Avances en la Síntesis Enzimática Avances en la Síntesis Enzimática

de Oligosacáridos Prebióticosde Oligosacáridos PrebióticosOskarOskar Bañuelos, José M. Corral, Carmen Bañuelos, José M. Corral, Carmen RonchelRonchel, ,

José L. José L. AdrioAdrio;; Javier VelascoJavier Velasco

BiotecBiotec 2004, Oviedo 2004, Oviedo

Probióticos y PrebióticosProbióticos y Prebióticos

* 1013 células* 30.000 genes

¿Tiene algún efecto beneficiosopara la salud?

¿Se puede modular?

* 10% Hombre/90% bacteria* 1014 células procariotas* > 400 especies distintas* 70.000 genes procariotas

FLORA INTESTINAL

EstómagoEstómago Intestino delgadoIntestino delgado ColonColon8

6pH4

2Tiempo de Tránsito

15 - 20 min 24- 72 horas

102-103 /ml 1011-1012 /ml

LactobacillusStreptococcusLevadurasH. pylori

Lactobacillus, StreptococcusEnterobacterias, BifidobacteriasBacteriodes, Clostridium, levadurasPeptococcus, Ruminococcus,Butyrovibrio, Fusobacterium, Eubacterium, Peptostreptococcus,Atopobium

Digestion, almacenamiento Absorción de agua, minerales, ácidos orgánicos

Proteolisis y sacarolisisProducción de toxinas y ácidos grasos de cadena corta

2- 3 horas

104-108 /mlLactobacillus, StreptococcusEnterobacterias, BifidobacteriasBacteriodes, Clostridium

Absorción de minerales, azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, etc

Proteolisis y sacarolisis parcialProducción de toxinas y ácidos grasos de cadena corta

Flora Típica

Procesos microbianos

Procesos fisiológicos

Fuente: Gibson & Rastall, ASM News Mayo 2004

ALIMENTOS, DIGESTIÓN Y FLORA

Alimentos ricos en Alimentos ricos en proteínasproteínas

Alimentos ricos en Alimentos ricos en fibrafibra

Alimentos conAlimentos conPREBIÓTICOSPREBIÓTICOS

Lactobacillus,

Bifidobacterias

Eubacterium

Fusobacterium, Enterobacterias,Bacteriodes, Butyrovibrio, Enterococcus, Peptostreptococcus, AtopobiumStreptococcus,Clostridium

Peptococcusasacaroliticos

Bacteriodes, asacaroliticos,

Clostridium

Ácidos grasos de cadena corta

Lactato

Vitaminas del grupo B

Toxinas

Carcinógenos

Gas

Fuente: Gibson & Rastall, ASM News Mayo 2004

EFECTOS BENEFICIOSOS

Prebiótico:Prebiótico:

1. No degradado en estómago ni intestino delgado.

2. Transferido al colon intacto.

3. Estimular selectivamente el crecimiento y actividad deBifidobacterias y Lactobacillus.

EFECTOS SOBRE LA MICROFLORAEFECTOS SOBRE LA MICROFLORA

• Aumento en los recuentos fecales de lactobacilos y bifidobacterias.

• Formación de biofilms en la mucosa intestinal.

• Reducción en el recuento de clostridios.

• Incremento en la resistencia a la colonización por patógenos.

• Bloqueo de sitios de unión de patógenos.

Fuente: Cumming JH & MacFarlane, GT British J Nutr. 2002 Suppl 2: 145—151.Elaboración propia

EFECTOS BENEFICIOSOS

EFECTOS DE LA FERMENTACIÓN EN EL INTESTINOEFECTOS DE LA FERMENTACIÓN EN EL INTESTINO

• Producción de ácidos grasos de cadena corta y lactato.

• Descenso en el pH fecal.

• Mejora en la absorción de calcio, hierro y magnesio.

• Estimulación de la proliferación de enterocitos (butirato)

• Aumento en la biomasa fecal

• Aumento en el contenido energético y de nitrógeno fecales

• Ligeras propiedades laxantes

OTROS EFECTOSOTROS EFECTOS

• Protección frente a caries.

• Reducción en el contenido calórico y en IG (Índice Glicémico)

• Posible prevención de cáncer de cólon.

• Indicios de reducción de la concentración de colesterol y triglicéridos en sangre (inhibición de lipogénesis por ac. propiónico?).

Fuente: Cumming JH & MacFarlane, GT British J Nutr. 2002 Suppl 2: 145—151.Elaboración propia.

