1. AuspiciosArgenBio es el Consejo Argentino para la Informacin y Desarrollo de laBiotecnologa. Es una organizacin sin fines de lucro que tiene como misin divulgar Biotecnologainformacin sobre la biotecnologa, contribuyendo a su comprensin a travs de laeducacin y estimulando su desarrollo. y Mejoramiento Vegetal IIConsideramos prioritario el apoyo a iniciativas relacionadas con la biotecnologa ydirigidas a la comunidad educativa de todos los niveles. En este sentido, este libro Editores:cubre una necesidad importante ya que aporta informacin completa y actualizada Gabriela Levitus, Viviana Echenique,sobre las tecnologas de laboratorio que se aplican al mejoramiento vegetal, escrita Clara Rubinstein, Esteban Hopp y Luis Mroginskipor especialistas y en idioma espaol.Confiamos en que tanto estudiantes con profesionales encontrarn en este libro unaexcelente fuente de informacin. Consejo Argentino para la InformacinPara conocer ms sobre ArgenBio, visitar www.argenbio.org y el Desarrollo de la Biotecnologa Ediciones Instituto Nacional de INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGA AGROPECUARIA ARGENBIO - Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa Tecnologa Agropecuaria

2. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II Editores: Dra. Gabriela Levitus, Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Dr. Esteban Hopp Ing. Agr. Luis Mroginski. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 1

3. 2 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

4. ndicePrefacio ............................................................................................................................... 6Agradecimientos ................................................................................................................ 7Lista de Autores .................................................................................................................. 7Prlogo a la Primera Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ............................................. 11Prlogo a la Segunda Edicin. Dr. Francisco Garca Olmedo ........................................... 11Parte I: Herramientas Bsicas ........................................................................................... 15Captulo 1: Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. Luis Mroginski, Pedro Sansberroy Eduardo Flaschland . 17Captulo 2: Morfognesis. Silvia Radice ... 26Captulo 3: La citogentica molecular e inmunocitogentica en el estudio de los genomas ve-getales. Guillermo Seijo, Graciela I. Lavia, Germn Robledo, Aveliano Fernndez y Viviana G. SolsNeffa. .................................................................................................................................................. 34Captulo 4: Herramientas bsicas de ingeniera gentica. Ingrid Garbus, Marisa Gmez y Vi-viana Echenique. ................................................................................................................................ 47Captulo 5: Marcadores moleculares. Mara Carolina Martnez, Marcelo Helguera y Alicia Carrera. 70Captulo 6: Construccin de mapas de ligamiento gentico, localizacin de genes y regionescromosmicas asociadas a caracteres de inters en plantas. Gerardo D. L. Cervigni, Juan Pa-blo A. Ortiz y Sergio E. Feingold. ......................................................................................................... 86Captulo 7: Genmica. Viviana Echenique, Juan P. Selva, Mauro Meier, Pablo Roncallo y GustavoSchrauf. .............................................................................................................................................. 100Captulo 8: Transcriptmica. Silvina Pessino y Silvina Felitti. .......................................................... 121Captulo 9: Protemica. Paula Casati y Mara F. Drincovich ............................................................. 136Captulo 10: Metabolmica. Fernando Carrari, Telma E. Scarpeci, Luciano A. Abriata, Alejandro J.Vila y Estela M. Valle. ......................................................................................................................... 146Captulo 11: Metagenmica. O. Mario Aguilar y Daniel H. Grasso. ................................................... 157Captulo 12: Bioinformtica aplicada a la biotecnologa vegetal. Norma Paniego, Ruth Heinz,Paula Fernndez, Vernica Lia, Corina Fusari. ................................................................................... 170Parte II: Mtodos para generar y analizar diversidad 183Captulo 1: Polinizacin y fertilizacin in vitro. Susana Cardone, Gladys Prez Camargo y AuroraPicca. .................................................................................................................................................. 185Captulo 2: Hibridacin somtica. Pablo Polci y Pablo Friedrich. .................................................... 197 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 3

5. Captulo 3: Epigentica y evolucin. Ricardo W. Masuelli y Carlos F. Marfil .................................. 211Captulo 4. Mutagnesis, TILLING y EcoTILLING. Alberto Prina, Alejandra Landau, Mara GabrielaPacheco y Esteban Hopp ................................................................................................................... 217Captulo 5: Variacin somaclonal. Susana Cardone, Sofa Olmos y Viviana Echenique. ............... 229Captulo 6: Aplicacin de la transformacin gentica al mejoramiento vegetal. Marina L. Daz,Diego C. Zappacosta, Pascual M. Franzone y Ral D. Ros ............................................................... 243Captulo 7: Usos del silenciamiento gnico para el anlisis funcional de genes candidatos.Cecilia Vzquez Rovere, Ariel Bazzini, Cecilia Rodrguez, Natalia Almasia y Sebastin Asurmendi .. 259Captulo 8: Anlisis de experimentos biolgicos. Sofa Olmos, Miguel DiRenzo, Mercedes Ib-ez, Nlida Winzer .............................................................................................................................. 271Captulo 9: Mtodos multivariados para estimar variabilidad gentica. Nlida Winzer, MiguelDiRenzo, Sofa Olmos y Mercedes Ibez. ......................................................................................... 283Parte III: Mtodos para acelerar programas de mejoramiento e identificacin varietal 295Captulo 1: Obtencin de plantas doblehaploides. Pablo Polci, Vernica Conti y Rubn Miranday Nicols Gear. .................................................................................................................................... 297Captulo 2: Aplicaciones de los marcadores moleculares. Alicia Carrera, Gabriela Tranquilli, An-tonio Garayalde y Marcelo Helguera. .................................................................................................. 311Captulo 3: Marcadores moleculares y mejoramiento gentico de cultivos. Carlos Sala, Maria-no Bulos, Anala Fresco y Emiliano Altieri. .......................................................................................... 325Captulo 4: Identificacin y registro de variedades. Ana Laura Vicario, Marcelo Labarta y MaraAlicia Loray ......................................................................................................................................... 339Parte IV: Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasma 351Captulo 1: Micropropagacin. Sofa Olmos, Gabriela Luciani y Ernestina Galdeano .................... 353Captulo 2: Semilla sinttica. Hebe Rey y Luis Mroginski ................................................................. 363Captulo 3: Conservacin de germoplasma in vitro. Adriana Scocchi y Hebe Rey. ....................... 369Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnologa vegetal 377 Captulo 1: Aportes de la citogentica al estudio de genomas vegetales. Lidia Poggio, Gra-ciela Gonzlez, Mara Rosa Ferrari, Ana Mara Garca, Arturo Wulff, Eduardo Greizerstein, PabloTomas y Gustavo Schrauf. .................................................................................................................. 379Captulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genmica. Germn Spangenberg,Mauro Meier y Viviana Echenique ....................................................................................................... 389 Captulo 3: Caracterizacin molecular de la apomixis y su aplicacin en la agricultura. Silvi-na C. Pessino y Juan Pablo A. Ortiz .................................................................................................... 403Captulo 4: Avances de la biotecnologa en cultivos ornamentales. Alejandro S. Escandn, Pa-blo A. Marinangeli y Mariana Prez de la Torre. .................................................................................. 4214 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

