Aus der Abteilung Plastische und Handchirurgie ...
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Aus der Abteilung Plastische und Handchirurgie
Chirurgische Universitaumltsklinik der Albert-Ludwigs-
Universitaumlt Freiburg i Br
Wundheilung von Vollhautdefekten durch Kombination einer autologen
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) mit einer dermalen
Matrix mit und ohne Fibroblasten - ein Kurz- und Langzeitversuch am
Schweinemodell
I N A U G U R A L ndash D I S S E R T A T I O N
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultaumlt
der Albert-Ludwigs-Universitaumlt
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2003
Von Friedrich Knam
Geboren in Baden-Baden
Dekan Prof Dr med J Zentner
1 Gutachter Prof Dr med GB Stark
2 Gutachter PD Dr med M Augustin
Jahr der Promotion 2005
1
1 EINLEITUNG 3
11 Allgemeines 3
12 Hautersatzstrategien 4 121 Anforderungen an einen Hautersatz 4 122 Temporaumlrer Hautersatz 5 123 Definitiver Hautersatz 6 124 Bedeutung der dermalen Matrix 7 125 Komposit-Hautersatz 8
13 Versuchstier Schwein 8
14 Fragestellung 9
2 METHODIK 11
21 Uumlberblick 11
22 Zellkultivierung 15 221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten 15
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS) 17 222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur 18
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) 19 2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten mit Fluospheresreg 19
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg) 20
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung 23 231 Operation 23 232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten 26 233 Taumltowierung und Transplantation 27 234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ 29 235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion 29 236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses 31 237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde 31
24 Histologische Untersuchungen 33 241 Klassische Lichtmikroskopie 33 242 Immunhistochemie 33
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 33 2422 Nachweis von Myofibroblasten 34
243 Bewertung der Reteleisten 35
25 Statistik und Computerprogramme 35
3 ERGEBNISSE 36
31 Praumloperative Zellkultivierung 36
32 Verlauf des Tierversuchs 36 321 Operation 36 322 Versuchsverlauf 38
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung 39 331 Einheilung der Transplantate 39 332 Wundverschluss 40 333 Die makroskopische Wundheilung 41
3331 KFGS-Gruppe 42
2
3332 F-KFGS-Gruppe 43 3333 hAD-Gruppe 44 3334 hAD+F-Gruppe 44 3335 pAD-Gruppe 45 3336 pAD+F-Gruppe 46
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion 46 335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Wunden mit der Vakuumsonde 50
34 Histologische Resultate 52 341 Klassische Lichtmikroskopie 52
3411 Ergebnisse der Gruppen 52 3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro 57
342 Immunhistochemie 58 3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 58 3422 Nachweis von Myofibroblasten 60
4 DISKUSSION 62
41 Allgemeine Gegebenheiten 62
42 Geschichte 62 421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 62 422 Verschiedene Traumlgermaterialien 64 423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension 65 424 bdquocomposite-graftsldquo 65 425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung 67
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten 68
431 Wundkontraktion 69 432 Vaskularisieung des Transplantats 70 433 Reepithelisierung 71 434 Basalmembrankomplex 71 435 Elastizitaumltsbestimmung 72
44 Schlussfolgerungen 74
5 WEITERE ANSAumlTZE UND AUSBLICKE 75
6 ZUSAMMENFASSUNG 76
7 LITERATURVERZEICHNIS 77
8 VEROumlFFENTLICHUNGEN 83
9 LEBENSLAUF 84
10 DANKSAGUNG 85
3
1 Einleitung
11 Allgemeines
Jaumlhrlich beduumlrfen Tausende von Brandverletzten sowie Hunderttausende von
Patienten mit chronischen Wunden unterschiedlicher Genese eines
Wundverschlusses um Fluumlssigkeits- und Elektrolytverluste Infektionen
Stoffwechselentgleisungen Schmerzen und Amputationen zu verhindern
Allein die Kosten fuumlr die stationaumlre Behandlung von Schwerbrandverletzten an den
deutschen Zentren fuumlr Brandverletzte betragen jaumlhrlich mehrere hundert Millionen
Euro bei Tagessaumltzen zwischen 2000 und 4000 Euro Die Kosten fuumlr die Behandlung
chronisch nicht heilender Wunden bei Diabetes Mellitus und arterieller
Verschlusskrankheit sowie venoumls bedingter Ulzera und Dekubitalulzera die mit
steigendem Alter vermehrt auftreten gehen in die Milliarden [Kremer und Berger
2000] Mit demographisch zunehmendem Lebensalter der Bevoumllkerung ist zu
erwarten dass diese Zahlen noch steigen werden Somit ist den Entwicklungen auf
dem Gebiet kuumlnstlicher Hautersatzverfahren eine wesentliche medizinische und
wirtschaftliche Bedeutung beizumessen Waumlhrend die initiale Schockphase bei
ausgedehnten drittgradigen Verbrennungen dank der modernen
intensivmedizinischen Maszlignahmen in der Regel uumlberlebt werden kann ist die
weitere Prognose hauptsaumlchlich von dem fruumlhzeitigen Ersatz des verlorenen
Gewebes abhaumlngig
Seit uumlber hundert Jahren bedienen sich Chirurgen der autologen Vollhaut- oder
Spalthauttransplantation [Reverdin 1872] Daruumlber hinaus kam waumlhrend des zweiten
Weltkrieges vermehrt die Idee auf einen kuumlnstlich hergestellten Hautersatz
einzusetzen [Ciaschini und Bernard 2001] Der Nachteil bei den autologen
Hauttransplantationen besteht darin dass an den Spenderstellen eine
Hebedefektmorbiditaumlt entsteht und dies ein zusaumltzliches Trauma bedeutet
Auszligerdem wird die Deckung ausgedehnter exzidierter Brandwunden
natuumlrlicherweise durch die Menge der verfuumlgbaren Hautspenderareale des Patienten
begrenzt So kann eine plastische Deckung des Hautverlustes ab etwa 70 Prozent
der Koumlrperoberflaumlche nicht mehr durch patienteneigene Haut alleine erzielt werden
[Muhlbauer et al 1995]
4
Eine weitere Moumlglichkeit zur Behandlung von Verbrennungswunden ist die
Verwendung von Leichenhaut Auf diesem Gebiert leistete Medawar in den 30er und
40er Jahren Pionierarbeit Er erhielt fuumlr seine Arbeit auf dem Gebiet der erworbenen
Immuntoleranz nach Hauttransplantation 1960 den Nobelpreis fuumlr Medizin [Medawar
1961] Hauptprobleme bei der Verwendung von Leichenhaut sind die
Abstoszligungsreaktionen und die Gefahr der Uumlbertragung von Krankheitserregern wie
Hepatitsviren oder HIV
Durch die Errungenschaften in den letzten Jahrzehnten auf dem Gebiet der in vitro
Kulturtechniken entstanden neue Moumlglichkeiten zur Schaffung eines Hautersatzes
Rheinwald und Green gelang durch die Kultivierung von Keratinozyten bereits 1975
die Herstellung von mehrlagigen Epithelschichten im Labor [Rheinwald und Green
1975] Die erste Transplantation eines derartigen Hautersatzes auf einen Menschen
wurde bereits ein paar Jahre spaumlter durch OrsquoConnor 1981 durchgefuumlhrt [Gallico et al
1984] Die Haut war somit das erste mittels bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Organ
Ziel des bdquoTissue Engineeringldquo ist die Regeneration von Gewebe mit normaler
Anatomie und Funktion
Anfaumlngliche Euphorie wurde jedoch gedaumlmpft da es trotz intensiver Bemuumlhungen
weltweit bis dato nicht gelungen war einen Hautersatz zu schaffen der in saumlmtlichen
Eigenschaften wie beispielsweise Stabilitaumlt und Aumlsthetik der natuumlrlichen Haut
entsprach
12 Hautersatzstrategien
121 Anforderungen an einen Hautersatz Die Anforderungen an einen biotechnologisch hergestellten Hautersatz muumlssen sich
an den Eigenschaften menschlicher Haut orientieren Dieser muss zudem die
Faumlhigkeit besitzen mit dem Wundbett in physiologischer Weise zu interagieren Der
ideale kuumlnstliche Hautersatz sollte eine gute Adhaumlrenz an das Wundbett und eine
Keimbarriere gewaumlhrleisten Er sollte einen Schutz vor Fluumlssigkeitsverlust bieten und
zur Temperaturregulation beitragen Auszligerdem stimuliert der optimale Hautersatz die
Wundheilungsvorgaumlnge und verhindert eine ausgepraumlgte Narbenbildung Zudem soll
die bdquoneueldquo Haut langfristig zufriedenstellende Ergebnisse liefern was die
mechanische und aumlsthetische Qualitaumlt angeht [Ruszczak und Schwartz 2000 Schulz
et al 2000 Boyce 2001]
5
Zahlreiche Hautersatzverfahren sind bis heute entwickelt worden und auch
