Bioquimica Ultima
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8/18/2019 Bioquimica Ultima
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Introducción:
La glucólisis es una vía importante del metabolismo humano debido a que es
una manera rápida de generar energía para los procesos vitales, sin embargo,
esta vía por sí sola no completa los requerimientos energéticos para las
grandes formas de vida multicelulares. Dada la limitación energética de la
glucólisis, las células poseen otras vías complementarias para producir más
energía a partir de los productos generados en la glucólisis: el ciclo de rebs !
la cadena respiratoria. "stas dos vías generan más energía con el piruvato
producido al #nal de la glucólisis ! los equivalentes reductores que se dirigen al
ciclo de $rebs ! a la cadena respiratoria respectivamente. In vivo, estas vías
contienen diferentes tipos de reacciones% de los tipos más importantes en ellas
son las reacciones de ó&ido reducción, que son el pilar fundamental de la
cadena respiratoria. 'ara esta práctica, se estudiarán una en(ima de la
glucólisis, una del ciclo de rebs ! componentes de la cadena respiratoria: la
lactato deshidrogenasa, la succinato deshidrogenasa ! el citocromo ) con la
citocromo o&idasa. "n general para evidenciar el transporte de electrones enlas reacciones de ó&ido.reducción que catali(an estos componentes, se
utili(arán indicadores*a(ul de metileno ! parafenildiamina.
+betivos:
-islar las en(imas ! los citocromos lo meor posible
)omprobar la actividad ó&ido reducción de los componentes aislados
Interpretar correctamente cada tubo preparado
esultados:
"&p. /0 /1 /2 /3 /4 /5 /6 /7LD8 /rans. -(ul
claro
-(ul
claro
-(ul
re!
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re!
9 9 9
D8 Decol
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Dec.
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9
)I/ epia /rans. café salmó
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a
claro
9Discusión de resultados
Descripción del sistema de reacción general de la deshidrogenasa succínica:
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"n este e&perimento se busca observar la reacción de ó&ido reducción que
sucede en presencia de la deshidrogenasa succínica ! el succinato. La
deshidrogenasa succínica catali(a la conversión de succinato a fumarato con la
intervención del <-D que act=a como el agente o&idante en la reacción. 'ara
que la en(ima contin=e reali(ando el proceso catalítico, su cofactor en forma
reducida debe o&idarse, por lo que debe e&istir una especie química que recibaesos electrones que el <-D81 posee% In vivo, el aceptor #nal es el o&ígeno, pero
para evidenciar la reacción, se usará otro aceptor, el a(ul de metileno, el cual
al reducirse pierde la coloración por la que es nombrado. 'ara evitar que el
aceptor #nal sea el o&ígeno *!a que el e&perimento se reali(a en condiciones
aerobias> se a?ade una capa de aceite para evitar que el o&ígeno se
introdu(ca al sistema ! evite la decoloración del a(ul de metileno que es usado
como indicador.
'ara algunos de los tubos, se a?ade además malonato de sodio, que dada su
similar estructura respecto al succinato, act=a como un inhibidor competitivo.
"sta =ltima aseveración se demostró mediante la adición de este reactivo adistintas concentraciones en los tubos.
/ambién se usó agua destilada para completar un volumen de 2 mL para cada
tubo.
Interpretación de los tubos del e&perimento de deshidrogenasa succínica:
/ubo 0
)ontenía succinato de sodio, a(ul de metileno, agua, la en(ima D8 ! aceite
vegetal. 'or lo comentado en la descripción general, teóricamente se esperaba
una decoloración del a(ul de metileno por la presencia tanto de la en(ima
como del sustrato. "&perimentalmente se observó la decoloración del tubo al
color del e&tracto*roo sangre>.
/ubo 1
"ste tubo actuó como un testigo, !a que contenía agua, a(ul de metileno,
succinato de sodio ! aceite. La falta de la en(ima evidenció que la reacción no
se lleva a cabo, o si se lleva a cabo, esta tarda demasiado tiempo*lo que es
contraproducente en organismos vivos>. e mantuvo el color a(ul re! que
presenta el a(ul de metileno en su forma o&idada.
/ubo 2
"n este tubo se a?adió la en(ima, el a(ul de metileno, agua ! aceite, pero no
sustrato. La reacción se llevó a cabo pero no se observó una decoloración
considerable. "sto sucedió por la presencia del sustrato en el e&tracto que
contenía la en(ima, debido a que era un e&tracto recién elaborado ! poco
tratado.
