus DMF 0802, Asp. parasiticus DMF 0805

použité v práci pochádzajú zo Zbierky baktérií, plesní a kvasiniek z Ústavu technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha, eská republika. A kmene plesní F. culmorum 301, F. culmorum 302, F. graminearum 608 pochádzajú z Výzkumného ústavu rostlinné výroby, Odd lení šlechtitelských metod, Praha, eská republika.

VýsledkySledovanie fermentácie média metódou merania aktívnej a titra nej kyslosti

Meraním aktívnej a titra nej kyslosti po kultivácií kme ov v médiach sa zistilo, že najlepšia fermentácia sa dosiahla po kultivácií v MRS bujóne (pH 3,7-4,1; 74,8-48,0 oSH). K horšiemu prekysávaniu dochádzalo po kultivácií kme ov v arti okovom médiu (pH 3,8-4,1; 30,2-15,0 oSH). V odstredenom mlieku bola fermentácia najslabšia (pH 5,5-6,2; 16,5-10,2 oSH).Vo všetkých médiach bola nameraná najvyššia titra ná kyslos u kme a Lbc. casei Shirota a najnižšia u kme a Lbc. rhamnosus VT1. Bolo možné sledova odlišnosti v hodnotách aktívnej a titra nej kyslosti medzi kultiva nými médiami, u všetkých kme ov kultivovaných v príslušnom médiu. Z výsledkov vyplýva, že všetky testované kmene najlepšie rástli v komplexnom médiu.

Produkcia peroxidu vodíka Najvyššia produkcia, po kultivácií v MRS bujóne, bola nameraná u kme ov Lbc. curvatus

2775 (7,5 g/ml), Lbc. casei 2750 (6,9 g/ml), Lbc. paracasei SF1 (3,8 g/ml) a Lbc. paracasei 05(2,5 g/ml). U ostatných kme ov bola nameraná koncentrácia peroxidu vodíka menej ako 2 g/ml. Po kultivácií v odstredenom mlieku najviac peroxidu vodíka produkoval kme Lbc. casei Shirota (4,83 g/ml), a ostatné kmene naprodukovali menej ako 2 g/ml. Po kultivácií kme ovv arti okovom médiu ani jeden kme nevyprodukoval viac než 2 g/ml peroxidu vodíku.

Enzymaticko imunochemická kvantitatívna analýza histamínu Produkcia histamínu bola sledovaná vo všetkých médiach. Produkcia histamínu bola

preukázaná iba po kultivácií kme a Lbc. casei 2750 v MRS bujóne a v arti okovom médiu, a to o koncentrácii 87,5 g/ml resp. 4 g/ml. Ostatné kmene za daných podmienok histamín neprodukovali.

Meranie produkcie organických kyselín metódou izotachoforéza Po fermentácii boli média použité pre ur enie kvalitativného a kvantitativného zastúpenia

organických kyselín. Koncentrácie naprodukovaných kyselín boli rozdielne v závislosti na použitom médiu a kmeni. V MRS bujóne produkovali všetky kmene kyselinu mlie nu (400 až 851 mM/l), bez dvoch kme ov (Lbc. curvatus 2768 a Lbc. casei Shirota) kyselinu octovú (25 až 150 mM/l). V obnovenom odstredenom mlieku bola kyselina mlie na naprodukovaná v koncentráciach 13 až 127 mM/l, kyselinu octovú produkovalo len šes kme ov v rozmedzí 8 až 100 mM/l. V arti okovom médiu kyselina mlie na dosiahla koncentrácie 110 až 337 mM/l, kyselina octová, ktorá bola produkovaná všetkými kme mi okrem Lbc. paracasei SF1, sa pohybovala v rozmedzí 9 až 180 mM/l. Na základe pomeru dosiahnutých koncentrácií kyseliny mlie nej a octovej je možné ur i homofermentatívny alebo heterofermentatívny priebeh fermentácie príslušnými bakteriálnymi kme mi v jednotlivých médiach (Tab. I).

69

Tabu ka I Homofermentatívny alebo heterofermentívny priebeh fermentácie jednotlivých kme ov rodu Lactobacillus v rozdielnych médiach na základe dosiahnutých koncentrácii kys. mlie nej a octovej.

kys.mlie na/kys.octová >8 kys.mlie na/kys.octová <8 Homofermentatívny / Heterofermentatívny

MRS bujón Mlieko JA bujón O1 O1 O1

O5 O5 O5 154 154 154

SF1 SF1 SF1 VT1 VT1 VT1 2142 2142 2142 2750 2750 2750

2768 2768 2768 2775 2775 2775

Shirota Shirota Shirota

Stanovenie antifungálnej aktivity metódou dvojitých agarových platní použitím živých buniek a supernatantu

Najvyššia aktivita buniek bola zistená u kme ov Lbc. curvatus 2775 a Lbc. curvatus 2768, ktoré inhibovaly rast všetkých plesní. Najcitlivejšie boli kmene F. culmorum 302 a Asp. flavusDMF 0802, ktorých rast bol potla ený bunkami všetkých bakteriálnych kme ov. V prípade aktivity supernatantu boli najú innejšie kmene Lbc. paracasei 05 a Lbc. curvatus 2768. Pri pôsobení supernatantu bol najviac potla ený rast F. culmorum 301, F. graminearum 608 a Asp. flavus DMF 0802 (Tab. II).

Tabu ka IIInhibi ný ú inok laktobacilov proti plesniam rodu Fusarium a rodu Aspergillus.

kmeF.

culmorum301

F. culmorum

302

F. proliferatum

M 5689

F. graminearum

608

Asp. flavus

DMF 0802

Asp. parasiticus DMF 0805

01 + / + + / - - / - + / + + / + - / - 05 + / + + / + - / + - / + + / + - / +

154 + / + + / - + / + + / + + / + - / + SF1 - / + + / + - / - + / + + / + - / + VT1 + / + + / + + / - - / + + / + - / - 2142 + / + + / + + / + - / + + / + - / - 2750 + / + + / - - / - + / + + / + - / + 2768 + / + + / + + / + + / + + / + + / + 2775 + / + + / + + / + + / + + / + + / -

Shirota + / + + / + + / - - / + + / + - / + aktivita živých buniek / aktivita supernatantu + ... inhibícia, - ... žiadna inhibícia

70

Antifungálna aktivita jednotlivých kme ov rodu Lactobacillus sa prisudzuje tvorbe organických kyselín, peroxidu vodíka, tvorbe bakteriocínu a alších metabolitov. Zo získaných výsledkov (tab. I), ak bol inhibi ný ú inok len v prípade použitia živých buniek (+/-) usudzujeme, že antifungálny ú inok, na rast plesní, bol spojený s tvorbou a následným pôsobením organických kyselín. Ak bola aktivita len v prípade použitia supernatantu (-/+) usudzujeme, že inhibi ný ú inoknenastáva vplyvom organických kyselín, ke že sa supernatant neutralizuje a tepelne ošetruje, ale pravdepodobne pôsobením naprodukovaných látok s antifungálnou aktivitou (nízko molekulárne a tepelne stabilné zlú eniny, bakteriocíny), ktoré sú v dostato nom množstve na za iatku rastu sledovanej plesne, a tým pádom dochádza k inhibi nému ú inku. Inhibi ný efekt sa na miskách prejavoval tvorbou inhibi nej zóny okolo kolónie živých buniek alebo okolo korkovrtu s difundovaným supernatantom, a to úplným potla ením rastu plesne alebo degradáciou mycélia a zamedzením sporulácie.

Sledovanie inhibície laktobacilov na rast plesní a produkciu aflatoxínu B1 po as spolo nej kultivácie v tekutom médiu

V alšej asti práce sme sledovali vplyv laktobacilov na rast plesní a tvorbu aflatoxínu B1 v tekutom médiu pri spolo nej kultivácii po dobu 20-tich dní pri 30°C. Boli použité dva kmene plesní, Asp. flavus DMF 0802 a Asp. parasiticus DMF 0805. Rast plesní bol sledovaný metódou váženia mycélia. Po spolo nej kultivácii sa médium v príslušných d och sledovania prefiltrovalo. Získané hodnoty hmotnosti mycélia sa prepo ítali ako prírastok, resp. úbytok, hmotnosti mycélia vzh adom ku kontrole. Výsledky sú znázornené graficky (obr.1., 2.).

Aspergillus flavus DMF 0802

50

75

100

125

5 8 14 20as (de )

hmot

nos

myc

élia

(%)

kontrola

01

05

154

SF1

VT1

2142

2750

2768

2775

Shirota

Obr. 1. Zmeny hmotnosti mycélia, oproti kontrole, Asp. flavus DMF 0802 v prítomnosti jednotlivých kme ov rodu Lactobacillus v priebehu spolo nej kultivácie v tekutom médiu.

Aspergillus parasiticus DMF 0805

0

50

100

150

200

250

5 8 14 20as (de )

hmot

nos

myc

élia

(%)

kontrola0105154SF1VT12142275027682775Shirota

Obr. 2. Zmeny hmotnosti mycélia, oproti kontrole, Asp. parasiticus DMF 0805 v prítomnosti jednotlivých kme ov rodu Lactobacillus v priebehu spolo nej kultivácie v tekutom médiu.

71

Z filtrátu získaného po kultivácií sa následne izoloval, pomocou imunoafinitnej kolóny, aflatoxín B1 (AFB1) a jeho koncentrácia sa stanovila metódou HPLC. Pri spolo nej kultivácii kme a Asp. flavus DMF 0802 s laktobacilmi nedochádzalo k tvorbe aflatoxínu na rozdiel od prípadu kultivácie Asp. parasiticus DMF 0805, kde sme stanovili príslušné koncentrácie aflatoxínu B1 v priebehu 20-tich dní sledovania. Produkcia aflatoxínu B1 u kme a Asp. parasiticusDMF 0805 bola zaznamenaná už po 5. d och spolo nej kultivácie v prítomnosti bakteriálnych kme ov Lbc. paracasei 05, Lbc. casei 154 a Lbc. paracasei SF1 o koncentrácii približne 0,025 g/ml. Po 8. dni kultivácie bola koncentrácia aflatoxínu B1 v rozmedzí 0,02-0,2 μg/ml, v prítomnosti všetkých bakteriálnych kme ov okrem kme a Lbc. rhamnosus VT1. V alších d och kultivácie koncentrácia aflatoxínu B1 postupne klesala, len v prípade prítomnosti kme aLbc. casei 2750 bola koncentrácia po 20. dni kultivácie rovná 0,167 μg/ml. Získané výsledky poukazujú na to, že v prítomnosti laktobacilov nastala produkcia aflatoxínu B1 kme om Asp. parasiticus DMF 0805 vzh adom ku kontrole, u ktorej nedochádzalo k produkcii AFB1. Ale na druhej strane, v alších d och kultivácie sa koncentrácia AFB1 znižovala, o mohlo byspôsobené práve prítomnos ou bakteriálnych buniek kme ov rodu Lactobacillus.

DiskusiaDôležitou charakteristikou kme ov baktérii mlie neho kysnutia je schopnos rastu

v komplexnom médiu a pre mliekarenský priemysel je najdôležitejšou vlastnos ou schopnos rastu v mlieku. Významným znakom kme ov, ktoré sa využívajú pri výrobe fermentovaných mlie nychvýrobkov, je produkcia organických kyselín. V mliekarenstve sa homofermentatívne kmene používajú pri výrobe syrov. Niektoré druhy sa používajú pri výrobe mlie nych výrobkov, slúžia k priemyselnej výrobe kyseliny mlie nej z melasy, pretože fermentujú laktózu. Lactobacillusplantarum našel uplatnenie pri konzervácii uhoriek a kapusty, je taktiež sú as ou kefírových z n a spolu s Lactobacillus brevis a Lactobacillus fermentum sa vyskytuje v pekárskom kvásku6,7,8.V posledných rokoch sa skúma využitie laktobacilov k ochrane cereálnych výrobkov. Jedná sa hlavne o využitie kme ov vyizolovaných z kvásku, ako napr. Lactobacillus plantarum alebo využitie kme a s potvrdenou antifungálnou aktivitou Lactobacillus rhmanosus VT19. Niektoré baktérie mlie neho kysnutia produkujú antibakteriálne, ale i antifungálne látky. Tieto látky sa dajú využi ako prírodné konzervanty a mohli by pred ži skladovate nos potravín. Jedná sa o rôznorodé látky, ale dominantné postavenie majú organické kyseliny2. Všeobecne uznávanou konzerva nou látkou je kyselina octová, pretože inhibuje rast gram-pozitívnych a gram-negatívnych baktérii, ale taktiež aj plesní. Medzi obligátne heterofermentatívne kmene laktobacilov, ktoré produkujú antifungálne látky patrí Lbc. sanfrancisco CB1, ktorý bol vyizolovaný z kvásku. Tento kme produkoval široké spektrum organických kyselín s antifungálnou aktivitou. Medzi ne patrí kyselina octová a kapronová, ktoré inhibujú rast plesne F. graminearum10. Z Lbc. plantarumMiLAB 393 bola okrem cyklických dipeptidov vyizolovaná kyselina 3-fenylmlé ná s pomerom L(+) a D(-) 9:1. Toto spektrum látok pôsobilo inhibi ne proti F. sporotrichioides a Asp. fumigatus11. Existujú tiež laktobacily, ktoré produkujú organické kyseliny na báze mastných kyselín. Okrem mastných kyselín sú tiež niektorými kme mi produkované i estery mastných kyselín. Konkrétne z Lbc. rhamnosus VT1 sa vyizolovali methylestery a 2-methyl-5-hydroxyhexanová kyselina12. Nesmieme však zabudnú zoh adni vplyv okolitých podmienok, ako je doba a teplota inkubácie, pH a kme . Preukázalo sa, že inhibícia plesní nie je spôsobená iba produkciou organických kyselín, ale i okolitými podmienkami13. Nedávno bolo objavené, že Lbc. coryniformis Si3 môže produkova antifungálne látky na základe bielkovín4. Taktiež boli identifikované antifungálne cyklické dipeptidy z Lbc. plantarum izolovaného zo siláže11. BMKspôsobia nielen na rast plesní, ale aj na tvorbu mykotoxínov. Existujú dve teórie ako dochádza k odstráneniu mykotoxínov z vodného média v prítomnosti baktérii mlie neho kysnutia. Prvou je vplyv štruktúr v bunkovej stene, kedy dôjde k naviazaniu mykotoxínu na bunkovú stenu a tým dôjde k jeho inaktivácii. Druhý prístup predpokladá, že k odstráneniu dôjde produkciou niektorých antimikrobiálnych metabolitov BMK. V poslednej dobe sa pozornos sústre uje na 3 hlavné body: a) väzba lactobacillus-mykotoxin; b) stabilita vzniknutého komplexu; c) vplyv inkuba ného asu

72

na väzbu toxínu14. Rast Asp. parasiticus sledovaný vážením suchého mycélia bol spo iatku ve mi rýchly v zmesnej kultúre, než ke plese rástla samotná, ale nárast plesne na konci inkubácie bol porovnate ný v obidvoch kultivovaných kultúrach. Je to možné tým, že bakteriálne metabolity môžu stimulova rast plesne v po iato nej fáze inkubácie15. Viac ako 2% hm. kyseliny mlie nejprítomnej v médiu nepodporoval len rast Asp. parasiticus, ale ur itá koncentrácia stimulovala biosyntézu aflatoxínu16. Efekt mlie nanu sodného na produkciu aflatoxínu je funkciou po iato néhopH. Nedisociované organické karboxylové kyseliny, než ich ionizovaná forma, majú sklon bytransportované cez bunkové membrány a spomali alebo zvýši metabolizmus bunky. Preto pH blízke neutrálnemu je nepriaznivé pre kyselinu mlie nu transportujúcu sa cez membránu a to môže by dôvod pre o tieto zložky stimulujú produkciu aflatoxínu17.

ZáverNa základe meraní aktívnej a titra nej kyslosti, peroxidu vodíka, histamínu a organických kyselín sa zistil výrazný vplyv použitého kultiva ného média Najvyššia aktivita buniek bola zistená u kme ov Lbc. curvatus 2775 a Lbc. curvatus 2768, ktoré inhibovaly rast všetkých plesní. V prípade aktivity supernatantu boli najú innejšie kmene Lbc. paracasei 05 a Lbc. curvatus 2768 Prítomnos laktobacilov má zna ný vplyv na rast a produkciu aflatoxínu B1, o sa zistilo v priebehu spolo nej kultivácie v tekutom médiu Z uskuto nených pokusov boli získané pozitívne výsledky, ktoré sa dajú v budúcnosti zoh adnipri príprave doplnkových zmesných laktobacilových kultúr pre výrobu produktov obsahujúcich mlie nu a cereálnu zložku.

Po akovanieTáto práca vznikla s podporou výskumného zámeru CEZ: MSM 6046137305 a projektu CZ – HU 5/2004. Autor alej akuje Mgr. Sv tlane Sýkorovej CSc. za poskytnutie kme ov plesní rodu Fusarium.

Literatúra1. SCHNÜRER J., MAGNUSSON J. Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Trends Food Sci.

Technol., 2005, vol. 16, pp. 70-78. 2. NIKU-PAAVOLA M. L., LAITILA A., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A. New types

of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol.,1999, vol. 86, pp. 29-35.

3. OKKERS D. J., DICKS L. M. T., SILVESTER M., JOUBERT J. J., ODENDAAL H. J. Characterization of pentocin TV35b a bacteriocin like peptide isolated from Lactobacillus pentosus with a fungistatic effect on Candida albicans. J. Appl. Microbiol., 1999, vol. 87, pp. 726-734.

4. MAGNUSSON J., SCHNÜRER J. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad spectrum proteinaceous antifungal compound. Appl. Environ. Microbiol., 2001, vol. 67, pp. 1-5.

5. WISEMAN D. W., MARTH E. H. Growth and aflatoxin production by Aspergillus parasiticus when in the presence of Streptococcus lactis. Mycopathologia, 1981, vol. 73, pp. 49-56.

6. GOBETTI M., CORSETTI J. Lactobacillus sanfrancisco a key sourdough lactic acid bacterium: a review. Food Microbiol., 1997, vol. 14, pp. 175 – 187.

7. ŠILHÁNKOVÁ L. Mikrobiologie, str. 57 – 60, 297, 303 – 304, Victoria Publishing, Praha 2002. 8. LAVERMICOCCA P., VALERIO F., VISCONTI A. Antifungal activity of phenyllactic acid against

molds isolated from bakery products. Appl. Environ. Microbiol., 2003, vol. 69, pp. 634 – 640. 9. LAITILA A., ALAKOMI H-L., RAASKA L., MATTILA-SANDHOLM T., HAIKARA A. Antifungal

activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro nad in malting of barley. J. Appl. Microbiol., 2002, vol. 93, pp. 566 – 576.

10. CORSETTI A., GOBETTI M., ROSSI J., DAMINIANI P. Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of mixture of organic acids by Lactobacillus sanfrancisco CB1. Appl. Microbiol.

73

Biotechnol., 1998, vol. 50, pp. 253-256. 11. STRÖM K., SJÖGREN J., BROBERG A., SCHNÜRER J. Lactobacillus plantarum MiLAB 393

produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo(L-Phe-L-Pro) and cyclo(L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro) and 3-Phenyllactic acid. Appl. Environ. Mocrobiol., 2002, vol. 68, pp. 4322-4327.

12. PETRÁKOVÁ H. Diplomová práce, VŠCHT, Praha, 2002 13. GOURAMA H., BULLERMAN L. B. Anti-aflatoxigenic activity of Lactobacillus casei

pseudoplantarum. Int. J. Food Microbiol., 1997, vol. 34, pp. 131 – 143. 14. PELTONEN K., EL-NEZAMI H. S., HASKARD C. A., AHOKAS J., SALMINEN S. Aflatoxin B1

binding by dairy strains of lactic acid bacteria and bifidobacteria. Journal of Dairy Science, 2001, vol. 84, no. 10, pp. 2152-2156.

15. EL-GENDY S. M., MARTH E. H. Growth and aflatoxin production by Aspergillus parasiticus in the presence of Lactobacillus casei. Journal of Food Protection, 1980, vol. 44, pp. 211-212.

16. EL-GAZZAR F. E., RUSUL G., MARTH E. H. Growth and aflatoxin prodution by Aspergillusparasiticus NRRL 2999 in the presence of lactic acid and at different initial pH values. Journal of Food Protection, 1987, vol. 50, pp. 940-944.

17. LUCHESE R. H., HARRIGAN W. F. Growth of, and aflatoxin production by Aspergillus parasiticuswhen in the presence of either Lactococcus lactis or lactic acid and at different initial pH values. Journal of Applied Bacteriology, 1990, vol. 69, pp. 512-519.

Kontaktná adresaJaroslav Hudá ek ([email protected]), VŠCHT, Technická 5, 166 28 Praha 6

Plakátová sd lení

77

ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA A BUN NÁ LYSE KMEN LACTOCOCCUS LACTIS Abrlová Magdaléna, Šviráková Eva, Hlavsová Barbora, Plocková Milada


Basic characterization and cell lysis of Lactococcus lactis strains

Summary:This work was aimed at basic phenotypical characterizations and lytic abilities of Lactococcus lactis

strains (NIZO R5, NIZO B643, HMM 81 and AM2) in different media. All strains were specified as Lactococcus lactis subsp. lactis on the base of phenotypical characterizations (pH tolerance (9.2, 9.6), NaCl tolerance (2; 4 a 6,5 % w/w), methylen blue tolerance (0.1 % w/w), arginine hydrolysis, citrate fermentation, nisin production, MICnisin), although the AM2 strain was kept as Lactococcus lactis subsp.cremoris in world microbiological collections.

Lytic abilities of lactococci were measured in citrate buffer at the temperature 13°C after 12 days. Lactococcus lactis subsp. lactis NIZO B643 was located as medium lytic strain (cell lysis was from 10 till 30 %) and Lactococcus lactis strains (NIZO R5, HMM 81 and AM2) were located as highly lytic strains (cell lysis were more than 30 %). No prophage was released in Lactococcus lactis AM2 during assignment of presence of thermo-inducible prophage in lactococal strains (in LM17 broth at the temperature 30 and 39 °C after 8 h). Also Lactococcus lactis strains (NIZO R5, NIZO B643 and HMM 81) were non-lytic on condition of this method.

ÚvodBun ná lyse je d sledkem enzymatické degradace peptidoglykan bun né st ny bakterií

endogenními peptidovými hydrolasami – lysiny. Dochází k ní jak u grampositivních, tak u gramnegativních bakterií. Probíhá se za podmínek, které vedou k zastavení syntézy peptidoglykan (nap íklad p i hladov ní nebo jiných nep íznivých podmínkách v bu kách.

Bakterie mlé ného kvašení, u nichž dochází k bun né lysi lze použít jako starterové kultury, nap . p i fermentaci mléka. ízení a zvyšování lyse bakterií mlé ného kvašení je nezbytným faktorem p i kontrole a urychlení zrání sýr . Bakterie mlé ného kvašení produkují intracelulární enzymy (peptidasy, lipasy a enzymy pro metabolismus aminokyselin), které hrají klí ovou roli p i vývoji aroma b hem zrání sýr [1].

Cíle práceCílem této práce bylo zjistit:

• základní fenotypickou charakteristiku laktokok• autolysu laktokok v citrátovém pufru • prokázat uvoln ní termoindukovatelného profága u laktokok .

Materiál a metody

Použité kmenyLactococcus lactis subsp. lactis NIZO B 643 (National Collection of Dairy Organisms, Reading, Velká Británie) Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 (University College Cork, Irsko) Lactococcus lactis subsp. lactis NIZO R5 (Netherlands Institute for Dairy Research, Department of Biophysical Chemistry and Genetics, Ede, Nizozemí) Lactococcus lactis subsp. lactis HMM 81 (Vysoká škola chemicko-technologická v Praze,

eská republika).

Fenotypizace laktokokMezi základní fenotypické charakteristiky laktokokových kmen pat ily: r st p i pH 9,2 a 9,6; tolerance k NaCl (2; 4 a 6,5 % hm.), tolerance k methylenové mod i (0,1 % hm.) v mléce, hydrolysa argininu, fermentace citrát , produkce nisinu a MICnisinu).

78

Lyse laktokok v citrátovém pufruB hem 12 denní kultivace laktokok v citrátovém pufru p i teplot 13 °C byla m ena absorbance (A650). Procento bun né lyse bylo vypo ítáno podle rovnice 1: [(A0 - At)/A0] · 100 (rovnice 1), kde A0 je po áte ní absorbance a At je absorbance m ená v ase t [1].

D kaz p ítomnosti termoindukovatelného profágaPro uvoln ní termoindukovatelného profága, který zp sobuje bun nou lysi laktokok za zvýšené teploty, byla použita kultivace laktokok v bujónu LM17 p i teplotách 30 a 39 °C. Je-li profág p ítomen, projeví se lysí bun k kultivovaných p i vyšší teplot . Teplota 39 °C odpovídá po áte nífázi výroby sýr typu edar, tzv. edarování [3].

Výsledky

Fenotypizace laktokok

Tabulka I Fenotypické vlastnosti kmen Lactococcus lactis

Tolerance k pH Tolerance k NaCl [% hm.] Kmen L.lactis

9,2 9,6 2 4 6,5 Tolerance k met. mod i

[0,1 % hm.]

NIZO R5 + - + + + +

HMM 81 + - + + - +

NIZO B 643 + - + + - +

AM2 + + + + + + +/-…positivní/negativní reakce

Tabulka II Další fenotypické vlastnosti kmen Lactococcus lactis

Kmen L.lactis Fermentace citrát Hydrolýza argininu Produkce nisinu [IU·ml-1]

MICnisinu[IU·ml-1]

NIZO R5 + + 330 500

HMM 81 + + 0 50

NIZO B 643 + + 0 10

AM2 + + 0 10 +/-…positivní/negativní reakce

79

Autolysa laktokok

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 2 6 8 12as (den)

abso

rban

ce (-

)

HMM81B643AM2

Obr. 1. Pr b h lyse kmen L. lactis v citrátovém pufru p i teplot 13 °C b hem 12 dn .

Tabulka III Lyse laktokok v citrátovém pufru p i teplot 13 °C za 12 dní

Kmen L. lactis Bun ná lyse [%]

NIZO R5 38

HMM 81 44

NIZO B 643 26

AM 2 36

Uvoln ní termoindukovatelného profága z laktokok

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 1 2 3 4 5 6 7

as (h)

abso

rban

ce (-

)

AM2 t=30°CAM2 t=39°C

Obr. 2. Uvoln ní termoindukovatelného profága z laktokok p i teplotách 30 a 39 °C.

80

Záv ry• Kmeny Lactococcus lactis vykazovaly obvyklý fenotypický projev. Kmen Lactococcus

lactis subsp. cremoris AM2 se jevil jako poddruh lactis.• Autolysy laktokok se v citrátovém pufru lišily. Kmeny Lactococcus lactis (HMM 81,

NIZO R5 a AM2) byly vysoce lytické, kmen Lactococcus lactis NIZO R5 se jevil jako st edn lytický.

• K uvoln ní termoindukovatelného profága a k lysi bun k u kmene Lactococcus lactis subsp. lactis AM2 za podmínek použité metody nedošlo.

Pod kováníTato práce byla podpo ena Ministerstvem školství, mládeže a t lovýchovy eské republiky (výzkumný zám r MSM 6046137305).

Literatura1. Lortal S., Chapot-Chartier M.-P.: Role, mechanism and control of lactic acid bacteria in cheese.

Int. Dairy J. 15, 857 - 871 (2005). 2. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.C., Monnet V.: Simple tests for predicting lytic behavior

of lactococcal strains in cheese. J. Dairy Sci. 81, 2321 - 2328 (1998). 3. O‘Sullivan, D., Ross, R. P., Fitzgerald, G. F., Coffey, A.: Investigation of the relation between

lysogeny and lysis of Lactococcus lactis in cheese using prophage – targeted PCR. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2192 - 2198 (2000).

Kontaktní adresaMagdaléna Abrlová, [email protected]

81

CHARAKTERIZÁCIA RASTU LACTOBACILLUS RHAMNOSUS GG V MLIEKU Medve ová Alžbeta, Valík ubomír, Liptáková Denisa, Bajúsová Barbora

Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave

Characterization of growth of the Lactobacillus rhamnosus GG in milk

Summary:Growth of L. rhamnosus GG in terms of growth rate and lag phase was described in temperature range from 6 °C to 50 °C. Lag-phase duration of L. rhamnosus increased with decreasing of incubation temperature under the equation 1/lag = 0.0006T2 – 0.0003T + 0.0331 (R2

lag = 0.9876). Growth rate was significantly positively related to increase of incubation temperature in accordance with the Ratkowsky´s model: Gr = 0.0235T – 0.0191 (R2

Gr = 0.9963) as well as modified Arrhenius model acording to Davey: lnGr = -5.3166 + 0.2472T – 0.003T2 (R2

Gr = 0.9964). Based on this equations, optimal temperature Topt = 40.5 to 41.1 °C for growth and metabolism was calculated. The results found in this work may contribute to the information sources that are needed in selection and application of probiotics in dairy industry.

Lactobacillus rhamnosus GG patrí medzi grampozitívne, fakultatívne anaeróbne alebo mikroaerofilné, nepohyblivé, pali kovité, katalázo-negatívne, nespórotvorné baktérie. Pre svoj rast vyžaduje riboflavín, kyselinu folovú, vápnik, pantotén a nicín (2). Dobre rastie v slabokyslých médiách s po iato nou hodnotou pH 6,4 až 4,5. Patrí k mezofilným mikroorganizmom, ale v závislosti od kme a dokáže rás pri teplotách nad 40 °C a aj pri teplotách nižších ako 15 °C. Hexózy fermentuje výlu ne na L(+) kyselinu mlie nu pod a Embden-Meyerhofovej dráhy. Pentózy fermentuje v aka tvorbe aldolázy a fosfoketolázy. Pri nedostatku glukózy fermentuje hexózy na kyselinu mlie nu, kyselinu octovú, etanol a kyselinu mrav iu (4).

L. rhamnosus nie je schopný fermentova laktózu a rafinózu. Dokáže ale fermentovagalaktózu, maltózu, sacharózu, manitol, ramnózu, glukózu, manózu, ribózu, fruktózu a sorbitol. Okrem toho je schopný fermentova látky ako sú amygdalín, celobióza, eskutín, glukonáty a melezitóza (2, 7).

Bunky Lactobacillus rhamnosus majú pali kovitý tvar, rastú bu samostatne alebo v krátkych retiazkach. Majú sploštené konce a ich rozmery sú 0,8 až 1,0 x 2,0 až 4,0 μm (9).

Pozornos mliekarenských technológov a mikrobiológov sa sústre uje hlavne na jeho probiotické vlastnosti a antimikrobiálnu aktivitu vo i kontaminujúcim mikroorganizmom. Tieto vlastnosti sa komer ne používajú vo forme ochranných kultúr aplikovaných do fermentovaných a aj nefermentovaných mlie nych výrobkov, ovocných nápojov, syrov, šalátov a na fermentáciu suchých salám na potla enie rastu Staphylococcus aureus (3, 7, 8).

Cie om našej práce bolo popísa dynamiku rastu Lactobacillus rhamnosus GG v UHT mlieku v závislosti od teploty inkubácie.

Materiál a metódy Kme Lactobacillus rhamnosus GG pochádza od fínskych mikrobiológov Ouwehanda

a Salminena a s ich vedomím nám ho poskytla Dr. Lauková zo Štátneho veterinárneho ústavu v Košiciach.

Paralelne nao kované vzorky UHT mlieka štandardnou 18h kultúrou L. rhamnosussa inkubovali pri teplotách v rozmedzí od 6 do 50 °C. V príslušne stanovených asovýchintervaloch sa odoberali množstvá vzorky potrebné na stanovenie po tu L. rhamnosus GG (MRS agar; Biomark, Pune, India).

Po ty L. rhamnosus GG boli vyhodnotené v závislosti od asu inkubácie pod a Baranyiho modelu (1). Rastové parametre z príslušných rastových iar boli podrobené analýze v sekundárnej fáze matematického modelovania mikrobiálneho rastu.

82

Výsledky a diskusia Výsledky pokusov z paralelne vykonaných kultiva ných stanovení po tov L. rhamnosus

GG v UHT mlieku sú uvedené na obr. 1 a 2. Pre lepšiu názornos sú na obr. 1 znázornené rastové iary L. rhamnosus GG pri teplotách 6, 8, 12, 15 a 18 °C a na obr. 2 sú rastové iary pri teplotách

21, 30, 35 a 41 °C. Znázornené hodnoty pH mlieka, v pozadí rastových iar, sa po as trvania všetkých pokusov prakticky nemenili. Dôvodom môže by skuto nos , že Lactobacillus rhamnosusGG nie je schopný utilizova laktózu a ani konvertova kyselinu pyrohroznovú na kyselinu mlie nutakou rýchlos ou akou prebieha glykolýza, a preto kyselinu pyrohroznovú pravdepodobne odbúrava na metabolity ako acetoín, diacetyl alebo acetát (5).

2

3

4

5

6

7

8

9

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264t [h]

log

KTJ

.ml-1

LGG_6

LGG_8

LGG_12

LGG_15

LGG_18

pH

Obr. 1. Dynamika rastu kultúry L. rhamnosus GG a hodnoty pH v mlieku v závislosti od teploty inkubácie

2

3

4

5

6

7

8

9

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33t [h]

log

KTJ

.ml-1

LGG_21LGG_30

LGG_35

LGG_41

pH

Obr. 2. Dynamika rastu kultúry L. rhamnosus GG a hodnoty pH v mlieku v závislosti od teploty inkubácie

83

Napriek tomuto nedostatku vykazoval L. rhamnosus GG dobrý rast a v stacionárnej fáze dosiahol po ty vyššie ako 108 KTJ/ml pri všetkých inkuba ných teplotách, okrem okrajových teplôt 6, 8 a 50 °C. Je zaujímavé, že hoci pomaly, ale rástol aj pri teplote 6 °C, kedy po 10 d ochinkubácie rástol v exponenciálnej fáze. So zvyšujúcou sa teplotou inkubácie sa skracoval as trvania lag-fázy a rýchlos rastu v exponenciálnej fáze sa zvyšovala. Najkratší as potrebný na dosiahnutie stacionárnej fázy bol zaznamenaný pri teplote 41 °C (9h), so zvyšujúcou sa teplotou sa táto doba za ala predlžova a to nazna uje, že teplota 41 °C by mohla by optimálnou teplotou pre rast L. rhamnosus GG. Pre potvrdenie tohto predpokladu sme namerané rastové parametre podrobili

alšej analýze.

Vplyv teploty na rastovú rýchlos Lactobacillus rhamnosus GGVplyv teploty na rastovú rýchlos mikroorganizmov v oblasti suboptimálnych teplôt sa

asto popisuje Ratkowského odmocninovým modelom, ktorý linearizuje závislos medzi rastovou rýchlos ou a teplotou inkubácie. Pre charakterizáciu rastu študovaného kme a je preto potrebné ur i koeficienty týchto všeobecne platných vz ahov. Na ich základe je potom s definovanou pravdepodobnos ou omylu možné vypo íta rastovú rýchlos , resp. predpoveda rast v podobnom prostredí vzh adom na teplotu inkubácie bez potreby vykonáva alšie experimenty.

V našom prípade bola závislos odmocniny rastovej rýchlosti od teploty lineárna v rozmedzí teplôt 6 až 41 °C. Táto závislos , popísaná rovnicou Gr = 0,0235T – 0,0191 (R2

Gr = 0,9963) je znázornená na obrázku 3. So zvyšujúcou sa teplotou inkubácie sa rastová rýchlossmerom k optimálnej rastovej teplote lineárne zvyšovala. Pri optimálnej teplote bola rýchlos rastu prirodzene maximálna (Gr = 0,859 h-1) a alej sa so zvyšovaním inkuba nej teploty už len znižovala. Takéto správanie sa kultúry v celej oblasti inkuba ných teplôt sa dá popísamodifikovaným Arrheniusovým modelom pod a Davey-a. Na základe prispôsobovania polynomických rovníc rôzneho stup a sme získali rovnicu: lnGr = -5,3166 + 0,2472T - 0,003T2

(R2Gr = 0,9964). Z tejto funkcie sa pomocou aplikácie softvéru Microsoft Excel, tzv. Riešite om

vypo íta optimálna teplota rastu L. rhamnosus GG, Topt = 41,1 °C (vk = 4,6%).

y = 0.0235x - 0.0191R2 = 0.9963

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

5 10 15 20 25 30 35 40 45

T [°C]

sqrt

_rat

e

Obr. 3. Grafické znázornenie závislosti odmocniny rastovej rýchlosti (gr) L. rhamnosus GG v mlieku od teploty inkubácie

Vplyv teploty na trvanie lag-fázy Lactobacillus rhamnosus GGFaktory, ako fyziologický stav kultúry (príprava inokula) a prispôsobovanie sa buniek

novým podmienkam prostredia ovplyv ujú d žku lag-fázy. Trvanie lag-fázy L. rhamnosus GG bolo v našich pokusoch ur ované teplotou inkubácie štatisticky vysoko významne pod a vz ahu, ktorého grafické znázornenie je na obr. 4.

84

1/lag = 0.0006T2 - 0.0003T + 0.0331R2 = 0.9876

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 10 20 30 40 50T [°C]

1/la

g

lag-1

Obr. 4. Grafické znázornenie závislosti trvania lag-fázy (lag) L. rhamnosus GG v mlieku od teploty inkubácie

Z tohto vz ahu, tak ako aj z jeho grafického znázornenia je zrejmé, že so zvyšujúcou sa teplotou inkubácie sa trvanie lag-fázy prirodzene skracovalo. To súvisí s rýchlejším prispôsobovaním sa buniek na podmienky prostredia. Táto rovnica má ale svoje obmedzenie, platí len v rozsahu teplôt 6 až 45 °C. Pri teplote 50 °C rástla kultúra takmer bez lag-fázy, preto jej reciproká hodnota bola nevy íslite ná (0/1) a nevhodná pre matematické spracovanie.

Overenie optimálnej teploty pre rast kultúry Lactobacillus rhamnosus GG v mlieku Po as experimentov sa okrem rastu Lactobacillus rhamnosus GG sledovali aj zmeny

hodnôt pH mlieka. Tieto boli síce nepatrné, ale aplikáciou pod a Baranyiho (1) bolo v niektorých prípadoch možné vypo íta parametre ako lag-fáza pH (pHlag) a rýchlos poklesu pH (pHr) po asrastu vyšetrovanej kultúry v mlieku. Na vhodnos podmienok pre metabolizmus L. rhamnosus GG v mlieku by mohol poukáza sú in týchto parametrov, ktorý v prípade rastu Baranyi a kol. (1) definoval ako fyziologický stav kultúry. Sú in hodnôt pHlag a pHr v závislosti od teploty v našom prípade vykazoval kvadratický priebeh s oblas ou maxima v intervale okolo teploty 40 °C. Táto oblas teplôt na základe obidvoch súvisiacich a navzájom aj odlišných parametrov pHlag a pHrcharakterizovala optimálne podmienky pre metabolizmus L. rhamnosus GG. Na základe grafického znázornenia závislosti fyziologického stavu kultúry od teploty a pomocou “Riešite a” (Microsoft Excel) sa vypo ítala optimálna teplota pre metabolizmus vyšetrovanej kultúry, Topt = 40,5 °C (vk = 6,3%).

Týmto sme tiež overili a potvrdili už vypo ítanú optimálnu teplotu pre rast. Obidve vypo ítané optimálne teploty sú navzájom ve mi blízke a so zna nou istotou môžeme poveda , že optimálna teplota pre rast a metabolizmus Lactobacillus rhmanosus GG sa nachádza v oblasti 40,5 až 41,1 °C.

Kme Lactobacillus rhamnosus GG, ktorý preukázal ve mi dobré rastové schopnosti v rozmedzí teplôt 6 až 50°C, by mohol by využitý ako probiotikum v mlie nych produktoch, i už kyslých alebo sladkých. Získané výsledky nazna ili, že ak by sa pridával do kyslomlie nych

produktov, zachovával by si svoju schopnos prežíva v nich aj pri odporú anej teplote skladovania. Skuto nos , že zmeny pH v mlie nom médiu neboli výrazné, nazna ujú možnú aplikáciu študovanej kultúry aj pri výrobe pasterizovaného mlieka, pri om by sa nemenili jeho senzorické vlastnosti.

Po akovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy

. APVV-20-005605.

85

Použitá literatúra:1. BARANYI, J., ROBERTS, T. A., McCLURE, P. A non-autonomous differential equation

to model bacterial growth. In Food Microbiology, 1993, vol. 10, p. 43-49. 2. CURRY, B., CROW, W. Lactobacillus casei group. In ROGINSKI H., FUGUAY, J. W., FOX,

P. F. Encyclopedia of Dairy Sciences. San Diego: Academic Press, 2003, vol. 3, p. 1488 – 1494. 3. ERKKILÄ, S., SUIHKO, M. L., EEROLA, S., PETÄJÄ, E., MATTILA-SANDHOLM, T. Dry

sausage fermented by Lactobacillus rhamnosus strains. In International Journal of Food Microbiology, 2001, vol. 64, p. 205-210.

4. GÖRNER, F., VALÍK, . Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd., Bratislava: Malé Centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7.

5. JYOTI, B. D., SURESH, A. K., VENKATESH, K. V. Effect of preculturing conditions on growth of Lactobacillus rhamnosus on medium containing glucose and citrate. In Microbiological Research, 2004, vol. 159, no. 1, p. 35 – 42.

6. ØSTLIE, H. M., HELLAND, M. H., NARVUS, J. A.: Growth and metabolism of selected strains of probiotic bacteria in milk. In International Journal of Food Microbiology, 2003, vol. 87, no. 1 – 2, p. 17 – 27.

7. RODGERS, S. Preserving non-fermented refrigerated foods with microbial cultures. In Trendsin Foods Science and Technology, 2001, vol. 12, no. 8, p. 276 – 284.

8. TYÖPPÖNEN, S., PETÄJÄ, E., MATILLA-SANDHOLM, T. Bioprotectives and probiotics for dry sausage. In International Journal of Food Microbiology, 2003, vol. 83, no. 3, p. 233 – 244.

9. WOOD, B. J. B., HOLZAPFEL, W. H. The generea of lactic acid bacteria. London: Blackie Academic and Professional, 1995, 420 p. ISBN 075140215X

Kontaktná adresa:Ing. Alžbeta Medve ová, Doc. Ing. ubomír Valík, PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

86

VÝB R JOGURTOVÉ KULTURY PRO SÓJOVÉ VÝROBKY Pavlasová Marcela, Dvo ák Milan, Dvo áková Eva, Chumchalová Jana


Selection of a yoghurt culture for soy products

Summary:The aim of this study was to select the most suitable yoghurt culture for making fermented soy products. The selection of culture was made on the basis of titratable and active acidity, total counts of yoghurt culture and sensory analysis. Among the three yoghurt cultures (YO-401, Danisco, Denmark; Laktoflora, Milcom, CR; YC-350, Chr. Hansen, Denmark), the culture YC-350 reached the highest counts of streptococci and lactobacilli and the lowest acidity after fermentation after 8 hours of incubation at 35 °C. For sensory analysis, soy fermented products were manufactured to the decrease in the pH 4.6. All these products contained more then 108 CFU.g-1 of yoghurt cultures and amount of streptococci was comparable. The culture YC-350 (Hansen) reached the highest counts of lactobacilli at pH 4.6 (1.4×108 CFU.g-1). It was found using the Friedman test that soy fermented products did not differ, within each other significantly (P<0.05).

Úvod:

Jogurtová kultura je tvo ena homofermentativními bakteriemi mlé ného kvašení -Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus. Laktobacily jsou mikroaerofilní grampozitivní nesporotvorné ty inky, které se asto vyskytují v etízcích a tvo íporcelánov kompaktní hmotu najednou v celém médiu. Streptokoky adíme mezi aerobní grampozitivní koky, zkvašující sacharidy za vzniku L(+) kyseliny mlé né. V kravském mléce je jejich spole ný r st popisován jako symbiotický [1], kde se jejich vzájemný pom r pohybuje v rozmezí 2:1 až 1:2. V sójovém médiu se tento vzájemný vztah neprokázal [2] a jejich pom r se v pr b hu fermentace m ní [3]. Zatímco laktobacily rostou v sójovém médiu pomalu, streptokoky se adaptují na sójové médium dob e a vykazují zde vysoký nár st.

I proto se jogurtová kultura používá p i výrob sójových analog fermentovaných výrobkpat ící mezi sójové fermentované výrobky druhé generace. Jejich výhodou jsou pozitivní ú inky na organismus, jako je hypocholesterolemický efekt, prevence proti osteoporose a proti n kterýmdruh m onkologických onemocn ní [4,5].

Nevýhodou sóji je limitující zastoupení sirných aminokyselin a valinu [6]. Fermentované sójové výrobky doprovází atypická chu (tzv. lušt ninová), která je zp sobena vznikem nízkomolekulárních látek oxidací lipid lipooxygenasami a která lze zmírnit nap . p idáním ovocného komponentu.

Cílem práce bylo vybrat jogurtovou kulturu vhodnou pro sójové médium na základzhodnocení parametr získaných p i m ení r stové k ivky a výsledk získaných ze vzorkp ipravených pro senzorickou analýzu.

Materiál a metody:

Jogurtové kultury. Pro fermentaci byly použity kultury YO-401, Danisco, Dánsko, Laktoflora, Milkom, R a YC-350, Chr. Hansen, Dánsko.

Sledování r stu a metabolické aktivity kultur. Hodnoty pro r stové k ivky byly získány fermentací sójového média nezávisle t emi jogurtovými kulturami v 1 hodinových intervalech p i teplot 35 °C po dobu 8 hodin. Pro stanovení po t jogurtové kultury byla použita plotnová metoda, dále byly zaznamenány hodnoty titra ní a aktivní kyselosti (postup viz Obrázek 1). Pokusy byly provedeny celkem dvakrát pro každou kulturu, z hodnot byly spo teny pr m ry.

87

P íprava a rozbory vzork pro sensorickou analýzu. Jogurtové kultury byly kultivovány v sójovém médiu (Klasik, Sunfood, R) p i teplot 35 ˚C. Fermentace byla ukon ena p i dosažení hodnoty pH 4,6. U vzniklých výrobkbyly stanoveny po ty mikroorganism jogurtové kultury. Pro senzorickou analýzu byly p ipraveny výrobky bez p íchuta s ovocnou p íchutí (20 % hm.).

Hodnocení sensorické analýzy. Pro posouzení sensorických rozdíl mezi výrobky bylo použito po adovéhotestu. 30 hodnotitel obdrželo 2 skupiny výrobk - 3 vzorky neochucené a 3 ochucené ovocnou složkou. Vzorky ve skupinm li hodnotitelé samostatn se adit podle intenzity zkoumaného znaku pro každý úkol. Po adí pro jednotlivé vzorky a úkoly se se etly a statisticky vyhodnotily Friedmanovým po adovým testem.

Obrázek 1 Postup p i rozboru vzorku

Výsledky a diskuze:

R st a produkce kyselinSledováním r stových k ivek (viz Obrázek 2) bylo zjišt no, že nejlépe rostla v sójovém

médiu kultura YC-350, která obsahovala po ty jogurtové kultury 4,3·108 JTK.g-1, z toho streptokok 2,3·108 JTK.g-1 a laktobacil 1,9·108 JTK.g-1. Dále Laktoflora - jogurtová kultura 3,2·108 JTK.g-1, streptokok 3,2·108 JTK.g-1 a laktobacil 5·106 JTK.g-1. Nejmén laktobacil bylo zjišt no u kultury YO-401 s po tem 4,7·103 JTK.g-1, po ty streptokok 2,6·108 JTK.g-1 a celkové jogurtové kultury 2,6·108 JTK.g-1.

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

1,0E+09

0:00 1:00 2:00 3:00 4:00 5:00 6:00 7:00 8:00as [hod]

poty

MO

[JTK

.g-1

]

Laktoflora streptokoky YO-401 streptokokyYC-350 streptokoky Laktoflora laktobacilyYO-401 laktobacily YO-350 laktobacily

Obrázek 2 Po ty streptokok a laktobacil u sledovaných jogurtových kultur b hem kultivace p i teplot 35 °C po dobu 8 hodin

PLOTNOVÁMETODAlaktobacily

MRS agar pH 5,2anaerobne

37 °C, 3 dny

PLOTNOVÁMETODA

streptokokyM17 agaraerobne

42 °C, 1 den

VZOREK

stanoveníaktivní

kyselosti

odber pro stanovenípoctu MO

stanovenítitracní

kyselosti

HOMOGENIZACE

REDENÍfyziologickým

roztokem

ODBER 1 ml

Pocty narostlých MO

PLOTNOVÁMETODAlaktobacily

MRS agar pH 5,2anaerobne

37 °C, 3 dny

PLOTNOVÁMETODA

streptokokyM17 agaraerobne

42 °C, 1 den

VZOREK

stanoveníaktivní

kyselosti

odber pro stanovenípoctu MO

stanovenítitracní

kyselosti

HOMOGENIZACE

REDENÍfyziologickým

roztokem

ODBER 1 ml

Pocty narostlých MO

88

Nejlépe prokysávala kultura YC-350 (viz Obrázek 3), po 8 hodinách kultivace dosahovala pH hodnoty 4,2 a titra ní kyselost 73 mmol.kg-1. U kultury Laktoflora a YO-401 byla hodnota pH shodná (pH 4,5). U Laktoflory byla nam ena titra ní kyselost 61 mmol.kg-1, u YC-350 66 mmol.kg-1.

Obrázek 3 Hodnoty titra ní a aktivní kyselosti u sledovaných jogurtových kultur b hem kultivace p i teplot35 °C po dobu 8 hodin

Rozbor pro sensorickou analýzu P i prokysání sójového média jogurtovými kulturami do pH 4,6 (viz Obrázek 4) byly

zjišt ny nejvyšší po ty jogurtové u kultury YO-401. Tato kultura dosáhla celkových po tjogurtové kultury 8,3·109 JTK.g-1, avšak po ty laktobacil byly velmi nízké (4,1·102 JTK.g-1).Nejvíce laktobacil bylo zjišt no u kultury YC-350 (1,4·108 JTK.g-1).

1,0E+00

1,0E+02

1,0E+04

1,0E+06

1,0E+08

1,0E+10

poty

MO

[JTK

.g-1

]

Laktoflora YC-350 YO-401název kultury

laktobacily streptokoky jogutová kultura celkem

Obrázek 4 Po ty streptokok , laktobacil a celkové jogurtové kultury u sledovaných jogurtových kultur po kultivaci p i teplot 35 °C do pH 4,6

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0:00 1:00 2:00 3:00 4:00 5:00 6:00 7:00 8:00 as [hod]

pH [-

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

titra

ní k

ysel

ost [

mm

ol.k

g-1]

Laktoflora aktivní kyselost YO-401 aktivní kyselostYC-350 aktivní kyselost Laktoflora titra ní kyselostYO-401 titra ní kyselost YC-350 titra ní kyselost

89

Sensorická analýza Po adovým testem byly zjišt ny sou ty po adí, pr m ry po adí a tyto hodnoty porovnány

s kritickou hodnotou 2, která je pro 3 vzorky na hladin pravd podobnosti ( =0,05) rovna 5,99. Porovnáním s vypo tenou hodnotou Friedmanova testu (viz Tabulka I a Tabulka II) bylo zjišt no(všechny hodnoty byly nižší než kritická hodnota), že se jednotlivé kultury mezi sebou významnneliší. Tento výsledek m že být dán také tím, že fermentované sójové výrobky nejsou b žnrozší ené a respondenti nem li vytvo ený vlastní standard pro hodnocení.

Tabulka I Statistické vyhodnocení Friedmanovým po adovým testem pro vyrobené sójové fermentované výrobky se sledovanými jogurtovými kulturami - výrobky bez p íchutVýrobek bez p íchut Pr m rné po adíHodnocený znak

Friedman.test Laktoflora YC-350 YO-401

Textura na lži ce 0,9 2 2,1 1,9 V n vzorku 4,2 1,7 2,1 2,2 P íjemnost kyselé chuti 4,2 1,7 2,1 2,2 Intenzita nep íjemné chuti 4,3 1,7 2 2,3 Celkový dojem 2,9 1,8 2 2,2 Poznámka: Kritická hodnota 2 pro 3 vzorky je 5,99 (pro = 0,05)

Tabulka II Statistické vyhodnocení Friedmanovým po adovým testem pro vyrobené sójové fermentované výrobky se sledovanými jogurtovými kulturami - výrobky s ovocnou p íchutí Výrobek s ovocnou p íchutí Pr m rné po adíHodnocený znak

Friedman.test Laktoflora YC-350 YO-401

Textura na lži ce 2,6 2,2 1,8 1,9 V n vzorku 0,3 2,1 2 1,9 P íjemnost kyselé chuti 3,3 2,1 2,2 1,7 Intenzita nep íjemné chuti 0,5 1,9 2,1 2 Celkový dojem 1,4 2,2 2 1,8

Záv r:Protože se sensoricky výrobky významn nelišily, byly porovnávány empirické hodnoty

získané z r stových k ivek. Za nejvhodn jší kulturu lze tedy považovat YC-350 od firmy Chr. Hansen, která vykazovala nejvyšší nár st jogurtové kultury (zejména pak laktobacil ) i nejvyšší hodnotu titra ní kyselosti.

Dále bylo pozorováno, že laktobacily v sójovém médiu rostou tém lineárn a mají menší zastoupení než streptokoky, což by bylo zajímavé prozkoumat podrobn ji p i p íštích pokusech.

Pod kování:Práce byla podpo ena výzkumným zám rem CEZ: MSM 6046137305.

90

Použitá literatura:1. Kurultay, S., Öksüz, Ö., Kaptan, B. : Determination of the effects of different amino acids,

sodium formate and their combinations on some growth characteristics of mixed and single cell cultures of yoghurt bacteria. J. Tekirdag Agricult. Facult. 2(2), 153-160 (2005).

2. Chumchuere, S., Robinson, R.K.: Selection of starter cultures for the fermentation of soya milk, Food Microbiol. 16, 129-137 (1999).

3. Dvo ák, M.: Jogurty na bázi sóji s probiotickou mikroflórou. Diplomová práce, ÚTMT, VŠCHT 2005.

4. Andersson, J.J.B., Anthony, M., Messina, M., Garner, S.C.: Effects of phyto-estrogens on tissues. Nutr. Res. Rev. 12, 75-116 (1999).

5. Setchell, K.D.R., Cassidy, S.: Dietary isoflavones: biological effect and relevance to human health. J. Nutr. 129, 758S-767S (1999).

6. Velíšek, J.: Chemie potravin I. kap.2.1.1.1.1, str. 7. Ossis, Tábor 1999.

Kontaktní adresa:Marcela Pavlasová ([email protected]), Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko- technologická v Praze, Technická 5, 16628 Praha 6.

91

SKRÍNING VYBRANÝCH STARTOVACÍCH KULTUR NA P ÍTOMNOST DNA SEKVENCÍ KÓDUJÍCÍCH DEKARBOXYLÁZY Ú ASTNÍCÍ SE TVORBY

BIOGENNÍCH AMINBurdychová Radka, Komprda Tomáš

Ústav technologie potravin agronomické fakulty MZLU v Brn

Screening of selected starter cultures for the presence of DNA sequences coding for decarboxylases causing biogenic amine production

Summary:Biogenic amines (BA) are low-molecular organic bases which are normal constituents of many foods. BA are mainly generated by decarboxylation of the corresponding amino acids through substrate-specific enzymes produced by present microorganisms. Microorganisms with a decarboxylase activity can be starter microorganisms or other spontaneous microflora. Several methods have been described to determine the BA production by microorganisms. The newest methods are based on detection of genes encoding microbial decarboxylases responsible for the production of BA. Here, seven different starter cultures used in the production of fermented sausages were screened for the presence or absence of specific DNA sequences coding for tyrosine decarboxylase. PCR with a set of specific primers TDC2/TDC5 was used. The PCR analysis of DNA from two starter cultures confirmed the presence of DNA sequences for tyrosine decarboxylase. A detailed analysis of the starter cultures showed that DNA sequences for tyrosine decarboxylase are contained in genomic DNA of Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei.These results show suitability of the described PCR method for the screening of starter cultures for the presence of the gene for tyrosine decarboxylase that is responsible for the production of the biogenic amine tyramine.

Úvod:Biogenní aminy jsou organické bazické slou eniny, k jejichž produkci dochází v r zných

typech potravin jako jsou sýry, víno, pivo, trvanlivé salámy nebo rybí produkty1. K toxikologicky nejvýznamn jším biogenním amin m pat í histamin, tyramin, putrescin a kadaverin. Nejvíce prostudovaným je tyramin, a to díky jeho fyziologickým ú ink m. Tyramin zvyšuje krevní tlak, zp sobuje migrény s bolestí hlavy, v krajních p ípadech m že být i p í inou krvácení do mozku, resp. selhání srdce. Toxický ú inek tyraminu závisí na p ijatém množství, p ítomnosti jiných biogenních amin (násobení ú ink ) a na celkovém fyziologickém stavu jedince2.

Základními podmínkami pro vznik tyraminu jsou p ítomnost volné aminokyseliny tyrosinu v substrátu (potravin ), p ítomnost mikroorganism s dekarboxylázovou aktivitou a vhodné podmínky pro r st a množení mikroorganism . N které mikroorganismy kódují tyrosindekarboxylázu, enzym ú astnící se tvorby tyraminu z volného tyrosinu. P ítomnost této specifické DNA sekvence byla popsána u bakterií náležejících do rod Lactobacillus,Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus a u mnoha zástupc eledi Enterobacteriaceae3.Zástupci uvedených rod mikroorganism se používají jako startovací kultury p i výrobfermentovaných potravin živo išného p vodu.

N které kmeny bakterií používané do startovacích kultur produkují výše popsaný enzym, ú astnící se tvorby nežádoucího toxického biogenního aminu tyraminu z volného tyrosinu p ítomného v potravin 4. Dekarboxylázová aktivita mezi kmeny ur itého druhu se m že lišit dokonce až o t i ády, existují i kmeny bez dekarboxylázové aktivity4. Proto je v praxi nutné testovat vždy konkrétní použité bakteriální kmeny.

V asná detekce enzymu tyrosindekarboxylázy, respektive specifické DNA sekvence, která ho kóduje, je pro potraviná ský pr mysl vzhledem k ochran spot ebitele velmi d ležitá.Pro rychlou detekci p íslušné specifické DNA sekvence ve startovacích kulturách jsou vhodné metody molekulární biologie. Pro skríning startovacích kultur byla použita nedávno publikovaná metoda polymerázové et zové reakce (PCR), která umož uje rychlou, velmi citlivou a specifickou detekci cílového genu. Tato PCR byla popsána5 v roce 2004. Modifikovaná varianta publikované PCR metody je v této práci použita pro ov ení sedmi startovacích mikrobiálních kultur, ur ených pro výrobu fermentovaných potravin, na p ítomnost genu kódujícího enzym tyrosindekarboxylázu.

92

Materiál a metody: Bakteriální kmeny a jejich r stové podmínky:

Startovací kultury ur ené pro výrobu fermentovaných tepeln neopracovaných trvanlivých salám (BioCarna, N mecko) byly kultivovány na PCA, MRS a M17 agaru (Merck, N mecko). Pro rozlišení a identifikaci jednotlivých mikrobiálních druh byly použity komer ní API testy (Biomerieux, Francie), kataláza test a Gramovo barvení. Složení použitých startovacích kultur je uvedeno v Tab. I.

Bakteriální bu ky Enterococcus faecalis CNRZ 2385 byly kultivovány v médiu s kanamycinem, eskulinem a azidem sodným (KEAA, Merck, N mecko) p i 37 °C. Kultura byla použita jako pozitivní kontrola pro PCR.

Tabulka I: Použité startovací kultury pro výrobu fermentovaných výrobk , výrobce BioCarna

Detekce DNA sekvencí pro tyrosindekarboxylázuíslo

startovacíkultury

Ozna enístartovací kultury

výrobcem

Složení startovacích kultur(bakteriální druhy) celková DNA DNA z isté

kultury

1 PPX Pediococcus pentosaceus Staphylococcus xylosus - -

-

2 SG1 Staphylococcus carnosus Streptomyces griseus - -

-

3 SC1 Staphylococcus carnosus Lactobacillus curvatus + -

+

4 PLS Pediococcus acidilactici Staphylococcus carnosus Lactobacillus plantarum

----

5 CXK Staphylococcus carnosus Staphylococcus xylosus Lactobacillus sakei

+--+

6 PPLX Pediococcus pentosaceus Lactobacillus plantarum Staphylococcus xylosus

----

7 SLG1 Staphylococcus carnosus Lactobacillus plantarum Streptomyces griseus

----

+ sekvence detekována, - sekvence nedetekována

Izolace DNA a PCR:Lyze bun k startovacích kultur, izolace DNA z bakteriálních kultur, její purifikace a

zp sob kontroly koncentrace a istoty byly provedeny dle6,7. Pro amplifikaci specifické DNA sekvence kódující bakteriální tyrosindekarboxylázu byla použita dvojice specifických oligonukleotidových primer TD2/TD55. PCR reakce byla provedena v termocyklátoru PTC 130 (MJ Research, Waltham, MA, USA). PCR byla provedena v celkovém objemu 25 l a obsahovala 10 ng purifikované DNA, 10 pmol každého primeru TD2/TD5, 1U HotStar Taq DNA polymerázy a p íslušné množství HotStar Master Mixu (Qiagen, Hilden, N mecko). Templátové DNA byly nejprve denaturovány inkubací p i 95 °C 15 min. DNA byla amplifikována ve 30 cyklech

93

(denaturace p i 95 °C 45 s, hybridizace primer p i 52 °C po dobu 45 s a syntéza komplementárního DNA et zce p i 72 °C 75 s). V posledním amplifika ním cyklu byla teplota 72 °C prodloužena na 10 min, a to pro kompletní dosyntetizování finálního PCR produktu. PCR produkty byly detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy na p ístroji Easy, model B1 (Owl Scientific, USA) a vizualizovány na UV transluminátoru (EB-20E Ultralum, USA) po nabarvení ethidium bromidem (0,5 μg/ml). Jako pozitivní kontrola PCR byla použita DNA purifikovaná z bun kEnterococcus faecalis CNRZ 238, jako negativní kontrola PCR byly použity komponenty PCR bez DNA.

Výsledky a diskuse: Produkce biogenního aminu tyraminu byla již d íve popsána u ady mikroorganism

používaných jako startovací kultury p i výrob fermentovaných výrobk živo išného p vodu4.Vzhledem k tomu, že je t eba pro prevenci rizika, které pro spot ebitele plyne z p ítomnosti biogenních amin ve fermentovaných potravinách produkci biogenních amin snížit nebo zcela eliminovat, vyvstává nutnost startovací kultury pe liv vybírat a testovat.

P i testování metody PCR pro skríning studovaných startovacích kultur (viz Tab. I) na p ítomnost i nep ítomnost genu pro tyrosindekarboxylázu bylo nejprve nutné ov it specifitu PCR. Do PCR reakce byla jako DNA templát použita purifikovaná DNA izolovaná z bakteriálního kmene Enterococcus faecalis CNRZ 238, který byl popsán5 jako producent tyrosindekarboxylázy. V reakci byl amplifikován PCR produkt p edpokládané velikosti (1100 bp). Pro PCR byla v této práci na rozdíl od5 použita HotStar Taq DNA sm s (Qiagen), která obsahuje HotStar Taq DNA polymerázu spolu s p íslušnými komponentami PCR. Tato polymeráza je modifikovanou formou Taq DNA polymerázy. V PCR sm si je v inaktivovaném stavu, takže nemá žádnou polymerázovou aktivitu. Absence polymerázové aktivity brání extenzi nespecificky hybridizovaných primer a vzniku primerových dimer , které se mohou tvo it p i nízkých teplotách na po átku PCR a b hem prvního PCR cyklu. HotStar Taq DNA polymeráza je aktivována desetiminutovou až patnáctiminutovou inkubací p i 95 °C8. Koncentrace polymerázy je vzhledem k ostatním komponentám sm si již optimalizována, což minimalizuje tvorbu nespecifických PCR produkt a zaru uje dobrou amplifika ní ú innost enzymu. PCR pufr obsahuje vyváženou kombinaci KCl a (NH4)2SO4, které jsou d ležité pro specifickou hybridizaci primer s DNA matricí. Optimalizovaná koncentrace ho e natých iont zaru uje dobrou ú innost reakce a reak ní specificitu. Pro optimalizaci PCR je nutné pouze ov ení vhodného množství DNA a po tu PCR cykl , obojí bylo v této práci testováno. Optimální bylo použití 10 ng DNA do PCR sm si a 30 cyklpolymerázové et zové reakce.

Po ov ení specificity a funk nosti byla PCR použita pro skríning startovacích kultur používaných pro výrobu fermentovaných potravin (Tab. I). Po izolaci a purifikaci celkové DNA z jednotlivých sm sných startovacích kultur byla tato DNA použita jako matrice pro PCR. Specifické PCR produkty o ekávané velikosti (1100 bp) byly detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy ve sm sné kultu e SC1 ( . 3, obsahující mikroorganismy Staphylococcus carnosus a Lactobacillus curvatus) a CXK ( . 5, obsahující mikroorganismy Staphylococcus carnosus,Staphylococcus xylosus a Lactobacillus sakei) ( íslování kultur viz Tab. I). Detekce specifických PCR produkt v t chto sm sných kulturách je uvedena na Obr. 1.

Po detekci p ítomnosti genu pro tyrosindekarboxylázu ve sm sných startovacích kulturách byly tyto sm sné kultury kultivovány a purifikovány s použitím specifických kultiva ních p d.P ítomnost jednotlivých bakteriálních druh v istých kulturách byla ov ena provedením základních biochemických reakcí. Z istých kultur jednotlivých bakteriálních druh byla dále izolována a purifikována DNA, která byla použita jako DNA matrice (10 ng) pro PCR. Postup detekce genu pro tyrosindekarboxylázu byl stejný jako u kontrolního kmene. Specifické PCR produkty se amplifikovaly s použitím DNA bakterií druhu Lactobacillus sakei a Lactobacillus curvatus (Tab I). Uvedené nespecifikované kmeny t chto dvou bakteriálních druh byly tedy identifikovány jako potenciální producenti tyrosindekarboxylázy a mohou se tedy ve fermentovaných potravinách ú astnit tvorby biogenního aminu tyraminu.

94

10001200

500

bp bp

1100

M 1 2 4 5 6 73 8 9

Vzhledem k ochran konzumenta p ed nežádoucími vlastnostmi tyraminu, který mohou za vhodných podmínek9 startovací kultury . 3 a . 5 (Tab I) obsahující druhy Lactobacillus sakei a Lactobacillus curvatus tvo it, se výrobci analyzovaných startovacích kultur nedoporu uje tyto mikroorganismy používat a distribuovat.

Obr. 1. PCR detekce sekvencí kódujících tyrosindekarboxylázu v celkové DNA izolované ze startovacích kulur. M: 100 bp ladder (New England Biolabs), b h . 1 – 7: startovací kultury . – 7 (Tab.1), b h . 8: pozitivní kontrola - E. faecalis CNRZ 238 (COTON a kol., 2004), b h . 9: negativní kontrola (komponenty PCR bez DNA)

Použitá literatura:1. BRINK, B. T., DAMINK, C., JOOSTEN, H. J., HUIS IN´T VELD, J. Occurence and formation of

biologically active amines in foods. Int. J. Food Microbiol. 1990, 11, s. 73 – 84. 2. SILLA-SANTOS M. H. Biogenic amines: their importance in foods. Int J Food Microbiol. 1996, 29: s.

213 – 231. 3. SHALABY, A. R. Significance of biogenic amines in food safety and human health. Food Res. Int.

1996, 29, s. 675 – 690. 4. KOMPRDA, T., SM LÁ, D., PECHOVÁ, P., KALHOTKA, L., ŠTENCL, J., KLEJDUS, B. Effect of

starter culture, spice mix and storage time and temperature on biogenic amine content of dry fermented sausages. Meat Sci. 2004, 67, 4: s. 607 – 616.

5. COTON, M., COTON, E., LUCAS, P., LONVAUD, A. Identification of the gene encoding a putative tyrosine decarboxylase of Carnobacterium divergens 508. Development of molecular tools for the detection of tyramine-producing bacteria. Food Microbiol. 2004, 21, s. 125 – 130.

6. SAMBROOK, J., MACCALLUM, P., RUSSELL, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd. ed. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001. 2344 s.

7. AUSUBEL, F. M., BRENT, R., KINGSTON, R. E., MOORE, D. D., SEIDMAN, J. G., SMITH, J. A., STRUHL, K. Current protocols in molecular biology. New York: Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. 1994. 350 s.

8. DRÁBER, P., PET Í EK, M., BOUBELÍK, M., BRDI KA, R., ZADINA, J. Pokroky v PCR technologii a jejím využití. Pracovní materiály seminá e. 1. vyd. Praha: Ústav molekulární genetiky AV R. 1993. 550 s.

9. KOMPRDA, T., SM LÁ, D., NOVICKÁ, K., KALHOTKA, L., ŠUSTOVÁ, K., PECHOVÁ, P. Content and distribution of biogenic amines in Dutch-type hard cheese. Food Chemistry. 2007, 102, s. 129 – 137.

Kontaktní adresa:Ing. Radka Burdychová, Ph.D., Ústav technologie potravin Agronomické fakulty MZLU v Brn ,Zem d lská 1, 613 00 Brno, email: [email protected], tel: +420 545 13 3334

95

VPLYV BAKTÉRIÍ MLIE NEHO KYSNUTIA NA RASTSTAPHYLOCOCCUS AUREUS V MLIEKU

Bajúsová Barbora, Valík ubomír, Liptáková Denisa, Medve ová Alžbeta Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave

Effect of lactic acid bacteria on growth of Staphylococcus aureus in milk

Summary:The behaviour of Staphylococcus aureus 2064 and lactic acid bacteria (LAB) were studied in co-culture in milk in temperature range from 10 to 25 °C. Effect of temperature, inoculum density and Iactic acid development by LAB on the growth of S. aureus 2064 is showed by the changes of growth curves and calculated growth parameters. S. aureus did not reach the counts indicating presence of its enterotoxins during cultivation with Iactic acid bacteria of the various inoculum (0.5, 1, 2, 4 and 6 % v/v).

Pod spolo ným názvom „baktérie mlie neho kysnutia“ (BMK) radíme skupinu nie striktne taxonomicky definovaných baktérií, ktoré sú však fylogeneticky podobné a vyzna ujú sa mnohými spolo nými fyziologickými a ekologickými vlastnos ami1. V sú asnosti sa v princípe medzi tzv. BMK po ítajú rody (v abecednom poradí): Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weisella.

Baktérie mlie neho kysnutia sú prirodzenými antagonistami nežiadúcich mikroorganizmov v potravinách. Hlavným inhibi ne pôsobiacim faktorom pri fermentácii mlieka je nízka hodnota pH spôsobená vzniknutou kyselinou mlie nou pri om smerodajná je koncentrácia nedisociovanej kyseliny mlie nej. Ú inné sú aj iné kvantitatívne menej významné sekundárne metabolity. Vzh adom na druhy BMK a fermentovaný substrát to môžu by aj iné organické kyseliny, bakteriocíny, CO2, peroxid vodíka, etanol, diacetyl, nízky redoxný potenciál, vy erpanie živín, nahromadenie rôznych metabolitov1. Tieto faktory môžu p sobi individuálne alebo synergicky.

V ov om mlieku získanom a spracovanom na salaši je Staphylococcus aureusnajfrekventovanejším podmienene patogénnym mikroorganizmom2. Jeho pôvodným prame om sú mlie na ž aza oviec, pokožka udí a prostredie. Dôležitým faktorom jeho rizikovosti v ov om hrudkovom syre a potom v syre bryndza sú spôsob a podmienky spracovania ov ieho mlieka na hrudkový syr3,4. S. aureus pritom m že by inhibovaný alebo sa m že rozmnoži na denzity produlcujúce rizikové množstvo stafylokokových enterotoxínov5. Natívne prítomné baktérie mlie neho kysnutia, ktoré sa roznmožujú pri výrobe ov ieho hrudkového syra však množenie a toxínotvorbu S. aureus m žu inhibovat.

Pod a niektorých autorov, asi jedna tretina až 80% plazmakoagulázo-pozitívnych kme ovS. aureus produkuje za vhodných podmienok enterotoxíny, ktoré zaprí i ujú alimentárne otravy u udí6,7. Stafylokokové toxíny sú termostabilné, a preto ani tepelná úprava kontaminovaného mlieka tento problém nerieši. Dôležité preto je, potla it rast S. aureus v štádiu, kým koncentrácia toxínov nie je dostato ne vysoká pre vyvolanie enterotoxikózy. Pri optimálnom kysnutí mlíeka je inhibícia rastu S. aureus v aka metabolizmu BMK prirodzená. Pod a Holzapfela8 prídavok štartovacích kultúr napomáha procesu fermentácie a vzniknuté organické kyseliny pôsobia inhibi ne na rast patogénnych mikroorganizmov.

Predmetom tejto práce bolo preto túto skuto nost overit a kvantitatívne popísa vz ahymedzi zú astnenými BMK, konkrétne mezofilnou kultúrou AC zloženou z laktokokov a Lactobacillus acidophilus a kmefiom Staphylococcus aureus 2064 spolo ne nao kovaných do mlieka.

Materiál a metódy Kme Staphylococcus aureus 2064 bol izolovaný z ov ieho syra na Štátnom veterinárnom

a potravinovom ústave v Prešove (poskytnutý MVDr. Haniélyovou). Identifikácia tohto kme a bola dodato ne potvrdená systémom API (BioMérieux, Marcy l‘Etoile, Francúzsko).

96

Po as subkultivácie kme a Staphylococcus aureus 2064 a kultúry AC v mlieku pri teplotách 10°C, 15°C, 18°C, 21°C a 25°C sa po ty S. aureus zis ovali v príslušných asovýchintervaloch na Baird-Parkerovom agare (ImunaPharm, Šarišské Micha any, SR) podla STN ISO 6888. Baktérie mlie neho kysnutia kultúry AC sa do mlieka pridávali v po iato ných inokuláciách 0,5%, 1 %‚ 2 %, 4 % a 6 % (obj.). Po ty KTJ/ml kultúry AC sa stanovovali orienta ne na agare Ml7 (Merck, Darnistatd, SRN). Sú asne sa zis ovali hodnoty pH a titra nej kyslosti. Aktívna kyslos bola stanovená pH metrom Radelkis OP-201 (Budapeš , Ma arsko), potenciálna kyslos sa stanovila titra ne (cNaOH = 0,25 mo1.l-1 ; indikátor fenolftaleín).