kommerziell erhaumlltlich Grundsaumltzlich lassen sich diese in einen temporaumlren und
einen definitiven Hautersatz unterteilen
122 Temporaumlrer Hautersatz Hierbei soll ein sicherer und stabiler temporaumlrer Wundverschluss erreicht werden
bis entweder Spenderareale fuumlr eine erneute Nutzung zur Spalthautentnahme zur
Verfuumlgung stehen oder aber bis zur Kultivierung ausreichend groszliger epithelialer
Transplantate aus den Hautbiopsien eines Brandverletzten Zu dieser Gruppe gehoumlrt
die homologe Fremdhaut die den besten verfuumlgbaren temporaumlren Wundverschluss
darstellt Das groumlszligte Risiko der Fremdhauttransplantation ist die Uumlbertragung von
Infektionskrankheiten Fremdhaut wird in aller Regel von Leichen gewonnen Frische
Fremdhaut besitzt eine sehr gute Barrierefunktion und hat eine guumlnstige Wirkung auf
die Heilung Die kosmetischen Ergebnisse sind bei Anwendung von zweitgradigen
Verbrennungen sehr gut Probleme bestehen in den antigenen Eigenschaften die
innerhalb von 3 bis 4 Wochen zu einer Abstoszligung fuumlhren Die Aufbewahrung uumlber
eine Woche hinaus macht die Kryokonservierung erforderlich wobei die antigenen
Eigenschaften erhalten bleiben Derzeit wird an den meisten deutschen
Verbrennungszentren glycerolkonservierte Haut verwendet die von der Euro Skin
Bank in Beverwijk Niederlande bezogen wird [Horch et al 1994] Sie kann bei 4 degC
gelagert werden und ist im Gegensatz zu frischer und kryokonservierter Haut avital
Waumlhrend des Konservierungsprozesses gehen sowohl die dermalen als auch die
epidermalen Zellen zugrunde Dies fuumlhrt zu einer Reduzierung der antigenen
Eigenschaften [Germann und Raff 1995]
Das Intervall bis ein definitiver Wundverschluss moumlglich ist kann anstelle von
Fremdhaut auch mit allogenen Keratinozytentransplantaten uumlberbruumlckt werden
[Hefton et al 1983] Eine akute Abstoszligung der Fremdkeratinozyten kommt nach
Eldad et al (1987) nur gelegentlich vor und das Risiko der Uumlbertragung von
Infektionen ist geringer [Eldad et al 1987] Entscheidend fuumlr das Uumlberleben der
Fremdkeratinozyten wie grundsaumltzlich aller Transplantate ist der Wundgrund Tief
dermale und tiefere Wunden fuumlhren zu einem fruumlheren Verlust als
Spalthautentnahmestellen mit vorhandener Dermis [Germann und Raff 1995]
6
Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra
Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced
Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der
groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus
Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als
temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll
Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen
klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al
2000]
TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch
vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt
das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren
Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte
Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den
Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt
dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]
123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen
sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend
aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die
Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung
[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos
wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig
belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht
ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange
Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al
1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al
1995 Bannasch et al 2000]
Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als
Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)
Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung
[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
Dekan Prof Dr med J Zentner
1 Gutachter Prof Dr med GB Stark
2 Gutachter PD Dr med M Augustin
Jahr der Promotion 2005
1
1 EINLEITUNG 3
11 Allgemeines 3
12 Hautersatzstrategien 4 121 Anforderungen an einen Hautersatz 4 122 Temporaumlrer Hautersatz 5 123 Definitiver Hautersatz 6 124 Bedeutung der dermalen Matrix 7 125 Komposit-Hautersatz 8
13 Versuchstier Schwein 8
14 Fragestellung 9
2 METHODIK 11
21 Uumlberblick 11
22 Zellkultivierung 15 221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten 15
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS) 17 222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur 18
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) 19 2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten mit Fluospheresreg 19
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg) 20
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung 23 231 Operation 23 232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten 26 233 Taumltowierung und Transplantation 27 234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ 29 235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion 29 236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses 31 237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde 31
24 Histologische Untersuchungen 33 241 Klassische Lichtmikroskopie 33 242 Immunhistochemie 33
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 33 2422 Nachweis von Myofibroblasten 34
243 Bewertung der Reteleisten 35
25 Statistik und Computerprogramme 35
3 ERGEBNISSE 36
31 Praumloperative Zellkultivierung 36
32 Verlauf des Tierversuchs 36 321 Operation 36 322 Versuchsverlauf 38
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung 39 331 Einheilung der Transplantate 39 332 Wundverschluss 40 333 Die makroskopische Wundheilung 41
3331 KFGS-Gruppe 42
2
3332 F-KFGS-Gruppe 43 3333 hAD-Gruppe 44 3334 hAD+F-Gruppe 44 3335 pAD-Gruppe 45 3336 pAD+F-Gruppe 46
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion 46 335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Wunden mit der Vakuumsonde 50
34 Histologische Resultate 52 341 Klassische Lichtmikroskopie 52
3411 Ergebnisse der Gruppen 52 3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro 57
342 Immunhistochemie 58 3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 58 3422 Nachweis von Myofibroblasten 60
4 DISKUSSION 62
41 Allgemeine Gegebenheiten 62
42 Geschichte 62 421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 62 422 Verschiedene Traumlgermaterialien 64 423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension 65 424 bdquocomposite-graftsldquo 65 425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung 67
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten 68
431 Wundkontraktion 69 432 Vaskularisieung des Transplantats 70 433 Reepithelisierung 71 434 Basalmembrankomplex 71 435 Elastizitaumltsbestimmung 72
44 Schlussfolgerungen 74
5 WEITERE ANSAumlTZE UND AUSBLICKE 75
6 ZUSAMMENFASSUNG 76
7 LITERATURVERZEICHNIS 77
8 VEROumlFFENTLICHUNGEN 83
9 LEBENSLAUF 84
10 DANKSAGUNG 85
3
1 Einleitung
11 Allgemeines
Jaumlhrlich beduumlrfen Tausende von Brandverletzten sowie Hunderttausende von
Patienten mit chronischen Wunden unterschiedlicher Genese eines
Wundverschlusses um Fluumlssigkeits- und Elektrolytverluste Infektionen
Stoffwechselentgleisungen Schmerzen und Amputationen zu verhindern
Allein die Kosten fuumlr die stationaumlre Behandlung von Schwerbrandverletzten an den
deutschen Zentren fuumlr Brandverletzte betragen jaumlhrlich mehrere hundert Millionen
Euro bei Tagessaumltzen zwischen 2000 und 4000 Euro Die Kosten fuumlr die Behandlung
chronisch nicht heilender Wunden bei Diabetes Mellitus und arterieller
Verschlusskrankheit sowie venoumls bedingter Ulzera und Dekubitalulzera die mit
steigendem Alter vermehrt auftreten gehen in die Milliarden [Kremer und Berger
2000] Mit demographisch zunehmendem Lebensalter der Bevoumllkerung ist zu
erwarten dass diese Zahlen noch steigen werden Somit ist den Entwicklungen auf
dem Gebiet kuumlnstlicher Hautersatzverfahren eine wesentliche medizinische und
wirtschaftliche Bedeutung beizumessen Waumlhrend die initiale Schockphase bei
ausgedehnten drittgradigen Verbrennungen dank der modernen
intensivmedizinischen Maszlignahmen in der Regel uumlberlebt werden kann ist die
weitere Prognose hauptsaumlchlich von dem fruumlhzeitigen Ersatz des verlorenen