6. Captulo 5: Aplicacin de la biotecnologa en la mejora y conservacin de especies forestales.Susana Marcucci Poltri, Leonardo Gallo, Noga Zelener, Susana Torales, Sandra Sharry .................... 435Captulo 6: Tcnicas de ingeniera gentica para conferir resistencia a virus en plantas. Maria-na del Vas, Ana Julia Distfano, Cecilia Vzquez-Rovere, Esteban H. Hopp. ..................................... 447Captulo 7: Obtencin de plantas resistentes a enfermedades bacterianas. Adrin Vojnov, Mer-cedes Rivero y Diego Zappacosta ....................................................................................................... 457Captulo 8: Aproximaciones biotecnolgicas para un manejo sustentable del estrs fngicoen la agricultura. Juan Carlos Daz Ricci; Ursula Tonello; Gustavo Martnez-Zamora; Sergio Sala-zar; Nadia Chalfoun; Gabriel Vellicce; Carlos Grellet; Paula Filippone; Alicia Mamani; Marta Ontiveroy Atilio Pedro Castagnaro. ................................................................................................................... 467Captulo 9: Utilizacin de cultivos de tejidos para la obtencin y conservacin de plantas li-bres de enfermedades. Vilma Conci. ................................................................................................ 481Captulo 10: Obtencin de plantas resistentes a insectos. Dalia Lewi y Clara Rubinstein ............... 495Captulo 11: Aplicaciones biotecnolgicas al manejo de malezas. Germn Ferrari y Julio E. De-lucchi. .................................................................................................................................................. 507Captulo 12: Obtencin de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abiticos. Florenciadel Viso, Andrea F. Puebla, Nstor Carrillo y Raquel L. Chan ............................................................. 519Captulo 13: Manipulacin gentica del metabolismo secundario en plantas. Alicia Zelada, Ma-ra Binaghi ........................................................................................................................................... 529Captulo 14: Mejoras de calidad en alimentos. Clara Rubinstein, Gabriela Levitus ............................. 539Captulo 15: Fitorremediacin. Mara Eugenia Segretn, Paula Bey y Alejandro Mentaberry ............. 545Captulo 16: Plantas como biorreactores. Fernando Bravo Almonacid, Sonia Wirth, Mara EugeniaSegretin, Mauro Morgenfeld, Ezequiel Matas Lentz. ......................................................................... 559Parte VI: Manejo responsable de la tecnologa 569Captulo 1: Criterios cientficos para la evaluacin de la bioseguridad de Organismos Genti-camente Modificados. Clara Rubinstein ........................................................................................... 571Captulo 2: Bioseguridad de Organismos Genticamente Modificados - Marcos Regulatorios.Moiss Burachik .................................................................................................................................. 583Captulo 3: Flujo gnico y su posible impacto ambiental. Mnica Poverene, Soledad Ureta yAgustina Gutirrez. ............................................................................................................................. 595Captulo 4: Deteccin de OGM en la cadena agroalimentaria. Florencia Longo y Ana Vicario. ....... 603Captulo 5: Manejo integrado de plagas Programa de Refugios. Viviana Confalonieri y CeciliaRoca. ................................................................................................................................................... 613Captulo 6: Resistencia de malezas a herbicidas: evolucin y estrategias de manejo. DanielTuesca, Luisa Nisensohn, Mario R. Sabbatini, Guillermo Chantre. ..................................................... 621Parte VII: Biotecnologa y sociedad 631Captulo 1: La transformacin tecnolgica y los nuevos desafos. Carmen Vicin. .......................... 633 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 5

7. Captulo 2: Adopcin de los cultivos genticamente modificados en Argentina y en el mun-do. Gabriela Levitus ......................................................................................................................... 639Captulo 3: Biotecnologa en la mira: el problema de la percepcin. Valeria Durand ............... 6436 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

8. PREFACIO En oportunidad de la Primera Edicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, nos habamospropuesto responder a la necesidad de un texto en idioma espaol, dirigido a docentes y estudian-tes de los cursos de Agronoma y de otras formaciones relacionadas con las tecnologas aplicadasal mejoramiento vegetal, as como brindar un recurso de informacin general y consulta para noespecialistas. Esta Segunda Edicin, intenta actualizar, profundizar y extender estas temticas,atendiendo a la rpida evolucin en este campo del conocimiento. En el contexto de los principios bsicos del mejoramiento, es decir, generar variabilidad genti-ca y seleccionar caractersticas deseables, las tecnologas evolucionan rpidamente y, del mismomodo, se acelera la transferencia del conocimiento bsico a las aplicaciones. Esta edicin intentareflejar este proceso dinmico y aportar informacin actualizada con ejemplos de aplicaciones almejoramiento de diferentes especies vegetales. En este trabajo se han reunido las contribuciones de investigadores y especialistas en diferentescampos relacionados con el mejoramiento. En las secciones dedicadas a las herramientas bsicas,se ha hecho foco en las tcnicas de cultivo de tejidos y micropropagacin que se utilizan en s mis-mas para generar variabilidad, conservar germoplasma, producir clones libres de enfermedades ocomo paso obligado en la construccin de plantas transgnicas. En la seccin que se ocupa de lasaplicaciones de estas tcnicas a casos especficos, se brindan ejemplos de mejoramiento logradoen diferentes especies. La tecnologas omicas (genmica, transcriptmica, metabolmica) constituyen una de las herra-mientas ms importantes en el mejoramiento, por la potencialidad que presentan, tanto en el campode la investigacin bsica, en el mapeo de genes y la identificacin de marcadores moleculares,como en la identificacin de funciones y redes regulatorias que influyen en las caractersticas que sedesean mejorar: resistencia a enfermedades y plagas, rendimiento, calidad nutricional y respuestasa diferentes tipos de estrs ambiental, entre otras. Es claro que dentro de las tecnologas de mejoramiento, la transgnesis o transformacin ge-ntica es una de las herramientas ms verstiles y poderosas, ya que permite resolver problemasque por va del mejoramiento convencional no sera posible enfrentar. En esta edicin se presentannumerosos ejemplos de transgnesis para la obtencin de cultivos tolerantes a estrs bitico yabitico, a plagas y enfermedades o con mejoras en su calidad nutricional. Desde 1996, cuando se cultivaron por primera vez, la superficie mundial de cultivos transgnicosaument 80 veces, alcanzando las 134 millones de hectreas en 2009. Segn el ltimo informe delISAAA (Servicio Internacional para las Adquisiciones Agrobiotecnolgicas) estas hectreas fueroncultivadas por 14 millones de agricultores de 25 pases, siendo Argentina uno de los lderes enadopcin, con el 16% del rea global. Por otro lado, es importante notar que se han establecido sistemas de control a nivel internacionalpara regular el desarrollo y la aplicacin de la ingeniera gentica al mejoramiento de organismosvivos (conocidos como organismos genticamente modificados u OGMs). Si bien stos no se limitana plantas, en este trabajo se presentan slo los aspectos regulatorios y de bioseguridad relaciona-dos con los cultivos transgnicos. Esperamos que esta nueva edicin constituya una herramienta til y accesible para docentes,estudiantes y profesionales que se dedican y se dedicarn a la noble tarea de mejorar la agricultura. Los Editores Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 7

9. AGRADECIMIENTOSA todos y cada uno de los 141 autores, en su mayora investigadores y profesionales de institu-ciones argentinas, que han contribuido con sus aportes.Al Dr. Francisco Garca Olmedo, reconocido investigador y catedrtico espaol, por regalarnostambin el prlogo de esta segunda edicin.Al Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa (ArgenBio), por aus-piciar la publicacin del libro.A los revisores, colegas y personal de apoyo, por sus valiosas contribuciones para concretar esteproyecto. Los EditoresEl uso de fuentes y nombres comerciales en este documento es slo para fines de identificaciny no implica ningn aval ni recomendacin. Adems, los contenidos u opiniones expresadas enesta publicacin son de exclusiva responsabilidad de los autores.LISTAS DE AUTORES (por orden alfabtico)Abriata Luciano A. Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarAguilar O. Mario IBBM, Facultad de Ciencias Exactas, UNLPAlmasia Natalia Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarAltieri Emiliano Nidera SemillasAsurmendi Sebastin Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarBazzini Ariel Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarBey Paula INGEBI, CONICETBinaghi Mara Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBABravo Almonacid Fernando INGEBI, CONICETBulos Mariano Nidera SemillasBurachik Moiss Dir. de Biotecnologa, Min. de Agricultura, Ganadera y PescaCardone Susana Facultad de Agronoma, UBACarrari Fernando Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarCarrera Alicia Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del SurCarrillo Nstor IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNRCasati Paula CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioCastagnaro Atilio Pedro EEAOC, TucumnCervigni Gerardo D. CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioChalfoun Nadia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumnChan Raquel L. Universidad Nacional del LitoralChantre Guillermo CERZOS, CONICET, Universidad del SurConci Vilma INTA IFFIVEConfalonieri Viviana Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA)Conti Vernica INTA-EEA Bordenavedel Vas Mariana Instituto de Biotecnologa, INTA Castelardel Viso Florencia Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarDelucchi Julio E. Monsanto Argentina8 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