Zo zistených po tov sa zostrojili rastové iary, ktoré sa podrobili primárnemu modelovaniu pod a Baranyiho9, výsledkom ktorého boli vypo ítané rastové parametre (rastová rýchlos , lag-fáza a i.). Rastové parametre z príslušných rastových iar boli podrobené analýze v sekundárnej fáze matematického modelovania mikrobiálneho rastu.

Výsledky a diskusia Na obr. 1 až 6 sú znázornené rastové iary kme a S. aureus 2064 po as spolo nej

kultivácie s kultúrou AC v mlieku pri teplotách 18°C, 21°C a 25°C. Ako možno vidie z grafov, na rast S. aureus vplývala teplota skladovania a tiež po iato ný po et baktérií mlie neho kysnutia.

Pri teplote 18 °C (obr. 1 a obr. 2) sa 50 zvyšujúcim sa prídavkom kultúry AC rastová rýchlos S. aureus znižovala. Pri 0,5% prídavku kuhúry AC dosiahla rastová rýchlos S. aureushodnotu GrSa = 0,066 h-1, pri om S. aureus narástol (Nmax - N0) o 1,7 log poriadku. Pri 2% prídavku kultúry AC (obr. 2) sa táto rýchlos znížila na GrSa = 0,055 h-1 a nárast S. aureus bol už len o 1,2 log. Z prezentovaných obrázkov je tiež vidie , že S. aureus rástol pri nezmenených hodnotách P14, teda v ase, kedy metabolizmus BMK bol ešte v tzv. lag-fáze (lagpH).

Obr. 1 a 2. Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 a mezofilnej kultúry AC (0,5% a 2%) po as spolo nej kultivácie v mlieku pri 18°C.

Táto skuto nos sa potvrdila aj v nasledujúcich pokusoch vykonaných pri teplote 21 °C (obr. 3 a 4). Prídavok 1 % kultúry AC umožnil S. aureus nárast o 1,6 log a rastová rýchlos dosiahla hodnom 0,090 h-1. Zvýšenie prídavku BMK na 2% ešte výraznejšie ovplyvnilo rast S. aureus,o sa ukázalo na alšom znížení rastovej rýchlosti S. aureus GrSa = 0,038 h-1. Za týchto podmicnok

S. aureus zvýšil svoj po et len o 0,5 logaritmického poriadku.

97

Obr. 3 a 4. Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 a mezofilnej kultúry AC (1% a 2%) po as spolo nej kultivácie v mlieku pri 21°C.

Pri fermentácii mlieka 1% inokuláciou BMK pri teplote 25°C (obr. 5) S. aureus dosiahol rastovú rýchlos 0,293 h-1, o bola najvyššia rýchlos zo všetkých vykonaných pokusov. Avšak pri 2% inokulácii kultúrou AC S. aureus znížil rastovú rýchlos o 65 %‚ na 0,104 h-1.Nárast S. aureus pri 1 a 2% inolculácii kultúrou AC bol 1,6 log a 0,75 log v poradí.

Obr. 5 a 6. Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 a mezofilnej kultúry AC (1% a 2%) po as spolo nej kultivácie v mlieku pri 25°C

Záver V pokusoch sa potvrdila všeobecne známa skuto nos , že BMK a v našom prípade

kultúra AC pósobia inhibi ne na rast S. aureus 2064. Za podmienok našich experimentov sa rast študovaného kme a S. aureus zastavil pri všetkých vyšetrovaných teplotách. Inhibícia jeho rastu bola tým ú iinnejšia, ím bol po iato ný prídavok kultúry AC vyšší a teplota inkubácie nižšia. Ani pri jednom z vykonaných z pokusov S. aureus nedosiahol po ty 106 KTJ.ml-1, ktoré by mohli znamena riziko prítomnosti enterotovínov7,11.

Po akovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy . APVV-20-005605.

98

Použitá literatúra: 1. ADAMS, R., NICOLAIDES, L.: Review of the sensitivity of different foodborne pathogens

to fermentation. Food Control, 199‘7, vol. 8, p. 227-239. 2. ELE KO, J., JACKOVA, A. VASIL, M.: Dynamika výskytu mastitíd pri klasickom ru nom

a strojovom dojení oviec. Chov oviec a kóz, 23, 2003, .2, s. 15-17. 3. GRIEGER, C., BEDNARCIKOVA, E. A VERDON, F.: Vplyv zrenia ov ieho hrudkového syra

na rastovú kriku Staphylococcus aureus. Veteriná ství, 1979, ro . 29, . 9, s. 407-409. 4. GYARMATHY, E.: Spracovanie ov ieho mlieka a charakteristika mlie nych výrobkov.

In: Problematika rozvoja chovu oviec na Slovensku. [HTML dokument]. Nitra, SPU [cit. August 2003]. Dostupný z http ://www .agroporadestvo .sk.

5. ASPERGER, H., ZANGERL, P.: Staphylococcus aureus. In ROGINSKI H., FUQUAY J.W., FOX P.F.:Encyclopedia of Dairy Sciences. San Diego: Academic Press, 2003, vol. 4, p. 2563- 2509.

6. BALABAN, N., RASOOLY, A.: Staphylococcal enterotoxin. International Journal of food Microbiology, 2000, vol 61, p. 1-10.

7. GÖRNER, F., VALIK, L.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd., Bratislava: Malé Centrum, 2004, 528 s. ISBN 80-967064-9-7.

8. HOLZAPFEL, W.H., GIESEN, R., SCHILLINGER, U.: Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes. International Journal of Food Microbiology, 1995, vol. 24, p. 343-362.

9. BARANYI, J., ROBERTS, T. A., McCLURE, P.: A non-autonomous differential equation to model bacterial growth. Food Microbiology, 1993, vol. 10, p. 43-49.

10. HOLZAPFEL, W.H.: Use of starter cultures in fermentation on hausehold scale. Food control, 1997, vol. 8, p. 241-258.

11. LINDQVIST, R., SYLVEN, S., VAGSHOLM, I.: Quantitative microbial risk assessment by Staphylococcus aureus in unripened cheese made from raw muk. International Journal of Food Microbiology, 2002, vol. 78, p. 155-170.

12. STN ISO 6888. Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na stanovenie po tu baktérií Staphylococcusaureus. Metóda po Ítania kolónií. Slovenský ústav technickém normalizácie, 1997, 16 s.

Kontaktná adresa: Ing. Barbora Bajúsová, Doc. Ing. Lubomír Valík PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Radlinského 9, 81237 Bratislava, Slovensko

99

VLIV KOMBINACE LYSOYZYMU A LAKTOKOK PRODUKUJÍCÍCH NISINNA R ST BACILLUS CEREUS DMF 2001 V MODELOVÉM SYSTÉMU MLÉKA UHT

Šviráková Eva, Ostap uk Radek, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha

Influence of combination of lysozyme and nisin-producing lactococci on the growth of Bacillus cereus DMF 2001 in the model UHT milk system.

Summary:This work was focused on monitoring of common effect of Lactococcus lactis subsp. lactis (NIZO R5 or HMM 32 strain) and lysozyme (100 mg l-1) on the growth of Bacillus cereus DMF 2001 in the model UHT milk system (0.5 % w/w milk fat content). The density of B. cereus DMF 2001 was on the decrease in three decimal reduction (from density 3.6 · 107 CFU ml-1 till 3.0 · 104 CFU ml-1) by the growth of L. lactis subsp.lactis NIZO R5 (nisin-producing strain, 330 IU nisin ml-1 of LM17 broth, and lactic acid-producing strain) and also by using of lysozyme (100 mg l-1) in the UHT milk. The density of B. cereus DMF 2001 was on the decrease in one decimal reduction (from density 3.6 · 107 CFU ml-1 till 1.6 · 106 CFU ml-1)by the growth of L. lactis subsp. lactis HMM 32 (nisin-non-producing strain and lactic acid-producing strain) and also by using of lysozyme (100 mg l-1) in the UHT milk. The significative common effect of lactococcal strains (producing nisin and lactic acid) and lysozyme was proved during inhibition of B. cereus DMF 2001 in the model UHT milk system. The role of the nisin produced in situ was not underlying and some significative differences between effects of nisin-producing and nisin-non-producing strains were not proved in the work.

ÚVODB. cereus je grampozitivní, aerobní, sporulující bakterie b žn se vyskytující v p d ,

na rostlinách, a také v syrových materiálech (nap . syrové mléko aj.). Št pí bílkoviny za vzniku amoniaku a sacharidy fermentuje s mén významnou tvorbou kyselin [1]. Jeho spory jsou odolné v i vysokým (pastera ním) i nízkým (chladni kovým) teplotám [2]. Spory, p ítomné v potraviná ských výrobcích, p edstavují zvýšené zdravotní riziko.

a) b) Obr. 1. Mofrologický obraz (a) (médium PEMBA) a mikroskopický obraz (b) (zv tšení 1600 ×) B. cereus 2008 [3].

Kmeny L. lactis produkují mnoho antimikrobiálních látek. Jde p edevším o kyselinu mlé nou, která p irozen snižuje pH potraviny a pozastavuje nebo inhibuje r st n kterých mikroorganism [4], ale také o r zné bakteriociny (diplococcin, lactostrepcin, lactococcin, lacticin 481, bac, nisin) [5]. V mlékárenském pr myslu nej ast ji používá nisin [6].

Nisin p ímo rozrušuje cytoplazmatickou membránu grampozitivních (G+) vegetativních bun k, což vede k jejich lysi [7]. Nisin inhibuje germinaci spor grampozitivních bakterií [8]. V eské republice ( R) se nisin (E 234) používá jako konzerva ní látka nap . p i výrobmlékárenských výrobk typu zrající a tavené sýry v nejvyšším p ípustném množství 12,5 mg kg-1

potraviny [9]. Lysozym hydrolyticky št pí (1-4) glykosidické vazby N-acetylmuramové kyseliny

a N-acetylglukosaminu v peptidoglykanu bun ných st n G+ bakterií [10]. Ú inn p sobí

100

p i prevenci germinace spor Clostridium tyrobutyricum v sýrech. V R se v mlékárenském pr myslu p ipouští použití lysozymu jako konzerva ní látky (E 1105) u p írodních zrajících sýrv nezbytném množství [9].

P i kombinaci p sobení nisinu s lysozymem na bu ky nejd íve p sobí lysozym (vznik sféroplastu), nisin následn perforuje cytoplazmatickou membránu a dojde k bun né lysi [11].

CÍLE PRÁCEV p edložené práci byla prov ována role p idávaného lysozymu a nisinu (p irozen

produkovaného kmenem L. lactis subsp. lactis NIZO R5 za podmínek in situ) v modelovém systému mléka UHT (0,5 % hm. mlé ného tuku) p i cíleném potla ování r stu B. cereus DMF 2001 p vodn izolovaného z pudinkového dezertu Danette.

MATERIÁL A METODY

Bakteriální kmeny. Pro práci byly použity následující bakteriální kmeny (Sbírka bakterií, plísní a kvasinek,

Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT v Praze, R):B. cereus DMF 2001 (izolát z dezertu Danette, R, 1995)B. cereus DMF 2007 (izolát z jogurtu, R, 1995)B. cereus DMF 2008 (izolát z mléka UHT, R, 1995)B. subtilis LCC 666 (DMF 2006) (izolát z mléka UHT, R, 1995)B. stearothermophillus LCC 796 (DMF 2003) (ATCC, USA, 1995)L. lactis subsp. lactis FI 5876 (DMF 4014) (nisin A; IFR Norwich, VB)L. lactis subsp. lactis NIZO R5 (DMF 4009) (nisin A; NIZO, Ede, NL) L. lactis subsp. lactis HMM 32 (DMF 4017) (Hostomice, R)L. lactis subsp. cremoris MG 1614 (DMF 4012) (IFR Norwich, VB) [12, 13].

Lb. helveticus CH-1 (DMF 3008) (citlivost k nisinu; Ch. Hansen Laboratories A/S, Koda , DK) [14, 15].

Stanovení citlivosti bacilárních a laktokokových kmen k nisinu.Citlivost bacilárních a laktokokových kmen k nisinu byla zjiš ována formou minimální

inhibi ní koncentrace nisinu (MICnisinu), vyjad ující nejnižší detekovatelnou koncentraci nisinu (Nisaplin®; 0; 0.1; 0.5; 1; 5; 10; 50; 100; 500; 1000 IU nisinu.ml-1 = 0,0025; 0,0125; 0,025; 0,125; 0,25; 1,25; 2,5; 12,5; 25 mg nisinu.l-1), zp sobující v r stových agarech inhibici r stu konkrétního testovaného kmene (za vzniku vyjasn ných inhibi ních zón r stu kmene pipetovaného na Petriho misku).

Stanovení citlivosti bacilárních a laktokokových kmen k lysozymu. U bacilárních a laktokokových kmen byla zjiš ována taková koncentrace lysozymu

(Sigma, St. Louis, USA) (0; 0,5; 5; 10; 50; 100 mg.l-1), která u vyšet ovaných kmen v r stovýchbujónech zp sobovala nejvyšší redukci jejich r stu, tzn. nejnižší po et mikroorganism (JTK.ml-1)stanovených plotnovou metodou.

Spole ná kultivace laktokok a bacil v modelovém systému mléka UHT s p ídavkemlysozymu.

Do mléka UHT (0,5 % hm. mlé ného tuku) (50 ml) byly jednotliv o kovány (inokulum 1 % obj.) kmeny (B. cereus DMF 2001, L. lactis subsp. lactis (NIZO R5 a HMM 32)) nebo spole n kmeny (B. cereus DMF 2001 a L. lactis subsp. lactis NIZO R5; B. cereus DMF 2001 a L. lactis subsp. lactis HMM 32). Zárove byl do kultiva ních nádob (Erlenmayerovy ba ky)p idán lysozym (100 mg.l-1). Kultivace kmen probíhaly p i teplot 30 ºC po dobu 16-18 h. P ed a po uskute n ných kultivacích se byly kmen stanoveny jejich po ty (plotnová metoda) a zm eny aktivní kyselosti mléka (pH).

101

VÝSLEDKY

Výb r bacilárního kmene a Nis+ a Nis- laktokokových kmen pro spole né kultivace.

Vliv nisinuZ testovaných bacilárních kmen byl k nisinu nejcitliv jší B. cereus DMF 2001 (MICnisinu

byla 0,5 IU nisinu.ml-1 = 0,0125 mg nisinu.l-1). Z testovaných laktokokových kmen byl k nisinu naopak nejmén citlivý L. lactis subsp. lactis NIZO R5 (MICnisinu byla 1000 IU nisinu.ml-1

= 25 mg nisinu.l-1). Pro spole né kultivace bacil a laktokok v modelovém systému mléka UHT byly vybrány kmeny B. cereus DMF 2001 a L. lactis subsp. lactis (NIZO R5 a HMM 32).

a) b) Obr. 2. Mikroskopický obraz laktokokových kmen ; a) L. lactis subsp. lactis NIZO R5,b) L. lactis subsp. lactis HMM 32 [16].

Vliv lysozymu Z bacilárních kmen došlo ke nejvyššímu snížení po tu bun k - o dva ády - u B. cereus

DMF 2001 v Živném bujónu za p ítomnosti lysozymu (100 mg.l-1) (vzhledem ke kultiva nímu systému bez p ídavku lysozymu). Z laktokokových kmen došlo ke nejvyššímu snížení po tu bun k- o jeden ád - u L. lactis subsp. lactis NIZO R5 v bujónu LM17 za p ítomnosti lysozymu (100 mg.l-1) (vzhledem ke kultiva nímu systému bez p ídavku lysozymu). U kmene L. lactis subsp.lactis HMM 32 došlo v bujónu LM17 za p ítomnosti lysozymu (100 mg.l-1) ke snížení po tu bun kv rámci jednoho ádu (vzhledem ke kultiva nímu systému bez p ídavku lysozymu). Kultiva nísystémy bacilárních a laktokokových kmen s p ídavkem lysozymu (0,5 - 100 mg.l-1) se chovaly velmi individuáln . Pro spole né kultivace bacil a laktokok v modelovém systému mléka UHT byl vybrán lysozym (100 mg.l-1), který u B. cereus DMF 2001 zp sobil nejvyšší snížení po tubun k.

Vliv lysozymu a Nis+ a Nis- kmen L. lactis subsp. lactis na r st B. cereus DMF 2001v modelovém systému mléka UHT

V mléce UHT byl r st B. cereus DMF 2001 snížen v p ítomnosti L. lactis subsp. lactisNIZO R5 (produkujícího nisin) o t i ády (z hodnoty 3,6.107 JTK.ml-1 na 3,0.104 JTK.ml-1)a v p ítomnosti L. lactis subsp. lactis HMM 32 (neprodukujícího nisin) o jeden ád (z hodnoty 3,6.107 JTK.ml-1 na 1,6.106 JTK.ml-1). Na snížení r stu B. cereus DMF 2001 se podílela kyselina mlé ná (produkovaná ob ma laktokoky), nisin (p irozen produkovaný, 145 IU.ml-1 = 3,6 mg.l-1)a p idávaný lysozym (100 mg.l-1). Lysozym (100 mg.l-1) snižoval po et laktokok u obou kmenL. lactis subsp. lactis (NIZO R5 i HMM 32) i bacil (B. cereus DMF 2001). P i spole ných r stech bacil a laktokok v modelovém systému mléka UHT bylo zjišt no, že bacily významnneovliv ovaly (nestimulovaly ani neinhibovaly) r st laktokok , p estože byla v minulosti stimulace bakterií mlé ného kvašení v kokultivaci se siln proteolyticky aktivními kontaminanty rodu Bacillus prokázána [17].

102

Tabulka ISpole ná kultivace laktokokových kmen a bacilárního kmene v modelovém systému mléka UHT (0,5 % hm. mlé ného tuku) p i teplot 30 °C a po dobu 16-18 h za p ídavku lysozymu (100 mg.l-1)

Po etlaktokok

Po etbacilKultiva ní

systémKrok

kultivaceJTK [ml-1] JTK [ml-1]

pH

P ed kultivací 3,5 · 108 - 6,32 L. lactis subsp. lactis NIZO R5 Po kultivaci 6,3 · 108 - 4,67

P ed kultivací 1,3 · 109 - 6,30 L. lactis subsp. lactis HMM 32 Po kultivaci 3,0 · 108 - 5,47

P ed kultivací - 6,6 · 107 6,31B. cereus DMF 2001 Po kultivaci - 3,6 · 107 6,26

L. lactis subsp. lactis NIZOR5 P ed kultivací 2,7 · 108 6,9 · 107 6,31

+ B. cereus DMF 2001 Po kultivaci 1,7 · 109 3,0 · 104 4,34

L. lactis subsp. lactis HMM 32 P ed kultivací 1,5 · 109 3,4 · 107 6,29

+ B. cereus DMF 2001 Po kultivaci 6,8 · 108 1,6 · 106 5,21

ZÁV RYV modelovém systému mléka UHT (0,5 % hm. mlé ného tuku) byl prokázán významný

spole ný ú inek kmen L. lactis subsp. lactis (NIZO R5 a HMM 32, produkujících kyselinu mlé nou a nisin) a lysozymu (100 mg.l-1) p i redukci r stu B. cereus DMF 2001. V modelovém systému mléka UHT nebyly prokázány významné antimikrobiální rozdíly mezi L. lactis subsp.lactis NIZO R5 (kmenem produkujícím nisin) a L. lactis subsp. lactis HMM 32 (kmenem neprodukujícím nisin). Zkušenosti získané z modelového systému mléka UHT by bylo v budoucnu vhodné otestovat v systému reálných potravin.

Pod kováníTato práce byla podpo ena Ministerstvem školství, mládeže a t lovýchovy eské republiky

(výzkumný zám r MSM 6046137305) a Národní agenturou pro zem d lský výzkum (výzkumný projekt NAZV QF 3163).

LITERATURA1. Görner F., Valík L.: V knize: Aplikovaná mikrobiológia požívatín (Görner F., Valík L., ed.),

s. 334 - 336. Malé Centrum, Bratislava 2004. 2. Meer R.R., Baker J., Bodyfelt F.W., Griffiths M.W.: Psychrotrophic Bacillus spp. in fluid milk

products: A review. J. Food Prot. 54, 969 - 979 (1991). 3. David C.: The effect of nisin on the growth of undesirable microorganisms in thermisized curd

desserts. Diploma thesis, s. 29, Department of Dairy and Fat Technology, ICT Prague, Prague 2005.

4. Kimoto H., Mizumachi K., Okamoto T., Kurisaki J.: New Lactococcus strains with immunomodulatory activity: Enhancement of Th1-type immune response. Microbiol. Immunol. 48, 75 - 82 (2004).

5. Klaenhammer T.D.: Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochemie 70 (3), 337 - 349 (1988).

103

6. Davidson P.M., Braner A.L.: Antimicrobials in Food, Academic Press, London 1993. 7. Henning S., Metz R., Hammes W.P.: Studies on the mode of action of nisin. Int. J. Food

Microbiol. 3, 121-134 (1986). 8. Delves-Broughton J., Gasson M.J.: Nisin. V knize: Natural Antimicrobial Systeme and Food

Preservation (Dillon V.M., Board R.G., ed.), s. 99 - 131. Wallingford, Cab International 1994. 9. Vyhláška MZe . 304/2004 Sb. kterou se stanoví druhy a podmínky použití p ídatných

a pomocných látek p i výrob potravin. Sbírka zákon 1997, ástka 110 (2004). 10. McKenzie H.A., White, F.H.: Lysozyme and alpha-lactalbumin: structure, function, and

interrelationships. Adv. Prot. Chem. 41, 173 - 315 (1991). 11. Chung W., Hancock R.E.W.: Action of lysozyme and nisin mixtures against lactic acid bacteria.

Int. J. Food Microbiol. 60, 25 - 32 (2000). 12. Gasson M.J.: Plasmid components of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic

streptococci after protoplast-induced curing. J. Bacteriol. 154, 1 - 9 (1983). 13. Gasson M.J.: Transfer of sucrose fermenting ability, nisin resistance and nisin production

in Streptococcus lactis 712. FEMS Microbiol. Rev. 21, 7 - 10 (1984). 14. Dodd H.M., Horn N., Zhang H., Gasson M.J.: A lactococcal expression system for engineering

nisin. Appl. Environ. Mikrobiol. 136, 555 - 556 (1992).15. Dood H.M., Horn N., Giffard C.J., Gasson M.J.: A gene replacement strategy for engineering

nisin. Microbiology 142, 47 - 55 (1996). 16. Tichovský P.: Význam antibakteriáln aktivních bakterií mlé ného kvašení pro výrobu

erstvých sýr . Bakalá ská práce, s. 36, Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT v Praze, Praha 2006.

17. Šviráková E., David C., Plocková M.: Vliv Nis+ a Nis- kmen Lactococcus lactis subsp. lactisna r st Bacillus cereus DMF 2008 v modelovém systému mléka. Mléka ské listy - Zpravodaj 93, 15 - 18 (2005).

Kontaktní adresa: Eva Šviráková, Ústav technologie mléka a tuk , FPBT, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6, eská republika, tel: +420 220 443 271, fax: +420 220 443 285, e-mail: [email protected]

104

VPLYV LACTOBACILLUS RHAMNOSUS GG NA RAST CANDIDA MALTOSA V MLIEKU Liptáková Denisa, Valík ubomír, Bajúsová Barbora, Medve ová Alžbeta

Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, STU Bratislava, Slovensko

Effect of Lactobacillus rhamnosus GG on the growth dynamics of Candida maltosa in milk

Summary:The growth and survival of yeast Candida maltosa YP1 in ultra-pasteurized milk were studied in relation to the influence of incubation temperature and different initial concentration of probiotic Lactobacillusrhamnosus GG. Application of 1 % of L. rhamnosus GG at initial concentration of 104 and 106 CFU.ml-1resulted in partial inhibition of the growth and multiplication of acidtolerant and psychrotrophic strain C. maltosa YP1. At the initial density of L. rhamnosus GG 102 KTJ.ml-1, typical sigmoid kinetics of Candida maltosa YP1 growth was observed. At the higher initial concentrations, the growth of L. rhamnosus GG, caused biphasic growth kinetics of C. maltosa YP1. Inhibitory effect of lactobacillus was performed by primary and secondary metabolites and their undissociated forms, lower pH and temperature. High counts of the culture GG (from 108 to 109 CFU.ml-1) reached in stationary growth phase after 7 to 97 h have also contributed to the yeast growth inhibition. Influence of the factors mentioned above on growth rate of C. maltosa YP1 was significantly described by secondary mathematical linear equations. The need to identify the non-specific metabolites of L. rhamnosus GG also resulted from our study. On the base of the results the possible application of the culture in combination with other strains of lactic acid bacteria is be recommended.

Mlie ne výrobky patria medzi spotrebite sky ob úbené produkty. V sú asnosti sa do popredia dostáva snaha zvýši hygienickú kvalitu a bezpe nos potraviny. Nežiadúci je každý mikrobiálny kontaminant, ktorý dokáže rás , rozmnožova sa a metabolizova vo vnútornom prostredí mlie nych výrobkov.

Jedným z novších spôsobov, ako zabráni , resp. spomali rozmnožovanie nežiadúcich mikroorganizmov v mlie nych produktoch, je aplikácia tzv. ochranných kultúr. Ich prídavok môže spomali rast kontaminujúcich mikroorganizmov a pred ži tak trvanlivos produktu. Jedným z druhov, o ktorý prejavujú mliekarenskí technológovia a mikrobiológovia záujem je druh Lactobacillus rhamnosus. Vybrané kmene tohto druhu, napríklad L. rhamnosus LC 705, sa už využívajú ako komer né ochranné kultúry v zmesi so zástupcami Propionibacterium freudenreichiissp. shermanii. Okrem kyseliny mlie nej, octovej a propiónovej tvoria aj široké spektrum alšíchbližšie neidentifikovaných antimikrobiálne pôsobiacich látok. Iné kmene, napríklad L. rhamnosusGG, sa vyzna ujú probiotickými vlastnos ami, a tak ich aplikáciou možno zvýši nielen hygienickú ale i lie ebno-dietetickú hodnotu mlie nych produktov.

Vybrané kmene Lactobacillus rhamnosus sa asto spolu s Lactobacillus acidophillusvyužívajú ako probiotické kmene do kyslomlie nych produktov. Konzumácia mlie nych produktov obsahujúcich tieto baktérie napomáha lepšie tolerova laktózu (1, 2). Pozitívny ú inok probiotík na udský organizmus bol pozorovaný aj v prípade prevencie cestovate ských hna iek ako aj hna iek

spájaných s užívaním antibiotík, sulfónamidov, chemoterapeutík alej pri urovaginálnych infekciách, imunitných poruchách a osteoporóze. Preukázalo sa, že Lactobacillus rhamnosus GG, ktorý sa vyzna uje udským pôvodom, efektívne redukuje trvanie rotavírusom vyvolanej gastroenteritídy (3, 4, 5, 6) vo svojej štúdii uvádzajú, že kme L. rhamnosus GG napomáha k urýchleniu lie by respira ných ochorení a znižuje potrebu užívania antibiotík.

alšou pozitívnou vlastnos ou probiotík je ich podiel na antikarcinogénnom pôsobení, dokázanom vo viacerých vedeckých štúdiách. Napríklad u udí trpiacich na rakovinu hrubého reva vedci preukázali zníženie obsahu Escherichia coli v stolici pôsobením Lactobacillus acidophilus.Zaznamenalo sa tiež zníženie aktivity -glukuronidázy, azoreduktázy a nitroreduktázy. Podobné ú inky sa pozorovali aj v prípade aplikácie Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus plantaruma L. rhamnosus GG (7, 8, 9).

Zdraviu prospešné ú inky probiotických baktérií sa však prejavia iba v prípade, ak sa do hrubého reva dostanú v požadovanom množstve. V probiotických produktoch, napríklad jogurtoch

105

a acidofilnom mlieku, by mala by ich koncentrácia na konci doby trvanlivosti 106 až 107 KTJ.ml-1.Iba v tejto a vyššej koncentrácii majú v reve požadovaný ú inok (10, 11, 12).

Cie om našej práce bolo sledova vzájomný vz ah medzi istou probiotickou kultúrou Lactobacillus rhamnosus GG a kvasinkou Candida maltosa YP1 v UHT mlieku pri viacerých teplotách uchovávania. Cie om práce bolo získa o najviac rastových odoziev C. maltosa YP1 na rôzne kombinácie teploty a po iato nej koncentrácie L. rhamnosus GG v mlieku. V práci sa použili princípy prediktívnej mikrobiológie, ktorá sa v potravinárskej mikrobiológii používa najmä na predikcie po tu a správania sa mikroorganizmov ako aj na predpovede tvorby metabolitov a toxínov mikroorganizmov v rôznych modelových i reálnych substrátoch.

Dynamika rastu kvasinky Candida maltosa YP1 zámerne inokulovanej do mliek zao kovaných istou kultúrou Lactobacillus rhamnosus GG (102, 104, 106 KTJ.ml-1)pri teplotách uchovávania 8, 10, 15, 21 a 25 ± 0,5 °C.

Kme Lactobacillus rhamnosus GG, ktorý pochádza od fínskych mikrobiológov prof. Ouwehand a Salminena nám za ú elom vykonania experimentov poskytla Dr. Lauková A. z Ústavu fyziológie hospodárskych zvierat SAV Košice s ve korysým povolením vyššie uvedených vedeckých pracovníkov z Oddelenia Biochémie a Potravinárskej Chémie Univerzity v Turku, Fínsko.

Z rastových iar vyšetrovaného kme a C. maltosa YP1 pri každej z použitých koncentrácií L. rhamnosus GG a teplotách 8, 10, 15, 21 a 25 ± 0,5 °C sa vypo ítali rastové parametre: d žka lag-fázy, rastová rýchlos a genera ný as.

S využitím štatistického balíka Microsoft sme analyzovali závislos prvej a druhej rastovej rýchlosti C. maltosa YP1 ako funkcie prirodzeného logaritmu (ln μ) od teploty a po iato nej inokulácie UHT mliek kultúrou L. rhamnosus GG. Kombinovaný vplyv oboch sledovaných faktorov prostredia na rastové rýchlosti C. maltosa bolo možné popísa rovnicami s vysokými korela nými koeficientami (R2

μ1 = od 0,7282 do 0,9962; R2μ2 = od 0,7248 do 0,9133; obr. 1 a 2).

Najvyššie hodnoty rastových rýchlostí C. maltosa boli pozorované pri teplote 25 °C, kedy sa prvé rastové rýchlosti pohybovali v rozmedzí od 0,23 h-1 vo vzorkách bez prídavku laktobacila do 0,032 h-1 vo vzorkách obsahujúcich 6,4. 106 KTJ.ml-1 laktobacila. V prípade nižších teplôt uchovávania, napríklad 8 a 10 °C, boli hodnoty prvých rastových rýchlostí kvasinky C. maltosa vypo ítané v intervale od 0,0119 h-1 (pre LGG 06) do 0,031 h-1(pre kontrolnú vzorku) pri 8 °C, resp. od 0,013 h-1 (pre LGG 06) do 0,044 h-1(pre kontrolnú vzorku) pri 10 °C.

Dynamika rastu kvasinky vo vzorkách obsahujúcich po iato né koncentrácie L. rhamnosusGG N0 = 2,0 log, resp. N0 = 4,0 log, bola ve mi podobná a k výraznejšiemu poklesu prvej rastovej rýchlosti pri jednotlivých teplotách dochádzalo až po inokulácii mliek priemernou po iato noudenzitou laktobacila N0 = 6,0 log. Napríklad pri teplote 15 ± 0,5 °C, vo vzorkách bez obsahu laktobacila bola zaznamenaná rastová rýchlos C. maltosa 0,072 h -1. Zvýšením jeho po iato nejkoncentrácie na 2,0 až 4,0 log sa rastová rýchlos C. maltosa znížila na hodnoty 0,059, resp. 0,060 h -1. Až po prídavku L. rhamnosus GG v priemernej po iato nej denzite N0 = 6,0 log klesla prvá rastová rýchlos kvasinky na 0,029 h -1, t. j. takmer o 50 % v porovnaní s predchádzajúcimi experimentami (obr. 1 a 2).

V prípade druhej fázy dvojfázových rastových iar C. maltosa YP1 (obr. 2) sa so zvyšujúcou sa po iato nou koncentráciou L. rhamnosus GG v mlie nych substrátoch predlžovala druhá lag-fáza, pri om jej najdlhšie trvanie bolo zaznamenané pri teplote 8 °C a N0 = 6,0 log L. rhamnosus GG (225 h, t. j. 9 dní). So zvyšujúcou sa teplotou inkubácie dochádzalo pri jednotlivých priemerných po iato ných denzitách laktobacila k zvyšovaniu druhej rastovej rýchlosti (obr. 2). Napríklad pri teplote 8 °C a koncentrácii N0 = 6,0 log L. rhamnosus GG bola druhá rastová rýchlos vypo ítaná na 0,0089 h -1. Postupným zvyšovaním teploty až na 25 °C sa jej hodnota zvýšila takmer 8- násobne (μ2 = 0,071 h -1). Podobne aj pri nižšej po iato nej denzite laktobacila (LGG 04) sa hodnoty druhej rastovej rýchlosti s teplotou zvyšovali, napríklad z hodnoty 0,012 h -1 stanovenú pri teplote 10 °C až na 0,125 h -1 vypo ítanú pri 25 ± 0,5 °C.

106

y8°C = -0,0026x + 0,0303R2 = 0,8957

y10°C = -0,0039x + 0,0449R2 = 0,7282

y15°C = -0,0058x + 0,0749R2 = 0,7822

y21°C = -0,0186x + 0,1651R2 = 0,9962

y25°C = -0,0256x + 0,2441R2 = 0,7631

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 1 2 3 4 5 6 7 8

log [ KTJ.ml-1] LGG

rast

ová

rých

los

[h-1

]

8 °C 10°C15°C 21°C25°C

yLGG04 = 0,1411x - 6,2021R2 = 0,7428

yLGG06 = 0,1355x - 6,2336R2 = 0,9133

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

0 5 10 15 20 25 30

teplota [°C]

ln ra

stov

á rý

chlo

s

LGG 04

LGG 06

Obr. 1. a 2. Vplyv L. rhamnosus GG a teploty uchovávania na prvé a druhé rastové rýchlosti C. maltosa YP1.

Rast kvasinky v mlieku s 1 % prídavkom probiotickej kultúry L. rhamnosus GGv po iato nej koncentrácii N0 = 6,0 log bolo možné porovna aj s výsledkami experimentov súbežnej kultivácie C. maltosa YP1 s prídavkom 18 h kultúry L. rhamnosus VT1 v rovnakej po iato nej koncentrácii pri teplote 8 a 21 ± 0,5 °C.

Pri súbežnej kultivácii C. maltosa a L. rhamnosus VT1, kvasinka vykazovala klasický sigmoidálny rast, kým po as kultivácie s kme om L. rhamnosus GG bol pozorovaný dvojfázový rast. Inhibi ný ú inok kultúry L. rhamnosus VT1 sa prejavil hlavne v pred žení lag-fázy C. maltosa,o bolo pravdepodobne výsledkom pôsobenia kyseliny mlie nej, ktorá je jedným z inhibi ných

metabolitov vytváraným L. rhamnosus VT1, ale aj v dôsledku pôsobenia iných faktorov (nízke pH, teplota a iné metabolity). Percentuálny obsah kyseliny mlie nej pôsobiaci na za iatku rastu kvasinky sa pohyboval od 0,30 do 0,34 % v závislosti od teploty kultivácie. V prípade kultúry L. rhamnosus GG bol obsah kyseliny mlie nej na za iatku experimentov stanovený na 0,16 %, pri om d žky prvej lag-fázy C. maltosa YP1 boli pri jednotlivých teplotách podstatne kratšie ako v prípade súbežných kultivácii kvasinky s L. rhamnosus VT1. Nízky obsah kyseliny mlie nejmohol pôsobi iasto ne ako stimulant rastu kvasinky, ktorá sa vyzna uje oxidatívnym metabolizmom.

107

ZáverCie om našej štúdie bolo sledova dynamiku rastu psychrotrófnej, acido- a termo-

rezistentnej kvasinky C. maltosa YP1 zámerne inokulovanej do UHT mliek zao kovaných rôznymi koncentráciami probiotického kme a L. rhamnosus GG pri teplotách 8, 10, 15, 21 a 25 °C.

Pri aplikácii po iato ných koncentrácií kultúry L. rhamnosus 102 KTJ.ml-1 došlo k zníženiu rastovej rýchlosti kvasinky pri jednotlivých teplotách v priemere o 30 % v porovnaní s kontrolnými vzorkami. Prídavok kultúry L. rhamnosus GG do UHT mlieka v po iato ných koncentráciách 104 a 106 KTJ.ml-1 viedol k výraznejšej parciálnej inhibícii rastu a rozmnožovania kvasinky C. maltosa YP1, o sa prejavilo dvojfázovým rastom. Za inhibi ný vplyv L. rhamnosusGG zodpovedali pravdepodobne primárne a sekundárne metabolity a ich nedisociované formy, ktoré v spolupôsobení s kyselinou mlie nou, zníženým pH a teplotou vytvárali nepriaznivé podmienky pre rast kvasinky. Parciálne k inhibícii prispievali aj vysoké po ty kultúry GG (108 až 109 KTJ.ml-1) dosiahnuté v UHT mlieku po 7 až 97 hodinách súbežnej kultivácie (pri 25 až 8 °C). Kultúra GG a teplota ovplyv ovali predovšetkým rastové rýchlosti kvasinky, o bolo možné popísa lineárnymi rovnicami s vysokými korela nými koeficientami (R2

μ1 = od 0,7282 do 0,9962; R2

μ2 = od 0,7248 do 0,9133). Na základe získaných výsledkov je možné aplikáciu kultúry v kombinácii s alšími druhmi baktérií mlie neho kysnutia odporu i aj ako ochrannú kultúru.

Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy .APVV-20-005605.Literatúra:1. OLIVEIRA, M. N. - SODINI, I. – REMEREF, F. – CORRIER, G.: Effect of milk supplementation and

culture composition on acidification, texture properties and microbiological stability of fermented milks containing probiotic bacteria. In International Dairy Journal, 2001, vol. 11, p. 935 – 942.

2. OUWEHAND A. C. – SALMINEN, S. J. – ISOLANRI, E.: Probiotics: an overview of beneficial effects. In Antonie van Leeuwenhoek, 2002, vol. 82, no. 1 – 4, p. 279 – 289.

3. OUWEHAND, A. C. – KIRJAVAINEN, P. V. - SHORTT, C. – SALMINEN, S.: Probiotics: mechanisms and established effects. In International Dairy J, 1999, vol. 9, no. 1, p. 43-52.

4. OUWEHAND A. C. – SALMINEN, S. J.: The health effects of cultured milk products with viable and non – viable bacteria. In International Dairy Journal, 1998, vol. 8, no. 9, p. 749 – 758.

5. RINKINEN, M. – JALAVA, K. – WESTERMARCK, E. – SALMINEN, S. – OUWEHAND, A. C.: Interaction between probiotic lactic acid bacteria and canine enteric pathogens: a risk factor for intestinal Enterococcus faecium colonization? In Veterinary Microbiology, 2003, vol. 92, p. 111 – 119.

6. SAXELIN, M. – TUNKKYNEN, S. – MATTILA-SANDHOLM, T. – DE VOS, V.: Probiotic and other functional microbes: from markets to mechanisms. In Current Opinion Biotechnology, 2005, vol. 16, p. 204 – 211.

7. SAARELA, M. – MOGENSEN, G. – FONDÉN, R. – MÄTTÖ, J. – SANDHOM, T. M.: Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. In Journal Biotechnology, 2000, vol. 84, no. 3, p. 197-215.

8. MERCENIER, A. – PAVAN, S. – POT, B.: Probiotics as biotherapeutic agents: present knowledge and future prospects. In Current Pharmaceut Design, 2003, vol. 9, no. 2, p. 175-191.

9. SALMINEN, S. - OUWEHAND, A.C. - ISOLAURI, E.: Clinical applications of probiotic bacteria. In International Dairy Journal, 1998, vol. 8, no. 5-6, p. 563-572.

10. VINDEROLA, G. G. – REINHEIMER, J. A.: Enumeration of Lactobacillus casei in the presence of L.acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria in fermented products. In International Dairy Journal, 2000, vol. 10, p. 271 – 275.

11. FORESTIER, Ch. – DE CHAMPS, Ch. – VATOUX, C. – JOLY, B.: Probiotic activities of Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties. In Research in Microbiology, 2001, vol. 152, p. 167 – 173.

12. GÖRNER, F., VALÍK, .: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1st ed. Bratislava: Malé Centrum, 2004. 528 s. ISBN 80-967064-9-7.

Kontaktná adresa:Ing. Liptáková Denisa PhD., Doc. Ing. Valík ubomír PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

108

EXTRAKCE BAKTERIOCINU KMENE ENTEROCOCCUS MUNDTII EN3 ORGANICKÝM ROZPOUŠT DLEM A POMOCÍ ADSORPCE BAKTERIOCINU

NA BUN NOU ST NUMiller Petr1, Bakir Hatice Eda2, Ku erová Kate ina1, Chumchalová Jana1, Míková Kamila3

1Ústav technologie mléka a tuk , 3Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha, 2Department of Food Engineering, Istanbul Technical University.

Purification of bacteriocin produced by Enterococcus mundtii EN3 using a organic solvent and the adsorption on the cell surface method

Summary:The aim of this work was to determine methods for bacteriocin extraction from the cell-free

supernatant of Enterococcus mundtii EN3 strain using protein extraction by organic solvent method and the adsorption on the cell surface method. These methods are used as the first step of bacteriocin’s isolation. Seven different solvents were tested, the influence of broth acidity and supernatant/solvent ratio were determinate. The highest total recovery, the highest antibacterial activity and the highest purification were achieved with 1/3 supernatant/solvent ratio at pH 3 with n-propanol extraction. LM17 was determinated as a more suitable cultivation medium for the adsorption method. The optimal pH value for releasing bacteriocin from the cell is 2. Extraction method gives better results but is laborious, time consuming and requires special equipment. Adsorption method could be an economical procedure to produce large quantities of bacteriocins.

ÚvodBakteriociny jsou bioaktivní peptidy i peptidové komplexy produkované n kterými

bakteriemi (nej ast ji bakteriemi mlé ného kvašení), které mají baktericidní i bakteriostatické ú inky na jiné, asto p íbuzné druhy. Bakteriociny se používají ke konzervaci potravin a to jak v isté form (komer ní preparát nisinu) tak ve form kultury produkující daný bakteriocin (Lactococcus lactis ssp. cremoris JS102, sýr edar) [1]. Získání istého bakteriocinu vyžaduje nákladné chromatografické metody a schopnost r stu dané kultury v ur ité potravin bývá omezená a asto nežádoucí.

Tato práce byla zam ena na porovnání extrakce baktericionu dv ma výše uvedenými metodami. Bakteriocin produkovaný kmenem EN3 (Enterococcus mundtii, izolát z Tatarské omá ky) má široké antibakteriální ú inky (19 z 20 testovaných kmen laktobacil , 3 z 5 laktokok ,Bacillus cereus DMF2001 a Listeria monocytogenes CCM5576).

Principem metody ‘extrakce rozpoušt dlem‘ je zm na dielektrické konstanty zp sobenározpoušt dlem. Ta má vliv na rozpustnost látek. Principem metody ‘adsorpce‘ je adsorpce bakteriocinu na bun nou st nu p i neutrální hodnot pH a desorpce p i nízké hodnot pH.

MetodyStanovení bakteriocinového titru (BT)

Pro stanovení bakteriocinového titru byl použit jako indikátorový mikroorganismus Lactobacillus sakei DMF 3017. U vzorku byla vytvo ena ada dvojkových, resp. p tkových ed ní ( ed no fosfátovým pufrem, pH 6,5), které byly vpichovány na plotnu (agarová vpichová metoda). Plotny byly inkubovány aerobn p i teplot 37 °C po dobu 16-18 hod. Po inkubaci bylo ode tenonejvyšší ed ní, které ješt zp sobovalo vznik inhibi ní zóny. Bakteriocinový titr byl po ítán podle následujícího vzorce:

VBT

x 10002 resp. V

BTy 10005

[AU ml-1] (1, resp. 2) kde x resp. y je nejvyšší ed ní zp sobující tvorbu inhibi ní zóny pro dvojkové ed ní(rov. 1) resp. p tkové (rov. 2) a V [ml] je objem vpichovaného vzorku. V p ípad , že jedno ed ní poskytovalo z etelnou inhibi ní zónu a následující ed ní již zónu neohrani enou, byl pro výpo etBT použit pr m r z t chto ed ní [2].

109

Extrakce antibakteriálních látek organickým rozpoušt dlemByl p ipraven supernatant kmene EN3. Supernatant byl extrahován organickým

rozpoušt dlem. K extrakci byl použit n-hexan, diethylether, chloroform, n-propanol, n-butanol, isobutanol a n-amylalkohol. Na vakuové odparce bylo p i teplot 45 °C pro n-hexan, diethylether a chloroform a p i teplot 60 °C pro n-propanol, n-butanol, isobutanol a n-amylalkohol rozpoušt dlo odpa eno. V p ípad použití n-propanolu byl ke sm si n-propanolu a supernatantu p idán NaCl (50 g l-1) pro odd lení fází. Organická fáze byla odd lena a na vakuové odparce byl zbytek rozpoušt dla odpa en (45 °C pro n-hexan, diethylether a chloroform a p i teplot 60 °C pro n-propanol, n-butanol, isobutanol a n-amylalkohol). Zbytek po odpa ení rozpoušt dla byl rozpušt n ve 20 ml sterilní vody [4]. Byla stanovena antibakteriální aktivita vodných i organických fází v i Lactobacillus sakei DMF 3017 agarovou vpichovou metodou i titrem bakteriocinu. V p ípad , kdy byla stanovována vhodná kyselost supernatantu, byla hodnota pH supernatantu upravena p ed extrakcí na 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 a ú innost extrakce byla vyhodnocena podle t chto parametr :specifická aktivita (SA) = BT / obsah bílkovin [AU mg-1] (3)stupe p e išt ní (SP) = specifická aktivita (vzorek) / specifická aktivita (supernatant) [1] (4)celková aktivita (CA) = BT V [AU] (5) výt žnost = 100 celková aktivita (vzorek) / celková aktivita (supernatant) [%] (6)kde V je objem vzorku. V p ípad , kdy byl ur ován vhodný pom r rozpoušt dla k supernatantu, byl k extrakci použit n-propanol v objemovém pom ru 1:1, 1:2, 1:3, 2:3 a pro opakovanou extrakci v pom ru 1:1 v i supernatantu a ú innost extrakce byla vyhodnocena dle výše uvedených rovnic (3, 4, 5 a 6).

Extrakce bakteriocinu adsorpcí na bun nou st nuByly p ipraveny roztoky A, B a C (A: 1,0 mol l-1 NaCl, 0,08 % hm. Tweenu 20,

0,066 mol l-1 KH2PO4 o pH upraveném pomocí 1% obj. H3PO4 na hodnotu 1,5, B: na hodnotu pH 2, C: na hodnotu pH 2,5) na desorpci bakteriocinu z bun né st ny. Kyselost erstv narostlého kmene EN3 v bujónu LM17 i MRS nebo LM17 s Tweenem 80 (1 % hm.) byla upravena na hodnotu pH 6. Bujón byl 1,5 hod míchán magnetickým míchadlem p i teplot 4 °C a poté odst ed n (otá ky:6000 min-1, teplota: 4 °C, doba: 15 min). Usazené bu ky byly promyty fosfátovým pufrem (pH 6,5) a znovu odst ed ny za stejných podmínek. Usazené bu ky byly rozpušt ny v roztoku B nebo A, B a C a suspenze byly míchány 1,5 hod magnetickým míchadlem p i teplot 4 °C. Poté byly suspenze odst ed ny (otá ky: 9000 min-1, teplota: 4 °C, doba: 20 min). Byly sbírány tyto vzorky: p vodnísupernatant, promývací pufr a supernatanty po kone ném odst ed ní (kone né extrakty). Všechny vzorky byly tepeln ošet eny (90 °C, 10 min.) [1].

Stanovení obsahu bílkovin (OB)Pro stanovení obsahu bílkovin podle Bradfordové bylo použito komer ní inidlo Bio-Rad.

Pomocí standardu hov zího sérového albuminu byla sestrojena kalibra ní p ímka pro koncentrace BSA od 0 do 25 g ml-1. Reakce vzorku (1,6 ml) s inidlem (0,4 ml) trvala 20 min a poté byla m ena absorbance p i vlnové délce 595 nm. Slepý vzorek byl p ipraven reakcí inidla Bio-Rad s destilovanou vodou.

Výsledky a diskuse

Extrakce bakteriocinu organickým rozpoušt dlemNejprve bylo vybráno vhodné rozpoušt dlo pro extrakci bakteriocinu ze supernatantu

kmene EN3. Ze sedmi testovaných rozpoušt del byl jako nejvhodn jší ur en n-propanol, jelikož jako jediný extrahoval bakteriocin do organické fáze (viz tab. I). Z výsledk je patrné, že aspo ástmolekuly bakteriocinu je polárního charakteru.

110

Tabulka I Stanovení vhodného rozpoušt la pro extrakci.

Fáze Rozpoušt dlo vodná organická chloroform ++ - n-butanol ± ± isobutanol - - n-amylalkohol - ± n-propanol - +++ n-hexan ± - diethylether + - supernatant +++

- žádná antibakteriální aktivita, velmi slabá aktivita, + slabá aktivita, ++ silná aktivita, +++ velmi silná aktivita

Podobných výsledk dosáhl také ten Brink, který dokázal acidocin B produkovaný kmenem Lbc. acidophilus M64 extrahovat n-propanolem, n-butanolem a isoamylalkoholem do organické fáze [4].

Dále byla hledána optimální aktivní kyselost, v rozmezí hodnot pH 3-9, supernatantu kmene EN3 pro extrakci bakteriocinu n-propanolem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce II pouze pro hodnoty pH 3-5, jelikož u supernatant o vyšších hodnotách pH nedocházelo k p echodubakteriocinu do organické fáze nebo byl p echod velmi slabý.

Tabulka II Vliv hodnoty pH na extrakci antibakteriálních látek kmene EN3 n-propanolem.

pHvzorku Fáze BT

[AU ml-1]OB

[ g ml-1]SA

[AU mg-1]SP[1]

CA[AU]

Výt žnost[%]

3supernatantvodnáorganická

112050500

28,716,99,4

390002600

53100

-01

22400700

10000

-5

45


3500

220

32,915,96,3

106000

35000

-03

70000

4400

-0

65


500150100

54,118,27,3

92008200

13700

-11

1000023002000

-2520

BT bakteriocinový titr, OB obsah bílkovin, SA specifická aktivita, SP stupe p e išt ní, CA celková aktivita

U vzorku p i hodnot pH 3 (organická fáze) je dosahováno nejv tší celkové aktivity (10000 AU ml-1) a u vzorku p i hodnot pH 4 (organická fáze) je dosahováno nejv tšího stupnp e išt ní (3) a výt žnosti (65 %). Proto byly tyto postupy extrakce vybrány jako nejvhodn jší a byl u nich stanoven pom r vhodného rozpoušt dla. Byly zkoušeny tyto objemové pom ry supernatantu a rozpoušt dla 1:1, 1:2, 1:3, 2:3 a dále opakovaná extrakce v pom rech 1:1 (viz tab. III).

S rostoucím obsahem rozpoušt dla dochází k vyextrahování menšího obsahu bílkovin do organické fáze, ale bílkoviny s antibakteriální aktivitou se extrahují ve stejném množství (pH 4) nebo jejich obsah roste (zvýšená výt žnost p i pom rech rozpoušt dla 1:2 a 1:3 u supernatantu o hodnot pH 3). S rostoucím obsahem rozpoušt dla tedy dochází k v tšímu p e išt ní bílkovin.

Jako nejvhodn jší zp sob extrakce bakteriocin ze supernatantu kmene EN3 organickým rozpoušt dlem byl zvolen tento postup: extrakce n-propanolem v objemovém pom ru 1:3 p i hodnot pH supernatantu 3 do organické fáze, protože u tohoto postupu dochází k nejv tšímu p e išt ní a je dosahováno nejvyšší aktivity a nejvyšší výt žnosti.

111

Tabulka III Stanovení vhodného pom ru n-propanolu k supernatantu.

pH supernatantu 3 pH supernatantu 4 Pom rrozpoušt dla Fáze SP

[1]CA

[AU]Výt žnost

[%] SP[1]

CA[AU]

Výt žnost[%]

supernatant - 22 400 - - 7 000 -

1:1 vodnáorganická

01

70010 000

345

03

04 400

065


04

20022 400

0100

04

04 400

065


05

10022 400

0100

05

04 400

065


01

30010 000

145

03

04 400

065

2x vodnáorganická

02

20010 000

045

03

04 400

065

SP stupe p e išt ní, CA celková aktivita, 2x opakovaná extrakce v pom rech 1:1

Extrakce bakteriocinu adsorpcí na bun nou st nuByla provedena extrakce antibakteriálních látek pomocí adsorpce bakteriocinu

na bun nou st nu. Bylo zjišt no, že vhodné kultiva ní médium pro extrakci, je LM17 (viz. tab. IV). Díky p ítomnosti Tweenu 80 v bujónu LM17 s Tweenem 80 nedocházelo k extrakci. Byla zjiš ována vhodná hodnota pH na desorpci bakteriocinu z bun né st ny. Adsorpce probíhala p i hodnot pH 6 a desorpce tedy p i hodnotách pH 1,5, 2 a 2,5 (roztok A, B a C). Výsledky jsou uvedeny v tabulce V. Samotné roztoky A, B a C nemají žádnou antibakteriální aktivitu. Nejlepších výsledk se dosáhlo za použití roztoku B. K nejv tší desorpci bakteriocinu dochází tedy p i pH o hodnot 2.

Tabulka IV Stanovení vhodného kultiva ního média pro extrakci bakteriocinu. Bujón Výsledný extrakt LM17 + LM17 + Tween 80 - MRS -

+,- pozitivní, negativní antibakteriální aktivita

Tabulka V Extrakce bakteriocinu adsorpcí na bun nou st nu po kultivaci kmene EN3 v bujónu LM17.

Vzorek BT[AU ml-1]

OB[ g ml-1]

SA[AU mg-1]

SP[1]

CA[AU]

Výt žnost [%]

p vodnísupernatant 800 50,4 15 900 - 40 000 -

promývací pufr 100 7,7 13 100 1 3 000 10 S(A) 1 600 40,5 39 500 2 32 000 80 S(B) 1 600 39,9 40 000 3 32 000 80 S(C) 1 600 43,4 36 900 2 32 000 80

S(A) výsledný extrakt za použití roztoku A, S(B) výsledný extrakt za použití roztoku B, S(C) výsledný extrakt odst ed ní za použití roztoku C

112

Záv rJako nevýhodn jší zp sob extrakce antibakteriálních látek organickým rozpoušt dlem

ze supernatantu kmene EN3 byl vybrán postup: extrakce n-propanolem v objemovém pom ru 1:3 p i hodnot pH supernatantu 3 do organické fáze, protože u tohoto postupu dochází k nejv tšímu p e išt ní (stupe p e išt ní 5) a je dosahováno nejvyšší aktivity a nejvyšší výt žnosti (100 %). Metodou extrakce bakteriocinu na bun nou st nu je získáno 80 % antimikrobiálních látek p i stupni p e išt ní 3 ze supernatantu kmene EN3 kultivovaném v LM17 bujónu. Vzhledem k dosaženým výsledk m, k jednoduchosti a p ístrojové nenáro nosti byla tato metoda zvolena jako nejvhodn jší metoda pro extrakci antibakteriálních látek ze supernatantu kmene EN3 a bude dále použita jako první stupe p i snaze o úplné p e išt ní a následném sekvenování tohoto bakteriocinu.

Tato práce byla podpo ena výzkumným zám rem MSM 6046137305 a vnit ním grantem 322080015.

Použitá literatura:1. Eguchi T., Kaminaka K., Shima J., Kawamoto S., Mori K., Choi S., Doi K., Ohmono S.:

Isolation and characterization of enterocin SE-K4 produced by thermophilic enterococci, Enterococcus faecalis K-4. Biosci. Biotech. Biochem. 65, 247-253 (2001).

2. Chumchalová J., Josephsen J., Plocková M.: The antimicrobial activity of acidocin CH5 in MRS broth and milk with added NaCl, NaNO3 and lysozyme. Int. J. Food. Microbiol. 43,33-38 (1998).

3. Schillinger U., Geisen R., Holzapfel W.H.: Potential of antagonistic microorganism and bacteriocins for the biological preservation of foods. Trends Food. Sci. Technol. 7, 58-64 (1996).

4. ten Brink B., Minekus M., van der Vossen J.M.B.M., Leer R.J., Huis in t Veld J.H.J.: Antimicrobial activity of lactobacilli: preliminary characterization and optimization of production of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus M64. J. Appl. Bacteriol. 77, 140-148 (1994).

Kontaktní adresa:[email protected]

113

VÝSKYT BACILLUS CEREUS A BACILLUS LICHENIFORMIS V PR B HU VÝROBY STERILOVANÉ SMETANY A TERMIZOVANÉHO DEZERTU

N me ková Irena1, Roubal Petr1, Pecha ová Marta1, Vylet lová Marcela2,Nejeschlebová Ludmila2

1 MILCOM, a.s., Praha, 2 Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín

Occurrence of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis during the manufacturing of sterilized cream and thermized dessert

Summary:B. cereus and B. licheniformis play an important role at the production and manufacturing of milk, namely from the point of view food-safety and sensory quality and shelf-life of final products. Occurrence of these microorganisms, total mesophilic count and count of thermoresistant microorganisms were monitored in phase samples taken from the manufacturing line of coffee cream sterilized in autoclave and creamy-curd thermized dessert. 55 of 103 spore-forming isolates were identified as B. licheniformis and 5 as B. cereus.B. licheniformis occurred during the whole manufacturing process. Manufacturing lines had no serious problems. Deterioration of monitored parameters could arise in consequence of incorrect function or improper sanitation of technological plant for fat standardization, cream pasteurisation, cream storage or curd manufacturing.

ÚvodV syrovém mléce je dominantním mezofilním sporulátem B. licheniformis, dále B. pumilus

a B. subtilis (11). Ze spíše psychrotrofních druh , zp sobujících alimentární onemocn ní, byl nej ast ji identifikován B. cereus (13). V roce 1998 byly psychrotolerantní kmeny B. cereus,které rostou p i 4 – 7 °C a nerostou p i 40 – 43 °C, za azeny do samostatného druhu B. weihenste-phanensis (7).

Bacily se vyzna ují bohatým enzymovým vybavením, zejména tvorbou proteas a lipas. Typické vady enzymatického p vodu jsou sladké srážení mléka, gelovat ní nebo tvorba sedimentu, ho knutí nebo zatuchlá pachu (2, 9, 12).

B. cereus zp sobuje adu infek ních onemocn ní a otrav z potravin, které jsou zap í in nytvorbou emetického nebo diarrheálního toxinu (6). Dalšími virulen ními faktory jsou nap .extracelulární hemolysin nebo fosfolipasa C (10). B. licheniformis svými toxiny zp sobuje vznik otrav z potravin provázených pr jmy a v polovin p ípad také zvracením (1).

Postup práceCílem této práce je v provozních podmínkách prokázat pr chod B. cereus a

B. licheniformis jednotlivými technologickými kroky a vytipovat možná riziková místa. Ve spolupráci s mlékárnami byly odebírány fázové vzorky z výroby smetany do kávy

sterilované v autoklávu a smetano-tvarohového termizovaného dezertu. Celkem byly od každého výrobku analyzovány ty i šarže vyrobené v pr b hu p l roku. Fázové vzorky byly hodnoceny po jednom kuse, finální výrobky po šesti kusech (sterilovaná smetana po termostatové zkoušce 30 °C/15 dn ).

Stanovován byl celkový po et mezofilních mikroorganism (CPM) podle SN ISO 6610 (4) a po et termorezistentních mikroorganism (TRM, 85 °C/10 min) podle SN 56 0100 (3). B. cereus a B. licheniformis byly konfirmovány s využitím SN ISO 7932 (5). Identifikace obou bacil byla potvrzena v eské sbírce mikroorganism , Brno.

Výsledky a diskuse Stanovené denzity mikroorganism vykazovaly ve všech ty ech šaržích srovnatelné

trendy – pr m rná data jsou znázorn na na obr. 1 až 3.V p ípad smetany do kávy (obr. 1) se po et termorezistentních mikroorganism až

do sterilace významn nem ní – pohybuje se ádov v desítkách. Naproti tomu celkový po et mezofilních mikroorganism je ovlivn n pasterací. Nejvyšší je CPM v syrovém mléce a v syrové

114

smetan – 105 až 106 JTK/ml. Pasterací smetany o tu nosti 10 % (95 – 98 °C/2 – 10 s) je usmrceno 99,95 % mikroorganism . V dalším technologickém kroku (standardizaci) vzr stá denzita p ítomných mikroorganism o ád a v pr b hu dalších operací se drží v tisících. Sterilací (117 °C/20 min) je v tšina mikroorganism usmrcena – ze všech finálních výrobk dohromady byly vykultivovány pouze dv kolonie.

0

1

2

3

4

5

6

7

syr. ml. syr. sm. past. sm. stand. sm. p edhomog.

po homog. p ed steril.

log

(JTK

/ml)

CPMTRM

Obr. 1 Fázová kontrola výroby smetany do kávy

Na obr. 2 a 3 jsou znázorn ny mikrobiologické pom ry p i výrob smetano-tvarohového termizovaného dezertu.

Za daných podmínek (83 – 85 °C/8 min) byl zjišt n pastera ní efekt pro mléko 99,98 %, pro ostrou smetanu pasterovanou 95 – 98 °C/2 – 10 s tato hodnota iní 98,56 %.

Mléko je zakysáváno smetanovou kulturou na denzitu 105 – 106 JTK/ml. B hem fermentace se CPM zvyšuje o ád a v dalších fázích výroby tvarohu se na této hodnot udržuje. Používaný záh ev (60 – 64 °C/4 – 6 min) neslouží k inaktivaci mikroorganism , ale ke zvýšení výt žnosti v d sledku navázání -laktoglobulinu na -kasein. B hem skladování tvarohu klesá celkový po et mikroorganism o více než t i ády. To by mohlo být zp sobeno odumíráním mikroorganism ve výrazn kyselém prost edí (pH nižší než u fermentovaných mlé ných výrobk ),zejména pokud je tvaroh nedostate n chlazen nebo delší dobu skladován.

Naproti tomu b hem skladování pasterované smetany se prakticky obnovuje výše CPM, která byla v syrovém mléce. Smísením s ostatními surovinami se CPM ješt o ád zvyšuje. Pravd podobn dochází k dalšímu pomnožení mikroorganism ze smetany, nebo CPM tvarohu je tisíckrát nižší než CPM smetany a další suroviny na výrobu dezertu (cukr, stabilizátory, aroma) netvo í významný podíl na objemu sm si. Porovnáním obr. 2 a 3 lze však konstatovat, že tvaroh m že být p í inou navýšení denzity termorezistent .

Termizací sm si (68 – 70 °C/15 s) je zni eno 97,42 % mikroorganism . B hem skladování finálního výrobku klesá CPM o tém dva ády.

Denzita termorezistentních mikroorganism se v po áte ních fázích výroby pohybuje ádov v desítkách, od záh evu koagulátu až po finální výrobek je o ád vyšší.

115

0

1

2

3

4

5

6

7

8

syr. ml. past. ml. zakysání koagulát koag.zah .

tvarohodst .

tvarohbarel

log

(JTK

/ml p

op. g

)

CPMTRM

Obr. 2 Fázová kontrola výroby dezertu – výroba tvarohu

0

1

2

3

4

5

6

7

syr. sm. past. sm. sm. silo sm s p edterm.

sm s poterm.

sm snášleh.

výrobek

log

(JTK

/ml p

op. g

)

CPMTRM

Obr. 3 Fázová kontrola výroby dezertu – p íprava a zpracování sm si

116

Izolováno bylo celkem 103 sporotvorných aerobních bakterií, v pr m ru 10 z jedné šarže výroby smetany a 16 z výroby dezertu. 55 izolát bylo identifikováno jako B. licheniformis, 5 jako B. cereus. Vysv tlením tohoto rozdílu m že být výrazné zastoupení B. licheniformis, který proti B. cereus p sobí inhibi n (11). Vyšší frekvenci záchytnosti B. licheniformis než B. cereus uvádí ve své práci i Vylet lová a Hanuš (14).

B. cereus byl izolován pouze ze syrové smetany, pasterovaného mléka a finálního termizovaného dezertu.

B. licheniformis byl p i výrob sterilované smetany izolován ze všech odb rových míst s výjimkou smetany po standardizaci a finálního výrobku. Protože p i standardizaci nedochází k inaktivaci mikroorganism , p edpokládat lze jeho pr chod. Vzhledem k rozsahu této práce a nízké pravd podobnosti záchytu bakterií po sterilaci nebyl pr chod sledovaných bacil do finálního výrobku prokázán. Tato možnost však nebyla vyvrácena.

Ve druhé sledované šarži termizovaného dezertu byl B. licheniformis zachycen ve všech fázích výroby. Výjimkou byl tvaroh skladovaný v barelu p ed použitím k p íprav sm si. Z tohoto místa byl B. licheniformis izolován ve tvrté šarži. Z ejmý je pr chod B. licheniformis celým výrobním procesem od syrového mléka až po finální výrobek.

Záv rPoužitými metodami nebyly u žádného z vyšet ovaných vzork zjišt ny závady.

Vytipovány však byly technologické kroky, které mohou být v p ípad nesprávné funkce nebo nedostate né sanitace p í inou zhoršení sledovaných mikrobiologických parametr .

Výroba sterilované smetany nezahrnuje výrazn riziková místa. Pozornost by m la být v nována standardizaci tu nosti. Ke zhoršení mikrobiologických parametr m že docházet sm šováním s mén kvalitní surovinou nebo v d sledku nesprávn provád né sanitace.

V p ípad smetano-tvarohového termizovaného dezertu se ukázala jako slabé místo výroba smetany. Problematická je pasterace ostré smetany, nebo vysoký obsah tuku zhoršuje proces sdílení tepla a navíc p sobí p i záh evu v i mikroorganism m protektivn . Nezbytná je správná funkce pastéru – p etlak na stran pasterované smetany a dostate ná t snost za ízení, aby nedocházelo k pr niku syrové smetany do pasterované, a dále d kladné odstra ování usazenin z tepelného vým níku.

K nevhodnému nár stu celkového po tu mikroorganism dochází b hem skladování pasterované smetany. Doporu it lze co nejv tší možné zkrácení doby skladování a dodržení chladícího et zce.

V obou sledovaných výrobách je denzita termorezistentních mikroorganism prakticky konstantní nebo se mírn zvyšuje. Jediným krokem, ve kterém dochází k jejímu snížení, je sterilace. Hlavním zdrojem termorezistent v dezertu je tvaroh. Pravd podobnými p í inami jsou kontaminace z biofilm nebo aktivace spor p i záh evu koagulátu.

S výjimkou sterilace byl v provozních podmínkách prokázán pr chod B. licheniformiscelým výrobním procesem sterilované smetany i termizovaného dezertu od vstupní suroviny až po finální výrobek. V souladu se zjišt ním, že hlavním zdrojem B. cereus v pasterovaném mléce je vstupní surovina (8), ze získaných výsledk pro ob sledované technologie vyplývá význam kontaminace syrového mléka B. licheniformis.

Pod kováníTato práce vznikla za finan ní podpory NAZV MZe R p i ešení projektu QF 4004 –

Vývoj metody pro ur ení p vodu kontaminace finálních mlé ných výrobk potravními patogeny.

Literatura1. Bacteria Genomes, Bacillus licheniformis [on-line]. European Molecular Biology Laboratory –

European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) [cit. 2006-12-20]. Dostupný na www: <http://www.ebi.ac.uk/2can/genomes/bacteria/Bacillus-licheniformis>

117

2. Celestino, E. L., Iyer M., Roginski, H.: Reconstituted UHT-treated milk: Effects of raw milk, powder quality and storage conditions of UHT milk on its physico-chemical attributes and flavour. Int. Dairy J. (1997), 7: 129 – 140.

3. SN 56 0100 Mikrobiologické zkoušení poživatin, p edm t b žného užívání a prost edípotraviná ských provozoven. NI, Praha, 1994.

4. SN ISO 6610 Mléko a mlé né výrobky – Stanovení po tu jednotek mikroorganism tvo ícíchkolonie – Technika po ítání kolonií vykultivovaných p i 30 °C. NI, Praha, 1996.

5. SN ISO 7932 Mikrobiologie. Všeobecné pokyny pro stanovení po tu Bacillus cereus.Technika po ítání kolonií vykultivovaných p i 30 °C. NI, Praha, 2005.

6. Gabig-Ciminska, M., Andresen, H., Albers, J., Hintsche, R., Enfors, S. O.: Identification of pathogenic microbial cells and spores by electrochemical detection on a biochip. Microb. Cell Factor. (2004), 3:2.

7. Lechner, S., Mayer, R., Francis, K.P., Prüss, M., Kaplan, T., Wiessner-Gunkel, E., Steward, G.S.A.B., Scherer, S.: Bacillus weihenstephanensis spp. no. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group. Int. J. Syst. Bacteriol. (1998), 48: 1373 – 1382.

8. Lin, S., Schraft, H., Odumera, J. A., Griffiths, M. W.: Identification of contamination sources of Bacillus cereus in pasteurised milk. Int. J. Food Microbiol. (1998), 43: 159 – 171.

9. Santos, M. V., Ma, Z., Caplan, Z., Barbano, D. M.: Sensory threshold of off-flavours caused by proteolysis and lipolysis in milk. J. Dairy Sci. (2003), 86: 1601 – 1607.

10. Sneath, P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, M. E., Holt, J. G.: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1986, str. 1113, 1131, 1133. ISBN 0-683-07893-3.

11. Sutherland, A. D. & Murdoch, R.: Seasonal occurrence of psychrotrophic Bacillus species in raw milk, and studies on the interaction with mesophilic Bacillus sp. Int. J. Food Microbiol. (1994), 21: 279 – 292.

12. Valero, E., Villamiel, M., Miralles B., Sanz J., Martínez-Castro I.: Changes in flavour and volatile components during storage of whole and skimmed UHT milk. Food Chem. (2001), 72: 51 – 58.

13. Vylet lová, M., Švec, P., Pá ová, Z., Sedlá ek, I., Roubal, P.: Occurrence of Bacillus cereusand Bacillus licheniformis strains in the course of UHT milk production. Czech J. Anim. Sci. (2002), 47 (5): 200 – 205.

14. Vylet lová M., Hanuš O.: Výskyt vybraných potravních patogen p i výrob UHT mléka, jogurtu a sýru a jejich vztah k n kterým skupinám mikroorganism . Veteriná ství (2005), 9: 567 – 572. ISSN 050-68-231.

Kontaktní adresa Ing. Irena N me ková, MILCOM, a.s., Ke Dvoru 12a, 160 00 Praha 6, tel.: 235 354 551-2, [email protected]

118

MIKROBIOLOGICKÁ A MOLEKULÁRN -BIOLOGICKÁ DETEKCE BAKTERIE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM V POLOTVRDÝCH SÝRECH

Sládková Pavla, Burdychová Radka Ústav technologie potravin, MZLU Brno

Detection of Clostridium tyrobutyricum in semi-hard cheeses using microbiological and PCR methods

Summary:Butyric acid fermentation caused by the outgrowth of clostridial spores present in raw milk can create considerable loss of product, especially in the production of semihard cheeses. This defect is called the late blowing defect in cheese. Modern studies show, that only one bacterium of the genus Clostridium is able to provoke late blowing – Clostridium tyrobutyricum. Semihard cheeses with visible clostridial defect were used for analysis. In this work, microbiological detection of butyric acid producing clostridia in semihard cheeses was optimalized. Also biochemical analysis (using API testes) of mentioned bacteria was performed. Further experiments were focused on optimalization of rapid PCR method for Clostridium tyrobutyricum identification. The results show, that this PCR metod is suitable for rapid screening of the presence of Clostridium tyrobutyricum in late- blowing defect cheeses.

Úvod:Vedle požadavku na zdravotní nezávadnost sýra jsou základními znaky kvality zralého

polotvrdého sýra odpovídající fyzikáln -chemické složení a senzorické vlastnosti. P i zrání a vývoji výsledné chuti a v n zralých sýr hrají významnou úlohu zm ny bílkovinné matrice sýrspolup sobením proteáz z mléka, použitými istými mléka skými kulturami, použitého sy idla i kontaminující mikroflórou, p ežívající pasteraci mléka ur eného pro výrobu sýr (3). Významný vliv na výslednou kvalitu polotvrdých sýr mají bakterie máselného kvašení rodu Clostridium.Ke kontaminaci touto bakterií nej ast ji dochází ze siláže, p ípadn v prvovýrob mléka p i špatných hygienických podmínkách. Jestliže zví e poz e v tší množství t chto anaerobních bakterií nebo spor, m že za ur itých podmínek v trávicím traktu dojít k jejich zmnožení, jsou vylu ovány výkaly a m žou i p i minimálním zne išt ní vemene kontaminovat mléko. Zástupci rodu Clostridium mají v sýrech vhodné podmínky pro klí ení a pomnožování, s následnou produkcí vodíku a kyseliny máselné. Dochází k tvorb v tších i menších dutinek odd lených od sebe tenkou blankou a sýry získávají pálivou chu po zv tralém másle. Tato vada se ozna uje jako pozdní du ení sýr . Za p vodce této vady byla v nejnov jších studiích ozna ena jediná bakterie – Clostridium tyrobutyricum (4). Množství spor, které pozdní du ení zp sobuje, se pohybuje v rozmezí 5 až 106 spor na litr mléka ur eného k výrob sýr (6). Po et spor, které zp sobí pozdní du ení sýr , je závislé také na velikosti a tvaru sýra. Jsou známé p ípady, kdy kontaminace jednou endosporou C. tyrobutyricum zp sobila vadu pozdního du ení u sýru Gouda (5).

Clostridium tyrobutyricum je grampozitivní sporulující anaerobní bakterie. Na masopeptonovém krevním agaru roste v drobných, okrouhlých šedobílých koloniích s jemnými hladkými okraji o velikosti 0,5 mm. Optimální teplota r stu je 37 °C, je schopno r stu i p i teplot25 °C. P i teplot 45 °C již mikrob neroste. R st v bujónu podporuje p ítomnost fermentativních cukr jako je glukosa, fruktosa nebo laktosa. R st je inhibován p ítomností 6,5 % NaCl v mléku.

V sou asné dob se mnoho prací zabývá technologickým významem a negativním vlivem C. tyrobutyricum na zrání polotvrdých sýr a jejich finální kvalitu. Mezi metody pro stanovení a identifikaci této bakterie pat í kultivace na RCM (Reinforced Clostridium Medium) a API testy vyráb né firmou bioMerieux, Inc. Pomocí API je mikrobiální identifikace jednodušší, rychlejší a spolehliv jší. Další významnou metodou je molekulárn biologická metoda PCR. S její pomocí jsme schopni na základ analýzy deoxyribonukleové kyseliny stanovit konkrétní druh mikroorganismu. V roce 1995 použili (6) tuto metodu ke stanovení výše zmi ovanémuC. tyrobutyricum v syrovém mléce.