Gewebes abhaumlngig
Seit uumlber hundert Jahren bedienen sich Chirurgen der autologen Vollhaut- oder
Spalthauttransplantation [Reverdin 1872] Daruumlber hinaus kam waumlhrend des zweiten
Weltkrieges vermehrt die Idee auf einen kuumlnstlich hergestellten Hautersatz
einzusetzen [Ciaschini und Bernard 2001] Der Nachteil bei den autologen
Hauttransplantationen besteht darin dass an den Spenderstellen eine
Hebedefektmorbiditaumlt entsteht und dies ein zusaumltzliches Trauma bedeutet
Auszligerdem wird die Deckung ausgedehnter exzidierter Brandwunden
natuumlrlicherweise durch die Menge der verfuumlgbaren Hautspenderareale des Patienten
begrenzt So kann eine plastische Deckung des Hautverlustes ab etwa 70 Prozent
der Koumlrperoberflaumlche nicht mehr durch patienteneigene Haut alleine erzielt werden
[Muhlbauer et al 1995]
4
Eine weitere Moumlglichkeit zur Behandlung von Verbrennungswunden ist die
Verwendung von Leichenhaut Auf diesem Gebiert leistete Medawar in den 30er und
40er Jahren Pionierarbeit Er erhielt fuumlr seine Arbeit auf dem Gebiet der erworbenen
Immuntoleranz nach Hauttransplantation 1960 den Nobelpreis fuumlr Medizin [Medawar
1961] Hauptprobleme bei der Verwendung von Leichenhaut sind die
Abstoszligungsreaktionen und die Gefahr der Uumlbertragung von Krankheitserregern wie
Hepatitsviren oder HIV
Durch die Errungenschaften in den letzten Jahrzehnten auf dem Gebiet der in vitro
Kulturtechniken entstanden neue Moumlglichkeiten zur Schaffung eines Hautersatzes
Rheinwald und Green gelang durch die Kultivierung von Keratinozyten bereits 1975
die Herstellung von mehrlagigen Epithelschichten im Labor [Rheinwald und Green
1975] Die erste Transplantation eines derartigen Hautersatzes auf einen Menschen
wurde bereits ein paar Jahre spaumlter durch OrsquoConnor 1981 durchgefuumlhrt [Gallico et al
1984] Die Haut war somit das erste mittels bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Organ
Ziel des bdquoTissue Engineeringldquo ist die Regeneration von Gewebe mit normaler
Anatomie und Funktion
Anfaumlngliche Euphorie wurde jedoch gedaumlmpft da es trotz intensiver Bemuumlhungen
weltweit bis dato nicht gelungen war einen Hautersatz zu schaffen der in saumlmtlichen
Eigenschaften wie beispielsweise Stabilitaumlt und Aumlsthetik der natuumlrlichen Haut
entsprach
12 Hautersatzstrategien
121 Anforderungen an einen Hautersatz Die Anforderungen an einen biotechnologisch hergestellten Hautersatz muumlssen sich
an den Eigenschaften menschlicher Haut orientieren Dieser muss zudem die
Faumlhigkeit besitzen mit dem Wundbett in physiologischer Weise zu interagieren Der
ideale kuumlnstliche Hautersatz sollte eine gute Adhaumlrenz an das Wundbett und eine
Keimbarriere gewaumlhrleisten Er sollte einen Schutz vor Fluumlssigkeitsverlust bieten und
zur Temperaturregulation beitragen Auszligerdem stimuliert der optimale Hautersatz die
Wundheilungsvorgaumlnge und verhindert eine ausgepraumlgte Narbenbildung Zudem soll
die bdquoneueldquo Haut langfristig zufriedenstellende Ergebnisse liefern was die
mechanische und aumlsthetische Qualitaumlt angeht [Ruszczak und Schwartz 2000 Schulz
et al 2000 Boyce 2001]
5
Zahlreiche Hautersatzverfahren sind bis heute entwickelt worden und auch
kommerziell erhaumlltlich Grundsaumltzlich lassen sich diese in einen temporaumlren und
einen definitiven Hautersatz unterteilen
122 Temporaumlrer Hautersatz Hierbei soll ein sicherer und stabiler temporaumlrer Wundverschluss erreicht werden
bis entweder Spenderareale fuumlr eine erneute Nutzung zur Spalthautentnahme zur
Verfuumlgung stehen oder aber bis zur Kultivierung ausreichend groszliger epithelialer
Transplantate aus den Hautbiopsien eines Brandverletzten Zu dieser Gruppe gehoumlrt
die homologe Fremdhaut die den besten verfuumlgbaren temporaumlren Wundverschluss
darstellt Das groumlszligte Risiko der Fremdhauttransplantation ist die Uumlbertragung von
Infektionskrankheiten Fremdhaut wird in aller Regel von Leichen gewonnen Frische
Fremdhaut besitzt eine sehr gute Barrierefunktion und hat eine guumlnstige Wirkung auf
die Heilung Die kosmetischen Ergebnisse sind bei Anwendung von zweitgradigen
Verbrennungen sehr gut Probleme bestehen in den antigenen Eigenschaften die
innerhalb von 3 bis 4 Wochen zu einer Abstoszligung fuumlhren Die Aufbewahrung uumlber
eine Woche hinaus macht die Kryokonservierung erforderlich wobei die antigenen
Eigenschaften erhalten bleiben Derzeit wird an den meisten deutschen
Verbrennungszentren glycerolkonservierte Haut verwendet die von der Euro Skin
Bank in Beverwijk Niederlande bezogen wird [Horch et al 1994] Sie kann bei 4 degC
gelagert werden und ist im Gegensatz zu frischer und kryokonservierter Haut avital
Waumlhrend des Konservierungsprozesses gehen sowohl die dermalen als auch die
epidermalen Zellen zugrunde Dies fuumlhrt zu einer Reduzierung der antigenen
Eigenschaften [Germann und Raff 1995]
Das Intervall bis ein definitiver Wundverschluss moumlglich ist kann anstelle von
Fremdhaut auch mit allogenen Keratinozytentransplantaten uumlberbruumlckt werden
[Hefton et al 1983] Eine akute Abstoszligung der Fremdkeratinozyten kommt nach
Eldad et al (1987) nur gelegentlich vor und das Risiko der Uumlbertragung von
Infektionen ist geringer [Eldad et al 1987] Entscheidend fuumlr das Uumlberleben der
Fremdkeratinozyten wie grundsaumltzlich aller Transplantate ist der Wundgrund Tief
dermale und tiefere Wunden fuumlhren zu einem fruumlheren Verlust als
Spalthautentnahmestellen mit vorhandener Dermis [Germann und Raff 1995]
6
Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra
Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced
Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der
groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus
Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als
temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll
Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen
klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al
2000]
TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch
vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt
das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren
Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte
Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den
Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt
dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]
123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen
sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend
aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die
Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung
[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos
wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig
belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht
ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange
Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al
1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al
1995 Bannasch et al 2000]
Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als
Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)
Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung
[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
1
1 EINLEITUNG 3
11 Allgemeines 3
12 Hautersatzstrategien 4 121 Anforderungen an einen Hautersatz 4 122 Temporaumlrer Hautersatz 5 123 Definitiver Hautersatz 6 124 Bedeutung der dermalen Matrix 7 125 Komposit-Hautersatz 8
13 Versuchstier Schwein 8
14 Fragestellung 9
2 METHODIK 11
21 Uumlberblick 11
22 Zellkultivierung 15 221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten 15
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS) 17 222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur 18
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) 19 2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten mit Fluospheresreg 19
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg) 20
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung 23 231 Operation 23 232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten 26 233 Taumltowierung und Transplantation 27 234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ 29 235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion 29 236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses 31 237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde 31