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/ubo 3
)on la adición de succinato de sodio, en(ima D8, a(ul de metileno, aceite !malonato de sodio*0mL>, este tubo es el primero de los tubos que evidencian el
efecto de inhibición competitiva. e observó poca decoloración en el tubo, !
fue además el menos decolorado de los tubos que contenían el inhibidor.
/ubo 4
"ste tubo contenía, succinato de sodio, agua, aceite, D8, a(ul de metileno !
malonato de sodio*@.4 mL>. "n el tubo se observó una ligera decoloración,
observándose un color menos intenso que el tubo 3.
/ubo 5
"ste tubo contenía todo el sistema como los dos anteriores, ! @.14 mL de
malonato de sodio. e notó una ma!or decoloración en comparación con los
tubos 3 ! 4
/ubo 6
"n este tubo ! en conunto con los resultados obtenidos en los tubos 3,4 ! 5, se
comprueba el tipo de inhibición que presenta el malonato de sodio respecto al
succinato de sodio. "n este tubo se adicionó la en(ima, el sustrato * 3 veces
más concentrado que el inhibidor>, el a(ul de metileno, agua, aceite, ! el
inhibidor*@.14 mL>% se observó una considerable decoloración, equiparable a ladel tubo 0. "n la serie de tubos que contenían inhibidor, a medida que se
aumenta la concentración del inhibidor se observa una disminución de la
decoloración , lo que indica que la velocidad catalítica es menor% además, en el
tubo 6 se observa que a ma!ores concentraciones de sustrato, a pesar de la
presencia del inhibidor, la velocidad de reacción no se ve drásticamente
afectada. "sto indica, que ha! una competencia por el sitio catalítico de la
en(ima, ! que a ma!ores concentraciones de inhibidor respecto al sustrato, la
reacción puede verse completamente detenida.
"&perimento deshidrogenasa succínica: "l tubo 0 se observa en el e&tremo
derecho, ! el 6mo en el e&tremo i(quierdo.
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Descripción del sistema general de la deshidrogenasa láctica
"n el e&perimento dise?ado se busca la observación de la catálisis de la
Lactato deshidrogenasa sobre el lactato. La reacción produce el cambio de
lactato a piruvato, con el uso de un A-D como coen(ima que se ve reducido enel proceso. 'ara poder continuar el proceso de catálisis, el A-D8 *forma
reducida del A-D> debe ceder esos electrones a un aceptor. "l aceptor #nal de
los electrones en la cadena respiratoria In vivo es el o&ígeno, pero para
con#rmar que la reacción se lleva a cabo, se introduce un colorante indicador
que acepta los electrones al #nal del proceso: el a(ul de metileno. 'ara evitar la
interferencia del o&ígeno, se utili(a aceite, que evita la entrada del o&ígeno
dentro del sistema de reacción. La reacción que se lleva a cabo es reversible,
por lo que para evitar la reconversión de piruvato a lactato ! el consiguiente
uso del A-D8 para ello, el piruvato formado se hace reaccionar con )A,
formando una cianohidrina que no es blanco de catálisis para la LD8. e utili(ó
también agua para completar un volumen de reacción igual para cada tubo de
4.2 mL
Interpretación de los tubos:
/ubo 0
"ste tubo contenía a(ul de metileno, aceite, lactato, A-D, en(ima LD8 ! )A.
e observó la decoloración casi total del tubo rápidamente, !a que todos los
componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, como se e&plicó en la
descripción del sistema general, estaban presentes.
/ubo 1
"ste tubo se decoloró medianamente ! hasta un a(ul cielo. "l tubo contenía
LD8, agua, a(ul de metileno, aceite, )A ! lactato. La falta de la coen(ima A-D
debió hacer que el tubo se quedara en el color a(ul re! del a(ul de metileno,
pero las condiciones del e&tracto recién preparado indican que había presencia
de la coen(ima en el e&tracto.
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/ubo 2
"l tubo 2 contenía )A, a(ul de metileno, agua, A-D, aceite ! LD8. e observó
una coloración similar a la obtenida en el tubo 1, lo que indica que se llevó a
cabo la reacción% sin embargo, por la falta de sustrato en el tubo se esperaría
que el tubo quedara en su color original. La e&plicación a este evento es similar
a la del tubo 1, esto es, debido a las condiciones del e&tracto recién preparado
que a=n contenía sustrato.