10. Daz Marina L. CERZOS, CONICET, Universidad del SurDaz Ricci Juan Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumnDiRienzo Miguel Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de CrdobaDistfano Ana Julia Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarDrincovich Mara F. CEFOBI, Universidad Nacional de RosarioDurand Valeria Ketchum Argentina - ArgenBioEchenique Viviana Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del SurEscandn Alejandro S. Instituto de Floricultura, INTA CastelarFeingold Sergio E. INTA - EEA BalcarceFelitti Silvina Universidad Nacional de RosarioFernndez Aveliano Fac. Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE IBONEFernndez Paula Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarFerrari Germn Monsanto ArgentinaFerrari Mara Rosa Universidad Nacional de Buenos AiresFilippone Paula EEAOC, TucumnFlaschland Eduardo Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONEFranzone Pascual M. IGEAF INTA CastelarFresco Anala Nidera SemillasFriedrich Pablo Universidad Nacional del SurFusari Corina Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarGaldeano Ernestina Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONEGallo Leonardo INTA - EEA BarilocheGarayalde Antonio CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGarbus Ingrid CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGarca Ana Mara Facultad de Agronoma, UBAGarca Olmedo Francisco Universidad Politcnica de MadridGear Nicols SyngentaGmez Marisa CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurGonzlez Graciela Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAGrasso Daniel H. Instituto de Suelos, INTA CastelarGreizerstein Eduardo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBAGrellet Carlos INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumnGutirrez Agustina Universidad Nacional del SurHeinz Ruth Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarHelguera Marcelo INTA EEA Marcos JurezHopp Esteban Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarIbez Mercedes Universidad Nacional de Ro CuartoLabarta Marcelo Instituto Nacional de Semillas INASELandau Alejandra Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarLavia Graciela I. Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONELentz Ezequiel M. INGEBI, CONICETLevitus Gabriela ArgenBioLewi Dalia IGEAF INTA CastelarLia Vernica Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarLongo Florencia Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarLoray Mara Alicia Direccin de Calidad - INASELuciani Gabriela CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMamani Alicia INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumnMarcucci Poltri Susana Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarMarfil Carlos F. INTA - EEA MendozaMarinangeli Pablo A. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMartnez Ma. Carolina Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 9

11. Martnez-Zamora Gustavo INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumnMasuelli Ricardo W. INTA - EEA MendozaMeier Mauro CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurMentaberry Alejandro Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAMiranda Rubn Asociacin Cooperativas Argentinas (ACA), Univ. del SurMorgenfeld Mauro INGEBI, CONICETMroginski Luis Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONENisensohn Luisa Universidad Nacional de RosarioOlmos Sofa Laboratorio de Biotecnologa, INTA PergaminoOntivero Marta INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumnOrtiz Juan Pablo Facultad de Ciencias Agrarias, UNRPacheco Ma. Gabriela IGEAF INTA CastelarPaniego Norma Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarPrez Camargo Gladys Facultad de Agronoma, UBAPrez de la Torre Mariana Instituto de Floricultura, INTA CastelarPessino Silvina C. Facultad de Ciencias Agrarias, UNRPicca Aurora Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del SurPoggio Lidia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAPolci Pablo Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del SurPoverene Mnica Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del SurPrina Alberto IGEAF INTA CastelarPuebla Andrea F. Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarRadice Silvia INTA CastelarRey Hebe Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONERos Ral D. IGEAF INTA CastelarRivero Mercedes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBARobledo Germn Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONERoca Cecilia Dow AgrosciencesRodrguez Cecilia Instituto de Biotecnologa, INTA CastelarRoncallo Pablo CERZOS, CONICETRubinstein Clara Monsanto Argentina ILSISabbatini Mario R. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurSala Carlos Nidera SemillasSalazar Sergio INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumnSansberro Pedro Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONEScarpeci Telma E. IBR - Facultad de Cs Bioquimicas y Farmaceuticas, UNRSchrauf Gustavo Facultad de Agronoma, UBAScocchi Adriana Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) - IBONESegretin Ma. Eugenia INGEBI, CONICETSeijo Guillermo Fac. de Cs Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE, IBONESelva Juan P. CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurSharry Sandra Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de La PlataSols Neffa Viviana G. Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE) IBONESpangenberg Germn Victorian Department of Primary Industries (DPI)Tomas Pablo FCA, Universidad Nacional del LitoralTonello Ursula INSIBIO, CONICET, Universidad Nacional de TucumnTorales Susana IRB, INTA CastelarTranquilli Gabriela IRB, INTA CastelarTuesca Daniel Facultad de Ciencias Agrarias, UNRUreta Soledad CERZOS, CONICET, Universidad Nacional del SurValle Estela M. IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNRVzquez Rovere Cecilia Instituto de Biotecnologa, INTA Castelar10 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

12. Vellicce Gabriel EEAOC, TucumnVicario Ana Laura Direccin de Calidad INASEVicin Carmen Facultad de Agronoma, UBAVila Alejandro J. IBR - Facultad de Cs Bioqumicas y Farmaceuticas, UNRVojnov Adrin Fundacin Pablo CassarWinzer Nlida Universidad Nacional del SurWirth Sonia INGEBI, CONICETWulff Arturo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAZappacosta Diego C. Departamento de Agronoma, Universidad Nacional del SurZelada Alicia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBAZelener Noga IRB, INTA CastelarPRLOGOSPrlogo a la primera edicin Recientemente, un periodista, que comparta una ensalada con un bilogo, exclam: Si yoslo aspiro a que la lechuga que yo tenga que consumir no tenga genes! Cuando el bilogo leexplic que al comer sta no haba ms opcin que engullir unos 25.000 genes del genoma deLactuca sativa y varios miles de genes adicionales correspondientes a los genomas de los mi-croorganismos que habitual y cmodamente habitan en la superficie de las turgentes hojas, elperiodista qued atnito. Segn un eurobarmetro de hace unos meses, ms de dos tercios de los europeos estaban encontra de los alimentos transgnicos. Sin embargo, en la misma encuesta se inclua una aseve-racin - los tomates normales no tienen genes, los transgnicos s - frente a la que tambin msde dos tercios de los encuestados se mostraban de acuerdo o confesaban su ignorancia. Es unalstima que dicho eurobarmetro no registrara la proporcin correspondiente al encabezamientono saben, pero s contestan, aunque es fcil colegir que dicha fraccin era alta y en extremovergonzante. Los avances del conocimiento biolgico y de la biotecnologa destacan en el panorama cien-tfico-tcnico de este fin de siglo y han impregnado las ms diversas vertientes de nuestra vidacotidiana sin que se haya aceptado que un mnimo de estos conocimientos debera formar parteintegral de la cultura general. La ignorancia de los hechos bsicos relativos a nuestra herenciagentica o a nuestra alimentacin se considera incluso de buen tono. Esto se refleja de entradaen el caos semntico que se ha creado en torno a la biotecnologa, del que hay que culpar noslo a la ignorancia del ciudadano sino tambin a la torpeza de los cientficos y a la dictadura delos medios de comunicacin. Es preciso despejar este caos si queremos entendernos a partir dela ciencia, y no a sus espaldas. Trminos tales como organismos genticamente modificados (OGMs), alimentos transgni-cos, ingeniera gentica, ADN recombinante, transferencia gnica, clonacin, alimentos natura-les, mejora gentica e, incluso, biotecnologa, han invadido nuestro lenguaje cotidiano sin ordenni concierto. A estas alturas empieza a ser difcil normalizar la situacin, pero tratemos de con-tribuir a ello. La definicin de biotecnologa abarca a todas las tecnologas mediadas por un ser vivo o porpartes de l, sean stas clulas o enzimas aisladas. Bajo esta definicin se incluyen desde lapropia agricultura, inventada hace diez milenios, y la fabricacin de las veinticuatro clases decerveza mesopotmica, que tanto gustaban a Nabucodonosor, hasta la ltima forma de producir Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 11