24 Histologische Untersuchungen 33 241 Klassische Lichtmikroskopie 33 242 Immunhistochemie 33
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 33 2422 Nachweis von Myofibroblasten 34
243 Bewertung der Reteleisten 35
25 Statistik und Computerprogramme 35
3 ERGEBNISSE 36
31 Praumloperative Zellkultivierung 36
32 Verlauf des Tierversuchs 36 321 Operation 36 322 Versuchsverlauf 38
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung 39 331 Einheilung der Transplantate 39 332 Wundverschluss 40 333 Die makroskopische Wundheilung 41
3331 KFGS-Gruppe 42
2
3332 F-KFGS-Gruppe 43 3333 hAD-Gruppe 44 3334 hAD+F-Gruppe 44 3335 pAD-Gruppe 45 3336 pAD+F-Gruppe 46
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion 46 335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Wunden mit der Vakuumsonde 50
34 Histologische Resultate 52 341 Klassische Lichtmikroskopie 52
3411 Ergebnisse der Gruppen 52 3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro 57
342 Immunhistochemie 58 3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 58 3422 Nachweis von Myofibroblasten 60
4 DISKUSSION 62
41 Allgemeine Gegebenheiten 62
42 Geschichte 62 421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 62 422 Verschiedene Traumlgermaterialien 64 423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension 65 424 bdquocomposite-graftsldquo 65 425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung 67
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten 68
431 Wundkontraktion 69 432 Vaskularisieung des Transplantats 70 433 Reepithelisierung 71 434 Basalmembrankomplex 71 435 Elastizitaumltsbestimmung 72
44 Schlussfolgerungen 74
5 WEITERE ANSAumlTZE UND AUSBLICKE 75
6 ZUSAMMENFASSUNG 76
7 LITERATURVERZEICHNIS 77
8 VEROumlFFENTLICHUNGEN 83
9 LEBENSLAUF 84
10 DANKSAGUNG 85
3
1 Einleitung
11 Allgemeines
Jaumlhrlich beduumlrfen Tausende von Brandverletzten sowie Hunderttausende von
Patienten mit chronischen Wunden unterschiedlicher Genese eines
Wundverschlusses um Fluumlssigkeits- und Elektrolytverluste Infektionen
Stoffwechselentgleisungen Schmerzen und Amputationen zu verhindern
Allein die Kosten fuumlr die stationaumlre Behandlung von Schwerbrandverletzten an den
deutschen Zentren fuumlr Brandverletzte betragen jaumlhrlich mehrere hundert Millionen
Euro bei Tagessaumltzen zwischen 2000 und 4000 Euro Die Kosten fuumlr die Behandlung
chronisch nicht heilender Wunden bei Diabetes Mellitus und arterieller
Verschlusskrankheit sowie venoumls bedingter Ulzera und Dekubitalulzera die mit
steigendem Alter vermehrt auftreten gehen in die Milliarden [Kremer und Berger
2000] Mit demographisch zunehmendem Lebensalter der Bevoumllkerung ist zu
erwarten dass diese Zahlen noch steigen werden Somit ist den Entwicklungen auf
dem Gebiet kuumlnstlicher Hautersatzverfahren eine wesentliche medizinische und
wirtschaftliche Bedeutung beizumessen Waumlhrend die initiale Schockphase bei
ausgedehnten drittgradigen Verbrennungen dank der modernen
intensivmedizinischen Maszlignahmen in der Regel uumlberlebt werden kann ist die
weitere Prognose hauptsaumlchlich von dem fruumlhzeitigen Ersatz des verlorenen
Gewebes abhaumlngig
Seit uumlber hundert Jahren bedienen sich Chirurgen der autologen Vollhaut- oder
Spalthauttransplantation [Reverdin 1872] Daruumlber hinaus kam waumlhrend des zweiten
Weltkrieges vermehrt die Idee auf einen kuumlnstlich hergestellten Hautersatz
einzusetzen [Ciaschini und Bernard 2001] Der Nachteil bei den autologen
Hauttransplantationen besteht darin dass an den Spenderstellen eine
Hebedefektmorbiditaumlt entsteht und dies ein zusaumltzliches Trauma bedeutet
Auszligerdem wird die Deckung ausgedehnter exzidierter Brandwunden
natuumlrlicherweise durch die Menge der verfuumlgbaren Hautspenderareale des Patienten
begrenzt So kann eine plastische Deckung des Hautverlustes ab etwa 70 Prozent
der Koumlrperoberflaumlche nicht mehr durch patienteneigene Haut alleine erzielt werden
[Muhlbauer et al 1995]
4
Eine weitere Moumlglichkeit zur Behandlung von Verbrennungswunden ist die
Verwendung von Leichenhaut Auf diesem Gebiert leistete Medawar in den 30er und
40er Jahren Pionierarbeit Er erhielt fuumlr seine Arbeit auf dem Gebiet der erworbenen
Immuntoleranz nach Hauttransplantation 1960 den Nobelpreis fuumlr Medizin [Medawar
1961] Hauptprobleme bei der Verwendung von Leichenhaut sind die
Abstoszligungsreaktionen und die Gefahr der Uumlbertragung von Krankheitserregern wie
Hepatitsviren oder HIV
Durch die Errungenschaften in den letzten Jahrzehnten auf dem Gebiet der in vitro
Kulturtechniken entstanden neue Moumlglichkeiten zur Schaffung eines Hautersatzes
Rheinwald und Green gelang durch die Kultivierung von Keratinozyten bereits 1975
die Herstellung von mehrlagigen Epithelschichten im Labor [Rheinwald und Green
1975] Die erste Transplantation eines derartigen Hautersatzes auf einen Menschen
wurde bereits ein paar Jahre spaumlter durch OrsquoConnor 1981 durchgefuumlhrt [Gallico et al
1984] Die Haut war somit das erste mittels bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Organ
Ziel des bdquoTissue Engineeringldquo ist die Regeneration von Gewebe mit normaler
Anatomie und Funktion
Anfaumlngliche Euphorie wurde jedoch gedaumlmpft da es trotz intensiver Bemuumlhungen
weltweit bis dato nicht gelungen war einen Hautersatz zu schaffen der in saumlmtlichen
Eigenschaften wie beispielsweise Stabilitaumlt und Aumlsthetik der natuumlrlichen Haut
entsprach
12 Hautersatzstrategien
121 Anforderungen an einen Hautersatz Die Anforderungen an einen biotechnologisch hergestellten Hautersatz muumlssen sich
an den Eigenschaften menschlicher Haut orientieren Dieser muss zudem die
Faumlhigkeit besitzen mit dem Wundbett in physiologischer Weise zu interagieren Der
ideale kuumlnstliche Hautersatz sollte eine gute Adhaumlrenz an das Wundbett und eine
Keimbarriere gewaumlhrleisten Er sollte einen Schutz vor Fluumlssigkeitsverlust bieten und
zur Temperaturregulation beitragen Auszligerdem stimuliert der optimale Hautersatz die
Wundheilungsvorgaumlnge und verhindert eine ausgepraumlgte Narbenbildung Zudem soll
die bdquoneueldquo Haut langfristig zufriedenstellende Ergebnisse liefern was die
mechanische und aumlsthetische Qualitaumlt angeht [Ruszczak und Schwartz 2000 Schulz
et al 2000 Boyce 2001]
5
Zahlreiche Hautersatzverfahren sind bis heute entwickelt worden und auch
kommerziell erhaumlltlich Grundsaumltzlich lassen sich diese in einen temporaumlren und
einen definitiven Hautersatz unterteilen
122 Temporaumlrer Hautersatz Hierbei soll ein sicherer und stabiler temporaumlrer Wundverschluss erreicht werden
bis entweder Spenderareale fuumlr eine erneute Nutzung zur Spalthautentnahme zur
Verfuumlgung stehen oder aber bis zur Kultivierung ausreichend groszliger epithelialer
Transplantate aus den Hautbiopsien eines Brandverletzten Zu dieser Gruppe gehoumlrt
die homologe Fremdhaut die den besten verfuumlgbaren temporaumlren Wundverschluss
darstellt Das groumlszligte Risiko der Fremdhauttransplantation ist die Uumlbertragung von
Infektionskrankheiten Fremdhaut wird in aller Regel von Leichen gewonnen Frische
Fremdhaut besitzt eine sehr gute Barrierefunktion und hat eine guumlnstige Wirkung auf
die Heilung Die kosmetischen Ergebnisse sind bei Anwendung von zweitgradigen
Verbrennungen sehr gut Probleme bestehen in den antigenen Eigenschaften die
innerhalb von 3 bis 4 Wochen zu einer Abstoszligung fuumlhren Die Aufbewahrung uumlber
eine Woche hinaus macht die Kryokonservierung erforderlich wobei die antigenen
Eigenschaften erhalten bleiben Derzeit wird an den meisten deutschen
Verbrennungszentren glycerolkonservierte Haut verwendet die von der Euro Skin
Bank in Beverwijk Niederlande bezogen wird [Horch et al 1994] Sie kann bei 4 degC
gelagert werden und ist im Gegensatz zu frischer und kryokonservierter Haut avital
Waumlhrend des Konservierungsprozesses gehen sowohl die dermalen als auch die
epidermalen Zellen zugrunde Dies fuumlhrt zu einer Reduzierung der antigenen
Eigenschaften [Germann und Raff 1995]
Das Intervall bis ein definitiver Wundverschluss moumlglich ist kann anstelle von
Fremdhaut auch mit allogenen Keratinozytentransplantaten uumlberbruumlckt werden
[Hefton et al 1983] Eine akute Abstoszligung der Fremdkeratinozyten kommt nach
Eldad et al (1987) nur gelegentlich vor und das Risiko der Uumlbertragung von
