bacterias anaerobias

BACTERIAS ANAEROBIAS DE IMPORTANCIA CLINICA

Evelyn RodríguezFacultad de Microbiología,

UCR

¿Por qué son importantes?

Flora bacteriana humana predominante

Causan infecciones e intoxicaciones serias, con frecuencia fatales

Patógenos oportunistas

En asocio con infecciones por aerobios

Requerimientos de O2 para crecer

Aerobios: 15-21%Microaerofílicos: 5-10%Facultativos: 0-21%Anaerobios: 0%. Según puedan soportar O2– Obligados: < 0.05%– Moderados: 0-5%– Tolerantes: 0---?%

Toxicidad del oxígeno

O2 + e- → O2- radical superóxido

O2 - + e- + 2 H+ → H2 O2 Peróxido de

hidrógeno

H2 O2 + e- + H+ → H2 O + OH. Radical hidroxilo

(los macrófagos y PMN usan esos derivados para destruir patógenos)

Protección contra los tóxicos del O2

Superóxido dismutasa:2O2

- + 2 H+ → H2 O2 (dismunye el radical superóxido )

Catalasa:2 H2 O2 → 2 H2 O + O2

Peroxidasa:H2 O2 + Sust. reducido → H2 O + sust oxidado

Vitamina E, C, glutatión

Anaerobios y Presencia de O2

Los e-disponibles para reacciones metabólicas se dirigen a reducir el O2 :

E disponible para síntesis Efecto bacteriostático(reversible)

Se forman los derivados tóxicos Efecto bactericida

Flora normal predominante en humanos

PielTracto respiratorioBocaIntestino

UretraVagina

PropionibacteriumBG- CG-CG+, CG-, BG-Bacteroides, Clostridium,Bifidobacterium Peptostretococccs.Bacteroides, BG-Lactobacillus, Peptostreptococus

Infecciones por anaerobios

Aprox. 99% de tipo endógenoAsociadas a una mucosa cerca del sitio anatómico de la infecciónLlegada de anaerobios a sitio diferente, muerte de los anaerobios muy estrictos, crecimiento de facultativos y predominio de anaerobios menos estrictosFactores de virulenciaFlora mixta: 3-4 anaerobios

Factores que predisponen las infecciones por anaerobios

Trauma – De piel– De membranas mucosas

Irrigación sanguínea deficienteNecrosis de tejidosDisminución del potencial de Redox

Sospechas de infección por anaerobios

Historia de mordeduras, cirugías, extracciones dentales, otrosInfección en proximidades de superficies mucosasTratamiento previo con aminoglicósidos, trimetoprín-sulfa, algunas quinolonasOlor fétidoPresencia de gas Coloración negruzcaFlorescencia roja con UVPresencia de gránulos de azufreMorfología en tinción de GramAusencia de crecimiento en aerobiosis

Frecuencia de anaerobios en muestras clínicas

BacteroidesCocos G+PropionibacteriumClostridiumFusobacteriumOtros

Anaerobios de importancia clínica

Tinción de Gram

PeptostreptococcusPeptococcus

Cocos

Clostridium

Con esporas

Actinomyces BifidobacteriumEubacterium Lactobacillus

Propionibacterium

Sin esporas

Bacilos

Gram positivos

Anaerobios de importancia clínica

Tinción de Gram

Veillonella

Cocos

BacteroidesFusobacteriumPorphyromonas

Prevotella

Bacilos

Negativa

1. Selección de muestras

Todas las muestras que se contaminen con las bacterias de la flora normal deben ser rechazadas:– Torunda de garganta o nasofaringe o cualquier sitio

de la mucosa oral– Esputo expectorado– Lavados bronquiales– Torundas vaginales, cervicales o uretrales– Torundas de abscesos– Heces o torundas rectales* excepto para C. difficile

Aspirados

Cualquier aspirado de un sitio normalmente estéril es aceptable.Desinfección adecuada del sitiocon aguja y jeringa. NUNCA con torundaSe debe expulsar el aire que quede en la jeringa (cuidado con aerosoles)Transporte rápido al laboratorio (tapón de hule estéril) o inoculación de medios PRAS

Abscesos

Con aguja y jeringa, NO con torunda.Si son profundos deben ser aspirados con catéter o por procedimientos quirúrgicosSi son orales, se aísla la zona con algodón y se limpia con torunda y alcohol. Luego se aspira con aguja