13. insulina humana. No es apropiado, por tanto, usar el trmino de forma restringida para referirseexclusivamente a los ltimos avances basados en la biologa molecular. Para esto ltimo resultams adecuado el uso de la expresin biotecnologa molecular. Prcticamente la totalidad de lo que ponemos en nuestra mesa ha sido genticamente modifi-cado. La domesticacin de plantas y animales supuso una alteracin muy drstica de sus geno-mas y la mejora gentica subsiguiente ha ido aadiendo modificaciones extensas y sustanciales.Lo importante es la naturaleza de los cambios introducidos y no los mtodos empleados paraello. De hecho, la ingeniera gentica es slo uno de esos mtodos - una modalidad ms de me-jora gentica - y slo sirve para modificar uno o pocos genes de forma muy selectiva. No servirapara obtener razas de perro tan distintas - en su tamao, morfologa y temperamento - como elChihuahua y el Pit Bull Terrier, que en cambio han surgido de la mano del hombre gracias a losmtodos genticos ms tradicionales. En consecuencia, resulta absurdo denominar OGMs sloa los productos de la ingeniera gentica para contraponerlos a los supuestamente naturales. Casi nada de lo que ponemos en nuestra mesa es natural, hasta el punto que la mayora delos organismos de los que derivamos nuestro alimento han perdido su capacidad de sobrevivirpor s mismos en la naturaleza. Es ms, para llegar a nuestra mesa han debido sufrir alteracionesgenticas que les priven de infinidad de sustancias naturales que son txicas o inhibitorias parael ser humano. Una variedad moderna, modificada por ingeniera gentica, est tan lejos de sernatural como las que la precedieron. Por fortuna! Ya que es obvio que natural no es sinnimode inocuo. Se consideran organismos transgnicos aquellos cuyo genoma ha sido alterado por ingenieragentica o, si se prefiere, por sastrera gentica, ya que las operaciones fundamentales de estava experimental consisten en cortar y coser (unir) piezas de ADN. Un gen es un tramo de ADN(una secuencia construida con las bases A, T, G, C) que, en general, determina una protena (unasecuencia de aminocidos), de acuerdo con las equivalencias plasmadas en la clave gentica.Mediante la nueva tecnologa se puede alterar un genoma por la adicin de uno o varios (pocos)genes que previamente no formaban parte de l o por la inutilizacin de uno o varios genes entrelos ya existentes. Estas operaciones se hacen para conferir caracteres deseables y para eliminarcaracteres indeseables del organismo, respectivamente, objetivos que no difieren de los de lamejora gentica tradicional. En lo que difieren la vieja y la nueva tecnologa es en el repertorio gnico que se puede mane-jar - genes de la misma especie, en el caso de la vieja, y de cualquier especie, en el de la nue-va - y en el modo de introducir y transferir la modificacin gentica, por va sexual o por adicinexgena (transformacin), respectivamente. Los organismos modificados por transformacin sesuelen denominar transgnicos. Llamar transgnicos a los alimentos derivados de dichos orga-nismos resulta menos apropiado porque, como dice el refrn, degradado es todo gen que entrapor boca de cristiano. Es absurdo llamar transgnico al azcar procedente de una remolachatransgnica, ya que es un producto qumico puro, esencialmente indistinguible del aislado de laremolacha normal o de la caa de azcar. Con acertado criterio, los editores de esta obra han adoptado un tratamiento integral de todoslos mtodos, objetivos y logros de la alteracin gentica de las plantas con fines prcticos. Faltanen nuestro idioma obras que acerquen con rigor a una parte tan importante de nuestra culturageneral. Las adaptaciones a los nuevos avances de textos preexistentes, hechas a menudo porun nico autor, suelen adolecer de falta de familiaridad con la nueva tecnologa. De aqu que laaproximacin adoptada en esta obra, segn la cual cada captulo est a cargo de verdaderosespecialistas, sea la ms apropiada en la actualidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 200412 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

14. Prlogo a la segunda edicin La buena fortuna de un libro lleva aparejada la esclavitud de su autor o autores, que quedanencadenados a la necesidad de mantenerlo vivo en sucesivas ediciones. Estamos ante la segundaedicin de Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, un texto que, hace seis aos, supuso una es-plndida y afortunada aportacin a la recensin de un rea tecno-cientfica en vigorosa ebullicin yde gran relevancia prctica. La necesidad de esta edicin surge de mltiples circunstancias, entrelas que cabe resaltar el enorme avance del conocimiento que ha tenido lugar, la redefinicin delos retos entonces planteados y la aparicin de otros nuevos que han diversificado los objetivosprcticos de la disciplina. Adems, entre la aparicin de la primera edicin y la de esta segunda, haocurrido una crisis alimentaria significativa que no es separable de otras, tales como la econmica,la climtica o la energtica. Segn todos los indicios, la crisis alimentaria va a ser duradera y obedece a factores mltiples: lasubida del precio del petrleo, el bajo nivel de reservas, la especulacin, el incremento de la pobla-cin y del consumo per capita, el desvo de una parte sustancial de la produccin agraria hacia lafabricacin de biocombustibles, la disminucin de los rendimientos por el estrs debido al cambioclimtico y la falta de inversin en innovacin agropecuaria. Parece como si el xito relativo de lasltimas dcadas hubiera hecho bajar la guardia. En particular, la tasa de crecimiento de la produccin de alimentos ha ido por detrs de la delcrecimiento de la poblacin durante la ltima dcada, justo el tipo de comportamiento relativo quepropuso Malthus hace ms de dos siglos. En el ltimo medio siglo, ha sido la mejora gentica laque ha tenido el protagonismo tcnico en la derrota de la amenaza maltusiana, ya que la superfi-cie de suelo laborable apenas ha crecido. En la actualidad, se ha adquirido de pronto concienciade que no se sabe bien cmo se va a conseguir el aumento de la produccin de alimentos en un70-100 % para el ao 2050, necesidad que se considera mnima para alimentar una poblacin pro-yectada de unos 9.000 millones de seres humanos que, adems, tendrn una demanda per cpitasignificativamente superior a la actual. Si se quiere lograr dicho objetivo, habremos de ser an mseficaces en las prximas dcadas de lo que lo hemos sido en las precedentes. Por supuesto, las respuestas a los retos planteados ni han sido ni sern exclusivamente tcni-cas, pero todas las estrategias posibles han tenido y tendrn un importante componente tcnico yes sobre este componente sobre el que se centra el libro que ahora se reedita. El cambio climtico est alterando los estreses biticos y abiticos a que deben hacer frente lascosechas, lo que hace prioritaria la investigacin bsica y aplicada tanto en el esclarecimiento delos mecanismos involucrados como en la adaptacin de las cosechas tradicionales a las nuevascondiciones, as como el desarrollo de nuevas cosechas que sean ms apropiadas para condicio-nes extremas. La crisis energtica ha impulsado un nuevo inters por los biocombustibles, en los que se hancentrado algunas esperanzas infundadas que han dado lugar a la formulacin de objetivos polticosque pueden tener consecuencias perjudiciales para la alimentacin mundial. As por ejemplo, losobjetivos declarados para fechas prximas, tanto por lo EEUU como por la UE, estn determinandouna competencia por el suelo agrcola de la generacin de biocombustibles con la produccin dealimentos que no puede sino encarecer significativamente los alimentos y aumentar el nmero dehambrientos en el mundo, as como contribuir a la destruccin de bosque tropical. Por otra parte,La bsqueda de especies y variedades aptas para la produccin de biocombustibles plantea retosformidables a la investigacin de su agronoma y a su mejora convencional y biotecnolgica. Es en el escenario que a grandes rasgos acabamos de esbozar, donde la presente edicin deBiotecnologa y Mejoramiento Vegetal II manifiesta su pleno potencial y debe alcanzar su mxi-ma funcionalidad. Dr. Francisco Garca Olmedo, 2010 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 13