Infektionen ist geringer [Eldad et al 1987] Entscheidend fuumlr das Uumlberleben der
Fremdkeratinozyten wie grundsaumltzlich aller Transplantate ist der Wundgrund Tief
dermale und tiefere Wunden fuumlhren zu einem fruumlheren Verlust als
Spalthautentnahmestellen mit vorhandener Dermis [Germann und Raff 1995]
6
Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra
Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced
Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der
groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus
Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als
temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll
Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen
klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al
2000]
TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch
vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt
das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren
Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte
Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den
Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt
dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]
123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen
sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend
aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die
Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung
[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos
wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig
belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht
ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange
Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al
1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al
1995 Bannasch et al 2000]
Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als
Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)
Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung
[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
2
3332 F-KFGS-Gruppe 43 3333 hAD-Gruppe 44 3334 hAD+F-Gruppe 44 3335 pAD-Gruppe 45 3336 pAD+F-Gruppe 46
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion 46 335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Wunden mit der Vakuumsonde 50
34 Histologische Resultate 52 341 Klassische Lichtmikroskopie 52
3411 Ergebnisse der Gruppen 52 3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro 57
342 Immunhistochemie 58 3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran 58 3422 Nachweis von Myofibroblasten 60
4 DISKUSSION 62
41 Allgemeine Gegebenheiten 62
42 Geschichte 62 421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 62 422 Verschiedene Traumlgermaterialien 64 423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension 65 424 bdquocomposite-graftsldquo 65 425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung 67
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten 68
431 Wundkontraktion 69 432 Vaskularisieung des Transplantats 70 433 Reepithelisierung 71 434 Basalmembrankomplex 71 435 Elastizitaumltsbestimmung 72
44 Schlussfolgerungen 74
5 WEITERE ANSAumlTZE UND AUSBLICKE 75
6 ZUSAMMENFASSUNG 76
7 LITERATURVERZEICHNIS 77
8 VEROumlFFENTLICHUNGEN 83
9 LEBENSLAUF 84
10 DANKSAGUNG 85
3
1 Einleitung
11 Allgemeines
Jaumlhrlich beduumlrfen Tausende von Brandverletzten sowie Hunderttausende von
Patienten mit chronischen Wunden unterschiedlicher Genese eines
Wundverschlusses um Fluumlssigkeits- und Elektrolytverluste Infektionen
Stoffwechselentgleisungen Schmerzen und Amputationen zu verhindern
Allein die Kosten fuumlr die stationaumlre Behandlung von Schwerbrandverletzten an den
deutschen Zentren fuumlr Brandverletzte betragen jaumlhrlich mehrere hundert Millionen
Euro bei Tagessaumltzen zwischen 2000 und 4000 Euro Die Kosten fuumlr die Behandlung
chronisch nicht heilender Wunden bei Diabetes Mellitus und arterieller
Verschlusskrankheit sowie venoumls bedingter Ulzera und Dekubitalulzera die mit
steigendem Alter vermehrt auftreten gehen in die Milliarden [Kremer und Berger
2000] Mit demographisch zunehmendem Lebensalter der Bevoumllkerung ist zu
erwarten dass diese Zahlen noch steigen werden Somit ist den Entwicklungen auf
dem Gebiet kuumlnstlicher Hautersatzverfahren eine wesentliche medizinische und
wirtschaftliche Bedeutung beizumessen Waumlhrend die initiale Schockphase bei
ausgedehnten drittgradigen Verbrennungen dank der modernen
intensivmedizinischen Maszlignahmen in der Regel uumlberlebt werden kann ist die
weitere Prognose hauptsaumlchlich von dem fruumlhzeitigen Ersatz des verlorenen
Gewebes abhaumlngig
Seit uumlber hundert Jahren bedienen sich Chirurgen der autologen Vollhaut- oder
Spalthauttransplantation [Reverdin 1872] Daruumlber hinaus kam waumlhrend des zweiten
Weltkrieges vermehrt die Idee auf einen kuumlnstlich hergestellten Hautersatz
einzusetzen [Ciaschini und Bernard 2001] Der Nachteil bei den autologen
Hauttransplantationen besteht darin dass an den Spenderstellen eine
Hebedefektmorbiditaumlt entsteht und dies ein zusaumltzliches Trauma bedeutet
Auszligerdem wird die Deckung ausgedehnter exzidierter Brandwunden
natuumlrlicherweise durch die Menge der verfuumlgbaren Hautspenderareale des Patienten
begrenzt So kann eine plastische Deckung des Hautverlustes ab etwa 70 Prozent
der Koumlrperoberflaumlche nicht mehr durch patienteneigene Haut alleine erzielt werden
[Muhlbauer et al 1995]
4
Eine weitere Moumlglichkeit zur Behandlung von Verbrennungswunden ist die
Verwendung von Leichenhaut Auf diesem Gebiert leistete Medawar in den 30er und
40er Jahren Pionierarbeit Er erhielt fuumlr seine Arbeit auf dem Gebiet der erworbenen
Immuntoleranz nach Hauttransplantation 1960 den Nobelpreis fuumlr Medizin [Medawar
1961] Hauptprobleme bei der Verwendung von Leichenhaut sind die
Abstoszligungsreaktionen und die Gefahr der Uumlbertragung von Krankheitserregern wie
Hepatitsviren oder HIV
Durch die Errungenschaften in den letzten Jahrzehnten auf dem Gebiet der in vitro
Kulturtechniken entstanden neue Moumlglichkeiten zur Schaffung eines Hautersatzes
Rheinwald und Green gelang durch die Kultivierung von Keratinozyten bereits 1975
die Herstellung von mehrlagigen Epithelschichten im Labor [Rheinwald und Green
1975] Die erste Transplantation eines derartigen Hautersatzes auf einen Menschen
wurde bereits ein paar Jahre spaumlter durch OrsquoConnor 1981 durchgefuumlhrt [Gallico et al
1984] Die Haut war somit das erste mittels bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Organ
Ziel des bdquoTissue Engineeringldquo ist die Regeneration von Gewebe mit normaler
Anatomie und Funktion
Anfaumlngliche Euphorie wurde jedoch gedaumlmpft da es trotz intensiver Bemuumlhungen
weltweit bis dato nicht gelungen war einen Hautersatz zu schaffen der in saumlmtlichen
Eigenschaften wie beispielsweise Stabilitaumlt und Aumlsthetik der natuumlrlichen Haut
entsprach
12 Hautersatzstrategien
121 Anforderungen an einen Hautersatz Die Anforderungen an einen biotechnologisch hergestellten Hautersatz muumlssen sich
an den Eigenschaften menschlicher Haut orientieren Dieser muss zudem die
Faumlhigkeit besitzen mit dem Wundbett in physiologischer Weise zu interagieren Der
ideale kuumlnstliche Hautersatz sollte eine gute Adhaumlrenz an das Wundbett und eine
Keimbarriere gewaumlhrleisten Er sollte einen Schutz vor Fluumlssigkeitsverlust bieten und
zur Temperaturregulation beitragen Auszligerdem stimuliert der optimale Hautersatz die
Wundheilungsvorgaumlnge und verhindert eine ausgepraumlgte Narbenbildung Zudem soll
die bdquoneueldquo Haut langfristig zufriedenstellende Ergebnisse liefern was die
mechanische und aumlsthetische Qualitaumlt angeht [Ruszczak und Schwartz 2000 Schulz
et al 2000 Boyce 2001]
5
Zahlreiche Hautersatzverfahren sind bis heute entwickelt worden und auch
kommerziell erhaumlltlich Grundsaumltzlich lassen sich diese in einen temporaumlren und
einen definitiven Hautersatz unterteilen
122 Temporaumlrer Hautersatz Hierbei soll ein sicherer und stabiler temporaumlrer Wundverschluss erreicht werden
bis entweder Spenderareale fuumlr eine erneute Nutzung zur Spalthautentnahme zur
Verfuumlgung stehen oder aber bis zur Kultivierung ausreichend groszliger epithelialer
Transplantate aus den Hautbiopsien eines Brandverletzten Zu dieser Gruppe gehoumlrt
die homologe Fremdhaut die den besten verfuumlgbaren temporaumlren Wundverschluss