Ulceras superficiales

Desinfección del sitio y debridación del tejido expuesto (por flora aerobia contaminante)Colección del material en la zona profunda de la úlceraSi la úlcera es purulenta, se puede aspirar el material

Desinfección deheridas

Toma de muestra

Con torunda Con jeringa

Con cureta

Secreciones del tracto respiratorio

Las colectadas a través de la cavidad oral NO son aceptables para anaerobios

Se requieren procedimientos quirúrgicos o invasivos con agujas o catéteres que lleguen hasta los sitios deseados

Muestras del Tracto Genitourinario

Aspiración suprapúbica (orina)Aspiración de abscesosCuldocentesis (para obtener muestras del saco vaginal)Succión de la pared endometrialProcedimientos quirúrgicosLavados (no muy adecuada)

Tejidos

Cualquier muestra de tejido obtenida por cirugía es adecuada para anaerobios

pequeña, se debe inocular en un medio sin oxígeno

grande, se coloca en placa de Petri y se procesa rápido. Si se dispone de bolsas de anaerobiosis se puede tardar más tiempo

2. Transporte de muestras

Siempre a temperatura ambiente

Nunca en la jeringa:Con aguja es muy riesgosoSin aguja se puede perder el materialSi el tiempo es corto se puede usar tapones de hule

Medios de transporte PRAS (ideal)

En medios detransporte

En mediosPRAS

Torundas en mediossemisólidos

3. Procesamiento de muestras

Idealmente en cámara anaeróbicaExamen macroscópico de la muestra:– ¿Es adecuada? ¿Se ha desecado?– ¿Tiene mal olor?– ¿Fluoresce con luz UV?– ¿Se observa el tejido necrótico?– ¿Se ven gránulos de azufre?– ¿Es purulenta?


Examen microscópico:– Fijación del frotis con metanol 30 seg y no con calor– Tinción de Gram con fucsina básica 0.5%

Observaciones:– Tipo y número de microorganismos– Identificación presuntiva en algunos casos– Sugiere el tipo de medios de cultivo a emplear– Presencia de leucocitos *– Control de calidad

BacteroidesPrevotella

Porphyromonas

Fusobacterium

Clostridium

PropionibacteriumActinomyces

BifidobacteriumEubacterium

Veillonella

Peptostreptococcus


Microscópico Macroscópico

Ex directo En medio líquido(PRAS)

AS suplementado con Vit K y heminaMedios selectivos

según tinción de Gram

Medios para aerobios

En Platos

Muestra

Incubación anaerobia

Medios selectivos para anaerobios

BBE: grupo Bacteroidesfragilis y BilophilaGentamicina (inhibición de

aerobios)Bilis (inhibición de otros

anaerobios)Esculina y hierro

(colonias negras de B. fragilis)

AS BBEGrupo B. fragilis

BBE

B. fragilis vrs. B. vulgatus Bilophila


KVLB: Bacteroides y Prevotella

– Kanamicina (inhibición de aerobios y otros anaerobios G-)

– Vancomicina (inhibición de G+)

– Sangre lisada (pigmento de Prevotella)

KVLB ASPrevotella


PEA: crecimiento de anaerobios– Feniletilacohol (Inhibición de aerobios y del

“swarming”, – La morfología de anaerobios es similar a la de AS

Clostridium septicum

4. Inoculación

Previa homogeneización de la muestra

5. Incubación

Cámara de anaerobiosisIncubadora, para medios PRAS (“sellados”)Evacuación y reemplazoJarra o bolsas de anaerobiosis

2 a 3 hr para lograr anaerobiosisNUNCA abrir la jarra antes de 48 hrIncubar de 5 a 7 días, hasta 3 semanas (Actinomyces)

¿Qué sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?

Mal olor: FusobacteriumClostridium,Porphyromonas

Morfotipos coloniales presentes en anaerobiosis y ausentes en aerobiosis

“Swarming” extenso C. tetani, C. septium, Clostriium sp.


Doble hemólisis en AS C. perfringens

Fluorescencia roja con UV Prevotella, Porphyromonas


Colonias café oscuro Prevotella, PorphyromonasPeptostreptococcusniger

Ennegrecimiento y buen crecimiento en BBEgrupo Bacteroidesfragilis


Colonias lipasa + en AYHC. botulinum, C, sporogenes, C. novyi

Colonias lecitinasa + en AYHC. Perfringens y otros

6. Identificación

Aislamiento en cultivo puro

1. AS + CO2 2. AS + anaerobiosis

Prueba detolerancia al O2

Morfología colonialTinción de Gram

Si 1>2: facultativo

Si 1<2: anaerobio

Identificación presuntiva: B, CB G+

SI: Clostridium

+: ActinomycesPropionibacterium

Eubacterium

doble hemólisisC. perfringens

irregularswarmingcol. gdes

Clostridium

regularsin doble hemólisisActinomy, Propion.