119

Materiál a metody:

1. Bakteriální kmeny a jejich r stové podmínkyBakteriální bu ky C. tytobutyricum (soukromá sbírka Milcom, Tábor) byly kultivovány

anaerobn na RCM médiu p i 37 °C po dobu 5 dní. Kultura byla použita jako pozitivní kontrola pro PCR.

2. Izolování mikroorganism ze sýrK analýze byly použity polotvrdé sýry s vadou pozdního du ení. Dvojice 10 g vzork byla

zalita 90 ml sterilního fyziologického roztoku (NOACK, Francie) a homogenizována 2 minuty. Následn byly zhomogenizované vzorky z ed ny sterilním fyziologickým roztokem v pom ru 1:10 a rozpipetovány do sterilních Petriho misek v množství 1 ml. Jako živná p da bylo použito RCM médium s bromcresolovou mod í (Milcom,Tábor, eská republika) a s polymyxinem B (500 mg/l roztoku). Vzorky byly kultivovány v anaerobních podmínkách p i 37°C po dobu 5 dní. Presumptivní kolonie byly 2x p e išt ny p es jednu kolonii a použity pro izolaci DNA.

P i zkumavkové metod bylo použito RCM médium s bromcresolovou mod í(Milcom,Tábor, eská republika) a s polymyxinem B (500 mg/l roztoku), které bylo rozpipetováno po 10 ml do sterilních zkumavek. Do média bylo rozpipetováno p íslušné ed níhomogenizovaného vzorku v množství 1 ml. Obsah zkumavky byl šetrn promíchán a po mírném zchladnutí zalit sterilním parafinovým voskem. Zkumavky byly inkubovány v termostatu p i 37 °C po dobu 5 dní.

3. Izolace DNA PCR metodou Standardní DNA manipulace byly provedeny podle SAMBROOK et al. (2001). PCR byla

provedena v kone ném objemu 25 μl obsahujícím 10 ng genomové DNA, 10 pmol každého primeru Ct1F/Ct1R, 1 U Taq DNA polymerázy a p íslušné množství Qiagen HotStar Master Mixu (Qiagen, Hilden, Germany). Vzorky DNA byly nejprve kompletn denaturovány 15 min. inkubací p i 95 °C. DNA byla amplifikována ve 30 cyklech: denaturace p i 95 °C po dobu 45 s, p ipojeníprimer p i 55 °C po dobu 45 s a elongace p i 72 °C po dobu 75 s, s použitím modelu PTC – 150 HB thermal cycler (MJ Research, Waltham, MA, USA). V posledním amplifika ním cyklu byly vzorky inkubovány 5 min p i 72 °C pro kompletní elongaci PCR produkt . PCR produkty byly vizualizovány agarosovou gelovou elektroforézou (1 %, 5 V/cm, 60 min.) a barvením ethidium bromidem (0,5 μl/ml). Nested PCR byla provedena s primery Ct2F/Ct2R p i stejném amplifika ním programu. Do PCR sm si bylo p idáno 5 μl PCR produktu z 1. cyklu.

Výsledky a diskuse:Práce byla zam ena na stanovení a identifikaci kmene C. tyrobutyricum ze dvou vzork

polotvrdých sýr , které vykazovaly zjevné senzorické zm ny s podez ením na vadu pozdního du ení sýr . Zkumavková metoda byla v této práci využita pouze k orienta nímu stanovení druhu C. tyrobutyricum. Tato metoda je doporu ena k orienta nímu stanovení kyseliny a plyn produkujících druh Clostridium sp. v mléce (7). P i stanovení C. tyrobutyricum zkumavkovou metodou byla využita p da RCM s bromcresolovou mod í a polymyxinem B. Již po 24 hodinách byly zaznamenány pozitivní reakce. Došlo ke zm n barvy média z ervenofialové na žlutohn dou.Tvorbou vodíku byla parafinová zátka vyražena sm rem vzh ru a agar ve zkumavce na n kolika místech potrhán.

Stanovení C. tyrobutyricum bylo provedeno plotnovou metodou. P i práci bylo použito RCM médium s bromcresolovou mod í (Milcom, a.s., Tábor) pro stanovení po tu sporulujících anaerobních mikroorganism v mlé ných výrobcích, obohaceno p ídavkem polymyxinu B (500 mg/l). C. tyrobutyricum bylo detekováno v obou vzorcích sýra r stem specifických velkých o kovitých žlutých kolonií o pr m ru 0,5 mm. ichem bylo možné zaznamenat zápach

po kyselin máselné. Tvorba vodíku byla patrná potrháním agaru. Po et kolonií ode tených a

120

zpr m rovaných ve vzorku . 1 byl 10,0 KTJ/g. Ve vzorku . 2 bylo 55,0 KTJ/g. (6) uvád jí, že množství spor, které zp sobuje pozdní du ení sýr , se pohybuje v rozmezí 5 až 106 spor na litr mléka ur eného k výrob sýr . Stanovené po ty C. tyrobutyricum ve vzorcích sýr prokazují vadu pozdního du ení sýr . Pro srovnání správnosti pracovního postupu a vyhodnocení plotnové i zkumavkové metody byl sou asn testován ob ma metodami sbírkový bakteriální druh C. tyrobutyricum (soukromá sbírka Milcom, Tábor).

P ítomnost C. tyrobutyricum byla potvrzena pomocí API test (bioMérieux, Francie) - API 50 CHB a RAPID ID 40 A. Protože jsou však API testy založeny na pr kazu biochemických vlastností analyzovaných bakterií a z literatury je známo, že se biochemické vlastnosti sbírkových a terénních kmen mohou zna n lišit, p ítomnost C.tyrobutyricum byla ov ena pomocí PCR, která je založena na analýze DNA stanovovaných mikroorganism . Pro PCR byla v této práci použita HotStar Taq DNA sm s (Qiagen), která obsahuje HotStar Taq polymerázu spolu s p íslušnými komponentami PCR. Tato polymeráza je modifikovanou formou Taq DNA polymerázy. V PCR sm si je v inaktivovaném stavu, takže nemá žádnou polymerázovou aktivitu. Absence polymerázové aktivity brání extenzi nespecifických hybridiza ních primer a vzniku primerových dimer , které se mohou tvo it p i nízkých teplotách na po átku PCR a b hem prvního PCR cyklu. HotStar Taq DNA polymeráza je aktivována desetiminutovou až patnáctiminutovou inkubací p i 95 °C (2). Koncentrace polymerázy je vzhledem k ostatním komponentám sm si již optimalizována, což minimalizuje tvorbu nespecifických PCR produkt a zaru uje dobrou amplifika ní ú innost enzymu. PCR pufr obsahuje vyváženou kombinaci KCl a (NH4)2SO4, které jsou d ležité pro specifickou hybridizaci primers DNA matricí. Optimalizovaná koncentrace ho e natých iont zaru uje dobrou ú innost reakce a reak ní specifitu. Pro optimalizaci PCR je nutné pouze ov ení vhodného množství DNA a po tuPCR cykl (1). Optimální bylo použití 10 ng DNA do PCR sm si a 30 cykl polymerázové et zové reakce. PCR byla použita pro identifikaci vykultivovaných kolonií z analyzovaných

vzork sýr (Obr. I). Do PCR reakce byla jako DNA templát použita purifikovaná DNA izolovaná z presumptivního bakteriálního kmene C. tyrobutyricum z RCM agaru. Specifické PCR produkty o ekávané velikosti (237 bp) byly detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy, která potvrdila p ítomnost kmene C. tyrobutyricum v analyzovaných vzorcích sýr .

Obr. 1. PCR detekce C. tyrobutyricum izolovaného z polotvrdých sýr .B h . 1 a 2: vzorky sýru pozitivního na p ítomnost C. tyrobutyricum, b h . 3: pozitivní PCR kontrola (C. tyrobutyricum, Milcom, Tábor), b h . 4: negativní PCR kontrola (komponenty PCR bez DNA), b h . 5: 100 bp ladder (New England Biolabs, Anglie)

1 2 3 4 5bpbp

237

12001000

500

bp

121

Záv r:1. C. tyrobutyricum bylo detekováno ve všech sýrech s viditelnou klostridiální vadou

v koncentraci 10.0 a 55.0 KTJ/g.

2. P ítomnost C. tyrobutyricum byla potvrzena pomocí API test (BioMérieux, Francie) API 50 CHB a RAPID ID 40 A.

3. P ítomnost C. tyrobutyricum byla potvrzena pomocí PCR (6).

Použitá literatura:1. BURDYCHOVÁ, R.: Skríning vybraných startovacích bakteriálních kultur na p ítomnost DNA

sekvencí kódujících dekarboxylázu tyrosinu. Acta univ. Agric. Et silvic. Mendel. Brun., 2006, LIV, No. 5, pp. 7 – 12

2. DRÁBER, P., PET Í EK, M., BOUBELÍK, M., BRDI KA, R., ZADINA, J.: Pokroky v PCR technologii a jejím využití. Pracovní materiály seminá e. 1. vyd. Praha: Ústav molekulární genetiky AV R. 1993, 550 s.

3. ERBAN, V., ERNÝ, V., KOMÁRKOVÁ, E.: Zm ny ve složení sýrové hmoty b hem zrání. Sborník mléko a sýry, 2006, pp. 4

4. FRAZIER, W. C., WESTHOFF, D.: Food Mikrobiology, 1988, 4th edition. New York: McGrew Hill Book, ISBN 0-07-021921-4, 539 s

5. CHENG, S. Y., INGHAM, S. C.: Influence of milk centrifugation, brining and ripening conditions in preventing gas farmation by Clostridium spp. in Gouda Cheese, International Journal of Food Mikrobiology, 2000, [online], vol. 54, is. 3 [cit. 2006 –12-07]

6. HERMAN, L. M. F., DE BLOCK, J. H., WAES, G. M.: A direct PCR Detection Method for Clostridium tyrobutyrikum Spores in up to 100 Milliliters of Raw Milk, Applied andEnvironmental Microbiology, Dec. 1995, p. 4141-4146

7. N ME KOVÁ, I., PECHA OVÁ, M., ROUBAL, P.: Semikvantitativní stanovení Clostridium sp. zkumavkovou metodou, Mléka ské listy, 2006, 95, pp. 16 - 17

8. SAMBROOK, J., FRITCH, E. F., MANIATIS, T.: Molecular cloning, 2001, 3rd. Ed. New York: Cold spring Barbor Lab. Press.

Kontaktní adresa:Ing. Pavla Sládková, Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, eská republika. Ing. Radka Burdychová Ph.D., Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, eská republika.

122

IZOLÁCIA A PCR-TYPIZÁCIA KME OV BAKTÉRIÍ MLIE NEHO KYSNUTIA Z BRYNDZE

Bertaová Gabriela 1, Kuchta Tomáš 1, Valík ubomír 2, Pangallo Domenico 3

1Výskumný ústav potravinársky, Bratislava; 2Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita, Bratislava,

3 Ústav molekulárnej biológie, Slovenská akadémia vied, Bratislava

Isolation and PCR-typing of lactic acid bacteria from bryndza cheese

Summary:Non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) are the natural microflora of bryndza cheese (typical Slovak sheep cheese). NSLAB during cheese manufacturing contribute to an increase in the level of free amino acids, peptides, and free fatty acids, which leads to enhanced flavour intensity and accelerates cheese ripening. Several kinds of NSLAB were isolated from two different bryndza cheeses by cultivation on MRS plates. The isolated NSLAB were identified by API 50 CHL as: Lactobacillus plantarum (11 strains), Lb. brevis(4 strains), Lb. paracasei subsp. paracasei (6 strains), Lb. acidophilus (2 strains), Lb. curvatus (2 strains), Lb. fermentum (5 strains) and Lactococcus lactis subsp. lactis (5 strains). All the NSLAB were also characterized by two PCR-based methods, the repetitive extragenic palindrome polymerase chain reaction (REP-PCR) and the random amplified microsatellite polymorphic DNA (RAMP). The methods were optimized by setting up the correct DNA concentration of the samples and by the selection of a suitable PCR program. Both methods were able to differentiate the NSLAB strains on the species level and also to extend their characterization to the subspecies level.

ÚvodBryndza je zrejúci tvarohovitý syr s bielou až žltkavou farbou a jemnou roztierate nou

konzistenciou, ktorý patrí do skupiny prírodných syrov. Výroba bryndze má na území Slovenskej Republiky dlhoro nú tradíciu. Základnou surovinou na výrobu bryndze je ov í syr (ov í hrudkový syr), alebo jeho skladovaná forma – skladovaný ov í syr (sudový ov í syr) vyrobený z ov ieho mlieka a hrudkový syr vyrobený z kravského mlieka. Najviac zastúpenou mikroflórou v bryndzi sú baktérie mlie neho kysnutia. Baktérie mlie neho kysnutia tvoria ve kú prirodzenú skupinu nepohyblivých, nesporulujúcich grampozitívnych kokov a pali iek, ktoré svojím fermentatívnym metabolizmom produkujú kyselinu mlie nu a alšie látky, v aka ktorým tradi ná bryndza získava svoje jedine né vlastnosti [1].

Cie om tejto práce bola izolácia kme ov baktérií mlie neho kysnutie z bryndze, pri om sme sa sústredili na druhy rodu Lactobacillus. Použili sa klasické fenotypické metódy a molekulárno-biologické metódy založené na polymerázovej re azovej reakcii (PCR). Zárove sa overila aplikovate nos typiza ných metód REP-PCR a RAMP na súbore izolovaných kme ovLactobacillus sp.

Materiál a metódy Vzorky bryndze sa spracovali štandardnou mikrobiologickou technikou a analyzovali na

selektívnych médiách MRS Lactobacillus agar (anaeróbna kultivácia pri 37 °C, 24-72 h) a M-17 agar (aeróbna kultivácia pri 30 °C, 24-48 h). Z vyrastených kolónií na MRS agare sa z každej vzorky na základe morfológie kolónií vybralo 5-6 kolónií. Vybrané kolónie sa podrobili morfologickej, fyziologickej analýze: farbenie pod a Grama, katalázová skúška, KOH test, rast baktérií v zvislom agarovom st pci, tvorba plynu z glukózy a biochemickej analýze identifika nýmsystémom API 50 CHL (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francúzsko). Ako kontrolné kmene sa použili: Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCM 7275, Lb. casei CCM 4798, Lb. plantarumCCM 3626, Lactococcus lactis subsp. lactis CCM 1877.

Z 5 ml kultúry vyrastenej po as 24 h kvapalnej pôde MRS pri 37 °C sa izolovala DNA použitím chaotropickej extrakcie na tuhej fáze súpravou QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko).

PCR sa realizovala v 25 μl reak nej zmesi. Na RAMP sa použili priméry K7 (CAA CTC TCT CTC TCT) a 1254 (CCG CAG CCA A) [2]. Pre REP-PCR sa použili priméry REP 1R-I (III

123

ICG ICG ICA TCI GGC) a REP 2-I (ICG ICT TAT CIG GCC TAC) [3]. Použila sa HotStarTaq DNA polymeráza (Qiagen). Pri optimalizácii koncentrácie DNA sa použivalo 50, 100, 150, 200, 300 ng DNA. Amplifikácia prebiehala v cykléri Biometra Personal (Whatman Biometra, Göttingen, Nemecko) s teplotným programom: úvodná denaturácia pri 95 °C, 15 min; 30 cyklov amplifikácie (denaturácia pri 94 °C, 60 s; annealing pri 40 °C, 90 s; polymerizácia pri 68 °C, 180 s); závere nápolymerizácia pri 68 °C, 10 min. PCR produkty sa analyzovali elektroforézou v 1,5% agarózovom géli [4].

Výsledky a diskusia Fenotypiza nými metódami sa získalo druhové taxonomické spektrum baktérií mlie neho

kysnutia: Lactobacillus acidophilus, Lb. brevis, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. fermentum,Lb. paracasei subsp. paracasei a Lactococcus lactis subsp. lactis. Celkový zoznam kme ov uvádza Tabu ka I.

Tabu ka I Zoznam izolovaných a identifikovaných kme ov pochádzajúcich z piatich výrobní bryndze.

Druh íslo kme a OblasLactobacillus brevis 22A2 Tisovec Lactococcus lactis subsp. lactis 24A2 Tisovec Lactobacillus fermentum 28A1 Tisovec Lactobacillus brevis 3D1 Liptovský Mikuláš Lactobacillus acidophilus 27C Tur ianske Teplice Lactobacillus acidophilus 21C Tur ianske Teplice Lactococcus lactis subsp. lactis 16C1 Tur ianske Teplice Lactococcus lactis subsp. lactis 16C2 Tur ianske Teplice Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 14C1 Tur ianske Teplice Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 14C2 Tur ianske Teplice Lactobacillus fermentum 21A1 Tisovec Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 9B2 Zvolenská Slatina Lactococcus lactis subsp. lactis 22C Tur ianske Teplice Lactobacillus fermentum 10B1 Ružomberok Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 19C Tur ianske Teplice Lactobacillus fermentum 25A1 Tisovec Lactobacillus fermentum 27A1 Tisovec Lactobacillus rhamnosus 18C Tur ianske Teplice Lactobacillus brevis 4D1 Liptovský Mikuláš Lactobacillus curvatus 26A11 Tisovec Lactobacillus curvatus 26A12 Tisovec Lactobacillus plantarum 1F6 Ružomberok Lactobacillus plantarum 1F5 Ružomberok Lactobacillus plantarum 1F31 Ružomberok Lactobacillus plantarum 1F61 Ružomberok Lactobacillus brevis 2F4 Tur ianske Teplice Lactobacillus plantarum 2F2 Tur ianske Teplice Lactobacillus plantarum 2F6 Tur ianske Teplice Lactobacillus plantarum 2F11 Tur ianske Teplice Lactobacillus plantarum 2F1 Tur ianske Teplice Lactobacillus plantarum 1F1 Ružomberok Lactobacillus plantarum 1F11 Ružomberok Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 2F Tur ianske Teplice

124

Obr. 1. REP-PCR profily: 1,2 - Lb. acidophilus, 3 - Lb. fermentum, 4,5 - Lc. lactis,6,7 - Lb. paracasei, 8 - Lb. paracasei CCM7275, 9. - Lc. lactis CCM1877, 10 - Lb. brevis,11 - Lb. paracasei, L - štandard molekulových hmotností 250 bp.

Obr. 2. RAMP profily: 1, 2, 3 - Lb. fermentum, 4 - Lc. lactis, 5 - Lb. rhamnosus,6 - Lb. acidophilus, 7 - Lb. plantarum, 8 - Lb. fermentum, 9 - Lb. acidophilus, 10 - Lb. brevis,11 - Lb. paracasei, 12 Lc. lactis, L - štandard molekulových hmotností 250 bp.

125

Nevýhodou fenotypiza ných metód je asová náro nos , technická obtiažnos a malá univerzálnos . Sú limitované obmedzeným po tom vlastností vhodných pre analýzu, variabilná expresia génov môže vies k nesprávnym výsledkom a nie každý zástupca príslušného bakteriálneho druhu je typizovate ný. DNA analyza né metódy, v porovnaní s fenotypiza nými metódami, nie sú závislé od fyziologického stavu bunky, sú univerzálnejšie, vhodné na detekciu viacerých bakteriálnych druhov a detekciu špecifických DNA sekvencií, charakteristických len pre ur itý druh, i kme .[5]. Práve preto alším cie om tejto práce bolo nájs vhodné metódy na typizáciu. Ako prvé sme na PCR-typizáciu izolovaných kme ov vybrali dve metódy založené na DNA analýze: REP-PCR – polymerázová re azová reakcia repetitívnych sekvencií a RAMP - náhodne amplifikované polymorfné mikrosatelity.

Metódy REP-PCR a RAMP sa optimalizovali o do použitého teplotného programu a optimalizovala sa koncentrácia templátovej DNA. Obe metódy umož ovali druhové rozlíšenie a v niektorých prípadoch tiež rozlíšenie rôznych kme ov v rámci jedného druhu.

Záver

Na základe výsledkov sme dospeli k záveru, že obe metódy REP-PCR aj RAMP umož ujúmedzidruhové rozlíšenie a do ur itej miery sú vhodné aj na subtypizáciu kme ov rámci jedného druhu. Na overenie týchto metód je nutná analýza alších kme ov.Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy . APVV-20-005605.

Použitá literatúra: 1. Görner, F. - Valík, .: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava : Malé centrum, 2004, 528 s. 2. Kun-sheng, W. - Jones, R. - Danneberger, L. - Scolnik, P.: Detection of microsatellite polymorphisms

without cloning. Nucleic Acids Research, 22, 1994, s. 3257-3258. 3. Versalovic, J. - Koeuth, T. - Lupski, J. R.: Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and

application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 19, 1991, s. 6823-6831. 4. Pangallo, D. - Karpíšková, R. - Tur a, J. - Kuchta, T.: Typing of food-borne Listeria monocytogenes by

the optimized repetitive extragenic palindrome-based polymerase chain reaction. New Microbiologica, 25, 2002, s. 449-454.

5. Busch, U. - Nitschko, H.: Methods for the differentation of microorganisms. Journal of Chromatography B, 722, 1999, s. 263-278.

Kontaktná adresa:Mgr. Gabriela Bertaová, Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, 824 75 Bratislava 26, Slovensko. [email protected]

126

MONITORING A IDENTIFIKÁCIA POTENCIÁLNYCH BAKTERIÁLNYCH KONTAMINANTOV OV IARSKYCH VÝROBKOV VO VÝROBNOM PROCESE

Kostolníková Mária, Kore ová Janka, Lopašovská Janka Výskumný ústav potravinársky Bratislava, Odd. hygieny, sanitácie a mikrobiológie potravín

Monitoring and identification of bacterial contaminants in production process of sheep products

Summary:The work is a meant to enhance the sanitary standards of the production of traditional regional specialities from sheep´s milk. It is targeted on monitoring of selected genera of bacterial contaminants and on identification of authentic tribes G- and G bacteria izolated from products and processing surfaces (stainless steel, plastic material, wood) in 4 sheep plants. It were the staphylococci and the enterococci of the G bacteria and the coliforms of G- bacteria of the processed graph of the quantity of the selected contaminant genera, that were the most common ones on all 3 kinds of surfaces. The staphylococci, enterococci, coliforms bacteria and pseudomas were the most frequent contaminants present in traditional products from sheep´s milk (sheep´s milk, fresh cheese, slovak steamed cheese „parenica“ and slovak sheep cheese „bryndza“). After identification of G- bacteria we found the occurrence of the species: E. coli, Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris, Enterobacter cloacae and the genus Pseudomonas, which occurrence is certified even by foreign literature. From G bacteria we found Staphylococcus aureus, St. haemolyticus, St. saprophyticus, St. hominis, Enterococcus faecalis, Ent. faecium, Bacillus cereus, B. cereus var. mycoides.

ÚvodProblematika mikrobiologickej bezpe nosti výroby tradi ných potravín živo íšneho pôvodu

a potravín vôbec je zoh adnená v Nariadeniach ES [1, 2, 3]. Ako z nich vyplýva, jedným z cie ovpotravinového práva je vysoká úrove ochrany verejného zdravia.

Jedným z možných zdrojov kontaminácie produktov je aj nedokonalé o istenie povrchov výrobných zariadení po výrobe a následne tým ovplyvnená neú inná dezinfekcia [4]. Navyše mikroorganizmy sú schopné nadobudnutia rezistencie na nízke koncentrácie dezinfek nýchprostriedkov, ktorá má za následok spolu s organickými zvyškami aj vhodné podmienky pre tvorbu biofilmov na povrchoch zariadení. Ako východisko k štúdiu podmienok tvorby a merania aktivity biofilmov na tuhých povrchoch sme sa pokúsili zmapova prostredie prevádzok ov iarskych výrobkov z h adiska výskytu mikrobiologických kontaminantov potravín na povrchoch výrobných zariadení a vo výrobkoch.

Materiál a metódyOdber vzoriek: Vzorky z nerezových, plastových a drevených povrchov výrobných zariadení sme odoberali priamo v prevádzkach vatovým tampónom z plochy 100 cm2. Z desiatkového riedenia sa inokulovalo 0,2 ml - 0,5 ml na povrch príslušnej selektívnej pôdy, po et baktérií bol udávaný na plochu 1 cm2.Ako alternatívna metóda stanovenia po tu baktérií bola použitá odtla ková metóda (Hygicult, Orion Diagnostica). Získaný materiál sme podrobili mikrobiologickému rozboru z h adiska CPM, po tukoliformných baktérií a enterokokov, ktorých druhy sú považované za významné z h adiskahygieny [5]. alej sme selektovali stafylokoky, pseudomonády a Bacillus cereus.

Kultiva né médiá: Pre stanovenie CPM bolo použité médium GTK agar (HiMedia). Pre stanovenie po tu koliformných baktérií médium V ŽL (Chromocult C, Merck). Pre stanovenie po tu enterokokov Slanetz-Bartleyho médium (HiMedia). Pre stanovenie po tu stafylokokov Baird-Parkerovo médium (BioMark). Pre stanovenie po tu koagulázo-pozitívnych stafylokokov Baird Parkerovo médium + králi ia plazma (Bio-Rad). Pre izoláciu pseudomonád Pseudomonas Isolation Agar (HiMedia). Pre stanovenie Bacillus cereus selektívne médium MYP (Merck).

127

Identifikácia MO: Zo selektívnych médií bolo vybraných 10 typických kolónií enterobaktérií, enterokokov, stafylokokov a pseudomonád z každej Petriho misky. Boli inokulované na GTK agar a po overení istoty kultúry, zaradenia pod a Gramma, mikroskopického obrazu, boli kmene identifikované

súpravami ENTEROtest 24, EN-COCCUStest, STAPHYtest 16, NEFERMtest 24 (Mikrolatest, Lachema).

Výsledky a diskusiaZo spracovaného preh adu po tu kontaminantov v ov iarskych prevádzkach boli

na všetkých troch povrchoch najviac zastúpené stafylokoky, enterokoky a koliformné baktérie (obr.1-3). V tradi ných výrobkoch z ov ieho mlieka (ov ie mlieko, erstvý syr, slovenský oštiepok, slovenská parenica a slovenská bryndza) boli z kontaminantov najviac zastúpené: stafylokoky, enterokoky, koliformné baktérie a pseudomonády, ktorých íselné hodnoty sú uvedené v tab. I.

Po identifikácii kme ov G baktérií sme zistili prítomnos nasledovných druhov: E. coli, Klebsiella oxytoca, Proteus vulgaris, Enterobacter cloacae a rod Pseudomonas, ktorých výskyt potvrdzuje aj zahrani ná literatúra (tab. II). Rod Pseudomonas sa vo ve kej miere podie a na tvorbe biofilmov [6, 4]. Z G baktérií z ov iarskych prevádzok sme stanovili rod Staphylococcus, Enterococcus a Bacillus (Staphylococcus aureus, St. haemolyticus, St. saprophyticus, St. hominis, Enterococcus faecalis, Ent. faecium, Bacillus cereus, B. cereus var. mycoides)(tab. III). Druh Bacillus cereus sa zara uje medzi patogény pre produkciu enterotoxínov a je významným bežným kontaminantom vzduchu, mlieka a cereálií [7, 8]. Obsah Staphylococcusaureus je spolu s CPM meraným štandardom pre surové kravské a ov ie mlieko [9, 10]. Podmienky pre rast stafylokokov na povrchoch výrobných liniek a možnej rekontaminácii produktov aj po ich tepelnom ošetrení sú potenciálnym rizikom ohrozenia udského zdravia [11, 12].

nerez-ov

0

1

2

3

4

5

6

2 5 7 9

prevádzka

log

KTJ

/cm

2

CPM

koli

enterok

stafylok

B.cereus

plesne

Obr. 1. Preh ad po tu vybraných kontaminantov v ov iarskych prevádzkach na nerezových povrchoch výrobných zariadení.

128

plast-ov .

0

1

2

3

4

5

6

2 4 6 7

. odberu vzoriek

log

KTJ

/cm

2CPM

koli

enterok

stafylok

pseudom

plesne

Obr. 2. Preh ad po tu vybraných kontaminantov v ov iarskych prevádzkach na plastových povrchoch výrobných zariadení.

drevo ov .

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4 6

. odberu vzoriek

KTJ

/cm

2 CPMkoliplesne

Obr. 3. Preh ad po tu vybraných kontaminantov v ov iarskych prevádzkach na drevených povrchoch výrobných zariadení. Pozn.: V prevádzkach 4 - 6 bol vyšetrovaný len po et CPM, koliformných baktérií a plesní.

Tabulka I Priemerné po ty MO vo výrobkoch z ov ieho mlieka KTJ/g

koliform.

enterokoky

stafylok.

pseudom.

Bacillus

cereus

plesne

mlie

nebaktérie

ov ie mlieko 1,2.104 2,2. 104 5,7. 105 1,9. 101 2,7. 101 2,8. 102 2,7. 105

erstvý syr 3,0.105 2,9. 105 1,3.107 8,6. 102 1,0 5,1. 103 5,5. 108

zrelý syr 2,8.105 1,3. 104 1,2. 105 2,6. 102 1,0 2,8. 105 3,2. 109

parený syr 7,7. 104 7,9. 104 2,3. 105 6,3. 101 1,0 1,0 1,4. 108

bryndza 6,2. 104 1,3. 105 3,5. 107 1,0 1,0 3,1. 104 3,9. 108

129

Tabulka II Identifikované kmene G- baktérií na povrchoch a vo výrobkoch

Ov iarske prevádzky Literatúra(G v mliek.prevádzkach)

11x Escherichia coli 7x Klebsiella oxytoca Ps. fluorescens [6] 6x Proteus vulgaris Ps.fragi [13] 4x rod Citrobacter Shigella 2x Enterobacter cloacae E. coli 2x Kluyvera ascorbata E. aerogenes

Enterobaktérie (38 kme ov)

4 kmene mimo diagn. škály KlebsiellaIné G kmene rod Pseudomonas Proteus [14]

Tabulka III Identifikované kmene G baktérií na povrchoch a vo výrobkoch

Ov iarske prevádzky Literatúra(G v mliek.prevádzkach)

3x St. hominis2x St. haemolyticus 2x St. aureus L.monocytogenes [13,15,16]1x St. warneri/pasteuri Bacillus sp.

St. auricularis Bacillus cereus [14,17]St. simulans Staphylococcus sp. Kocuria kristinae Staphylococcus aureus

Stafylokoky(15 kme ov)

4 kmene mimo diagn. škály Micrococcus sp. [14] 3x Bacillus cereus

Iné G kmene 6x B.c. var. mycoides

Záver

Z vyšetrovaných G baktérií na povrchoch výrobných zariadení po as výroby boli zaznamenané stafylokoky a enterokoky v množstve 103-104 KTJ/cm2. Bacillus cereus a B. cereus var. mycoides v erstvom ov om mlieku 101 KTJ/ml a vo vyšetrovanom vzduchu. Z G - koliformné baktérie v priemere 102-103 KTJ/cm2, vo výrobkoch – enterokoky 104-105 KTJ/g, stafylokoky 105-107 KTJ/g, celkové koliformné baktérie 104-105 KTJ/g a pseudomonády 101-102 KTJ/g.

Druhy identifikovaných baktérií zodpovedajú druhom mikroorganizmov publikovaných v literatúre, ako potenciálne schopné tvorby biofilmov a následnej odolnosti vo i dezinfek ným prostriedkom.

Použitá literatúra:1. Nariadenie (ES) . 178/2002 Európskeho Parlamentu a Rady z 28. januára 2002, ktorým sa

ustanovujú všeobecné zásady a požiadavky potravinového práva, zria uje Európsky Úrad pre bezpe nos potravín a stanovujú postupy v záležitostiach bezpe nosti potravín

130

2. Nariadenie Európskeho Parlamentu a Rady (ES) . 854/2004 z 29. apríla 2004, ktorým sa ustanovujú osobitné predpisy na organizáciu úradných kontrol produktov živo íšneho pôvodu ur ených na udskú spotrebu

3. Nariadenie komisie (ES) . 2073/2005 z 15. novembra 2005, o mikrobiologických kritériách pre potraviny

4. Ammor, S. - Chevallier, I. - Laguet, A. - Labadie, J. - Talon, R. - Dufour, E.: Investigation of the selective bactericidal effect of several decontaminating solutions on bacterial biofilms including useful, spoilage and/or pathogenic bacteria. Food Microbiology, 21, 2004, s. 11-17.

5. Schönwälder, A. - Kehr, R. - Wulf, A. - Smalla, K.: Wooden boards affecting the survival of bacteria?, Holz als Roh- und Werkstoff, 60, 2002, s. 249-257.

6. Lindsay, D. - Brözel, V.S. - Mostert, J.F. - von Holy, A. 2002. Differencial efficacy of a chlorine dioxide - containing sanitizer against single species and binary biofilms of a dairy - associated Bacillus cereus and a Pseudomonas fluorescens isolate. Journal of Applied Microbiology, 92, 2002, s. 352-361.

7. Andersson,A. - Rönner, U. - Granum, P.E.: What problems does the food industry have with the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens? Int. J. Food Microbiology, 28, 1995, s. 145-155.

8. Kore ová, J. - Valík, . - Liptáková, D. - Petríková, J.: Využitie princípov prediktívnej mikrobiológie pri zvyšovaní bezpe nosti potravín. Zborník z vedeckej konferencie Bezpe nosa kontrola potravín, Nitra, 2006, s. 48 – 52.

9. Nariadenie vlády SR .312/2003 o zdravotných požiadavkách na výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mlie nych výrobkov, as D

10. Nariadenie vlády SR . 284/2004, ktorým sa mení a dop a nariadenie 312/2003 o zdravotných požiadavkách na výrobu a uvádzanie na trh surového mlieka, tepelne ošetreného mlieka a mlie nych výrobkov

11. Kleiss, T. - van Schotorst, M. - Cordier, J.-L. - Untermann, F.: Staphylococci in a whey powder plant environment: an ecological survey as a contribution to HACCP studies. Food Control, 5(3), 1994, s. 196-199.

12. Smith, J.P. - Phillips Daifas, D. - El-Khoury, W. - Koukoutsis, J. - El-Khoury, A.: Shelf Life and Safety Concerns of Bakery Products – A Review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44, 2004, s. 19-55.

13. Norwood, D.E. - Gilmour, A.: The differencial adherence capabilities of two Listeriamonocytogenes strains in monoculture and multispecies biofilms as a function. Letters in Applied Microbiology, 33, 2001, s. 320-324.

14. Sharma, M. - Anand, S.K.: Characterization of constitutive microflora of biofilms in dairy processing lines. Food Microbiology, 19, 2002, s. 627-636.

15. Borucki, M.K. - Peppin, J.D. - White, D. - Loge, F. - Call, D.R.: Variation in biofilm formation among strains of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology, 69, 2003, s. 7336-7342.

16. Zhao, T. - Doyle, M.P. - Zhao, P.: Control of Listeria monocytogenes in a biofilm by competetive – exlusion mocroorganisms. Applied and Environmental Microbiology, 70, 2004, s. 3996-4003.

17. Oosthuizen, M.C. – Steyn, B. – Lindsay, D. – Brözel, V.S. – von Holly, A.: Novel method for the proteomic investigation of a dairy – associated Bacillus cereus biofilm. FEMS Microbiology Letters, 194(1), 2001, s. 47-51.

Kontaktná adresa:Ing. Mária Kostolníková, Výskumný ústav potravinársky, Kostolná 7, 900 01 Modra, Slovenská republika, e-mail: [email protected]

131

SLEDOVÁNÍ ZM N KYSELOSTI MLÉKA B HEM VÝROBY KOZÍCH SÝRKou imská Lenka, Ková ová Eva, Dragounová Hedvika, Babi ka Luboš

Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, ZU v Praze

Monitoring of milk acidity changes during goat cheesemaking

Summary:Goat milk acidity was monitored in different stages of lactation during the processing. Titratable acidity of samples was determined by Soxhlet-Henkel method. Goat cheese products were frozen and transported to the laboratory where their acidity was determined too. The average titratable acidity of milk after milking was 6.55 SH. Its maximum value (7.88 SH) was in the 198th day of lactation, which corresponds with feed portion change that time. Higher acidity of milk influenced cheesemaking: the milk coagulation time was shorter and the acidity of final products was higher. The obtained data show that the acidity of milk reasonably affects the quality of cheese.

ÚvodA koliv výroba kozího mléka p edstavuje pouze 2 % celkové sv tové produkce1, hraje

kozí mléko d ležitou roli ve výživ lov ka2. P edpokladem výroby kvalitních mlé ných produktje vysoká kvalita mléka. Tato vstupní surovina musí vyhovovat organoleptickým, nutri ním, fyzikáln -chemickým a mikrobiálním jakostním požadavk m3. Kyselost mléka pat í k d ležitým parametr m mléka, které jsou posuzovány p i jeho zpracování na mlé né výrobky. Zm ny kyselosti mléka ovliv ují významn nejen jeho chu , v ni a konzistenci, ale též jeho technologické vlast-nosti. P edložená práce sleduje zm ny kozího mléka b hem výroby sýr a vliv kyselosti mléka na kyselost finálních výrobk .

Materiál a metodyVzorky mléka byly získány na soukromé kozí farm na Hané, která je od roku 1992 leny

PRO-BIO a hospoda í ekologicky. Na farm bylo chováno 30 koz plemene koza bílá krátkosrstá, které pat í u nás k nejrozší en jším. Dojivost na této farm se pohybuje v pr m ru kolem 1000 kg mléka za laktaci. Za átek laktace u sledovaných koz byl v druhé polovin února. Kozám bylo p edkládáno mechanicky upravené krmivo, p i emž rozhodujícím krmivem v letním období byla zelená píce. Základ krmné dávky v zimním období tvo ilo p evážn seno. P echod na toto krmivo prob hl v první polovin m síce zá í.

Dojení bylo provád no dvakrát denn strojov do konví. Po nadojení bylo mléko zchla-zeno b hem dvou hodin pod 6 °C do následujícího dne. Syrové kozí mléko ur ené k výrob sýrse tepeln ošet ovalo šetrnou pasterací p i 72 – 72 °C po dobu 30 sekund.

Odb r vzork byl proveden v šesti sériích mezi 68. a 231. dnem laktace. Pokaždé byla prom ena titra ní kyselost vzork mléka ve ty ech fázích technologie: okamžit po nadojení, po zchlazení, po pasteraci a p ed p idáním sy idla. Zárove byla zm ena titra ní kyselost vyrobených sýr a odd lené syrovátky. Stanovení titra ní kyselosti mléka a syrovátky bylo provád no podle SN 57 05304, titra ní kyselost sýr pak dle SN 57 01075.

Výsledky a diskuseZjišt né hodnoty titra ní kyselosti kozího mléka a erstvých sýr jsou uvedeny v tabulce I.

Pr m rná titra ní kyselost syrového kozího mléka okamžit po nadojení byla 6,55 SH, p i emž minimální nam ená hodnota byla 5,91 SH (v 98. dni laktace), maximální pak 7,88 SH ke konci lakta ního období (198. den laktace). Zvýšení titra ní kyselosti mléka koresponduje s p echodemna zimní krmivo. Stanovené hodnoty titra ní kyselosti kozího mléka jsou v souladu s literaturou6,7,8,9.

132

Tabulka I Titra ní kyselost kozího mléka a erstvých sýr .

Titra ní kyselost [SH] Pr m r Rozptylvýb ru

Sm.odch. výb ru Min. Max.

mléka po nadojení 6,55 0,604 0,777 5,91 7,88 mléka po zchlazení 6,45 0,558 0,747 5,91 7,74 mléka po pasteraci 6,20 0,674 0,821 5,51 7,62 mléka p ed sý ením 6,73 0,533 0,730 6,11 7,98 erstvých sýr 86,60 5,082 2,254 83,73 89,64

syrovátky 4,91 0,079 0,281 5,33 5,33

Na obrázku 1 jsou znázorn ny zm ny pr m rné titra ní kyselosti mléka b hem zpracování, spolu se hodnotami titra ní kyselosti vyrobeného sýra a syrovátky. Kyselost erstvého kozího mléka po zchlazení lehce poklesla, což m že být zp sobeno snížením obsahu CO2 v mléce10.Kyselost mléka se po pasteraci ješt snížila, což je v souladu s literaturou11. P ídavek zákysové kultury a innost mikroorganism titra ní kyselost mléka p ed sý ením zvýšily.

Pr m rná titra ní kyselost kozího mléka

6,55 6,45 6,20 6,73

86,60

4,91

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

Mléko ponadojení

Mléko pozchlazení

Mléko popasteraci

Mléko p edsý ením

Sýr Syrovátka

Titr

aní

kys

elos

t [SH

]

Obr. 1. Pr m rná titra ní kyselost kozího mléka, sýra a syrovátky b hem technologického zpracování.

V tabulce II jsou uvedeny korela ní koeficienty závislosti titra ní kyselosti kozího mléka b hem zpracování na titra ní kyselosti výsledného produktu. Získané hodnoty ukazují na velmi t sný vztah mezi kyselostí mléka a výsledného produktu.

Tabulka II Korela ní koeficienty závislosti titra ní kyselosti kozího mléka a vyrobeného sýra. Titra ní kyselost mléka Korela ní koeficient mezi kyselostí

mléka a sýra po nadojení 0,854 po zchlazení 0,850 po pasteraci 0,888 p ed sý ením 0,900

Krom korela ních koeficient byl pomocí regresní analýzy zkoumán pr b h závislosti mezi kyselostí mléka p ed sý ením a kyselostí sýra (hodnota korela ního koeficientu zde byla nejvyšší). Koeficient lineární regresní p ímky R2 byl 0,8101, z ehož vyplývá, že se zvyšující kyselostí mléka ve sledovaném rozsahu stoupá kyselost vyrobeného sýra a tato závislost m že být lineárn aproximována.

133

Záv rZm ny složení krmiva ovliv ují hodnotu titra ní kyselosti nadojeného kozího mléka.

M ení zm n titra ní kyselosti kozího mléka b hem výroby sýra ukázalo, že titra ní kyselost významn ovliv uje kvalitu finálního produktu. Sledováním zm n kyselosti mléka si m že zpracovatel ov it kvalitu vstupní suroviny, jakož i správný pr b h technologie výroby.

Použitá literatura:1. Haenlein, G. F. W. Relationship of somatic cell counts in goat milk to mastitis and productivity.

Small Rumin. Res. 2002, No. 45, s. 163 – 178. 2. Haenlein, G. F. W. Goat milk in human nutrition. Small Rumin. Res. 2004, No. 51, s. 155–163. 3. Raynal-Ljutovac, K., Gaborit, P., Lauret, A. The relationship between quality criteria of goat

milk, its technological properties and the quality of the final products. Small Rumin. Res. 2005, No. 60, s. 167 – 177.

4. SN 57 0530 Metody zkoušení mléka a tekutých mlé ných výrobk . Praha: eskýnormaliza ní institut. 1972. 100 s.

5. SN 57 0107 Metody zkoušení sýr , tvaroh , krém a pomazánek. Praha: eský normaliza níinstitut. 1965. 28 s.

6. Aganga, A. A., Amarteifio, J. O., Nkile, N. Effect of Stage of Lactation on Nutrient Composition of Tswana Sheep and Goat’s Milk. J. Food Comp. Anal. 2002, No. 11, s. 533–543.

7. Franco, I., Prieto, B., Bernardo, A., Prieto, J. G., Carballo, J. Biochemical changes throughout the ripening of a traditional Spanish goat cheese variety (Babia-Laciana). 2003, No. 13, s. 221-230.

8. Mehaia, A. M., Saad, M. E. Physiochemical characteristics and rennet coagulation time of ultrafiltered goat milk. Food Chemistry. 1998, vol. 62, No. 3, s. 257–263.

9. Torii, M. S., Damasceno, J. C., Riberio, L. R., Sakaguti, E. S., Santos, G. T., Matsushita, M., Fukumoto, N. M. Physical-Chemical Characteristics and Fatty Acids Composition in Dairy Goat Milk in Response to Roughage Diet. Braz. Arch. Biol. Technol. 2004, vol. 47, No. 6, s. 903–909.

10. Gajd šek, S., Mléka ství II. 1. vyd. Brno: Mendelova zem d lská a lesnická universita. 1998. 135 s. ISBN 80-7157-342-6.

11. Forman, L. a kol. Mlékárenská technologie. 2. vyd. Praha: VŠCHT Praha. 1996. ISBN 80-7080-250-2.

Kontaktní adresa:Dr. Ing. Lenka Kou imská, Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, ZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, e-mail: [email protected].

134

VLIV PO ADÍ LAKTACE NA CHEMICKÉ SLOŽENÍ OV ÍHO MLÉKA Novotná Lenka, Kuchtík Jan, Zajícová Pavlína

Ústav chovu a šlecht ní zví at, MZLU v Brn

Influence of parity on the chemical composition of sheep milk

Summary:The aim of the study was determined the influence of parity on ewe’s milk composition. The evaluation was performed on base of analyses of milk sampled from 22 sheep (Lacaune x East Friesian x Improved Walachian) with 11 ewes each in parities 1, 2. The sampling was carried five times during whole lactation (on 65th (1st sampling), 99th (2nd sampling), 139th (3rd sampling), 167th (4th sampling) and 202nd day of lactation (5th sampling). The analysis involved a total of 110 milk samples. Milk was analysed by standard methods for total solids TS (%), fat F (%) solids-non-fat SNF (%), protein P (%), casein C (%) and lactose L contents. Recorded data were statistically analyzed by program UNISTAT 5.1. Milk of first parity contained on average 19,98 % TS, 7,76 % F, 12,22 % SNF, 6,54 % P, 5,16 % C and 4,49 % L. Milk of second parity contained on average 18,74 % TS, 7,06 % F, 11,68 % SNF, 6,18 % P, 4,71 % C and 4,49 % L. The parity had only significant effect (P 0,05) on SNF content for the whole lactation. The parity had significant effect (P 0,05) in the1st sampling on C, in the 2nd sampling on C and SNF, in the 3rd sampling on TS, in the 4th sampling on F, SNF, P, C. The parity had highly significant effect (P 0,01) in the 4th sampling on TS and in the 5th

sampling on all chosen parameters under study.

ÚvodV R jsou stavy dojných ovcí v pom ru k ostatním užitkovým kombinacím na nízké

úrovni, p esto je však produkce ov ího mléka a výroba ov ích sýr perspektivní (4). Ov í mléko je vodnatá, bílá nebo lehce nažloutlá tekutina s mírn natrpklou chutí. Složením se ov í mléko zna nliší od mléka kravského. Obsahuje pr m rn 5,5 % bílkovin, 7 % tuku, 5 % cukru a 0,9 % popelovin (18). Ov í mléko se u nás k p ímému konzumu nepoužívá (19), p i emž na rozdíl od kravského a kozího mléka je toto mléko využíváno tém výhradn k výrob sýr ,když základním je sýr hrudkový. Na výrobu 1 kg hrudkového sýra je t eba p ibližn 3 - 5 kg mléka. Z hrudkového sýra se dále vyrábí brynza, parenica, ošt pky, roquefort a camembert (10). P i výrobsýr hraje d ležitou roli chemické složení mléka a variabilita obsahu jednotlivých složek (15). Složení a kvalita ov ího mléka je ovliv ována celou adou faktor , p i emž mezi nejvýznamn jšípat í: plemenná p íslušnost, fáze a po adí laktace, etnost vrhu, klimatické podmínky, výživa, zdravotní stav a management (1, 3, 12, 13, 15, 16). Cílem našeho sledování se stalo zhodnocení vlivu po adí laktace na složení ov ího mléka a to u bahnic k íženek plemen Lacaune (L), Východofrízská ovce (VF) a Zušlecht ná valaška (ZV). Podobnou studii, nicmén u jiných plemen realizovali taktéž Casoli et al. (5), Gonzalo et al. (11), apistrák et al. (6) a Sevi et al. (17).

Materiál a metodika K laboratorním analýzám byly použity vzorky ov ího mléka z ekologické farmy

ve Valašské Byst ici. Do pokusu bylo za azeno 22 kus bahnic k íženek L 50 VF 37,5 ZV z toho 11 bahnic bylo na 1. laktaci a dalších 11 na 2. laktaci. Všechny sledované bahnice byly chovány v identických podmínkách a po celou dobu sledování byly v dobrém zdravotním a výživném stavu. Jejich krmná dávka v pr b hu celého sledování byla založena na ad libitní celodenní pastvna trvalém travním porostu. Dopln k krmné dávky tvo ily pšeni né otruby, jejichž pr m rná spot eba na kus a den inila 50 g a minerální liz (ad libitum). Bahn ní u sledovaných ovcí probíhalo koncem m síce února, následn byl provád n tradi ní odchov jeh at pod matkami. Odstav jeh atbyl realizován v pr m rném 60. dni laktace (konec m síce dubna). Následn se zapo alo s dojením, které bylo ukon eno na po átku m síce íjna. Odb ry vzork byly realizovány v pravidelných intervalech p tkrát v pr b hu celé laktace a to v pr m rném 65. dni (první odb r), 99. dni (druhý odb r), 139. dni (t etí odb r), 167. dni ( tvrtý odb r) a 202 dni (pátý odb r). Dojení ovcí bylo provád no strojn , p i emž vzorky mléka na laboratorní analýzy byly odebírány z ranního dojení a ihned po odb ru vychlazeny na teplotu 5-8 °C a poté, v termoboxu, p evezeny do rozborových laborato i na MZLU v Brn . V rámci laboratorních analýz byly zjiš ovány obsahy následujících

135

mlé ných složek: sušina (S), tuk (T), tukuprostá sušina (TPS) bílkoviny (B), kasein (Kas) a laktóza (L). Celkov bylo vyhodnoceno 110 vzork . Obsah S (%) byl stanovován vážkovou metodou p i teplot 102 2°C dle SN ISO 6731 (9). Obsah T (%) byl stanovován acidobutyrometrickou metodou dle Gerbera (8). Obsah TPS byl zjišt n výpo tem, když obsah tuku byl ode ten od obsahu sušiny. Obsahy B a Kas (%) byly stanoveny na p ístroji PRO – MILK (Danish Co. Foss Electric) (7). Obsah L (%) byl stanovován polarimetricky (7). Statistické zpracování bylo realizováno s využitím statistického programu UNISTAT 5.1. K ur ení diferencí mezi jednotlivými skupinami bylo využito Mann-Whitneyova U testu.

Výsledky a diskuse Zhodnocení vlivu po adí laktace na vybrané složky ov ího mléka je uvedeno v tabulce I.

Z této tabulky je sice patrné, že hodnoty obsahu všech sledovaných složek mléka za celou laktaci byly mírn vyšší u mléka bahnic na 1. laktaci, s výjimkou obsahu L, kdy bylo dosaženo shodného obsahu (4,49 %), nicmén pr kazný rozdíl (P 0,05) byl zjišt n pouze mezi obsahy TPS. Také Ploumi et al. (14) zaznamenali nižší hodnoty TPS a T u mléka bahnic na 2. laktaci než na 1. laktaci a tém shodný obsah L u obou skupin. Naproti tomu zjistili mírn vyšší obsah B u bahnic na 2. laktaci. Dále ve své práci výše uvedení potvrzují vliv po adí laktace na produkci mléka. Také

apistrák et al. (6) zaznamenali vliv po adí laktace na obsahy TPS, B a L. Naproti tomu Bencini (2) a Sevi et al. (17) uvádí, že se zvyšujícím se po adím laktace se zvyšují obsahy T a B v mléce a snižuje obsah L. Z tabulky I. dále vyplývá, že v rámci jednotlivých odb r , s výjimkou prvního odb ru, byly obsahy S, T, TPS, B a Kas vždy vyšší u bahnic na 1. laktaci. Také obsah L byl ve všech odb rech mírn vyšší u bahnic na 1. laktaci, nicmén p i 5. odb ru byl zjišt n výraznvyšší obsah této složky u bahnic na druhé laktaci (4,39 % vs. 3,94). Co se týká pr kazného vlivu po adí laktace na obsahy vybraných složek mléka v jednotlivých fázích laktace, tak v 1. odb ru byl zjišt n pr kazný rozdíl (P 0,05) mezi bahnicemi na 1. a na 2. laktaci pouze v obsahu Kas. Ve 2. odb ru byly prokázány pr kazné rozdíly (P 0,05) v hodnotách Kas a TPS. Ve 3. odb ru byl zaznamenán pr kazný vliv (P 0,05) po adí laktace pouze na obsah S. Ve 4. odb ru byly zjišt nypr kazné rozdíly (P 0,05) mezi bahnicemi na 1. a na 2. laktaci v obsahu T, TPS, B, Kas, když vysoce pr kazný rozdíl (P 0,01) mezi bahnicemi na obou laktacích byl zjišt n v obsazích sušiny. V 5. odb ru byl zjišt n vysoce pr kazný vliv (P 0,01) po adí laktace na obsahy všech sledovaných chemických složek. Dynamika zm n všech sledovaných složek v pr b hu laktace probíhala u obou po adí laktace ve stejném trendu. Obsahy S (obr. 1), T (obr. 2), TPS (obr. 3), B (obr. 4) a Kas (obr.5) se m nily následovn : nejd íve došlo k nár stu jejich hodnot, poté nastal jejich pokles, který byl ovlivn n vzr stající se dojivostí (139 den laktace), nicmén posléze následovalo pom rn razantní zvyšování jejich obsah a to až do konce laktace. Naproti tomu obsah L (obr. 6) se m nil v opa ném trendu. Výše uvedené odpovídá trend m jež uvád jí Bencini (2), Ploumi et al. (14) a Sevi et al. (17).

Záv rHodnoty obsahu všech sledovaných složek mléka za celou laktaci byly mírn vyšší

u mléka bahnic na 1. laktaci, s výjimkou L, u které byly zjišt ny shodné obsahy. Nicménstatisticky pr kazný rozdíl (P 0,05) byl zjišt n pouze mezi obsahy TPS. Z našeho sledování dále vyplývá, že se zvyšujícím se dnem laktace se taktéž zvyšuje i po et ukazatel u nichž jsou zjiš ovány statistické diference z pohledu faktoru po adí laktace.

Pod kování:Sledování bylo realizováno s podporou MSM 432100001.

136

Tabulka I Vlivu po adí laktace na vybrané složky ov ího mléka.

Bahnice na 1. laktaci Bahnice na 2. laktaci Pr kaznostUkazatel Obdobílaktace x sx x sx1. odb r 17,43 1,73 18,17 1,42 2. odb r 19,40 1,37 18,76 0,71 3. odb r 18,21 1,55 17,03 1,04 *

4. odb r 19,25 0,90 18,02 0,98 **

5. odb r 25,61 1,75 21,71 1,88 **

Sušina(%)

celá laktace 19,98 3,26 18,74 2,01 1. odb r 6,53 1,08 7,12 1,13 2. odb r 7,38 1,10 7,13 0,54 3. odb r 6,50 1,01 5,80 0,73 4. odb r 7,21 0,75 6,42 0,76 *

5. odb r 11,19 1,07 8,84 1,15 **

Tuk(%)

celá laktace 7,76 2,01 7,06 1,34 1. odb r 10,90 0,72 11,05 0,61 2. odb r 12,03 0,41 11,64 0,27 *

3. odb r 11,71 0,66 11,23 0,46 4. odb r 12,04 0,33 11,60 0,35 *

5. odb r 14,42 0,76 12,87 0,81 **

Tukuprostásušina

(%)

celá laktace 12,22 1,32 11,68 0,82 *

1. odb r 5,31 0,61 5,70 0,51 2. odb r 6,29 0,39 6,12 0,41 3. odb r 6,07 0,52 5,70 0,37 4. odb r 6,37 0,39 5,97 0,34 *

5. odb r 8,65 0,81 7,39 0,68 **

Bílkoviny(%)

celá laktace 6,54 1,26 6,18 0,78 1. odb r 3,66 0,56 4,03 0,52 *

2. odb r 4,69 0,43 4,50 0,29 *

3. odb r 4,71 0,61 4,21 0,40 4. odb r 5,17 0,49 4,63 0,54 5. odb r 7,55 0,82 6,18 0,81 **

Kasein(%)

celá laktace 5,16 1,43 4,71 0,93 1. odb r 4,57 0,24 4,36 0,30 2. odb r 4,62 0,26 4,50 0,15 3. odb r 4,69 0,18 4,63 0,31 4. odb r 4,63 0,19 4,58 0,21 5. odb r 3,94 0,28 4,39 0,21 **

Laktóza(%)

celá laktace 4,49 0,36 4,49 0,26 * = (P 0,05); ** = (P 0,01)

137

16

18

20

22

24

26

1. odb. 2. odb. 3. odb. 4. odb. 5. odb.

obsa

h S

(%)

1. laktace 2. laktace

Obr. 1. Zm ny obsahu sušiny v pr b hulaktace

5

7

9

11

13


obsa

h T

(%)


Obr. 2. Zm ny obsahu tuku v pr b hu laktace

10

11

12

13

14

15


obsa

h T

PS (%

)


Obr. 3. Zm ny obsahu tukuprosté sušiny v pr b hu laktace

5

7

9


obsa

h B

(%)


Obr. 4. Zm ny obsahu bílkoviny v pr b hulaktace

3

5

7


obsa

h K

as (%

)


Obr. 5. Zm ny obsahu kaseinu v pr b hulaktace

3

4

5


obsa

h L

(%)


Obr. 6. Zm ny obsahu laktózy v pr b hulaktace

Použitá literatura:1. ANTUNOVIC, Z., et al. Changes in ewe milk composition depending on lactation stage and

feeding season. Czech Journal of Animal Science. 2001, 47, s. 80-84. 2. BENCINI, R. Factors Affecting the Quality of Ewe’s Milk. In THOMAS, D. L. and PORTER,

S. (ed.) Proceedings of the 7th Great Lakes Dairy Sheep Symposium. Eau Claire, Wisconsin: [s.n.], 2001: 52-84.

3. BENCINI, R., PULINA, G. The quality of sheep milk: A review Australian Journal of Experimental agriculture.1997, 37, s. 485-504.

4. BUCEK, P., et al. Ro enka chovu ovcí a koz v eské republice za rok 2005. [s.l.] : [s.n.], 2006. 89 s. ISBN 80-239-7482-3.

138

5. CASOLI, C., et al. Quantitative and compositional variations of Massese sheep milk parity and stage of lactation. Small Ruminant Research. 1989, 2, s. 47-62.

6. APISTRAK, A., et al. Produkci a zloženie mlieka oviec plemena zošlecht ná valaška po as dojnej periódy. Živo išná výroba. 1995, 40, s. 187-190.

7. SN 57 0530. Metody zkoušení mléka a tekutých mlé ných výrobk . Vydavatelství ÚNM (Ú ad pro normalizaci a m ení), Praha, 1974. 108 s.

8. SN ISO 2446. Mléko - Stanovení obsahu tuku (Rutinní metoda). eský normaliza ní institut, Praha, 2001. 16 s.

9. SN ISO 6731. Mléko, smetana a zahušt né neslazené mléko - Stanovení obsahu celkové sušiny. eský normaliza ní institut, Praha, 1998. 5 s.

10. DRAGOUNOVÁ, H., HEJTMÁNKOVÁ, A. Zm ny základních ukazatel kvality ov ího mléka v pr b hu laktace. In ŠT TINA, J., URDA, L. Mléko a sýry. Praha : VŠCHT Praha, 2006. s. 120-123.

11. GONZALO, C., et al. Factors influencing variation of test day milk yield, somatic cells count, fat and protein in diary sheep. Journal of Dairy Science. 1994, 77, s. 537-1542.

12. FUERTES, J., et al. Parameters of test day milk yield and milk components for dairy ewes.Journal of Dairy Science. 1998, 81, s. 1300–1307.

13. PAVI , V., et al. Influence of stage of lactation on the chemical composition and physical properties of sheep milk. Czech Journal of Animal Science. 2002, 47, s. 80-84.

14. PLOUMI, K., et al. Some factor affecting daily milk yield and composition in a flock of Chios ewes. Small Ruminant Research. 1998, 28, s. 89-92.

15. PUGLIESE, C., et al. Evolution of chemical composition, somatic cell count and renneting properties of the milk of Massese ewes. Small Ruminant Research. 2000, 35, s. 71-80.

16. SAHAN, N., et al. Changes in chemical and mineral content of Awassi ewe’s milk during lactation. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 2005, 29, s. 589-593.

17. SEVI, A., et al. Effect of parity on milk yield, composition, somatic cell count and renneting parameters and bacteria count of Comisana ewes. Small Ruminant Research. 2000, 37, s. 99-107.

18. ŠTOLC, L., NOHEJLOVÁ, L. Mlé ná užitkovost ovcí. In Den mléka 2003. Praha : ZU Praha, 2003. s. 79-81.

19. ŠTOLCOVÁ, J., et al.Ov í mléko v podmínkách eské Republiky. In Den mléka 2006. Praha : ZU Praha, 2006. s. 168-170.

Kontaktní adresa:Ing. Lenka Novotná, MZLU v Brn , ÚCHŠZ, Zem d lská 1, 613 00 Brno,email: [email protected] tel.: 5 45 13 32 39

139

OBSAH A SLOŽENÍ SYROVÁTKOVÝCH BÍLKOVIN KOZÍHO A OV ÍHO MLÉKA Jansová Blanka1, Hejtmánková Alena1, Dragounová Hedvika2

1Katedra chemie, 2Katedra kvality zem d lských produkt ,Fakulta agrobiologie, potravinových a p írodních zdroj , ZU v Praze

Content and constituion of goat and sheep whey proteins

Summary:Depending on the lactation stage, the overall whey proteins were undergoing the alterations in their content. However, these alterations were not substantial and only small oscillations from the average values (0,450 g.100g-1) were noticed. It appears nonetheless from the results that the higher contents of whey proteins were noticed on the beginning of the lactation, playing a role in the immunisation process of the sucklings, and in the final stage of the lactation, probably in the connection with the increase of the overall protein. By 72°C heating for 10 minutes, the denaturation in the goat milk touched 36 % of the whey proteins, whereas only 33 % in the sheep´s milk and 30 % in the cow milk. The average percentage of the whey proteins in the overall proteins of the sheep´s milk is 17,51 %, which is approximately equivalent to the composition of the goat milk. The amino acid composition of proteins and whey proteins of sheep’s and goat milk was determinate.

ÚvodSyrovátkové bílkoviny jsou p irozenou sou ástí mléka. P i výrob sýr , tvaroh a kaseinu

se nesráží a odchází v podob syrovátky. Hlavními komponenty syrovátkových bílkovin jsou -laktoglobulin ( -LG), -laktalbumin ( -LA), sérový albumin, imunoglobuliny a proteoso –

peptonová frakce. Význam syrovátkových bílkovin spo ívá v jejich vysoké nutri ní hodnot , která je vyšší než u kaseinu. Celkový obsah bílkovin (N – látek) v syrovátce kolísá od 14 do 24 % (Forman, 1959). Bílkoviny obsažené v syrovátce p edstavují jeden z nejhodnotn jších b žndostupných bílkovinných materiál . Je to p i ítáno vhodnému složení jejich aminokyselin.

S rostoucí výrobou sýr a tvaroh , roste i výroba syrovátky. Její ekonomicky efektivní využití je stále problém, a proto se neustále hledají nové technologie pro její zpracování a nová uplatn ní v nejr zn jších odv tvích.

Sienkiewicz a Riedel (1990) uvád jí, že syrovátka obsahuje 50 % všech složek mléka. Díky nízké koncentraci t chto složek (sušinu syrovátky tvo í asi 6,4 – 7 %) nebyla syrovátka dlouho považována za vedlejší produkt, ale produkt odpadní a byla p evážn zkrmována hospodá skými zví aty. Veselá (2003) uvádí, že v roce 1970 se v EU využilo pro lidskou výživu jen 5 % vyrobené syrovátky, zatímco ke krmným ú el m 95 %. V roce 2000 byl již tento pom r50 : 50. P edpokládá se, že využití syrovátky k lidské výživ stále poroste.

Syrovátku zpracovává i farmaceutický pr mysl. Je p idávána do ple ových mlék, vod a krém . P i vn jším použití skv le vyhlazuje pokožku. Reguluje její pH a stabilizuje kyselou reakci povrchu t la.

Syrovátka má mnoho pozitivních ú ink na lidský organismus. Auto i se shodují, že nap . p sobí detoxika n a podporuje innost ledvin, p ízniv upravuje metabolismus, kladnovliv uje innost st ev a obnovuje st evní mikroflóru a dodává t lu pot ebné vitamíny a minerály.

Malá (2002) uvádí, že u syrovátkových bílkovin byl zjišt n podíl 21 % z celkového proteinu u koz plemene murcinano-granadina. -laktoglobulin tvo í 11,4 % (5,8 g.l-1) z celkových bílkovin. Sražený -laktoglobulin se váže do pevné vazby s bílkovinami kaseinu. -laktalbumin je p ítomen v obsahu 3,4 % (1,5 g.l-1) a je nezbytný pro biosyntézu laktózy. Zbývající syrovátkové proteiny jsou obsaženy ze 3,4 % (1,4 g.l-1), jsou tvo eny p edevším imunoglobuliny. Velmi malý podíl syrovátkových bílkovin tvo í proteoso – peptony, jejichž obsah v kozím mléce nebyl ještzjiš ován.

140

MetodyV letech 2003-2005 bylo analyzováno kozí mléko a syrovátka v pr b hu lakta ního

období. V roce 2005 bylo také analyzováno ov í mléko a syrovátka. Pro analýzu syrovátkových bílkovin byly použity vzorky kozího mléka a syrovátky ze dvou soukromých ekofarem zam ujících se na chov koz plemene bílá krátkosrstá a vzorky ov ího mléka a syrovátky z farmy zam ující se na chov ovcí plemene východofríského. Pro stanovení syrovátkových bílkovin byla použita metoda vylu ovací vysokoú innékapalinové chromatografie. Metoda vychází z normy ISO/DIS 11814. Sou asn byly stanoveny celkové bílkoviny na p ístroji Milco-Scan 133 B. Analýzy byly provád ny ve dvou paralelních opakováních. V tabulkách jsou uvedeny pr m rné hodnoty.

Výsledky byly zpracovány statisticky v po íta ovém programu Excel metodou Anova, dvoufaktorovou analýzou rozptylu s opakováním.

Dále byl sledován stupe denaturace syrovátkových bílkovin v kozím mléce a porovnání tepelné stability syrovátkových bílkovin kozího mléka s tepelnou stabilitou syrovátkových bílkovin mléka kravského a ov ího. Mléko kozí, kravské a ov í bylo zah íváno p i teplot 65 °C po dobu 10, 20 a 30 minut a p i 72 °C po dobu 10 minut.

Sou asn bylo sledováno aminokyselinové složení syrovátkových bílkovin kozího a ov ího mléka. Stanovení bylo provedeno metodou HPLC po kyselé hydrolýze.

Výsledky a diskuseZa syrovátkové bílkoviny byly považovány látky eluující se v ase v rozmezí 8,5 –

12 minut. Z kolony byly vymývány první pravd podobn imunoglobuliny ( as 8,7 minut), sérum albumin (9,5 minut), -laktoglobulin (10,5 minut) a -laktalbumin (11,3 minut). Píky s vyššími elu ními asy nelze považovat za syrovátkové bílkoviny. M že se jednat nap íklad o látky peptidické povahy, mohou se zde objevovat i jiné ve vod rozpustné a v UV oblasti absorbující složky mléka.

Bylo stanoveno celkové množství syrovátkových bílkovin, -laktoglobulinu a souhrnné množství -laktoglobulinu a -laktalbuminu. Rozdíl mezi celkovým množstvím syrovátkových bílkovin a množstvím -LG a -LA p ipadá na imunoglobuliny, sérum albumin a proteoso-peptonovou frakci.

Pr m rné zastoupení syrovátkových bílkovin v proteinech kozího mléka bylo 15,7 % a bylo nižší než v mléce kravském (cca 20 %) (Velíšek, 2002). Souhrnné množství -LA a -LGv syrovátkových bílkovinách kozího mléka bylo na obou farmách pom rn vyrovnané a pohybovalo se v rozmezí 87-90 %. Pom r zastoupení -LA a -LG se b hem laktace m nil (množství -LG se pohybovalo od 19,7 do 66 %). Ve v tšin p ípad p evažovalo množství -LAnad -LG.

Hodnoty celkových syrovátkových bílkovin nam ené v kozí syrovátce byly v pr m ruo 24,03 % nižší než v mléce. Hodnoty syrovátkových bílkovin v kozí syrovátce se pohybovaly v rozmezí od 0,015 do 0,446 g.100g-1.

Ve srovnání s mlékem kozím (2,81 g.100g-1), bylo v ov ím mléce zjišt no více než dvojnásobné množství celkového proteinu (6,356 g. 100g-1). Zatímco v pr b hu laktace celkové bílkoviny kozího mléka byly zhruba na stejné hodnot a pouze ke konci laktace došlo k jejich mírnému nár stu, bílkoviny v ov ím mléce se postupn zvyšovaly a ke konci laktace byl zaznamenán výrazn jší nár st jejich hodnot.

Pr m rná hodnota syrovátkových bílkovin v ov ím mléce byla 1,113 g.100g-1. V ov ísyrovátce byly nam eny hladiny syrovátkových bílkovin v pr m ru o 17,77 % nižší než v mléce.

Pr m rné zastoupení syrovátkových bílkovin v celkových proteinech ov ího mléka je 17,51 %, což zhruba odpovídá složení mléka kozího.

Nejcitliv jší na tepelné namáhání byly syrovátkové bílkoviny kozího mléka. P i nejvyšším záh evu (72 °C po dobu 10 minut) došlo k denaturaci 36 % syrovátkových bílkovin. V ov ím mléce to bylo 33 % a v kravském 30 % syrovátkových bílkovin.

141

Bylo také stanoveno aminokyselinové složení hrubých i syrovátkových bílkovin kozího a ov ího mléka, které ukazuje tabulka V (s výjimkou tryptofanu, který se po kyselé hydrolýze rozkládá a je tímto zp sobem nestanovitelný). V syrovátkových bílkovinách kozího mléka oproti hrubým výrazn ji stouplo zastoupení glycinu a alaninu a kleslo zastoupení glutamové kyseliny a methioninu. V ov ích syrovátkových bílkovinách výrazn ji stoupl alanin a kyselina asparagová a klesl methionin, prolin a kyseliny glutamová.

Denaturace SB

00,20,40,60,8

11,21,41,6

syrové 65°C/10min

65°C/20min

65°C/30min

72°C/10min

teplota a doba záh evu

g.10

0g-1 SUMA-kravské

SUMA-kozí

SUMA-ov í

Obr. 1 Denaturace syrovátkových bílkovin kozího, ov ího a kravského mléka

Tabulka IHodnoty syrovátkových bílkovin v ov ím mléce v g.100g-1, farma C, 2005 farma C SUMA -LA+ -LG -LGdatum odb ru mléko syrovátka mléko syrovátka mléko syrovátka 10.6. 0,894 0,820 0,817 0,784 0,508 0,496 27.7. 0,749 0,730 0,715 0,702 0,489 0,451 23.8. 1,015 0,959 0,980 0,836 0,637 0,238 20.9. 1,117 0,628 1,100 0,520 0,457 0,341 25.10. 1,791 1,440 1,440 1,244 1,306 1,184 pr m r 1,113 0,915 1,010 0,817 0,576 0,645

Tabulka IIZastoupení syrovátkových bílkovin v proteinech ov ího mléka, farma C, 2005

datum odb ru celkový protein(g.100g-1) SUMA(g.100g-1) SUMA/celk.protein(%) 10.6. 4,78 0,894 18,7 27.7. 4,81 0,749 15,57 23.8. 5,6 1,015 18,13 20.9. 7,98 1,117 14

25.10. 8,61 1,791 20,8 pr m r 6,36 1,113 17,51

142

Tabulka III Hodnoty syrovátkových bílkovin v kozím mléce g.100g-1 – farma A, 2005 Farma A 2005 SUMA -LA+ -LG -LGdatum odb ru mléko syrovátka mléko syrovátka mléko syrovátka 14.3. 0,472 0,433 0,409 0,332 0,142 0,105 18.4. 0,493 0,478 0,434 0,419 0,143 0,095 13.5. 0,513 0,447 0,437 0,395 0,143 0,096 27.6. 0,424 0,361 0,396 0,350 0,098 0,086 8.8. 0,382 0,308 0,331 0,279 0,103 0,065 26.9. 0,667 0,221 0,572 0,198 0,221 0,057 17.10. - 0,465 - 0,398 - 0,142 pr m r 0,492 0,388 0,430 0,339 0,142 0,092

Tabulka IVZastoupení syrovátkových bílkovin v proteinech kozího mléka, farma A, 2005 datum odb ru celkový protein(g.100g-1) SUMA(g.100g-1) SUMA/celk.protein(%) 14.3. 2,69 0,472 17,55 18.4. 2,7 0,493 18,26 13.5. 2,8 0,513 18,32 27.6. 2,58 0,424 16,43 8.8. 2,71 0,382 14,10 26.9. 3,07 0,667 21,73 pr m r 2,83 0,492 17,38

Tabulka VProcentické zastoupení aminokyselin v hrubých a syrovátkových bílkovinách kozího a ov íhomléka a jejich vzájemný pom r

hrubé bílkoviny (%) syrovátkové bílkoviny (%) pom rAMK kozí ov í kozí ov í kozí ov íAsp 7,31 7,02 10,16 9,92 1,39 1,41Ser 3,1 2,68 4,23 4,47 1,36 1,67Glu 20,26 17,4 14,08 13,68 0,69 0,79Gly 1,85 2,06 5,28 5,16 2,85 2,51His 2,83 2,86 1,8 1,72 0,63 0,6Arg 3,46 3,76 3,5 3,14 1,01 0,84Thr 4,12 3,45 5,43 5,82 1,31 1,69Ala 3,12 3,65 8,78 9,57 2,81 2,62Pro 10,79 10,2 6,95 6,53 0,64 0,64Cys 2,9 4,31 3,45 3,98 1,18 0,92Tyr 3,03 3,91 3,77 2,38 1,24 0,61Val 7,65 7,08 6,57 7,09 0,85 1Met 2,28 3,19 0,25 0,48 0,11 0,15Lys 7,6 8,07 8,29 8,19 1,09 1,01Ile 5,25 5,54 5,98 6,01 1,13 1,08Leu 9,74 9,93 9,13 9,45 0,93 0,95Phe 4,7 4,84 2,33 2,42 0,49 0,5

143

Záv rNebyly zjišt ny statisticky významné rozdíly v obsahu syrovátkových bílkovin mezi

sledovanými farmami ani jednotlivými roky. Množství syrovátkových bílkovin je však do jisté míry statisticky závislé na dob odb ru mléka v pr b hu lakta ního období. V závislosti na fázi laktace docházelo u celkových syrovátkových bílkovin ke zm nám jejich obsahu. Tyto zm ny však nebyly výrazné a docházelo pouze k malým výkyv m od pr m rných hodnot (0,450 g.100g-1). Z výsledkje patrné, že vyšší obsahy syrovátkových bílkovin byly zaznamenány na po átku laktace, což patrnsouvisí s jejich rolí p i získávání imunity mlá at, a v kone né fázi laktace, což pravd podobnsouvisí se zvyšováním celkového proteinu.