darstellt Das groumlszligte Risiko der Fremdhauttransplantation ist die Uumlbertragung von
Infektionskrankheiten Fremdhaut wird in aller Regel von Leichen gewonnen Frische
Fremdhaut besitzt eine sehr gute Barrierefunktion und hat eine guumlnstige Wirkung auf
die Heilung Die kosmetischen Ergebnisse sind bei Anwendung von zweitgradigen
Verbrennungen sehr gut Probleme bestehen in den antigenen Eigenschaften die
innerhalb von 3 bis 4 Wochen zu einer Abstoszligung fuumlhren Die Aufbewahrung uumlber
eine Woche hinaus macht die Kryokonservierung erforderlich wobei die antigenen
Eigenschaften erhalten bleiben Derzeit wird an den meisten deutschen
Verbrennungszentren glycerolkonservierte Haut verwendet die von der Euro Skin
Bank in Beverwijk Niederlande bezogen wird [Horch et al 1994] Sie kann bei 4 degC
gelagert werden und ist im Gegensatz zu frischer und kryokonservierter Haut avital
Waumlhrend des Konservierungsprozesses gehen sowohl die dermalen als auch die
epidermalen Zellen zugrunde Dies fuumlhrt zu einer Reduzierung der antigenen
Eigenschaften [Germann und Raff 1995]
Das Intervall bis ein definitiver Wundverschluss moumlglich ist kann anstelle von
Fremdhaut auch mit allogenen Keratinozytentransplantaten uumlberbruumlckt werden
[Hefton et al 1983] Eine akute Abstoszligung der Fremdkeratinozyten kommt nach
Eldad et al (1987) nur gelegentlich vor und das Risiko der Uumlbertragung von
Infektionen ist geringer [Eldad et al 1987] Entscheidend fuumlr das Uumlberleben der
Fremdkeratinozyten wie grundsaumltzlich aller Transplantate ist der Wundgrund Tief
dermale und tiefere Wunden fuumlhren zu einem fruumlheren Verlust als
Spalthautentnahmestellen mit vorhandener Dermis [Germann und Raff 1995]
6
Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra
Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced
Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der
groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus
Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als
temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll
Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen
klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al
2000]
TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch
vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt
das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren
Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte
Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den
Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt
dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]
123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen
sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend
aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die
Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung
[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos
wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig
belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht
ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange
Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al
1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al
1995 Bannasch et al 2000]
Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als
Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)
Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung
[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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83
8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
3
1 Einleitung
11 Allgemeines
Jaumlhrlich beduumlrfen Tausende von Brandverletzten sowie Hunderttausende von
Patienten mit chronischen Wunden unterschiedlicher Genese eines
Wundverschlusses um Fluumlssigkeits- und Elektrolytverluste Infektionen
Stoffwechselentgleisungen Schmerzen und Amputationen zu verhindern
Allein die Kosten fuumlr die stationaumlre Behandlung von Schwerbrandverletzten an den
deutschen Zentren fuumlr Brandverletzte betragen jaumlhrlich mehrere hundert Millionen
Euro bei Tagessaumltzen zwischen 2000 und 4000 Euro Die Kosten fuumlr die Behandlung
chronisch nicht heilender Wunden bei Diabetes Mellitus und arterieller
Verschlusskrankheit sowie venoumls bedingter Ulzera und Dekubitalulzera die mit
steigendem Alter vermehrt auftreten gehen in die Milliarden [Kremer und Berger
2000] Mit demographisch zunehmendem Lebensalter der Bevoumllkerung ist zu
erwarten dass diese Zahlen noch steigen werden Somit ist den Entwicklungen auf
dem Gebiet kuumlnstlicher Hautersatzverfahren eine wesentliche medizinische und
wirtschaftliche Bedeutung beizumessen Waumlhrend die initiale Schockphase bei
ausgedehnten drittgradigen Verbrennungen dank der modernen
intensivmedizinischen Maszlignahmen in der Regel uumlberlebt werden kann ist die
weitere Prognose hauptsaumlchlich von dem fruumlhzeitigen Ersatz des verlorenen
Gewebes abhaumlngig
Seit uumlber hundert Jahren bedienen sich Chirurgen der autologen Vollhaut- oder
Spalthauttransplantation [Reverdin 1872] Daruumlber hinaus kam waumlhrend des zweiten
Weltkrieges vermehrt die Idee auf einen kuumlnstlich hergestellten Hautersatz
einzusetzen [Ciaschini und Bernard 2001] Der Nachteil bei den autologen
Hauttransplantationen besteht darin dass an den Spenderstellen eine
Hebedefektmorbiditaumlt entsteht und dies ein zusaumltzliches Trauma bedeutet
Auszligerdem wird die Deckung ausgedehnter exzidierter Brandwunden
natuumlrlicherweise durch die Menge der verfuumlgbaren Hautspenderareale des Patienten
begrenzt So kann eine plastische Deckung des Hautverlustes ab etwa 70 Prozent
der Koumlrperoberflaumlche nicht mehr durch patienteneigene Haut alleine erzielt werden
[Muhlbauer et al 1995]
4
Eine weitere Moumlglichkeit zur Behandlung von Verbrennungswunden ist die
Verwendung von Leichenhaut Auf diesem Gebiert leistete Medawar in den 30er und
40er Jahren Pionierarbeit Er erhielt fuumlr seine Arbeit auf dem Gebiet der erworbenen
Immuntoleranz nach Hauttransplantation 1960 den Nobelpreis fuumlr Medizin [Medawar
1961] Hauptprobleme bei der Verwendung von Leichenhaut sind die
Abstoszligungsreaktionen und die Gefahr der Uumlbertragung von Krankheitserregern wie
Hepatitsviren oder HIV
Durch die Errungenschaften in den letzten Jahrzehnten auf dem Gebiet der in vitro
Kulturtechniken entstanden neue Moumlglichkeiten zur Schaffung eines Hautersatzes
Rheinwald und Green gelang durch die Kultivierung von Keratinozyten bereits 1975
die Herstellung von mehrlagigen Epithelschichten im Labor [Rheinwald und Green
1975] Die erste Transplantation eines derartigen Hautersatzes auf einen Menschen
wurde bereits ein paar Jahre spaumlter durch OrsquoConnor 1981 durchgefuumlhrt [Gallico et al
1984] Die Haut war somit das erste mittels bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Organ
Ziel des bdquoTissue Engineeringldquo ist die Regeneration von Gewebe mit normaler
Anatomie und Funktion
Anfaumlngliche Euphorie wurde jedoch gedaumlmpft da es trotz intensiver Bemuumlhungen
weltweit bis dato nicht gelungen war einen Hautersatz zu schaffen der in saumlmtlichen
Eigenschaften wie beispielsweise Stabilitaumlt und Aumlsthetik der natuumlrlichen Haut
entsprach
12 Hautersatzstrategien
121 Anforderungen an einen Hautersatz Die Anforderungen an einen biotechnologisch hergestellten Hautersatz muumlssen sich
an den Eigenschaften menschlicher Haut orientieren Dieser muss zudem die
Faumlhigkeit besitzen mit dem Wundbett in physiologischer Weise zu interagieren Der
ideale kuumlnstliche Hautersatz sollte eine gute Adhaumlrenz an das Wundbett und eine
Keimbarriere gewaumlhrleisten Er sollte einen Schutz vor Fluumlssigkeitsverlust bieten und
zur Temperaturregulation beitragen Auszligerdem stimuliert der optimale Hautersatz die
Wundheilungsvorgaumlnge und verhindert eine ausgepraumlgte Narbenbildung Zudem soll
die bdquoneueldquo Haut langfristig zufriedenstellende Ergebnisse liefern was die
mechanische und aumlsthetische Qualitaumlt angeht [Ruszczak und Schwartz 2000 Schulz
et al 2000 Boyce 2001]
5
Zahlreiche Hautersatzverfahren sind bis heute entwickelt worden und auch
kommerziell erhaumlltlich Grundsaumltzlich lassen sich diese in einen temporaumlren und
einen definitiven Hautersatz unterteilen
122 Temporaumlrer Hautersatz Hierbei soll ein sicherer und stabiler temporaumlrer Wundverschluss erreicht werden