Lactobacillus

-: Morfologia colonial

NO: catalasa

esporas

Morf. Gram

Morf. Gram

Identificación presuntiva: B G- o variables

Sí: Clostridium

PorphyromonasPrevotella

SensibleClostridium

ResistenteBG-:

FusobacteriumBacteroides

NO: sensib a vancomicina

NO: Fluroscencia UVo colonias negras

esporas

Morf. Gram

Identificación presuntiva: cocos

PeptostreptococcusPeptococcus niger

Gram positivos

Veionella

Gram negativos

Morf. colonial

Importancia de la identificación presuntiva

Puede indicar la fuente probable de una infección:– Bacteremia por :

Clostridium: problemas de colonPorphyromonas: lesiones de cavidad oralBacteroides: origen intestinal

Ayuda en la escogencia de antibióticosBase de datos que permita conocer la importancia de los agentes en determinados procesos

Identificación presuntiva (nivel II)

Morfología colonialTinción de GramSusceptibilidad a Kanamicina, VancomicinaColistinaCatalasa, indol, nitratos, urea,movilidad

Identificación presuntiva (nivel II)

Grupo Kanamicina1000ug

Vancomicina5ug

Colistina10ug

Gram - V R* VGram + V S** R

B. Grupo fragilis R R RB. ureolyticus *** S R SFusobacterium S R SPorphyromonas R S R

Prevotella R R RVeillonella S R S

Identificación presuntivanivel II: CG+

Sodio polianetil sulfonato (SPS) 10000 ug

Peptostreptococcus anaerobius SOtros cocos G + R

Identificación definitiva

Tubos convencionales (PRAS)Por pruebas bioquímicas miniaturizadas– API 20A

Sistemas de identificación basados en EZ preformadas:– API ID 32, RAPID ANA II, Vitek ANI Card

Cromatografía de gasesCromatografía de gas líquido alta resolución (análisis de ác. grasos celulares)

Tratamiento de las infecciones por anaerobios

1. Limitar la proliferación de anaerobios:Drenar, debridar, eliminar obstrucción, liberar el gas atrapado, mejorar la circulación, oxigenar, cirugía.

2. Impedir que la infección se extienda a tejidos sanos:

Tratamiento con antibióticos.3. Neutralizar las toxinas.

TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO

Generalmente empírico

Con base en el sitio y tipo de infección:– Endocarditis: sólo bactericidas

– Abscesos cerebrales: no clindamicina porque no atraviesa

barrera hematoencefálica

Penicinilinas, Cefalosporinas, Imipenem, Clindamicina,

Metronidazol, Cloranfenicol

PSA

PSA Bacterias anaerobias: ¿Cuándo debe hacerse?

NO de rutinaSi el m.o. aislado es conocido como “resistente”:

– grupo Bacteroides fragilis - Clostridium perfringens– B. gracilis - C ramosum, C. innocum– Fusobacterium - C. clostridioforme– Bilophila

Si la infección persiste después de tratamiento empírico.Si no hay datos precedentes de sensibilidad (c/6 meses)En infecciones severasEn tratamientos prolongadosEvaluación de nuevos antimicrobianos

Resistencia múltiple en CR, grupo Bacteroides

Aislamientos: 34Antibióticos probados: 16Resistencia a número frecuencia

14 AB 1 3%12 AB 2 6%11 AB 1 3%9 AB 1 3%8 AB 5 14%

10/34 (30%) de las cepas fueron resistentes a la mitad de los AB probados

PSA Bacterias anaerobias Idealmente, según tipo de muestra

Infecciones del SNCEndocarditisOsteomielitisBacteremiaImplantesInfección de articulaciones

Métodos PSA-Bacterias anaerobias

Dilución en agar: REFERENCIA (NCCLS)– agar Brucella, con sangre lisada y vitamina K.– una placa para cada antibiótico en cada

concentración– Inóculo estandarizado como KB– incubación anaerobia– no es práctico– interpretación en tablas específicas para anaerobios– Caro, difícil.– No se hace en CR

Métodos PSA-Bacterias anaerobias: Dilución en caldo

Micro o macrométodosVarios caldos:

– Caldo Brucella + hemina + vit K– West-Wilkins– ICC, otros

Pocillos de microdilucióncomerciales y determinar la MIC Sólo si hay buen crecimiento en el control sin AB

Sistemas automatizados (VITEK)

Métodos PSA Bacterias anaerobiasEpsilométrico o E test

Inóculo 0,5 McFarlandMedio de cultivo AS u otrosUna tira y una placa por

antibióticoIncubación: anaerobiosis 24-

48-72 hrsInterpretación: MIC en la

misma tiraCaro ($300 c/paq de 100ud)

----_

Métodos PSA Bacterias anaerobiasATB ANA (casa Biomerierux)

( estudios recientes lo equiparan al método de referencia, No validado)ATB impregnado en las celdas

inóculo: 3 Mc FarlandIncubación: anaerobiosis 24-48 hInterpretaciInterpretacióón: dos n: dos concconc..

–– si crece en ambas es Rsi crece en ambas es R–– si crece en la mayor es Isi crece en la mayor es I–– si no crece en ninguna es Ssi no crece en ninguna es S

No todas las bacterias crecen bien, en cuyo caso NO se puede interpretarCaro? ($10 cada tira).

Importancia clínica: BG+esporulados (Clostridium)

1. Tétanus: C. tetaniAmpliamente distribuido en el suelo: hasta en 54% (7/% en Meseta Central, 43% en UCR).Presente en aguas, sedimentos e intestinos de animalesContaminación de la herida con esporasContaminación fecal del cordón umbilical (Tétanos neonatal)Disminución del potencial de oxidorrecducciónGerminación y producción de tetanospasmina, Inhibición de neurotransmisores y rigidez muscular

C. tetani, cont.

P.I.:7 días (1-54)Síntomas en mandíbula (risa sardónica), cuello, espalda, faringe, dificultad respiratoria y muerte.Vacuna DPTDiagnóstico: clínico*, de lab: BG+, esporulados(pocas veces), sarwming en AS, toxigenicidad en ratónTx: toxoideCasos en CR: sí, (pocos), tétano neonatal


2. Gangrena gaseosa o mionecrosis:C. perfringens (80%), C. hystoliticum, C. septicum, C. novyi, C. bifermentans.Heridas contaminadas, traumas o cirugíasInvasión y necrosis licuefactiva de músculoProducción de exotoxina mionecrótica potente y de rápida acciónDiagnóstico: BG+, esporulados o no en las muestrasDebridación AmputaciónNo hay registros en CR

Importancia clínica: BG+ esporulados(Clostridium)

3. Botulismo: C. botulinumDistribución mundial en suelos, ambientes acuáticos, e intestinos de aves y mamíferos.Conglomerado de especies fenotípicamentediversasProductoras de la exotoxina más letal que se conoce: neurotoxina botulínica (1 X 108 LD 50ratón/mg)

C. botulinum, cont.

parálisis flácida aguda bilateral que inicia en cara, cabeza, faringe y desciende simétricamente a tórax y

extremidadesmuerte por fallo respiratorio (parálisis de la lengua,

músculos de faringe, diafragma e intercostales)Diagnóstico:– Identificación de la toxina específica en:

SueloHecesAlimentoAspirado gástricoSuero

Cultivo de C. botulinum e identificación de toxina

1. Botulismo clásico

Cocción inadecuada

Sobrevivencia de esporas

Germinación y multiplicaciónProducción de toxina

Ingestióm de toxinapreformada en alimentos

Alimentos en conserva (hortalizas y frutas), pasteles, papas asadas (USA, tipoA)

Embutidos, Europa, tipo B

Pescado, Japón, tipo E

PI 12PI 12--36 h, hasta d36 h, hasta dííasas INTOXICACION

2. Botulismo intestinal

Ingestión de esporas

Germinación y multiplicaciónen intestino

Producción de toxina en intestino

INFECCIÓN, con producción de toxina

2. Botulismo intestinal

Forma más común de la enfermedad (USA)Niños < 1 año (94% < 6 m meses) o adultos con alteraciones en anatomía y flora intestinalEstreñimiento, intranquilidad, pérdida de control de cabeza, hipotonía (bebé laxo)fallo respiratorio.

benignaMuerte repentina

5% de casos de muerte súbita

Letalidad de 1% en hospitalizados

3. Botulismo por heridas

Esporas en suelos

Germinación y multipli-cación en herida

Producción de toxina in situ

Similar a tétano Se ha relacionado con drogas endovenosas

Clostridium boulinum, Costa Rica (23%)

Jicaral

Barranca

Mata de Limón

Pitahaya

Paquera

Chirripó

Parismina

Suelos toxigéncicos

Aislamientos

¿Qué pasa en Costa Rica?