Aminokyselinové složení syrovátkových bílkovin kozího a ov ího mléka se lišilo p edevším v zastoupení methioniu a tyrosinu. V syrovátkových bílkovinách ov ího mléka bylo stanoveno tém dvojnásobné množství methioninu než v syrovátkových bílkovinách mléka kozího. Množství tyrosinu bylo vyšší v syrovátkových bílkovinách mléka kozího.

Práce vznikla za finan ní podpory výzkumného zám ru MSM 6046070901

Použitá literatura:1. FORMAN, L. – MERGL, M. a kol. Syrovátka – její využití v lidské výživ a ve výživ

hospodá ských zví at. 1. vydání. Praha: St edisko technických informací potraviná ského pr myslu – Výzkumného ústavu potraviná ského pr myslu v Praze, 1959. 343 s.

2. MALÁ, G. Kozí mléko pod lupou: Bílkoviny vládnou mléku. Zpravodaj Svazu chovatel ovcí a koz v R, 2002, .2, s. 43-46. ISSN 1213-374X.

3. SIENKIEWICZ, T. – RIEDEL, C.-L. Whey and whey utilization. 2. edit. Verlag Th. Mann, Gelsenkirchen-Buer, Germany, 1990. 379 s. ISBN 3-7862-0086-6.

4. VELÍŠEK, J. Chemie potravin I. 2. vydání. OSSIS, 2002, 331 s. ISBN 80-86659-00-3. 5. VESELÁ, P. Syrovátka = hodnotná surovina. Celostátní p ehlídky sýr : Výsledky p ehlídek a

sborník seminá e Mléko a sýry 2003. eská spole nost chemická, 2003. s. 55-59. ISBN 80-8623831-8.

Kontaktní adresa:Ing. BLANKA JANSOVÁ, eská zem d lská univerzita v Praze, Fakulta agrobiologie, potravinových a p írodních zdroj , 165 21 Praha 6-Suchdol, eská republika,tel.: +420 224 382 727; e–mail: [email protected]

144

VLIV STADIA LAKTACE NA MLÉ NOU UŽITKOVOST HOLŠTÝNSKÉHO SKOTU Skýpala Martin, Chládek Gustav

Ústav chovu a šlecht ní zví at, AF, MZLU, Brno

The influence of stage of lactation on milk efficiency of holstein cattle

Summary:The aim of this study was to found out influence of stage of lactation on milk yield and composition of milk of Holstein cattle on the first lactation breed in the school farm Žab ice. The samples of milk were taken from the morning milking. We measure the milk yield, milk fat yield, milk protein yield, milk fat content, milk protein content, protein /fat ratio, milk lactose content, somatic cell count. The dairy cows were divided out 2 groups: group 1 (n = 39, to 200.day of lactation) and group 2 (n = 40, more than 200. day of lactation). We found high significant influence (P<0,01) in milk yield, milk fat yield and milk protein yield. The significantly influence (P<0,05) was found in protein/fat ratio. No significantly influence was found in milk fat content, milk protein yield, milk lactose content and somatic cell count.

ÚvodMléko je hlavní zdroj potravy v rozvinutých zemích. Po staletí bylo neustálou snahou

zlepšit produkci a složení mléka (1). Mlé né složky jsou nejen významným indikátorem vnit níhoprost edí dojnice, ale mají bezprost ední vztah k zpen žování mléka a tím významn ovliv ujírentabilitu výroby mléka (2).

Pro mlé nou užitkovost krav je d ležitá nejen produkce mléka, ale také produkce jeho jednotlivých složek (3). Mlé ná užitkovost má v pr b hu laktace n které zákonitosti, které jsou v jednotlivých stádech více i mén z etelné, nebo mimo genotypu jsou pro produkci významné i vn jší podmínky chovu a jejich úrove , zdravotní stav jednotlivých zví at i celého stáda (4). Laktací – ili lakta ním obdobím se nazývá období tvorby mléka od porodu do zaprahnutí (5). U krávy je žádoucí doba laktace kolem 305 dn (6).

Materiál a metodikaK experimentu bylo použito mléko krav holštýnského plemene na 1. laktaci chovaných

na ŠZP Žab ice. Krávy byly ustájeny ve stejné stáji a krmeny shodnou krmnou dávkou. Vzorky mléka byly odebírány z ranního dojení pomocí za ízení Tru-test. Zjiš ovalo se množství mléka, produkce tuku, produkce bílkovin, obsah tuku, obsah bílkovin, pom r tuk:bílkovina, obsah laktózy, po et somatických bun k. Dojnice byly rozd leny na 2 skupiny: skupina 1 (n = 39, do 200. dne laktace) a skupina 2 (n = 41, nad 200. den laktace). Mléko bylo analyzováno ve VÚCHS v Rapotínna p ístrojích Milko-scan 133 B (obsah bílkovin, obsah tuku, obsah laktózy) a PSB fossomatic 90 (po et somatických bun k).

Výsledky a diskuze

Produkce a složení mléka se m ní se stádiem laktace nebo dobou produkce mléka (7). Pokud uvážíme 305 denní laktaci, období produkce normálního mléka bez 5 dní po otelení je 300 dní (8). Denní dojivost zjišt nou v kontrolních dnech lze vyjád it graficky do tzv. lakta ník ivky (9). Typická lakta ní k ivka je popisována jako zvyšování produkce mléka od otelení až po maximální výt žnost, udržení maximální výt žnosti a poté množství mléka klesá až do konce laktace (10). Nam ili jsme vysoce statisticky v tší (P<0,01) množství mléka u skupiny 1 (15,0 kg), než u skupiny 2 (12,7 kg). Tyto výsledky odpovídají pr b hu lakta ní k ivky, kdy s postupující laktací množství mléka klesá.

V mléce se vyskytují 2 typy bílkovin: globulární syrovátkové bílkoviny, které jsou rozpustné v mlé ném séru a kaseiny, které se vyskytují jako stabilní koloidní suspenze agregátznámé jako kaseinové micely (11). Bílkoviny mléka jsou z nutri ního hlediska nejvýznamn jšísložkou mléka, jsou to vysokohodnotné bílkoviny (obsahují nenahraditelné esenciální aminokyseliny) dodávající mléku vysokou biologickou hodnotu. Bílkoviny podmi ují rovn žhlavní technologické vlastnosti mléka (kvasnost a sy itelnost mléka) (12). Obsah bílkovin byl

145

vysoce statisticky pr kazn vyšší u skupiny 2 (3,54 %) než u skupiny 1 (3,18 %). V tší obsah bílkovin na konci laktace uvád jí také SUCHÁNEK et al. (13), SEMJAN et al. (8). Produkce bílkovin v pr b hu laktace mírn klesala (skupina 1 – 0,48 kg; skupina 2 – 0,45 kg), což je ve shods údaji BARTESE a HOLUBÁ E (4). Vyšší produkce bílkovin na za átku laktace a její pokles na konci je zp soben nádojem, ze kterého se tato produkce po ítá.

Tuk v mléce p edstavují kuli ky v rozmezí 1 - 10 m, v tšinou kolem 4 m, závisející na plemeni krávy a ro ním období (14). Tuk je nejvíce prom nlivou složkou v mléce p ežvýkavc .Obsah tuku v mléce je ovlivn n zví etem a faktory životního prost edí jako plemeno, výživa, fáze laktace, ro ní období, okolní teplota a t lesná kondice (15). Obsah tuku v mléce se podle ZADRAŽILA (12) pohybuje od 3,20 % do 6,00 %. Také u obsahu tuku v mléce jsme pozorovali na konci laktace vyšší než na za átku (skupina 1 – 4,13 %; skupina 2 - 4,20 %). Nízký obsah tuku v první p li laktace a jeho zvýšený obsah na konci laktace zmi uje také GAJD ŠEK (16). I EJNA a CHLÁDEK (17) zjistili na konci laktace vyšší obsah tuku. Jak uvádí BARTES a HOLUBÁ (4) jsou svým vývojem v laktaci antagonistou k samotné produkci mléka s tím, že u tu nosti je v daném stád z etelná asová prodleva za vývojem dojivosti. Produkce tuku byla na konci laktace vysoce statisticky pr kazn nižší, než na za átku laktace (skupina 1 – 0,61 kg; skupina 2 – 0,53 kg). Také BARTES a HOLUBÁ (4) uvádí na za átku laktace vyšší produkci tuku oproti konci laktace.

Pro posouzení výživy, konverze živin a metabolismu má význam také sledování pom ruobsahu tuku a bílkovin. Za optimální lze považovat pom r T/B = 1,2 – 1,4. P i klesající hodnottohoto kvocientu lze p edpokládat nástup subklinických acidóz bachorového obsahu, vysoká acidogenní zát ž vnit ního prost edí, ohrožení reproduk ní výkonnosti dojnic a nebezpe í vzniku poruch minerálního metabolismu. Zvýšení kvocientu nad 1,4 signalizuje energetický deficit a p i nálezu ketolátek subklinickou ketózu (18). Ketózy všeobecn jsou v období vzniku tzv. „energetické díry“ resp. negativní energetické bilance po otelení zp sobené vyšším výdejem živin laktací organismu oproti nižšímu p ívodu. Jsou charakterizovány odbouráváním t lesných energetických (p edevším tukových) rezerv (19). Zjistili jsme u 1. skupiny jsme pr m rnou hodnotu 1,31 a u 2. skupiny 1,19. Také EJNA a CHLÁDEK (20) uvád jí, že s postupující laktací klesá pom r tuk:bílkovina.

Mlé ný cukr neboli laktóza je disacharid (C12H22O11), který se nachází pouze v mléce (21). Pokud je rozpušt na ve vod nebo syrovém mléce, existuje ve dvou formách: alfa a beta (22). Obsah laktózy v mléce se podle AUDIC et al. (23) pohybuje kolem 4,8 %. Obsah laktózy byl u 1. skupiny 4,99 % u 2. skupiny poklesl na 4,93 %. Pokles laktózy v pr b hu laktace popisují i SEMJAN et al. (8) a TEPLÝ et al. (24).

Po et somatických bun k v kravském mléce je indikátorem zdraví vemene a kvality mléka a m že souviset s bun nou imunitní odezvou na zán tlivý proces (25). Podle BOETTCHERA et al. (26) je to z toho d vodu, že leukocyty se mobilizují do vemene ke zní ení patogen . Stadium laktace má vliv na po et somatických bun k. V prvním týdnu laktace je po et somatických bun knejvyšší, poté se snižuje a ke konci laktace op t stoupá (v kone né fázi laktace množství mléka klesá a stejný po et somatických bun k se tak edí v menším objemu) (16). Zjistili jsme, že u skupiny 1 bylo v mléce v pr m ru 141 000 somatických bun k v 1 ml a u skupiny 2 175 000 somatických bun k v 1 ml. Zvyšování po tu somatických bun k ke konci laktace uvádí také DE VLIEGHER et al., (27).

146

Tabulka I Pr m rné hodnoty, jejich sm rodatné odchylky a varia ní koeficienty stanovovaných ukazatelu skupin 1 a 2

Skupina 1 Skupina 2 Ukazatel X SX VX X SX VXStat.pr k.

nádoj (kg) 15,0 2,71 17,99 12,7 2,41 18,94 ** tuk (%) 4,13 0,77 18,61 4,20 0,58 13,72 NS tuk (kg) 0,61 0,12 19,01 0,53 0,12 22,32 ** bílkoviny (%) 3,18 0,26 8,16 3,54 0,35 9,93 ** bílkoviny (kg) 0,48 0,09 18,05 0,45 0,07 16,66 NS T/B 1,31 0,26 20,23 1,19 0,14 11,57 * laktóza (%) 4,99 0,13 2,61 4,93 0,23 4,71 NS PSB (tis./ml) 141 141,91 100,35 175 233,06 133,44 NS


Graf 1. Rozdíly mezi množstvím mléka u skupiny 1 a 2

Graf 2. Rozdíly mezi produkcí tuku u skupiny 1 a 2

Graf 3. Rozdíly mezi obsahem bílkovin u skupiny 1 a 2

Graf 4. Rozdíly mezi pom rem tuk:bílkovina u skupiny 1 a 2

1 2

skupina

0,46

0,48

0,50

0,52

0,54

0,56

0,58

0,60

0,62

0,64

0,66

0,68tu

k (k

g)

1 2

skupina

11,5

12,0

12,5

13,0

13,5

14,0

14,5

15,0

15,5

16,0

16,5

nádo

j (kg

)

1 2

skupina

3,0

3,1

3,2

3,3

3,4

3,5

3,6

3,7

bílk

ovin

y (%

)

1 2

skupina

1,05

1,10

1,15

1,20

1,25

1,30

1,35

1,40

T/B

147

Záv rPro mlé nou užitkovost krav je d ležitá nejen produkce mléka, ale také produkce jeho

jednotlivých složek. Zjistili jsme vysoce statisticky pr kazný rozdíl (P<0,01) mezi množstvím mléka u skupin 1 (n = 39; do 200. dne laktace) a 2 (n = 41; nad 200. den laktace), kdy se potvrzuje, že s postupující laktací klesá množství mléka. Vysoce statisticky pr kazný rozdíl (P<0,01) je i mezi produkcí tuku u skupiny 1 a 2 a obsahem bílkovin. Ty spolu s tuky mají opa nou tendenci, tedy s postupující laktací dochází k jejich nár stu. Statisticky pr kazn vyšší hodnota (P<0,05) byla mezi pom rem tuk:bílkovina u skupiny 1. U ostatních ukazatel (obsah tuku, produkce bílkovin, obsah laktózy a po et somatických bun k) byly zjišt né rozdíly statisticky nepr kazné.

Pod kování:P ísp vek byl vypracován s podporou projektu QF 4005.

Použitá literatura:1. HOUDEBINE, L-M., RIVAL, S., PANTANO, T., JOLIVET, G., THEPOT, D., ATTAL, J.:

Transgenesis for the study and the control of lactation. Reprod. Nutr. Dev., 2002, 42:117-1252. DIVOKÝ, L.: Mlé né složky a výživa. Plemo report, listopad 2005, s. 30-31 3. ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J., GAJD ŠEK, S., POSPÍŠIL, Z.: Pr b h a variabilita složek a

vlastností mléka krav v prvních 100 dnech laktace. Živo . Výr., 34, 1989, 8: 675-6854. BARTES, P., HOLUBÁ , J.: Mlé ná užitkovost dojnic a její vývoj v laktaci. Plemo report,

listopad 2005, s.19-21 5. HROUZ, J., ŠUBRT, J.: Obecná zootechnika. Brno: MZLU, 2000, 207 s. 6. SOVA, Z. et al.: Fyziologie hospodá ských zví at. Praha: Státní zem d lské nakladatelství,

1981, 512 s. 7. SCOTT, T. A., YANDELL, B., ZEPEDA, L., SHAVER, R. D., SMITH, T.R.: Use of lactation

curves for analysisof milk production data. J. Dairy Sci., 1996, 79:1885-19848. SEMJAN Š. et al.: Výroba kvalitného mlieka. Bratislava: Príroda, 1987, 304 s 9. PAŠEK, V., et al.: Cvi ení z chovu skotu I. Praha: VŠZ, 1983, 140 s. 10. GROSSMAN, M., HARTZ, S.M., KOOPS, W.J.: Persistency of lactation yield: A novel

approach. J. Dairy Sci., 1999, 82:2192-2197 11. HORNE, D. S., BANKS, J. M.: Rennet-induced coagulation of milk. Cheese: chemistry,

Physics and microbiology. Third edetion – Volume 1: general aspects, 2004, p. 47-66 12. ZADRAŽIL, K.: Mléka ství. Praha: ZU A ISV, 2002, 128 s. 13. SUCHÁNEK, B. et al.: Zvyšování produkce mléka. Praha: SZN, 1973, 380 s. 14. MICHALSKI, M-C., BRIARD, V., MICHEL, F.: Optical parameters of milk fat globules for

laser light scattewring measurements. Lait, 2001, 81:797-796 15. McGUIRE, M. A., BAUMAN, D. E.: Milk fat. Encyclopedia od Dairy Sciences, 2002, p. 1828-

183416. GAJD ŠEK, S.: Laktologie. Brno: MZLU. 2003, 84 s. 17. EJNA, V., CHLÁDEK, G.: Vliv stádia laktace na vybrané mlé né ukazatele holštýnských

dojnic na první laktaci. Sborník Mendelnet04Agro (MZLU Brno), 2004, multimediální CR-rom 18. HAAS, D., HOFÍREK, B.: Diagnostický význam mlé ných složek pro zdraví lov ka a dojnice.

Sborník: Den mléka 2004. s. 107-114 19. HANUŠ, O., FRELICH J., KRON, V., ÍHA, J., POZDÍŠEK, J.: Kontrola t lesné kondice,

zdravotního stavu a výživy dojnic a zlepšování jejich produkce. Zem d lské informace, 2004, 3, 72 s.

20. EJNA, V., CHLÁDEK, G.: Pom r tuk:bílkovina v mléce holštýnských dojnic. Náš chov . 2, 2006, s. 24-26.

148

21. SCHUCK, P., DOLIVET, A.: Laktose crystallization: determination of -lactose monohydrate in spray-dried dairy products. Lait, 2002, 82:413-421

22. VUATAZ, G.: The phase diagram of milk: a new tool for optimising the drying process. Lait, 2002, 82:485-500

23. AUDIC, J-L., CHAUFER, B., DAUFIN, G.: Non-food application of milk components and dairy co-products: A review. Lait. 2003, 83:417-438

24. TEPLÝ M. et al.: Mléko a jeho produkce k pr myslovému zpracování. Praha: SNTL, 1979, 376 s.

25. LINDMARK-MÅNSSON, H., BRÄNNING, C., ALDÉN, G., PAULSSON, M.: Relatioship between somatic cell count, individua leukocyte populations and milk components in bovine udder quarter milk. International Dairy Journal, 2006, 16:717-727

26. BOETTCHER, P.J., CARAVIELLO, D., GIANOLA, D.: Genetic analysis of somatic cell scores in US Holsteins with a Bayesian mixture model. J. Dairy Sci., 2007, 90:435-443

27. DE VLIEGHER, S., BARKEMA, H.W., STRYHN, H., OPSOMER, G., DE KRUIF, A.: Impact of early lactation somatic cell counts over the first lactation. J. Dairy Sci., 2004, 87:3672-3682

Kontaktní adresa:[email protected], [email protected]

149

VARIABILITA DUSÍKATÝCH LÁTEK V MLÉCE. Šustová Kv toslava1, Kopunecz Pavel2

1Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn2 MSCH

Variability of nitrogenous matter in milk

Summary:This work occupied with variability nitrogenous matter (proteins, casein and urea) in cow ´s milk. About 6200 samples were followed from 40 dairies during the year. The percentage of samples was determined according to content of proteins and urea. About 20 % of dairy cows had a deficiency of energy in feeding amount during the season May to August. This value increased over 36 % in June.

Bílkoviny mléka jsou sou ástí složitého komplexu dusíkatých látek v mléce, který ozna ujeme jako celkové bílkoviny. Dusíkaté látky mléka tvo í nejkomplexn jší složku mléka, ur ují také základní fyzikální a chemické vlastnosti mléka. Ze zpracovatelského hlediska jsou významné isté bílkoviny, jejichž obsah se v kravském mléce pohybuje v rozmezí 3,0 až 3,3 %. Nejvýznamn jší složkou mlé ných bílkovin je kasein, jehož množství kolísá v rozmezí 2,4 až 2,6 %. Jako hrubé bílkoviny potom ozna ujeme isté bílkoviny spole ns tzv. nebílkovinnými dusíkatými látkami. Koncentrace nebílkovinných dusíkatých látek v mléce od zdravých a dob e krmených zví at se pohybuje v rozmezí od 250 do 350 mg N v 1 litru mléka, v p evážné ásti se jedná o produkty metabolismu. Nejv tší podíl z t chto látek tvo í mo ovina. Množství mo oviny v syrovém mléce není normou stanovený jakostní ukazatel. Mo ovina je kone ným produktem metabolismu bílkovin a je obsažena v krvi, mo i, slinách i mléku. Byla prokázána úzká korelace mezi koncentrací mo ovinyv krevní plazm a mléku. V krevní plazm zdravých dojnic p i optimální výživ je koncentrace mo oviny 3,0-5,0 mmol/l. Hodnoty koncentrace mo oviny v mléku se pohybují v rozmezí 2,6-4,6 mmol/l. Koncentrace mo oviny v krevní plazm a mléku je výslednicí energetického a dusíkatého metabolismu. P i nedostate ném p íjmu sacharid jsou v p edžaludku dusíkaté látky nedostate n využívány (nedostate ná tvorba bakteriálního proteinu) a játra syntetizují z resorbovaného amoniaku mo ovinu, která je vylu ována z organismu mo í a mlékem. Rovn žp i zkrmování dusíkatými látkami se koncentrace mo oviny zvyšuje v krvi, mo i i mléku. Koncentrace mo oviny v krevní plazm a mléku je velmi citlivým ukazatelem úrovn zásobení organismu dusíkatými látkami a jejich využitím [3, 5]. Úrove obsahu mo oviny v syrovém mléce diagnostikuje vhodnost složení krmné dávky [6]. Fyziologické rozmezí úrovn mo oviny leží mezi 150-300 mg na 1 litr mléka. Ve zna némpo tu p ípad dochází ke zvýšení obsahu mo oviny nad fyziologicky optimální hranici do 300 mg/l. Jako p í inu lze uvést zejména p ekrmování dusíkatými látkami, nedostatek energie nebo situaci, kdy je vyrovnaný pom r energie a dusíkatých látek, ale dochází ve zna né mí e k odbourávání dusíkatých látek v bachoru. Ze stanovení obsahových složek mléka a obsahu mo oviny lze vyvodit, že vysoká hladina mo oviny v mléce p i fyziologickém obsahu bílkovin je zp sobena p ebytkem bílkovin v krmivu a vysoká hladina mo oviny v mléce p i nízkém obsahu bílkovin je zp sobena nedostatkem energie v krmivu [1]. Obsah mo oviny stoupá p i podávání krmiva, jež obsahuje více než 17 % hrubých bílkovin nebo p i zkrmování mladé zelené píce i pastevního porostu s vysokým obsahem rychle rozpustných a rychle degradovatelných dusíkatých látek. Zvýšené hodnoty mo oviny v mléku jsou zjiš ovány i p i nedostate ném využívání dusíkatých látek z d vodu nedostatku pohotové energie. Zvýšení koncentrace mo oviny v mléku jsou zpravidla doprovázeny alkalózou bachorového obsahu, poruchami trávení a nedostate nou tvorbou t kavých mastných kyselin i bakteriálního proteinu [2]. P i dlouhodob zvýšené zát ži dusíkatými látkami dochází k r zným poruchám metabolismu. Skladba mléka je výrazn narušena. Dochází ke snížení tukuprosté sušiny, obsahu bílkovin, laktózy, snižuje se titra ní kyselost mléka a zvyšuje se po et somatických bun k v mléce.

150

Tabulka I Hodnoty mo oviny v syrovém kravském mléce pro ur ování správné výživy dojnic [4]. Obsah mo oviny v mg / 100 ml

< 15 15 - 30 > 30Obsah

bílkovin v % Nedostatek P ebytek bílkovin a P ebytek bílkovin

> 3,6 p ebytek energie a energieenergie

Nedostatek P ebytek bílkovin a Bílkoviny bílkovin a

3,2 - 3,6 slabý a energie slabý p ebytek v rovnováze nedostatek energie energie

P ebytek Nedostatek Nedostatek bílkovin a

< 3,2 energie energie nedostatek a bílkovin energie

Jakost mlé ných bílkovin je ur ena proporcionálním zastoupením všech dusíkatých látek v mléce. Vliv deficitní výživy, zejména energie, m že vést i ke snížení termostability bílkovin, což se negativn projevuje p i všech tepelných procesech p i zpracování mléka [3]. Pro mléka skoutechnologii je výhodný velmi nízký obsah zbytkového dusíku a vysoký obsah kaseinu v mléce. V dnešní dob , kdy se platí za mléko hlavn podle obsahu celkových bílkovin, by se m lop ihlédnout k faktu, že kasein, který má hlavní význam p i výt žnosti výroby sýr tvo í pouze v pr m ru 75 % z celkových bílkovin. Pro zvýšení obsahu bílkovin v mléce jsou tedy zkrmovány vyšší dávky krmiv s vysokým obsahem dusíkatých látek, což má za následek navýšení také obsahu mo oviny. Dusík z mo oviny následn ovliv uje výpo et obsahu bílkovin z celkového dusíku.

Cíl práceCílem práce bylo zhodnotit ro ní variabilitu dusíkatých látek mléka a jejich vzájemný

vztah. Vzorky byly odebírány celoro n p ibližn od 40 mlékáren, po et vzork za m síc byl 6200. V práci byly použity údaje z rozbor vzork mléka z centrální laborato e Pardubice. Vzorky byly odebírány od ledna do prosince v roce 2003. U vzork byl vyhodnocen obsah celkových bílkovin, kaseinu a mo oviny.

Výsledky a diskuseNejvyšší pr m rná m sí ní hodnota bílkovin byla zjišt na v listopadu (3,52 %) a nejnižší

pr m rná hodnota byla zjišt na v ervnu (3,24 %). Podle obsahu bílkovin jsme vytvo ili intervaly po 0,2 % v rozmezí od 2,8 do 4,0 %. V jednotlivých intervalech bílkovin jsme stanovili etnostvzork . Nejvyšší etnost v intervalu bílkovin od 3,4 do 3,6 % byla v zimním období a to íjen až únor. Po zbytek roku byla nejvyšší etnost v intervalu bílkovin 3,2 až 3,4 %. V ervnu dokonce byla etnost v intervalu bílkovin 3,0 až 3,2 % tém 35 % z celkových bílkovin.

Nejvyšší pr m rná m sí ní hodnota kaseinu byla zjišt na v listopadu (2,71 %) a nejnižší pr m rná hodnota byla zjišt na v ervnu a srpnu (2,36 %). Obsah kaseinu koreluje s obsahem bílkovin, byla prokázána pozitivní závislost mezi obsahem bílkovin a obsahem kaseinu. T snostzávislosti byla velmi vysoká, výjimku tvo í m síc zá í, kdy t snost byla “pouze“ velká. Vypo tenéhodnoty korela ního koeficientu byly vysoce pr kazné (P = 0,01). Kaseinové íslo se vypo ítá jako procentické množství kaseinu z celkových bílkovin. Hodnota kaseinového ísla, jak uvádí tabulka II mírn klesala od ledna do srpna (73 >> 72), od zá í se zvyšovala na 75 a do prosince hodnota kaseinového ísla stoupala až na 77. Závislost obsahu kaseinu na syrovátkových bílkovinách, byla pozitivní, t snost význa ná až velká. Výjimku tvo il m síc zá í, kdy byla t snost nízká. Vypo tenéhodnoty korela ního koeficientu jsou vysoce pr kazné (P = 0,01).

151

Tabulka II Variabilita kaseinového íslam síc x Sx

2Sx Vx min. max.

leden 73,4 0,77 0,88 1,19 58,7 94,1únor 72,7 0,71 0,84 1,16 63,3 88,7

b ezen 73,0 0,64 0,80 1,10 62,7 78,0duben 73,0 0,61 0,78 1,07 60,1 81,8kv ten 72,9 0,62 0,79 1,08 63,8 77,2erven 72,8 0,64 0,80 1,10 53,4 77,2

ervenec 72,4 0,87 0,93 1,29 60,6 79,1srpen 71,9 0,67 0,82 1,14 54,8 76,0zá í 75,0 4,94 2,22 2,96 50,3 82,8íjen 76,2 1,71 1,31 1,72 68,1 95,6

listopad 77,1 1,22 1,11 1,43 71,4 96,9prosinec 77,2 1,26 1,12 1,45 71,4 83,9

Tabulka III Variabilita obsahu mo ovinym síc x (mg/100ml) Sx

2Sx Vx min. max.

leden 19,9 75,1 8,7 43,6 0,9 58,8únor 23,3 74,5 8,6 37,1 1,4 59,9

b ezen 24,8 91,1 9,5 38,5 1,7 73,4duben 25,4 84,0 9,2 36,1 1,4 65,3kv ten 25,1 93,7 9,7 38,5 3,2 72,4erven 22,3 72,4 8,5 38,2 1,2 70,6

ervenec 25,1 72,7 8,5 33,9 5,1 58,8srpen 25,2 76,3 8,7 34,6 3,0 60,1zá í 24,5 92,6 9,6 39,2 0,7 59,5íjen 26,5 87,8 9,4 35,4 5,0 59,7

listopad 20,4 64,0 8,0 39,2 2,6 55,9prosinec 21,7 72,4 8,5 39,2 4,3 58,7

Tabulka IV Vzájemná korelace mezi obsahem bílkoviny, kaseinu a mo ovinypearson bílkovina mo ovina bílkovinam síc mo ovina kasein kaseinleden 0,167 0,199 0,988unor 0,183 0,220 0,989

b ezen 0,195 0,242 0,989duben 0,202 0,238 0,990kv ten 0,155 0,183 0,987erven 0,102 0,127 0,986

ervenec 0,054 0,084 0,978srpen 0,024 0,058 0,987zá í 0,108 0,254 0,881íjen 0,040 0,089 0,959

listopad 0,089 0,138 0,986prosinec 0,095 0,149 0,984

Nejnižší obsah mo oviny bývá zjiš ovány dubnu, nejvyšší pak v zá í [6]. V našich výsledcích byl nejnižší obsah v lednu (19,9 mg /100 ml) a nejvyšší v íjnu (26,5 mg /100 ml). V období únor až kv ten byly hodnoty mo oviny spíše vyšší. Závislost mezi obsahem mo oviny a obsahem bílkovin a mezi obsahem mo oviny a kaseinu je pozitivní, t snost nízká. Vypo tené hodnoty korela ního koeficientu jsou vysoce pr kazné (P = 0,01). Výjimku tvo í m síc srpen, kde se závislost obsahu bílkovin na obsahu mo oviny neprokázala. Zajímavé výsledky poukazuje pr m rné množství mo oviny v jednotlivých intervalech bílkovin. Dá se íci, že množství mo oviny stoupá až do intervalu bílkovin 3,4 až 3,6 respektive 3,6 až 3,8 a dále pak klesá s rostoucím intervalem bílkovin. Výjimku tvo í letní m síce kv ten a erven, kdy v intervalu bílkovin nad 4 % zase obsah mo oviny roste, v ervnu dokonce v intervalu bílkovin nad 4 % je extrémn vysoké množství mo oviny (31,1 mg/100 ml). Výsledky jsou ovšem ovlivn ny malou etností v intervalech bílkovin vyšších než 3,6 až 3,8 %.

152

Jak vyplývá z tabulky I., správn vybilancovaná krmná dávka je základem pro zisk mléka s optimálním složením. Procentické zastoupení námi sledovaných vzork mléka podle obsahu bílkovin a mo oviny je patrné z obr. 1 a 2.

leden únor

b ezen duben

kv ten erven

Obr. 1. Procentické zastoupení vzork v jednotlivých intervalech bílkovin a mo oviny v m sícíchleden až erven podle tab. I

153

ervenec srpen

zá í íjen

listopad prosinec

Obr. 2. Procentické zastoupení vzork v jednotlivých intervalech bílkovin a mo oviny v m sícíchervenec až prosinec podle tab. I

154

V období kv ten až srpen trpí nad 20 % dojnic nedostatkem energie, v ervnu se dokonce tato hodnota zvýšila až na 36 % veškerých dojnic. Tyto hodnoty souvisí ovšem také s nejv tším po tem laktací v letním období. V m sících íjen až leden trpí zase dojnice p ebytkem energie, v listopadu je to tém t etina z celkového po tu. Na druhé stran bílkovin je v krmné dávce nedostatek v m sících listopad až leden, po zbytek roku je v krmné dávce bílkovin spíše p ebytek. P es to všechno v pr m ru u 40 % dojnic je každý m síc krmná dávka vybilancovaná správn . Z výsledk je patrné, že ve zna ném po tu p ípad dochází ke zvýšení obsahu mo oviny nad fyziologicky optimální mez (30mg/100ml), v n kterých m sících dokonce u více než t etiny analýz a tím k ekonomickým ztrátám v chovech. Jako p í inu lze uvést zejména p ekrmování dusíkatými látkami, nedostatek energie nebo situaci, kdy je vyrovnaný pom r energie a dusíkatých látek, ale dochází ve zna né mí e k odbourávání dusíkatých látek v bachoru. Pro zvýšení obsahu bílkovin v mléce tedy n kte í zem d lci zkrmují vyšší dávky krmiv s vysokým obsahem dusíkatých látek, avšak zvýší se hlavn obsah mo oviny. Dusík z mo oviny pak negativn ovliv uje nejen výpo etobsahu bílkovin z celkového dusíku ale i celkovou výt žnost sýr .

Práce podrobn statisticky vyhodnotila obsáhlý soubor vzork mléka a m že být vzhledem k velkému množství zpracovaných dat d ležitým p ínosem pro výrobce i zpracovatele mléka.

Použitá literatura:1. BUCEK, P. a kol. Výsledky analýz mléka v chovatelských laborato ích. Náš chov, 2002, 5, s.

30-31.2. FRANK, B., SWENSSON, C. Relationship between content of crude protein in rations for dairy

cows and milk yield, concentration of urea in milk and ammonia emissions, J Dairy Sci., Sweden, 2002, 7, p. 1829-38.

3. ILLEK, J., KADLEC, I. Výživa dojnic a její vliv na jakost a složení mléka. In Problematika prvovýroby mléka. Pardubice: ÚVO, 1995, s. 69-105.

4. KADLEC, I. a kol. Požadavky a p í ina nízké jakosti mléka. Milcom servis, a.s., Praha 1995. 202s.

5. KOUKAL, P. Metabolizovatenlý protein ve výživ dojnic, Náš chov, 2004, 8, s. 37-42. 6. SEYDLOVÁ, R., KADLEC, I. Využívání výsledk jakosti mléka pro zabezpe ování jakostní

výroby mléka a výživy dojnic. In Problematika prvovýroby mléka. Pardubice: ÚVO, 1995, s. 107-110.

Kontaktní adresa:Ing. Kv toslava Šustová, Ph.D., Ústav technologie potravin, Fakulta agronomická, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno, tel. 545 133 257, e-mail: [email protected]

155

VLIV KONCENTRACE MO OVINY NA SÝRA SKÉ VLASTNOSTI KRAVSKÉHO MLÉKA

ejna Vladimír, Chládek Gustav Ústav chovu a šlecht ní zví at, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn

Effect of milk urea level on cheese-making properties of cow’s milk

Summary:Milk composition can considerably affect milk processing and consequently quality and quantity of dairy products. We found a statistically significant negative effect (P<0.05) milk urea concentration on rennet coagulation time. This result implies that urea concentration monitoring is important not only for producers but also for dairy factories.

Úvod Složení mléka m že mnoha zp soby ovliv ovat výrobní proces a následn kvalitu a kvantitu mlé ných produkt [1]. Z hlediska zpracovatelnosti a výroby mlékárenských produkt je nutné, aby mléko m lo nejen vhodné složení, ale i vlastnosti. Ze základních vlastností mléka se jedná p edevším o jeho kyselost (titra ní i aktivní) a z technologických vlastností podle zp sobuzpracování o kysací schopnost, sy itelnost a tepelnou stabilitu [2].

Koncentrace mo oviny v mléce je uznávaným indikátorem dusíkato–energetické bilance ve výživ dojnic ve vztahu jejich dojivosti, kdy zvýšené hodnoty jsou asto dány absolutním nebo relativním p ebytkem dusíkatých látek nebo nedostatkem energie [3]. V mléce p edstavuje koncentrace mo oviny 2,5 až 3 % z celkového dusíku v kravském mléce [4]. K nežádoucímu vzr stu koncentrace mo oviny v krvi a v mléce dochází p i p ekro ení proteosyntetické kapacity bachorové mikroflóry, nap . p ebytkem N–látek v krmné dávce, nebo nedostatkem pohotové energie pro metabolickou mikrobiální aktivitu. Amoniak, vzniklý v bachoru v d sledku rozšt pení p ibližn 70 % krmného proteinu, pak nem že být mikrobiáln zp tn využit pln k proteosyntéze, jeho p ebytek p echází do krve a je v játrech detoxikován na mo ovinu [5]. P i dlouhodobém a dieteticky zcela nevhodném krmení tak dále dochází k neúm rnému zatížení detoxika ní kapacity jater a následn ke zvýšení obsahu mo oviny ve všech t lesných tekutinách, v etn mléka a krve. Každé odbourávání mo oviny v játrech je energeticky velmi náro ným procesem a jen prohlubuje energetický deficit [6]. Martin et al. (1997) [7] uvád jí, že mo ovina bezprost edn ovliv uje prokysávání mléka, chemické složení a texturní vlastnosti sýr , p i emž mo ovina p ímoneovliv uje chu sýr . Vysoké hladiny mo oviny v mléce jsou také spojovány se zhoršováním jednotlivých ukazatel reprodukce [8, 9, 10, 11]. Nap . Hanuš et al. (2001) [12] uvád jí, že dlouhodobé navýšení obsahu mo oviny v mléce v d sledku zatížení dusíkatými látkami ve výživ o 10 mg/100 ml nad b žný pr m r (cca 26 až 28 mg/100 ml) m že prodloužit servis periodu cca o 10 dní a zkrátit produk ní v k dojnice cca o 0,5 laktace. Zhoršující ukazatele reprodukce pak mají za následek zhoršení ekonomické situace chovatel [13]. Zadražil (2002) [14] uvádí fyziologicky únosnou koncentraci mo oviny 15–30 mg/100 ml mléka.

Cílem práce bylo zjistit vliv r zných hladin mo oviny na sýra ské vlastnosti mléka (sy itelnost a kvalita sý eniny).

Materiál a metodika Byly analyzovány individuální vzorky kravského mléka v rámci dvou chov . V chovu A

(Moravskoslezský kraj) byly odebírány vzorky (ve erní nádoj) od dojnic holštýnského (n = 8; H75 a vyšší, po adí laktace = 1,00) a eského strakatého plemene (n = 8; C75 a vyšší; po adí laktace = 2,1) v pr b hu celé laktace. Výsledný soubor dat (pr m rná koncentrace mo oviny: 33,79 mg/100 ml) byl rozd len na t i koncentra ní hladiny mo oviny: 1 (20,00–29,99); 2 (30,00–39,99) a 3 (40,00–49,99 mg/100 ml). V chovu B (Jihomoravský kraj) byly odebírány vzorky (denní nádoj) od istokrevných holštýnských dojnic (n = 24; po adí laktace = 1,43) v pr b hu celé laktace. Výsledný soubor dat (pr m rná koncentrace mo oviny: 44,87 mg/100 ml) byl rozd len na t i koncentra ní hladiny mo oviny: 1 (30,00–39,99); 2 (40,00–49,99)

156

a 3 (50,00–59,99 mg/100 ml). Vzorky od dojnic, jejichž mléko bylo vylou eno z dodávky pro mlékárnu, nebyly analyzovány.

Koncentrace mo oviny byla zjišt na pomocí enzymaticko–konduktometrické metody (Ureakvant 2) v laborato i LRM Brno-Chrlice. Ostatní ukazatele byly zjišt ny v laborato i Ústavu chovu a šlecht ní zví at MZLU v Brn . Sy itelnost mléka byla stanovena pomocí „Nefelo–turbidimetrického sníma e koagulace mléka“ m ící principem vysv tleným v práci ejnya Chládka (2005) [15]. Bylo použito sy idlo Laktochym 1:5000 (Milcom Tábor) v množství 1 ml na 50 ml mléka po z ed ní sy idla 1:4. Kvalita sý eniny byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 50 ml zasý eného mléka p i 35 °C a posouzena dle známé tabulky [16] hodnotící vzhled sý eniny a syrovátky (t ída 1 = nejlepší, t ída 5 = nejhorší). Titra ní kyselost byla provád nadle SN 57 0530 l. 58.

Výsledky a diskuze Pr m rné hodnoty sledovaných technologických vlastností v jednotlivých koncentra níchhladinách mo oviny v chovech A a B uvádí tab. I. Grafické znázorn ní zm n sy itelnosti a kvality sý eniny v jednotlivých hladinách mo oviny je patrné z grafu 1. V obou sledovaných chovech m la zvyšující se koncentrace mo oviny statisticky pr kazný vliv (P<0,05) na zhoršování sy itelnosti.V chovu A se projevilo zhoršování sy itelnosti v jednotlivých hladinách mo oviny takto: 203 s; 212 s a 257 s. Obdobné zhoršování sy itelnosti se prokázalo i v chovu B (201 s; 209 s a 233 s). Jedním z vysv tlením m že být skute nost, že vysoké hladiny mo oviny v mléce ovliv ují složení a pom r mlé ných složek v etn minerálních látek, což se výsledn projeví zhoršením sy itelnosti mléka. Nap . Doležal et al. (2005) [6] uvád jí, že s v tším vylu ováním amoniaku m že docházet k zvýšení obsahu vápníku v mo i. Vyšší hladiny mo oviny také negativn ovlivnily kvalitu sý eniny ve sledovaných chovech, ovšem bez statisticky pr kazných rozdíl . V chovu A došlo k tomuto zhoršení kvality sý eniny: 1,45 t .; 1,52 t . a 1,92 t . V chovu B se kvalita sý eninyzhoršovala v lineárním trendu (1,94 t .; 2,01 t . a 2,10 t .). Naše výsledky jsou ve shod s Martin et al. (1997) [7], kte í zjistili u skupiny dojnic s vysokou koncentrací mo oviny horší sy itelnosta pomalejší tvorbu sý eniny.

Tabulka I Pr m rné hodnoty sledovaných technologických vlastností v jednotlivých koncentra ních hladinách mo oviny v chovech A a B

koncentrace mo oviny (mg/100 ml) koncentrace mo oviny (mg/100 ml) 1 2 3 1 2 3 chov A

20,00 - 29,99 30,00 - 39,99 40,00 - 49,99 chov B

30,00 - 39,99 40,00 - 49,99 50,00 - 59,99

n 56 67 13 n 53 70 52 x 26,59 33,88 43,46 x 35,43 45,18 54,07

min 20,56 30,09 40,22 min 30,10 40,40 50,20 max 29,96 39,85 49,34 max 39,90 49,90 59,90 sx 2,412 2,690 2,690 sx 3,069 2,826 2,815 v% 9,073 7,942 6,188 v% 8,659 6,255 5,206 sy itelnost (s) sy itelnost (s) x 203a 212 257b x 201a 209 233b

sx 60,6 69,2 20,1 sx 46,3 52,8 71,1 v% 29,8 32,6 7,84 v% 23,0 25,3 30,6 kvalita sý eniny (t .) kvalita sý eniny (t .)x 1,45 1,52 1,92 x 1,94 2,01 2,10

sx 0,730 0,699 0,730 sx 0,872 0,765 0,815 v% 50,467 45,901 37,947 v% 44,957 37,988 38,869 Pr m rné hodnoty jednoho faktoru ozna ené ve stejném ádku r znými písmeny (a, b) se liší statisticky pr kazn(P<0,05).

157

Obr. 1: Grafické znázorn ní zm n sy itelnosti a kvality sý eniny v jednotlivých hladinách mo oviny v chovech A a B

Záv r Složení mléka zásadním zp sobem ovliv uje jeho technologické vlastnosti. Zjistili jsme statisticky pr kazný vliv (P<0,05) koncentrace mo oviny na zhoršování sy itelnosti mléka. Z toho vyplývá, že sledování koncentrace mo oviny v mléce je d ležité nejen pro prvovýrobce (z hlediska reprodukce a následn ekonomiky chovu), ale i pro zpracovatele (z hlediska optimálních technologických vlastností mléka).

P ísp vek byl vypracován s podporou projeku QF 4005.

Literatura1. AULDIST, M. J. , MULLINS, C., O´BRIEN, B., O´KENNEDY, B. T., GUINEE. T.: Effect

of cow breed on milk coagulation properties. Milchwissenschaft, 2002, 57(3): 140 - 1432. GAJD ŠEK, S.: Sezónní zm ny dusíkatých látek a vlastností kravského mléka. Živo išná

výroba, 1993, 38(8): 745-752 3. JOHNSON, R. G., YOUNG, A. J.: The association between milk urea nitrogen and DHI

production variables in Western commercial dairy herds. J. Dairy Sci., 2003, 86:3008-3015 4. DePETERS, E. J., CANT, P.: Nutritional factors influencing the nitrogen composition of bovine

milk: a review. J. Dairy Sci., 1992, 75:2043-2070 5. HANUŠ, O., GEN UROVÁ, V., FICNAR, J., GABRIEL, B., ŽVÁ KOVÁ, I.: Vztah obsahu

mo oviny a bílkovin v stádových vzorcích mléka k n kterým chovatelským faktor m. Živo išnávýroba, 1993, 38(1):61-72

6. DOLEŽAL, P., DVO Á EK, J., ZEMAN, L.: Vliv volného pavku v krmivech a jeho p sobení na trávení. Náš chov, 2005, (65)3: 31-34

158

7. MARTIN, B., COULON, J. B., CHAMBA, J. F., BUGAUD, C: Effect of milk urea content on characteristics of matured Reblochon cheeses. Le Lait, 1997, 77(4):505-514

8. BUTLER, W. R., CALAMAN, J. J., BEAM, S. W.: Plasma and milk urea nitrogen in relation to pregnancy rate in lactating dairy cows. J. Anim. Sci., 1996, 74:858-865

9. BURKE, J. M., STAPLES, C. R., RISCO, C. A., de la SOTA, R. L., THATCHER, W. W.: Effect of ruminant grade menhaden fish meal on reproductive and productive performance on lactating dairy cows. J. Dairy Sci., 1997, 80:3386-3398

10. LARSON, S. F., BUTLER, W. R., CURRIE, W. R.: Reduced fertility associated with low progesterone postbreeding and increased milk urea nitrogen in lactating cows. J. Dairy Sci., 1997, 80:1288-1295

11. LEE, J. H., KIM, C. K., CHUNG, Y. C., YOON, J. T.: Efeect of milk production, season, parity and lactation period on variations of milk urea nitrogen concentration and milk components of Holstein dairy cows. Asian-Aust. J. Anim. Sci., 2004, 17(4):479

12. HANUŠ, O., KVAPILÍK, J., KLOP I , M., BJELKA, M.: D ležité složky dusíkaté fáze mléka a chovatelské faktory. In Chov a šlecht ní skotu pro konkurenceschopnou výrobu. VÚCHS Rapotín, 2001, s. 114-121

13. HANUŠ, O., HEGEDÜŠOVÁ, Z., BJELKA, M., LOUDA, F., MACHÁLEK, A.: Reprodukce dojených krav, její problémy v sou asných podmínkách a faktory, které ji ovliv ují ve vztahu k produkci mléka. In Vliv výrobních faktor a welfare na zdraví a plodnost dojnic a kvalitu a bezpe nost mléka jako potravinové suroviny. VÚCHS Rapotín, 2006, s. 99-128

14. ZADRAŽIL, K.: Mléka ství. Praha ZU, 2002, 127 s. 15. EJNA, V., CHLÁDEK, G.: Individuální sy itelnost mléka holštýnských dojnic a její vztah

k po adí a stadiu laktace. In Mléko a sýry 2005 1. vyd. Praha: eská spole nost chemická, 2005, s. 33 – 37

16. GAJD ŠEK, S.: Mléka ství II (cvi ení). Brno: MZLU. 1999, 92 s.

Kontaktní adresa:Ing. Vladimír ejna, ÚCHŠZ AF MZLU BRNO, Zem d lská 1, 613 00 e-mail:[email protected]

159

MLIEKO SO ZVÝŠENÝM OBSAHOM SELÉNU, AKO SUROVINA PRE VÝROBU FUNK NÝCH POTRAVÍN V PREVENCII PROTI NÁDOROVÝM OCHORENIAM

Foltys Vladimír1, Kirchnerová Katarína1, Bob ek Rastislav2.1Slovenské centrum po nohospodárskeho výskumu, Výskumný ústav živo íšnej výroby, Nitra,

2Alltech Slovakia, Nitra

Milk with higher Selenium content as the raw material for functional food production in the prevention of tumour disease

Summary:We studied the effect of feeding the organic selenium on somatic cell count in milk of dairy cows, health status of mammary gland, and the increase of selenium content in milk. Selenium was added to the premix in form of Selplex Se (firm Alltech, Inc.) in the amount 0.2 ppm into 1 kg feed mixture. The enriched mixture was fed to 44 dairy cows during 8 weeks. SCC and Selenium content was studied in milk samples and compared with the control group. Decrease of SCC from 229.3x103/ml to 174.5x103/ml (P<0.001) was noticed with Se feeding from 1st to 8th week of experiment. Content of Se in milk rose from 0.048 mg/ml to 0.138 mg/ml during the experiment, i.e. by 288 % compared with common cow's milk.

Vitálne funkcie selénuV súvislosti s oraz viac za aženým životným prostredím sa zna ná pozornos venuje

antioxida nej ochrane udí a zvierat. Medzi jej najaktívnejšie zložky patria selenoproteíny. Dôležitým selenoproteínom je enzým glutation peroxidáza, ktorý má k ú ovú úlohu v antioxida ných reakciách pri odstra ovaní peroxidov vodíka, fosfolipidových peroxidov a iných škodlivých hydroperoxidov na membránach a v cytoplazme. Treba tu zárove aj uvies , že mnohé antioxida né reakcie Se prebiehajú v úzkom vz ahu s vitamínom E, a preto sa niektoré príznaky ich deficiencie môžu prekrýva . (1)

alším významným selenoproteínom je thioredoxín reduktáza. Jej úlohou je redukcia cysteínových zvyškov v transkrip ných faktoroch a tým aj zásah do nukleotidov v DNA syntéze, regenerácia antioxida ného systému, udržiavanie redukovaného stavu v bunke transfermi elektrónu (kritické pre životaschopnos bunky) a regulácia expresie génov kontrolou redox potenciálu pri väzbe transkrip ných faktorov na DNA (2).

V poslednej dobe si ve kú pozornos ako selenoproteíny získali tri izoenzýmy jódtyronín dejodinázy, z ktorých dva katalyzujú aj konverziu neaktívnej formy hormónu tyroxínu (T4)sekrétovaného štítnou ž azou na aktívnu formu 3,3,5-trijódtyronín (T3) (3).

Selén má zna nú úlohu v imunitných funkciách. Je známe, že jeho deficiencia znižuje bunkovú aj humorálnu imunitnú schopnos u udí a zvierat. Evidentne to súvisí s vysokou aktivitou GSH-Px v bielych krvinkách (4).

Pomerne ve a sa hovorí o potenciálnom antikarcinogénnom ú inku selénu na základe po etných štatistických a modelových prác. Pri dávkach odporú aných pre udí, v USA a Ve kej Británii (príjem cca 60 a 75 g denne) Se funguje ako antimutagénny faktor zabra ujúci malígnej transformácii normálnych buniek a aktivácii onkogénov prostredníctvo antioxida ných funkcií GSH-Px a rioredoxín reduktázy. Zdá sa však, že aj tento, doposia odporú aný príjem, bude potrebné zvýši až na 80 – 100 g denne vzh adom na nové kritéria saturovate nosti GSH-Px v trombocytoch (5). Pri ešte vyšších príjmoch Se (200 až 300 g denne) sa predpokladá, že by sa mohli navyše uplatni podobné mechanizmy ú inku niektorých jeho metabolitov, ako boli zistené in vitro inhibícia tvorby kolónií tumorových buniek a ich selektívna deštrukcia (6).

U udí má selén má dôležitú úlohu aj v duševnom zdraví. Súvisí to s narušením obratu niektorých neurotransmiterov po as Se-deficiencie. Mozgové tkanivá sú chudobné na katalázu a preto produkty peroxidácie ako H2O2 a primárne peroxidy musia by odstránené prevažne antioxida nými selenoenzýmami (7).

Prieskum ústavu preventívnej a klinickej medicíny potvrdil, že patríme ku krajinám s nízkym stavom selénu. Štúdie potvrdzujú, že udia s nízkou hladinou selénu majú až trojnásobne vyššie riziko onkologických a kardiovaskulárnych ochorení. Odporú ané denné množstvá pod a

160

WHO by mali by 50 – 200 Tg. Optimálne množstvo je 100. Prieskum v SR ukázal, že u nás je to od 46 – 77 Tg/l.

Nedostato ný prívod Se hospodárskym zvieratám zaprí i uje vznik po etných zdravotných porúch (nutri ná myodystrofia, exsudatívna diatéza a edémy hydiny a zdravotný stav mlie nejž azy). V poslednej dobe sa dostala do popredia otázka výhodnosti suplementácie k mnych zmesí pre hospodárske zvieratá prípravkami s organickou formou Se, namiesto doposia užívaného seleni itanu sodného. Prirodzené pozadie selénu tvorené Se-metionínom a Se-cysteínom bielkovín jednotlivých komponentov našich k mnych zmesí je na úrovni len cca 0,03 až 0,12 mg.kg-1 sušiny (skôr sa pohybuje v oblasti nižších hodnôt), o by znamenalo jeho výraznú deficienciu so všetkými následnými zdravotnými problémami. Preto sú v sú asnosti k mne zmesi u nás dotované seleni itanom sodným v množstve cca 0,2 mg Se na kg sušiny krmiva, ím sa dosahuje jeho takmer optimálny príjem. Základným rozdielom medzi anorganickými a organickými zlú eninami Se je schopnos z reva resorbovaného selenometionínu, ktorý pri nadbytku Se nie je použitý na syntézu selenoproteínov, zabudova sa do bielkovín svalov, pe ene, erytrocytov a podobne. Nahrádza tu oby ajný metionín, ktorý obsahuje v molekule síru, ke že tRNAMet ich nevie odlíši . Tým sa vytvára metabolická rezerva pre budúce prípadné stresy, ochorenia a tiež pre prenos Se cez selenometionín na mlá atá v reproduk ných procesoch.

Zdravotný stav mlie nej ž azy charakterizuje po et somatických buniek (PSB). Normálny PSB v mlieku sa pohybuje okolo 100 x 103/ml. Za normálnej situácie sú v mlieku bunky (epiteliálne bunky a krvné bunky, t.j. leukocyty a lymfocyty) podliehajúce prirodzenému odbúravaniu a ich náhrade. Ke na mlie nu ž azu pôsobia škodlivé vplyvy, ako chovate ské podmienky, chyby v dojení, infekcia rôznymi pôvodcami poprípade výživa, dochádza k zvýšenému prívodu týchto buniek a ich po et v mlieku sa silne zvyšuje. Vtedy PSB funguje ako kritérium poškodenia a obrannej reakcie mlie nej ž azy. Pod a STN 57 0529 (8) je rozhodujúcou hranicou 400 000 SB v 1 ml surového mlieka.

V experimentálnej asti príspevku popisujeme výsledky nášho výskumu, ktoré ukazujú, že prídavok organicky viazaného selénu do k mnej dávky zlepšuje zdravotný stav vemien dojníc a výrazne zvyšuje aj obsah selénu v mlieku.

Materiál a metódyCie om pokusu bolo zisti , i pri prídavku organického selénu do k mnej dávky dôjde

k zníženiu po tu somatických buniek v mlieku dojníc. Vlastný pokus sme zorganizovali v po nohospodárskom podniku s priemerným stavom

270 dojníc holštajnského plemena s priemernou dojivos ou 7540 kg na dojnicu. K mna dávka pre dojnice s dennou dojivos ou 30 l bola zostavená pod a požiadaviek správnej výživy dojníc, zodpovedala požiadavkám normy potreby živín pre danú kategóriu zvierat s uvedenou dojivos ou a bola doplnená nasledovným obsahom selénu:

- Se pokusná skupina 6,0 mg - Se kontrolná skupina 2,2 mg Selén vo forme Selplex Se (od firmy Alltech,Inc.) bol daný do premixu pod a odporu enia

UKSÚP. Do premixu, ktorý dodala firma Biofaktory. Selén bol v množstve 0,2 ppm v 1 kg k mnej zmesi v organickej forme ako Selenomethionin a Selenocystein. K milo sa krmným vozom a kravy zožrali krmivo bezo zvyšku. K mna zmes obohatená selénom bola podávaná skupine dojníc po otelení, teda vysokoproduk ným dojniciam.

Vzorky mlieka pre zistenie PSB sme odoberali od 44 dojníc ako kontrolná vzorka pred skrmovaním Se a potom 1., 2., 3., 5., 8. týžde vždy od tých istých zvierat. Ako kontrolné vzorky pre zistenie fyziologického poklesu PSB v priebehu laktácie sme odobrali individuálne vzorky mlieka od 40 dojníc v rovnakom ase po otelení. Prvý odber bol týžde po otelení, potom po 8 týžd och. Vzorky mlieka na stanovenie obsahu Se v mlieku sme odobrali od 10 dojníc pred podávaním Selplexu Se a potom v 3. a 8. týždni.

161

Výsledky a diskusiaTabu ka I dokumentuje PSB pri skupine dojníc pred za atím pokusu so skrmovaním Se

a v priebehu pokusu. Pred pokusom bol priemerný PSB 249,7 x 103/ml. Pri vlastnom pokuse sme zaznamenali znižovanie PSB od 1. týžd a po 8. týžde pokusu z priemerných 229,3 x 103/ml po 174,5 x 103/ml. Vo všetkých sledovaných týžd och bol pokles PSB oproti predpokusnému stavu vysoko preukazný (P<0,001). Celkový pokles PSB (obr. 1) bol o 30,13 %.

Tabu ka I Po et somatických buniek (PSB) v mlieku dojníc pred a po skrmovaní organického Se v k mnej dávke (tis./ml). n dojníc=44 Pred Se (0) 1. týžde 2. týžde 3. týžde 5. týžde 8. týždePSB priemer 249,7 229,3 211,0 202,0 184,4 174,5 Št. odchýlka 119,7 104,7 98,2 96,3 86,5 85,0 Max 529 432 405 503 418 399 Min 31 61 60 43 39 56 Párový t-test (P) 0,012 8,7E-05 0,001 9,31E-05 7,51E-06 Významnos

vo vz ahuk týžd u 0 ++ +++ +++ +++ +++

R2 = 0,991

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8

týždne skrmovania organického Se (Sel-Plex) dojniciam

PSB

(tis

/ml)

Obr. 1. Po et somatických buniek v mlieku v priebehu pokusu.

Je všeobecne známe, že pokles PSB závisí od asu po otelení, ím dlhší as, tým vä šípokles PSB. Preto sme vybrali druhú skupinu dojníc v danom stáde v rovnakom ase po otelení, kde nebol skrmovaný Se a výsledky sme porovnali. Pod a záznamov v tabu ke II vidíme, že dojnice v 1. týždni mali PSB 243,2 x 103/ml a po 8. týžd och 224,8 x 103/ml. Tento pokles bol síce štatisticky preukazný (P<0,05), ale bol len 7,57 %.

Tabu ka II PSB v mlieku dojníc bez pridania Se do k mnej dávky (tis/ml). n dojníc=40 1k.týžde 8k.týždePSB priemer 243,2 224,8 Št. odchýlka 109,0 99,1 Max 523 497 Min 53 56 Predmet porovnania 0 – 1k 1k – 8k+ 8 – 8k++

T-test (P) 0,828 0,043 0,006 Významnos - + ++

162

Preto, až po potvrdení uvedených pozorovaní, sme si dovolili konštatova , že pokles PSB pri skrmovaní organického selénu bol spôsobený práve týmto prvkom. V pokusnej aj kontrolnej skupine sme sledovali aj výskyt mastitíd. V skupine so selénom sme pre ochorenie mlie nej ž azy museli vyradi 4 dojnice. V kontrolnej skupine to však bolo až 9 dojníc. I v tomto prípade sa podávanie organického Se prejavilo lepším zdravotným stavom dojníc.

V neposlednom rade sme našim experimentom chceli overi , i skuto ne dochádza aj k zvýšeniu obsahu Se v mlieku. V tabu ke III uvádzame hodnoty obsahu selénu v mlieku pred jeho skrmovaním. Priemerná hodnota bola 0,048 mg/l. V 3. týždni podávania Se táto hodnota stúpla na 0,071 mg/l a v 8. týždni na 0,138 mg/l. Tento nárast predstavoval 48 % a 188 % oproti obsahu selénu v bežnom surovom kravskom mlieku (obr.2).

Tabu ka III Množstvo Se v mlieku pred a po skrmovaní Se v k mnej dávke dojníc ( mg/l ). n dojníc=10 Pred Se (0) 3. týžde 8. týždeSe priemer 0,048 0,071 0,138 Št. odchýlka 0,026 0,027 0,036 Max 0,09 0,1 0,21 Min 0,01 0,02 0,08 Párový T-test (P) 0,011 7,78E-06 Významnos

vo vz ahuk týžd u 0 +++ +++

y = 0.0419e0.1323x

0.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.20

0 1 2 3 4 5 6 7 8

týždne skrmovania organického Se (Sel-Plex) dojniciam

Se (m

g/l)

Obr. 2. Obsah Se v mlieku v priebehu pokusu.

Ú inky Se sú podobné i v alších štúdiách (9; 10) a potvrdzujú naše poznatky o znižovaní PSB. Uvedené výsledky potvrdzujú aj zahrani né pozorovania (5, 11); títo autori udávajú zvýšenie selénu v surovom kravskom mlieku 3 až 6 násobne.

Zvýšenie obsahu selénu v mlieku dáva možnos mliekarenským závodom uvažovao výrobe funk nej potraviny – tzv. Selénové mlieko, prípadne mlie nych výrobkov, ktoré by obsahovali nadštandardné množstvo selénu. Podobným produktom sú aj selénové vají kaz Novogalu, ktoré sú modernou, tzv. funk nou potravinou, vyrobenou pomocou špi kovýchbiotechnológií. Obsahujú nadštandardné množstvo selénu vo forme esenciálnej aminokyseliny selénometionínu, prírodnej a najlepšie biovyužite nej formy tohto pre život nevyhnutného mikroprvku. Skonzumovanie len dvoch selénových vají ok znamená prívod cca 55 g selénu, o predstavuje viac ako 70 % denného príjmu (75 g/de ) tohto mikroprvku

163

Pri pôdach chudobných na selén v celej Strednej Európe, zabezpe ujú bežné potraviny na Slovensku len jeho ve mi nízky príjem udskou populáciou (do 38 g denne), z oho zna náas nie je v metabolicky najvhodnejšej forme. Následkom deficientného príjmu selénu je zhoršený

zdravotný stav našej populácie. Selén má prostredníctvom svojich špecifických selénoenzýmov nezastupite nú funkciu pri antioxida nej ochrane organizmu pred vo nými radikálmi, pri vývoji a udržiavaní prirodzenej imunity vo i rôznym ochoreniam, ako aj v správnych funkciách štítnej ž azy a reproduk ných orgánov oboch pohlaví. Po etné plošné štúdie v celom svete preukázali jeho významnú úlohu v prevencii srdcovocievnych ochorení a vzniku nádorov prostaty, prsníka, p úc a hrubého reva. Selén sa podie a na udržiavaní duševného zdravia udí a tvorbou inertných zlú enín s ažkými kovmi znižuje ich toxicitu. Zásahom do mechanizmov oxida ného stresu má zvýšený príjem selénu pozitívny vplyv aj na zdravotný stav udí postihnutých reumatickými zápalmi k bov, astmou a zápalmi pankreasu.

ZáverUkon ený experiment jednozna ne ukázal, že skrmovanie organického selénu v množstve

0,2 ppm v k mnej zmesi znižuje dojniciam PSB v mlieku a zvyšuje obsah selénu v mlieku, o by mohlo by využité pre výrobu mlieka a mlie nych výrobkov so zvýšeným obsahom

organicky viazaného selénu. Funk né potraviny sú najvhodnejším spôsobom ako priviespotravinovým re azcom dostato né množstvo esenciálnych nutri ných látok vo vhodnej biovyužite nej forme pre naše telo.

Použitá literatúra:1. KÖHRLE, J.:Selenium in biology: facts and medical perspectives. Biol. Chem., 381, 9-10,

2000, s. 849-864 2. ARNER, E. S., HOLMGREN, A.:Physiological function of thioredoxin reductase. Eur. j.

Biochem., 267, 2000, s. 6102-6109 3. KVI ALA, J.: Status and selenium intake as related to the thyroid gland in the population.

Vnit . Lék., 52, 1996, s. 738-742 4. RAYMAN, M.G.: The importance of selenium to human health. Lancet, 15, 356, 2000, s. 233-

2415. EDENS, F.W.: Organic selenium : feathers to muscle integrity to drip loss. Five years onward :

no more sodium selenite. In: Biotechnology in the Feed Industry, 13th Animal Sympozium, Nottingham Univ. Press, 1996, UK, p.165

6. SCHRAUZER, G.N.: Anticarcinogenic effects of selenium. Cell. Mol. Life Sci., 57, 2000, s. 588-590

7. CASTANO, A.: Low selenium diet increases the dopamine turnover in prefrontal cortex of the rat. Neurochem. Int., 30, 1997, s. 549-555

8. STN 57 0529 „Surové kravské mlieko pre mliekarenské ošetrenie a spracovnaie, 1999. 9. HEMKEN, R.A.: Effect of source and level of copper and zinc and selenium on growth and

organ trace mineral levels in cow. J.Anim.Sci., 1998, 76, s. 2711-2718 10. WEIESS, W.P., HOGAN, J.S., TODHUNTER, D.A., SMITH, K.L.: Effect of vitamin E

supplementation in diets with a low concentration of Selenium on mammary gland health of dairy cows. J.Dairy Sci., 1997, 80: 1728

11. ALLAWAY, W.H., MOORE, D.P., OLDFIELD, J.E., MUTH ,O.H.: Movement of physiological levels selenium from soil through plants to animals. J.Nutr., 1996, 98, s. 411-418

Kontaktná adresa:Ing. Vladimír Foltys, PhD., Slovenské centrum po nohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, [email protected]

164

VLIV DOTACE KRMNÉ DÁVKY DOJNIC CHRÁN NÝMI ESENCIÁLNÍMI AMINOKYSELINAMI NA TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI MLÉKA.

erný Vladimír1, T ináctý Ji í2, Havlíková Šárka1, Kvasni ková Eva1, Hadrová Sylvie2

1Milcom a.s., Výzkumný ústav mlékárenský Praha, pracovišt Tábor, 2Výzkumný ústav pro chov skotu, pracovišt Poho elice

The influence of milk cow feeding ration with protected essential amino acids on the technological properties of milk.

Summary:Four lactating Holstein cows with ruminal and duodenal cannulas were used to examine the effect of added purified soya protein enriched by the amino acids lysine, methionin (experiment 1) and leucin (experiment 2) on the technological properties and composition of milk. Amino acids were fed in the form of rumen-protected tablets or in the powdered form. The most positive effect on the monitored technological parameters had the application of tablets containing the amino acids combination (lysine and methionin) under the experimental condition. Effect of protected amino acid leucin was lower than effect of amino acids methionin and leucin.

Ve dvou pokusech, každý provedený na ty ech laktujících holštýnských dojnicích, byl sledován vliv dopl ku AK lysinu, methioninu a kombinace AK lysinu a methioninu (pokus 1) a dále AK leucinu (pokus 2), podávaného ve form rumináln chrán ných tablet do krmné dávky dojnic, na technologické vlastnosti a složení mléka. Do každého pokusu byly za azeny 4 dojnice holštýnského typu se srovnatelnou užitkovostí. Dojnice byly individuáln ustájeny ve vazných stáních. Každý pokus byl rozd len do 4 period v délce 14 dní (každá perioda se skládala z 10 dnp ípravného období a 4 dn experimentálního období).

Krávy byly krmené individuáln dvakrát denn (v 7.00 a v 16.35 hod) ad libitum KD založenou na kuku i né siláži, vojt škové senáži a dopl kové sm si. Krmné dávky byly sestaveny tak, aby byla vyrovnaná energetická a bílkovinná pot eba1 i požadavek na zastoupení aminokyselin2. Aminokyseliny byly podávány ve form rumináln chrán ných tablet. Tablety byly aplikovány po celou periodu bezprost edn p ed krmením a to zamícháním do dopl kové krmné sm si dojnic.

B hem experimentálního období každé periody byla zaznamenána užitkovost dojnic a z každého dojení byly odebrány vzorky mléka k analýzám. Z každého experimentálního období (1x v každé period ) bylo odebráno cca 12 l mléka pro stanovení technologických parametra mikrobiologický rozbor mléka. Vzorky mléka byly bezprost edn po nadojení vychlazeny na teplotu cca 4 – 6 °C a p evezeny na pracovišt VÚM v Tábo e, kde byly následn uloženy v chladírn p i teplot cca 8°C a druhý den ráno zapo aly rozbory mléka. Každý vzorek mléka byl rozd len na 3 ásti :

1. dovezené mléko – je použito pro mikrobiologické rozbory a základní charakteristiku vzorkmléka,

2. odst ed né mléko - ást mléka je zbavena tuku odst ed ním. Toto mléko je po úprav jeho titra ní kyselosti na standardní hodnotu použito k hodnocení dalších vlastností syrového mléka. Tento postup umož uje eliminaci vlivu obsahu tuku v mléce i jeho rozdílné kyselosti na m ení základních technologických parametr mléka.

3. odst ed né pasterované mléko - ást mléka upraveného dle bodu 2 byla podrobena šetrné pasteraci p i teplot 65 °C po dobu 30 minut a jeho úprava i analytické, mikrobiologické a technologické zkoušky jsou opakovány.

Uspo ádání pokusu 1 Pokus 1 byl uspo ádán ve form latinského tverce 4x4 se ty mi úrovn mi faktoru – kontrola, lysin, methionin, methionin + lysin (Met + Lys). V první period dostávala dojnice . 1 kontrolní KD, dojnice . 2 lysin, dojnice . 3 methionin, dojnice . 4 Met+Lys. V každé další perioddocházelo k rotaci dojnic takovým zp sobem, aby se na každé dojnici vyskytly všechny úrovnfaktoru.

165

Uspo ádání pokusu 2 Pokus 2 byl uspo ádán ve form „cross-over“ designu se dv ma úrovn mi faktoru (kontrola a leucin) ve ty ech periodách. V první period dojnice . 1 a 3 – kontrola, dojnice . 2 a 4 – leucin. V každé další period docházelo k rotaci dojnic takovým zp sobem, aby se na každé dojnici vyskytly ob úrovn faktoru.

Analytické metody :Stanovení aktivní kyselosti pH metrem Stanovení titra ní kyselosti – roztokem NaOH o c(NaOH) 0,25 mol/l Stanovení obsahu sušiny mléka vážkovou metodou Stanovení tuku butyrometricky Stanovení tukuprosté sušiny výpo tem Stanovení obsahu celkového dusíku (TN) v mléce Kjeldahlovou metodou Stanovení obsahu nekaseinového dusíku (NCN) v mléce Kjeldahlovou metodou po srážení p i pH 4,6 – vyjád eno v procentech z celkového dusíku Stanovení obsahu kazeinu výpo tem jako rozdíl TN – NCN Stanovení obsahu vápníku v mléce komplexometricky Stanovení obsahu n kterých nízkých organických kyselin v mléce isotachoforeticky na kapilárním isotachoforetickém analyzátoru ZKI 01(Villa Labeco, Spišská Nová Ves)

Testy technologické:Kvasná zkouška dle SN 56 0101 Stanovení kysací schopnosti mléka - zjiš uje se kyselost mléka dosažená zao kováním

mléka. 1 % smetanové kultury a kultivací po dobu 4 hodin p i 30°C. P ed p ídavkem smetanové kultury se provede inaktivace mléka rychlým záh evem na 85°C s výdrží 5 minut a vychlazení na 30°C. Kontrola aktivity zákysu se stanoví soub žnou zkouškou za použití obnoveného mléka prostého inhibi ních látek. Minimální hodnota titra ní kyselosti dle SH je pro mléko s dobrou kysací schopností 10 ml NaOH/100 ml c(NaOH) 0,25 mol/l.

Stanovení sy itelnosti mléka - zjiš uje se as pot ebný ke koagulaci mléka (k okamžiku prvního srážení mléka) p i teplot 32°C po p ídavku 1% roztoku sy idla o koagula ní aktivit1:1000. Doba pot ebná ke sražení dobrého syrového mléka je 5 - 7 minut.

Stanovení pr b hu koagulace mléka a vytužování sý eniny na p ístroji MKM-1, který je obdobou p ístroje Laktodynamograf. Tuhost sý eniny je ur ena odporem, který je kladen kmitající membrán a je vyjád en hodnotou síly. Pr b h koagulace je popsán asem srážení /R/ a dobou od zasý ení do dosažení tuhosti odpovídající nár stu tlaku o 10 Pa /k10/ a o 20 Pa /k20 / a je vyjád enhodnotami p1, p2, pc.

Soub žn je využíváno vyhodnocení celého pr b hu vytužování sý eniny po dobu prvních 60 minut od zasý ení. Vyhodnocení této závislosti bylo pro názornost zpracováno do formy grafu.

Mléko dovezené do VÚM i mléko po jeho úpravách pro vlastní rozbory bylo kontrolováno po mikrobiologické stránce tak, aby byl vylou en potenciální vliv n kterých skupin mikroorganism na jeho chemické složení i na technologické vlastnosti. Kvalita syrového mléka byla vyrovnaná bez významn jších rozdíl a ani p i porovnání mikrobiologického složení mléka z pokusných a kontrolních náb r nebyly zjišt ny výrazn jší rozdíly.

Výsledky rozbor z pokusu 1 s chrán nými aminokyselinami Lysin a Methionin jsou shrnuty v tabulkách . Ia až Id, výsledky rozbor z pokusu 2 s chrán nou aminokyselinou leucin jsou shrnuty v tabulkách . IIa až IIc. Výsledky rozbor vztažených k jednotlivým dojnicím a ozna ených ísly od 1 do 4 jsou uvedeny v tabulkách . IIIa až IIIc a v obrázku .1 (dokumentuje vliv individuality dojnice na vytužování sý eniny) a obrázku .2 (dokumentuje vliv chrán ných amikokyselin použitých v pokusu 1 na vytužování sý eniny).