bis entweder Spenderareale fuumlr eine erneute Nutzung zur Spalthautentnahme zur
Verfuumlgung stehen oder aber bis zur Kultivierung ausreichend groszliger epithelialer
Transplantate aus den Hautbiopsien eines Brandverletzten Zu dieser Gruppe gehoumlrt
die homologe Fremdhaut die den besten verfuumlgbaren temporaumlren Wundverschluss
darstellt Das groumlszligte Risiko der Fremdhauttransplantation ist die Uumlbertragung von
Infektionskrankheiten Fremdhaut wird in aller Regel von Leichen gewonnen Frische
Fremdhaut besitzt eine sehr gute Barrierefunktion und hat eine guumlnstige Wirkung auf
die Heilung Die kosmetischen Ergebnisse sind bei Anwendung von zweitgradigen
Verbrennungen sehr gut Probleme bestehen in den antigenen Eigenschaften die
innerhalb von 3 bis 4 Wochen zu einer Abstoszligung fuumlhren Die Aufbewahrung uumlber
eine Woche hinaus macht die Kryokonservierung erforderlich wobei die antigenen
Eigenschaften erhalten bleiben Derzeit wird an den meisten deutschen
Verbrennungszentren glycerolkonservierte Haut verwendet die von der Euro Skin
Bank in Beverwijk Niederlande bezogen wird [Horch et al 1994] Sie kann bei 4 degC
gelagert werden und ist im Gegensatz zu frischer und kryokonservierter Haut avital
Waumlhrend des Konservierungsprozesses gehen sowohl die dermalen als auch die
epidermalen Zellen zugrunde Dies fuumlhrt zu einer Reduzierung der antigenen
Eigenschaften [Germann und Raff 1995]
Das Intervall bis ein definitiver Wundverschluss moumlglich ist kann anstelle von
Fremdhaut auch mit allogenen Keratinozytentransplantaten uumlberbruumlckt werden
[Hefton et al 1983] Eine akute Abstoszligung der Fremdkeratinozyten kommt nach
Eldad et al (1987) nur gelegentlich vor und das Risiko der Uumlbertragung von
Infektionen ist geringer [Eldad et al 1987] Entscheidend fuumlr das Uumlberleben der
Fremdkeratinozyten wie grundsaumltzlich aller Transplantate ist der Wundgrund Tief
dermale und tiefere Wunden fuumlhren zu einem fruumlheren Verlust als
Spalthautentnahmestellen mit vorhandener Dermis [Germann und Raff 1995]
6
Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra
Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced
Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der
groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus
Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als
temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll
Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen
klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al
2000]
TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch
vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt
das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren
Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte
Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den
Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt
dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]
123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen
sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend
aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die
Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung
[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos
wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig
belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht
ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange
Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al
1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al
1995 Bannasch et al 2000]
Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als
Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)
Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung
[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
4
Eine weitere Moumlglichkeit zur Behandlung von Verbrennungswunden ist die
Verwendung von Leichenhaut Auf diesem Gebiert leistete Medawar in den 30er und
40er Jahren Pionierarbeit Er erhielt fuumlr seine Arbeit auf dem Gebiet der erworbenen
Immuntoleranz nach Hauttransplantation 1960 den Nobelpreis fuumlr Medizin [Medawar
1961] Hauptprobleme bei der Verwendung von Leichenhaut sind die
Abstoszligungsreaktionen und die Gefahr der Uumlbertragung von Krankheitserregern wie
Hepatitsviren oder HIV
Durch die Errungenschaften in den letzten Jahrzehnten auf dem Gebiet der in vitro
Kulturtechniken entstanden neue Moumlglichkeiten zur Schaffung eines Hautersatzes
Rheinwald und Green gelang durch die Kultivierung von Keratinozyten bereits 1975
die Herstellung von mehrlagigen Epithelschichten im Labor [Rheinwald und Green
1975] Die erste Transplantation eines derartigen Hautersatzes auf einen Menschen
wurde bereits ein paar Jahre spaumlter durch OrsquoConnor 1981 durchgefuumlhrt [Gallico et al
1984] Die Haut war somit das erste mittels bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Organ
Ziel des bdquoTissue Engineeringldquo ist die Regeneration von Gewebe mit normaler
Anatomie und Funktion
Anfaumlngliche Euphorie wurde jedoch gedaumlmpft da es trotz intensiver Bemuumlhungen
weltweit bis dato nicht gelungen war einen Hautersatz zu schaffen der in saumlmtlichen
Eigenschaften wie beispielsweise Stabilitaumlt und Aumlsthetik der natuumlrlichen Haut
entsprach
12 Hautersatzstrategien
121 Anforderungen an einen Hautersatz Die Anforderungen an einen biotechnologisch hergestellten Hautersatz muumlssen sich
an den Eigenschaften menschlicher Haut orientieren Dieser muss zudem die
Faumlhigkeit besitzen mit dem Wundbett in physiologischer Weise zu interagieren Der
ideale kuumlnstliche Hautersatz sollte eine gute Adhaumlrenz an das Wundbett und eine
Keimbarriere gewaumlhrleisten Er sollte einen Schutz vor Fluumlssigkeitsverlust bieten und
zur Temperaturregulation beitragen Auszligerdem stimuliert der optimale Hautersatz die
Wundheilungsvorgaumlnge und verhindert eine ausgepraumlgte Narbenbildung Zudem soll
die bdquoneueldquo Haut langfristig zufriedenstellende Ergebnisse liefern was die
mechanische und aumlsthetische Qualitaumlt angeht [Ruszczak und Schwartz 2000 Schulz
et al 2000 Boyce 2001]
5
Zahlreiche Hautersatzverfahren sind bis heute entwickelt worden und auch
kommerziell erhaumlltlich Grundsaumltzlich lassen sich diese in einen temporaumlren und
einen definitiven Hautersatz unterteilen
122 Temporaumlrer Hautersatz Hierbei soll ein sicherer und stabiler temporaumlrer Wundverschluss erreicht werden
bis entweder Spenderareale fuumlr eine erneute Nutzung zur Spalthautentnahme zur
Verfuumlgung stehen oder aber bis zur Kultivierung ausreichend groszliger epithelialer
Transplantate aus den Hautbiopsien eines Brandverletzten Zu dieser Gruppe gehoumlrt
die homologe Fremdhaut die den besten verfuumlgbaren temporaumlren Wundverschluss
darstellt Das groumlszligte Risiko der Fremdhauttransplantation ist die Uumlbertragung von
Infektionskrankheiten Fremdhaut wird in aller Regel von Leichen gewonnen Frische
Fremdhaut besitzt eine sehr gute Barrierefunktion und hat eine guumlnstige Wirkung auf
die Heilung Die kosmetischen Ergebnisse sind bei Anwendung von zweitgradigen
Verbrennungen sehr gut Probleme bestehen in den antigenen Eigenschaften die
innerhalb von 3 bis 4 Wochen zu einer Abstoszligung fuumlhren Die Aufbewahrung uumlber
eine Woche hinaus macht die Kryokonservierung erforderlich wobei die antigenen
Eigenschaften erhalten bleiben Derzeit wird an den meisten deutschen
Verbrennungszentren glycerolkonservierte Haut verwendet die von der Euro Skin
Bank in Beverwijk Niederlande bezogen wird [Horch et al 1994] Sie kann bei 4 degC
gelagert werden und ist im Gegensatz zu frischer und kryokonservierter Haut avital
Waumlhrend des Konservierungsprozesses gehen sowohl die dermalen als auch die
epidermalen Zellen zugrunde Dies fuumlhrt zu einer Reduzierung der antigenen
Eigenschaften [Germann und Raff 1995]
Das Intervall bis ein definitiver Wundverschluss moumlglich ist kann anstelle von
Fremdhaut auch mit allogenen Keratinozytentransplantaten uumlberbruumlckt werden
[Hefton et al 1983] Eine akute Abstoszligung der Fremdkeratinozyten kommt nach
Eldad et al (1987) nur gelegentlich vor und das Risiko der Uumlbertragung von
Infektionen ist geringer [Eldad et al 1987] Entscheidend fuumlr das Uumlberleben der
Fremdkeratinozyten wie grundsaumltzlich aller Transplantate ist der Wundgrund Tief
dermale und tiefere Wunden fuumlhren zu einem fruumlheren Verlust als