15. 14 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

16. Parte IHerramientas bsicas Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 15

17. 16 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

18. I - CAPTULO 1 1. Objetivo del cultivo: si bien es difcil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podra esquemati-Establecimiento de cultivos de zarlas en aplicaciones para:tejidos vegetales Estudios bsicos. En este caso, los explan- tes cultivados pueden ser diversos. Si lo nicoLuis Mroginski, Pedro Sansberro y que se quiere lograr es un sistema de callosEduardo Flaschland para estudiar algn proceso fisiolgico, se puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula 1 Introduccin viva. En este caso en que lo nico que se bus- ca es la induccin de callos lo ideal es cultivar El cultivo de tejidos en su acepcin amplia explantes jvenes, derivados de semillas enpuede ser definido como un conjunto muy hete- germinacin, donde se obtienen respuestas r-rogneo de tcnicas que presentan en comn pidas y, en general, hay menores problemas deel hecho de que un explante (una parte sepa- contaminacin con microorganismos. A vecesrada del vegetal que pueden ser protoplastos se hace uso del cultivo de tejidos porque repre-clulas desprovistas de pared celular clulas, senta un sistema experimental que simplificatejidos u rganos) se cultiva aspticamente en la complejidad generada por los fenmenosun medio artificial de composicin qumica de- de correlacin entre las distintas partes quefinida y se incuba en condiciones ambientales normalmente estn presentes en una plantacontroladas. La imprecisin de esta definicin entera. El explante que se usar estar condi-puede generar muchas polmicas, pero es ac- cionado por lo que se quiere estudiar. Un buentualmente aceptada. Generalmente es comn ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fe-dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos cundados del tomate para estudiar los reque-grandes grupos: a) cultivos en medios semis- rimientos nutricionales durante el crecimientolidos y b) cultivos en medios lquidos, los que de los frutos. Asimismo, el cultivo de vulos haa su vez pueden ser agitados (mediante el em- sido muy til para estudiar aspectos relaciona-pleo de agitadores de uso continuo) o estacio- dos con la formacin de las fibras en algodn.narios. Tambin es frecuente dividir al cultivo El cultivo de discos de tallos brind una valiosade tejidos atendiendo a los niveles de comple- ayuda para estudiar la rizognesis in vitro.jidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y Obtencin de plantas con sanidad contro-cultivo de protoplastos. Para el establecimien- lada. Es muy comn la utilizacin del cultivo deto de los cultivos utilizando cualquiera de los tejidos para la obtencin de plantas libres desistemas es necesario tener en cuenta algunos virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello esaspectos generales comunes relacionados con el meristema (dependiendo de la especie, deel explante, la asepsia, el medio de cultivo y 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo ylas condiciones de incubacin. La discusin de de un par de primordios foliares.estos aspectos constituye el objetivo de este Micropropagacin. En este caso depende-captulo. Adicionalmente se incluye el tema de r del sistema que se quiere utilizar. Si lo quela aclimatacin de las plantas regeneradas in se quiere explotar es la brotacin de meris-vitro, que es de gran importancia en la mayora temas, los pices terminales y los segmentosde las aplicaciones del cultivo de tejidos en la uninodales de ramas jvenes constituyen ex-agricultura. celentes explantes. En este caso el cultiva- dor de tejidos debe conocer perfectamente la biologa de la reproduccin de la planta para 2 Explante aprovechar aquellos explantes que en formaVarios factores deben ser tenidos en cuenta natural son propgulos. En cambio, si se pre-en la eleccin del explante apropiado para el tende micropropagar mediante el empleo deestablecimiento de los cultivos in vitro, entre semillas sintticas (ver Parte IV, captulo 2) elellos: explante original deber posibilitar la induccin Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 17

19. de la embriognesis somtica. En este caso, la Establecimiento de suspensiones celula-utilizacin de embriones zigticos inmaduros u res. En este caso se recomienda iniciar los cul-hojas, suelen ser frecuentes como explantes. tivos a partir de explantes extrados de semillas Obtencin de hbridos interespecficos. en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledo-Una de las primeras aplicaciones del cultivo de nes, races).tejidos en la agricultura lo constituy su empleocomo ayuda para la obtencin de hbridos deri- 2. Posibilidad de contaminacin con mi- croorganismos. De ser posible, se deben cul-vados de cruzamientos interespecficos, donde tivar explantes de plantas donantes que crecense produce el aborto temprano de embriones. en condiciones de invernadero, con ello seEn estos casos, el explante cultivado es el reduce sustancialmente las tasas de contami-embrin cigtico en estadios tempranos de su nacin. Por otra parte, es recomendable evitardesarrollo. Con la misma finalidad tambin se el uso de explantes sucios (races, rizomas)utilizan ovarios u vulos fecundados. que provienen de plantas crecidas en macetas Obtencin de plantas de semillas con em- o en el campo, dado que en la mayora de losbriones rudimentarios. Para esta finalidad los casos no es posible conseguir una buena des-explantes pueden ser semillas (por ej. orqu- infeccin de los mismos.deas) o bien, se aslan los embriones en un es-tado temprano de desarrollo (corazn) como 3. Edad fisiolgica. Este es un aspecto deen el caso de yerba mate o de algunas varieda- gran influencia en la morfognesis. Como reglades de duraznero. general se puede decir que cuando ms joven Obtencin de plantas haploides (consi- e indiferenciado se encuentre el explante a cul- tivar, mejor ser su respuesta in vitro. Es porderando como haploide a un esporofito que ello que los meristemas apicales y axilares soncontiene el complemento gamtico de cromo- ampliamente usados en numerosas especies.somas). En este caso, los explantes ms uti- En el caso de la micropropagacin de plan-lizados son las anteras, aunque tambin pue- tas leosas, la edad del explante es un factorden emplearse microsporas aisladas, vulos y crtico. Si los tejidos son jvenes, la micropro-ovarios no fertilizados. pagacin tiene mayores posibilidades de ser Induccin de variacin somaclonal. En este exitosa que con tejidos maduros. Este hechocaso se pueden utilizar varios explantes, pero genera la necesidad de realizar tratamientossi la finalidad de su utilizacin es la aplicacin de rejuvenecimiento de las plantas donantesen planes de mejoramiento gentico de plan- de explantes.tas, los explantes utilizados deben posibilitar laregeneracin de plantas enteras. 4. Tamao. En general, cuanto ms grande Produccin y/o conversin de sustancias sea el explante mayores sern las posibilida-tiles. Se puede utilizar una gran variedad des de inducir la proliferacin de callos o la re-de explantes. Los de races suelen ser muy generacin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin son ma-utilizados. yores las probabilidades de que los cultivos se Obtencin de hbridos somticos. Para esta contaminen con microorganismos. Tambin esfinalidad se recurre a la fusin de protoplastos. necesario tener en cuenta que existe un ta-En la mayora de los casos se aslan los proto- mao mnimo del explante, que depende de laplastos de mesfilos de hojas y de suspensio- especie y del material vegetal, por debajo delnes celulares. cual no es fcil lograr el establecimiento de los Conservacin e intercambio de germo- cultivos. Los explantes muy pequeos suelenplasma. Los meristemas son los explantes requerir del empleo de medios ms complejospreferidos para el desarrollo de sistemas de o de los denominados medios acondicionados.conservacin a mediano y largo plazo (cro- 5. Epoca del ao. Es un factor que suelenconservacin con nitrgeno lquido) y para el tener mucha importancia en la micropropaintercambio de material gentico. gacin y que generalmente est asociado al18 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