166

I. Výsledky pokusu 1 – chrán ná aminokyseliny LYS, MET a LYS+MET :

Tabulka Ia Rozbory dovezeného mléka - pr m ry podle typu krmení

Typ °SH pH Tuk Sušina Ca CB NCN Kazein Citrát Fosfáttablet (%) (%) mg/100g (%) (%) (%) mg/100g mg/100g

kontrola 6,6 6,70 2,59 9,12 126 3,02 0,70 2,32 181 222Methionin 6,4 6,70 2,13 9,09 125 3,05 0,71 2,34 173 216Lysin 6,5 6,72 1,75 9,16 127 3,27 0,75 2,53 174 224MET+LYS 6,5 6,71 1,86 9,16 120 3,12 0,72 2,40 178 217

Tabulka Ib Rozbory odst ed ného mléka - pr m ry podle typu krmení

Typ R P10 P20 R+P10 R+Pc Pc P1 P2 Sy itel. kysa katablet (s) (s) (s) (s) (s) (-) (-) (-) (s) (SH)

kontrola 428 648 882 1075 1958 1,02 0,50 0,52 416 17,1Methionin 408 616 832 1024 1857 1,12 0,55 0,56 399 17,0Lysin 404 595 788 998 1786 0,93 0,47 0,47 395 16,9MET+LYS 459 653 871 1112 1983 0,89 0,42 0,47 430 17,3

Tabulka Ic Rozbory odst ed ného pasterovaného mléka - pr m ry podle typu krmení


kontrola 535 931 1412 1466 2878 1,43 0,69 0,75 501 15,9Methionin 438 720 1036 1158 2194 1,41 0,66 0,75 402 16,5Lysin 436 666 921 1102 2023 1,09 0,52 0,57 424 17,1MET+LYS 460 714 998 1174 2172 1,15 0,55 0,60 440 17,0

Tabulka Id Prodloužení as a zm na koeficient vlivem pasterace (%)


1 kontrola 25,0 43,7 60,1 36,3 47,0 39,8 36,2 43,4 20,4 -7,02 Methionin 7,2 16,9 24,5 13,0 18,2 26,0 18,9 32,9 0,7 -2,93 Lysin 8,0 12,1 16,9 10,4 13,3 16,6 12,2 21,0 7,1 1,54 MET+Lys 0,2 9,4 14,6 5,6 9,5 29,6 30,4 28,9 2,4 -1,6

II. Výsledky pokusu 2 – chrán ná aminokyselina LEUCIN :

Tabulka IIa Rozbory dovezeného mléka - pr m ry podle typu krmení

krmeni Tuk Ca Citrát Fosfát kys. akt.typ °SH pH % mg/100g mg/100g mg/100g °SH

Leucin pr m r 6,13 6,75 3,09 117 168 219 14,8n=8 RSD 0,71 0,10 0,59 9 30 34 1,9

RSD % 11,65 1,47 19,19 8 18 16 12,9MIN 5,40 6,61 2,40 106 116 187 11,6MAX 7,30 6,91 4,20 132 215 281 17,8

kontrola pr m r 6,21 6,73 3,49 118 172 207 15,1n=8 RSD 0,56 0,04 0,93 6 21 25 1,9

RSD % 9,01 0,66 26,70 5 12 12 12,8MIN 5,40 6,68 2,15 106 135 173 12,2MAX 7,10 6,83 5,00 124 201 238 17,4

kyselost mléka

167

Tabulka IIb Rozbory odst ed ného mléka - pr m ry podle typu krmení

krmeni Sušina CB NCN Kazein Sy itelnos Kys.akt. Pc P1 P2typ % % % % s °SH - - -

Leucin pr m r 9,24 3,25 0,80 2,45 408 15,5 0,84 0,44 0,40n=8 RSD 0,06 0,11 0,03 0,10 98 1,8 0,07 0,04 0,07

RSD % 0,61 3,50 3,22 4,10 24 11,5 8,25 8,24 17,03MIN 9,13 3,05 0,74 2,26 318 13,2 0,76 0,37 0,32MAX 9,31 3,37 0,83 2,55 589 18,6 0,95 0,51 0,53

kontrola pr m r 9,19 3,21 0,79 2,42 427 15,5 0,87 0,47 0,40n=8 RSD 0,16 0,20 0,04 0,21 73 2,4 0,15 0,13 0,08

RSD % 1,77 6,14 5,28 8,51 17 15,6 17,57 26,61 19,32MIN 9,01 2,82 0,70 2,01 294 13,1 0,64 0,33 0,31MAX 9,55 3,46 0,85 2,61 539 19,2 1,13 0,75 0,52

Tabulka IIc Rozbory odst ed ného pasterovaného mléka - pr m ry podle typu krmení

krmeni Sušina CB NCN Kazein Sy itelnos Kys.akt. Pc P1 P2typ % % % % s °SH - - -

Leucin pr m r 9,23 3,28 0,76 2,52 434 15,6 0,99 0,49 0,50n=8 RSD 0,12 0,14 0,03 0,12 114 1,5 0,14 0,07 0,09

RSD % 1,30 4,36 3,37 4,88 26 9,9 13,81 13,32 18,02MIN 9,01 2,93 0,71 2,21 340 13,8 0,81 0,38 0,42MAX 9,39 3,43 0,80 2,65 723 18,4 1,23 0,59 0,66

kontrola pr m r 9,17 3,21 0,76 2,45 455 16,0 1,10 0,54 0,56n=8 RSD 0,18 0,18 0,03 0,18 66 1,4 0,17 0,09 0,12

RSD % 1,91 5,47 4,48 7,25 14 8,5 15,68 16,12 22,35MIN 8,93 2,86 0,69 2,10 362 13,8 0,78 0,37 0,41MAX 9,48 3,42 0,82 2,60 604 18,2 1,35 0,65 0,78

III. Vyhodnocení rozbor provedených v pokusu 2 podle jednotlivých dojnic :

Tabulka IIIa Rozbory dovezeného mléka - pr m ry podle jednotlivých dojnic

dojnice Tuk Ca Citrát Fosfát Kys.akt.íslo °SH pH % mg/100g mg/100g mg/100g °SH1 5,65 6,77 2,48 115 162 190 14,92 5,80 6,76 2,86 116 196 187 13,33 6,08 6,77 4,25 120 181 220 16,24 7,15 6,66 3,56 118 140 256 16,2

kyselost mléka

Tabulka IIIb Rozbory odst ed ného mléka - pr m ry podle jednotlivých dojnic

dojnice Sušina CB NCN Kazein Sy itelnos Kys.akt. Pc P1 P2íslo % % % % s °SH - - -1 9,22 3,17 0,78 2,39 365 14,8 0,87 0,50 0,362 9,18 3,29 0,80 2,48 355 15,3 0,82 0,47 0,353 9,32 3,21 0,81 2,40 406 16,7 0,76 0,39 0,374 9,13 3,26 0,79 2,46 543 15,3 0,96 0,45 0,51

168

Tabulka IIIc Rozbory odst ed ného pasterovaného mléka - pr m ry podle jednotlivých dojnic

dojnice Sušina CB NCN Kazein Sy itelnos Kys.akt. Pc P1 P2íslo % % % % s °SH - - -1 9,17 3,18 0,76 2,42 399 15,6 1,02 0,56 0,452 9,20 3,23 0,76 2,47 398 15,0 1,02 0,52 0,503 9,33 3,21 0,77 2,44 427 16,8 0,88 0,42 0,454 9,11 3,30 0,75 2,55 554 16,0 1,26 0,55 0,70

0

20

40

60

80

100

120

0 1000 2000 3000 4000

as (s)

tuho

st s

ýen

iny

(Pa)

P1

P2

P3

P4

Obr. .1 : vytužování sý eniny - pasterované odst ed né mléko od jednotlivých dojnic - kontrola

0

20

40

60

80

100

120

0 1000 2000 3000 4000

as (s)

tuho

st s

ýen

iny

(Pa)

1 MET+LYS

2 kontrola

3 methionin4 lysin

Obr. .2 : Vliv chrán ných aminokyselin na vytužování sý eniny - pasterované odst ed né mléko, dojnice .4

169

Shrnutí výsledk :Pr m rné hodnoty výsledk rozbor mléka od 4 dojnic z pokusu 1 a prezentovaných v tabulkách . Ia-Id lze shrnout do t chto bod :

- aplikace chrán ných aminokyselin methioninu, lysinu a methioninu spole n s lysinem nem lavliv na zm ny v titra ní a aktivní kyselosti mléka (P 0,05). Po podání tablet s lysinem byl patrný pozitivní vliv na n které ze sledovaných technologických parametr (tuk, sušina, celkový obsah N-látek, kaseinu, parametry popisující koagulaci mléka a vytužování vznikající sý eniny po zasý ení odst ed ného pasterovaného mléka). Zjišt né výsledky však nebyly statisticky pr kazné (P 0,05).

- nejmenší vliv pasterace mléka na zm nu parametr popisujících koagulaci mléka a vytužování vznikající sý eniny byl p i aplikaci tablet obsahujících lysin + methionin.

- výsledky rozbor vztažené na jednotlivé dojnice potvrzují významný vliv individuality dojnice na sledované technologické parametry (obr.1 a 2)

Pr m rné hodnoty výsledk rozbor mléka od 4 dojnic z pokusu 2 a prezentovaných v tabulkách . IIa-IIc lze shrnout do t chto bod :

1. dovezená mléka od dojnic krmené KD s dotací tabletovaným leucinem m la mírn nižší kyselost ( 0,08 °SH, 0,02 pH), kysací aktivitu (0,3 °SH) i hodnotu p ír stku kysací aktivity vztažené ke kontrolnímu m ené na obnoveném mléce ( 0,8 °SH), výrazn nižší obsah tuku (0,4 %) a mírn vyšší obsah fosfátu ( 12 mg/100g),

2. odst ed ná mléka od dojnic krmené KD s dotací tabletovaným leucinem m la mírn vyšší obsah tukuprosté sušiny (0,05 %), celkových bílkovin ( 0,04 %), nekazeinového dusíku (0,01 %), kazeinu (0,03 %), lepší sy itelnost (19 s), i hodnoty Pc, P1 a P2 popisujících vytužování sý eniny.

3. Pasterovaná odst ed ná mléka od dojnic krmené KD s dotací tabletovaným leucinem vykazují obdobnou charakteristiku jako mléka odst ed ná a rozdíly jsou o n co vyšší,

4. Vypo ítané hodnoty sm rodatné odchylky i rozdíly mezi maximální (MAX) a minimální (MIN) hodnotou pro jednotlivé analyty jsou vysoké a ukazují, že intervaly hodnot se u všech analytp ekrývají. Z toho je možno dovozovat, že zjišt né rozdíly je možno pro tento soubor dat považovat za statisticky nevýznamné a na souboru dat se projevují další vlivy, nap . individualita dojnice.

Soubor výsledk z pokusu 2 vztažený na individuální dojnice je uveden v tabulkách . IIIa – IIIc : 5. Takto zpracované výsledky ukazují na výrazný vliv individuální charakteristiky dojnic,

který následn zp sobuje p i statistickém zpracování nam ených dat velkou hodnotou sm rodatné odchylky a vysv tlují i výrazné rozdíly mezi maximální a minimální nam enouhodnotou jednotlivých analyt . Tato skute nost se markantn projevuje nap . u tu nosti mléka nebo sy itelnosti ( rozdíl je 1,77 % resp. 188s ).

6. Tyto výsledky jsou i v souladu v výsledky získanými v pokusu 1 a prezentovaných na obrázcích .1 a .2.

Použitá literatura:1. Sommer A. et al., 1994. Nutrient Requirement and Tables of Nutritional Values of Feedstuffs

for Ruminants. Editor Research Institute of Animal Nutrition Poho elice, 198 p. 2. Rulquin H., 2001. Acides aminés digestibles dans l´intestin. INRA Prod. Anim. 14, 275-278

Práce vznikla za finan ní podpory grantu MZe NAZV 1B44037.

Kontaktní adresa:Ing. Vladimír erný, MILCOM a.s., VÚM Praha, e-mail : v.cerny @vum-tabor.cz

170

OBSAH HYDROXYMETHYLFURFURALU A P ÍBUZNÝCH LÁTEK V MLÉCE Bartáková Klára, Borkovcová Ivana, Vorlová Lenka, Kr ková Lucie, Chocholá ová Markéta

Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie,Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Content of hydroxymethylfurfural and related compounds in milk

Summary:In this study was determined content of hydroxymethylfurfural (HMF) and related compounds (furfural (F), methylfurfural (MF) and furylmethylcetone (FMC)) in ultra-high-temperature-treated (UHT) milk. The samples of milk were sorted according to fatness (fat-extracted milk – 8 samples, half-fat milk – 10 samples, whole milk – 4 samples). Furfural compounds content was determined using RP-HPLC with UV detection. HMF contents ranged from 21.2 to 66.8 g.(100 ml)-1, F contents ranged from 1.0 to 9.8 g.(100 ml)-1. No MF and FMC were detected in the analysed samples. It was found that fat content in milk did not influence neither HMF content nor F content.

ÚvodHydroxymethylfurfural (HMF) je cyklický aldehyd, který je uznávaným indikátorem

kvality potravin z hlediska nadm rné tepelné úpravy, skladování nebo i jejich falšování. Názory na jeho cytotoxické, genotoxické a karcinogenní ú inky doposud nejsou jednotné, ale jisté je, že p ítomnost HMF zhoršuje organoleptické vlastnosti a nutri ní hodnotu potravin. P ítomnostHMF v medu je dlouhodob známa a je podchycena jak v legislativ národní, tak i mezinárodní. HMF je p ítomen v celé ad dalších potravin, které obsahují sacharidy v kyselém prost edí anebo p i jejichž technologickém opracování probíhá Maillardova reakce. Koncentrace HMF v t chtopotravinách m že dosahovat významných hodnot. V mléce m že HMF vznikat dv ma cestami – z Amadoriho slou enin, které jsou meziprodukty Maillardovy reakce, v p ítomnosti aminoslou enin nebo izomerizací laktózy. HMF je první furfuralová slou enina vznikající v pr b hu Maillardovy reakce. V dalších krocích Maillardovy reakce mohou z HMF vznikat další látky, jako je furfural (F), methylfurfural (MF) a furylmethylketon (FMC).

Materiál a metodikaMateriál

Analyzované vzorky UHT mléka byly zakoupeny na p elomu let 2006 a 2007 v tržní síti eské republiky a p edstavují r zné druhy mléka vyskytující se na pultech brn nských obchod ,

supermarket a hypermarket . Vyšet ená mléka byla rozd lena podle tu nosti do t í skupin (odtu n né – 8 vzork , polotu né – 10 vzork , plnotu né – 4 vzorky).

MetodikaObsah HMF a jemu p íbuzných látek (furfuralu, methylfurfuralu a furylmethylketonu) byl

stanoven pomocí metody HPLC, která byla zavedena na základ již používané metody pro stanovení HMF v medu. P íprava vzorku byla provedena na základ postupu uvedeného v publikaci autor Ferrer et al. (2000)1 – 15 ml mléka bylo inkubováno s kyselinou š avelovouve vroucí vodní lázni, poté byla p idána kyselina trichloroctová a sm s byla dvakrát t epána a odst e ována. V získaném supernatantu byl HMF a jemu p íbuzné látky stanoven pomocí kapalinového chromatografu Breeze firmy Waters (USA), který byl složen z n kolika modul(717 plus Autosampler, 1525 Binary HPLC Pump a 2487 dual Absorbance Detector). K separaci byla využita kolona ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4,6 150 mm, 5 m), mobilní fází byla voda a methanol v pom ru 90:10 v izokratickém režimu za pr toku mobilní fáze 1,0 ml.min-1. Teplota na kolon byla 30 °C, objem nást iku 20 l. Detekce prob hla v UV oblasti p i vlnových délkách 285 nm pro hydroxymethylfurfural a furfural, 274 nm pro furylmethylketon a 293 nm pro methylfurfural.

Statistické vyhodnocení bylo provedeno v programu Microsoft Excel 97.

171

Výsledky a diskuseValida ní parametry HPLC metody

Nov zavedená HPLC metoda pro stanovení HMF a jemu p íbuzných látek v mléce byla nejprve validována, p i emž byla stanovena mez detekce metody pro všechny ty i látky 0,17 g.(100 ml)-1. Co se tý e opakovatelnosti metody - p i pr m rné hodnot HMF 80,25 g.(100 ml)-1 v zah átém vzorku mléka byla SD 4,69 g.(100 ml)-1 a RSD 5,8 % a p i pr m rné hodnot F 2,95 g.(100 ml)-1 v zah átém vzorku mléka byla SD 0,43 g.(100 ml)-1

a RSD 14,7 %. Obsah dalších dvou stanovovaných látek se pohyboval pod mezí detekce metody.

Obsah HMF a p íbuzných látek v mléce Zjišt ný obsah HMF a F v mléce je uveden v tabulce I a na obrázcích 1 a 2. Obsah dalších

dvou stanovovaných látek (methylfurfural a furylmethylketon) se v analyzovaných vzorcích mléka pohyboval pod mezí detekce metody. Na obrázcích 3 a 4 jsou ukázky chromatogram standardvšech ty stanovovaných látek a vzorku mléka.

Z tabulky I je z ejmé, že obsah HMF se v analyzovaných vzorcích mléka pr m rnpohyboval v hodnotách 34,9 11,8 μg.(100 ml)-1 a obsah F v hodnotách 2,4 1,8 μg.(100 ml)-1.Zjišt né množství HMF ádov odpovídá obsahu HMF ve špan lských vzorcích mléka (21,7 – 66,4 μg.(100 ml)-1) analyzovaných autory Ferrer et al. (2000)1. Tito auto i však v žádném vzorku mléka nedetekovali p ítomnost furfuralu, methylfurfuralu ani furylmethylketonu.

Z tabulky I a z obrázk 1 a 2 je z ejmé, že obsah tuku v mléce nemá vliv na množství HMF ani na množství F. Z ejm jiné vlivy než tu nost mohou ovliv ovat tvorbu HMF a F v tepelnošet eném mléce, protože analyzované vzorky mléka pocházely od r zných výrobc z eskéi Slovenské republiky. Jak je vid t z obrázk 1 a 2, ve dvou r zných vzorcích mléka o stejné tu nosti se obsah HMF nebo F m že trojnásobn nebo i vícenásobn lišit.

Tabulka I Obsah hydroxymethylfurfuralu (HMF) a furfuralu (F) v analyzovaných vzorcích mléka.

HMF [μg.(100 ml)-1] F [μg.(100 ml)-1]mléko

pr m r sm rodatnáodchylka pr m r sm rodatná

odchylkaodtu n né (n = 8) 32,2 13,9 2,1 1,1

polotu né (n = 10) 37,8 11,2 2,8 2,4

plnotu né (n = 4) 34,0 2,7 1,9 0,1

všechny vzorky (n = 22) 34,9 11,8 2,4 1,8

172

Obr. 1. Obsah hydroxymethylfurfuralu (HMF) v analyzovaných vzorcích mléka.

Obr. 2. Obsah furfuralu (F) v analyzovaných vzorcích mléka.

AU

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

Minutes1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00

0.51

7

HM

F - 4

.824

F - 6

.001

FMC

- 12

.958

MF

- 16.

227

Obr. 3. Ukázka chromatogramu standard hydroxymethylfurfuralu (2.pík), furfuralu (3.pík), furylmethylketonu (4.pík) a methylfurfuralu (5.pík).

0

10

20

30

40

50

60

70

odtu n né polotu né plnotu né

HM

F [

g.(1

00 m

l)-1]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

odtu n né polotu né plnotu né

F [

g.(1

00 m

l)-1]

173

Obr. 4. Ukázka chromatogramu vzorku mléka – poslední pík je HMF (menší obrázek je zv tšená ást chromatogramu s viditelnými píky hydroxymethylfurfuralu (1.pík) a furfuralu (2.pík)).

HMF v mléce a v jiných potravinách Porovnáním zjišt ného obsahu HMF v mléce s již d íve stanoveným obsahem HMF

v medu a v ovocných a zeleninových výrobcích jsme zjistili, že p íjem HMF z mléka není nikterak vysoký. Obsah HMF v medu se m že pohybovat v závislosti na stá í medu v rozmezí 0 – 66,1 mg.kg-1, v ovocných sirupech a džusech byl zjišt n obsah HMF v rozmezí 0 – 27,3 mg.kg-1,v džemech 4,5 – 159,6 mg.kg-1 a v ke upech 0,8 – 189,8 mg.kg-1. Tato množství HMF jsou ve v tšin p ípad vyšší než koncentrace HMF zjišt ná v UHT mléce (0,212 – 0,668 mg.l-1)2,3.

HMF a zdravotní riziko? I když je HMF považován za potenciální karcinogen, bylo zjišt no, že p i obvyklé denní

dávce kolem 1 mg.kg-1 t lesné hmotnosti nehrozí pro lov ka nebezpe í. Škodlivý efekt nebyl pozorován až do dávky 80 mg.kg-1 t lesné hmotnosti4. Z této informace je z ejmé, že p i b žnémtepelném opracování potravin, u kterých to technologický proces vyžaduje, se z hlediska obsahu HMF není t eba obávat zdravotního rizika. Proto není nutné uvažovat o legislativním ošet ení obsahu HMF v potravinách, u kterých se p edpokládá vznik HMF v d sledku technologického procesu. Zcela jinak je tomu však u medu, kde jakékoliv tepelné ošet ení není žádoucí, ba naopak každé zah átí snižuje nutri ní hodnotu medu. Proto v legislativ týkající se medu je zakotvena limitní hodnota pro obsah HMF (40 mg.kg-1) jako indikátor nežádoucího tepelného ošet ení a jiných zp sob porušení medu5.

Záv rTato studie byla pilotní ve stanovení obsahu HMF a jemu p íbuzných látek v mléce

vyskytujícím se v tržní síti eské republiky. Cílem bylo zjistit, v jakých hladinách se HMF a zárove jemu p íbuzné látky v eském mléce nacházejí a z toho vyplývající p ípadné riziko pro zdraví lov ka. Bylo zjišt no, že p íjem HMF z mléka není nikterak vysoký, protože v jiných druzích potravin se HMF pohybuje v hodnotách i o n kolik ád vyšších.

Práce byla financována z prost edk Výzkumného zám ru „Veterinární aspekty bezpe nosti a kvality potravin“ MSM6215712402.

Použitá literatura:1. FERRER, E., ALEGRÍA, A., COURTOIS, G., FARRÉ, R. High-performance liquid chromato-

graphic determination of Maillard compounds in store-brand and name-brand ultra-high-temperature-treated cows´ milk. Journal of Chromatography A, 2000, Vol. 881, p. 599-606.

AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

Minutes1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00

0.30

0

3.86

9

HM

F - 4

.773

AU

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

Minutes4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00 7.20 7.40 7.60

HM

F - 4

.797

F - 5

.970

6.33

8

174

2. KALÁBOVÁ, K., VORLOVÁ, L., BORKOVCOVÁ, I., SMUTNÁ, M., VE EREK, V. Hydroxymethylfurfural in Czech honeys. Czech Journal of Animal Science, 2003, Vol. 48, p. 551-557.

3. VORLOVÁ, L., BORKOVCOVÁ, I., KALÁBOVÁ, K., VE EREK, V. Hydroxymethylfurfural contents in foodstuffs determined by HPLC method. Journal of Food and Nutrition Research, 2006, Vol. 45, p. 34-38.

4. POTRAVINÁ SKÉ AKTUALITY – výživa, trendy v potraviná ství, legislativa. Ústavzem d lských a potraviná ských informací Praha, 2001, No. 0/2001, p. 11.

5. VYHLÁŠKA . 76/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro p írodní sladidla, med, cukrovinky, kakaový prášek a sm si kakaa s cukrem, okoládu a okoládové bonbony. Sbírkazákon , 2003, ástka 32, s. 2470-2487.

Kontaktní adresa:Ing. Klára Bartáková, Ph.D.; Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1-3, 612 42 Brno [email protected]

175

HPLC ANALÝZA SACHARIDOV A ORGANICKÝCH KYSELÍN V MLIE NYCHPRODUKTOCH

Greifová Mária, Greif Gabriel, Kraj ová Eva, Karovi ová Jolana, Schmidt ŠtefanÚstav biotechnológie a potravinárstva FCHPT-STU v Bratislave, Slovenská republika

HPLC estimation of saccharides and organic acids in milk products

Summary:A new HPLC method was issued by AOAC and accepted by IDF for estimattion of saccharides (galactose, glucose, lactose) and organic acids (lactic, acetic) in milk products. We estimated lactose, galactose and lactic acid by this method using ionex column in H+ cycle and RI detector. Estimation of lactose and other sugars has a great importance from both the methodic and nutritional points of view.

Laktóza je najvýznamnejší sacharid mlieka. Skladá sa z -D-galaktopyranózya -D-glukopyranózy, ktoré sú spojené (1-4) glykozidovou väzbou.

O

CH2

OH

OH

OH

O

HO O

OH

OH

CH2HO

OH

1

4

Obr. 1. Laktóza

Laktóza sa syntetizuje v bunkách mlie nych žliaz cicavcov a je nevyhnutná vo výžive mladých jedincov. Je ahko strávite ná a zárove je vhodným zdrojom energie.

Mlie ny cukor, oproti ostatným sacharidom z rastlinných surovín ( sacharóza – repný alebo trstinový cukor, glukóza – dextróza), má niektoré odlišné fyzikálne i fyziologické vlastnosti. Laktóza má výrazne nižšiu sladivos než sacharóza alebo glukóza. Vysoká sladivos rastlinných sacharidov sa javí v porovnaní s laktózou ako negatívna vlastnos .

Laktóza má osobitnú úlohu v rannom období mlá a a ako zdroj glukózy a galaktózy. Samotná glukóza predstavuje ve mi dôležitú zložku krvi a zárove slúži aj ako stavebná zložka glykogénu. Galaktóza je nepostrádate ná najmä pri formovaní nervových tkanív a pozitívne ovplyv uje reguláciu telesnej teploty a reguláciu pohybu riev. Okrem toho priaznivo vplýva na absorpciu a využitie vápnika v tele, o má význam pri raste kostí. V závislosti od živo íšneho druhu je koncentrácia laktózy v mlieku 0-7%.

Laktóza v neposlednom rade je zdrojom uhlíka pre kyslomlie ne baktérie v procese mliekarenskej technológie[1, 2].

Cie prácePomocou HPLC metódy stanovi sacharidy (galaktóza, glukóza, laktóza) a organické kyseliny (hlavne k. mlie na) v rôznych mlie nych výrobkoch. Metóda zah a stanovenie sacharidov a organických kyselín na ionexovej kolóne v H+ cykle pri použití RI detektora.

Materiál a metódaZoznam testovaných výrobkov je uvedený v tabu ke I.Výrobky boli zakúpené na tuzemskom trhu a boli testované pred vypršaním expira nej doby.

176

Tabu ka IZoznam testovaných výrobkov

íslo vzorky Názov vzorky 1 acidko 2 jugurt probio biely 3 zakysanka 4 Bryndza zimná balená 5 bryndza zimná vážená 6 mini Monika natierka 7 Eidamská tehla 8 Parenica údená 9 Paladin Edelp 10 nátierka 11 kidiboo – tavený syr 12 tavený syr bryndzauer 13 encián 14 syrové nite slané údené 15 vrchár 16 eidam tehla 17 domáci erstvý syr (kravský) 18 syrové slané nite 19 mlieko polotu né

Úprava vzorky:Naváži sa 30 g zhomogenizovanej vzorky, extrahuje 30 ml deionizovanej vody (30 min)

a vy íri sa 5 ml roztoku Carrez I a 5 ml roztoku Carrez II. Po premiešaní sa obsah odmernej banky doplní do 100 ml deionizovanou vodou. Po 5 min. státia sa obsah banky prefiltruje cez skladaný filter. Pred dávkovaním na kolónu sa filtrát ešte raz prefiltruje cez mikrofilter (0,22 m).

Podmienky HPLC metódy [3]Vysokotlaková pumpa DeltaChromTM SDS 030;Dávkova : LCI 30, dávkovacia slu ka 20 lKolóna: Polymer IEX H+ cyklus 300 x 8 mm DeltaChrom TM Temperature Control Unit (40 ± 0,1 °C) Mobilná fáza: 9 mM H2SO4; Prietok mobilnej fázy: 1 cm3. min-1;Detektor: K-2301 KNAUER

177

VýsledkyObsah sacharidov a kyseliny mlie nej vo vybraných mlie nych výrobkoch zakúpených v obchodnej sieti je uvedený v tabu ke II.

Tabu ka IIObsah sacharidov a kyseliny mlie nej vo vybraných mlie nych výrobkoch.

Obsah laktózy Obsahgalaktózy

Obsah kys. mlie nejv z o r k a n

(g/100g)1. acidko 3 3,19-3,35 0,04-0,06 0,71-0,78 2. jugurt probio biely 3 2,44-2,62 0,78-0,86 0,91-0,98 3. zakysanka 3 2,92-3,12 0,03-0,05 0,66-0,73 4. bryndza zimná balená 3 0,39-0,42 0,13-0,15 1,35-1,41 5. bryndza zimná važená 3 0,45-0,49 0,02-0,04 1,28-1,33 6. Monika – nátierka 3 2,98-3,25 0,50-0,59 0,56-0,64 7. eidamská tehla 3 0,19-0,21 ND 0,75-0,83 8. parenica údená 3 0,12-0,18 0,07-0,1 1,19-1,29 9. paladin Edelp 3 0,37-0,41 0,15-0,19 1,06-1,13 10. nátierka 3 4,44-4,67 0,49-0,52 0,76-0,85 11. tavený syr kidiboo 3 2,15-2,35 0,03-0,05 0,43-0,47 12. tavený syr bryndzauer 3 1,33-1,46 0,04-0,06 0,86-0,95 13. encián 3 ND ND 0,05-0,07 14. syrové nite slané údené 3 0,65-0,73 0,05-0,07 0,71-0,79 15. vrchár 3 0,17-0,20 ND 1,33-1,42 16. eidam tehla 3 0,22-0,32 ND 1,04-1,09 17. domáci erstvý syr (kravský) 3 2,51-2,57 ND 0,01-0,04 18. syrové slané nite 3 0,27-0,32 ND 1,59-1,66 19. mlieko polotu né 3 4,18-4,25 ND ND

ND – nedetekovate né množstvo

DiskusiaV práci boli uvedenou metódou analyzované rôzne vzorky mlie nych výrobkov na obsah

sacharidov a kyseliny mlie nej. Chromatografický záznam štandardov je uvedený na obr. 2 a vzorky „zakysanka“ na obr. 3.

Stanovenie laktózy a alších cukrov v týchto výrobkoch má ve ký význam z metodického aj z výživového h adiska. Laktóza sa odlišuje od rastlinných sacharidov (sacharózy, glukózy, fruktózy, maltodextrinu, škrobu) tiež tým, že k jej tráveniu dochádza až v revách. Trávenie rastlinných sacharidov za ína už v ústnej dutine po zmiešaní potravy so slinami. Tu môžu bypotravou pre baktérie, ktoré sa v nej vyskytujú. Môžu podporova ich množenie a tým podporovavznik zubného kazu.

Iná situácia je pri trávení laktózy. Laktóza prechádza ústnou dutinou, žalúdkom a až v revách, kde sa nachádzajú baktérie produkujúce príslušný enzým - laktázu, dochádza k rozkladu laktózy na základné zložky ( glukózu a galaktózu) a ich vstrebávanie.

Existuje však skupina udí, ktorá nie je vybavená týmto enzýmom. Hovoríme vtedy o intoleráncií (neznášanlivosti) laktózy. Nestrávená laktóza sa v hrubom reve rozkladá za vzniku plynných substancií (metán, vodík) a štiepnych produktov (kyselina mrav ia, kyselina octová, formaldehyd), ktoré pôsobia ve mi dráždivo na sliznicu reva. Intoleranciou laktózy trpí 70-90 % obyvate ov Afriky, Ázie a Stredomoria. U európskej populácii je situácia omnoho priaznivejšia.

178

[min.]Time

0 5 10 15 20 25

[mV]Vo

ltage

-50

0

50

100

150

2

5

1

3

4

67

E:\CVIKO\STANDARD 1CE:\cviko\Zmes Lak+KC+Glu+KP+KO

Obr. 2. Chromatogram štandardov: laktóza (1), kyselina citrónová (2), glukóza (3), galaktóza (4), kyselina mlie na (5), kyselina octová (6), kyselina propiónová (7)

Obr. 3. Chromatografický záznam sacharidov: laktóza (Lak), galaktóza (Gal) a organických kyselín: kyselina citrónová (KC), kyselina mlie na (KM) a kyselina octová (KO) vo vzorke zakýsanka

179

Len 10-15 % belochov sa musí vyhýba z tohto dôvodu konzumácii mlieka. Nedostatok enzýmu laktázy môže by vrodený, ale môže by aj dôsledkom niektorých ochorení, napr. gastroenteridíty alebo celiakie. U asti dospelých jedincov klesá aktivita laktázy s vekom. S intoleranciou laktózy sa stretávame preto skôr u dospelých vo veku nad 25 rokov, ale postihuje aj doj atá. Lie ba pozostáva z obmedzenia laktózy a povo ujú sa iba kyslomlie ne výrobky. V týchto sa trávenie nezastavuje, ale spoma uje a pomáhajú k tomu prítomné baktérie.

V zahrani nej literatúre sa konštatuje, že obsah laktózy do 20 g/l nespôsobuje problémy. Preto je ve mi dôležité vedie stanovi obsah laktózy vo finálnom výrobku.

Táto práca bola podporená grantom VEGA 1/2392/05; VEGA 1/3546/06.

Literatúra1. Cataldi T.R.I., Angelotti M., Bianco G.: Determination of mono- and disaccharides in milk and

milk products by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Analytica Chimica Acta, 485, 43–49 (2003)

2. Ferreira I.M.P.L.V.O., Gomes A.M.P., Ferreira M.A.: Determination of sugars, and some other compounds in infant formulae, follow-up milks and human milk by HPLC-UV/RI. Carbohydrate Polymers, 37 225–229 (1998).

3. ISO/DIS 22662 | IDF 198, International Organization for Standardization and International Dairy Federation: Milk and milk products — Determination of lactose content by high-performance liquid chromatography (Reference method) 2005

Kontaktná adresa:Ing. Mária Greifová, PhD., FCHPT STUv Bratislave, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovensko, e-mail: [email protected]

180

HODNOCENÍ FYZIKÁLN -CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ SÝRS NÍZKODOH ÍVANOU SÝ ENINOU POMOCÍ FT-NIR

Dra ková Michaela1, e uchová Mirka1, Hadra Luboš2, P idalová Hana1, Navrátilová Pavlína1, Janštová Bohumíra1, Vorlová Lenka1

1Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2Bioveta, a.s.

Determination of physical and chemical properties in low scalded cheese by FT-NIR

Summary:The aim of this study was to determine the physical and chemical properties (fat in solids, total solids and fat content, titratable acidity, water and NaCl content) of low scalded cheese by FT-NIR spectroscopy. A set of 100 samples Edam type of cheese were purchased in various grocery stores in the Czech Republic. The instrument was calibrated by partial least squares (PLS) method. Spectra were measured in the reflectance mode with a compressive cell between 10000 and 4000 cm-1, averaging 100 scans. The calibration models were developed and evaluated by statistical values. The best results were obtained for total solids: correlation coefficient R = 0.965 and standard error of calibration SEC = 0.774. A reliable calibration model for total solids, aw and NaCl content were developed. Good calibration levels were obtained for fat and fat in solids contents. Cross validation were pointed out the applicability of NIR spectrometer for the determination of basic components. FT-NIR presents thus a viable technique for rapid cheese analysis.

ÚvodSpektroskopie v blízké infra ervené oblasti s Fourierovou transformací (FT-NIR)

a statistické softwary zvyšují možnosti fyzikáln -chemické analýzy potravin a krmiv. Tato technika nahrazuje laboratorní a asov náro né konven ní metody. Oproti tradi ním chemickým metodám nabízí NIR spektroskopie adu výhod. Jedná se o fyzikální, nedestruktivní metodu, kde p íprava vzork je minimalizována nebo zcela eliminována. Další výhody p edstavují úspora práce, asu a materiálu, snadná obsluha a možnost m ení vzork i p es transparentní obaly. Jedno spektrum je použitelné ke kvalitativní analýze i kvantitativnímu stanovení více složek.1,2

NIR spektroskopie je široce používanou technikou pro stanovení fyzikáln -chemických parametr sýr . V sou asné dob má také zna nou perspektivu p i kontrole výroby sýr .Stanovením fyzikáln -chemických parametr (tuk, bílkoviny, sušina atd.) v sýrech pomocí NIR spektroskopie se zabývala ada autor .3,4 Tato metoda byla použita také k sledování vlhkosti, pH a senzorických vlastností.5,6

Cílem práce bylo vytvo it kalibra ní modely pro stanovení fyzikáln -chemických parametr sýr s nízkodoh ívanou sý eninou pomocí FT-NIR spektroskopie.

Materiál a metodikaVzorky sýr (100 ks) s nízkodoh ívanou sý eninou (eidamského typu) pocházely z r zných

prodejen z tržní sít eské republiky. Ve vzorcích byly stanoveny obsahy tuku v sušin , sušiny, tuku, titra ní kyselost ( SN 570107, 1965)7 a obsah NaCl ( SN 570107- ást 12, 1980)8. Aktivita vody byla stanovena pomocí aw-metru Thermoconstanter TH 200 (Novasina, Švýcarsko).

Vzorky byly p ed stanovením homogenizovány mletím. Vzorky sýr byly prom enyna spektrometru NIR Nicolet Antaris (Thermo electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu 10000 – 4000 cm-1 se 100 scany. as snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla m ena na integra ní sfé e v režimu reflektance s kompresní kyvetou. Nam ená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze 6.2.1.509 (Thermo Elektron Corporation, Madison, USA) metodou PLS ( áste ných nejmenších tverc ). Stejné vzorky byly použity pro k ížovou validaci. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí statistického a grafického softwaru STAT Plus. Pro srovnání hodnot nam ených pomocí FT-NIR s hodnotami zjišt nými v laborato ibyl použit párový T-test.9

181

Výsledky a diskuseU vzork byly stanoveny parametry: obsah tuku v sušin , sušiny, tuku, titra ní kyselost,

aktivita vody a obsah NaCl. Rozp tí referen ních hodnot pro sledované parametry byly vyjád eny jako sm rodatné odchylky pr m ru (tab. I.). Odlehlé standardy, u kterých byly nep esn stanoveny referen ní hodnoty nebo se objevila spektrální odchylka ve zm eném spektru, byly odst ed nypomocí diagnostických nástroj Spectrum Outlier a Leverage.

Tabulka I Referen ní hodnoty parametr n x min max SD Tuk v sušin (%) 99 38,18 18,43 79,00 10,78 Sušina (%) 100 52,75 42,86 61,69 3,06 Tuk (%) 97 20,23 9,92 42,00 5,77 Titra ní kyselost (ºSH) 100 66,45 28,50 85,00 8,09 Aktivita vody 95 0,974 0,954 0,990 0,008 NaCl (%) 100 1,90 1,03 3,02 0,37

n – po et vzork , x - pr m r, min a max – minimální a maximální hodnota, SD – sm rodatná odchylka

Tabulka IIKalibra ní a valida ní výsledky

kalibrace validace parametr n PLS

faktory R SEC CCV(%) R SECV PCV

(%)Tuk v sušin (%) 81 4 0,936 2,67 7,23 0,915 3,05 8,26 Sušina (%) 95 10 0,965 0,77 1,46 0,950 0,92 1,74 Tuk (%) 84 5 0,972 1,17 6,06 0,951 1,54 7,97 Titra ní kyselost (ºSH) 74 5 0,942 2,22 3,26 0,742 4,48 6,58 Aktivita vody 67 9 0,985 0,001 0,12 0,735 0,005 0,46 NaCl (%) 86 10 0,991 0,04 2,02 0,906 0,12 6,66

R – korela ní koeficient, SEC – sm rodatná odchylka kalibrace, SECV – sm rodatná odchylka validace, CCV – kalibra ní varia ní koeficient, PCV – predik ní varia ní koeficient, n – po et vzork po odstran níodlehlých standard

Kalibra ní modely pro všechny sledované parametry byly vytvo eny pomocí PLS algoritmu. PLS využívá u vyšet ených vzork spektrální a sou asn koncentra ní informaci ke stanovení latentních prom nlivých (PLS faktor ) v souboru dat.5 U všech vytvo ených kalibra ních model byl zvolen maximální po et PLS faktor 10. Nejvyšší po ty faktor byly zjišt ny pro sušinu a NaCl (10). Nejmenší po et PLS faktor (4) byl nalezen pro obsah tuku v sušin . Stejný po et PLS faktor získali také další auto i.10 Všechny kalibra ní modely byly získány na 1. derivaci s výjimkou sušiny, kde kalibra ní model byl vytvo en bez derivace spekter.

Nejlepší kalibra ní modely byly vybrány na základ korela ních koeficient (R) a standardních chyb kalibrace (SEC). Spolehlivost kalibra ních model byla ov ena metodou k ížové validace.5

Korela ní koeficienty kalibrace (R) byly pro jednotlivé parametry získány v rozmezí od 0,991 pro obsah NaCl do 0,936 pro obsah tuku v sušin se sm rodatnými odchylkami kalibrace (SEC) 0,04 % a 2,67 (%) (tab. II, grafy 1 a 4). Obdobné výsledky zjistili i jiní auto i10, kte ísledovali v sýrech obsah tuku, bílkovin a sušiny. Pro všechny sledované parametry zjistili korela níkoeficienty v rozmezí 0,98 – 0,99 v závislosti na použité derivaci. K vytvo ení kalibra ních modeltito auto i použili metody PCA (principal component analysis) a modifikovanou metodu áste ných nejmenších tverc (MPLS).

182

Pro vytvo ení valida ních model byla použita stejná sada vzork jako p i kalibraci. K ížovou validací byla ov ena spolehlivost kalibra ního modelu. Jedná se o pevnou závislost mezi hodnotami referen ními a hodnotami predikovanými (grafy. 1 - 4). P esnost validace byla posouzena na základ korela ních koeficient validace (R) a standardních chyb validace (SECV).5Korela ní koeficienty validace (R) byly nalezeny v rozmezí 0,951 pro obsah tuku a 0,735 pro aktivitu vody se sm rodatnými odchylkami validace (SECV) 1,54 % a 0,005 (tab. II, graf 3).

NIR reflektan ní techniku využili pro stanovení obsahu tuku a vlhkosti i další auto i6, kte ízískali pro obsah sušiny korela ní koeficienty kalibrace 0,990 - 0,998 a pro vlhkost 0,75 – 0,87. Pomocí NIR spektroskopie lze sledovat také senzorické vlastnosti sýr . Reflektan ní a transmitan ní spektroskopie byla využita ke sledování senzorických vlastností sýr , které byly kontaminovány mikroorganismy Cl. tyrobutyricum a propionibakteriemi.5

Na základ posouzení hodnot parametr kalibra ních varia ních koeficient (CCV) a predik ních varia ních koeficient (PCV) 11 byla posouzena spolehlivost kalibra ních model(tab. II). Zjišt né výsledky byly statisticky zhodnoceny pomocí programu STAT Plus.9 Mezi referen ními hodnotami a vypo ítanými hodnotami pomocí FT-NIR nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly (p = 0,05).

y = 0,8753x + 4,6052R = 0,9356

y = 0,8566x + 5,3618R = 0,9149

20

25

30

35

40

45

50

55

20 25 30 35 40 45 50 55

laboratorní hodnoty (%)

pred

ikov

ané

hodn

oty

(%)

kalibrace cross validace kalibrace validace

Obr. 1. Kalibra ní a valida ní model pro tuk v sušin

y = 0,9305x + 3,6743R = 0,9646

y = 0,9106x + 4,7252R = 0,9497

42

47

52

57

62

42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62


pred

ikov

ané

hodn

oty

(%)


Obr. 2. Kalibra ní a valida ní model pro sušinu

183

y = 0,9439x + 1,0824R = 0,9715

y = 0,934x + 1,333R = 0,9507

8

12

16

20

24

28

32

8 12 16 20 24 28 32


pred

ikov

ané

hodn

oty

(%)


Obr. 3. Kalibra ní a valida ní model pro tuk

y = 0,982x + 0,034R = 0,9915

y = 0,7481x + 0,4637R = 0,9061

1,21,41,61,82,02,22,42,62,83,0

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0


pred

ikov

ané

hodn

oty

(%)


Obr. 4. Kalibra ní a valida ní model pro NaCl

Záv rByly vytvo eny kalibra ní modely pro stanovení obsahu tuku v sušin , sušiny, tuku,

titra ní kyselost, aktivitu vody a obsah NaCl. Výsledky byly posouzeny na základ korelace mezi referen ními a vypo tenými hodnotami z kalibra ních rovnic a na základ sm rodatných odchylek kalibrace a validace (SEC, SECV). Nejlepší výsledky byly zjišt ny pro obsah sušiny. Pro získání lepších výsledk pro obsah NaCl by bylo dobré za adit více vzork s vyšší koncentrací. K ížovávalidace nazna ila možnost využití NIR spektrometru pro stanovení základních složek. FT-NIR tak p edstavuje vhodnou techniku pro rychlou analýzu fyzikáln -chemických parametr sýrs nízkodoh ívanou sý eninou.

Práce vznikla za podpory výzkumného zám ru MSM6215712402 Veterinární aspekty bezpe nosti a kvality potravin.

184

Použitá literatura:1. BÜNING-PFAUE, H. Analysis of water in food by near infrared spectroscopy. Food Chem.,

2003, vol. 82, no. 1, p. 107-115. 2. URDA, L., KUKA KOVÁ, O., NOVOTNÁ, M. NIR spektroskopie a její využití

p i analýze mléka a mlé ných výrobk . Chem. Listy, 2002, vol. 96, no. 5, p. 305-310. 3. WITTRUP, CH., NØRGARD, L. Rapid near infrared spectroscopic screening of chemical

parameters in semi-hard cheese usiny chemometrics. J. Dairy Sci., 1998, vol. 81, no. 7, p. 1803-1809.

4. McQUEEN, DH., WILSON, R., KINNUNEN, A., JENSEN, EP. Comparison of two infrared spectroscopic methods for cheese analysis. Talanta, 1995, vol. 42, p. 2007-2015.

5. SØRENSEN, LK., JEPSEN, R. Assessment of sensory properties of cheese by near-infrared spectroscopy. Int. Dairy J., 1998, vol. 8, no. 10-11, p. 863-871.

6. McKENNA, D. Measuring moisture in cheese by near infrared absorption spectroscopy. 2001, vol. 84, no. 2, p. 623-628.

7. SN 570107. Metody zkoušení sýr , tvaroh , krém a pomazánek. Vydal Ú adpro normalizaci a m ení, Praha, 1965, s. 28.

8. SN 570107, ást 12. Metody zkoušení p írodních a tavených sýr . Stanovení obsahu chloridu sodného. Vydal Ú ad pro normalizaci a m ení, Praha, 1980, s.4.

9. MATOUŠKOVÁ, O., CHALUPA, J., CÍGLER, M., HRUŠKA, K. STAT-Plus uživatelská p íru ka, verse 1.01., 1992. Veterinary Research institute, Brno, CR., s. 168.

10. RODRIGUEZ-OTERO, JL., HERMIDA, M., CEPEDA, A. Determination of fat, protein, and total solids in cheese by near-infrared reflectance spectroscopy. J. AOAC Int., 1995, vol. 78, no. 3, p. 802-806.

11. ALBANELL, E. CÁCERES P., CAJA G., MOLINA E., GARGOURI A. Determination of fat, protein and total solids in ovine milk by near-infrared spectroscopy. J. AOAC Int., 1999, vol. 82, p. 753-758.

Kontaktní adresa:MVDr. Michaela Dra ková, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, 612 42 Brno, e-mail: [email protected]

185

VYUŽITÍ NIR SPEKTROSKOPIE P I SLEDOVÁNÍ PR B HU ZRÁNÍ EIDAMSKÝCH SÝR R ZNÝCH VÝROBC

Králíková Marcela, Lužová Tá a, Ml ek Ji í, Šustová Kv toslavaÚstav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn

The use of NIR spectroscopy by monitoring rippening eidam s cheeses from different producers

Summary:Our objective was to determine range of usage NIR spectroscopy during monitoring of rippening eidam cheeses 4 different makers. For measuring were used eidam cheeses 45% fat form makers A, B, C, D. Samples were controled every month from 7 months at FT NIR Antaris in reflectance mode with number of scans 80, with resolution 4 with using a spinner. Every samle were measured 4times. For interpretetion was used average spectrum. The individual groups (clusters) were analyzed by discriminant analyse. With use discriminant analyse were differentiated all cheeses from 4 different producers after first month of rippening.

ÚvodDíky své rychlosti a nedestruktivit se NIR spektroskopie stává stále více využívanou

metodou p i rutinních analýzách v zem d lství, farmacii, zejména pak v potraviná ství.Blízká infra ervená spektroskopie je hojn využívána v mléka ství. FRANK a BIRTH se již

v roce 1982 zabývali stanovením základních složek jako tuk, bílkoviny. Dv rozdílné metody infra ervené spektroskopie p i analýze sýr porovnával McQUEEN et al. (1995).

Krom stanovení základních majoritních složek se NIR spektroskopie zabývá i analýzou kvantitativní, p i které lze pomocí diskrimina ní analýzy rozlišit materiály do definovaných t íd(cluster ). Takto lze nap íklad rozlišit r zné druhy sýr . PILLONEL et al. se zjiš oval schopnost NIR spektrometru rozlišit geografický p vod ementálského sýru (2003). V naší práci jsme se zabývali možností využití NIR spektroskopie p i rozlišování eidamských sýr 4 r zných výrobc a rovn ž schopností zachytit rozdíl u eidamských sýr vyrobených s použitím dvou r znýchstartovacích kultur.

Materiál a metody K analýze byly použity eidamské sýry 4 r zných výrobc (A, B, C, D). Vzorky byly m eny

po dobu 7 m síc . Každý m síc byly analyzovány na p ístroji FT NIR Antaris ve spektrálním rozsahu 4000 – 10000 cm-1 v režimu reflektance s rozlišením 4 a po tem scan 80. Každý vzorek sýru byl zm en 4krát. Vyhodnoceno bylo pr m rné spektrum.

K vyhodnocení spekter byla použita metoda diskrimina ní analýzy. Tato metoda rozliší spektra dle kvality. Ur í t ídu, která je nejpodobn jší posuzovanému spektru vzorku. Po et t íd je roven po tu porovnávaných vzork . Velké rozdíly mezi t ídami mohou být patrné z p ítomnostidiskrimina ního k íže.

Diskrimina ní analýza byla použita pro porovnání všech ty výrobc a rovn ž pro rozlišení dvou r zných startovacích kultur (YY, LL).

Výsledky Ke zjišt ní možného rozdílu mezi 4 r znými výrobci eidamských sýr A, B, C, D byly použity vzorky sýr o 45% tu nosti. Každý vzorek byl zm en 4krát a k vytvo ení kalibra ních model byla použita spektra pr m rná. Byla použita metoda diskrimina ní analýzy. Jednotlivé t ídy popisují standardy, jež tvo í shluk kolem t žišt t ídy (cluster). Na následujících obrázcích jsou zaznamenány rozdíly mezi jednotlivými výrobci A, B, C, D.

186

Obrázek I Rozlišení výrobce A ( tverec) a B (trojúhelník)

Obrázek II Rozlišení výrobce A ( tverec) a B (trojúhelník)

Obrázek III Rozlišení výrobc A( tverec) a D(trojúhelník)

187

Obrázek IV Rozlišení výrobc D( tverec) a C(trojúhelník)

Obrázek V Rozlišení výrobce B ( tverec) a D (trojúhelník)

Obrázek VI Rozlišení výrobce B ( tverec) a C (trojúhelník) Na obrázcích I-VI vidíme, že NIR spektroskopie dokázala rozlišit všechny výrobce

188

již po prvním m síci zrání sýr . Tém ve všech p ípadech je p ítomen diskrimina ní k íž. Pouze u výrobc D x C se diskrimina ní k íž neobjevil, ale i tak je možno oba výrobce od sebe odlišit. Na obrázcích VII-VIII jsou uvedeny výsledky diskrimina ní analýzy, která byla zhotovena pro p ípad dvou r zných startovacích kultur. B hem sedmi m síc skladování nebyly zaznamenány diskrimina ní analýzou významné rozdíly mezi kulturami LL a YY.

Obrázek VII Startovací kultura YY ( tverec) a startovací kultura LL (trojúhelník) první m síc sledování

Obrázek VIII Startovací kultura YY ( tverec) a startovací kultura LL (trojúhelník) sedmý m síc sledování

Záv rV naší práci jsme se zabývali možností využití NIR spektroskopie p i sledování pr b hu

zrání eidamských sýr r zných výrobc . Z výsledk lze usuzovat, že je tato technika schopna rozlišit r zné výrobce eidamských sýr stejné tu nosti. Diskrimina ní analýzou se rozdíl mezi sýry výrobc A, B, C, D potvrdil již po prvním m síci zrání.

V p ípad rozlišení r zných startovacích kultur pro výrobu eidamských sýr se s použitím diskrimina ní analýzy nepoda ilo dob e rozlišit kultury p i žádném m ení b hem 7mi m sí níhopokusu.

Metodu lze používat pro odlišení r zných výrobc eidamských sýr v praxi pro její rychlost a nedestruktivitu.

189

Použitá literatura:1. FRANK J. F., BIRTH G. S., 1982. Application of near infrared reflectance spectroscopy to

cheese analysis, Jurnalo of Dairy Science 65: 1110-1116 2. McQUEEN D. H., WILSON R., KINNUNEN A., JENSEN E. P., 1995. Comparison of two

infrared spectroscopic methods for cheese analysis, Talanta 42: 2007-20153. PILLONEL L., LUGINBU W., PICQUE D., SCHALLER E., TABACCHI R., BOSSET J. O.,

2003. Analytical methods for the determination of geographic origin of Emmental cheese: Mid- and near-infrared spectroscopy, European Food Research and Technology 2: 174-178

Kontaktní adresa:Marcela Králíková, Ústav Technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, Brno 613 00, eská republika Tel: +420 545 133 362, email: [email protected]

190

VYUŽITÍ NIR SPEKTROSKOPIE P I ANALÝZE SUŠENÉHO MLÉKA R ži ková Jana1, Šustová Kv toslava2

1UTB ve Zlín , Fakulta technologická, Ústav potraviná ského inženýrství, Zlín2MZLU v Brn , Fakulta agronomická, Ústav technologie potravin, Brno

Application of the FT NIR spectroscopy for analysis of milk powder

Summary:The aim of this work was to examine the possibility of application of near-infrared spectroscopy for analysis of moisture content and titrable acidity of milk powder. The samples of milk powder and whey powder were mixed for increasing the scale of reference values. The mixed samples were measured by FT NIR Antaris at integrating sphere in Petri dish within reflectance mode in wavelengths ranging from 10 000 to 4 000 cm-1.Every sample of milk powder was measured three times and for calibration average spectrum was used. To develop the calibration model for examined components the partial lest squares (PLS) method was used and this model was validated by full cross validation. The highest correlation coefficients estimated were 0,993 of calibration and 0,990 of validation for titrable acidity of milk powder and 0,885 of calibration and 0,842 of validation for moisture content of milk powder. The results of this study prove the availability of NIR spectroscopy for a quick and non-destructive analysis of selected quantitative parameters of the milk powder.

NIR spektroskopie je metoda využívající blízké infra ervené oblasti spektra, která poskytuje širokou paletu aplikací v kontrole kvantitativních a kvalitativních ukazatelpotraviná ských surovin, meziprodukt i finálních výrobk . Díky snadné obsluze, rychlosti analýz p i minimální spot eb chemikálií a úpravách vzork si tato technika našla své místo v mlékárenském oboru. Blízká infra ervená spektroskopie se b žn využívá p edevším pro stanovení hlavních základních složek (sušina, bílkoviny, tuk, laktóza) u syrového mléka10,11,fermentovaných mlé ných výrobk a sýr 6,4 a také rovn ž pro stanovení fyzikáln chemických ukazatel u daných výrobk 9. Mezi další aplikace NIR v mlékárenském pr myslu je oblast výroby sušeného mléka, syrovátky a r zných mlé ných sm sí ke stanovení základních jakostních ukazatel(obsah tuku, bílkovin, laktózy) pomocí filtrových p ístroj 1,7 i jiných typ spektrometr 8. NIR spektrometrie je vhodná ke zjišt ní složení originálního a lyofilizovaného sušeného mléka2,p ípadn p i kontrole jakosti z hlediska možných p ím sí a ne istot v sušeném mléce5. Cílem naší práce bylo použití blízké infra ervené spektroskopie p i stanovování vybraných kvantitativních ukazatel sušeného mléka – obsah vody, titra ní kyselost.

MetodikaK analýze byly použity vzorky odst ed ného sušeného mléka a sušené syrovátky,

byly dodány mlékárnou Olma, a. s., Olomouc a sušárnou mléka Brno, a.s. Vzorky sušeného mléka a sušené syrovátky byly míchány mezi sebou v r zných pom rech pro zajišt ní v tšího rozsahu referen ních hodnot. Referen ní analýzy pro stanovení obsahu vody a titra ní kyselosti byly provedeny v laborato i Ústavu technologie potravin MZLU v Brn .

U sušených mlé ných výrobk se pro stanovení vlhkosti (obsahu vody) použila metoda dle SN 57 0105, kdy se obsah vody stanoví sušením p i teplot 87 ± 2°C, p i které nedochází k porušení organických látek. Suší se do nejnižší váhy. Obsah vody v % se dopo ítá.

Pro stanovení titra ní kyselosti u sušeného mléka se postupovalo podle metody Soxhlet-Henkela. Princip spo ívá ve spot eb alkalického odm rného roztoku p i neutralizaci zkoušeného vzorku na p edepsaný indikátor (fenolftalein). Titra ní kyselost dle Soxhlet-Henkela (°SH) udává po et mililitr odm rného roztoku (0,25M NaOH) pot ebných k neutralizaci 100 ml mléka a tekutých mlé ných výrobk . Pro sušená mléka je spot eba odm rného roztoku vztažena na 100 ml obnoveného mléka3.

Vzorky sušeného mléka byly následn m eny v Petriho misce p ístrojem FT NIR Antaris firmy ThermoNicolet na integra ní sfé e v režimu reflektance p i vlno tech 10 000 – 4 000 cm-1.Konstantní vrstva sušeného mléka byla vymezena výškou Petriho misky a také vrstvou alobalu.

191

Snímání probíhalo v programu Omnic s rozlišením 8 a po tem scan 100. Doba pro získání jednoho spektra byla cca 50 vte in. Vzorky byly m eny t ikrát na r zných místech a do kalibra níhomodelu bylo za azeno pr m rné spektrum.

Následn byly pomocí PLS algoritmu vytvo eny kalibra ní modely pro každou stanovovanou složku a jejich spolehlivost ov ena k ížovou validací. Zhodnocení výsledk bylo provedeno na základ korelace mezi referen ními hodnotami a hodnotami získanými výpo temkalibra ních rovnic a na základ velikosti sm rodatných odchylek kalibrace (SEC) a validace (SEP). Vhodnost modelu se posuzuje také podle korela ních koeficient (R). ím víc se hodnota blíží 1, tím lze považovat kalibraci za použiteln jší. Dalším ukazatelem spolehlivosti je hodnota kalibra ního varia ního koeficientu (CCV), která by nem la p esáhnout 5%, a hodnota predik níhovaria ního koeficientu (PCV), n hož je stanovena hranice do 10%. Rozdíly mezi referen ními a predikovanými (NIR) hodnotami byly porovnávány párovým T-testem.

Výsledky a diskuzeP i tvorb kalibra ního modelu vlhkosti bylo použito 71 vzork odst ed ného sušeného

mléka. Do kalibra ního modelu titra ní kyselosti bylo za azeno 40 vzork sušeného mléka namíchaného v r zném pom ru se sušenou syrovátkou pro rozší ení rozp tí referen ních hodnot titra ní kyselosti. Kone ný po et vzork byl upraven technikami TQ Analyst (Leverage, PC Scores a Spektrum Outlier) umož ující odstran ní odlehlých spekter, které by mohly negativn ovliv ovat výslednou kalibraci. Základní statistické údaje pro ob kalibrace jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulka I Základní statistické údaje pro stanovení vlhkosti a titra ní kyselosti sušeného mléka Kalibrovaná složka n xp sx min max PLS Vlhkost (%) 66 3,27 0,439 2,45 4,10 4 Titra ní kyselost (°SH) 37 6,20 0,247 5,84 6,63 4

n – po et vzork ; xp – pr m r; sx – sm rodatná odchylka; min – minimální hodnota; max – maximální hodnota; PLS – po et faktor .

Kalibra ní modely byly vytvo eny pomocí PLS algoritmu (metoda áste nýchminimálních tverc ). PLS faktory použité v modelech zahrnují spektrální a také koncentra ní informaci. Pokud je po et PLS faktor p íliš vysoký lze usuzovat, že v model má v sob zahrnuto p íliš mnoho spektrálního šumu, který se m že zkreslovat kone né výsledky kalibrace. V našem p ípad je po et faktor nízký (4) pro oba modely a pr b h PRESS má klesající trend.

Výsledky kalibrace a validace pro vlhkost a titra ní kyselost sušeného mléka jsou uvedeny v tabulkách II a III. Korela ní koeficienty kalibrace vlhkosti sušeného mléka dosahují hodnot 0,885 a 0,842, což ukazuje na dobrou korela ní závislost modelu. T snost závislostí modelu je patrna z grafického vyjád ení (obr. 1). Rozdíl mezi sm rodatnými odchylkami SEC a SEP je minimální a jejich velikost se pohybovala v rozmezí od 0,204% do 0,237%. Pro ov ení spolehlivosti vyhotoveného kalibra ního modelu se vypo ítaly kalibra ní (CCV) a predik ní (PCV) varia ní koeficienty. Hodnota CCV je 6,24%, což p esahuje podmínku spolehlivosti modelu (CCV pod 5%). Hodnota PCV by se m la pohybovat pod 10%, tuto podmínku kalibra ní model spl uje (hodnota PCV je 7,24%). Dá se tedy konstatovat, že model pro stanovení vlhkosti sušeného mléka je relativn spolehlivý.

192

Tabulka IIKalibra ní výsledky vlhkosti a titra ní kyselosti sušeného mléka Kalibrovaná složka a ± bx R SEC CCV (%)

Vlhkost (%) 0,7088 + 0,7831x 0,885 0,204 6,235 Titra ní kyselost (°SH) 0,0806 + 0,9870x 0,993 2,84·10-2 0,458

a ± bx – regresní rovnice; R – korela ní koeficient; SEC – sm rodatná odchylka kalibrace; CCV – kalibra ní varia ní koeficient.

y = 0,7831x + 0,7088R = 0,885

y = 0,7312x + 0,87R = 0,842

2

2,5

3

3,5

4

4,5

2 2,5 3 3,5 4 4,5

Referen ní hodnoty (%)

NIR

hodn

oty

(%)

Kalibrace Validace Lineární (Kalibrace) Lineární (Validace)

Obr. 1. Grafické znázorn ní kalibra ních a valida ních výsledk vlhkosti sušeného mléka.

Tabulka III Valida ní výsledky vlhkosti a titra ní kyselosti sušeného mléka Kalibrovaná složka a ± bx R SEP PCV (%) Vlhkost (%) 0,8700 + 0,7312x 0,842 0,237 7,244 Titra ní kyselost (°SH) 0,1564 + 0,9743x 0,990 3,55·10-2 0,573

a ± bx – regresní rovnice; R – korela ní koeficient; SEP – sm rodatná odchylka predikce;PCV – predik ní varia ní koeficient.

Kalibra ní hodnota korela ního koeficientu u modelu titra ní kyselosti sušeného mléka je zna n vysoká (0,993), což sv d í o velmi pevné závislosti vyhotovené kalibrace. Sm rodatnáodchylka kalibrace je 2,84·10-2 °SH (tab. II), která je patrná i z grafického pr b hu na obrázku 2. Výsledky pro validaci (tab. III) potvrzují výsledky kalibrace, hodnota korela ního koeficientu je op t velmi vysoká a tém se shoduje s korela ním koeficientem kalibrace (0,990). Dle velikosti CCV (kalibra ního varia ního koeficientu) a PCV (predik ního varia ního koeficientu) lze kalibra ní modely pro stanovení titra ní kyselosti u sušeného mléka považovat za velmi spolehlivé, pon vadž hodnota CCV inila 0,46 a 0,90%. Nedošlo tedy k p ekro ení hrani ní hodnoty spolehlivosti modelu 5%. Hodnota PCV inila 0,57 a 1,32 %, což je hluboko pod hranicí 10% (mez spolehlivosti u PCV).

193

y = 0,987x + 0,0806R = 0,993

y = 0,9743x + 0,1564R = 0,990

5,6

5,8

6

6,2

6,4

6,6

6,8

5,8 6 6,2 6,4 6,6 6,8

Referen ní hodnoty (°SH)

NIR

hod

noty

(°SH

)

Kalibrace ValidaceLineární (Kalibrace) Lineární (Validace)

Obr. 2. Grafické znázorn ní kalibra ních a valida ních výsledk titra ní kyselosti sušeného mléka.

Tabulka IV Statistické vyhodnocení vlhkosti a titra ní kyselosti sušeného mléka T-testem Kalibrovaná složka xREF xNIR SD tstat tkrit (1) tkrit (2)Vlhkost (%) 3,27 3,27 5,40·10-2 3,58·10-2 1,669 1,987 Titra ní kyselost (°SH) 6,20 6,20 4,07·10-2 -1,2·10-2 1,688 2,028

xNIR – hodnoty predikované; xREF – hodnoty referen ní; d – diferen ní rozdíl predikovaných a referen ních hodnot; sx – sm rodatná odchylka diference; t stat – T-test; t krit.(1) – tabulková hodnota p i = 0,05; t krit.(2) – tabulková hodnota p i = 0,01.

Použitelnost vytvo ených model jsme ov ili za pomocí statistických metod. Pro oba dva vytvo ené kalibra ní modely byl aplikován dvouvýb rový párový T-test. P i srovnání souborreferen ních hodnot a hodnot vypo ítaných spektrometrem pro vlhkost a titra ní kyselost sušeného mléka (tab. IV), vyplývá, že mezi nimi není zaznamenán statisticky pr kazný rozdíl (tstat < ttab) ani v hladin významnosti = 0,05 (tkrit(1)) ani p i = 0,01 (tkrit(2)).

Literární prameny uvádí vyšší hodnoty korela ních koeficient u kalibra ních modelvlhkosti sušeného mléka. BARABÁSSY a KAFFKA (1995) dosáhli p ístrojem NIRSystems 6500 hodnot v modelech vlhkosti sušeného mléka R = 0,988 a SEC = 0,161%, p ístroj PMC spectralyzer 1025 vykázal ješt lepší výsledky a to R = 0,998 a SEC = 0,098%. BAER et al. (1983) uvádí filtrovým spektrometrem korela ní koeficient pro model vlhkosti (R) 0,971 a sm rodatnouodchylku predikce (SEP) 0,274%. Naše výsledky jsou nepatrn horší, což m že být zp sobené menším po tem vzork v kalibraci a menším rozptylem hodnot vlhkosti v sušeném mléce. K problematice stanovení titra ní kyselosti sušeného mléka jsme nenašli žádné literární zdroje. Jedná se pravd podobn o první aplikaci spektrometrie pro stanovení titra ní kyselosti sušeného mléka.

Záv rem lze konstatovat, že vytvo ené kalibra ní modely spl ují podmínky spolehlivosti. U modelu stanovení vlhkosti jsou parametry nepatrn horší, ale pro orienta ní zjišt ní je model použitelný. Kalibra ní model na stanovení titra ní kyselosti u sušeného mléka je velmi spolehlivý a vysoce robustní, tudíž ho lze doporu it pro b žné rutinní stanovení v praxi.

194

Použitá literatura:1. BAER, R. J., FRANK, J. F., LOEWENSTEIN, M. Compositional analysis of nonfet dry milk

by using near infrared diffuse reflectance spectroscopy. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, 1983, 66: 858–863.

2. BARABÁSSY, S. P., TURZA, S. Investigation of the lyophilization effect on mixed milk powder product by near infrared spectroscopy. Near Infrared Spectroscopy: The Future Waves,1995, IM Publications, Chichester.

3. SN 57 0105 Metody zkoušení mlé ných výrobk sušených a zahušt ných, 1965. 4. KAROUI, R., MOUAZEN, A. M., DUFOUR, E., PILLONEL, L., SCHALLER, E., PICQUE,

D., DE BAERDEMAEKER, J., BOSSET, J.-O. A comparison and point use of NIR and MIR spectroscopic methods for determination of some parameters in European Emmental cheese. European Food Research and Technology, 2006, 223: 44–50.

5. MARABOLI, A., CATANEO, T. M. P., GIANGIACOMO, R. Detection of vegetable proteins from soy, pea and wheat isolates in milk poder by near infrared spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 2002, 10: 63–69.

6. NAVRÁTIL, M., CIMANDER, C., MANDENIUS, C.-F. On-line Multisensor Monitoring of Jogurt and Filmjölk Fermentations on Production scale. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(3): 415–420.

7. PASTIEROVÁ, E. Stanoveni bielkovin v sušenom mlieku metódou NIR, Bulletin PV 30, 1991, s. 263–269.

8. RACHEV, M., PETROVA, S. Analysis of dry milk infant foods by near infrared spectroscopy (NIR). Journal of Chromatography, 1991, 552: 273–279.

9. SKEIE, S., FETEN, G., ALMØY, T., ØSTLIE, H., ISAKSSON, T. The use of near infrared spectroscopy to predict selected free amino acids during cheese ripening. International Dairy Journal, 2006, 16: 236–242.

10. SPITZER, K., KÜNNEMEYER, R., WOOLFORD, M., CLAYCOMB, R. On-line milk spectrometry: Analysis of bovine milk composition. Proceedings of SPIE – The International Society for Optical Engineering, 2005, Volume 5852 PART II: 698–707.

11. WOO, Y.-A., TERAZAWA, Y., CHEN, J. Y., IYO, C., TERADA, F., KAWANO, S. Development of a new measurement unit (MilkSpec-1) for rapid determination of fat, laktose, and protein in raw milk using near-infrared transmittance spectroscopy. Applied Spectroscopy,2002, 56: 599–604.

Kontaktní adresa:Ing. JANA R ŽI KOVÁ, Ústav potraviná ského inženýrství, Fakulta technologická,Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , nám. T. G. Masaryka 275, 762 72 Zlín Tel.: +420 57 603 1524, e-mail: [email protected]

195

STANOVENÍ JAKOSTNÍCH UKAZATEL ERSTVÝCH KOZÍCH SÝRPOMOCÍ NIR SPEKTROSKOPIE

Lužová Tá a, Šustová Kv toslava, Horáková Ruth Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn

The determination of quality indexes fresh goat s cheeses with used NIR spectroscopy

Summary:In our work we occupied by monitoring basic performace indexes fresh goat s cheeses over

a period of lactation from April to November 2007. The samples were analysed every 14 days. With reference methods were at Department of Food Technology, MZLU Brno defined indexes: dry matter, pH, NaCl, titrable acidity, fat. After this were samples measured at FT NIR Antaris in reflectance mode with resolution 8 and number of scans 100. With help PLS methods were made calibration models. The models were checked with cross-validation.

V dnešní dob se NIR spektroskopie hojn využívá v chemii, farmacii, petrochemii a medicín . Klasickou oblastí pro aplikaci NIR je analýza potravin (Centner, 1999). Výhody, které poskytuje analýza NIR spektrometrií ve srovnání s klasickou spektrometrií a chromatografií, jsou hlavn rychlost a vysoká spolehlivost této nedestruktivní metody (Šikola, 2002).

P i analýze mléka a mlékárenských výrobk bývá NIR spektrometrie nej ast ji využívána pro stanovování základních složek, jako je sušina, obsah bílkovin, tuku, laktózy. Takovou analýzou se zabývali (Jankovská et al., 2003) a také (Laporte et al., 1999). Rovn ž byla publikovaná adavýsledk v analýze sýr (Skeie et al., 2005, McQueen et al., 1995).

Inspirací pro náš lánek nám byl neustále se zvyšující zájem o kozí sýry. Rozhodli jsme se proto vyzkoušet aplikaci NIR spektroskopie pro analýzu základních ukazatel erstvých kozích sýr .

Materiál a metodika K analýze byly použity vzorky erstvých kozích sýr , které byly odebírány od dubna do listopadu 2007. Každých 14 dní byl referen ními metodami u vzork stanoven obsah sušiny, tuku, NaCl, pH a titra ní kyselost. Vzorky byly analyzovány na p ístroji FT NIR Antaris v režimu reflektance s po tem scan 100, rozlišení 8. K vyhodnocení byla použita pr m rná spektra. Na základ získané závislosti mezi spektrální informací a složením vzorku byly vytvo enykalibra ní modely. Kalibra ní modely byly ov eny k ížovou validací. Kalibra ní modely pro pH a tuk byly upraveny 1. derivací. Ke statistickému zpracování dat byl použit program Excel.

Výsledky a diskuze Pro vytvo ení kalibra ních model byl použit algoritmus PLS. Kalibra ní modely byly následn ov eny k ížovou validací. V tabulce I a II jsou uvedeny hodnoty korela ních koeficientkalibrace i validace (R), sm rodatné odchylky (SEC, SEP), hodnoty kalibra ních (CCV) a predik ních (PCV) koeficient .

Tabulka I Kalibra ní výsledkysložky R SEC CCV (%) PLS faktory bx + a sušina (%) 0,81005 1,2300 2,66 5 0,6563x+15,896pH 0,95863 0,0231 0,48 4 0,9210x+0,3756SH 0,95256 0,8490 0,78 6 0,9072x+10,146NaCl (%) 0,96407 0,0701 5,79 10 0,9278x+0,0883Tuk (%) 0,82477 0,7860 3,40 4 0,6800x+7,3997

R – korela ní koeficient, SEC – sm rodatná odchylka kalibrace, CCV – kalibra ní varia ní koeficient, y = bx + a – rovnice regresní p ímky

196

Tabulka II Valida ní výsledky složky R SEP PCV (%) PLS faktory bx + a sušina (%) 0,67145 1,6000 3,46 5 0,5656x+20,083pH 0,65885 0,0626 1,31 4 0,5366x+2,2132SH 0,90118 1,1200 1,02 6 0,8550x+15,768NaCl (%) 0,86721 0,1350 11,15 10 0,8531x+0,1830Tuk (%) 0,66911 1,0600 4,59 4 0,5619x+10,080

R – korela ní koeficient, SEP – sm rodatná odchylka predikce, PCV – predik ní varia ní koeficient, y = bx + a – rovnice regresní p ímky

Spolehlivost kalibra ního modelu bývá ur ena více faktory. Kalibra ní i valida ní koeficienty se m ly co nejvíce blížit jedné. V tabulce I a II si m žeme povšimnout vysokých koeficient s relativn nízkými sm rodatnými odchylkami. Dob e fungující model by nem l mít více jak 15 PLS faktor pro stanovení na NIR spektrometru, což nedosahuje ani jedna námi stanovovaná složka. V tabulce I pro stanovení obsahu soli hodnota CCV lehce p esahuje 5%, rovn ž hodnota PCV pro stanovení NaCl v tabulce II lehce p ekra uje mezní hodnotu 10%. To znamená, že model není natolik spolehlivý. U všech ostatních sledovaných vlastností nedošlo p ekro ení limitních hodnot CCV (5%) a PCV (10%). Modely lez proto považovat za spolehlivé. V tabulce III jsou zaznamenány výsledky statistického vyhodnocení predikovaných NIR a referen ních hodnot jež byly testovány párovým t-testem. Nebyl zjišt n statisticky pr kaznýrozdíl mezi refern ními a predikovanými hodnotami.