¿Casos en CR?¿Condiciones para que se den?¿Uso de conservas en CR?¿Papel de C. perfringens en suelos?

58% de las cepas con efecto inhibitorio sobre C. botulinum2 cepas de 38 inhibían la producción de toxina


4. Tóxicoinfección: C. perfringensPatógeno más abundante en la naturalezaPresente en casi todo material expuesto al polvo, incluyendo alimentos (< 5 x 102

esporas/día)103 a 108 UFC/g de heces en niños desde 6 meses hasta adultos

4. Tóxicoinfección: C. perfringens(cont.)

En CR: – 88% en suelos – 46 % de carnes cocidas en restaurantes – 44 % de embutidos a base de carne de

cerdo (chorizo, salchichón y mortadela)– 93% de ganado vacuno, 55% de carne en

canal, 61% a 75% de carne procesada o molida en el expendio y 3 % restaurantes


Cocción inadecuada

Sobrevivencia de esporas

Germinación y multiplicación

Ingestión de 105-108 cél/g

Esporulación en intestino

Carnes y derivados

Recalentamiento inadecuado

enterotoxina Diarrea, cólico y náuseas


Aparición repentina de cólicos, diarrea y náusea (generalmente sin vómitos ni fiebre)PI: 7 a 15 hr.Leve, de corta duración (menos de 24 hr)Segunda causa de enfermedad asociada a alimentos en USA, sólo precedida por Salmonella. Diagnóstico:

– Datos epidemiológicos sugestivos– Aislamiento de al menos 105 cél/g alimento o 106/g en heces – Determinación de enterotoxina en heces o en cepas aisladas


5. Diarrea asociada a antibióticos, colitis seudomembranosa, diarrea nosocomial : C. difficile

AB:ampicilina, clindamicina y cefalosporinasAislado de suelos, paja, heces. Parte de la flora normal – 50% en niños < 1 año– 3% en niños > 2 años– 1.9% (Suecia) a 15.4% (Japón) en adultos– 21% en pacientes hospitalizados con alta

prevalencia de C. difficile, 1/3 con síntomas.

C. difficile, cont.

Proliferación de C. difficile por alteración de la flora normal.Produción de toxinas A y B (enterotoxina y citotoxina) y factor de alteración de la motilidadDiarrea y necrosis del colon

Importancia clínica: BG+ no esporulados

1. Actinomycosis: Actinomyces, Bifidobacterium, Eubacterium y Propionibacterium)

Infecciones oportunistas, parte de flora normalInfección granulomatosa crónica, con fístulas que drenan en la superficie pus y gránulos de azufre.Común en región orofacial, también en cerebro, región pleuropulmonar y órganos genitalesMorfología microscópica en material purulento: Dxpresuntivo

Importancia clínica: BG+ no esporulados

2. Vaginosis bacteriana: Mobiluncus(Bacteroides, Peptostreptococcus, Gardnerella)Flujo anormal y maloliente, infección más profunda hasta útero.Partos prematuros y otras complicacionesDe difícil cultivo, morfología microscópica característica (BG positivos curvos)

3. Abscesos, bacteremias, infecciones de heridas, peritonitis, etc.

Importancia clínica: BG-

Grupo Bacteroides fragilis, Prevotella, Porphyromonas y Fusobacterium.Generalmente de la flora normalInfecciones mixtas:

– Tejidos blandos– Orales, abdominales, respiratorias, etc– Abscesos– Peritonitis– Bacteremias– Infecciones sistémicas

Grupo Bacteroides fragilis

Patógeno más frecuente en infecciones humanasFuente usual: flora normal fecalAbscesos cerebrales, pulmonares, infecciones intraabdominales e intrapélvicas, peritonitis.20 a 30% de las infecciones por anaerobios25% de los aislamientos de anaerobios en el HSJD: 35% de abscesos, 30% de secreciones, 17% de cavidad abdominal.

Importancia clínica: Cocos

Gram positivos:– Peptostreptococcus anaerobius– Peptococcus niger ( > importancia veterinaria)– Abscesos cerebrales,orales, pulmonares,

genitales, etc.

Gram negativos:– Veillonella (habitante de cavidad oral).

Infecciones en cabeza, cuello, dentales y pulmonares, heridas por mordeduras

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