20. grado de dormicin que presentan ciertos ex- te con la ayuda de un microscopio estereos-plantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la cpico los cultivos en forma peridica (por loposibilidad de mayor o menor proliferacin de menos semanalmente). Tambin se puedenmicroorganismos. realizar pruebas con medios de cultivo dife- renciales y test bioqumicos especficos. 3 Asepsia Para evitar y/o minimizar las contaminacio- nes de los cultivos con microorganismos es Uno de los principales problemas que se necesario:presentan cuando se tratan de establecer loscultivos es el de la contaminacin de los mis- 1) Conocer el material vegetal con que se tra-mos con diversos tipos de microorganismos baja y los posibles contaminantes especficos.(hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, vi-rus). El ambiente generado por explante-medio 2) Realizar una adecuada preparacin de lade cultivo-condiciones fsicas de incubacin planta dadora de explantes, cultivndola pre-es altamente propicio para la proliferacin de ferentemente en invernaderos tratadas conmuchos de estos microorganismos que pue- productos qumicos que eliminen patgenos yden provocar la destruccin de los cultivos. Es eventuales microorganismos endfitos.difcil cuantificar el impacto de estas prdidas,pero en promedio, en laboratorios dedicados a 3) Proceder a la desinfeccin superficial dela micropropagacin se lo puede estimar en al- los explantes mediante el uso de compuestosrededor del 10%. En el mejor de los casos, es- qumicos con el objeto de eliminar los micro-tos microorganismos no destruyen los cultivos organismos con el menor dao posible parapero compiten con el explante por los nutrien- el explante. Si bien no es posible recomendartes del medio de cultivo o bien lo modifican. un procedimiento general, se puede sealarEs muy difcil conseguir cultivos estrictamen- que el procedimiento ms popularizado con-te aspticos dado que en la mayora de los siste en una doble desinfeccin mediante lacasos es altamente probable que los mismos inmersin de los explantes en etanol (70%v/v)contengan virus y fitoplasmas, por lo que en durante 20-60 segundos seguido de hipoclo-la prctica, cuando se refiere a cultivos asp- rito de sodio 1 -3%, contenido en el agua deticos, en general se quiere significar que son lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos,cultivos donde no se produce la proliferacin dependiendo de la naturaleza del explante.de hongos y bacterias. Algunos procedimientos se basan en el em- Dos son las fuentes de contaminaciones: a) pleo de nicamente etanol o de hipoclorito demicroorganismos presentes en el interior o en sodio. Finalmente, es necesario eliminar losla superficie de los explantes y b) fallas en los restos de estos productos mediante varios la-procedimientos de cultivo en el laboratorio. La vados con agua destilada estril.correcta deteccin de estas fuentes y del tipo En este ltimo punto hay que aconsejar quede microorganismo son aspectos importantes se utilice agua destilada estril de recientepara el xito de los cultivos, pues por un lado preparacin, dado que est demostrado que elayuda a determinar la fuente de contaminacin almacenaje prolongado del agua estril puedey por otro lado, ayuda a la planificacin de los ser la causa de contaminaciones con bacte-procedimientos para controlarlos. Varios gne- rias. Es aconsejable realizar estas operacio-ros de bacterias (Pseudomonas, Xanthomonas, nes de desinfeccin superficial en una cmaraErwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, de transferencia con aire estril. En lugar delMicrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclori-Mycobacterium, Corynebacterium) y de hon- to de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercuriogos filamentosos (Aspergillus, Penicilium, (0,1%- 1,5%). Es preciso recomendar extremaFusarium, Alternaria, Cladosporium y cautela con el empleo de este ltimo compues-Neurospora) estn frecuentemente en los cul- to, dado que es altamente txico y adems notivos. Es conveniente inspeccionar visualmen- es removido con facilidad del explante. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 19

21. En los casos en que no se utilice etanol, la croondas. El agua caliente tambin puede seradicin de agentes tensoactivos junto con el usada. En el caso de sustancias termolbiles,desinfectante es una prctica recomendada. la esterilizacin se puede hacer mediante fil-Entre los ms usados figuran Tween-20 (0,01 tracin a travs de filtros bacteriolgicos. 0.1%) o unas gotas de Triton. El lavado pre- No es posible recomendar ningn sistemavio de los explantes con agua corriente y de- de esterilizacin dado que la exitosa destruc-tergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La cin de los microorganismos depende de ml-inmersin de los explantes en soluciones con- tiples factores entre los que interesan el tama-teniendo sustancias antibiticas y /o antimic- o del recipiente, el tiempo de esterilizacin yticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sinampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de embargo, se pueden dar algunas sugerencias:gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifam- La esterilizacin en estufas mediante calorpicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) seco (aire caliente) es recomendable para es-puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados terilizar recipientes de vidrios secos (pipetas,en casos excepcionales. Estos productos tienen cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4el inconveniente de que alteran la composicin horas en estufas a 180-200 C brindan exce-de los medios de cultivo y adems pueden ser lentes resultados.metabolizados por los explantes. La esterilizacin con calor hmedo con va- ltimamente han aparecido soluciones bio- por bajo presin (en autoclave o en una olla acidas que matan bacterias y hongos, previenen presin). Es el procedimiento ms empleadola germinacin de esporas y a altas concen- para la esterilizacin de los medios de cultivotraciones pueden eliminar contaminaciones (salvo, como se indic ms arriba, para aque-de microorganismos endfitos. Uno de estos llos que posean componentes termolbiles).compuestos es el PPM (Plant Preaservative En este caso, lo ms comn es usar una pre-Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, sin de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, conun compuesto derivado de los furfurales de la lo que prcticamente se destruyen todas lascaa de azcar. Este compuesto, qumicamen- formas de vida. Es importante que en todoste: 1-(5-bromofur-2-il)-2- bromo-2-nitroeteno los puntos del autoclave se alcance dicha tem-fue desarrollado en la Universidad Central de peratura, para lo cual hay disponibles cintaslas Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y detectoras colorimtricas.fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plntulas cre- 5) Cultivar los explantes en una cmara decidas in vitro como plantas donantes de explan- transferencia con aire estril (gabinete de flu-tes, es necesario desinfectar las semillas para jo laminar), localizada en un ambiente limpiosu cultivo y germinacin y luego es aconsejable y no expuesta a corrientes de aire. De no dis-desinfectar tambin las plntulas resultantes. poner este equipamiento, se pueden sustituir En algunos materiales vegetales se utiliza con cuartos esterilizados previamente con luzla preincubacin de los explantes mediante lo ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV encual stos son desinfectados suavemente y forma directa). La mesada de trabajo y las pa-precultivados durante 24 horas en un medio redes del gabinete deben ser desinfectadasconteniendo sacarosa, y finalmente son desin- previamente con etanol al 70%. De la mismafectados nuevamente y cultivados. manera deben ser desinfectados exteriormen- 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo te todos los recipientes (conteniendo mediosesterilizados, es decir, liberados completamen- de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el reate de cualquier microorganismo vivo o espo- del aire estril.ras. Para la esterilizacin, en la mayora de los Los operarios constituyen frecuentementecasos se hace uso del calor en sus diversas una importante fuente primaria de contamina-formas: llama directa, calor hmedo (en forma cin, porque es recomendable que, antes dede vapor abierto o bajo presin), calor seco comenzar a trabajar laven sus manos y ante-(aire caliente). Se pueden usar hornos a mi- brazos con abundante agua y jabn y se des-20 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