Tabulka III Statistické vyhodnocení párovým t-testem, n = 30

složky xREF xNIR SD t-test t1 (krit) t2 (krit)

sušina 46,25 46,25 0,397 0,003 1,701 2,048 pH 4,77 4,77 0,016 0,000 1,700 2,050 SH 109,39 109,39 0,595 0,000 1,720 2,070 NaCl 1,21 1,21 0,051 -0,050 1,710 2,060 tuk 23,12 23,12 0,273 0,500 1,706 2,056

xREF- hodnoty referen ní, xNIR-hodnoty predikované, SD-sm rodatná odchylka diference

y = 0.855x + 15.768R = 0.9117

y = 0.9072x + 10.146R = 0.9524

104

106

108

110

112

114

116

102 104 106 108 110 112 114 116

kalibrace validace Lineární (validace) Lineární (kalibrace)

Obrázek I Kalibra ní a valida ní výsledky pro titra ní kyselost (SH)

197

validacey = 0,5656x + 20,083

R = 0,6716

kalibracey = 0,6563x + 15,896

R = 0,8100

40

42

44

46

48

50

52

40 42 44 46 48 50 52 54

kalibrace validace Lineární (validace) Lineární (kalibrace)

Obrázek II Kalibra ní a valida ní výsledky pro sušinu

Záv rZ našich výsledk kalibra ních model je patrné, že hodnoty korela ních koeficient

kalibraci, validace jsou vysoké, p i relativn nízkých sm rodatných odchylkách, a velmi dobrých hodnotách CCV, PCV. Takovéto výsledky poukazují na funk nost model s možností využití v praxi pro rychlé stanovení sušiny. Jedinou vyjímkou byl kalibra ní model pro stanovení obsahu soli, jehož hodnoty CCV a PCV mírn p ekra ovaly hrani ní hodnoty.

Použitá literatura:1. CENTER V., 1999. Blízká infra ervená spektroskopie (NIR) a její pr myslové aplikace,

CHEMagazín 1,22 –23 2. JANKOVSKÁ R., ŠUSTOVÁ K., 2003. Analysis of Cow Milk by Near-infrared Spectroscopy,

Czech J. Food science 4, 123-1283. LAPORTE M. F., PAQUIN P., 1999. Near-infrared analysis of fat protein and casein in cow s

milk, Journal of Agricultural and Food Chemistry 7, 2600-26054. McQUEEN D. H., WILSON R., KINNUNEN A., JENSEN E. P., 1995. Comparison of two

infrared spectroscopic methods for cheese analysis, Talanta 42, 2007-20155. SKEIE S., FETEN G., ALMOY T., OSTLIE H., ISAKSSON T., 2006. The use of near infrared

spectroscopy to predict selected free amino acids during cheese ripening, International Dairy Journal 16, 236-242

6. ŠIKOLA J., 2002. NIR SPEKTROSKOPIE – Perspektivní metoda pro kvalitativní a kvantitativní analýzu v potravinách, Kvalita potravin 4, 18-19

Kontaktní adresa:Tá a Lužová, Ústav Technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn ,Zem d lská 1, Brno 613 00, eská republika Tel: +420 545 133 362, email: [email protected]

198

SLEDOVÁNÍ JAKOSTI JEDLÝCH ROZTÍRATELNÝCH A SM SNÝCHROZTÍRATELNÝCH TUK

Panovská Zde ka, Dostálová Jana, Doležal Marek, Culková Jana, Šedivá Alena Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha

Monitoring of quality of margarines and spreads

Summary:The fats and oils are important parts of our nutrition. The margarines and table spreads with vegetable fats offer an acceptable alternative to butter. They are formulated to have the same or similar taste, appearance, and nutritional value as butter. The objectives of this study were to compare main chemicals parameters and to describe the sensory attributes of margarines and spreads with vegetable fat and with mixture vegetable and animals fats which are on the Czech markets This study was conducted as part of a evaluation done in cooperation with newspaper Mlada Fronta Dnes. 18 samples with fat content among 25 to 80% have the contents of saturated FA 24-61% and amounts of trans FA (TFA) ranged from 0.2 to 7.2%. A descriptive profiling test was used to evaluate the sensory characteristics of selected products. The differences in sensory characteristics were mainly in texture and saltiness, taste were evaluated better in samples contain mixture of animal and vegetable fat.

ÚvodVýznamnou sou ást naší výživy tvo í tuky a oleje. Jejich celková spot eba se neustále

sleduje, protože dlouhodob p ekra uje výživové doporu ené dávky. Podle vyhlášky . 124/2004 Sb. se jedlé tuky nebo oleje d lí na sedm skupin - rostlinné, živo išné, ztužené, pokrmové, roztíratelné, sm sné roztíratelné a tekuté emulgované.

Zvlášt u skupiny jedlé tuky roztíratelné a sm sné roztíratelné, které se používají pro mazání na pe ivo a p ípravu pomazánek, se výrobci snaží zavád t stále nové výrobky. Ješt p ed 20 lety se používalo k t mto ú el m p evážn máslo, které je vyrobeno z mléka a neobsahuje jiný než živo išný tuk. Jeho nejv tší p edností je p íjemná výrazná chu , navíc je bohaté na vitamin A a neobsahuje barviva ani konzerva ní látky. K omezení jeho používání došlo hlavnproto, že obsahuje cholesterol cca 250 mg/100 g. Další nevýhodou másla, krom výživového hlediska, je špatná roztíratelnost. Roztíratelné jedlé tuky (d íve nazývané margaríny) obsahují rostlinné tuky. Jejich hlavní výhodou je z hlediska výživy lepší složení mastných kyselin a nep ítomnost cholesterolu, takže jsou považovány za zdrav jší. Výhodou je i jeho dobrá roztíratelnost. V posledních letech se u t chto výrobk soust edila pozornost na obsah tzv. trans nenasycených mastných kyselin.

Sm sný tuk obsahuje krom rostlinných tuk i tuk živo išný. Tím se zlepší jeho chup i zachování dobré roztíratelnosti, ale zvýší se obsah nasycených mastných kyselin a sníží obsah mastných kyselin nenasycených.

Na VŠCHT v Praze se dlouhodob sleduje a posuzuje jak výživová, tak sensorická kvalita t chto výrobk . V roce 2006 ve spolupráci s Mladou Frontou Dnes byly testovány vybrané parametry jedlých roztíratelných a sm sných roztíratelných tuk zakoupených a b žn dostupných v eské tržní síti. Dodáno a otestováno bylo celkem 18 vzork . U vzork byly testovány jak chemické parametry, tak parametry sensorické.

Experimentální ástPopis vzork viz tabulka I

Chemická analýza Z chemických parametr bylo metodou GC-FID sledováno zastoupení jednotlivých skupin

mastných kyselin (nasycené, nenasycené, trans nenasycené a n-3 nenasycené). Transesterifikace p ítomných lipid za vzniku methylester mastných kyselin byla provedena methanolickým roztokem hydroxidu draselného (1). Analýza vzniklých methylester metodou kapilární plynové chromatografie byla provedena na p ístroji Agilent 6890 (Palo Alto, USA) za použití plamenov -ioniza ního detektoru (FID) a kapilární kolony SP 2560, 100m x 0,25mm, s tlouš kou filmu 0,20 m (Supelco, Bellefonte, USA).

199

Tabulka I – Popis vzork NÁZEV VÝROBCE % TUKU

1 Jiho eské AB Madeta eskéBud jovice 78 2 Zlatá Haná Olma Olomouc 76 3 Mazlí ko V Polsku 65

4 Masmix kombinace másla a rostlinného tuku se smetanou Raisio Polsko 75

5 Perla zlaté ráno Unilever R, P 8 74 6 Rama Creme Bonjour Unilever R, P 8 70 7 Lurpak Arla Foods, Dánsko 80 8 Lando Clever Stolz, Kleve, N mecko 70 9 Bertolli s olivovým olejem Unilever R, P 8 48

10 Sunny Glade, Na celý den Polsko 25 11 Easy Olma Olomouc 76 12 Roztíratelný tuk Euro shopper Ahold ( R) 25 13 Jedlý roztíratelný tuk Sonnenreife pro Lidl N mecko 80 14 Linco Family Royal Brinkers Ma arsko 40 15 Alfa Optima s máslovou chutí Setuza, Ústí nad Labem 70 16 Rama Classic Unilever R, P 8 70 17 Flora nové složení Unilever R, P 8 70 18 Perla tip Unilever R, P 8 25

Senzorická analýza Senzorické hodnocení probíhalo v senzorické laborato i VŠCHT v Praze. Hodnocení se

zú astnil senzorický panel VŠCHT. P i senzorické analýze se postupovalo v souladu s mezinárodní normou ISO 8589, tj. vzorky byly p edkládány a hodnoceny anonymn (zakódované). Hodnotitelé byli vybráni a vyškoleni také dle normy ISO. Postup všech senzorických analýz byl v souladu s mezinárodními normami ISO.

U vzork se hodnotila p íjemnost barvy, p íjemnost v n , p íjemnost chuti, p íjemnost textury, roztíratelnost. Pro hodnocení bylo použito p tibodové stupnice s tím, že deskriptor p íjemnost chuti byl násoben koeficientem. Posuzovatelé použili na hodnocení vzork i metodu slovního popisu.Stupnice p íjemnosti: 1. vynikající

2. velmi dobrý 3. celkem p ijatelný, pr m rný 4. velmi špatný 5. nep ijatelný

Výsledky a diskuseVýsledky senzorické analýzy Hodnocení sm sných tuk

P i senzorickém hodnocení byly vzájemn porovnány nejprve sm sné tuky tj. vzorky 1-7. Ze slovního popisu vzork vyplynulo, že nejv tší rozdíly mezi vzorky byly v p íjemnosti chuti. Vzorek . 3 byl chu ov nevyvážený se slabou pachutí. Mezi vzorky byly rozdíly ve slané chuti vzork , vzorek . 7 byl hodnocen jako výrazn slaný (popsán jako jemn slaný již na etiket ), jeho chu byla v tšinou hodnocena jako p íjemná. Slaná chu byla zaznamenána také u vzork 4 a 6, u ostatních byla slanost jen velmi slabá. U jednotlivých vzork nebyly shledány velké rozdíly v barv ani v ni. V roztíratelnosti se lišil vzorek . 2 , který byl výrazn tužší a naopak vzorek . 7 m k í. V textu e byl pouze u vzorku . 3 zaznamenán výrazn krupi kovitý charakter.

200

Barva vzork byla v tšinou hodnocena kladn , vzorky se v tšinou významn nelišily pouze vzorky 1 a 7 byly sv tlejší. V n byla u vzork . 1, 2, 3, 5 slabá a u vzork . 4, 5 a 6 intenzivní, v tšinou máslová, což bylo hodnoceno kladn . Nebyl zaznamenán vzorek s nep íjemnou v ní. Roztíratelnost byla u vzork . 1, 3, 4, 5 stejná, tj. velmi dobrá. Vzorek . 2 byl za stejné teploty po vyndání z chladni ky tužší proti ostatním vzork m, naopak vzorek . 7 byl po vyndání z chladni ky oproti ostatním vzork m výrazn až nep íjemn m kký. Je však nutné upozornit, že vzorek . 7 m l jako jediný na etiket poznámku „vhodný ke zmrazování“ a po vyndání z mrazni ky byl tuhý asi jako máslo po vyndání z chladni ky.

Hodnocení roztíratelných tukBarva v tšiny vzork byla podobná, pouze u vzork . 11, 13 a 16 byla p íliš intenzivní,

nep irozen žlutá a vzorek . 18 byl p íliš sv tlý. V n byla u v tšiny vzork jemná, nep ílišvýrazná, mezi vzorky nebyly velké rozdíly. Siln jší v n byla u vzork . 9 a 10, slabší v nu vzork . 11 a 12. Roztíratelnost u v tšiny vzork byla velmi dobrá, v tšina vzork byla m k ích, takže s roztíratelností nebyly problémy. Výrazn jší slanost byla zaznamenaná u vzork. 9 a 13. Textura byla u v tšiny vzork výborná, u vzork . 9 a 13 se po chvíli stání objevil olej,

u vzorku . 10 jemné krupi ky. Vzorek . 8 vykazoval lojovitou chu a celkov jeho chu byla nevyvážená.

Výsledky stanovení složení mastných kyselin roztíratelných a sm sných roztíratelných tuk

Tabulka II. : Složení mastných kyselin tuku (% celkových mastných kyselin) Vzorek SFA MUFA PUFA TRANS 1 Jiho eské AB * 61,9 32,2 5,7 2,5 2 Zlatá Haná * 56,9 32,1 10,9 1,1 3 Mazlí ko * 53,4 37,6 8,9 2,1 4 Masmix * 37,9 43,8 18,3 1,4 5 Perla zlaté ráno * 52,5 30,1 17,3 0,7 6 Rama Creme Bonjour * 52,9 31,7 15,2 1,1 7 Lurpak * 57,1 33,5 9,0 3,4 8 Lando * 50,5 31,3 18,2 0,7 9 Bertolli s olivovým olejem 48,8 38,9 12,3 0,4 10 Sunny Glade, Na celý den 27,4 53,5 19,1 3,0 11 Easy 31,2 52,4 16,4 7,2 12 Roztíratelný tuk Euro shopper 26,4 32,0 41,6 1,3 13 Jedlý roztíratelný tuk Sonnereife 34,1 40,4 25,5 0,6 14 Linco Family 30,8 29,0 40,2 2,4 15 Alfa Optima s máslovou chutí 31,2 33,9 34,9 1,4 16 Rama Classic 40,2 32,9 26,8 0,3 17 Flora nové složení 24,7 23,4 51,9 0,6 18 Perla tip 31,2 24,4 44,4 0,2

* sm sný roztíratelný tukSFA – nasycené mastné kyseliny, MUFA – monoenové mastné kyseliny, PUFA – polyenové mastné kyseliny, TRANS – trans nenasycené mastné kyseliny

201

Hodnocení složení mastných kyselin roztíratelných a sm sných roztíratelných tukObsah trans nenasycených mastných kyselin nep ekro il u žádného výrobku 10 %

z celkových mastných kyselin, což je oproti p edchozím let m výrazné zlepšení. V sérii analýz, které jsme provedli u 43 tuk zakoupených v prvním pololetí 2004 p ekro ilo obsah 10 % 9 výrobk . Pr m rný obsah trans kyselin v letošním testu je jen o n co vyšší než dv procenta, zatímco v analogickém testu MF DNES p ed t emi roky byl v pr m ru 10 %. Zlatá Haná m lav tomto testu 15,3%, dnes jen 1,1. Výrazn se zlepšilo i složení Jiho eského AB. To znamená, že výrobci již prakticky nepoužívají ve výrobcích áste n ztužené tuky s vysokým obsahem trans kyselin. Vyšší obsah než 0,5 g trans mastných kyselin na porci, který musí výrobci v USA od 1.1.2006 povinn vyzna ovat na obalech by p ekro il pouze výrobek Easy (1,08 g) a Lurpak (0,54 g) a to za p edpokladu, že porce je 20 g výrobku.

Záv rSensorickým hodnocením sm sných tuk bylo zjišt no, že nejv tší rozdíly mezi vzorky

byly dány rozdílnou p íjemností chutí vzork . Rozdíly byly rovn ž nalezeny ve slané chuti vzorka v textu e vzork . V barv a ve v ni podstatné rozdíly mezi vzorky nalezeny nebyly. Roztíratelné tuky byly rovn ž v barv velmi podobné, m ly v tšinou jemnou a ne p íliš výraznou v ni. Textura a roztíratelnost u t chto vzork byla hodnocená nej ast ji jako dobrá. U vzork Bertolli a Sonnereife již po krátké dob stání vystupoval olej, vzorek Sunny Glade byl krupi kovitý. Obsah trans nenasycených mastných kyselin nep ekro il u žádného výrobku 10 % z celkových mastných kyselin. Pr m rný obsah trans kyselin v letošním testu jsou necelá dv procenta. Z hlediska obsahu nasycených, monoenových a polyenových mastných kyselin je výrazn výhodn jší složení roztíratelných tuk než složení sm sných roztíratelných tuk , které mají vyšší obsah nasycených mastných kyselin a nižší obsah mastných kyselin nenasycených. Nejvyšší obsah polyenových mastných kyselin m la Flora nové složení, Perla tip, roztíratelný tuk Euro shoper a Linco family.

Pod kování:Práce byla vytvo ena za podpory MŠMT grant 6046137305

Použitá literatura:1. Nollet L.M.L.: Handbook of Food Analysis, Vol. 1, Dekker, New York, 1996, 358-360.

Kontaktní adresa: [email protected]

202

SENZORICKÉ HODNOCENÍ MRAŽENÝCH KRÉMJarošová Alžbeta, Šulcerová Hana, o ková Dana

Ústav technologie potravin, MZLU Brno

Sensorial assessment of frozen creams

Summary:At present time when market has been saturated, decisive indicators for customers are not only diet features but also sensorial characteristics of products, especially seasonings. Common consumer concentrates on descriptors already at chosing products at purchase itself, the others are judged while consuming. Experience from previous consuming influence next choise of the same or other product. At sensorial evaluation descriptors of two frozen vanilla creams Terno and Prima were monitored in dependence on vegetable as well as animal fat portion. Terno frozen cream contains milk and vegetable fat, Prima only vegetable fat. The evaluation was conducted by qualified people in sensorial laboratory of MZLU Brno, Faculty of Agronomy, Department of Food Technology during three years. Chosen descriptors were assessed at teperatures of - 6 °C and at common room temperature. Results were evaluated and statistically analyzed by programme Unistat Ltd.

ÚVOD

První písemné záznamy a odborná literatura uvád jí, že již faraónové ve starém Egypt znali ovocné š ávy chlazené sn hem. Sta í ekové a ímané si pochutnávali na zmrzlinách, které byly slazené medem a ochuceny r znými druhy ovocných š áv a vínem. Také anglický král Jakub II si pochutnával na takto p ipravených ovocných š ávách. Tyto poživatiny nem ly charakter dnešní zmrzliny, byly to zmrzlé vodní krystalky vzniklé z ovocných š áv (2). Prvním pokrokem sm ující k výrob mražené krémové sm si bylo objevení um lého ledu mužem jménem Blasius Villafrance z íma. Ten v roce 1550 zjistil, že je možné snížit bod mrazu, když se ke sn hu p idá ledek nebo s l (5). K dalšímu vývoji došlo v roce 1970, kdy paní Nancy Johnsonová sestrojila stroj na výrobu zmrzliny (2).

Pr lom p i výrob zmrzliny zp sobil první ru ní výrobník zmrzliny vynalezen v roce 1846 a samoz ejm patentování ledni ky Carlem von Linde v roce 1876 (5). Hladkou konzistenci získala zmrzlina až s vynálezem dvoupláš ových míchacích za ízení (2). V roce 1922 se Thomas Wall rozhodl pro výrobu balené zmrzliny. V té dob se také objevuje mražený krém mezi dv ma oplatkami ("Sibirka") a v 30. letech "zmrzliny na klacku". Ve 40. letech se zmrzlinový pr mysl "usadil" a výroba z stala bez podstatných zm n až do 70. let. V té dob za ala tradi ní zmrzlina ustupovat s nár stem balených zmrzlinových výrobk pro velké samoobsluhy (5).

P estože se objevují nové suroviny i p ísady, lze s ur itostí íci, že um ní výroby zmrzlin se za posledních 100 let již tém nezm nilo (2).

V dnešní dob má spot eba mražených krém stoupající tendenci. Spot eba v R iníasi 6 l na osobu, což je o t etinu mén než ve starých zemích EU. Celková spot ebaje od roku 2001 stabilní (12 300 až 12 900 t). Podíl mražených krém na celkové spot ebmlé ných výrobk je 13 %. V eské republice jsou nejpopulárn jší „levné“ zmrzlinové dorty – eská a slovenská specialita. Asi t etina tuzemské produkce se exportuje – tém celý export

(2 843 t) jde na Slovensko. Dovoz mražených krém dosáhl v roce 2004 60 %. Jednalo se p edevším o import z Ma arska (2 412 t), Polska (2 323 t) a Slovenska (1 030 t).

Senzorická analýza nachází v potraviná ském pr myslu stále významn jší uplatn ní.Její d ležitost p i výrob je dána odezvou spot ebitele. Práv spot ebitel hodnotí zakoupenou potravinu základními smysly, což p edstavuje základ senzorické analýzy. Na základ jeho hodnocení se tato potravina stane kupovanou nebo ne.

Mražené smetanové krémy pat í do skupiny potravin, u kterých jsou p esn stanovené znaky pro sledování senzorické jakosti výrobku.

203

MATERIÁL A METODY

Použitý materiál

K senzorickému hodnocení bylo použito dvou druh mražených krém . Vzorky byly zakoupeny v obchodní síti m sta Brna. V obou p ípadech se jednalo o vzorky vanilkového polárkového dortu.

Charakteristika vzorkVzorek 1: Mražený vanilkový polárkový dort Prima - výrobce - NOWACO s.r.o., Opava – složení: voda, cukr, rostlinný tuk, p írodn identické smetanové aroma, sušené odst ed né mléko, sušenou syrovátku, stabilizátory (estery masntných kyselin E 471, karubin E 410, guma gust E 412), rozpoušt dlo – hydroxypropyl – škrobový difosfát (E 1442), p írodní a p írodn identická aromata, potravní dopl ky, barviva. Vzorek 2: Mražený vanilkový polárkový dort Terno - výrobce - NANUK Zdounky - složení: voda, cukr, mlé ný tuk, rostlinný tuk (9%), sušené podmáslí, sušenou syrovátku, škrob, emulgátor (mono a diglyceridy E 471), stabilizátory (alginát sodný E401, karagenan E407, karubin E410, guma gust E412), smetanové aroma vanilkové a smetanové p írodn identické aroma, ethylvanilin, kakaovou polevu (voda, cukr, sušená syrovátka, kakao (7 %), corobový prášek, škrob.

Použité metody Senzorická analýza

U vzork mražených smetanových krém byla provedena senzorická analýza se zam ením na vybrané vlastnosti.Mražené krémy byly hodnoceny studenty Mendelovy zem d lské a lesnické univerzity v Brn , oboru Technologie potravin. Vlastní hodnocení probíhalo v senzorické laborato i Ústavu technologie potravin, která spl uje p esn definované podmínky mezinárodní normy ISO 8589, pro vybavení místnosti, p ípravy a p edkládání vzork (3). Vzorek mraženého krému byl posuzovatel m podáván p i dvou teplotách v závislosti na deskriptorech, který hodnotili. Textura zmrzliny byla analyzována p i teplot vzork -6 °C, chu byla hodnocena až po roztátí zmrzliny (teplota místnosti). Vzorek byl p edkládán vždy o stejném množství (30 g).

Pro hodnocení byly použity intervalové grafické nestrukturované stupnice (100 mm, 1 mm = 1 bod) se slovním popisem krajních bod . P i zpracovávání formulá byli zvláš vyhodnoceny odpov di žen a muž a následn byla vytvo ena pr m rná hodnota, která byla porovnávána mezi jednotlivými vzorky.

Statistické metody Výsledky m ení získané vyhodnocením dotazník byly vloženy do programu MS Excel.

Pomocí tohoto programu byly vypo teny pr m rné hodnoty jednotlivých deskriptor ,jejich minimální a maximální hodnota, sm rodatná odchylka a varia ní koeficient.

Nam ené hodnoty byly statisticky zpracovány v statistickém programu Unistat Ltd.

VÝSLEDKY A DISKUZE

U mražených krém byly hodnoceny tyto deskriptory: barva, rovnom rnost zabarvení, chladivost v ústech, tvrdost v ústech, konzistence, viskozita, p ilnavost v ústech, sladká chu ,intenzita p íchuti, smetanová chu , chu po mlé ném tuku, karamelová chu a chu ho ká.

Hodnocené deskriptory byly rozd leny do t í skupin: hodnocení vybraných vlastností, hodnocení textury, hodnocení chut .

204

Hodnocení vanilkového polárkového dortu Prima Hodnocení vybraných vlastností

Barva by m la být typická pro danou p íchu , s p im enou intenzitou. Pr m rnáhodnota (38) byla stanovena jako mírn sv tlá. Dalším hodnoceným deskriptorem bylo rovnom rnost zabarvení. Je d ležité, aby barva s intenzitou zabarvení tvo ila jednotný celek. Okraje nesmí být tmavší nebo sv tlejší. Hodnotitelé posuzovali barvu za dosti rovnom rnou (32). Chladivost v ústech udává, zda výrobek je pro spot ebitele osv žující nebo vyvolávající p ípadnýpocit bolesti z chladu. Tento deskriptor byl posuzován jako nadpr m rn intenzivní (68).

0

50

100

barva rovnom rnostzabarvení

chladivost v ústech

deskriptory

hodn

otite

lská

stup

nice

muži pr m r ženy

Obr. 1 Senzorické hodnocení vybraných vlastností polárkového dortu Prima

Hodnocení textury Tvrdost v ústech je pro konzumenta jedna s nejd ležit jších texturních vlastností. Celkov

byla hodnocena jako mírn m kká (28). Konzistence výrobku byla hodnocena jako st edn hladká (42).Viskozita výrobku byla hodnocena jako pr m rná, tzn., že výrobek viskozitou hodnotitel mzcela vyhovoval. P ilnavost v ústech by nem la být p íliš vysoká, což vzorek spl oval.

0102030405060

tvrdost v ústech konzistence viskozita p ilnavostv ústech

deskriptor

hodn

otite

lská

stup

nice

muži pr m r ženy

Obr. 2 Senzorické hodnocení texturních vlastností polárkového dortu Prima

Hodnocení chuti Sladká chu byla hodnocena jako dosti intenzivní (69). Intenzitu p íchut a smetanovou

chu všichni hodnotitelé zvolili jako pr m rnou, tzn. zcela vyhovující. Chu po mlé ném tuku byla hodnocena jako st edn intenzivní (44). Mezi vady chuti byla za azena chu karamelová a ho ká.

0

20

40

60

80

sladká chu intenzitap íchuti

smetanováchu

chu pomlé ném

tuku

karamelováchu

ho ká chu

deskriptor

hodn

otite

lská

stup

nice

muži pr m r ženy

Obr. 3 Senzorické hodnocení chuti polárkového dortu Prima

205

Hodnocení vanilkového polárkového dortu Terno Hodnocení vybraných vlastností

Barva by m la být krémov žlutá. Posuzovatelé ji hodnotili jako mírn sv tlou (39). Rovnom rnost zabarvení - vzorek byl tím rovnom rn ji zabarven ím m l nižší bodové ohodnocení - velmi rovnom rné (12). Chladivost v ústech byla hodnocena jako dosti intenzivní (65).

-50

0

50

100

barva rovnom rnostzabarvení

chladivost v ústech

deskriptor

hodn

otite

lská

stup

nice

muži pr m r ženy

Obr. 4 Senzorické hodnocení vybraných vlastností polárkového dortu Terno

Hodnocení textury Tvrdost v ústech byla vnímána jako dosti m kká (23). Konzistence byla hodnocena jako

dosti hladká (22) - nižší bodové hodnocení vyjad ovalo hladší konzistenci. Viskozita byla pr m rná, tzn., výrobek viskozitou hodnotitel m vyhovoval. P ilnavost v ústech by nem la být p íliš vysoká, což vzorek spl oval. Posuzovatelé jej hodnotily jako velmi mírn p ilnavou (28).

0204060

tvrdost vústech

konzistence viskozita p ilnavostv ústech

deskriptor

hodn

otite

lská

stup

nice

muži pr m r ženy

Obr. 5 Senzorické hodnocení texturních vlastností polárkového dortu Terno

Hodnocení chuti Sladká chu byla hodnocena jako mírn intenzivní (67). Intenzita p íchut (53)

i smetanová chu (58) byly vnímány jako pr m rné. Chu po mlé ném tuku (39) karamelová chu (19) byly zhodnoceny jako Ho ká chu byla nepatrná (4).

-200

204060

80100

sladká chu intenzitap íchuti

smetanováchu

chu pomlé ném

tuku

karamelováchu

ho ká chu

deskriptor

hodn

otite

lská

stup

nice

muži pr m r ženy

Obr. 6 Senzorické hodnocení chuti polárkového dortu Terno

206

Srovnání hodnocení mražených smetanových krém Prima (P) a Terno (T) Hodnocení vybraných vlastností

První hodnoceným deskriptorem byla barva. U obou vzork ji posuzovatelé vyhodnotili jako mírn sv tlou až st edn intenzivní (P – 38, T – 39). Další hodnocenou vlastností byla rovnom rnost zabarvení. Vzorek Prima byl vyhodnocen jako dosti rovnom rn zabarvený (32) a vzorek Terno jako velmi rovnom rn zabarvený (12). Chladivost v ústech byla ohodnocena v obou p ípadech (P – 68, T - 65) jako dosti intenzivní.

Bylo prokázáno, že vzorek Prima vykazoval vysoce významný statisticky pr kazný rozdíl v porovnání s vzorkem Terno v rovnom rnosti zabarvení. Terno byl nepatrn tmavší, ale i p esto výrobce dokázal docílit rovnom rnosti zabarvení. Lze usoudit, že vzorek Prima pravd podobnnebyl p i výrob dostate n homogenizován i použité barvivo nebylo vhodn zvoleno a upraveno. I p esto, že zde bylo použito E 1442, které se používá k rozpoušt ní, ed nía jiné fyzikální úprav p ídatných látek, nebylo docíleno dostate né rovnom rnosti zabarvení.

Hodnocení textury K hodnoceným deskriptor m byla do této skupiny za azena tvrdost v ústech. Tento

deskriptor byl u vzorku Terno vnímán jako dosti m kký (23) a u vzorku Prima jako mírn m kký(28). Další vlastností byla konzistence vzorku. U vzorku Prima byla hodnocena jako st edn hladká (42) a u vzorku Terno jako dosti hladká (22). U této vlastnosti byl prokázán vysoce významný statisticky pr kazný rozdíl. Viskozita obou výrobk byla hodnocena jako pr m rná, tzn., že výrobky viskozitou hodnotitel m vyhovovaly (P – 48, T – 43). Posledním posuzovaným deskriptorem v této skupin byla p ilnavost v ústech. Posuzovatelé u vzorku Prima hodnotily p ilnavost v ústech jako dosti slab p ilnavý (37) a u vzorku Terno jako mírn p ilnavý (28). Mezi výsledky stanovenými u p ilnavosti v ústech byl stanoven statisticky pr kazný rozdíl. Na základzjišt ných výsledk lze vyhodnotit, že vzorek Prima byl tvrdší než Terno, ale tento rozdíl nedosahoval statisticky pr kazného rozdílu. Naopak vzorek Terno byl dosti hladké konzistence a v porovnáním se vzorkem Prima rozdíl dosahoval statisticky velmi pr kazného rozdílu. Také p ilnavost v ústech u tohoto vzorku dosáhla statisticky pr kazného rozdílu v porovnání s vzorkem Terno. P i hodnocení texturních vlastností se projevil statisticky pr kazný rozdíl u dvou deskriptor , a to u konzistence a p ilnavosti v ústech. U obou vlastností posuzovatelé dávali p ednost vzorku Terno. Konzistence i p ilnavost v ústech je ovlivn na mnoha aspekty, a to jak p ivýb ru surovin tak i p i vlastní výrob . P i sestavování sm si záleží na vhodn zvoleném tuku, stabilizátoru a emulgátoru. U mraženého krému Prima nebylo použito emulgátoru, který má vliv na stabilitu tuku v mraženém krému. Velký vliv na konzistenci má op t správná homogenizace základní sm si, ímž se vytvo í hladká konzistence a zabrání se vyvstávání nebo shlukování mlé ného tuku, který je patrný p i hodnocení p ilnavosti v ústech a celkové lehkosti MK.

Hodnocení chuti Sladká chu - tato vlastnost byla u obou vzork vnímána jako dosti intenzivní (P – 69,

T- 67). Intenzita p íchut (P – 58, T – 53) a smetanová chu (P – 57, T – 58) byli považovány hodnotiteli za pr m rné. Chu po mlé ném tuku byla vyhodnocena jako mírn slabá (39) u vzorku Terno a u vzorku Prima jako st edn intenzivní (44).

K nežádoucím chu ovým vlastnostem pat í karamelová a ho ká chu . U obou vzork byla karamelová chu zaznamenaná jako mírn slabá (P – 22, T – 19). Ho ká chu byla vyhodnocena u vzorku Prima jako mírn patrná (8) a u vzorku Terno byla zhodnocena jako nepatrnzaznamenaná (4). U této vlastnosti byl prokázán statisticky pr kazný rozdíl. Ho ká chuby se nem la v mražených krémech v bec vyskytovat. Jejím zdrojem mohli být p ídavné látky. Jelikož u vzorku Prima byla ho ká chu intenzivn jší a zárove i intenzita p íchuti byla vyšší je možné usoudit, že ho ká chu pocházela z vanilkového aroma.

207

-200

2040

6080

Barv

a

Rovn

omrn

ost

zaba

rven

í

Chla

divo

stv

úste

ch

Tvrd

ost

vús

tech

Kon

ziste

nce

Visk

ozita

Piln

avos

tv

úste

ch

Slad

ká c

hu

Inte

nzita

píc

huti

Smet

anov

ách

u

Chu

po

mlé

ném

tuku

Kar

amel

ová

chu

Ho

ká c

hu

deskriptor

hodn

otite

lská

stup

nice

Prima Terno

Obr. 7 Porovnání senzorického hodnocení polárkových dort Prima a Terno

ZÁV R

P i porovnávání dvou druh mražených krém hodnotitelé dávali p ednost mraženému krému Terno. Tento krém m l rovnom rn jší zabarvení, hladší konzistenci, p ilnavost v ústech nebyla tak intenzivní a ho ká chu byla p ítomna jen nepatrn . Posuzovatelé jej hodnotili jako sv žís p im enou sladkostí a s p im enou intenzitou p íchuti a chutí smetanovou. U deskriptorse statisticky pr kazným rozdílem (p ilnavost v ústech, ho ká chu ) nebo vysoce významným pr kazným rozdílem (rovnom rnost zabarvení, konzistence) m l mražený krém Terno vždy kvalitativn lepší výsledky.

Mražený krém Prima byl vyhodnocen posuzovateli jako vyhovující. Byl sv tlejšího zabarvení a s nižší rovnom rností zabarvení. P i hodnocení texturních vlastností byla zjišt nast ední viskozita, mén hladká konzistence. P i hodnocení chu ových vlastností dosahoval nadpr m rných vlastností. Byla u n j výrazná ho ká a karamelová chu .

Mražený krém Terno byl hodnocen jako velmi dobrý.

Použitá literatura:1. GAJD ŠEK, S. Mlékárenství II. Brno: MZLU, 2000. 142 s. ISBN 80-7157-342-6. 2. HAMR, K., STEJSKALOVÁ, J., KADLEC, F. Receptury pro cukrá skou výrobu: Zmrzliny.

1. vyd.: Idea servis, konsorcium, 1996. 84 s. ISBN 18-66-030-96. 3. JAROŠOVÁ, A. Senzorické hodnocení potravin. 1. vyd. Brno: MZLU, 2001. 84 s. ISBN

80-7157-539-9.4. JANTOŠOVÁ, B., HOLEC, J. Hygiena a technologie mléka a mlé ných výrobk . 1. vyd. Brno:

VFU, 2004. 72 s. ISBN 4-1190-054. 5. ANONYM 2003: Zmrzlina. www.guido.cz / [online].[cit. 2004-09-02]. eský. Dostupný

z WWW:http://www.agris.cz/potravinarstvi/index.php

Kontaktní adresaIng. Hana Šulcerová, Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno,tel.: 545 133 337, e-mail: [email protected].

208

SLEDOVÁNÍ ZM N SENZORICKÝCH VLASTNOSTÍ BÍLÝCH JOGURTPO DOBU JEJICH MINIMÁLNÍ TRVANLIVOSTI

Šulcerová Hana, Šustová Kv toslava, Vaculínová Hana Ústav technologie potravin, MZLU Brno

Changes monitoring of white yoghurts sensorial characteristics during their minimal endurance time

Summary:Besides chemical and microbial parameters of white yoghurts, other quality indexes are also one of sensorial features. Products introduced in market have to fulfill set criteria. One of them is minimum endurance time. Of course, even during this period certain sensorial changes appear which can influence customer choice at repetitional purchase. In sensorial lab of Institute of MZLU Brno, Faculty of Agronomy, Department of Food Technology, samples of white yoghurts of different fat proportion from different producers were evaluated by qualified staff. Samples were given to the lab right from the producer and assessed on their production day. Changes of particular descriptors were monitored depending on length of storage and fat proportion during their minimum endurance time. Finally, results were evaluated and statistically analyzed.

ÚVODlov k konzumuje kysaná (fermentovaná) mléka již dlouhá staletí, a koliv p esn jší údaje

o jejich p vodu a vzniku se liší. P vodn byl jogurt p ipravován z ov ího a buvolího mléka a áste n z kozího a kravského. Používal se v lidské strav pro p ímou konzumaci, pozd jibyl ochucován a fortifikován dalšími p ísadami jako zelenina, ovoce a ko ení, byl využívám pro va ení a pe ení. Pr myslov byl jogurt poprvé p ipraven firmou DANONE (1922) a rozvoj výroby, jako takové, se datuje po druhé sv tové válce (4).

V sou asné dob je celosv tov uznávanou skute ností, že r zné druhy ušlechtile zakysaných mlék vhodnými mikroorganismy jsou možností, jak konzumovat mléko, které m ženejmén škodit a má naopak v mnoha ohledech pro lov ka nesporn kladný význam (6).

Fermentované mlé né výrobky pat í mezi historicky nejstarší mlé né výrobky. Jejich skladba je velmi pestrá a jsou výrazné rozdíly ve složení a vlastnostech t chto výrobka to zem pisné i krajové (5).

Jogurty jsou v celosv tovém m ítku nejrozší en jšími a nejoblíben jšími kysanými mlé nými výrobky. Rozší ení jejich výroby p ineslo s sebou i adu odlišných výrobních technologií a rozmanitost v charakteristických znacích finálních výrobk . Podle charakteru výroby i požadovaných organoleptických vlastností se ídí i výb r vhodných istých mléka ských kultur pro zajiš ování biochemických pochod (3).

Jogurty jsou kysané mlé né výrobky získané kysacím procesem z pasterovaného mléka s r zným obsahem mlé ného tuku, za použití „jogurtové kultury“, která obsahuje mikroorganismy druhu Streptococcus salivarum ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrücki ssp. bulgaricusve vhodném pom ru a vyvolává charakteristické biochemické zm ny (4). innost Streptococcussalivarum ssp. thermophilus se uplat uje zejména na po átku doby zrání, kdy produkuje r stové látky, které stimulují r st Lactobacillus delbrücki ssp. bulgaricus. Streptococcus thermophilusje zna n citlivý v i inhibi ním látkám, asto dochází k oslabení jeho innosti, což zp sobí snížení jakosti finálního výrobku (1). Nepatrná peptoniza ní innost Lactobacillus bulgaricus je významná tím, že uvol uje n které aminokyseliny z kaseinu a podporuje pokra ovací r st Streptococcusthermophilus po spot ebování d ležitých aminokyselin v mléce. Symbióza Streptococcusthermophilus a Lactobacillus bulgaricus zp sobuje vznik typického aroma, jehož hlavní složkou je acetaldehyd. Hlavním producentem acetaldehydu je Lactobacillus bulgaricus, ale ve sm snékultu e se tvo í rychleji a ve v tším množství. Pom r Streptococcus thermophilus a Lactobacillusbulgaricus (nej ast ji 1:1 i 2:1)v jogurtové kultu e závisí na teplot , dob kultivace a množství inokula.Vyšší teplota a delší kultiva ní doba i vyšší množství inokula zp sobují vyšší podíl Lactobacillus bulgaricus, a tudíž i vyšší aromati nost výrobku. Nižší teplota a vyšší množství inokula zap í i ují zvýšený podíl Streptococcus thermophilus, což zp sobuje pomalé prokysávání a menší tvorbu aromatických látek.

209

Zákazníci jsou, bohužel, velmi málo informováni o tom, pro vlastn jogurty – a obecn zakysané výrobky – jsou zdravé, co je toho podstatou, a podle jakých zásad by si je m livybírat, aby skute n pro jejich zdraví zaru ili doporu ované dieteticko-lé ebné výhody (6).

Jedním z ukazatel , sloužících k opakovanému výb ru a konzumaci jogurt spot ebiteli, jsou senzorické vlastnosti výrobk , podle nichž se b žný spot ebitel orientuje. Tyto vlastnosti se samoz ejm m ní v pr b hu doby skladování (minimální trvanlivosti). Avšak ne vždy jsou právtyto senzorické vlastnosti na konci doby minimální trvanlivosti odpovídající erstvému výrobku.

MATERIÁL A METODY

Použitý materiál

Pro mikrobiální rozbory a senzorické hodnocení bílých jogurt byly použity vzorky od r zných výrobc , kte í své produkty dodávají do maloobchodních i velkoobchodních sítí nejen na eském trhu. Vzorky pocházely ze šarží po výrob a na konci doby minimální trvanlivosti v období mezi 20.12.2006 až 31.12.2006.

Charakteristika vzorkVzorek 1: Moravia – bílý jogurt

- výrobce: Moravia Lacto, a.s., Jihlava - složení: mléko, živá jogurtová kultura - obsah tuku: min. 3,5%

Vzorek 2: Klasik – bílý jogurt se sníženým obsahem tuku - výrobce: OLMA, a.s., Olomouc - složení: mléko, sušené odst ed né mléko, škrob, sušená syrovátka, želatina, živá

jogurtová kultura - obsah tuku: mén než 3%

Vzorek 3: Bio Via Natur – biojogurt bílý - výrobce: OLMA, a.s., Olomouc - složení: mléko, škrob, sušené odst ed né mléko/sušená syrovátka - obsah tuku: nejmén 3,2 %

Vzorek 4: Silueta light jogurt – natur 0,1% tuku, bez cukru pro štíhlou linii - výrobce: OLMA, a.s., Olomouc - složení: odst ed né mléko, sušené mléko, sušené odst ed né mléko, škrob, mlé né

bílkoviny, želatina, živá jogurtová kultura - obsah tuku: nejvýše 0,1%

Vzorek 5: Revital aktive bílý - výrobce: OLMA, a.s., Olomouc - složení: mléko, sušené odst ed né mléko, škrob, mlé ná bílkovina, želatina, inulín,

jogurtová a probiotická kultura - obsah tuku: mén než 3%

Vzorek 6: Smetanový jogurt bílý - výrobce: Mlékárna Valašské Mezi í í, spol. s r.o., Valašské Mezi í í- složení: smetana, živá jogurtová kultura - obsah tuku: 10% - známka KLASA

Vzorek 7: Bílý jogurt z Valašska - výrobce: Mlékárna Valašské Mezi í í, spol. s r.o., Valašské Mezi í í- složení: mléko, sušené mléko, živá jogurtová kultura - obsah tuku: 3%

210

Použité metody

Senzorická analýza Vzorky bílých jogurt byly hodnoceny studenty Mendelovy zem d lské a lesnické

univerzity v Brn , oboru Technologie potravin. Senzorické hodnocení probíhalo v senzorické laborato i Ústavu technologie potravin, která spl uje podmínky mezinárodní normy ISO 8589, pro vybavení místnosti, p ípravy a p edkládání vzork (2).

Vzorky jogurt byly posuzovatel m p edloženy ihned po výrob (první den za átku doby minimální trvanlivosti) a následn v poslední den doby minimální trvanlivosti. V mezidobí byly skladovány p i teplotách doporu ených výrobcem, jež byly uvedeny na obalech. Vzorky byly podávány hodnotitel m vždy o stejném množství (30 g). Pro senzorickou analýzu byly použity formulá e s bodovými stupnicemi se slovním popisem jednotlivých bod .

Senzorické hodnocení jogurt probíhalo se zam ením na vybrané vlastnosti.

Mikrobiální analýza K rozbor m byla odebírána celá spot ebitelská balení. Odb r vzork byl provád ndle normy SN ISO 707 a jejich úprava dle normy SN ISO 8261.

Stanovení celkového po tu mikroorganism (CPM) dle normy SN ISO 6610 Kultivace se provádí na p d PCA (Plate Count Agar) firmy NOACK, Francie, aerobn ,po dobu 72 hod., p i teplot 30°C. O kování se provádí p elivem.Stanovení rodu Streptococcus dle normy SN ISO 9232Kultivuje se na p d M17 + bakteriologický agar firmy MERCK, N mecko, aerobn , po dobu 72 hod., p i teplot 37°C. O kování se provádí p elivem. Stanovení rodu Lactobacillus dle normy SN ISO 9232Kultivace se provádí na p d MRS firmy NOACK, Francie, anaerobn , po dobu 72 hod., p i teplot 30°C. O kování se provádí p elivem.

Analytické metody - stanovení titra ní kyselosti (SH) Stanovení titra ní kyselosti je jednou ze základních metod hodnocení mlé ných výrobk .

Vychází ze spot eby odm rného roztoku NaOH (0,25 mol*l-1) na neutralizaci kysele reagujících látek na indikátor fenolftalein ve 100 ml (100 g) vzorku.

VÝSLEDKY A DISKUZE

U všech zkoušených vzork byly sledovány tyto deskriptory: uvol ování syrovátky, viskozita, textura, v n , intenzita v n , chu , kyselost, p ítomnost cizích p íchutí, celkový dojem. Z t chto deskriptor byly vybrány a porovnávány u jednotlivých vzork takové, které jsou považovány pro spot ebitele jako st žejní. P i pozitivním ohodnocení t chto deskriptor se zvyšuje pravd podobnost, že konzument bude nákup opakovat. Senzorická zkouška se provád la vždy na za átku a na konci doby trvanlivosti, každého hodnocení se zú astnilo 10 hodnotitel .

Bílý jogurt z Valašska V n byla na za átku i na konci doby skladování ohodnocena velmi kladn . Na po átku

byla ozna ena 5 hodnotiteli z 10 jako „velmi p íjemná, typická pro daný výrobek“, na konci doby skladování ji stejn ohodnotili 3 posuzovatelé. Chu se nepatrn zhoršila, zatímco ji na za átku7 hodnotitel ozna ilo jako „ typickou, dosti p íjemnou“ na konci jich bylo 5, i když v jednom p ípad byla chu posouzena lépe – „velmi p íjemná, typická pro daný výrobek“. Kyselost v pr b hu skladování vzrostla a na konci byla v tšinou posuzována jako „pr m rná, dostate nkyselá“. Celkový dojem z daného výrobku se zhoršil. Na po átku skladování jej 4 hodnotitelé ozna ili jako „velmi dobrý, lahodný“, na konci byl vzorek takto ohodnocen pouze v jednom p ípad .

211

Smetanový jogurt bílý Tento jogurt si po celou dobu skladování udržoval velmi dobré vlastnosti. V n se tém

nezm nila. Na po átku byla hodnocena od „typické pro daný výrobek, velmi p íjemná“ p es „dosti p íjemná“ až po „pr m rná, ješt vyhovující“, na konci skladování byla v n ve všech p ípadech ozna ena jako „typická pro daný výrobek, velmi p íjemná“ a „dosti p íjemná“. Chu se mírnzlepšila a tém ve 100% byla srovnatelná na za átku i na konci, ani v jednom p ípad nebyla hodnocena h e než „pr m rná, ješt p íjemná“. Kyselost v pr b hu skladování klesla. Celkový dojem je srovnatelný jak na za átku tak na konci. B hem skladování si výrobek udržel své vlastnosti a jeho senzorická kvalita nebyla zm n na, což je velmi pozitivní pro spot ebitele a d ležité pro opakovanou koupi. Titra ní kyselost u vzorku smetanového jogurtu byla nejnižší, což mohlo být zp sobeno obsahem tuku 10%.

KlasikU v n došlo ke zhoršení, zatímco na za átku byla v n ozna ena 8 hodnotiteli jako „dosti

p íjemná“ na konci tento po et poklesl na 5. Chu se v pr b hu skladování zhoršila, Kyselost z stala tém srovnatelná a na konci ji 2 hodnotitelé ohodnocena jako „siln kyselá“. Celkový dojem se zhoršil, polovina respondent tento vzorek ozna ila body „pr m rný“ a „ne zcela uspokojivý“.

Silueta light V n byla po dobu minimální trvanlivosti srovnatelná. Hodnocení chuti se na po átku

pohybovalo v rozmení „velmi p íjemná, typická pro daný výrobek“ po „pr m rná, ješt p íjemná“,na konci byla uplatn ná stupnice „typická, dosti p íjemná“ po „tém nevyhovující, témnep íjemná“. Nejvyšší etnost v obou p ípadech je u bodu „pr m rná, ješt p íjemná“. Kyselost výrazn ji klesla a na konci skladování byla ohodnocena také jako „velmi slabá“. Celkový dojem se zhoršil. Na za átku je nejvyšší etnost u hodnoty „velmi dobrý, lahodný“ a „ lepší než pr m rný“, zatímco na konci se hodnocení pohybovalo v mezích „lepší než pr m rný“a „pr m rný“.

Revital V n se b hem skladování zhoršila. Na za átku byla ohodnocena nej ast ji jako „typická

pro daný výrobek, velmi p íjemná“ a „dosti p íjemná“, na konci byla nejv tší etnost u bodu „pr m rná, ješt p íjemná“. Docházelo též k výraznému uvol ování syrovátky na konci doby skladování. U chuti došlo k nepatrnému zhoršení. Kyselost na za átku i na konci byla srovnatelná. Cekový dojem se zhoršil. Na za átku 7 z 10 posuzovatel ozna ilo celkový dojem jako „velmi lahodný, lahodný“, na konci skladování byl stejn ohodnocen pouze ve 3 p ípadech a jedním hodnotitelem byl ozna en jako „ne zcela uspokojivý“.

MoraviaNa za átku ozna ilo 8 z 10 hodnotitel v ni jako „typickou pro daný výrobek, velmi

p íjemnou“, na konci ji stejn ohodnotil pouze 1 z 10 posuzovatel . P esto se hodnocení ve všech p ípadech pohybovalo do hodnoty „pr m rná, ješt p íjemná“ a nebyl ani jeden vzorek hodnocen jako „skoro nevyhovující, málo p íjemná“ nebo „nevyhovující, netypická, nep íjemná, cizí pachy“. Chu se výrazn zhoršila. Zatímco na za átku 5 hodnotitel z 10 ozna ili chu jako „velmi p íjemnou, typickou pro daný výrobek“, na konci takto nebyl ohodnocen ani jednou, 3 z 10 posuzovatel ur ili chu jako „tém nevyhovující, tém nep íjemná“. Kyselost se v pr b huskladování áste n zvýšila. Celkový dojem se pohyboval na po átku v rozmezí „vynikající, lahodný, harmonický“ až po „lepší než pr m rný“. Na konci se hodnocení pohybovalo od „lepší než pr m rný“ p es „pr m rný“ po „ne zcela uspokojivý“. Titra ní kyselost byla u tohoto vzorku nejvyšší.

Bio Via Natur U tohoto vzorku došlo v pr b hu skladování k viditelnému uvol ování syrovátky

a naprostá v tšina hodnotitel tuto vadu charakterizovala. V n se mírn zhoršila. Chu na za átkui na konci se pohybovala tém v celé škále hodnotitelské stupnice. Na konci byla chu ve dvou

212

p ípadech ohodnocena jako „nevyhovující, nep íjemná, netypická pro daný výrobek“. Kyselost se zvýšila. Celkový dojem se zhoršil a na konci se pohyboval od hodnoty „lepší než pr m rný“po „velmi špatný“. Samoz ejm by tento výsledek senzorického hodnocení m l být alarmující pro výrobce i spot ebitele.

Vyhláška 77/ 2003 Sb., ve zn ní pozd jších zm n a p edpis , kterou se stanoví požadavky na mléko a mlé né výrobky, mražené krémy, jedlé tuky a oleje vymezuje požadavky na jogurty a podle ní má 1 g jogurtu obsahovat nejmén 107 mlé né mikroflóry. Ve všech vzorcích byl tento limit dodržen. Pro CPM není limit vyhláškou stanoven, avšak jeho stanovení je významné, jako základní informace o stupni mikrobiální kontaminace nejen mléka jako vstupní suroviny, ale i hotových výrobk . Z výsledk lze usuzovat na dodržení technologických a hygienických postup p i výrob a je možno ur it pravd podobnou trvanlivost a zjistit po ínající zkázu potravin.

ZÁV R

V souboru vzork , které byly hodnoceny se vyskytovalo p t, se srovnatelným obsahem tuku (cca 3%), jeden vzorek – smetanový jogurt bílý – s obsahem tuku 10% a jeden jogurt Silueta light s obsahem tuku 0,1%. Dva poslední vzorky zde byly uvedeny pro srovnání.

Podstatné zm ny p i mikrobiální i senzorické analýze byly zjišt ny u dvou vzork . Patrný rozdíl – nár st – CPM byl zaznamenán u dvou vzork , a to Klasik a Bio Via Natur, kde narostlé kolonie v sedmém a osmém ed ní byly na konci doby trvanlivosti již nepo itatelné. U t chto dvou vzork došlo v pr b hu doby skladování též k nár stu po tu streptokok . Tímto nár stem mohl být ovlivn n celkový po et mikroorganism . Po et laktobacil se snížil. U obou vzork došlo také ke zhoršení senzorických vlastností. Syrovátka se uvol ovala v nepatrném množství již p i hodnocení ihned po výrob , a p i následné senzorické analýze na konci doby skladování došlo k jejímu výraznému uvol ování. Tento jev mohl být zp soben p ídavkem sušené syrovátky do obou výrobk . V ostatních vzorcích se sušená syrovátka nevyskytovala.

Všechny uvedené parametry mohly výrazn ovlivnit senzorické vlastnosti, protože také chu a celkový dojem byly p i senzorickém hodnocení u výrobk Klasik a Bio Via Natur nejhorší .

Výsledky tohoto hodnocení by m ly být nejen informací pro spot ebitele, dle jakých parametr si mají vybírat jogurty v tak velké škále nabídek, ale také pro výrobce, nebo nízká senzorická kvalita potraviná ských výrobk rozhoduje o obchodovatelnosti jejich zboží.

Použitá literatura:1. GAJD ŠEK, S. Mlékárenství II. Brno: MZLU, 2000. 142 s. ISBN 80-7157-342-6. 2. JAROŠOVÁ, A. Senzorické hodnocení potravin. 1. vyd. Brno: MZLU, 2001. 84 s. ISBN

80-7157-539-9.3. HYLMAR, B. Výroba kysaných mlé ných výrobk . Nakladatelství technické literatury, 1986,

s. 209 4. SNÁŠELOVÁ, J., DOSTÁLOVÁ, L. Jogurty v naší výživ, Spole nost pro výživu, 54, 1999,

s. 39-40 5. SIMEONOVONÁ, J., INGR, I., GAJD ŠEK, S. Zpracování a zbožíznalství živo išných

produkt . 1. vyd. Brno: MZLU, 2003. 124 s. ISBN 80-7157-708-1. 6. KROOVÁ, H. Jogurtový receptá . Milcom servis, a.s., Praha, 1992, 39 s.

Kontaktní adresaIng. Hana Šulcerová, Ústav technologie potravin, Mendelova zem d lská a lesnická univerzita v Brn , Zem d lská 1, 613 00 Brno tel.: 545 133 337, e-mail: [email protected].

213

VIRTUÁLNÍ REALITA V ELEKTRONICKÝCH POTRAVINÁ SKÝCH DATABÁZÍCH Uvíra Roman1, Pudil František1, Maryška Martin2

1 Ústav chemie a analýzy potravin, 2 Ústav skla a keramiky, VŠCHT Praha

Virtual reality in electronic food databases

Summary:With the full advantage of LUCIA G 5.0 software image analyser (Laboratory Imaging, Czech Republic) an image database for foods and food products is being developed within our workgroup. Virtual image documentation is also included in the database. Contribution of 3D focusing and three-dimensional imaging (through anaglyphs and 3D models), which create electronic virtual reality for reviewing food quality and for commodity expertise, is discussed on characteristic examples of ripening cheese.

ÚvodVirtuální realitu chápeme jako um lé prost edí vytvo ené po íta i. P estože je um lé,

umož uje nám simulovat reálné systémy, jejich vlastnosti a d je v nich probíhající 1. Pokro ilá virtuální realita vyžaduje zatím dosti drahé vybavení (p ilby se stereoskopickými displeji a prostorovým zvukem, rukavice s hmatovými senzory, atd.) a odpovídající technické zázemí, a proto není zatím p íliš rozší ená mimo oblast vojenského a zábavního pr myslu. Zjednodušené virtuální prost edí je realizovatelné i na b žném po íta i, kde p es vhodné zobrazovací za ízení (monitor, projekce, brýle) do virtuálního prostoru „vstupujeme“ a n jakým zp sobem (nap . myší a klávesnicí) s ním interagujeme 2. Hlavním cílem t chto technologií je intenzivn jší a v rohodn jšíp sobení na smysly lov ka.

Na r zných úrovních nachází virtuální realita široké uplatn ní ve vojenství (letecké a jiné simulátory), medicín , biologii, strojírenství (CAD aplikace), zábavním pr myslu (3D po íta ovéhry), atd.

Typickým p íkladem „reálného“ využití virtuální reality je virtuální mikroskopie. Virtuální mikroskopie je prezentací digitalizovaných obraz mikroskopických preparát (které již fyzicky nemusí existovat) prost ednictvím výpo etní techniky 345. S obrazy m žeme manipulovat jako bychom sed li u reálného mikroskopu. Navíc m žeme využívat r zná zobrazení a projekce. Virtuální mikroskopický obraz m že mít díky speciálnímu zpracování p vodních snímk podstatnvyšší hloubku ostrosti než dovoluje samotný mikroskop. Ovšem nezobrazuje se práv existující fyzický objekt, ale prezentují se elektronická data získaná jeho p edchozím snímáním a zpracováním.

Jedním druhem virtuální reality jsou vizualizované snímky z pro lov ka neviditelných oblastí spektra (UV, IR, apod.).

Nejv tším p ínosem technologií virtuální reality je možnost vid t, prezentovat nebo modelovat v ci, které reáln vid t není možné. Taková virtuální realita není pouze po íta em vygenerovaná fikce, ale je to ur itý jednozna ný odraz reáln existujícího sv ta.

V potraviná ství je virtuální realita využívána v obrazové analýze p i studiu mikroorganism 6, vlastností materiál 7 nebo potraviná ských parazit 8.

Cílem práce bylo na p íkladech jednodušších virtuálních obrazových dokumentzachycujících typické objekty plís ových sýr posoudit možnosti jejich využití v odborných potraviná ských aplikacích.

214

Materiál a metodyVirtuální obrazová dokumentace byla vytvo ena z fotografií plís ových sýr Fourme

d’Ambert (distributor Laktoimpex, eská Republika) a Lazur perlový Pearl (Spó dzielnaMleczarska Lazur, Polsko) zakoupených v obchodním et zci Delvita.

Materiál byl snímán t í ipovou TV kamerou Hitachi HV-C20 (Hitachi, Japonsko) s objektivem s prom nnou ohniskovou vzdáleností Navitar Macro Zoom (Navitar, USA). Osv tlení bylo zajišt no soustavou osv tlovacích prvk Kaiser RB 5000 DL (Kaiser, N mecko) a prosv tlovací sk íní Hama LP5000 K (Hama, N mecko).

Pro snímání objekt byla využita poslední verze softwaru pro obrazovou analýzu Lucia G 5.0 (Laboratory Imaging, eská Republika) obsahující modul Rozší ené hloubky ostrosti, který umož uje tvorbu virtuálních obraz .

VýsledkySnímáním objekt p i velkém optickém p iblížení dochází ve sm ru Z-osy k hloubkovému

rozost ení, kdy je zaost ená pouze ást objektu v rovin . Jemnou regulací objektivem a snímáním jednotlivých zaost ených rovin byly vytvo eny sekvence áste n zaost ených obraz jednotlivých objekt plís ových sýr ((d) (e) (f) Obr. 1a-1c).Modul Rozší ené hloubky ostrosti dokáže takto vytvo ené sekvence snímk zaost ených na r znýchhladinách slou it do jednoho obrazu s mnohem v tší hloubkou ostrosti (tzv. 3D zaost ování).Výsledný obraz lze prezentovat t emi zp soby: jako standardní barevný obraz ((d) (e) (f) Obr. 1d),jako prostorový anaglyf ((d) (e) (f) Obr. 1e) nebo jako 3D model ((d) (e) (f) Obr. 1f).

Objekty na anaglyfech mají dvojí barevné kontury, jejichž pozorováním p es odpovídající filtry (dvoubarevné brýle) vzniká v rohodný prostorový dojem 9. 3D modely, které lze v Lucia G 5.0 zkoumat pomocí vestav ného prohlíže e, simulují povrch snímaného objektu vystupujícího do prostoru.Vybrané virtuální obrazy plís ových sýr v r zných formách jsou prezentovány na Obr. 2a-2f.

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

Obr. 1. Ukázková sekvence obraz plís ového sýru Fourmet d’Ambert demonstrující použitou techniku a možnosti výstupních forem. Obrazy s r znou hloubkou ostrosti (a-c), výsledný zaost ený obraz (d), prostorový anaglyf - pro trojrozm rný vjem je zapot ebí brýlí s barevnými filtry (e), 3D model (f).

215

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

Obr. 2. Vybrané virtuální obrazy plís ových sýr – Fourmet d’Ambert (a-c), Lazur Pearl (d-f).

216

Záv rJe z ejmé, že uvedené techniky virtuální reality p inášejí adu dalších možností

pro studium potraviná ských materiál a pro p ípravu elektronických obrazových dokumentací. Mohou významn obohatit r zné zbožíznalecké obrazové databáze, jako nap . databáze ko ení,potraviná ských mikroorganism , parazit , atd. Plnohodnotné využití technologií virtuální reality p inese v budoucnu v mnoha odv tvích aspekty, které jsou v dnešní dob pro mnohé lidi t žko p edstavitelné.

Literatura a internetové zdroje [cit. 06.01.2007]

1. http://en.wikipedia.org/wiki/Virtual_reality 2. http://omicron.felk.cvut.cz/~bobr/ucspoc/virtreal.htm 3. Helin H. O., Lundin M. E., Laakso M., Lundin J., Helin H. J., Isola J.: Virtual Microscopy in

Prostate Histopathology: Simultaneous Viewing of Biopsies Stained Sequentially With Hematoxylin and Eosin, and -Methylacyl-Coenzyme A Racemase/p63 Immunohistochemistry, The Journal of Urology 175 (2), str. 495-499, (2006).

4. http://neuroinformatica.com/ 5. Kobayashi N., Hosoya T., Adachi M., Haku T., Yamaguchi K.: Virtual MR microscopy for

unruptured aneurysm, Computer Methods and Programs in Biomedicine 66 (1), str. 99-103, (2001).

6. http://education.denniskunkel.com/catalog/index.php?cPath=5 7. http://microscopy.fsu.edu/micro/gallery/flavors/flavor.html 8. http://education.denniskunkel.com/catalog/product_info.php?products_id=4739. http://en.wikipedia.org/wiki/Anaglyph_image 10. Uvíra R., Pudil F.: Anaglyfy v odborných potraviná ských dokumentech, Sborník p ísp vk ,

XXXVII. Symposium o nových sm rech výroby a hodnocení potravin, Skalský Dv r 29.5-31.5.2006.

11. Pittet J.-J., Henn Ch., Engel A., Heymann J. B.: Visualizing 3D Data Obtained from Microscopy on the Internet, Journal of Structural Biology 125, str. 123–132, (1999).

Kontaktní adresa:Ing. Roman Uvíra, Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Ing. František Pudil, CSc., Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6 Dejvice, 16628

217

HOUBOVÉ AROMA V TAVENÝCH SÝRECH Pudil František1, Uvíra Roman1, Janda Václav2

1 Ústav chemie a analýzy potravin, 2 Ústav technologie vody a prost edí, VŠCHT Praha

Mushroom flavour in processed cheese

Summary:Processed cheese flavouring is known to be one of the traditional ways of increasing product attractivity and distribution. Fresh (cultivated) mushrooms, dried mushrooms, mushroom flavour products or synthetic additives are suitable for mushroom flavour acquisition. Typical mushroom flavour of fresh sporocarps is caused by the „mushroom alcohol“ 1-octen-3-ol. Volatile compounds of two samples, „Tavený sýr se žampiony (processed cheese with champion mushrooms)“ and „Tavený sýr lah dkový roztíratelný (same cheese with no champion mushrooms)“ (both Delvita, Czech republic), were thoroughly analyzed using GC/MS chromatography. Volatile compounds were isolated using SPME technique. Mushroom flavour in the sample of the processed cheese with champion mushrooms is caused by the presence of 1-octen-3-ol, which was apparently a part of a flavouring additive. Presence of other natural mushroom flavour components was not proved reliably.

ÚvodOchucování tavených sýr pat í k tradi ním zp sob m zvýšení atraktivity výrobku a

rozší ení sortimentu. Pro získání houbové p íchuti je možno využít erstvých (p stovaných) hub, sušených hub, houbových ko enících p ípravk nebo synthetických p ísad. Typické houbové aroma erstvých hub zp sobuje tzv. „houbový alkohol“ 1-okten-3-ol 1,2. V p írodních produktech

p evažuje (R)-(-)-1-okten-3-ol, zatímco (S)-(+)-1-okten-3-ol bývá zastoupen jen nepatrn 3.V synthetických houbových aromatech bývají oba enantiomery ve srovnatelném množství.

Materiál a metodyDetailn byl analyzován „Tavený sýr se žampiony“ a „Tavený sýr lah dkový roztíratelný“

(oba Delvita, eská Republika)(Obr. 1). Pro srovnání byl použit p írodní sýr s bílou plísní „Bonifaz Waldpilze“ (Bergader Privatkäserei, N mecko).

Obr. 1. Etikety analyzovaných vzork tavených sýr .

Analýza t kavých látek sýr byla provád na plynovou chromatografií ve spojení s hmotnostní spektrometrií na p ístroji Fisons Instruments GC 8000 s hmotnostním detektorem MSD 800 (Fisons Instruments, Itálie). Pro separaci t kavých látek byla zvolena kapilární kolona 30 m × 0,32 mm se stacionární fází TR-5 s tlouš kou filmu 1 m (Thermo Fisher Scientific, USA). Teplota kolony byla programována od 50 °C (2 min izotermní prodleva) do 220 °C rychlostí 5 °C/min. Teplota nást iku byla 230 °C. Nosným plynem bylo helium. Energie ionizujících elektron byla 70eV.

218

Vzorek byl nast ikován technikou SPME po adsorpci na vlákno se zakotvenou fází 65 mCarbowaxTM – divinylbenzene (Supelco Park, USA). T kavé látky z erstv rozbaleného sýru umíst ného do uzav ené vialky byly izolovány p i teplot 60 °C po dobu 30 min. Pro identifikaci látek byla využita knihovna hmotnostních spekter NIST (NIST, Velká Británie).

Výsledky a diskusePorovnání GC-MS analýz obou podobných vzork tavených sýr je na Obr. 2 a

identifikované t kavé látky ze vzorku s p ídavkem žampion jsou shrnuty v Tabulka I. Identifikace hlavní složky houbového aroma 1-okten-3-olu ve vzorku „Tavený sýr se

žampiony“ je na Obr. 3.

2.000 4.000 6.000 8.000 10.00012.00014.00016.00018.00020.00022.00024.00026.00028.00030.00032.00034.00036.00038.00040.000rt11

100

%

10

100

%

22.7551.640 10.564

3.190 10.3174.043

7.6295.0796.639

16.756

14.31613.14214.830

20.72717.618 19.93920.874

26.910

26.50622.984

32.339

31.59628.60631.092

37.53134.79733.862 38.347

Scan ETIC

3.95eRT

7TSZ3

1.695 22.74616.793

2.777

10.3544.9233.208

6.9697.60216.343

14.30713.133

16.848

20.72820.425

26.910

26.497

32.340

31.68028.20331.092

37.52236.449

33.87238.329

Scan ETIC

6.10eRT

7TSN1

Obr. 2. GC-MS analýzy t kavých látek vzork „Tavený sýr lah dkový roztíratelný“ (naho e) a „Tavený sýr se žampiony“ (dole). Identifikované složky viz Tabulka I.

0

100

%

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140m/z0

100

%

57

43292741

393155

54447258 67 858173 9995 110

7TSZ2 1140 (10.482) Cm (1140-(1135+1147))1.29e5

57

2927 41

3931

38

43

545344

72675865 8173 85 9995 110

Hit 3F:959 WILEY 6880: 1-OCTEN-3-OL

Obr. 3. Hmotnostní spektrum 1-okten-3-olu identifikovaného ve vzorku houbového taveného sýra (naho e) ve srovnání s referen ním spektrem z knihovny (dole).

Krom toho zde byla identifikována ada dalších látek, ale pro houbové aroma má z ejmvýznam jen obsah 1-okten-3-olu. Skupina volných mastných kyselin a 2-keton a aldehydnalezená v obou vzorcích je typická pro tento druh výrobku. Blíže neidentifikované laktony jsou pravd podobn produkty vzniklé tepelným ú inkem z odpovídajících hydroxyderivát a jsou také hojn zastoupeny v obou vzorcích. To je p ípad i 2-fenylacetaldehydu, který se sice b žn vyskytuje v houbových aromatech, ale p ítomnost v obou vzorcích nasv d uje tomu, že jeho p vod je zde jiný.

219

Tabulka I Složky identifikované metodou GC-MS ve vzorku „Tavený sýr se žampiony“, reten ní asy Rt odpovídají hodnotám v Obr. 2. Rt (min) Identifikovaná složka Poznámka 1,640 kyselina octová - 1,768 ethyl-acetát - 2,722 kyselina propionová - 3,190 3-methylbutanal sm sný pík 4,419 kyselina valerová - 4,703 butandiol 1,3 ? 4,942 butandiol 2,3 ? 5,079 hexanal - 6,639 2-furylmethanol ? 7,629 2-heptanon - 10,317 kyselina kapronová - 10,564 1-okten-3-ol „houbový alkohol“ 10,904 1-pentylfuran - 11,436 oktanal - 13,142 2-fenylacetaldehyd - 13,518 kyselina enanthová - 14,316 2-nonanon - 14,830 nonanal - 16,756 kyselina kaprylová - 17,618 dodekan ? 18,618 2,4-nonadienal - 19,939 2-decenal - 20,727 2-undekanon - 20,874 lakton ? 22,755 kyselina kaprinová - 22,984 2-undecenal - 26,506 2-tridekanon - 26,910 lakton ? C8 28,258 kyselina laurová ? 28,606 undekanol - 29,276 ftalát kontaminant 31,596 lakton ? 31,679 2-pentadekanon - 32,339 lakton ? 36,458 2-heptadekanon - 37,531 lakton ? 38,347 ftalát kontaminant

? – neúplná nebo nejistá identifikace

Ve vzorku „Tavený sýr lah dkový roztíratelný“ byl navíc nalezen maltol (Rt = 15,279), jeho hydroxyderivát (Rt = 1,343) a další cyklický karbonylový derivát (Rt = 13,821, možná methylcyklopentatrion). Tyto komponenty z ejm pocházejí ze sacharidických prekurzor ,které u sýra s houbovou p íchutí nebyly použity.

Z detailního porovnání GC-MS analýz taveného a plís ového „houbového“ sýra „Bonifaz“ (Obr. 4) je vid t, že i v plís ovém sýru je významnou komponentou 1-okten-3-ol (Rt = 10,528), ale jsou zde p ítomny i další dv složky, které se v p írodních houbových aromatech b žnvyskytují, tj. 3-oktanon (Rt = 10,748) a 3-oktanol (Rt = 11,087). Všechny tyto látky mohou být též alespo áste n produkty metabolismu p ítomných plísní.

220

10.000 10.100 10.200 10.300 10.400 10.500 10.600 10.700 10.800 10.900 11.000 11.100 11.200rt0

100

%

0

100

%

10.528

10.354

10.748

11.087

Scan EI+ TIC

7.88e5RT

7BONZ2

10.482

10.198 10.354

Scan EI+ TIC

5.50e5RT

7TSZ2

Obr. 4. Detail GC-MS analýzy t kavých látek ze vzork „Tavený sýr se žampiony“ (naho e) a „Bonifaz Waldpilze“ (dole).

Záv ry

Houbové aroma vzorku taveného sýra se žampiony je zp sobeno p ítomností1-okten-3-olu, který byl z ejm sou ástí aromatiza ní p ísady. Nebyla spolehliv prokázána p ítomnost dalších komponent p ítomných v p írodních houbových aromatech.

Literatura1. Maga J. A.: Mushroom flavor, Journal of Agriculture and Food Chemistry 29, str. 1-4, (1981). 2. Mosandl A., Heusinger G., Gessner M.: Analytical and sensory differentiation of 1-octen-3-ol

enantiomers, Journal of Agriculture and Food Chemistry 34, str. 119-122, (1986). 3. Zawirska-Wojtasiak, R.: Optical purity of (R)-(-)-1-octen-3-ol in the aroma of various species

of edible mushrooms, Food Chemistry 86, str. 113-118, (2004).

Kontaktní adresa:Ing. Roman Uvíra, Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Ing. František Pudil, CSc., Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Prof. Ing. Václav Janda, CSc., Ústav technologie vody a prost edí, [email protected] Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6 Dejvice, 16628

221

VLIV GENETICKÝCH VARIANT KASEINU NA VÝT ŽNOST P I VÝROB SÝRLegarová Veronika, Kou imská Lenka

Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, ZU v Praze

The effect of casein genetic varieties on the yield during cheesemaking

Summary:The aim of this work was to evaluate the dependence of some technological characteristics of Holstein cattle on the kappa-casein genotype. Kappa-casein is a milk protein that does not pass to whey after milk coagulating, yet it remains in cheese, thus contributing to the basic yield of cheese as well as other technological properties, especially the curdling ability of milk, coagulation, syneresis (liberation of whey from junket), etc. Milk with favourable cheese-making properties is prerequisite for the higher yield of cheese with a required composition. Proteins are one of the basic milk components. The quality and quantity of the proteins rank among the most significant indicators of cheese yield. The principal technological property of milk is curdling. This is the ability of milk to curdle with the curdling agent to produce junket of desired qualities. The ability to separate whey (syneresis) during the time of junket formation is another indicator determining the suitability of milk for cheese production.The yield proper depends on the dry matter units that are transferred into cheese from one kilogram of milk.