/ubo 3
"n este tubo se tenían todos los componentes del sistema, a e&cepción de la
en(ima. "l tubo no presentó decoloración alguna durante todo el tiempo de
reacción. - pesar de que se a?adió A-D del e&tracto, no se llevó a cabo la
reacción como podría pensarse por la frescura del e&tracto. "sto se e&plica por
el tratamiento que recibió el e&tracto del A-D. "ste e&tracto se puri#có usando
temperaturas de ebullición del agua *apro&imadamente B1C)> por un periodo
de 4 min% a esta temperatura ! tiempo, se provocó la desnaturali(ación de la
en(ima, volviéndola inactiva.
/ubo 4
)arente de )A, el tubo 4 presentó una coloración a(ul re!, lo que indica que el
a(ul de metileno no se reduo. "ste resultado indica que el proceso catalítico de
la en(ima se dirigió completamente hacia la formación de lactato, como sucede
In vivo en condiciones anaerobias en la vía de la glucólisis. "l A-D8 se reo&ida
en la conversión de piruvato a lactato, ! no ha! transporte de electrones por
medio de la cadena respiratoria.
"&perimento lactato deshidrogenasa. "l tubo 0 se encuentra en el e&tremo
i(quierdo, ! siguiendo el orden numérico, el tubo 4 se encuentra en el e&tremo
derecho.
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)itocromos ! citocromo o&idasa
/ubo 0
"n el primer tubo se adiciono el D89)I/ ! la p9fenilendiamina ! agua por lo
cual la reacción que pudo haberse formado es que la p9fenilendiamina se
o&idara debido al protón del citocromo ), sin embargo no se podría dar en
evidencia que esta se lleve a cabo por que no se agregó ning=n indicador *-lfa9naftol>.
"n el tubo 1 tenemos que se agregó agua ! la p9fenilendiamina, al tener solo
estos 1 compuestos no se forma ninguna reacción.
"n el tubo 2 tenemos la presencia de un inhibidor *)A>, agua, D89)I/, la p9
fenilendiamina, estos compuestos reaccionaron pero de una forma menos
debido al inhibidor, sin embargo como en el tubo 0, no se adiciona ning=n
indicador q nos de fe de que la reacción este sucediendo ! de que intensidad, o
dicho de otra forma, la formación de la p9fenilendimina.
"n el tubo 3 tenemos agua ! D89)I/, con estos 1 compuestos no se reali(a
ninguna reacción de o&idación, esto es porque el D89)I/ no tiene a quien
pueda o&idar.
"n el tubo 4 tenemos agua, D89)I/, p9fenilendiamina ! un indicador que
formara un compleo llamado a(ul de indofenol, que se forma a partir de la p9
fenilendiamina que se o&ida ! se vuelve p9fenilendimina ! esta con el indicador
alfa naftol se produce una reacción de condensación por lo que nos da como
resultado el a(ul de indofenol.
"n el tubo 5 tenemos agua, p9fenilendiamina ! el indicador alfa naftol, lo quehace falta para que se lleve a cabo la reacción es el agente o&idante, que es el
D89)I/, por lo que no se lleva a cabo ninguna reacción de o&idación.
"n el tubo 6 tenemos el indicador alfa naftol, el D89)I/, p9fenilendiamina ! un
inhibidor es a?adido al tubo *)A> por lo que la reacción no se lleva tan
e#ca(mente como en el tubo 4, !a que el )ianuro reacciona con el citocromo,
evitando la o&idación de la p9fenilendiamina.
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"n el tubo 7 tenemos agua, alfa naftol, p9fenilendiamina ! el inhibidor, lo
=nico que hace falta para llevar a cabo la reacción es, nuevamente como en el
tubo 5 es el agente o&idante por lo que la p9fenilendiamina no se o&ida.
Tu experimento itchy bitchy
)onclusiones
La lactato deshidrogenasa catali(a una reacción de ó&ido9reducción sobre el
lactato
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La uccinato deshidrogenasa catali(a una reacción de ó&ido reducción sobre el
succinato
Los citocromos pueden actuar como agentes o&idantes
"l Ealonato de sodio es un inhibidor competitivo de la uccinato
deshidrogenasa
"l )A inhibe a la deshidrogenasa succínica ! al citocromo c.
Los e&tractos crudos poseen a=n sustratos ! en(imas, por lo que puede
producirse reacción sin adición de más reactivos
"l A-D funciona como coen(ima de la lactato deshidrogenasa
"l <-D es un grupo prostético de la succinato deshidrogenasa.
Fibliografía:
Albert L. Lehninger “Bioquimica” Ediciones Omega Octava reinmpresion 1984.
Van Holde,K.E.; Mathes, !.K.; Ahern, K.".; #Bioqu$mica#; Editorial %earson, &era Edici'n; Es(a)a
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