22. infecten con etanol al 70 %. La utilizacin de Tabla 1: Composicin de tres medios bsicosguardapolvos, guantes y mscaras protectoras usados en el cultivo in vitro de tejidos.de la boca y de la nariz, as como los gorros 1 Compuestos Medio bsicoprotectores de los cabellos, ayudan a reducir MS N6 B5sensiblemente los niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, NH 4NO3 1.650 ----- -----tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser KNO 3 1.900 2.830 2.500 KH 2PO4 170 400 -----esterilizados antes de su uso. Muchos de es- CaCl 2.2H 2O 440 166 150tos instrumentos pueden ser colocados en eta- (NH4) 2SO 4 ----- 463 134nol al 95% y, antes de ser usados, se deben MgSO4.7H 2O 370 185 250 NaH 2PO 4.4H 2O ----- ----- 150flamear cuidadosamente en la llama de un me- KI 0,83 0,80 0,75chero. Tambin es necesario flamear la boca MnSO 4.H2O ----- ----- 10,00de los recipientes que contienen los medios de H 3BO 3 6,20 1,60 3,00 MnSO 4.4H 2O 22,30 4,40 -----cultivo antes y despus de cultivar el explante. ZnSO 4.7H 2O 8,60 1,50 2,00 6) Incubar los cultivos en cmaras o cuar- Na2MoO 4.2H 2O 0,25 ----- 0,25 CuSO 4.5H 2O 0,025 ----- 0,025tos de cultivo, cerrados, libres de corrientes FeSO 4.7H 2O 27,80 27,85 27,80de aire y bien higienizados. En lo posible se Na2EDTA 37,30 37,25 37,30debe restringir la circulacin de personas, y los CoCl 2.6H 2O 0,025 ----- 0,025 Glicina 2,00 2,00 -----recipientes con cultivos contaminados deben Tiamina -HCl 0,10 1,00 10,00ser rpidamente eliminados de este sector. Es Piridoxina -HCl 0,50 0,50 1,00conveniente que antes del lavado, estos culti- cido Nicotnico 0,50 0,50 1,00vos sean esterilizados. Mioinositol 100,00 ----- 100,00 Sacarosa 30.000,00 50.000,00 20.000,00 4 Medios de cultivo PH 5,7 5,8 5,5 -1- 1. Un medio de cultivo puede ser definido 1) Composicin en mgLcomo una formulacin de sales inorgnicas y MS = Medio de Murashige y Skoog (Physiol. Plant. 15: 473 - 97. 1962)compuestos orgnicos requeridos para la nu- N6 = Medio de Chu,C.C., Wang,C:C., Sun,C.S., Hsu, C., Yin, K,C.,tricin y manipulacin de los cultivos. Existen y Chu, C. (Sci. Sinica 18: 6 59- 668. 1975) B5 = Medio de Gamborg, O.L., Miller,R.A. y Ojima, K. (Exp.Cellnumerosas formulaciones, cada una de las Res. 50: 151 - 158. 1968)cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.Para dar una idea de la cantidad de formu-laciones disponibles, George y col., luego de Otros compuestos.revisar ms de 3.000 trabajos cientficos des-criben en dos tomos (casi 1.000 pginas en to- Fuente de carbono: Prcticamente todos lostal) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin cultivos son hetertrofos (comparativamentedos empresas multinacionales ofrecen para la unos pocos son auttrofos) y por ende necesi-venta ms de 60 medios cada una, listos para tan del suministro de una fuente de carbono.su utilizacin especialmente en la micropropa- La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%,gacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se es el azcar ms utilizado. En algunos mediospresentan tres medios que son muy usados en se la reemplaza por glucosa. En casos particu-la actualidad. lares se cita el empleo de maltosa o galacto- Bsicamente, los medios de cultivo se com- sa. Tambin myo-inositol (100 mg/L) suele serponen de compuestos que suministran: incorporado a los medios resultando un mejor Una fuente de carbono crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales Nutrientes minerales: Los medios de cultivo Sustancias vitamnicas deben suministrar los mismos macro y micro- Sustancias reguladoras del crecimiento nutrientes que son esenciales para el creci- Agente gelificante (en el caso de medios miento de las plantas enteras. En general sesemislidos) destacan las concentraciones relativamente Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 21

23. altas de nitrgeno y potasio. El nitrgeno es agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pursuministrado en forma de amonio y/o nitrato. de banana. Tambin en ocasiones es necesa-Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y ria la incorporacin de agentes antioxidantescasena hidrolizada. Es fundamental que el hie- (L-cistena, cido ascrbico, polivinilpirrolido-rro sea incorporado juntamente con un agente na) para prevenir el ennegrecimiento tisularquelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible causado por la oxidacin de polifenoles pre-es un amplio rango de pH. sentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. Sustancias vitamnicas: De todas las que La preparacin de los medios de cultivo pue-comnmente se incorporan a los medios, pa- de llevarse a cabo de diferentes maneras, enreciera que la tiamina es la nica realmente lecturas recomendadas se citan manualesimprescindible para el buen crecimiento de los de laboratorio donde se describen detallada-cultivos. mente este punto. Sustancias reguladoras del crecimiento: En 5. Condiciones ambientales para lala mayora de los casos los medios utilizados incubacin.para el establecimiento de los cultivos con-tienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, AIB, NOA, La incubacin de los cultivos se debe llevarDicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, KIN, a cabo en condiciones controladas. Por lo me-ZEA, 2iP, Thidiazurn). Las giberelinas (es- nos en lo que se refiere a temperatura, calidadpecialmente GA3) son requeridas en algunas e intensidad de luz, fotoperodo, humedad at-ocasiones para el cultivo de meristemas o para mosfrica e higiene. Estas condiciones se lo-la elongacin de brotes. El ABA, es usado en gran con el empleo de cmaras climatizadasalgunos casos. o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (fro-calor) y una buena y uni- Agente gelificante (en el caso de medios se- forme circulacin de aire en el interior y dota-mislidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el com- dos de un buen sistema de alarma para cortarpuesto ms utilizado. Tambin pueden em- la iluminacin en caso de no funcionar el aireplearse Agargel (0,40-0,60%), Transfergel acondicionado. En general, los cultivos son in-(2,0-2,60%), Phytagel (0,25- 0,40%), agaro- cubados a temperatura constante de 25-28 C,sa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%). con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lmparas fluo- Otros compuestos: Muchas sustancias, de rescentes del tipo luz da con una irradianciavariada composicin qumica, suelen ser adi- de entre 50 y 200mol m-2s-1. La humedad at-cionadas a los medios bsicos. Adems de la mosfrica debe ser elevada (80- 90%).glicina, otros aminocidos se pueden agregara los medios. Es el caso de L-tirosina, aspara- 6 Aclimatacin de las plantas regenera-gina y cistena, aunque hay que tener presente das in vitro.que en dosis altas pueden inhibir el crecimien-to de los cultivos. El carbn activado (0,1 a Durante el perodo de incubacin, los cultivos5%) suele ser incorporado al medio, dado que son expuestos a condiciones ambientales dis-es probable que absorba metabolitos txicos miles al ambiente externo. La atmsfera internapara los cultivos. se caracteriza por presentar una considerable variacin diurna en la concentracin de CO2, En algunos medios se incorporan cidos humedad relativa elevada, temperatura cons-orgnicos como el mlico, el ctrico, el pirvi- tante e intensidad lumnica baja. A su vez, elco y el succnico y es frecuente el empleo de medio de cultivo compuesto por concentracio-L-glutamina y de casena hidrolizada. An hoy nes elevadas de azcares (en aquellos siste-se siguen utilizando ciertos componentes de mas hetertrofos y semiauttrofos de micropro-composicin qumica no bien definida como el pagacin), sales y reguladores del crecimiento,22 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

24. sumado a la ausencia de microorganismos, del substrato, para mantener la temperaturageneran anormalidades morfolgicas, anat- por encima de los 18-20 C.micas y fisiolgicas que las plantas debern Sin lugar a dudas, la opcin ms econmicacorregir cuando son transferidas al ambiente es el empleo de la luz natural, disminuyendo suexterno. Este perodo de adaptacin al nuevo irradiancia (20-50%) mediante el agregado dehbitat es llamado fase o etapa de aclimata- mallas de sombreado (saram). No obstante,cin. La estrategia a implementarse durante el en aquellas latitudes donde el nivel medio demencionado ciclo deber contemplar el control luz natural es bajo y los das son cortos du-minucioso de los parmetros ambientales (hu- rante una parte considerable del ao, la luz ar-medad, temperatura y luz) de tal manera que tificial puede ser aplicada como complementopermita disminuir la deshidratacin y, al mismo de la luz natural. Las lmparas tubulares fluo-tiempo, estimular la fotosntesis con el objeto de rescentes del tipo luz da son empleadasgenerar un rpido crecimiento de los plantines. en horticultura para prolongar el fotoperodo. El retraso en el desarrollo de la cutcula y la Asimismo, las lmparas tubulares de sodio altaescasa funcionalidad del aparato estomtico presin presentan una distribucin espectralque presentan las hojas de la mayora de las de la energa adecuada para estimular fotosn-especies cultivadas in vitro, determinan una tesis y se emplean para tal fin en una ampliaalta tasa de transpiracin que puede ocasionar variedad de cultivos.la muerte por deshidratacin. El control de este Otro aspecto importante a tener en cuentaproceso fisiolgico es de vital importancia du- lo constituye la eleccin del substrato, siendorante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la el adecuado aquel que permita el normal creci-disminucin de la transpiracin ser gradual y miento y desarrollo de las races. Se puede em-depender de la rehabilitacin de los estomas, plear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mez-as como tambin del desarrollo de la cutcu- clas de ellos, teniendo la precaucin de rea-la. El equipamiento necesario estar sujeto a la lizar una esterilizacin previa. Es convenienteespecie, pudiendo utilizarse desde tneles de el agregado de fertilizantes, sea a travs delpolietileno para plantas que posean un elevado substrato (fertilizantes de liberacin controla-control de la transpiracin (por ej. Malus pumila da) o bien mediante el sistema de riego (fer-o Agave tequilana) o bien, a travs del empleo tilizantes solubles); emplendose proporcio-de cmaras climatizadas (Fig.1) equipadas con nes ricas en fsforo (N-P-K: 9-45-15) y potasiosensores que permiten un descenso paulatino (N-P-K: 4-25-35) que favorecern el desarrollode la humedad relativa. En algunos casos pue- radicular y la rustificacin de las plantas.de resultar necesaria la aplicacin exgena de En todo momento deber realizarse un rigu-ABA (hormona involucrada en el control del cie- roso control fitosanitario emplendose antibiti-rre de los estomas) o bien, el empleo de sus- cos, fungicidas e insecticidas de uso universal.tancias antitranspirantes que forman una capa En la Figura 1, se detalla un modelo de c-semipermeable en la superficie de la hoja. En mara de aclimatacin diseada por los autoreseste ltimo caso debern tomarse algunas pre- y empleada por el Laboratorio de Cultivo decauciones debido a que pueden observarse re- Tejidos del Instituto de Botnica del Nordeste.acciones de fitotoxicidad. Bsicamente, est compuesta por una fase Resulta imprescindible evitar la exposicin a area construida en aluminio y policarbonatotemperaturas extremas tanto en la fase area alveolar (9) y un recipiente o batea (11) quecomo en el substrato. Mediante el empleo de contiene grnulos de arcilla expandida a fin deextractores y/o acondicionadores de aire com- facilitar el drenaje. Mediante el agregado debinados con un sistema de niebla, es posible arena u otro substrato adecuado, esta cmaraestablecer la temperatura de la fase gaseosa puede ser utilizada tanto para el enraizamientoentre los 25 y 30 C durante la estacin estival, ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa demientras que en la poca invernal es necesa- multiplicacin, as como tambin, para el en-rio, a veces, el empleo de mantas trmicas o raizamiento convencional (a raz desnuda)serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel de estacas de tallos u hojas. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 23