Úvod

Byl zkoumán vliv genetických variant kappa-kaseinu na výt žnost p i výrob sýr . Cílem práce bylo posouzení závislosti n kterých technologických vlastností na genotypu kappa-kaseinu. Prekursorem mlé ných bílkovin je v bachoru se utvá ející kyselina propionová. Bílkoviny mléka jsou výsledným produktem biosyntetických proces v mlé né žláze, kdy je syntetizováno a dále merokrinním zp sobem vylu ováno šest hlavních mlé ných bílkovin: alfa S1 - kasein ( S1 - CN), alfa S2 - kasein ( S2 - CN), beta - kasein ( - CN) a kappa - kasein ( - CN), dále beta - laktoglobulin ( - LG) a alfa - laktalbumin ( - LA). Ostatní bílkovinné frakce (bovinní sérový albumin nebo imunoglobuliny) p echázejí do mléka z krve. U mlé ných bílkovin bylo popsáno n kolik desítek genetických variant. Všechny bílkoviny mléka jsou polymorfní. Polymorfizmus mlé ných bílkovin je výsledkem substitucí, inzercí a delecí aminokyselin. Poznatky o genetickém polymorfizmu mlé ných bílkovin a jeho vztazích k chemickému složení mléka, užitkovým a reproduk ním vlastnostem dojnic jsou významné nejen z hlediska šlecht ní, ale též z hlediska efektivního zpracování mléka.1

Kasein je mlé ná bílkovina, která je syntetizována v ribozomech endoplazmatického retikula bun k mlé né žlázy a je transportován do Golgiho aparátu, kde je fosforylován pravd podobnp ednostn p i utvá ení micelárních jednotek, které tvo í kaseinovou micelu. Kaseinové micely jsou tvo eny komplikovanými bílkovinnými strukturami uspo ádanými v kulovitých ásticích s množstvím kanálk a dutinek vypln ných vodnou fází. Tím se vysv tluje vysoká hydratace kaseinové micely (2 – 2,5g vody na 1g bílkoviny).1

P i výrob sýr , dochází p sobením r zných bakterií rodu Streptococcus a Laktobacillus k okyselení mléka na pH zhruba 5,5. V této fázi kvašení se p idává proteolytický enzym chymosin (sy idlo). P sobením enzymu dojde ke specifické hydrolýze P sobením enzymu dojde k specifické hydrolýze -kaseinu tém výhradn v ur ité peptidové vazb a molekula se rozšt pí na dv ástia to: para- -kasein a -kaseinmakropeptid. Vzniklý para- -kasein (protein složený ze 105 aminokyselin) obsahuje hydrofobní ást molekuly -kaseinu. Z stává proto sou ástí kaseinových micel, ale na rozdíl od nativního -kaseinu zde již nemá ochrannou funkci. Mezi micelami vznikají silné vazby a za ú asti Ca2+ iont dojde k vysrážení kasein (sý eniny). Zbytek molekuly je

222

-kaseinmakropeptid, glykopeptid složený ze 64 zbytk aminokyselin. Obsahuje hydrofilní ástmolekuly -kaseinu s vázanými oligosacharidy, a proto p echází do syrovátky.2

Kappa-kasein ( -CN) se skládá z jedné hlavní bezcukerné složky a minimáln šesti malých složek. Kappa-kasein je menší sm s polymer spojených intermolekulárními disulfidickými m stky. Primární struktura hlavní bezcukerné složky je tvo ena 169 aminokyselinami. Obdobnjako p edchozí složky má kyselou povahu. Vzhledem k tomu, že kappa-kasein podmi uje stabilitu kaseinového komplexu v etn syrovátkových bílkovin, p edstavuje kappa-kasein výjime nousložku mezi kaseiny. V molekulách malých složek kaseinu je krom fosforu obsažena rovn žkyselina A-acetylneuraminová, galaktóza a galaktosamin. Kappa-kasein je jedinou frakcí kaseinu, která obsahuje sirné aminokyseliny (cystein a methionin) a jako jediná kaseinová frakce se nesráží vápenatými ionty. Je jedinou bílkovinnou frakcí, která je v po áte ní fázi p sobení sy idla št penachymosinem. Jsou popsány polymorfní genetické varianty -CN A, B, C, E, F a G. U v tšiny plemen je varianta A predominantní.1

Technologické vlastnosti mléka z hlediska výroby sýr

Technologické vlastnosti mléka z hlediska výroby sýr jsou podmín ny adou faktor a mají vliv na jakost sýr a ekonomiku výroby. Vliv genetického polymorfizmu bílkovin na složení mléka je popisován u fenotyp jednotlivých kaseinových frakcí, -laktoglobulinu, u stupn glykosylace

-kaseinu, u obsahu minerálních látek, zejména vápníku a u velikosti kaseinových micel.3

Tabulka I: Vliv genetické varianty -CN a -LG na technologické vlastnosti mléka4

genetická varianta: A B kappa-kaseinobsah bílkovin * vyšší kaseinové íslo * vyšší as sý ení * kratší

syneréze * rychlejší tuhost sraženiny * vyšší výt žnost sýr vyšší beta-laktoglobulin obsah bílkovin * vyšší kaseinové íslo * vyšší tuhost sraženiny * vyšší výt žnost sýr * vyšší * = ve srovnání s

Z hlediska zpracování mléka na sýry je d ležitá jeho sy itelnost. Je to schopnost mléka srážet se sy idlem a tvo it sý eninu požadovaných vlastností. Sy itelnost je v prvé ad podmín na obsahem vápníku v mléce, zejména jeho ionizované formy, množstvím kaseinu a zastoupením jeho jednotlivých frakcí v kaseinové micele, hodnotou pH apod. Faktory, které ovliv ují sy itelnostovliv ují také tvorbu a pevnost sý eniny, ale oba vlivy nemusí být vždy paralelní. Je všeobecnznámo, že vyšší titra ní kyselost (nižší pH) zlepšuje sy itelnost i tvorbu a pevnost sý eniny,ale pevnost sý eniny stoupá s poklesem pH až do maxima p i pH 5,8. P i nižších hodnotách pH pevnost sý eniny rapidn klesá (za íná p evažovat kyselé srážení a sraženina má zcela jiný charakter) zatímco sy itelnost se trvale zkracuje.5

223

Mléka s dobrou sy itelností obsahují p evážn genetické varianty typu B- -kaseinu, B- -kaseinu a B- -laktoglobulinu, zatímco mléka s horší sy itelností a v tší termostabilitou obsahují bílkovinné varianty A.

Normální obsah kaseinu 2,6 % je dobrým p edpokladem dobré sy itelnosti mléka, zvýšený obsah imunních globulin má negativní vliv na sy itelnost.

Za dobrou sy itelnost považujeme srážení mléka upraveného k výrob sýr p i 32°C tak, že první vlo ky sraženiny se tvo í za 15 až 18 minut.1

Byl také zjišt n vliv genetického polymorfizmu bílkovin mléka na synerézy. Siln jší syneréze byla zjišt na u sraženiny mléka -CN AB proti AA, obecn je vyšší syneréze u mlék s variantou -CN B ve srovnání s AA a to i p i nízkém i vysokém obsahu -CN.3

Pozorováním bylo zjišt no, že sýr vyrobený z mléka typu -CN BB snížil o 15 % více hmotnosti b hem 24 hodin než sýr vyrobený z mléka typu -CN AA, což poukazuje na intenzivn jší synerézy u sý eniny mléka -CN BB.6

Výt žnost sýr z mléka je dána sumou tuku, bílkovin, ostatních složek sušiny a vody, p evedených ze sýra ského mléka do sýra. Vyjad uje se bu jako spot eba litr sýra ského mléka na výrobu 1 kg daného sýra nebo naopak jako množství sýra v kg, které se vyrobí ze 100 l mléka.

Sýry jsou produkty, ve kterých jsou koncentrovány mlé ný tuk a bílkoviny, je tedy jasné, že výt žnost je závislá p edevším na jejich obsahu v mléce. P echod tuku do sýra (výt žnost tuku) není obvykle problematický. V závislosti na mechanickém zpracování sý eniny výt žnost kolísá od 85 až do 93 %.

Všechny proteiny mléka jsou polymorfní a byla u nich popsána ada genetických variant, lišících se po adím aminokyselin v bílkovinném et zci. Odlišnosti jednotlivých genetických variant ovliv ují i vlastnosti t chto bílkovin. Tyto odlišnosti se významn projevují i p i zpracování mléka na sýry. Z hlediska technologického jsou mnohem výhodn jší jak u -CN, tak i u -Lg alely B, zlepšující sy itelnost, kvalitu sý eniny, výt žnost apod.

Zastoupení jednotlivých frakcí bílkovin mléka je dáno geneticky a je tedy u každé dojnice nem nné. Celkový obsah hrubých bílkovin, pom r syrovátkových bílkovin a kaseinu, velikost kaseinových micel i vlastnosti mléka jsou však ovlivn ny adou dalších faktor a jejich vliv m že zcela p ekrýt vlivy genetického polymorfizmu bílkovin mléka. Z chovatelského hlediska nejvýznamn jšími faktory jsou zdravotní stav a výživa zví at.5

Metodika

Pokusný soubor tvo ilo 50 dojnic holštýnského plemene narozených v roce 1999 až 2000. Soubor byl rozd len podle zásadního kriteria a to podle genotypu kappa-kaseinu na t i skupiny dojnic. První skupinu tvo ilo 13 dojnic s genotypem AA. Druhá skupina zahrnovala 18 dojnic s genotypem AB a poslední, t etí skupina ítala 19 dojnic s genotypem BB.

Výt žnost byla zjiš ována p i demonstra ní výrob erstvých sýr z mléka z ve erníhonádoje podle vzorce:

lmlékamnožstvísušinakgsýrahmotnostvýtežnost % (SJ)

Výpo tem se z nam ených hodnot vyjád í výt žnost jako sušinové jednotky, které p ejdou do sýra z 1 kilogramu mléka.

224

Výsledky

Vztah genetického polymorfizmu bílkovin mléka a jeho technologických vlastností byl zkoumán u pasterovaného mléka. Výsledky lze použít k výb ru genotypu bílkovinného systému se zvýšeným procentem p echodu sušiny z mléka do sýra, vyšším obsahem bílkovin a kaseina vhodným pr b hem koagulace.

Tabulka II: Doba koagulace - as od p idání sy idla do pokrájení sý eniny 2005 AA AB BB zá í 10:20 - 12:55 10:25 - 12:55 10:35 - 12:55 íjen 9:40 – 12:50 10:10 - 12:50 10:30 - 12:50

listopad 10:45 - 13:20 11:15 - 14:00 11:45 - 14:30 prosinec 11:45 - 14:10 11:45 - 14:10 12:15 - 14:35

Mléko s genotypem BB ve všech m eních vykazuje nejkratší as sý ení krom m sícelistopadu, kdy nejkratší dobu sý ení vykazuje mléko s genotypem AA (2 hod. a 35 minut). Mléko s genotypem AB má také dobu sý ení kratší oproti genotypu AA, op t krom listopadu, kdy doba sý ení je shodná s genotypem BB a je delší oproti genotypu AA o 10 minut. V pr m ru je nejdelší doba sý ení u genotypu AA (Ø 161 minut), kratší doba sý ení je u genotypu AB (Ø 155minut)a nejkratší u genotypu BB (Ø 146 minut).

P i zjiš ování obsahu tuku v sýru genotyp AA vykazoval nejnižší hodnoty v pr b hu celého sledování. U genotypu AB byly nam eny ve všech p ípadech hodnoty vyšší než u genotypu AA. Hodnoty nam ené u genotypu BB jsou nejvyšší ve t ech m sících pouze v m síci listopadu byla nam ená hodnota genotypu AB vyšší než u genotypu BB. Z pr m rných hodnot má nejvyšší obsah tuku v sýru genotyp BB (18,34 %), nižší obsah tuku v sýru vykazuje genotyp AB (17,63 %) a pouhých 15,13 % tuku obsahuje sýr genotypu AA.

Tabulka III Obsah tuku v sýru (v %) v závislosti na genotypu kappa-kaseinu

2005 AA AB BB zá í 16,50 17,50 18,00 íjen 14,00 18,00 19,50

listopad 13,00 18,00 17,00 prosinec 17,00 17,00 19,00

Hmotnost sýra byla v zá í a íjnu nejv tší u genotypu AA a v listopadu a prosinci byla u genotypu AA hmotnost sýra nejmenší. Naopak práv v listopadu a prosinci byla hmotnost sýra nejv tší u genotypu BB. Zato u genotypu AB byly nam eny hodnoty nejnižší b hem celého sledování. Pr m rná hmotnost sýra genotypu AB je 210,71 gram , u genotypu BB byla pr m rná hodnota hmotnosti sýra 230,32 gram a nejv tší pak u genotypu AA a to 248,30 gram .

Ve všech ty ech m sících sledování byl obsah sušiny nejnižší u genotypu AA, naopak nejvyšší je u genotypu BB, vyjma m síce listopadu, kdy je obsah sušiny nejvyšší u genotypu AB. Nejvyšší pr m rnou hodnotu obsahu sušiny v sýru vykazuje genotyp BB (40,44 %), st ední pr m rnou hodnotu vykazuje genotyp AB (39,38 %) a nejnižší genotyp AA a to pouhých 34,78 %.

Hlavním cílem práce bylo sledovat vliv genotypu kaseinu na výt žnost mléka a mlé nýchvýrobk . Z grafického znázorn ní nam ených hodnot je patrný vliv alely B i p esto, že hodnoty nam ené v zá í a íjnu vykazují pozitivní vliv genotypu AA na výt žnost erstvých sýr . Pr m rnéhodnoty totiž jasn ukazují pozitivní vliv genotypu BB na výt žnost. Genotypy AA a AB se od sebe pr m rnými hodnotami výt žnosti liší neparn a to AA 8,19 SJ a AB 7,97 SJ, kdežto genotyp BB vykazuje pr m rnou výt žnost s viditelným rozdílem a to BB 8,88 SJ.

225

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 0

S J

A A 8 ,2 6 9 9 ,1 9 7 7 ,5 2 2 7 ,8 0 4

A B 6 ,5 3 9 8 ,5 5 1 8 ,5 2 5 8 ,2 6 9

B B 8 ,1 2 0 8 ,9 4 2 8 ,5 7 7 9 ,8 8 0

zá í íje n lis to p a d p ro s in e c

Obr. 1 Závislost výt žnosti sýra na genotypu kappa-kaseinu

Záv rMléko vhodné pro výrobu sýr musí vykazovat takové technologické vlastnosti, aby kvalita

sý eniny odpovídala veškerým požadavk m. Sýra ské vlastnosti mléka významn participují na celém procesu výroby a výsledné kvalit produkovaných sýr . Souhrnn ovliv ují množství vyrobených sýr (obsah bílkovin, sy itelnost) a dosažení požadovaných hodnot sý eniny (kvalita sý eniny, množství vylou ené syrovátky). Kyselost syrového mléka se podílí na predikci neporušenosti a vhodnosti mléka k výrob sýr .

Mléko s p íznivými sýra skými vlastnostmi dává p edpoklad vyšší výt žnosti sýr s jejich požadovaným složením než mléko s nevhodnými technologickými vlastnostmi.

Základní technologická vlastnost mléka je jeho sy itelnost. Sy itelnost mléka je kombinací inicia ní enzymatické hydrolýzy a následné enzymov nezávislé agrega ní reakce protein . Dobrá sy itelnost mléka závisí na jeho neporušeném složení, na obsahu kaseinových bílkovin, jejich složení a genetickém typu, na obsahu minerálních látek a jejich rovnováze s bílkovinami, na formminerálních látek a na p irozeném pH mléka, které s t mito faktory p ímo souvisí.

Další velmi d ležitá technologická vlastnost mléka je schopnost vylu ovat syrovátku (syneréze) b hem tvorby sý eniny. Syneréze rovn ž determinuje vhodnost mléka k výrob sýr .Vylu ování syrovátky ze sý eniny je výsledkem kontrakce sý eniny zp sobenou p eskupenímvabeb mezi proteinovými agregáty. D ležitost syneréze spo ívá v množství vylou ené syrovátky, která se projeví ve výsledné sušin sýr .

Genetický polymorfismus bílkovin má rovn ž velký vliv na výt žnost sýr . Výt žnost se vyjad uje v sušinových jednotkách, které p ejdou do sýra z 1kilogramu mléka.

Z nam ených hodnot u výše uvedených technologických vlastností byl patrný pozitivní vliv alely B genotypu kappa-kaseinu. Mléko s genotypem BB poskytovalo nejkvalitn jší sý eninu za nejkratší dobu sý ení s následnou nejvyšší pr m rnou výt žností, vypo tenou dle vzorce Böhmové a erného.

Na záv r lze obecn shrnout, že nejp ízniv jší technologické vlastnosti p i výrob erstvýchsýr jednozna n vykazovalo mléko s genotypem kappa-kaseinu BB, následovalo mléko s genotypem -CN AB a nejmén žádoucí hodnoty byly zjišt ny u mléka s genotypem -CN AA.

226

Použitá literatura1. Zadražil, K.: Mléka ství. Praha, 2002, s. 128. 2. Velíšek, J.: Chemie potravin I.. Tábor, 2002, s. 344. 3. Böhmová, J. - erný, V.: Stanovení technologických vlastností mléka z hlediska výroby

sýr .Ministerstvo zem d lství, Národní agentura pro zem d lský výzkum, . R - 329 - 142/2, 1992 - 1994.

4. Marziali, A.S. - Ng-Kwai-Hang, K.F.: Effects of milk composition and genetic polymorphism on coagulation properties of milk. J.Dairy Sci., 1986.

5. Gajd šek, S.: Faktory ovliv ující výt žnost sýr . Syrotech - zborník sp ednášok. Žilina, 2000, s. 224.

6. Michalak, W.: Influence of -lactoglobulin and -casein genotype and lactation stage on relative amounts of major milk constituents. Pr. Mater. Zootech., 1973, s. 31 - 56.

Kontaktní adresaIng. Veronika Legarová, Katedra kvality zem d lských produkt , FAPPZ, ZU v PrazeEmail: Legarová@af.czu.cz

227

VARIANTY SÝR S MLETOU SÝ ENINOU A JEJICH POLOPROVOZNÍ VÝROBA Mrázek Josef, Tykvartová Dagmar, Vráblíková Eva

VOŠ potraviná ská a SPŠ mlékárenská Krom íž

Variaties of milled curd cheese and their pilot plant production

Summary:Within the bounds of this work five selected varieties of cheese with milled rennet curd were experimentaly produced: one natural cheese, two of marblelike colour and two flavoured ones. Their physical-chemical and sensoric qualities were examined here. The cheese mostly showed typical characteristics of this cheese group. The experiment also showed the possibility to expand the assortment by unusual and untraditional taste and visual varieties. The authors are convinced that some of the mentioned varieties can be, after the completion of technological process, viable and perspective for potential producers on the Czech market.

ÚVODPolotvrdé sýry s mletou sý eninou jsou vyráb né po celém sv t . Celkovým objemem

výroby p evyšují všechny ostatní skupiny sýr . Situace v eské republice se zcela liší. V sou asnédob není na trhu sýr této skupiny tuzemské výroby.

Cílem naší práce1 bylo: upravit obecn známý technologický postup výroby sýr s mletou sý eninou na podmínky školního poloprovozu; ov it možnost výroby vybraných variant t chto sýr a posoudit jejich senzorické vlastnosti.

MATERIÁL K pokusným výrobám bylo použito: sm sné plné kravské mléko odpovídající vyhl. MZe .

203/2003 Sb., mlékárensky ošet ené odst ed ním a šetrnou pasterací firmou Kromilk s.r.o., Krom íž; mlékárenské kultury (provozní smetanový zákys, monokultury Lactobacillus helveticus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactobacillus casei subsp. casei); chymosinové sy idlo CHY-MAX Ultra (750 IMCU); nasycený roztok CaCl2, krystalický KNO3; chu ové a barvící látky (barvivo Annato A320-WS, suché ervené víno odr dy Merlot, rozinky ošet ené sterilací v pá e 2x10 min, ko ení h ebí ek).

METODYK výrob sýr byl použit výrobní postup podle Havlí ka2 upravený dle sm rného

technologického postupu3 a podmínek školního poloprovozu. Fyzikáln -chemický rozbor byl proveden b žnými analytickými metodami4 (stanovení

obsahu tuku mléka a sýr acidobutyrometricky, stanovení sušiny sýr p esnou vážkovou metodou, stanovení aktivní kyselosti sýr potenciometricky, stanovení titra ní kyselosti mléka a sýr titra npodle Soxhleta-Henkela, stanovení obsahu NaCl v sýru argentometricky podle Mohra).

Sýry senzoricky hodnotila odborná komise složená ze zam stnanc a student školy a vybraných pracovník fy Kromilk s.r.o.

VÝSLEDKY Byly provedeny 4 pokusné výroby a následnou úpravou a vzájemnou kombinací

edarizované hmoty bylo vyrobeno 5 variant sýr s mletou sý eninou:sýr p írodní - viz. Obr. 1. sýr mramorovit obarvený annatem - viz. Obr. 2. sýr mramorovit obarvený erveným vínem - viz. Obr. 3. sýr ochucený rozinkami - viz. Obr. 4. sýr ochucený h ebí kem - viz. Obr. 5.

Vybrané výrobní údaje jsou uvedeny v Tabulce I. Sýry zrály ve vakuované fólii Cryovac po dobu cca 3 m síc , resp. 6 m síc . Zjišt né fyzikáln -chemické vlastnosti sýr jsou uvedeny v Tabulce II.

228

Tabulka I Vybraná technologická data edarizace, lisování a zrání u jednotlivých variant sýr s mletou sý eninou

varianta sýra p írodní barvenýannatem

barvenývínem

ochucenýrozinkami

ochucenýh ebí kem

prokysání hmoty ( edarizace)p i cca 40°C [min] 120 120 120 100 100

hmotnost použité prokysané a nebarvené hmoty [kg] 4,0 1,5* 0,9* 2,0 2,8

hmotnost použité prokysané a barvené hmoty [kg] -- 1,9 1,4 -- --

celková hmotnost sýra [kg] 4,0 3,4 2,3 2,0 2,80 p ídavek ochucovadel [g] -- -- -- 100 20 p ídavek NaCl [%] 3,5 3,0 3,0 3,0 3,2 délka lisování [h] 16 17 17 16 16 kone né lisovací tlaky[kg/kg sýra] 27,5 19,3 19,3 22,9 22,9

délka osychání [h] 24 24 24 24 24 teplota zrání [˚C] 9-10 9-10 9-10 9-10 9-10 délka zrání** [dny] 105 98 98 96 96

* sý enina nakrájená na kostky cca 1x1x1 cm ** délka zrání do senzorického hodnocení

Tabulka II Fyzikáln -chemické vlastnosti jednotlivých variant sýr s mletou sý eninou

varianta sýra p írodní barvenýannatem

barvenývínem

ochucenýrozinkami

ochucenýh ebí kem

stá í sýra p i hodnocení [dny] 65 58 58 56 56pH 4,68 5,40 5,20 4,30 4,40titr. kyselost dle Soxhleta-Henkela 113,5 69,4 73,8 135,5 127,2

obsah sušiny [%] 59,75 66,85 60,96 61,41 61,73obsah tuku v sušin [%] 52,30 48,99 53,72 53,33 53,86obsah NaCl [%] 2,68 2,14 1,96 2,01 2,05

Bylo vyrobeno celkem 14,5 kg sýr . Použitý technologický postup se u žádné varianty nijak podstatn nelišil, zásadním odlišujícím krokem p i p íprav jednotlivých variant byla aplikace barvící nebo ochucující látky. Barvivo annato bylo p idáno do mléka p ed sý ením. Barvení vínem bylo provedeno namo ením nastrouhaného sý eniny do cca 38 °C teplého vína po dobu 20 minut. Takto vzniklé barevné hmoty pak byly smíšeny s kostkami neobarvené sý eniny. P ídavek ošet ených rozinek a h ebí ku byl proveden do nastrouhané hmoty p ed tvarováním a lisováním. Ko ení nebylo tepeln upraveno. Po p ídavku kuchy ské soli byly sýry mechanicky lisovány v obdélníkové kovové form do druhého dne. Po oschnutí povrchu byly sýry vakuov zabaleny do plastových sá k (cryovak). Sýry zrály uvedenou dobu p i stálé teplot 9 – 10 °C. Senzorické hodnocení sýr bylo provedeno ve stá í 3 – 3,5 m síce (viz Tabulka I) komisionáln odbornou komisí. U varianty „sýr s mletou sý eninou, p írodní) byly zjišt nynásledující vlastnosti:

Barva stejnorodá, krémov mlé n bílá, charakteristická pro prozrávající sýr. Konzistence celistvá, jemná, krátká, drobivá. V n charakteristická, sýrová, istá. Chu sýrová, istá, kyselejší, slan jší.

229

Obr. 1. Sýr s mletou sý eninou p írodní

U varianty „sýr s mletou sý eninou mramorovit barvený annatem“ byla pozorována: Barva mramorovitá, krémov bílá neobarvená z eteln odd lená zrna pom rn pravidelnrozmíst ná v okrov žlut zbarvené hmot .Konzistence jemná, celistvá, minimáln drobivá, elastická. V n istá, nevýrazná. Chu jemn sýrová, nevýrazná, istá.

Obr. 2. Sýr s mletou sý eninou mramorovit barvený annatem

Obr. 3. Sýr s mletou sý eninou mramorovit barvený vínem

230

Zajímavou variantou se jevil „sýr s mletou sý eninou mramorovit barvený vínem“,které m lo vliv nejenom na vzhled sýra, ale také na jeho chu ové vlastnosti. Komise hodnotila sýr následovn :

Barva mramorovitá, krémov bílá neobarvená zrna rovnom rn rozptýlená v temnfialovo ervené hmot , ohrani ení mén z ejmé jak u p edcházející varianty. Konzistence celistvá, pružná, polotvrdá. V n sýrová, istá, z etelná po použitém vín .Chu sýrová, mén slaná, pikantní, neobvyklá, výrazná po vín .

Ochucené varianty vykazovaly obdobný vzhled – ásti rozinek i h ebí ku byly víceménpravideln rozmíst ny v hmot sýra, které m lo tvarohovitý charakter, bylo krátké a drobivé. V na chu výrazn kyselá byla zp sobena p ekysáním sýra, což potvrdily i výsledky fyzikáln -chemické kontroly (viz Tabulka II). Vlastnosti „sýra s mletou sý eninou ochuceného rozinkami“byly:

Barva na ezu mlé n bílá, typická pro neprozrálý sýr, rozinky pravideln rozmíst nyv celém ezu.Konzistence krátká, drobivá, tvarohovitá. V n z eteln kyselá, sýrová. Chu sýrová, výrazn kyselá chu p ekrývá p íchu rozinek.

Obr. 4. Sýr s mletou sý eninou ochucený rozinkami

Obr. 5. Sýr s mletou sý eninou ochucený h ebí kem

231

Senzorickým posouzením „sýra s mletou sý eninou ochuceného h ebí kem“ jsme dosp li k následujícím zjišt ním:

Barva charakteristicky bílá pro neprozrálý sýr, ko ení rozmíst no mén pravideln .Konzistence krátká, drobivá, tvarohovitá, tuhá, ko ení tvrdé až nepoživatelné. V n nakyslá, výrazná po použitém ko ení.Chu výrazn aromatická po použitém ko ení, neobvyklá, p íliš kyselá.

Další hodnocení senzorických vlastností bylo provedeno po cca 6 m sících po výrob .Zjistili jsme, že vlastnosti sýr se po 3 a 6 m sících zrání významn nelišily, výrazn ji se projevila pouze sýrovitá chu daná probíhajícím zráním sýr .

B hem pokusných poloprovozních výrob se vyskytly i n které problémy. P edevšímproblematickým se jevilo zajišt ní správného pr b hu prokysání, které s výjimkou barvených sýr ,zpomalovalo jejich prozrávání. Také zp sob, zvolený k barvení sý eniny vínem, je podle našeho názoru možný provád t jen p i skute n malém množství sýr , pro v tší a velké objemy je nereálný.

Další úskalí p edstavuje mikrobiální istota použitých ochucujících p ísad. Rozinky jsme p ed použitím opakovan (2 x) ošet ili záh evem v pá e p i 100 °C, vždy po dobu 10 minut. P esto u jednoho vzorku, který byl ponechán v pr b hu zrání 48 hodin p i pokojové teplot , se objevila z etelná tvorba plynu. Lze se proto domnívat, že uvedené tepelné ošet ení rozinek nebylo dostate né. Zbývající vzorky tohoto sýra, podobn jako u sýra ochuceného h ebí kem, a zrající p istálé teplot 9 – 10 °C byly beze zm n. Mikrobiální vyšet ení jsme neprovád li.

Rovn ž jsme zjistili, že h ebí ek, který jsme p ed použitím tepeln ani mechanicky neupravovali, byl p íliš tuhý, konzisten n p íliš odlišný až rušil celkový dojem a v této formi nepoživatelný. P ílišnou chu ovou aromati nost lze snadno upravit na optimální míru jiným dávkováním.

ZÁV RV rámci prezentované práce bylo pokusn vyrobeno p t vybraných variant sýr s mletou

sý eninou: jeden sýr p írodní, dva mramorovit barvené a dva ochucené. Byly studovány jejich fyzikáln -chemické a senzorické vlastnosti.

Sýry vykazovaly zpravidla typické vlastnosti sýr této skupiny. Zárove také ukázaly možnost rozší ení sortimentu o neobvyklé a netradi ní chu ové a vizuální varianty. Auto i jsou p esv d eni, že n které z uvedených variant mohou být po dopracování technologického postupu na našem trhu životaschopné a pro p ípadného výrobce perspektivní.

LITERATURA 1. VRÁBLÍKOVÁ, E. Varianty sýr s mletou sý eninou a jejich výroba. Absolventská práce

VOŠP a SPŠM Krom íž, 2005, s. 9 – 46 2. HAVLÍ EK, Z. Praktikum sýra ské výroby, SNTL Praha 1975, s. 193 – 2113. Sm rné technologické postupy. STP Otava, edar. Mlékárenský pr mysl, koncern Praha, vydal

TOMOS 1987, s. 187 – 1944. INDRA, Z., MIZERA, J. Chemické kontrolní metody pro obor zpracování mléka. U ebnice pro

SPŠP, .j. 13197/92, 1992, s. 76 – 163

Kontaktní adresa Ing. Josef Mrázek; VOŠ potraviná ská a SPŠ mlékárenská, Št chovice 1358, 767 54 Krom íž[email protected]

232

VYUŽITÍ PLÍSN PENICILLIUM NALGIOVENSE K VÝROB PLÍS OVÉHO SÝRA Mrázek Josef, Pospíšil Michal, Korbelová Marie, Heraltová Veronika

VOŠ potraviná ská a SPŠ mlékárenská Krom íž

Use of Penicillium nalgiovense for production of cheese covered by white mould

SummaryThe component of this work was the verification of the use of the mould Penicillium nalgiovensefor the production of cheese covered by white mould. By the means of the experiments it was established that the cheese produced from the cow´s and goat´s milk with the help of the mould culture „M-EK-4 BactofermTM“ and „M-EK-6 BactofermTM“ shows similar characteristics to other cheese of this group. These types of cheese ripen in the similar way and have analogous sensoric qualities. It is possible to say that the use of the examined mould for the cheese production proves to be possible and may become an interesting marketing alternative particularly for smaller or beginning producers.

ÚVODK výrob m kkých sýr zrajících s plísní na povrchu se v eské republice používá

výhradn plíse Penicillium camemberti (syn. Penicillium candidum), pouze v n kterých p ípadech kombinovaná s jinými typy povrchových kultur. Inspirací pro naše pokusy byla existence Nalžovského sýra vyráb ného na p elomu a po átkem 20. století v obci Nalžovské Hory v západních echách. P i výrob sýru se používala plíse Penicillium nalgiovensis, prvn popsaná Laxou a studovaná Doležálkem1.

Cílem naší práce bylo: ov it možnost použití n kterých kmen plísn Penicillium nalgiovense, která jsou v sou asné dob distribuované jako ochranná plís ová kultura povrchu uzená ských výrobk , rovn ž k výrob sýr ; sýry vyrobit z kravského i kozího mléka a posoudit jejich vlastnosti.

MATERIÁL K pokusným výrobám bylo použito: sm sné plné kravské mléko odpovídající vyhl. MZe .

203/2003 Sb., mlékárensky ošet ené odst ed ním a šetrnou pasterací firmou Kromilk s.r.o., Krom íž, titra ní kyselost podle Soxhleta-Henkela 6,6 – 7,2, tu nost 3,60 – 4,50 %; kozí mléko z malochovu, titra ní kyselost podle Soxhleta-Henkela 7,8, tu nost 4,10 %; provozní smetanový zákys; lyofilizované kultury plísn Penicillium nalgiovense distribuované pod obchodním ozna ením M-EK-4 BactofermTM a M-EK-6 BactofermTM firmou Chr. Hansen GmbH); mikrobiální sy idlo FROMASE 750 TL (750 IMCU); nasycený roztok CaCl2, krystalický KNO3.

METODYK výrob sýr byl použit sm rný technologický postup2,3 upravený na podmínky školního

poloprovozu. Fyzikáln -chemický rozbor byl proveden b žnými analytickými metodami4

(stanovení obsahu tuku mléka a sýr acidobutyrometricky, stanovení sušiny sýr p esnou vážkovou metodou, stanovení aktivní kyselosti sýr potenciometricky, stanovení titra ní kyselosti mléka a sýr titra n ). Sýry senzoricky hodnotila odborná komise složená ze zam stnanc a student školy a vybraných pracovník fy Kromilk s.r.o.

VÝSLEDKY Byly provedeny 4 pokusné výroby plís ového sýru z kravského mléka, vždy byla použita

plíse Penicillium nalgiovense M-EK-6, p i 2. a 3. pokusu byla p idána do mléka p ed sý ením, p i 1. a 4. pokusu byla aplikována rozst ikem ve form suspenze na povrch prokysaných a krystalickou solí solených sýr v množství cca 3 %, resp. 2 % soli z hmoty sýr . Sýry následnzrály 4 dny p i teplot 15 °C a dále p i teplot 12 °C až do stá í 21 dn . Senzoricky hodnoceny byly z d vodu kontaminace pouze vzorky z 2. a 4. pokusu.

Na následující 2 pokusy bylo použito kozí mléko, které jsme laboratorn ošet ili záh evem na 73 °C s krátkou výdrží. Sýry byly vyrobeny obdobným zp sobem jako sýry z kravského mléka, zpracování sý eniny bylo prodlouženo na 30 minut. Solení se provád lo, obdobn jako v p edešlých

233

pokusech, krystalickou solí na povrch sýr , množství soli bylo cca 2 % na hmotu sýr . Na povrch prokysaných a vysolených sýr byla aplikována nást ikem vždy jiná plís ová kultura (M-EK-6 a M-EK-4). Sýry zrály 3 dny p i cca 20 °C, dále p i cca 6 °C. Sýry byly hodnoceny ve stá í 14 a 28 dní, resp. 14, 21 a 35 dní.

Tabulka I Vybraná data pokusných výrob sýr z kravského mléka s plísní Penicillium nalgiovense M-EK-6

pokusná výroba . 1 2 3 4 titra ní kyselost mléka dle Soxhleta-Henkela 6,6 7,2 6,6 7,2

tu nost mléka [%] 3,90 4,30 4,50 3,60 provozní smetanový zákys [%] 3,75 2,50 2,50 1,75 prokysání [min] 20 20 20 20 plís ová kultura do mléka [g/100 l mléka] - - 25 50 - - titra ní kyselost p ed sý ením dle Soxhleta-Henkela 8,0 8,2 8,2 7,8

mikrobiální sy idlo [ml / 100 l mléka] 10 10 10 10 srážení p i 35 °C [min] 20 20 20 20 zpracování sý eniny [min] 15 15 15 15 pH 24 h po výrob 4,56 5,12 4,99 4,89

Senzorické hodnocení plís ových sýr z kravského mléka

Obr. 1. Sýr z kravského mléka, stá í 14 dní

Obr. 2. Sýr z kravského mléka, stá í 21 dní

234

Sýr z kravského mléka vyrobené s pomocí plísn Penicillium nalgiovense M-EK-6 (viz Obr. 1. a Obr. 2.) byly senzoricky hodnoceny po 14 dnech zrání studenty a zam stnanci školy a po 21 dnech zrání odbornou komisí, kterou krom již uvedených tvo ili také vybraní pracovníci z mlékárenské praxe. Komise zjistila následující senzorické vlastnosti sýr :Vzhled a barva:

tvar pravidelný se stopami po zracím roštu, po 3 týdnech mírn svrašt lý povrch jako známka p ezrání, povrch porostlý bílou plísní bez známek kontaminace.

Konzistence a struktura: jemná, m kká, celistvá bez trhlin a dutinek, smetanov žluté t sto bylo dlouhé a roztíratelné, ve stá í 2 týdn zrání bylo patrné tvarohovité jádro.

V n :istá, p íjemn houbov sýrová, mírný náznak po amoniaku se objevil po 3 týdnech zrání

Chu :istá, sýrov jemná až máslová s p íchutí po houbách, u prozrálého sýra intenzívní houbová chu

a naho klá, ne však nep íjemná, dochu ; výrazn slaná.

Senzorické hodnocení plís ových sýr z kozího mlékaRovn ž i v p ípad plís ových kozích sýr byly senzorické vlastnosti hodnoceny

komisionáln studenty a zam stnanci školy a vybranými pracovníky praxe a to ve stá í 14 a 28 dní, resp. 14, 21 a 35 dní.

Obr. 3. Kozí sýr, stá í 28 dní, kultura M-EK-6

P i posuzování kozích plís ových sýr , vyrobených za pomoci plísn Penicillium nalgiovense M-EK-6 (viz Obr. 3.) byly zjišt ny následující senzorické vlastnosti: Vzhled

zrání 14 dn : nesouvislý porost plísn (potrhaný), barva bílá až sv tle šedá, prosvítá r žovézbarvení, tvar mírn deformovaný, povrch svrašt lýzrání 28 dn : typicky p ezrálý, svrašt lý, potrhaná vrstva plísn

Konzistence, struktura zrání 14 dn : t sto bílé, celistvé, krátké, konzistence jemná, bez hrudek, m kkázrání 28 dn : celistvá, jemná, krémové barvy, roztíratelná, ojedin lé dutinky, lepí se, povrchová vrstva plísn tuhá, odd luje se, mírné roztékání pod povrchem

Chu a v nzrání 14 dn : v n jemná, houbovitá, ne istá, zadušená; chu kyselá, mírn naho klá,výrazná kozízrání 28 dn : v n houbovitá, náznak po žampionech; chu kyselejší, pikantní, výrazná kozí, ne istá, naho klá, houbovitá

235

Obdobn byly hodnoceny kozí sýry porostlé plísní Penicillium nalgiovense M-EK-4 (viz Obr. 4.). Byly zjišt ny tyto vlastnosti: Vzhled

souvislý porost plísn , ze spodní strany potrhaný, barva sn hobílá, pravidelný, z etelné stopy po odkapní desce, od 3 týdn boky svrašt lé a horní strana propadající se

Konzistence, struktura zrání 14 dn : bílý souvislý porost plísn , spodní strana lososov r žová, konzistence jemná, hladká, roztíratelná, t sto mlé n bílézrání 21 dn : hmota bílá, hladká, jemná, m kká, roztíratelná až mazlavá, celistvá, lepí se, zrání 35 dn : celistvá bílá hmota, hladká, lesklá, jemná, m kká, mazlavá, lepí se, bez trhlinek, tuhá k ra ruší dojem

Chu a v nzrání 14 dn : v n a chu jemná, istá, houbovitá, kyselejší, typicky kozí, p íjemn pikantní zrání 21 dn : jemná houbovitá v n , istá; chu mírn nakyslá, istá, z eteln kozí, p íjemná zrání 35 dn : p íjemná houbovitá v n , istá, výrazná, typická kozí chu , nepatrn nakyslá, v konci mírn naho klá, slab mýdlovitá, p ezrálá ale p esto p íjemná

Obr. 4. Kozí sýr, stá í 28 dní, kultura M-EK-4

P i provád ných pokusných výrobách jsme ešili n kolik závažných problém . Prvním komplikujícím faktorem bylo zajišt ní optimálního pr b hu kysací k ivky vzhledem k velmi malému zpracovávanému množství mléka a k malé etnosti pokus . Druhým problémem bylo zajišt ní vhodného klima p i zrání, které vyústili ve znehodnocení vzork kontaminací cizí plísní u 1. a 3. výroby sýr z kravského mléka. P i pokusu s kozím sýrem nao kovaným plísní Penicilliumnalgiovense M-EK-6 kolísala teplota zrání v rozmezí 0 °C až 12 °C v období 4. – 6. dne zrání. Potrhaná a místy od sýra odtržená povrchová vrstva plísn je následkem opožd ného obracení sýr ,kdy zrací rošt zarostl vitální plísní.

I p es výše citované problémy a malé množství pokus je však možné íci, že senzorické vlastnosti vyrobených sýr odpovídaly naši p edstavám a b žným požadavk m na skupinu sýrs bílou plísní na povrchu. Pro praktické použití bude nutné ešit standardizaci technologického postupu hledáním optimálních podmínek výroby a zrání. Proto pokusy s výše uvedenými testovanými plísn mi na našem pracovišti pokra ují.

236

ZÁV RSou ástí této práce bylo ov ení použitelnosti plísn Penicillium nalgiovense k výrob sýr

s plísní na povrchu. Provedenými pokusy bylo zjišt no, že sýry z kravského i kozího mléka vyrobené za pomoci uvedené plísn dodávané pod ozna ením M-EK-4 BactofermTM a M-EK-6 BactofermTM vykazují obdobné vlastnosti jako ostatní sýry s bílou plísní na povrchu, obdobnprozrávají a mají i podobné senzorické vlastnosti.

Lze konstatovat, že použití testované plísn k sýra ským ú el m se v této fázi jeví jako možné a m že být zajímavou marketingovou alternativou p edevším pro menší nebo dosud nezavedené výrobce.

POD KOVÁNÍAuto i d kují panu Ing. Vladimíru Valentovi z fy Chr. Hansen Czech Republic s.r.o. za laskavé poskytnutí vzork testovaných plísní.

LITERATURA 1. DOLEŽÁLEK, J. Biochemie a technologie plís ových sýr . ÚVÚPP Praha, 1967, s. 89 - 240 2. Sm rné technologické postupy. STP Hermelín. Mlékárenský pr mysl, koncern Praha, vydal

TOMOS Praha, 1987, s. 138 - 145 3. MRÁZEK, J. Schémata technologických postup výroby sýr . Sýra ský pracovní sešit. SPŠM

Krom íž, 1996, s.14 4. INDRA, Z., MIZERA J.: Chemické kontrolní metody pro obor zpracování mléka. U ebnice

pro SPŠP, .j. 13197/92, 1992, s. 76 - 163

Kontaktní adresa Ing. Josef Mrázek; VOŠ potraviná ská a SPŠ mlékárenská, Št chovice 1358, 767 54 Krom íž[email protected]

237

VLIV P ÍDAVKU KAPPA- A IOTA-KARAGENANU NA VISKOELASTICKÉ A ORGANOLEPTICKÉ VLASTNOSTI TAVENÝCH SÝR

erníková Michaela 1), Bu ka František 1), Pavlínek Vladimír 2), echová Leona 1),B ezina Pavel 1), Hrab Jan 1)

1) Ústav potraviná ského inženýrství, FT UTB ve Zlín2) Centrum polymerních materiál FT UTB ve Zlín

The effect of addition of kappa- and iota-carrageenans on viscoelastic and organoleptic properties of processed cheeses

Summary:Consistency is a very important sensory characteristic of processed cheeses. In the work, there were analyzed and compared the samples of processed cheeses with additions of 0.25 % w/w -carrageenan and -carrageenan, after 14 days of storage at 6 2 oC using the dynamic oscillatory rheometry. With used

concentration of both carrageenans there increased the storage modulus G´ and the loss modulus G´´ in comparison with control samples. Influence of 0.25 % w/w -carrageenan on viscoelastic and organopeptic properties was higher as compared with -carrageenan in the same dosing. Additions of both carrageenans (0.25 % w/w) were sensory acceptable (there were no off-flavours).

Úvod

Polysacharidy (pektin, modifikované škroby, algináty, karagenany aj.) jsou k n kterýmmlékárenským produkt m p idávány s cílem stabilizovat strukturu finálního výrobku, resp. optimalizovat jeho konzistenci1,2. Karagenany mají význam také v technologii výroby tavených sýr pro schopnost ovlivnit a stabilizovat konzistenci. Karagenany jsou anionaktivní lineární polysacharidy extrahované z ervených as (Rhodophyceae) obsahující jako základní jednotku disacharid karabinózu ( -D-galaktopyranóza a 3,6-anhydro- -D-galaktopyranóza).Existují t i hlavní frakce karagenan ( -kappa, -iota a -lambda), které se odlišují po tem a polohou sulfátových skupin (SO3

-) na základním dimeru. Kappa-karagenan a iota-karagenan tvo ígely, což úzce souvisí s jejich schopností vytvo it za ur itých teplot (obvykle pod 50 oC) helikální konformaci. Kappa-karagenan obvykle poskytuje tuhé a k ehké gely, zatímco -karagenan m kkéelastické gely. Lambda-karagenan není schopen tvo it stabilní gely3-9.

Kaseinové micely jsou složeny z hlavních frakcí S1-, S2-, - a -kasein . Práce Thaiudom & Goff2, Tziboula & Horne7 a Augustin a kol.10 dokazují, že interakce -karagenanu a -karagenanu s kaseinovými micelami již byly publikovány. Tyto reakce se v tšinou zd vod ují

specifickými elektrostatickými interakcemi negativn nabitých sulfátových skupin karagenans kladn nabitými oblastmi mezi 97. a 112. aminokyselinovým zbytkem na -kaseinové frakci, která tvo í obalovou (ochrannou) vrstvu micely11,12. Vlastnosti kaseino-karagenanového systému závisí na velkém po tu parametr , k nimž pat í koncentrace obou biopolymer , pH, p ítomnost a koncentrace iont , p ítomnost a koncentrace cukr , teplota systému, molekulové hmotnosti protein , podmínky technologických operací aj.9.

Kappa-karagenan i iota-karagenan se adsorbují na kaseinové micely p i teplotách, kdy jsou karagenany v helikální konformaci. Adsorpce je teplotn reverzibilní pro -karagenan, zatímco u -karagenanu je ireverzibilní13,14. Langendorff a kol.13 p edpokládají dva typy interakcí v systému -karagenan-kaseinová micela závisející zejména na obsahu polysacharidu. Podle této hypotézy,

je-li koncentrace -karagenanu nižší než 0,2 % (w/w), tvo í tento polysacharid adsorbovaný na povrch kaseinových micel jen „mezivrstvu“ mezi kaseinovými micelami (za p edpokladu, že teplota systému se nachází v oblasti, kdy je -karagenan v helikální konformaci). P i vyšších koncentracích -karagenanu pak pravd podobn vznikají nejen výše popsané vazby, ale navíc je tvo ena sí mezi

samotnými karagenanovými et zci. Podle Langendorff a kol.14 se v systému -karagenan-kaseinová micela tvo í pouze druhý typ interakcí (sí mezi karagenanovými et zci).

238

Bourriot a kol.15 p edpokládají, že existuje minimální koncentrace -karagenanu, p i které se výše zmín ná sí m že efektivn vytvo it a je stabilní.

V p írodních sýrech (eidamského a ementálského typu), které jsou základní surovinou pro tavené sýry, se však nenachází ani kaseinové micely ani -kaseinová frakce v její nativní podob(tedy se 169 aminokyselinovými zbytky). Jen velmi málo studií se zabývá interakcemi

-karagenanu a -karagenanu s jednotlivými kaseinovými frakcemi4,12. Lynch & Mulvihill16

p edpokládají schopnost interakcí S- a -kaseinových frakcí s karagenany, které jsou však podmín ny p ítomností vápenatých iont a esterov vázaného fosforu zejména na serylových zbytcích.

Cílem této práce bylo použít -karagenan a -karagenan p i výrob tavených sýr s 50 % tuku v sušin a studovat rozdíly ve viskoelastických a organoleptických vlastnostech tavených sýrs r znými karagenany. Použitá koncentrace karagenan ve finálním výrobku byla zvolena tak, aby byla spln na podmínka tvorby 2 typ sítí, které p edpokládá Langendorff a kol.13, tedy nad 0,2 % w/w (viz výše).

Materiál a metody

Analyzovány byly tavené sýry s obsahem 40 % (w/w) sušiny a 50 % tuku v sušin (w/w), k jejichž výrob byly použity: sm s p írodních sýr (eidamská cihla 30 % tuku v sušin w/w, eidamská cihla 45 % tuku v sušin w/w), máslo, voda a komer n dodávané tavicí soli. Tavené sýry byly vyráb ny na za ízení Vorwerk Thermomix TM 21 blender cooker (Vorwerk & Co. Thermomix; GmbH, Wuppertal, N mecko), p i tavicí teplot 92 oC a celkové dob tavení cca 10 minut. Stejné za ízení pro výrobu tavených sýr použili Lee a kol.17. Tavené sýry byly po výrob zchlazeny na 6 2 oC a p i této teplot skladovány do doby provedení analýz.

K taveným sýr m byly samostatn p idávány -karagenan a -karagenan (Sigma Aldrich, Inc., St. Louis, USA) v množství 0,25 % w/w, a to p ímo v práškové form . Reologické a senzorické hodnocení bylo provedeno po 14 dnech skladování. Pro reprodukovatelnost výsledkbyla stejná technologie výroby v etn koncentrací -karagenanu a -karagenanu použita ve 4 opakováních (skupiny I až IV).

Reologické vlastnosti p ipravených tavených sýr byly charakterizovány pomocí rota níhoviskozimetru Bohlin Gemini (Bohlin Instruments, UK) v geometrii deska-deska (pr m r 40 mm, št rbina 1 mm) p i teplot 20 oC. M ení bylo provád no v oscila ním režimu s amplitudou smykového nap tí 20 Pa v oblasti lineární viskoelasticity. Elastický modul pružnosti G´ a ztrátový modul pružnosti G´´ byly vyhodnocovány v rozsahu frekvencí 0,1 až 50 Hz.

Senzorické hodnocení bylo v jednotlivých šaržích provedeno 20 vybranými posuzovateli (zam stnanci Ústavu potraviná ského inženýrství) vyškolenými podle SN ISO 8586-118. Vzorky byly p edkládány anonymn p i pokojové teplot (22 2 oC). Hodnoceny byly 3 senzorické znaky (tuhost, roztíratelnost, chu a v n ), a to podle sedmibodových ordinálních stupnic s charakteristikou každého stupn . Pro statistické vyhodnocení byl použit Kruskal-Wallis v test19.

Výsledky a diskuze

Dynamickou oscila ní reometrií byly analyzovány ty i skupiny tavených sýrs obsahem 40 % w/w sušiny a 50 % w/w tuku v sušin . Realizovány byly p ídavky -karagenanu a -karagenanu v množství 0,25 % w/w. Základní analýza ukázala, že všechny vzorky tytestovaných skupin mají prakticky stejné pH (v rozmezí 5,88 až 5,95) i obsah sušiny (v rozmezí 40,00 až 41,00 % w/w). Obdobný obsah sušiny a pH umožnil srovnání vlivu p ídavku r znýchkaragenan , nebo pH i obsah sušiny zna n ovliv ují konzistenci tavených sýr 17,20. Jednotlivé skupiny tavených sýr (I až IV) se lišily ve výrobci použitých p írodních sýr a jejich stupni prozrálosti z d vodu vyšší vypovídací schopnosti výsledk pro pr myslovou praxi, kde je velmi obtížné zajistit vždy stejného dodavatele suroviny a konstantní stupe prozrálosti. Proto m lykontrolní vzorky v jednotlivých testovaných skupinách odlišnou po áte ní tuhost (viz hodnoty

239

elastického modulu pružnosti G´, ztrátového modulu pružnosti G´´ a hodnoty tangentu úhlu fázového posunu pro referen ní frekvenci 1 Hz v tabulkách I a II). Záv ry o vlivu p ídavku 0,25 % w/w -karagenanu nebo -karagenanu byly pak vztahovány ke kontrolnímu vzorku dané skupiny.

Tabulka I Hodnoty elastického modulu pružnosti G´, ztrátového modulu pružnosti G´´ a tangentu úhlu fázového posunu tan pro referen ní frekvenci 1 Hz u tavených sýr s p ídavkem 0,25 % w/w

-karagenanu a -karagenanu ve skupinách I a II Skupina tavených sýrI II Tavený sýr G´ [Pa] G´´ [Pa] tan [-] G´ [Pa] G´´ [Pa] tan [-]

Kontrola 1275.0 1329.0 1.043 352.4 563.1 1.600 -karagenan 4098.0 2719.0 0.664 641.0 721.6 1.126 -karagenan 5288.0 2969.0 0.561 2750.0 1722.0 0.627

Tabulka II Hodnoty elastického modulu pružnosti G´, ztrátového modulu pružnosti G´´ a tangentu úhlu fázového posunu tan pro referen ní frekvenci 1 Hz u tavených sýr s p ídavkem 0,25 % w/w

-karagenanu a -karagenanu ve skupinách III a IV Skupina tavených sýrIII IV Tavený sýr G´ [Pa] G´´ [Pa] tan [-] G´ [Pa] G´´ [Pa] tan [-]

Kontrola 178.6 337.0 1.889 46.3 128.0 2.762 -karagenan 322.7 500.6 1.552 597.3 552.2 0.926 -karagenan 1335.0 1133.0 0.848 924.0 796.4 0.863

Tabulka III Výsledky senzorické analýzy tavených sýr s p ídavkem 0,25 % w/w -karagenanu a -karagenanu (vyjád eno jako medián) u II. a IV. skupiny

Skupina tavených sýrII IV Tavený sýr Tuhost Roztíra-

telnost Chua v n Tuhost Roztíra-

telnost Chua v n

Kontrola 5a 5a 3a 6a 6a 3a

-karagenan 4b 4b 3a 5b 5b 2a

-karagenan 3c 3c 3a 4c 4c 2a

Tuhost: 1-velmi tuhý, 7-velmi m kkýRoztíratelnost: 1-vzorek není možné rozet ít, 4-optimální roztíratelnost, 7-tekutý vzorek Chu a v n : 1-vynikající, 7-naprosto nep ijatelnáRozdílné písmenné indexy v jednotlivých sloupcích zna í signifikantní rozdíly (P < 0,05)

Na obrázku 1 je zobrazena (pro 4 posuzované skupiny) závislost elastického modulu pružnosti G´ a ztrátového modulu pružnosti G´´ na frekvenci (0,1 až 50 Hz) u tavených sýr , které byly skladovány 14 dn p i teplot 6 2 oC. Z výsledk vyplývá, že použitá koncentrace obou karagenan (0,25 % w/w) zvýší hodnoty elastického modulu pružnosti G´ i ztrátového modulu

240

pružnosti G´´ oproti p íslušným kontrolním vzork m v celé oblasti testovaných frekvencí (0,1 až 50 Hz). Tyto zm ny indikují skute nost, že množství 0,25 % w/w -karagenanu i -karagenanu v taveném sýru zm ní povahu jeho gelu, který vykazuje vyšší tuhost ve srovnání s kontrolou. Lze to pravd podobn vysv tlit tím, že -karagenan i -karagenan prost ednictvím interakcí svých et zc p isp jí k vytvo ení intenzivn ji zesí ované matrice tavených sýr .V p ípad p ídavku -karagenanu je možné také p edpokládat adsorpci et zc karagenanu v helikální konformaci na kaseinové frakce a vytvo ení „mezivrstvy“13,14. Zjišt ní, že tavené sýry s p ídavkem 0,25 % w/w -karagenanu i -karagenanu jsou signifikantn (P < 0,05) tužší a ménroztíratelné než p íslušné kontrolní vzorky, byl potvrzen i senzorickou analýzou, jejíž výsledky pro II. a IV. adu jsou prezentovány v tabulce III. Realizované p ídavky karagenan negativnneovlivnily chu a v ni u posuzovaných tavených sýr (P 0,05).

A B

C D

Obr. 1. Závislost elasického modulu pružnosti G´ [Pa] u kontrolního vzorku ( ), vzorku s p ídavkem 0,25 % w/w -karagenanu ( ), vzorku s p ídavkem 0,25 % w/w -karagenanu ( )a ztrátového modulu pružnosti G´´ [Pa] u kontrolního vzorku ( ), vzorku s p ídavkem 0,25 % w/w

-karagenanu ( ), vzorku s p ídavkem 0,25 % w/w -karagenanu ( ) na frekvenci [Hz]; A – skupina I, B –skupina II, C – skupina III a D – skupina IV

Z tabulek I a II a obrázku 1 vyplývá, že -karagenan p isp l k vytvo ení pevn jšího gelu než -karagenan (pro p ídavek 0.25 % w/w). Jednozna né vysv tlení v tší ú innosti -karagenanu než -karagenanu není jednoduché, zvlášt vezme-li v úvahu tvrzení Imeson6, že -karagenan tvo ítuhé gely a -karagenan m kké elastické gely. Odpov lze pravd podobn hledat nap íklad v p ítomnosti kationt (zejména draselných a vápenatých), jimiž je síla karagenanové sítsignifikantn ovlivn na21. V p írodních sýrech (základní surovina pro tavené sýry) se vyskytuje podle Fox a kol.22 p ibližn desetinásobné množství vápenatých iont , ke kterým je z hlediska tvorby gelu citlivý zejména -karagenan, oproti draselným iont m, ke kterým je citlivý zejména

241

-karagenan. Podle Spagnuolo a kol.3 totiž m že mít vliv nejen množství vápenatých a draselných iont , ale i jejich vzájemný pom r. P evaha koncentrace vápenatých iont nad draselnými pak m žesehrávat významnou roli v pevnosti gelu -karagenanu a -karagenanu. Je vhodné rovn ž zohlednit práci MacArtain a kol.23, kte í zjistili, že pro -karagenan existuje optimální koncentrace vápenatých iont v prost edí. V oblasti koncentrací menších než optimum zap í iní jejich rostoucí koncentrace zvyšování pevnosti gelu -karagenanu. Na druhou stranu p ekro í-li v daném systému koncentrace vápenatých iont optimum, pak s jejím dalším zvyšováním klesají hodnoty elastického modulu pružnosti G´ vytvo eného gelu (jeho tuhost).

Na základ výsledk senzorické analýzy lze konstatovat, že u testovaných skupin posuzovatelé ozna ili tavené sýry s 0,25 % w/w -karagenanu jako signifikantn tužší a ménroztíratelné (P < 0,05) než výrobky se stejným množstvím -karagenanu.

Záv r

V práci byla srovnávána konzistence tavených sýr s p ídavky 0,25 % w/w -karagenanunebo -karagenanu s kontrolním vzorkem u celkem 4 skupin výrobk s obsahem 50 % w/w tuku v sušin . Použité karagenany zap í inily ve srovnání s kontrolním vzorkem nár st elastického modulu pružnosti G´ i ztrátového modulu pružnosti G´´. Z toho plyne, že se tavené sýry v d sledkup ídavku 0,25 % w/w karagenan staly tužšími. Nár st tuhosti a pokles roztíratelnosti se u p ídavkukaragenan (ve srovnání s kontrolním vzorkem) signifikantn projevil i p i senzorické analýze testovaných výrobk . Ani u jednoho taveného sýra s karagenany nebyly zjišt ny nežádoucí p íchuti nebo pachuti.

Ze srovnání ú innosti -karagenanu a -karagenanu metodou dynamické oscila níreometrie vyplynulo, že p ídavek 0,25 % w/w -karagenanu je ú inn jší ve zvyšování tuhosti a snižování roztíratelnosti tavených sýr oproti -karagenanu. Tento záv r byl u t í ze typosuzovaných skupin tavených sýr potvrzen i senzorickou analýzou.

Pod kováníPráce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101.

Použitá literatura:1. Simeone, M., Alfani, A., Guido, S. Phase diagram, rheology and interfacial tension of aqueous

mixtures of Na-caseinate and Na-alginate. Food Hydrocolloids, 18, 2004, 463 – 470. 2. Thaiudom, S., Goff, H.D. Effect of -carrageenan on milk protein polysaccharide mixtures.

International Dairy Journal, 13, 2003, 763 – 771. 3. Spagnuolo, P.A., Dalgleish, D.G., Goff, H.D., Morris, E.R. Kappa-carrageenan interactions in

systems containing casein micelles and polysaccharide stabilizers. Food Hydrocolloids, 19,2005, 371 – 377.

4. Ribeiro, K.O., Rodrigues, M.I., Sabadini, E., Cunha, R.L. Mechanical properties of acid sodium caseinate- -carrageenan gels: effect of co-solute addition. Food Hydrocolloids, 18, 2004, 71 – 79.

5. Singh, H., Tamehana, M., Hemar, Y., Munro, P.A. Interfacial compositions, microstructures and properties of iol-in-water emulsions formed with mixtures of milk proteins and -carrageenan: 1. Sodium caseinate. Food Hydrocolloids, 17, 2003, 539 – 548.

6. Imeson, A.P. Carrageenan. In Handbook of hydrocolloids. Eds. Phillips, G.O. & Williams, P.A. Woodhead Publishing Limited and CRC Press: Boca Raton, 2000, 87 – 102.

7. Tziboula, A., Horne, D.S. Influence of milk proteins on -carrageenan gelation. InternationalDairy Journal, 9, 1999, 359 – 364.

8. Velíšek, J., Cejpek, K., Davídek, T., Míková, K., Pánek, J., Pokorný, J. Chemie potravin I. 1. vyd. Tábor: OSSIS, 1999, 352 s.

242

9. Syrbe, A., Bauer, W.J., Klostermeyer, H. Polymer Science Concepts in Dairy Systems – An Overview of Milk Protein and Food Hydrocolloid Interaction. International Dairy Journal, 8,1998, 179 – 193.

10. Augustin, M.A., Puvanenthiran, A., McKinnon, I.R. The effect of -carrageenan conformation on its interaction with casein micelles. International Dairy Journal, 9, 1999, 413 – 414.

11. Garnier, C., Michon, C., Durand, S., Cuvelier, G., Doublier, J.L., Launay, B. Iota-carrageenan/casein micelles interactions: evidence at different scales. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 31, 2003, 177 – 184.

12. Vega, C., Dalgleish, D.G., Goff, H.D. Effect of -carrageenan addition to dairy emulsions containing sodium caseinate and locust bean gum. Food Hydrocolloids, 19, 2005, 187 – 195.

13. Langendorff, V., Cuvelier, G., Launay, B., Michon, C., Parker, A., de Kruif, C.G. Casein micelle/iota-carrageenan interactions in milk: influence of temperature. Food Hydrocolloids, 13,1999, 211 – 218.

14. Langendorff, V., Cuvelier, G., Michon, C., Launay, B., Parker, A., de Kruif, C.G. Effects of carrageenan type on the behaviour of carrageenan/milk mixtures. Food Hydrocolloids, 14, 2000, 273 – 280.

15. Bourriot, S., Garnier, C., Doublier, J.L. Micellar-casein- -carrageenan mixtures. I. Phase separation and ultrastructure. Carbohydrate Polymers, 40, 1999, 145 – 157.

16. Lynch, M.G., Mulvihill, D.M. Rheology of -carrageenan gels containing caseins. FoodHydrocolloids, 10, 1996, 151 – 157.

17. Lee, S.K., Anema, S., Klostermeyer, H. The influence of moisture content on the rheological properties of processed cheese spreads. International Journal of Food Science and Technology,39, 2004, 763 – 771.

18. ISO Standard No. 8586-1:1993 Sensory analysis – General guidance for the selection, training and monitoring of assessors – Part 1: Selected assessors. International Organization for Standardization, Geneva, 1993.

19. Hrab , J., K íž, O., Bu ka, F. Statistické metody v senzorické analýze potravin [skripta]. 1. vyd. Vyškov : VVŠ PV, 2001, 114 s.

20. Marchesseau, S., Gastaldi, E., Lagaude, A., Cuq, J.L. Influence of pH on Protein Interactions and Microstructure of Process Cheese. Journal of Dairy Science, 80, 1997, 1483 – 1489.

21. Nickerson, M.T., Paulson, A.T., Hallett, F.R. Dilute solution properties of -carrageenanpolysaccharides: effet of potassium and calcium ions on chain conformation. CarbohydratePolymers, 58, 2004, 25 – 33.

22. Fox, P.F., Guinee, T.P., Cogan, T.M., McSweeney, P.L.H. Fundamentals of Cheese Science.Aspen Publication, 2000, 559 s.

23. MacArtain, P., Jacquier, J.C., Dawson, K.A. Physical characteristics of calcium induced -carrageenan networks. Carbohydrate Polymers, 53, 2003, 395 – 400.

Kontaktní adresa:MVDr. Michaela erníková, Ústav potraviná ského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlín , nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. 576 031 511, e-mail: [email protected]

243

VLIV VYBRANÝCH HYDROKOLOID NA MECHANICKÉ VLASTNOSTI GELU -KARAGENANU V MLÉCE

Šilhavá Jaroslava, Št tina Ji í , Loužecký Tomáš Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha

Influence of selected hydrocoloids on mechanical properties of -carrageenan gel in milk.

Summary:The influence of addition of representative hydrocolloids (guar gum, locust bean gum, tara gum,

conjac gum) on mechanical properties and syneresis of carrageenan gels prepared in reconstituted skim milk (10 % w/w) was evaluated. A 0.5 % blend of hydrocolloids standardized to content 10 % of KCl, in which the part of galactomannans or glucomannans was 5 - 50 %, were used for gel preparation. Mechanical properties of gels were evaluated by the puncture test at 10 °C. Solidity, adhesiveness, deformability and firmness were evaluated.

Konjac gum had different influence on mechanical properties of carrageenan gels in milk than galactomannans. The former increased the firmness and deformability, while the later decreased firmness and had only low effect on gel deformability. Conjac increased gel solidity up to its content 20 % in mixture with carrageenan, while galactomannans decreased it. The maximum solidity was found for the carrageenan gel mixed with 20 % of conjac gum, whereas the maximum firmness and deformability was found for the gel with 50 % of conjac gum. The least solidity and firmness was found for the gel prepared from the mixture of carrageenan with 50 % guar gum. The gel syneresis decreased as the gum content in blend with carrageenan was increased.

ÚvodKappa-karagenan (lineární sulfatovaný polysacharid tvo ený opakující se sekvencí

-D-galaktopyranosy a 3,6-anhydro- -galaktopyranosy)1 je asto využíván jako želírující prost edkem (E407) ur ující texturu r zných typ mlé ných dezert . Samotný -karagenan tvo ív mléce tuhý a k ehký termoreverzibilní gel podléhající syneresi. Mechanické vlastnosti t chto geljsou pozitivn ovlivn ny interakcemi -karagenanu s kaseinem, mohou se ovšem lišit podle p vodua zp sobu rafinace -karagenanu1. S cílem minimalizace synereze a zvýšení krémovitosti výrobku jsou asto kombinovány s dalšími hydrokoloidy, nap íklad galaktomannany3, polysacharidy tvo enými et zcem -(1 4)-D-mannopyranosy s r zným po tem substituent D-galaktosy p ipojených (1 6) -glykosidickou vazbou.4 Jedná se nap íklad o guarovou, lokustovou a tara gumu. Guarová guma je dob e rozpustná ve vod na siln viskózní roztoky stabilní v rozmezí pH 4 až 10. Lokusová a tara guma jsou rozpustné až po záh evu. Netvo í samostatn gely, ale zvyšují elasticitu a pevnost gel agaru a karagenan .4 Jiným polysacharidem, který zvyšuje elasticitu a tuhost gelu karagenanu, je glukomannan konjaková guma jehož et zec tvo í jednotky D-mannopyranosy a D-glukopyranosy spojené (1 4) -glykosidickou vazbou.5

V p edchozích pracech6 byly charakterizovány mechanické vlastnosti gelu vzorku rafinovaného -karagenanu a jeho sm sí s guarovou, lokustovou, tara a konjakovou gumou v r zných substrátech, v etn obnoveného mléka. P i t chto experimentech byla použita relativnvysoká koncentrace karagenanu, tak aby sm si tvo ily dostate n tuhý gel i v isté vod . Cíle této práce bylo doplnit údaje o vlivu uvedených dopl kových hydrokoloid na mechanické vlastnosti gelu karagenanu v mléce p i obsahu sm si t chto polysacharid odpovídající aplikacím v mlé nýchdezertech.

Materiály a metodyMateriálHydrokoloidy: rafinovaný karagenan, konjaková guma, lokustová guma, guarová guma, tara guma (TRUMF International s.r.o., Dolní Újezd) – charakterizaci uvádí Loužecký.6 Z hydrokoloid byla p ipravena sm s karagenanu s podílem 5-50 % dopl kového hydrokoloidu, standardizovaná na obsah KCl 10 % hm. Pro p ípravu substrátu bylo použito sušené odst ed né mléko (PML a.s., Nový Bydžov).

244

P íprava gel a hodnocení V substrátu (obnovené sušené odst ed né mléko; 10g mléka/90g destilované vody). byla

rozmíchána 0,5 % sm si hydrokoloid a míchána 30 minut p i 90°C. Vzniklá disperze byla oh átá a temperována za sou asného míchání p i 90 °C po dobu 30 min a p elita do kádinky 400 ml (pr m r7,5 cm) do výšky cca 4 cm (cca 200 ml). Po hodin chladnutí na pokojovou teplotu byl gel skladován do druhého dne p i 10°C. P íprava a m ení gel provedena dvakrát.

Mechanické vlastnosti vyhodnoceny metodou vtla ování válcové sondy do gelu (pr m r 2 cm; rychlost pohybu sondy 0,5 mm/s; hloubka vtla ování 25 mm; vysunutí na p vodní pozici sondy rychlostí 1 mm/s.) p i teplot 10°C. M ení bylo provedeno na p ístroji Textrure Analyser TA. XT. plus (Stable Micro Systems UK). Ze zat žovací k ivky (Obr. 1) byly vyhodnoceny následující veli iny:

S - po áte ní elasticita; sm rnice zat žovací k ivky do hloubky 2 mm - vyjad uje tuhost [N/mm]F - síla na mezi pevnosti; vyjad uje pevnost [N]H - hloubka vpichu (pozice sondy) na mezi pevnosti; vyjad uje deformovatelnost [mm]A - práce na p ekonání t ení p i vytažení sondy; vyjad uje p ilnavost [g.mm]

Ve vzorku po hodnocení mechanických vlastností pak byla po jednom dni skladování p i teplot10 °C stanoveno množství uvoln né vody.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

Force (N)

Time (sec)

1 2 3 4 5

Obr. 1. P íklad zat žovací k ivky p i hodnocení mechanických vlastností gelu metodou vtla ování (A – práce na p ekonání t ení p i vytažení sondy - p ilnavost; F - síla na mezi pevnosti - pevnost; H - hloubka na mezi pevnosti - deformovatelnost; S – po áte ní elasticita – tuhost; 1 – hloubka vtla ení sondy 2 mm, 2 – mez pevnosti; 3 - hloubka vtla ení sondy 25 mm; 4 – nulová síla p ivysunování sondy; 5 – kone ná pozice sondy)

Výsledky a diskuseZ charakteru zat žovací k ivky (Obr.1) je z ejmé, že karagenan gely karagenanu v mléce

vykazují výraznou lomivost. V pr b hu vtla ování se nejprve pot ebná síla tém lineárn zvyšuje až do meze pevnosti p i které dochází k výraznému lomu gelu a tudíž prudkému poklesu síly. B hem dalšího vtla ování síla již jen kolísá a nedochází k žádnému dalšímu zvýšení.

H

F

A

vtla ování sondy do gelu vysunování sondy z gelu

S

245

P i vysunování sondygel vykazoval relativn malou p ilnavost. Ze srovnání zat žovacích k ivekgel s r znými dopl kovými hydrokoloidy (podíl 20%, Obr.2) je vid t, že zatímco konjak pevnost a lomivost gelu zvyšoval, ostatní gumy naopak snižovaly. Nicmén charakter zat žovacích k ivekse nezm nil.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

Force (N)

Time (sec)

Obr. 2 Vliv druhu dopl kového hydrokoloidu (1 konjaková guma; 2 samotný karagenan; 3 tara guma; 4 lokustová guma; 5 guarová guma) na charakter zat žovací k ivky gelu karagenanu v mléce. Podíl dopl kového hydrokoloidu 20%.

Vliv podílu a druhu dopl kového hydrokoloidu na jednotlivé sledované mechanické vlastnosti a synerezi gelu karagenanu v mléce je uveden na obrázcích 3 a 4. Z graf je z ejmé rozdílné p sobení galaktomannan a konjaku. Zatímco konjak zvyšuje tuhost (elasticitu) gelu až do podílu ve sm si s karagenanem 20 % (Obr. 3A), galaktomannany ji naopak snižovaly (po adí tuhosti gelu lokust > tara > guar). P i vysokém podílu konjaku ovšem tuhost gelu klesla pod tuhost gel s galaktomananny. Konjak zvyšoval i pevnost a deformovatelnost gelu (síla a hloubka vpichu na mezi pevnosti, Obr. 3B a 3C). Zvýšení deformovatelnosti a tím i pevnosti gelu je p i podílu konjaku nad 10 % velmi významné, p i podílu 50 % již p i vtla ování k prasknutí gelu v bec nedošlo. Galaktomannany pevnost gelu naopak snižovaly (po adí pevnosti tara > lokust > guar), deformovatelnost ovšem podstatn ji neovlivnily, pouze p i nejvyšším podílu lokustové a tara gumy došlo k jejímu mírnému zvýšení. Podobné závislosti byly zjišt ny i p i dávce hydrokoloid 1,5 %, kdy ovšem tara guma vykazovala vyšší tuhost než lokust (rozdíly mezi t mito gumami jsou ale vzhledem k jejich podobné struktu e málo pr kazné ) a galaktomannany mírn zvyšovaly deformovatelnost gelu v celém rozmezí jejich podílu ve sm si6.

P ilnavost gel (Obr. 4A) se vyzna ovala zna nou variabilitou, pravd podobn vlivem lomivosti gel a tudíž nahodilosti vzniklé struktury po p ekonání meze pevnosti. Hodnota p ilnavosti proto také z ejm necharakterizuje lepivost i krémovitost gelu, ale vykazuje statisticky významnou korelaci s tuhostí gelu (r = 0,82). Rozdíly mezi podíly ve sm si 5 až 20 % jsou ovšem vzhledem k variabilit p ilnavosti v tšinou nepr kazné, ale je z ejmý pokles p ilnavostip i vysokém podílu všech dopl kových hydrokoloid a tedy p i poklesu tuhosti gelu.

Nejv tší syneresi (cca 2,5 % uvoln né vody) vykazovaly gely s 5% podílem dopl kovéhohydrokoloidu, a to srovnatelnou s gelem samotného karagenanu. Množství uvoln né vody z gelklesalo s rostoucím podílem dopl kového hydrokoloidu až na zanedbatelnou hodnoty okolo 0,1 %.