OLIGOSACÁRIDOS NO DIGERIBLES (I)

AchicoriaPataca INULINA FRUCTO-

OLIGOSACÁRIDOS

Remolacha SACAROSA

Hidrólisiscon inulinasas

Transfructosilacióncon β-D-fructosidasas

PALATINO-OLIGOSACÁRIDOS

GLUCOSIL SACAROSA

Síntesis de palatinosa con

palatinosasintasa

Condensaciónintermolecular

Transglucosilacióncon CGTasa

+MALTOSA

GALACTO-OLIGOSACÁRIDOS

Suero de leche

LACTOSATransgalactosilación con

β-D-galactosidasas

LACTOSACAROSATransfructosilación con β-D-fructosidasas

OLIGOSACÁRIDOS NO DIGERIBLES (II)

MALTO-OLIGOSACÁRIDOS

CICLODEXTRINAS

ISOMALTO-OLIGOSACÁRIDOS

GENTIO-OLIGOSACÁRIDOS

ALMIDÓN SOLUBLEAlmidón

Transglucosilacióncon α-glucosidasa

Transglucosilacióncon CGTasa

Hidrólisis conpululanasa yα-amilasa

Conversión a maltosa conα-amilasa

+ β-amilasa

Conversión aglucosa por

hidrólisis ácidao enzimática

Transglucosilacióncon

β-glucosidasa

Hidrólisis conisoamilasa opululanasa

Hidrólisiscontrolada conα-amilasas

XILO-OLIGOSACÁRIDOSXILANO Hidrólisis controlada con

Endo-1,4-β-xilanasasMateriales

Lignocelulósicos

FRUCTOOLIGOSÁCARIDOS

Sacarosa

Fructosil transferasa

Fructosil transferasa

Fructosil transferasa

Inulina

EndoinulinasaHidrólisis Parcial

EndoinulinasaHidrólisis parcial

EndoinulinasaHidrólisis parcial

Antecedentes

-Micelio de: Penicillium citrinum

Aspergillus sydowii

-Fructosiltransferasa de: Aureobasidium pullulans

Aspergillus oryzae

Aspergillus sydowi

Aspergillus niger

PATENTES: -Procesos

-Enzimas

-Genes...

Screening de la colección de m.o. de Puleva Biotech

Identificación y caracterización de una fructosiltransferasade Aspergillus niger BT18

Optimización de la producción de fructosiltransferasa

Producción de FOS (enzima libre e inmovilizada)

Fructosiltransferasa

SacarosaSacarosa0

H20 G:FG:F = 1= 1

24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 M

kDa

200

116.397.4

66.2

GlucosaGlucosa FructosaFructosa

SacarosaSacarosa0

SacarosaSacarosa0

GlucosaGlucosa 11--KestosaKestosa (GF(GF2)2)

0

0

G:FG:F >1>1

Fructosiltransferasa

Glucose

Fructose

Sucrose

Fructo-oligosaccharides

HPAEC-PAD: High performance anion exchange chromatographyPulse Amperometric Detection (Dionex)

PROPIEDADES PREBIÓTICAS

Fuente de Carbono óptima para las bacterias beneficiosas

Mayor especificidad

Prebióticos dePrebióticos deSegunda Segunda GeneraciónGeneración

Mayor efecto a menor dosis

Menores efectos secundarios(hinchazón, flatulencia)

Mejores propiedades tecnol.(resistencia bajo pH, Tª)

PROPIEDADES PREBIÓTICAS

A menor DP => efecto prebiótico mas rápidoFuente: Perrin et al Can J Microbiol. 2002 Aug;48(8): 759-63

Fuente: Van der Meulen et al Appl. Environ. Microbiol. 2004 Apr;70(4) 1923

Degradación de FOS por Bifidobacterium

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0 5 10 15 20 25

Horas

% C

arbo

hidr

atos

tot

DP3DP4DP5DP6DP7

PROPIEDADES PREBIÓTICAS Crecimiento

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Tiempo (h)

DO

600

nm

GlucosaFOS 60%FOS 95%Oligofruct 95%Inulina

Consumo de azúcares

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Tiempo (h)

Con

c (g

/l)

GlucosaFructosaSacarosaGF2GF3GF4

Lactobacillus fermentumCECT5716

PREBIÓTICOS DE “SEGUNDA GENERACIÓN"

M.O. PROBIÓTICOGenes

SUBSTRATO OLIGOSACÁRIDOSESPECÍFICOS

SIMBIÓTICOS

Enzima

Inmovilización

AspergillusSaccharomyces

LAB

Vectoresde expresión

Conclusiones.

Desarrollo de procesos de producción industrial de FRUCTOOLIGOSACÁRIDOS.

Sustentación científica de los valores nutricionales de los ingredientes.

Desarrollo de prebióticos de segunda generación.

Utilización de biotecnología para producción de carbohidratos y fibras de nueva generación:

Microbiología Industrial.Biocatálisis.

Agradecimientos

Área de Biotecnología

Área de Ingeniería de Procesos