25. La humedad relativa de la fase area es con- Debido a la latitud geogrfica en que se en-trolada por un sensor (6) ubicado por encima cuentra, la cmara est equipada con un acon-de la tubera de riego (4). El sistema humidifi- dicionador de aire (3000 frigoras) para evitarcador est compuesto por picos tipo fog y situaciones de estrs trmico en poca estival.es alimentado por una bomba de bajo caudal A su vez, y dado que la mayora de las espe-y alta presin (13). Con el propsito de evitar cies estudiadas son originarias de climas tro-el goteo que pudiese ocasionar el agua rema- picales y subtropicales, el sistema cuenta connente en las caeras, el sistema consta de mantas trmicas que son colocadas por deba-una vlvula solenoide de descarga y desage jo de los tubetes, manteniendo la temperatura(7). La fase gaseosa es renovada en forma in- del substrato durante el invierno. En este lti-termitente mediante el empleo de extractoresubicados en ambos extremos de la cmara (3) mo caso se agrega un material aislante entre lalos que, conjuntamente, introducen o extraen leca (10) y la malla de hierro (16) de tal maneraaire, generando un movimiento masal. de dirigir el calor hacia la fase area.24 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

26. 7. Agradecimientos.Los autores agradecen al Ing. Pablo A. Lunapor la planificacin digital de la cmara de acli-matacin. A la Secretara General de Cienciay Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La Ca-chuera por el aporte financiero recibido paraconstruir la misma. 8. Lecturas RecomendadasGEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEOR- GE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formu- lations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pg.GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE. 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pg.HURTADO, D.V. y MERINO, M.E. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. Mxico. 232 pg.PREZ PONCE, J.N. 1998. Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. Instituto de Biologa de Plantas.Santa Clara. Cuba. 390 pg.POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S. PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481-497.ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edicin). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colom- bia, 970 pg.TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998. Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pg.TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999 Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pg. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II 25

27. I - CAPTULO 2 2.- Tipos de morfognesis. Definiciones En condiciones de cultivo in vitro, las clulasMorfognesis somticas pueden regenerar embriones (FigSilvia Radice 1) o brotes, races y/o flores (Fig 2) como res- puesta a un determinado estmulo. La regene- 1.- Introduccin racin es un proceso que comprende diferen- tes fases que se suceden de manera similarLa embriognesis somtica y la organognesis para los tres tipos de morfognesis citadas. Deson dos procesos morfognicos muy frecuen- Klerk y colaboradores, en 1997, denominarontes en el cultivo in vitro de especies vegetales. a estas diferentes fases como adquisicin deLa embriognesis somtica es el proceso por la competencia; fase de induccin y fase deel cual se obtiene una estructura similar a un realizacin.embrin cigtico sin que medie la fertilizacin En la primera fase, las clulas no respon-de las gametas, mientras que por organog- den al estmulo organognico pero adquierennesis pueden obtenerse tallos, races o flores. esa competencia durante una fase de desdi-Estos rganos son inducidos a partir de una ferenciacin. En la segunda fase o fase de in-clula o de un grupo de clulas que, segn las duccin, las clulas son receptivas al estmulocondiciones de cultivo, tienen la propiedad de morfognico y hay una relacin directa con elmantenerse en activa divisin. tipo, concentracin y combinacin de regula-Esta totipotencialidad celular fue enunciada dores del crecimiento agregados al medio depor Haberlandt en 1902, quien propuso la teo- cultivo y el rgano a desarrollar. En la fase dera de que todas las clulas vegetales tienen realizacin, la clula sufre las sucesivas divi-la capacidad de regenerar plantas completas. siones para formar el rgano determinado.Haberlandt no lleg a demostrar su hiptesis A partir de la siembra in vitro de diferentes ex-debido a que no pudo lograr la divisin celu- plantes relativamente grandes y en condicio-lar. Los medios de cultivo que empleaba no nes de cultivo adecuadas, puede inducirse laincluan reguladores del crecimiento debido a formacin de nuevos rganos de manera direc-que esos compuestos eran an desconocidos. ta, sin la formacin de callo. Si la formacin esLos avances en el cultivo de tejidos vegetales de brotes, races o flores se denomina organo-fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, Whi- gnesis directa. Si en cambio se induce la for-te pudo mantener, en forma ilimitada, el creci- macin de embriones somticos, este procesomiento de races en medios lquidos a partir de se denominar embriognesis directa (Figs. 1 ypices de tomate. Al mismo tiempo se identi- 3). Si por el contrario, a partir de la siembra defic el cido indol actico (AIA), que posibilit un explante in vitro se observa la proliferacinel mantenimiento indefinido de callos de za- de clulas en forma desordenada y sin ningunanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se funcin predeterminada, se iniciar la produc-descubri el efecto de la leche de coco como cin de callos o suspensiones celulares (Figs.estimulante de la formacin de callo sobre el 2 A y 3). La diferenciacin de rganos a partircultivo de embriones de Datura stramonium. de callos, denominada morfognesis indirecta,En 1948 Skoog y Tsui, trabajando con cultivos estar condicionada a la previa formacin dede callo de tabaco, demostraron la existencia los meristemoides. Morfognesis directa o in-de una regulacin qumica en la parte area y directa fueron trminos propuestos por Hicksen la raz. Trabajos posteriores en callos de la en1980.misma especie, con el agregado de cinetina,la primera citocinina descubierta, permitieron 3.- Histologa de la morfognesisdemostrar que la diferenciacin de brotes, ra-ces o de ambos, era regulada por el balance de Despus de 48 horas de realizada la siembraauxinas/citocininas. del explante en el medio de cultivo adecuado,26 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

28. Figura 1: A-F embriognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriognesis somtica en di-ferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 deBAP. B-D-F, embriognesis somtica obtenida en diversos cultivares de Prunus sp a partir de embrioneszigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin con una previa induccin en MS+ 2 mg l-1 de 2,4-D. Las reglillas representan 5 mm.a partir de una clula epidrmica o del mesfilo renciacin de los nuevos rganos. Este tipo defoliar, como ocurre en las conferas, se suce- meristema puede iniciarse en forma directa, aden una serie de divisiones mitticas. As se partir de clulas diferenciadas pertenecientes apueden observar, a travs del estudio histolgi- un explante cultivado in vitro, o indirectamente,co, pequeas masas de clulas que contienen a partir de una clula o grupo de clul