1

2

34

5

246

A

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 10 20 30 40 50

podíl dopl kového hydrokoloidu (%)

tuho

st (N

/m)

J L T G

B

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50podíl dopl kového hydrokoloidu [%]

F [m

N]

J L T G

C

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50Podíl dopl kového hydrokoloidu [%]

H [m

m]

J L T G

Obr. 3 Vliv podílu dopl kového hydrokoloidu (K – kojaková guma; L – lokustová guma; G – guarová guma; T – tara guma) na tuhost (A), pevnost (B) a deformovatelnost (C) gelu karagenanu v mléce (0,5 % sm si karagenanu s dopl kovým hydrokoloidem a 10 % KCl).

247

A -12

-10

-8

-6

-4

-2

0J L T G

podíl dopl kového hydrokoloidu

piln

avos

t [m

N.m

]

0% 5% 10% 20% 30% 50%

B

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

J L T G

mno

žstv

í uvo

lnné

vod

y (h

m. %

)

0% 5% 10% 20% 30% 50%podíl dopl kového hydrokoloidu

Obr. 4 Vliv podílu dopl kového hydrokoloidu (K – kojaková guma; L – lokustová guma; G – guarová guma; T – tara guma) na p ilnavost (A) a synerezi (B) gelu karagenanu v mléce (0,5 % sm si karagenanu s dopl kovým hydrokoloidem a 10 % KCl). Chybové úse ky p edstavujíinterval spolehlivosti na hladin významnosti 95 %.

248

Záv rByl charakterizován a kvantifikován vliv b žných galaktomannan , resp. glukomannanu

konjaková guma, na mechanické vlastnosti gelu karagenanu. Nejpevn jší a nejvíce deformovatelný gel obsahuje 50% podíl konjakové gumy, naopak nejmenší pevnost a deformovatelnost m l gel s podílem 50 % guarové gumy, který zase vykazoval nejlepší vazbu vody. Získané výsledky budou využity pro návrh sm sí hydrokoloid p i konkrétních aplikacích karagenanu do mlé ných desert .

Pod kováníTato práce byla finan n podpo ena z projektu Ministerstva pr myslu a obchodu R - MPO .FT-TA/069 "Standardizace hydrokoloid a jejich aplikace pro potraviná ský pr mysl“. Projekt je ešen ve spolupráci se spole ností TRUMF International s.r.o. (Dolní Újezd).

Literatura1. Velíšek J.: Chemie potravin 1, 196 – 245, OSSIS Tábor 2002 2. Imerson A.P.: Carrageenan, In: Handbook of hydrocolloids, (Add Phillips G. O., Williams

P.A.), 88 – 102, Woodhead publishing limited, Cambridge 2000 3. Thaidom S., Goff H.D.: Effect of k.carrageenan on milk protein polysacharides mixtures.

International Dairy Journal 13, 763 – 771 (2003)4. Wielinga W.C. :Galactomannans, In: Handbook of hydrocolloids, (Add Phillips G. O., Williams

P.A.), 137 - 154, Woodhead publishing limited Cambridge 2000 5. Takigami S.: Konjac mannan., In: Handbook of hydrocolloids, (Add Phillips G. O., Williams

P.A.), 413 - 424, Woodhead publishing limited Cambridge 2000 6. Loužecký T., Št tina J.: Reologické vlastnosti gel karagenanu s galaktomannany v mléce,

Sborník Celostátní p ehlídky sýr 2006, 205 – 210, VŠCHT Praha 2006

Kontaktní adresa:Ing. Ji í Št tina, CSc., Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6 e-mail: [email protected]

249

TEXTURNÍ VLASTNOSTI GEL -KARAGENANUS VYBRANÝMI HYDROKOLOIDY V MLÉ NÝCH A SÓJOVÝCH SUBSTRÁTECH

Loužecký Tomáš, Dvo ák Milan, Dvo áková Eva, Šilhavá Jaroslava, Št tina Ji íÚstav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

Textural properties of -carrageenan gels with chosen hydrocolloids in milk and soya mixtures

Summary:The mixtures of -carrageenan with representative hydrocolloids (guar gum, locust bean gum, tara gum and conjac gum) were prepared. The rheological properties and water release were evaluated. For preparation 0.5% mixtures of hydrocolloids standardized to content 10 % of KCl, in which the part of galactomannans or glucomannans was 5 - 50 %, were used. The mixtures of refined -carrageenan were prepared in reconstitute skim milk (10 % w/w) and in soya drink (13.5 %) at the temperature 90 °C. The gels were stored after cooling one day at the temperature 10 °C. Mechanical properties of prepared gels were evaluated by the way of compressive method at the temperature 10 °C. The solidity, deformability and firmness were evaluated. The biggest solidity was found out in the gel, where was the mixture of -carrageenan with 30 % conjac gum prepared in reconstitute skim milk (27.3 kPa) and with 50 % conjac gum prepared in soya drink (18.0 kPa), whereas the fewest solidity was found out in the gel, where was the mixture of -carrageenan with 50 % guar gum prepared in reconstitute skim milk (1.9 kPa) and in soya drink (1.1 kPa). The biggest deformability was found out in the gel, where was the mixture of -carrageenan with 50 % conjac gum prepared in reconstitute skim milk (74 %) and in soya drink (78 %), whereas the fewest deformability was found out in the gel, where was the mixture of -carrageenan with 50 % guar gum prepared in reconstitute skim milk (24 %) and in soya drink (19 %). The biggest firmness was found out in the gel, where was the mixture of -carrageenan with 20 % conjac gum prepared in reconstitute skim milk (36.0 kPa) and with 20 % locust bean gum prepared in soya drink (27.0 kPa), whereas the fewest firmness was found out in the gel, where was the mixture of -carrageenan with 50 % guar gum prepared in reconstitute skim milk (6.9 kPa) and in soya drink (5.0 kPa). The gels prepared in reconstitute skim milk released less water (1.7 % w/w), than the gels prepared in soya drink, where was in several cases the amount of released water over 4 % w/w.

ÚVODKaragenany jsou lineární sulfátované polysacharidy, vyskytující se v ervených mo ských

asách (Rhodophyceae), zejména v rodech Euchema, Chondrus, Gigartina [2]. Základní strukturní jednotkou karagenanu jsou 3,6-anhydro- -D-galaktopyranosa (1 4) a -D-galaktopyranosa (1 3)[5,6]. Existují t i základní typy karagenan (kappa, iota, lambda), které se liší po tem a umíst ním sulfátových skupin na jednotce galaktosy [8]. Kappa a iota karagenany vykazují želírující vlastnosti, které jsou závislé na ad fyzikáln -chemických veli in, zejména na obsahu p ítomných iont (Na+, K+, Ca2+), pH, iontové síle v roztoku, molekulové hmotnosti a dalších [1,6,7].

Galaktomannany pat í mezi v tvené polysacharidy, vyskytující se v semenech mnoha rostlin. Základní et zec tvo í -D-mannopyranosa (1 4), na které je v ur itých místech vázána

-D-galaktopyranosa (1 6). Nejpoužívan jšími galaktomannany jsou guarová guma, lokusová guma a tara guma [4,9]. Samotné galaktomannany gely netvo í, n které z nich vykazují synergické p sobení s karagenanem, stejn jako glukomannan konjaková guma [9].

Želírující vlastnosti karagenan a jejich sm sí se asto využívají v mnoha mlé nýchvýrobcích, kde se uplat uje jejich interakce s mlé nými bílkovinami, zejména s kaseinem. Požadované textury výrobku m že být dosaženo rovn ž kombinací karagenanu s guarovou nebo lokusovou gumou [10]. N které hydrokoloidy a jejich sm si se používají p i aplikaci v sójových výrobcích, kde ovliv ují jejich senzorické a reologické vlastnosti [3].

CÍL PRÁCE V provedených m eních byly sledovány texturní vlastnosti sm sí -karagenanu

s vybranými hydrokoloidy s cílem, porovnat chování sm sí p ipravených v odst ed némobnoveném mléce a v sójovém nápoji z hlediska charakteru vzniklého gelu. Na základ získaných výsledk p ípadn navrhnout vhodný stabilizátor pro potraviná ské aplikace.

250

MATERIÁL A METODY hydrokoloidy: rafinovaný -karagenan, guarová guma, lokusová guma, tara guma, konjaková guma (TRUMF International s.r.o. , Dolní Újezd). Základní složení vzork hydrokoloid je uvedeno v Tab. I.sušené odtu n né mléko (PML a.s., Nový Bydžov), mléko bylo obnoveno v destilované vodna 10% hm. roztok sójový nápoj Klasik - sušina 13,5 % hm. (SUNFOOD, Dobruška) složení sm si hydrokoloid : sm s -karagenanu s 5 - 50 % p ídavného hydrokoloidu, standardizovaná na obsah KCl 10 % hm.

Tabulka I Složení vzork hydrokoloid (% hm.)

sušina bílkoviny AIS KCl popeloviny K Na Ca -karagenan 91,1 0,4 0,6 14,7 36,1 13,9 1,0 1,7

guarová guma 90,7 4,6 3,6 0,2 0,7 0,1 0,1 0,1 lokusová guma 90,5 5,7 6,7 0,6 1,5 0,3 0,1 0,1 tara guma 91,4 2,1 2,3 0,7 0,8 0,4 0,1 0,0 konjaková guma 90,0 0,8 1,3 0,5 1,1 0,3 0,1 0,0

AIS - látky nerozpustné v kyselin (acid insoluble substances)

P íprava gelSm si hydrokoloid byly rozpušt ny v odst ed ném obnoveném mléce a v sójovém nápoji

na 0,5% hm. roztoky. P ipravené sm si byly po zah átí temperovány a míchány ve sklen nýchduplikovaných nádobkách po dobu 30 minut p i teplot 90 °C. Poté byly sm si p elity do plastových zkumavek (50 ml) a po ochlazení na laboratorní teplotu (asi po jedné hodin ) byly umíst ny do termostatu, kde byly skladovány p i teplot 10 °C do druhého dne. Texturní vlastnosti p ipravených gel a množství uvoln né vody (% hm.) z 200 g gelu byly hodnoceny den po skladování p i teplot 10 °C.

Hodnocení mechanických vlastností vzniklých gelNásledující den po p íprav byly vytvo eny vzorky gel ve tvaru válce o pr m ru 27 mm

a výšce 30 mm, jejichž mechanické vlastnosti byly hodnoceny metodou stla ování mezi deskami na p ístroji TA.XTplus Texture Analyser (Stable Micro Systems, UK). Rychlost pohybu horní desky byla 1 mm/s a maximální deformace vzorku dosáhla 90 %.

Ze získané zat žovací k ivky byly vyhodnoceny následující veli iny (Obr. 1):

nap tí na mezi pevnosti mp (kPa), reprezentující pevnost gelu

02

0 hrhFmp

mp

relativní deformace na mezi pevnosti mp (%), která p edstavuje deformovatelnost gelu mp = ((h0-h)/h0)*100

modul pružnosti na mezi pevnosti E (kPa), vyjad ující tuhost gelu E = mp/ Hmp , , ,

kde Fmp síla, p i které je dosaženo meze pevnosti gelu; r0 po áte ní polom r vzorku; h0 po áte nívýška vzorku (mm), h výška vzorku p i lomu (mm) a Hmp = ln(h0/h) Henckyho deformace na mezi pevnosti (-).

251

Obr. 1 - P íklad zat žovací k ivky p i stla ování vzorku gelu mezi deskami.

VÝSLEDKY A DISKUSE

A Gely v obnoveném mléce (0,5% sm si)

0

5

10

15

20

25

30

10 20 30 40 50 60 70 80 90

deformovatelnost gelu mp (%)

pevn

ost g

elu

mp

(kPa

)

m kkost

k ehkost houževnatost (tuhost)

gumovitost

B Gely v sójovém nápoji (0,5% sm si)

0

5

10

15

20

25

30

10 20 30 40 50 60 70 80 90

deformovatelnost gelu mp (%)

pevn

ost g

elu

mp

(kPa

)

m kkost

k ehkost houževnatost (tuhost)

gumovitost

Obr. 2 Texturní mapy sm sí -karagenanu s dopl kovými hydrokoloidy v r zných substrátech:A - v obnoveném mléce, B - v sójovém nápoji. Samotný karagenan , p ídavek dopl kovéhohydrokoloidu: 5 %, 10 %, 20 %, 30 % a 50%; guarová guma: sv tle šedé symboly, erné ohrani ení symbol ; lokusová guma: erné symboly, erné ohrani ení symbol ; tara guma:

bílé symboly, erné ohrani ení symbol ; konjaková guma: tmav šedé symboly, bílé ohrani enísymbol (bez ohrani ení)

A1 práce na p ekonání meze pevnosti (N.mm)

A2 práce na maximální stla ení z meze pevnosti (N.mm)

A3 práce na p ekonání p ilnavostivzorku (N.mm) - p ilnavost

F1 mez pevnosti jako síla (N) F2 síla p i maximální deformaci (N)

tvrdost v ústech

252

0

5

10

15

20

25

30

sam

otný

kara

gen

guar

ová

gum

a

konj

akov

águ

ma

loku

sová

gum

a

tara

gum

a

sam

otný

kara

gen

guar

ová

gum

a

konj

akov

águ

ma

loku

sová

gum

a

tara

gum

a

obnovené mléko sójový nápoj

pevn

ost g

elu

mp (k

Pa)

5% 10% 20% 30% 50% 0 ada1

Podíl dopl kového hydrokoloidu:

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

sam

otný

kara

gen

guar

ová

gum

a

konj

akov

águ

ma

loku

sová

gum

a

tara

gum

a

sam

otný

kara

gen

guar

ová

gum

a

konj

akov

águ

ma

loku

sová

gum

a

tara

gum

a


defo

rmov

atel

nost

gel

u m

p (%

)

5% 10% 20% 30% 50% 0 ada1


Obr. 3 - Pevnosti gel sm sí -karagenanu (vlevo) a deformovatelnosti gel sm sí -karagenanu (vpravo) s dopl kovými hydrokoloidy.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

sam

otný

kara

gen

guar

ová

gum

a

konj

akov

águ

ma

loku

sová

gum

a

tara

gum

a

sam

otný

kara

gen

guar

ová

gum

a

konj

akov

águ

ma

loku

sová

gum

a

tara

gum

a


tuho

st g

elu

E (k

Pa)

5% 10% 20% 30% 50% 0 ada1


0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

sam

otný

kara

gen

guar

ová

gum

a

konj

akov

águ

ma

loku

sová

gum

a

tara

gum

a

sam

otný

kara

gen

guar

ová

gum

a

konj

akov

águ

ma

loku

sová

gum

a

tara

gum

a


uvol

nná

vod

a (%

hm

.)

5% 10% 20% 30% 50% 0 ada1


Obr. 4 - Tuhosti gel sm sí -karagenanu s dopl kovými hydrokoloidy (vlevo) a množství uvoln né vody u sm sí -karagenanu s dopl kovými hydrokoloidy (vpravo).

Texturní vlastnosti sm sí -karagenanu s vybranými hydrokoloidy p ipravenýchv odst ed ném obnoveném mléce a v sójovém nápoji jsou uvedeny na Obr. 2, kde jsou vyjád eny v podob texturní mapy, tedy závislosti pevnosti gelu na jeho deformovatelnosti. Zmín ná texturní mapa tedy poskytuje informace o charakteru vzniklých gel z hlediska jejich mechanických vlastností, které jsou z praktického hlediska významné zejména p i konzumaci potraviná ských výrobk . Na základ zm ny pevnosti a deformovatelnosti lze definovat ty i základní ukazatele textury, kterými jsou k ehkost, houževnatost (tuhost), m kkost a gumovitost. Kombinací vhodnzvolených sm sí hydrokoloid je možné navrhnout texturn p ijatelný výrobek. Pevnosti gel(nap tí pot ebné k porušení struktury gelu) a deformovatelnosti gel (relativní deformace) jsou uvedeny na Obr. 3. Na Obr. 4 jsou uvedeny tuhosti gel , vyjád ené jako zdánlivé moduly pružnosti a množství uvoln né vody po dni skladování, které vyjad uje synerezi vzniklého gelu. Na základt chto výsledk lze vyvodit následující záv ry.

Guarová guma snižuje pevnost a tuhost gel v obnoveném mléce i v sójovém nápoji, deformovatelnost nepatrn snižuje do obsahu 30 %, kdy je pokles výrazn jší.Konjaková guma zvyšuje pevnost gel do podílu 30 % v obnoveném mléce a 50 % v sójovém nápoji. Tuhost gel zvyšuje do obsahu 20 % v obnoveném mléce, resp. 30 % v sójovém nápoji, p i emž deformovatelnost gel zvyšuje od podílu 10 % v obnoveném mléce i v sójovém nápoji. Lokusová guma snižuje od podílu 20 % tuhost gel v obnoveném mléce i v sójovém nápoji, p i emž do obsahu 20 % tuhost prakticky nem ní.Tara guma snižuje od podílu 10 % tuhost gel v obnoveném mléce i v sójovém nápoji, p i emž do obsahu 10 % tuhost prakticky nem ní.

253

Lokusová guma a tara guma snižují pevnost gel od obsahu 10 % v obnoveném mléce. V sójovém nápoji do podílu 20 % pevnost nevýrazn zvyšují, od koncentrace 20 % dochází k poklesu pevnosti gel .Lokusová guma a tara guma nepatrn snižují deformovatelnost v obnoveném mléce, zatímco v sójovém nápoji deformovatelnost nepatrn zvyšují. Chování sm sí s p ídavkem lokusové gumy a tara gumy v obnoveném mléce, resp. sójovém nápoji bylo srovnatelné z hlediska charakteru vzniklého gelu (pevnost, deformovatelnost, tuhost).Gely s p ídavkem guarové gumy p ipravené v obnoveném mléce vykazovaly v tší pevnost, deformovatelnost i tuhost, než gely v sójovém nápoji. Gely s p ídavkem konjakové gumy p ipravené v obnoveném mléce vykazovaly rovn ž v tší pevnost, deformovatelnost i tuhost, než gely v sójovém nápoji, s výjimkou sm si s 50% obsahem konjakové gumy v sójovém nápoji, kde byla deformovatelnost v tší.Gely s p ídavkem lokusové gumy a tara gumy p ipravené v sójovém nápoji vykazovaly nepatrn vyšší pevnosti a tuhosti, než gely v obnoveném mléce. Deformovatelnosti byly prakticky totožné. Množství uvoln né vody se snižovalo s p ídavkem dopl kového hydrokoloidu. Nejvíce vody se uvol ovalo u sm sí s lokusovou gumou a tara gumou s podílem 5 % a 10 %, p ipravenýchv sójovém nápoji. Menší množství vody se uvol ovalo ze sm sí p ipravených v obnoveném mléce.

ZÁV R

Na základ získaných výsledk budou navrženy sm si hydrokoloid vhodné pro aplikace do mlé ných a sójových výrobk a desert .

Pod kováníTato práce byla finan n podpo ena z projektu Ministerstva pr myslu a obchodu R - MPO .FT-TA/069 „Standardizace hydrokoloid a jejich aplikace pro potraviná ský pr mysl“. Projekt je ešen ve spolupráci se spole ností TRUMF International s.r.o. (Dolní Újezd). Práce byla rovn ž podpo ena vnit ním grantem VŠCHT Praha ( . grantu: 322/08/0016).

LITERATURA: 1. Depypere Frédéric, Verbeken Dirk, Thas Olivier, Dewettinck Koen (2003): Mixture design

approach on the dynamic rheological and uniaxial compression behaviour of milk desserts. Food Hydrocolloids, 17: 311 - 320.

2. Dyrby M., Petersen R.V., Larsen J., Rudolf B., Nørgaard L., Engelsen S.B. (2004): Towards on-line monitoring of the composition of commercial carrageenan powders. Carbohydrate Polymers, 57: 337 - 348.

3. El-Sayed E.M., El-Gawad I.A. Abd, Murad H.A., Salah S.H. (2002): Utilization of laboratory-produced xanthan gum in the manufacture of yogurt and soy yogurt. European Food Research and Technology, 215: 298 - 304.

4. Chen Y., Liao M.-L., Boger D.V., Dunstan D.E. (2001): Rheological characterisation of -carrageenan/locust bean gum mixtures. Carbohydrate Polymers, 46: 117 - 124.

5. Chen Yu, Liao Ming-Long, Dunstan Dave E. (2002): The rheology of K+ - -carrageenan as a weak gel. Carbohydrate Polymers, 50: 109 - 116.

6. MacArtain P., Jacquier J.C., Dawson K.A. (2003): Physical characteristics of calcium induced -carrageenan networks. Carbohydrate Polymers, 53: 395 - 400.

254

7. Nickerson M.T., Paulson A.T., Hallett F.R. (2004): Dilute solution properties of -carrageenan polysaccharides: effect of potassium and calcium ions on chain conformation. Carbohydrate Polymers, 58: 25 - 33.

8. Singh Harjinder, Tamehana Michelle, Hemar Yacine, Munro Peter A. (2003): Interfacial compositions, microstuctures and properties of oil-in-water emulsions formed with mixtures of milk proteins and -carrageenan: 1. Sodium caseinate. Food Hydrocolloids, 17: 539 - 548.

9. Tako Masakuni, Qi Zhi-Qing, Yoza Eriko, Toyama Seizen (1998): Synergistic interaction between -carrageenan isolated from Hypnea charoides LAMOUROUX and galactomannan on its gelation. Food Research International, 31: 543 - 548.

10. Thaiudom S., Goff H.D. (2003): Effect of -carrageenan on milk protein polysaccharide mixtures. International Dairy Journal, 13: 763 - 771.

Kontaktní adresa: Ing. Tomáš Loužecký, Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, 166 28, Praha 6 - Dejvice,e-mail: [email protected]

255

ANTIFUNGÁLNÍ VLASTNOSTI ACYLGLYKOSID A JEJICH VYUŽITÍ Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír


Antifungal properties of acylglycosides and their usage

Summary:At present foodstuffs without synthetic additives are preferred. A possibility how to decrease the amount of preservatives, is to substitute them with compounds based on fatty acids and their derivatives. Fatty acid esters with glycerol, glucose and sucrose are commonly used as surfactants and have also a broad spectrum of antimicrobial activity1. These compounds could be therefore used also in dairy industry. The objective of this study was to investigate the susceptibility of Fusarium culmorum DMF 0103 to the antifungal properties of several fatty acids and their esters and verify their activity in a food product. Fatty acids (C10, C11, C12, C16 and C16:1), their corresponding monoacylglycerols, monoacylglucose C16:1 and monoacylfructoses (C12, C14 and C16) were used. Antifungal activity of fatty acids (C10, C11 and C12) and their 1-monoacylglycerols at their highest concentrations was verified in restored milk. A spectrophotometric method (A630) was used for the quantitative detection of the fungal growth. The number of viable spores cultivated in restored milk with the addition of tested compounds was determined by the plate cultivation method. Our results indicate that the addition of tested compounds decreases the number of viable spores. Fatty acids C10 and C11 and their corresponding monoacylglycerols showed the highest antifungal activity. The antifungal effects of the compounds used in restored milk were similar and the inhibition was 20 - 30 %.

Cíl práce:Cílem této práce bylo otestovat antifungální vlastnosti vybraných mastných kyselin a jejich

ester na kmeni Fusarium culmorum DMF 0103 a ov it jejich aktivitu v potraviná ském výrobku. Byly použity mastné kyseliny (C10, C11, C12, C16 a C16:1), jejich p íslušné 1-monoacylglyceroly, monoacylglukosa C16:1 a monoacylfruktosy (C12, C14 a C16). U nejvyšších testovaných koncentrací mastných kyselin (C10, C11 a C12) a jejich 1-monoacylglycerol byla ov ena antifungální aktivita v obnoveném odtu n ném mléce.

Úvod:Sou asným trendem v potraviná ství je snaha co nejvíce snížit obsah syntetických aditiv.

Jedním z možných ešení je nahrazení konzerva ních látek slou eninami na bázi mastných kyselin a jejich derivát . Estery mastných kyselin s glycerolem, glukosou a sacharosou jsou b žn používány jako emulgátory a zárove projevují antimikrobiální aktivitu v i širokému spektru mikroorganism 1. Tyto látky je proto s úsp chem možné využít také v mlékárenských technologiích.

Antifungální vlastnosti mastných kyselin jsou již dlouho známé. Ú inek závisí na délce et zce, koncentraci a pH prost edí. P i výb ru optimální délky mastné kyseliny musí být brán

ohled nejen na její inhibi ní aktivitu proti danému mikroorganismu, ale také na její rozpustnost2.Mastné kyseliny a jejich estery ovliv ují r st i germinaci spor plísní. Dochází k inhibici

myceliálního r stu a germinace konidií3. Mechanismus inhibi ních ú ink mastných kyselin a jejich derivát na mikroorganismy není dosud p esn znám. Povrchov aktivní látky ve vyšších koncentracích zp sobují poškození cytoplazmatických membrán, které vedou až k usmrcení bu ky4. K inhibici r stu mikroorganism dochází d sledkem zm ny bun né permeability2.Antimikrobiální efekt je zp soben inkorporací mastných kyselin do bun ných membrán5.Což zp sobuje neuspo ádanost okolních mastných kyselin a vede ke zvýšení membránové fluidity. Nespecifické zm ny fyzikálních vlastností lipidové dvojvrstvy mohou zp sobit zm nymembránových protein a m nit tak jejich normální funkci. Lipidová dvojvrstva membrán plísní je tedy primárním cílem ú inku mastných kyselin3.

256

Materiály a metody:Testované látky:

Byly použity mastné kyseliny (MK) - kaprinová (C10), undekanová (C11), laurová (C12), palmitová (C16) od firmy Fluka. Kyselina palmitolejová (C16:1) byla izolována z makadamiového oleje na ÚTMT, VŠCHT Praha. P íslušné 1-monoacylglyceroly (MAG) mastných kyselin, monoacylgukosa (GLU) C16:1 a monoacylfruktosy (FRU) (C12, C14 a C16) byly syntetizovány na ÚTMT, VŠCHT Praha. istota testovaných látek byla 95 % (GLC). Jako rozpoušt dlo testovaných látek byl použit ethanol, který m l výslednou koncentraci v mediu 2 %. Testované koncentrace:

Byly použity koncentrace 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 a 0,8 mmol/l pro všechny látky, krommonoacylfruktos (0,625; 1,25; 2,5 a 5 mmol/l). Testovaný mikroorganismus:

Fusarium culmorum DMF 0103; koncentrace spor v inokulu byla upravena na 1.105 ml-1.Použitá media:

Bujon se sladovým extraktem (MEB), agar se sladovým extraktem (MEA); pH 5,4. Použité potraviná ské výrobky:

Sušené mléko - odtu n né, Laktino; pH upraveno kyselinou mlé nou na 5,4. Použité metody:

Ke stanovení antifungální aktivity testovaných látek bylo použito p ímé stanovení r stuv tekuté p d (MEB) pomocí multispektrofotometru (630 nm):

Suspenze spor plísní byla zao kována do sady zkumavek obsahujících medium s danou koncentrací testovaných látek. Z t chto zkumavek byly napln ny sterilní mikrotitra ní desti ky, ve kterých probíhala kultivace i m ení absorbance. Po 24 h byla na multispektrofotometru prom ována denzita nár stu kultury. Výstupem byly k ivky závislosti absorbance na ase (240 h).

Ke stanovení r stu plísn v obnoveném mléce byla použita plotnová metoda a detekcí nár stu kolonií na pevné p d (MEA):

Suspenze spor plísní byla zao kována do sady zkumavek obsahujících obnovené mléko s danou koncentrací testovaných látek. Pro stanovení po tu životaschopných spor plísn byla použita technika po ítání kolonií. Po 24; 96; 120 a 168 h kultivace bylo 0,1 ml obnoveného mléka reinokulováno na povrch agaru. Výstupem byly k ivky závislosti logCFU na ase (168 h).

Výsledky a diskuse:Byly zm eny r stové k ivky testovaného kmene kultivovaného v tekutém mediu

v mikrotitra ních desti kách s p ídavkem inhibi ních látek po dobu 10 dn (240 h). Výsledky m ení byly graficky vyjád eny jako r stové k ivky Fusarium culmorum DMF 0103. Z výsledk je patrné, že p ídavek inhibi ních látek snižuje po et životaschopných spor. Z obr.1a vyplývá, že v p ítomnosti kyseliny dekanové dochází k prodloužení lag fáze r stu a ke snížení nár stu koltury. P i použití vyšších koncentrací nebyl zaznamenán žádný nár st kultury. Acylfruktosy byly ú inné pouze v nejvyšších použitých koncentracích (viz obr. 1b). Ostatní látky nem ly výrazný inhibi ní ú inek (viz obr. 1c). N které látky (MK C16:1 a její estery) r st plísn podporovaly (viz obr. 1d).

Pro srovnání inhibi ních ú ink testovaných látek byly vypo teny plochy pod jednotlivými inhibi ními k ivkami pro jednotlivé koncentrace inhibi ních látek a po srovnání s kontrolou vypo teny procentuální inhibice r stu kultury. Pro vzájemné porovnání použitých látek byly výsledky zracovány do formy p ehledných map (viz obr. 2). Je patrné, že zvýšení koncentrace vede k vyššímu inhibi nímu efektu. N které látky r st mikroorganismu podporovaly.

257

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 50 100 150 200 250

[h]

A

K0,050,100,200,400,80

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 50 100 150 200 250

[h]

A

K0,6251,252,55

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0 50 100 150 200 250

[h]

A

K0,050,100,200,400,80

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0 50 100 150 200 250

[h]

A

K0,050,100,200,400,80

Obr. 1. R stové k ivky F. Culmorum po p ídavku r zných koncentrací (mmol/l) a) MK C10, b) FRU C12, c) MK C16, d) MK C16:1. Pozn.: K – kontrola bez p ídavku inhibi ních látek.

Slou enina0,05 0,10 0,20 0,40 0,80

MK C10

MK C11

MK C12

MK C16

MK C16:1

MAG C10

MAG C11

MAG C12

MAG C16

MAG C16:1

Glu C16:1

Fusarium culmorum DMF 0103c [mmol/l]

Obr. 2. Inhibi ní efekt testovaných látek p i všech použitých koncentracích na F. culmorum.

Byly zm eny r stové k ivky testovaného kmene kultivovaného v obnoveném odtu n ném mléce s p ídavkem inhibi ních látek po dobu 168 h. Výsledky m ení byly graficky vyjád eny jako r stové k ivky Fusarium culmorum DMF 0103. Pro srovnání inhibi ních ú ink testovaných látek byly vypo teny plochy pod inhibi ními k ivkami a po srovnání s kontrolou vypo teny procentuální inhibice r stu kultury. V obnoveném mléce byl ú inek použitých látek vyrovnaný a hodnoty inhibice se pohybovaly mezi 20 – 30 % (viz obr. 3).

a) b)

c) d)

> 90 %

50 - 90 %

25 - 50 %

0 - 25 %

0 - 50 %

Inhibice

Vyšší nár st

Slou enina0,625 1,250 2,500 5,000

Fru C12

Fru C14

Fru C16

Fusarium culmorum DMF 0103c [mmol/l]

258

0

20

40

60

80

100

MK C10 MK C11 MK C12 MAG C10 MAG C11 MAG C12

Inhibi ní látka

Inhi

bice

rst

u [%

]

Inhibice r stu

Obr. 3. Inhibice r stu F. culmorum po p ídavku 0,80 mmol/l MK a MAG v obnoveném mléce.

Záv r:Byly testovány antifungální vlastnosti vybraných mastných kyselin a jejich ester

na kmeni Fusarium culmorum DMF 0103. Dále byla ov ena antifungální aktivita vybraných látek v obnoveném mléce. Z výsledk je patrné, že p ídavek inhibi ních látek snižuje po etživotaschopných spor. P i použití vyšších koncentrací nebyl zaznamenán žádný r st plísn . Nejvíce ú inné byly mastné kyseliny C10 a C11 a jejich 1-monoacylglyceroly. Acylfruktosy byly ú innépouze v nejvyšších použitých koncentracích. Ostatní látky nem ly výrazný inhibi ní ú inek. N které látky (MK C16:1 a její estery) r st plísn podporovaly. V obnoveném mléce byl ú inek použitých látek vyrovnaný a hodnoty inhibice se pohybovaly mezi 20 – 30 %.

Literatura:1. Bergsson G., Arnfinnsson J., Steingrímsson Ó., Thormar H.: In vitro killing of Candida

albicans by fatty acids and monoglycerides, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45, 3209 – 3212 (2001).

2. Kabara J. J., v knize Antimikrobial in Food (Branen A. R., Davidson P. M., Eds.), Marcel Dekker, New York 1993.

3. Avis T. J., Bélanger R. R.: Specificity and mode of action of the antifungal fatty acid cis-9-heptadecenoic acid produced by Pseudozyma flocculosa, Apllied and Environmental Microbiology 67 (2001).

4. Šilhánková L.: Mikrobiologie pro potraviná e a biotechnology. Victoria Publishing, Praha 1995.

5. Gray S. N., Robinson P., Wilding N., Markham P.: Effect of oleic acid on vegetative growth of the aphid-pathogenic fungus Erynia neoaphidis, FEMS Microbiology Letters 68 (1990).

Kontaktní adresa:Ing. Tereza Karlová, Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT v Praze,Technická 5, 166 28, Praha 6; [email protected]

259

MIKROBIOLOGICKÉ A REOLOGICKÉ VLASTNOSTI VYBRANÝCH PROBIOTICKÝCH SÓJOVÝCH VÝROBK

Dvo áková Eva, Dvo ák Milan, Loužecký Tomáš, Pavlasová Marcela, Chumchalová Jana, Št tina Ji í

Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko-technologická v Praze

Microbial and rheological properties of probiotic soy products

Summary:In this study fifteen foreign fermented soy products mostly with probiotic culture were investigated. These fermented soy products were produced by seven companies. The aim of the research was to analyze the characteristics of the products (counts of LAB - Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus and Steptococcus thermophilus, titratable acidity and active acidity). Five products without flavouring were evaluated by rheological properties. The products were fermented below pH 4,5 and their titrable acidities ranged from 48,2 mmol·l-1to 79,4 mmol·l-1. At the end of the expiration date, fifty percents of the products were declared as „probiotic quality” and reached therapeutic minimum 106 CFU·g-1. The highest total counts of probiotic microorganisms were detected in products of both (commercial) companies SOJADE and BONNETERRE. The highest viscosity and thixotropy were detected in products PROVAMEL natural and CHAMPION natural.

ÚvodPom r probiotických sójových výrobk k neprobiotickým je na francouzském trhu vyšší

v porovnání s tuzemským trhem [1]. Jako probiotická kultura se nej ast ji používá ABT kultura (sm s bakterií – rod Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus a Steptococcus thermophilus). Sójové nápoje a média mají vhodné p edpoklady pro r st probiotických kultur díky svému prebiotickému charakteru [2].

Krom asto se vyskytujících vysokých po t bakterií mlé ného kvašení v sójových fermentovaných výrobcích [3], jsou pro konzumenta d ležité i reologické vlastnosti koagulátu – nap . dobrá rozmíchatelnost, minimální uvol ování sójové syrovátky a vhodná viskozita.

Uvedené vlastnosti zvyšují prodejnost výrobk , proto ada výrobc využívá na úpravu textury p ídavk hydrokoloidních látek zejména rostlinného p vodu (pektin, agar, karob, guarová guma, karagenany a modifikované škroby).

Materiál a metody:

Analyzované vzorky fermentovaných sójových výrobk (viz Tabulka I a II) byly zakoupeny ve Francii v prodejnách racionální výživy a v supermarketu Champion. Výrobky byly skladovány p i teplot 6 – 8 °C do data spot eby a následn analyzovány. U jednotlivých produktbyla stanovena aktivní a titra ní kyselost, po ty vybraných bakterií mlé ného kvašení a reologické vlastnosti výrobku.

Reologické vlastnosti vybraných vzork bez p íchuti byly m eny na reometru RheoStress RS 80 (HAAKE, N mecko) v uspo ádání kužel – deska (C60/4, pr m r 60 mm s úhlem 4°) p iteplot 10 °C. Vzorek byl p ed nanesením vždy normalizovan rozmíchán. Po temperaci byla m ena závislost viskozity na ase p i konstantní smykové rychlosti 10 s-1 resp. 100 s-1 v asovémrozp tí 600 s resp 300 s. Dále byl proveden OSC CD frequency sweep test s amplitudou deformace 0,01 a frekvencí 0,1 – 100 Hz. Pro ú ely srovnání byly použity hodnoty komplexního modulu púružnosti ve smyku a fázového posunu p i frekvenci oscilace 1 Hz.

Aktivní kyselost byla stanovena za pomocí pH metru se sklen nou kombinovanou elektrodou p i pokojové teplot .

Titra ní kyselost byla stanovena titrací 25,0 g (± 0,1 g) vzorku s p ídavkem 1 ml fenoftaleinu (2%) do pH 8,3 roztokem NaOH (0,1 M) [4].

260

Stanovení po tu mikroorganism . Po ty rodu Bifidobacterium (bifidobakterie) byly stanoveny na p d MRS pH 6,8 s L-cysteinem a dicloxacillinem p i teplot 37 °C, anaerobn 3 dny [5]; Lactobacillus acidophilus (acidofily) na p d MNA p i teplot 37 °C, anaerobn 7 dní [6]; S. thermophilus (streptokoky) na p d M17 p i teplot 42 °C, aerobn 1 den.

Tabulka I Zakoupené sójové fermentované výrobky pro rozbor bez ovocného komponentu

Zkratka Název Složení Nutri ní složení Obsah

C1Champion

natural (Champion)

voda, sójový protein 6 %, sójový olej 2,4 %, modifikovaný tapiokový škrob, kultura

Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus,s l, vitamin E

209 kJ (50 kcal); bílkoviny 5,3 g; sacharidy 1,1 g; lipidy 2,7 g 100 g

D1 Sojade natural (Sojade)

sójový nápoj (voda, sója), kultura Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus


PProvamel

natural (Provamel)

voda, odslupkované sójové boby 9,4 %, tapiokový sirup, stabilizátory: pektin

a agar-agar, mo ská s l, korektor kyselosti: kyselina citronová, kultura Streptococcus thermophilus a Lactobacillus bulgaricus


S1 Sojasun natural (Sojasun)

sójový nápoj (voda, sója), fosfore nan vápenatý, kultura Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus, vitamin E


TBonneterre

natural (Bonneterre)

sójový nápoj (voda, sója 13 %), kultura Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus


Výsledky a diskuze:

Reologické vlastnosti Viskozita p i stálé smykové rychlosti - prokazateln nejvyšší po áte ní hodnoty

viskozity p i smykové rychlosti 10 s-1 a 100 s-1 (viz Obr. 1) byly nam eny u výrobku PROVAMEL natural, který obsahoval v porovnání s ostatními vzorky krom srovnatelného obsahu sójových bílkovin navíc stabilizátor: pektin a agar-agar. Dále následovaly t i vzorky – CHAMPION natural s nejvyšším obsahem bílkovin a p ídavkem stabilizátoru: modifikovaného tapiokového škrobu, SOJADE natural a BONNETERRE natural, u kterých byly rozdíly viskozit na po átku m ení nevýznamné. Nejmenší viskozity jak p i smykové rychlosti 10 s-1 tak 100 s-1 vykazoval výrobek SOJASUN natural.

Nejv tší diference mezi po áte ní a kone nou viskozitou, která charakterizuje míru tixotropie vzorku, byla nam ena u výrobk PROVAMEL natural a CHAMPION natural. Zatímco p i smykové rychlosti 10 s-1 byly jejich diference srovnatelné, u smykové rychlosti 100 s-1 byl pozorován výrazn vyšší rozdíl u produktu CHAMPION natural. Odlišné reologické chování vzorku CHAMPION natural od ostatních by mohlo nazna ovat rozdíl p i výrob média, který je i patrný z neobvyklého složení (sójové boby jsou zde nahrazeny sójovým proteinem a sójovým olejem).

OSC CD frequency sweep test – z tohoto testu je možné pomocí nam ených hodnot komplexního modul pružnosti, resp. ztrátového a pam ového modulu, posoudit tuhost vzorku, resp. její elastickou viskozitní složku. Úhel fázového posunu pak vyjad uje pom r elastického a viskózitního chování. V p ípad zkoumaných výrobk se hodnoty úhlu fázového posunu p i frekvenci oscilace 1 Hz pohybovaly v pom rn úzkém intervalu od 24,4° (SOJASUN natural) do 27,8° (PROVAMEL natural). Z nam ených úhl fázového posunu je patrné, že vzorek SOJASUN natural má v porovnání s ostatními vzorky nejvíce zastoupenou elastickou složku a vzorek PROVAMEL natural viskozitní složku.

261

Obr. 1. Hodnoty viskozity p i smykové rychlosti 10 s-1 a 100 s-1 u vybraných výrobk bez p íchuti

Aktivní a titra ní kyselost Všechny zkoumané výrobky m ly hodnotu pH od 4,0-4,5 (viz Tabulka II), to znamená

stejné nebo nižší než je pH isoelektrického bodu hlavní frakce sójové bílkoviny – glycininu [7]. Titra ní kyselost byla vyšší u výrobk s ovocnou p íchutí s nízkým pH (Champion ovoce 79,4 mmol·kg-1). U výrobku Provamel natural byla vysoká hodnota zp sobena z ejm p ídavkem kyseliny citrónové. Titra ní kyselost u sójových fermentovaných výrobk je zpravidla oproti mlé ným nižší, jedním z d vod je i nižší produkce kyselin v médiích na bázi sóji.

Tabulka II Hodnoty aktivní a titra ní kyselosti, stanovené po ty bifidobakterií, acidofil a streptokokna konci doby spot eby u zkoumaných výrobk .

Zkratka Název Hodnota pH [-]

Titra níkyselost

[mmol/kg]

Bifidobakterie[JTK/g]

Acidofily [JTK/g]

Streptokoky [JTK/g]

B BIOCHAMPS jedlé kaštany 4,1 73,6 3,3×104 - 4,1×108

C1 CHAMPION natural 4,3 48,2 3,1×106 1,7×105 3,3×108

C2 CHAMPION ervené ovoce 4,1 79,4 8,4×105 1,2×105 2,0×108

D1 SOJADE natural 4,4 52,1 1,7×107 «103 2,8×108

D2 SOJADE pomeran , citron 4,1 68,6 1,6×106 «103 5,5×105

D3 SOJADE ervené ovoce 4,1 63,0 3,6×106 «103 2,2×105

N1 DANONE ananas 4,3 69,3 - - 7,5×106

N2 DANONE t eše , malina 4,3 65,1 - - 1,5×107

P PROVAMEL natural 4,0 72,6 - - 5,9×108

S1 SOJASUN natural 4,5 51,3 3,1×107 4,7×104 6,5×108

S2 SOJASUN mango, citron 4,3 67,9 4,9×103 «103 4,4×108

S3 SOJASUN meru ka 4,3 67,3 «103 «103 1,1×108

S4 SOJASUN cereálie s ovocem 4,3 65,3 2,0×104 «103 9,2×107

S5 SOJASUN sušená švestka 4,3 64,9 7,3 × 105 1,5×104 1,7×108

T BONNETERRE natural 4,5 51,5 1,6×107 «103 2,9×108

Poznámka: «103 mén než 103 JTK/g - tato skupina mikroorganism nebyla deklarována

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00 [P

a.s]

Provamel(P)

Bonneterre(T)

Champion(C1)

Sojasun(S1)

Sojade (D1)

po áte ní rozdíl po áte ní a kone né

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

[Pa.

s]

Provamel(P)

Bonneterre(T)

Champion(C1)

Sojasun(S1)

Sojade(D1)

po áte ní rozdíl po áte ní a kone né

262

Po ty mikroorganismT i z 15 výrobk nem ly probiotický charakter. Jednalo se o dva výrobky firmy DANONE

(ananas a t eše , malina), u kterých byla deklarována p ítomnost monokultury - Steptococcus vegetalis, a výrobek firmy PROVAMEL natural, který byl kultivován jogurtovou kulturou.

U ochucených výrobk SOJASUN bylo možno v porovnání s produktem SOJASUN natural pozorovat vliv jednotlivých ovocných komponent na po ty bakterií mlé ného kvašení na konci skladování. Nejnižší po ty byly pozorována u výrobku SOJASUN meru ka (viz Tabulka II).

Nejvíce probiotické kultury bylo nalezeno ve výrobcích firmy SOJADE a BONNETERRE (více než 106 JTK·g-1).

Záv r:Reologii sójových výrobk ovliv ují výrazn hydrokoloidní látky – pektin a agar; a zp sob

p ípravy sójového média. Z nam ených dat vyplývá, že sójové médium je vhodné pro probiotické kultury, zvlášt

pro bifidobakterie.Legislativa nedostate n specifikuje po ty probiotické kultury v sójových fermentovaných

výrobcích, tudíž všechny výrobky spl ují legislativní požadavky.

Pod kování:Práce byla podpo ena vnit ním grantem VŠCHT Praha . FIS 322/08/0016 a výzkumným zám remCEZ: MSM 6046137305.

Použitá literatura:1. Dvo ák, M.: Jogurty na bázi sóji s probiotickou mikrofórou. Diplomová práce, Ústav

technologie mléka a tuk , VŠCHT, Praha (2005). 2. Gomes, A. M. P., Marcata, F. X.: Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus:

biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics. Trends in Food Science & Technology 10, 139-157 (1999).

3. Š chová, E.: Fermentované sójové výrobky s probiotickou mikrofórou. Diplomová práce, Ústav technologie mléka a tuk , VŠCHT, Praha (2006).

4. SN 570530 Metody zkoušení mléka a tekutin mlé ných výrobk . eský normaliza ní institut, Praha (1995).

5. Sozzi, T., Brigidi, P., Mignot, O., Matteuzzi, O. (1990). Use of dicloxacillin for the isolation and counting of Bifidobacterium from dairy products. Lait, 70, 357-361.

6. Lankaputhra, W.E., Shah N.P.: A simple method for selective enumeration of Lactobacillusacidophilus in yoghurt supplemented with L. acidophilus and Bifidobacterium sp. Milchwissenschaft 51, 446-451 (1996).

7. Garroa, M. S., de Valdeza, G. F., de Gloria, G. S.: Temperature effect on the biological activity of Bifidobacterium longum CRL 849 and Lactobacillus fermentum CRL 251 in pure and mixed cultures grown in soymilk, Food Microbiology 21, 511-518 (2004).

Kontaktní adresa:Eva Dvo áková ([email protected]), Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko- technologická v Praze, Technická 5, 16628 Praha 6.

263

P ÍPRAVA GALAKTOOLIGOSACHARID A JEJICH APLIKACE DO MLÉ NÝCH A SÓJOVÝCH MÉDIÍ

Dvo ák Milan1, Dvo áková Eva1, Hinková Andrea2, Chumchalová Jana1, urda Ladislav1,Hellerová Klára1, Loužecký Tomáš1, Pavlasová Marcela1

1Ústav technologie mléka a tuk , 2Ústav chemie a technologie sacharidVysoká škola chemicko-technologická v Praze

Preparation of galactooligosaccharides and their application into milk and soy media

Summary:The mixture of monosaccharides, disaccharides and the higher galactooligosaccharides (GOS) was produced during the transformation of lactose by use of -galactosidase. This reaction was used for production of GOS containing mixture of saccharides (MS) in which the following concentrations of components were estimated by use of HPAEC PAD: 11.0 % w/w glucose; 7.8 % w/w galactose; 8.6 % w/w lactose and 5.7% w/w GOS. MS was added in concentrations 0; 5; 10; 15; 20 % w/w to cow skim milk and soy milk inoculated with two different amounts of Bifidobacterium BB12. The effect of MS addition on the growth and acidification activity of Bifidobacterium BB12 was tested. The growth of Bifidobacterium BB12 in aerobic conditions was generally better in soy than in cow milk. Addition of 5 and 10 % w/w MS possessed the stimulative effect on the growth of Bifidobacterium BB12in cow milk even in the case of lower inoculum of Bifidobacterium BB12. In the case of higher inoculum, the stimulative effect was not obvious. The addition of MS into the soy milk did not significantly influence the growth and acid production of Bifidobacterium BB12. Only a low decrease in GOS content after the fermentations in both types of media was detected.

ÚvodGalaktooligosacharidy (GOS) jsou nestravitelné složky potravy, jsou tém rezistentní v i

p sobení gastrointestinálních enzym a p echázejí do tlustého st eva, kde jsou využívány probiotickými kmeny bakterií (Bifidobacterium, Lactobacillus), které pozitivn ovliv ují zdraví lov ka. GOS p sobí preventivn proti vzniku rakoviny tlustého st eva, mají kladný vliv

na absorbci minerálních látek, snižují hladinu cholesterolu a ovliv ují metabolismus lipid [1].V posledním desetiletí je patrný zvýšený zájem o výrobky s probiotickou mikroflórou.

Mlé ná média jsou v porovnání se sójovými mén vhodná pro r st probiotických bakterií. Jednou z možností je aplikace zmín ných GOS p ipravených enzymatickou hydrolýzou substrátu transgalaktosyla ní aktivitou -galaktosidasy jako prebiotikum. Funk ním substrátem pro p ípravuGOS m že být laktosa nebo provozn výhodn jší sladká syrovátka [2]. Využívání syrovátky jako vedlejšího produktu a její aplikace do nových druh výrobk m že být pro potraviná ský pr mysl velmi atraktivní. Pro laboratorní aplikace a následné analýzy je vhodn jší využívat substrát definovaných parametr , kterým je laktosa.

Sójové fermentované výrobky na rozdíl od mlé ných výrobk obsahují tzv. sójové oligosacharidy (rafinosa, stachyosa). P ídavek GOS jako další prebiotické složky m že ovlivnit množství probiotické kultury ve výrobcích.

Metodika

P íprava galaktooligosacharid enzymatickou hydrolýzou Pro p ípravu GOS byla použita laktosa. V pr b hu m ení bylo p ipraveno n kolik šarží

obsahujících GOS, z nichž pro pokusy byly vybrány šarže G a H. Pro p ípravu šarže H bylo použito 200 g laktosy rozpušt né v 800 g roztoku pufru (0,01M K2HPO4.3 H2O; 0,015M KCl a 0,012M MgCl2.6H2O). Po úprav pH na hodnotu 6,75 kyselinou citrónovou o koncentraci 30% hm. a temperaci na 37 °C byl p idán enzymový preparát Maxilact LX 5000 v koncentraci 1 g/l. Enzymová reakce probíhala p i 37 °C po dobu 30 min. Následn byla ukon ena inaktivací enzymu tepelným záh evem v UHT jednotce (95 °C, pr tok 20 l/h, p = 0,5 bar). Tepeln ošet ený produkt byl následn z ed n demineralizovanou vodou 1 : 1 a p efiltrován p es ultrafiltra ní jednotku k odstran ní denaturovaného enzymu. Rozdíl v p íprav šarže G byl v množství použité laktosy

264

(300 g) rozpušt né v 700 g pufru, v množství p idaného enzymového preparátu (2 g/l) a ve zp sobuinaktivace enzymu (vsádkov , 95 °C, 10 min). Vzhledem k malému objemu této šarže nebyl produkt p e išt n ultrafiltrací.

P íprava média s p ídavkem galaktooligosacharid (GOS) a jejich fermentace K fermentaci byla použita dv média - obnovené odst ed né mléko od firmy PML a.s., R

(dále jen zkratka M) a sójový nápoj Klasik od firmy Sunfood, R (dále jen zkratka S). Po jejich sterilaci (100 °C, 20 min) byl do obou médií steriln p idán roztok GOS v množství 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % hm. Vzniklé kombinace byly zao kovány probiotickou kulturou BifidobacteriumBB12 tak, aby na po átku fermentace byly v médiích po ty v ádu 106 JTK/g resp. 1010 JTK/g. Fermentace probíhala p i 37 °C aerobn a byla ukon ena v prvním p ípad po 12, 20, 36 hod a ve druhém p ípad po 20 hod. V uvedených asech se stanovovaly po ty bifidobakterií, titra ní a aktivní kyselost.

P íprava vzork na HPLC pomocí Carrezových inidelNavážka 10 g vzorku byla vy e ena p ídavkem 3 ml Carrez I (vodný roztok Zn(OAc)2 -

5,5 g ve 100 ml destilované vody) a 3 ml Carrez II (vodný roztok K4Fe(CN)6 – 2,7 g na 100 ml destilované vody) s následným odst ed ním (Hettich Universal 320R, Hettich, SRN). Kv liodstran ní tukové ásti bylo nutno vzorek vytemperovat na teplotu 4 °C. Odst ed ní probíhalo p i stejné teplot po dobu 30 minut, p i otá kách 4000 rpm. Následn byl supernatant kvantitativnp eveden do odm rné ba ky (50 ml) a dopln n destilovanou vodou. Vhodné ed ní pro stanovení sacharidu na HPLC bylo provád no ultra istou vodou (Millipore, Francie). Na ed ný vzorek byl p efiltrován p es mikrofiltr 20 m (Millipore, Francie).

Stanovení sacharid pomocí HPLC Pro analýzu sacharid byla použita vysokoú inná chromatografie s kolonou Nucleosil

1000-7-NH2 (250×4 mm) s LSD detektorem, který umož uje gradientovou eluci. Detektor byl nastaven na citlivost 500 mV a teplotu 55 °C, teplota kolony 40 °C, pr tok 1 ml·min-1. Eluce byla nejd íve zvolena isokratická s mobilní fází acetonitril - voda (70:30). Dále pak byly provedeny gradientové eluce s r znými pom ry acetonitrilu (60 - 99 %). Jako vn jší standardy byly použity: fruktosa, galaktosa, glukosa, sacharosa, maltosa, rafinosa, verbaskosa, stachyosa a maltotriosa. Objem nást iku vzorku byl standardn 10 l.

Stanovení po tu mikroorganismPo ty rodu Bifidobacterium (bifidobakterie) byly stanoveny na p d MRS pH 6,8

s L-cysteinem a dicloxacillinem p i teplot 37 °C, anaerobn 3 dny. Po et mikroorganism N p ítomných ve zkoumaném vzorku byl spo ten jako vážený pr m r dvou po sob následujících ed ní v 1 g vzorku [3,4]. U stanovení po tu bakterií byly za azeny do výpo tu všechny plotny

s koloniemi od po tu 10 až do 300 JTK/g.

dnnC

N)1,0( 21

, kde:

C sou et kolonií na všech plotnách použitých pro výpo et;n1 po et ploten použitých pro výpo et z prvního zvoleného ed ní;n2 po et ploten použitých pro výpo et z druhého zvoleného ed ní;d ed ní odpovídající pro první zvolené ed ní.

Stanovení aktivní a titra ní kyselosti Aktivní kyselost byla stanovena pomocí pH metru se sklen nou kombinovanou elektrodou

p i pokojové teplot . Titra ní kyselost byla stanovena titrací 25,0 g (± 0,1 g) vzorku s p ídavkem 1 ml fenolftaleinu (2%) do pH 8,3 roztokem 0,1 M NaOH [5].

265

Stanovení sušiny Vzorek byl sušen na p ístroji METTLER p i teplot sušení 125 °C do konstantní

hmotnosti.

Výsledky a diskuse

Byla vybrána 2 základní média, která se používala pro kultivaci probiotické kultury – mlé né medium (obnovené odst ed né mléko) a sójové medium (sójový nápoj Klasik SUNFOOD). U obou médií (tepeln ošet ené 100 °C, 20 min) byla stanovena sušina a sacharidy (viz Tabulka I).

Tabulka I Stanovení obsahu sacharid a sušiny v tepeln ošet eném mlé ném a sójovém médiu

Název sacharid Mlé né médium (M) [g/100g vzorku]

Sójové médium (S) [g/100g vzorku]

Galaktosa 0,03 0,00 Glukosa 0,01 2,50 Fruktosa 0,00 0,08 Sacharosa 0,00 0,60 Laktosa 4,11 0,02 Rafinosa 0,00 0,04 Stachyosa 0,00 0,32 Maltosa 0,00 0,29 Verbaskosa 0,00 0,01 GOS* 0,08 0,00 Celkem sacharid 4,24 3,86 Sušina 9,40% 13,80%

Poznámka: * GOS a neidentifikované sacharidy

Tabulka II Stanovení obsahu sacharid a sušiny v tepeln ošet ené sm si p ipravených GOS (šarže G a H)

Název sacharidSm s GOS (šarže G)

[g/100g vzorku]

Sm s GOS (šarže H)

[g/100g vzorku]

Sm s GOS (šarže G)

[%]

Sm s GOS (šarže H)

[%] Galaktosa 7,84 1,77 22,8 16,9 Glukosa 11,87 2,41 34,4 23,0 Fruktosa 0,06 0,00 0,2 0,0 Sacharosa 0,00 0,00 0,0 0,0 Laktosa 8,62 4,92 25,0 46,9 Rafinosa 0,36 0,05 1,0 0,4 Stachyosa 0,00 0,00 0,0 0,0 Maltosa 0,00 0,00 0,0 0,0 Verbaskosa 0,00 0,00 0,0 0,0 GOS* 5,71 1,35 16,6 12,9 Celkem sacharid 34,46 10,49 100,0 100,0 Sušina 35,66% 10,60% - - Poznámka: * GOS a neidentifikované sacharidy

266

Hodnocení p ipravených šarží GOS Z p ipravených sm sí GOS byly k dalším analýzám použity dv základní šarže G a H

(viz Tabulka II). Šarže G obsahovala 34,46 % sacharid , z toho 5,71 % GOS. U šarže H bylo celkem 10,49 % sacharid a z toho 1,35 % GOS. Z výsledk vyplývá, že šarže G byla více než t ikrát koncentrovan jší a tudíž byla vhodn jší pro p ípravu fermenta ních sm sí.

Výb r probiotické kultury a její kultivace v mlé ném a sójovém médiu Je známo, že rod Bifidobacterium je obecn anaerobní. N které kmeny tohoto rodu jsou

tolerantn jší ke kyslíku, což je z provozního hlediska výhodn jší [6], proto pro pokusy byl použit kmen Bifidobacterium BB 12.

Kultivace Bifidobacterium BB12 s po áte ním inokulem v ádu 106 JTK/gV tšina sójových médií na rozdíl od mlé ných dosahovala ádu 108 JTK/g již po 12 hod

(viz Obrázek 1). Vzorky mlé ného média s p ídavkem 0 %, 15 % a 20 % nebyly ádn prokysány ani po 20 hodinách a hodnota aktivní kyselosti byla nad pH 5,4, proto byla kultivace prodloužena na 36 h. Nejvyšších hodnot titra ní kyselosti dosáhl vzorek sójového média s p ídavkem 10 % sm si GOS (68,7 mmol/kg), u mlé ných s 5 % sm si GOS (66,0 mmol/kg) (viz Tabulka III).

Kultivace Bifidobacterium BB12 s po áte ním inokulem v ádu 1010 JTK/g a sledování zm nysložení sacharid po fermentaci

P i využití inokula 1010 JTK/g došlo ke koagulaci po 20 hodinách u všech médií (mlé nýchi sójových). Hodnoty titra ní kyselosti se pohybovaly u všech médií kolem 80 - 90 mmol/kg, po tybifidobakterií v ádu 108 JTK/g (viz Tabulka IV).

1,0E+001,0E+011,0E+021,0E+031,0E+041,0E+051,0E+061,0E+071,0E+081,0E+091,0E+10

poty

[JTK

/g]

M_0% M_5% M_10% M_15% M_20%

mlé ná média s % p ídavkem GOS (G)

12 hod 20 hod 36 hod

1,0E+001,0E+011,0E+021,0E+031,0E+041,0E+051,0E+061,0E+071,0E+081,0E+09

poty

[JTK

/g]

S_0% S_5% S_10% S_15% S_20%

sójová média s % p ídavkem GOS (G)

12 hod 20 hod

Obrázek 1 - Celkové po ty kultury Bifidobacterium BB12 v pr b hu kultivace p i teplot 37 °C, aerobn v sójových médiích (vlevo; 12 a 20 hod) a mlé ných médiích (vpravo; 12, 20 a 36 hod) s p ídavkem s p ídavkem 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % sm si GOS (G)

U sójových médií se množství sacharid po fermentaci snížilo v pr m ru o 20 %, u mlé ných pouze o 10 %, nejmén u mlé ného média s 0 % p ídavkem GOS. Galaktooligosacharidy významn ovliv ovaly fermentaci obou médií vybranou probiotickou kulturou. Fermentace sójových oligosacharid byla v sójových médiích využita více, než u médií s nízkým nebo žádným p ídavkem GOS. Stanovené množství sacharid po zmín né fermentaci je uvedeno níže (viz Tabulka V).

267

Tabulka III Hodnoty aktivní a titra ní kyselosti po 12 a 20 hod kultivaci kultury Bifidobacterium BB12 p iteplot 37 °C aerobn – v mlé ných (M) a sójových médiích (S) s p ídavkem 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % sm si GOS (G)

pH [-] titra ní kyselost [mmol/kg] Médium

12 hod 20 hod 12 hod 20 hod

M_0% 6,5 6,5 17,3 17,7

M_5% 6,5 4,7 17,5 66

M_10% 6,5 4,9 17,5 60,4

M_15% 6,5 5,4 17,6 34,8

M_20% 6,4 5,8 17,8 25,5

S_0% 5,8 5,1 24,3 42,1

S_5% 5,5 4,6 32,3 59,7

S_10% 5,6 4,5 29,4 68,7

S_15% 5,5 4,6 29,8 62,4

S_20% 5,5 4,6 28,2 60,1

Tabulka IV Spot eba GOS (galaktooligosacharid ), SOS (sójových oligosacharid ) a celková spot ebasacharid b hem fermentace, dosažené po ty Bifidobacterium BB12 a hodnoty titra ní a aktivní kyselosti po 20 hod fermentace p i 37 °C, aerobn – fermentace mlé ného (M) a sójového (S) média s p ídavkem 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % sm si GOS (G)

Spot eba sacharid b hemfermetance

Vzorek GOS* SOS Celkem

Po tybifidobakterií

[JTK/g]

Titra níkyselost

[mmol/kg] pH [-]

M_0% -49,6% - -3,3% 2,9x108 79 4,6

M_5% -26,2% - -4,3% 1,3x108 88,8 4,5

M_10% -33,7% - -15,1% 1,2x108 83,3 4,6

M_15% -30,9% - -8,7% 1,0x108 86,9 4,5

M_20% -28,7% - -7,4% 7,1x107 80,5 4,5

S_0% 0,0% -9,7% -24,6% 2,4x108 84,5 4,3

S_5% -43,9% -8,7% -22,4% 2,2x108 84,9 4,4

S_10% -43,6% -5,4% -23,4% 4,3x108 86,1 4,3

S_15% -43,0% -4,1% -19,9% 5,8x108 82,9 4,4

S_20% -43,0% -0,1% -18,7% 2,2x108 79,4 4,4

268

Tabulka V Množství sacharid po fermentaci mlé ného (M) a sójového (S) média s p ídavkem 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % sm si GOS (G), sušiny vzork

Množství sacharid v g na 100 g vzorku Vzorek Galaktosa Glukosa Fruktosa Sacharosa Laktosa Rafinosa Stachyosa Maltosa Verbaskosa GOS* Celkem

Sušina[%]

M_0% 0,15 0,03 0,00 0,00 3,88 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 4,10 9,30 M_5% 0,43 0,25 0,03 0,12 4,39 0,02 0,00 0,00 0,00 0,27 5,51 10,20 M_10% 0,67 0,61 0,02 0,22 4,19 0,04 0,00 0,00 0,00 0,43 6,17 11,40 M_15% 1,04 1,14 0,02 0,36 4,74 0,06 0,00 0,01 0,00 0,64 8,01 12,60

M_20% 1,37 1,64 0,03 0,49 5,04 0,08 0,00 0,02 0,00 0,86 9,52 14,00

S_0% 0,00 1,88 0,10 0,30 0,01 0,04 0,29 0,28 0,01 0,00 2,91 13,60 S_5% 0,23 2,29 0,11 0,46 0,32 0,06 0,28 0,26 0,00 0,16 4,18 14,20 S_10% 0,52 2,52 0,11 0,57 0,65 0,08 0,27 0,25 0,01 0,32 5,30 15,30 S_15% 0,86 3,01 0,10 0,70 1,02 0,09 0,27 0,23 0,00 0,49 6,77 16,50

S_20% 1,22 3,35 0,10 0,81 1,38 0,11 0,26 0,23 0,00 0,65 8,12 17,70

G 7,84 11,87 0,06 0,00 8,62 0,36 0,00 0,00 0,00 5,71 34,46 35,70 M 0,03 0,01 0,00 0,00 4,11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,08 4,24 9,40

S 0 2,5 0,08 0,6 0,02 0,04 0,32 0,29 0,01 0 3,86 13,9

Záv rKmen Bifidobacterium BB12 je velmi vhodný pro provozní využití - fermentuje sójová i mlé ná média za aerobních podmínek.Bifidobacterium BB12 v sójových médiích roste dob e i bez p ídavku GOS, p ídavek mírnpodporuje r st.Kultivace Bifidobacterium BB12 v kravském mléce je obtížná, avšak p ídavek 5 % a 10 % sm si GOS významn ovliv uje fermentaci. Po 20 hodinách kultivace s inokulem v ádu108 JTK/g dochází ke koagulaci. Médium bez p ídavk GOS nebo s vyššími p ídavkydo 20 hod nekoaguluje. Mlé ná i sójová média mohou zkoagulovat do 20 hod od za átku fermentace v p ípad použití inokula v ádu 1010 JTK/g.

Pod kování:Práce byla podpo ena vnit ním grantem VŠCHT Praha . FIS 322/08/0016 a výzkumným zám remCEZ: MSM 6046137305.

Použitá literatura:1. Crittende RG, Playne MJ.: Production, properties and application of food-grade

oligosaccharides. Trends in Food Science and Technology 7: 353-361 (1996). 2. Mahoney RR.: Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis. Food Chemistry

63: 147-154 (1998). 3. SN ISO 7218 (56 0103) Mikrobiologie potravin a krmiv – Všeobecné pokyny pro

mikrobiologické zkoušení. eský normaliza ní institut, Praha (1998). 4. SN ISO 8261 (56 0111) Mléko a mlé né výrobky – P íprava analytických vzork a ed ní pro

mikrobiologické zkoušení. eský normaliza ní institut, Praha (1995). 5. SN 570530 Metody zkoušení mléka a tekutin mlé ných výrobk . eský normaliza ní institut,

Praha (1995).

Kontaktní adresa:Milan Dvo ák ([email protected]),Ústav technologie mléka a tuk , Vysoká škola chemicko- technologická v Praze, Technická 5, 16628 Praha 6.

LABTECH PRAHA spol. s r.o.Kováků 26

150 00 Praha 5tel. 257328175, 606737749 fax 257323278

[email protected]

Analytické přístroje ALLIANCE INSTRUMENTS pro potravináře( především pro mlékárenský průmysl )

OPTIGRAPH - sledování časového vývoje koagulacemléka prostřednictvím měření transmitance NIR signálusoučasně v deseti vzorcích mléka. Důležité informacepro optimalizaci výrobního procesu sýrů (doba koagulace,vývoj tuhosti ).

CINAC - současné sledování až 32hodnot ( teplota, pH, vodivost, redox)charakterizujících průběh acidifikace připrocesech v mlékárenském průmyslu.

INFRASCAN - NIR spektrofotometr proširoké použití v potravinářském průmyslunapř. měření vlhkosti, obsahu tuků, proteinů atd.

FUTURA - kontinuální průtokový analyzátor(CFA) vhodný v potravinářství např. proanalýzu dusičnanů, dusitanů, močoviny atd.

eská

repu

blik

aM

ERA

K, sp

ol. s

r.o.

Pod

náse

pní1

d60

2 00

Brn

oTe

l.: 5

48 2

10 7

77Fa

x: 5

48 2

10 6

66e-

mai

l:of

fice@

mer

ak.c

zw

ww

.mer

ak.c

z

Slov

ensk

oM

ERA

K, sp

ol. s

r.o.

Bá12

693

0 30

Bá

Tel.:

031

/550

1171

Fax:

031

/550

1172

e-m

ail:

offic

e@m

erak

.skw

ww

.mer

ak.sk

istíc

ía d

esin

fek

nípr

oste

dky

Nak

ládá

nís

chem

ický

mi p

ípra

vky

Dávk

ovac

ía m

ícít

echn

ika

Serv

is sa

nita

ního

za

ízení

GHP

+ H

AC

CP

CIP

sta

nice

Ekon

omik

a sa

nita

ce

Škol

eníp

erso

nálu

Hygi

enic

ký a

udit

Sani

taní

plán

y

Sani

taní

zaíze

ní

Prog

ram

sni

žová

níA

OX

Laboratorní, analytická a pr myslová technika

Elektrochemie ada p ístroju ORION Star Firma Thermo Fisher SCIENTIFIC ORION ELECTROCHEMISTRY PRODUCTS nabízí progresivní technologii v etn p íslušenství, unikátní strukturu pr vodce menu a nejvyšší kvalitu m ení v etn IQ/OQ/PQ. Zabudovaný GLP systém zajiš uje analytickou integritu, metody m ení a kalibra ní data. Software STAR NAVIGATOR 21 zabezpe uje nam ená data, jejich archivaci, systém validace a kontrolu pr b hu zpracování dat.

M ení:

pH / mV / ORP / °C ISE iontov selektivní stanovení rozpušt ného kyslíku vodivosti, salinity a TDS

Jedno, dvou a multi parametrové m ící p ístroje v laboratorním nebo p enosném provedení v kombinaci s m ícími sondami a r zným p íslušenstvím ( pH, ISE elektrody, vodivostní a DO sondy, teplotní ATC idla, elektrolyty certifikované NIST pH pufry, standardy pro m ení Redox potenciálu, standardy pro m ení vodivosti, uchovávací a istící roztoky pro pH elektrody ) www.neotec.cz/orion

Speciální aplika ní sety pro stanovení:

pH v sýrech v mléce

chlorid v sýrech v mléce

vápníku v mléce

draslíku v mléce

vodivosti USP (645) ultra destilované vody

Laboratorní technika, pr myslová technologie IKALABORATORNÍ TECHNIKA:

t epa ky, topné lázn , termostaty magnetické mícha ky, homogenizátory extraktory, mlýnky, rota ní odparky laboratorní reaktory, míchací motory

VÝROBNÍ A POLOPROVOZNÍ ZA ÍZENÍ:

Disperga ní technologie – vsádková a kontinuální Míchací, sm šovací a homogeniza ní za ízení Hn ta e - kontinuální, vertikální a horizontální Kompletní emulga ní a míchací sestavy

NEOTEC, spol. s r.o. Jinonická 804/80 158 00 Praha 5

http: www.neotec.cz http: www.neotec.cz/orion e-mail: [email protected]

Tel: 257 289 511 Fax: 233 312 515 [email protected]

Specialisté v oboru molekulové spektroskopie

TThheerrmmooSScciieennttiiffiiccFFTTIIRR,, FFTTNNIIRR,, RRaammaann,, MMiiccrroossccooppyy

FT-NIR analyzátory potraviná ských výrobkStanovení b žných parametr potraviná ských výrobk za n kolik minut, bez destrukce vzorku a pot eby chemikálií.

Zakázkový vývoj metod, v etn automatizace stanovení, bezplatné p edvedení p ístroj s možností m ení vlastních vzork .

Servisní práce zdarma.

Kvalita spektrometr Nicolet ov ena více než 250 uživateli v R a SR.

Aplika ní, servisní a obchodní st edisko:

Nicolet CZ s.r.o. Nad Trnkovem 11 106 00 Praha 10

T/F: 272 760 432, 272 768 569

Mobil: 602325829, 603554788, 603725812

JAKdosáhnout lep‰ích v˘sledkÛ ve va‰em v˘zkumu a v˘voji?

Jak zv˘‰it konkurenceschopnost va‰í firmy?

Jste vûdeck˘ pracovník a hledáte nové moÏnosti v˘zkumné spolupráce?�

Jste spoleãnost, která vyvinula zajímavou technologii a hledá moÏnosti jejího uplatnûní na zahraniãních trzích?

�Nebo naopak urãité technologické fie‰ení hledáte?

VyuÏijte sluÏeb TECHNOLOGICKÉHO CENTRA AV âR jako jedné z moÏnostíjak získat partnera pro v˘zkum nebo v˘vojjak získat zájemce o zakoupení va‰í inovaãní technologiejak získat inovaãní technologie pro zv˘‰ení va‰í konkurenceschopnostijak si nechat ocenit va‰i technologii nebo získat pomoc pfii sjednávání

a uzavírání licenãních smluv jak se zúãastnit mezinárodních technologick˘ch burzjak získat nové poznatky z oblasti inovací v rámci ‰kolení

Kontakty pro spolupráci a nabídky, resp. poptávky po technologiích si po registraci mÛÏete vyhledat nebo zadat sami na:

www.circ.cz/hledate-technologii/

nebo nás mÛÏete kontaktovat:Potraviny: Jaroslav Lorenz, tel.: 234 006 139, 724 247 076, www.circ.cz

Biotechnologie: Radka Hávová, tel.: 234 006 138, 724 331 015, www.circ.czProgramy ‰kolení: www.cett.cz

nebo pfiímo Barbora MachoÀová, [email protected], tel.: 234 006 156

CHCETEse zapojit do mezinárodních v˘zkumn˘ch programÛ EU?

7. rámcov˘ program EU pro v˘zkum, technologick˘ rozvoj a demonstrace 2007 – 2013 pfiiná‰í fiadu pfiíleÏitostí jak pro v˘zkumné organizace a univerzity, tak i pro prÛmyslové podniky jak získat finanãní pfiíspûvek na v˘zkumné a v˘vojové aktivity v fiadû oborÛ.

Informace o 7. rámcovém programu EU najdete na www.fp7.cz

Kontakt pro oblast Zemûdûlství, potraviny, biotechnologie v 7. rámcovém programu: Naìa Koníãková, [email protected], tel.: 234 006 109

www.tc.cz

100-TCAV-inzerat-defi-A 22.1.2007 14:32 Str. 1

CELOSTÁTNÍ P EHLÍDKY SÝR 2007

Výsledky p ehlídek a sborník p ednášek seminá e „Mléko a sýry“

Vydavatel: Vysoká škola chemicko technologická v Praze Technická 5, 166 28 Praha 6

Editor: Št tina J., urda L.

Tisk: KANAG – TISK, s.r.o. Technická 5, 166 28 Praha 6

Rok vydání: 2007

Po et stran: 282

ISBN 978-80-7080-661-6

Publikace neprošla jazykovou ani odbornou úpravou. Za obsah p ísp vk odpovídají auto i.

ISBN 978-80-7080-661-6

CELOSTÁTNÍ P EHLÍDKY SÝR - vscht.cz

Documents

Transcript of CELOSTÁTNÍ P EHLÍDKY SÝR - vscht.cz