Spalthautentnahmestellen mit vorhandener Dermis [Germann und Raff 1995]
6
Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra
Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced
Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der
groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus
Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als
temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll
Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen
klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al
2000]
TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch
vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt
das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren
Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte
Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den
Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt
dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]
123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen
sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend
aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die
Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung
[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos
wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig
belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht
ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange
Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al
1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al
1995 Bannasch et al 2000]
Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als
Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)
Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung
[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
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84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
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- Statistik und Computerprogramme
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- Ergebnisse
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- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
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- Operation
- Versuchsverlauf
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- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
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- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
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- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
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- Klassische Lichtmikroskopie
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- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
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- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
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- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
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- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
5
Zahlreiche Hautersatzverfahren sind bis heute entwickelt worden und auch
kommerziell erhaumlltlich Grundsaumltzlich lassen sich diese in einen temporaumlren und
einen definitiven Hautersatz unterteilen
122 Temporaumlrer Hautersatz Hierbei soll ein sicherer und stabiler temporaumlrer Wundverschluss erreicht werden
bis entweder Spenderareale fuumlr eine erneute Nutzung zur Spalthautentnahme zur
Verfuumlgung stehen oder aber bis zur Kultivierung ausreichend groszliger epithelialer
Transplantate aus den Hautbiopsien eines Brandverletzten Zu dieser Gruppe gehoumlrt
die homologe Fremdhaut die den besten verfuumlgbaren temporaumlren Wundverschluss
darstellt Das groumlszligte Risiko der Fremdhauttransplantation ist die Uumlbertragung von
Infektionskrankheiten Fremdhaut wird in aller Regel von Leichen gewonnen Frische
Fremdhaut besitzt eine sehr gute Barrierefunktion und hat eine guumlnstige Wirkung auf
die Heilung Die kosmetischen Ergebnisse sind bei Anwendung von zweitgradigen
Verbrennungen sehr gut Probleme bestehen in den antigenen Eigenschaften die
innerhalb von 3 bis 4 Wochen zu einer Abstoszligung fuumlhren Die Aufbewahrung uumlber
eine Woche hinaus macht die Kryokonservierung erforderlich wobei die antigenen
Eigenschaften erhalten bleiben Derzeit wird an den meisten deutschen
Verbrennungszentren glycerolkonservierte Haut verwendet die von der Euro Skin
Bank in Beverwijk Niederlande bezogen wird [Horch et al 1994] Sie kann bei 4 degC
gelagert werden und ist im Gegensatz zu frischer und kryokonservierter Haut avital
Waumlhrend des Konservierungsprozesses gehen sowohl die dermalen als auch die
epidermalen Zellen zugrunde Dies fuumlhrt zu einer Reduzierung der antigenen
Eigenschaften [Germann und Raff 1995]
Das Intervall bis ein definitiver Wundverschluss moumlglich ist kann anstelle von
Fremdhaut auch mit allogenen Keratinozytentransplantaten uumlberbruumlckt werden
[Hefton et al 1983] Eine akute Abstoszligung der Fremdkeratinozyten kommt nach
Eldad et al (1987) nur gelegentlich vor und das Risiko der Uumlbertragung von
Infektionen ist geringer [Eldad et al 1987] Entscheidend fuumlr das Uumlberleben der
Fremdkeratinozyten wie grundsaumltzlich aller Transplantate ist der Wundgrund Tief
dermale und tiefere Wunden fuumlhren zu einem fruumlheren Verlust als
Spalthautentnahmestellen mit vorhandener Dermis [Germann und Raff 1995]
6
Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra
Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced
Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der
groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus
Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als
temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll
Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen
klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al
2000]
TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch
vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt
das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren
Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte
Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den
Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt
dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]
123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen
sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend
aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die
Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung
[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos
wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig
belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht
ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange
Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al
1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al
1995 Bannasch et al 2000]
Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als
Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)
Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung
[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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88 van Zuijlen P P A J van Trier J F Vloemans F Groenevelt R W Kreis and E Middelkoop (2000) Graft survival and effectiveness of dermal substitution in burns and reconstructive surgery in a one-stage grafting model Plast Reconstr Surg 106(3) 615-23
89 Vardaxis N J T A Brans M E Boon R W Kreis and L M Marres (1997) Confocal laser scanning microscopy of porcine skin implications for human wound healing studies J Anat 190 ( Pt 4) 601-11
90 Wainwright D J (1995) Use of an acellular allograft dermal matrix (AlloDerm) in the management of full-thickness burns Burns 21(4) 243-8
91 Wainwright D M Madden A Luterman J Hunt W Monafo D Heimbach R Kagan K Sittig A Dimick and D Herndon (1996) Clinical evaluation of an acellular allograft dermal matrix in full-thickness burns J Burn Care Rehabil 17(2) 124-36
92 Walden J L H Garcia H Hawkins J R Crouchet L Traber and D C Gore (2000) Both dermal matrix and epidermis contribute to an inhibition of wound contraction Ann Plast Surg 45(2) 162-6
93 Wood F M and M L Stoner (1996) Implication of basement membrane development on the underlying scar in partial thickness burn injury Burns 22(6) 459-62
94 Woodley D T H D Peterson S R Herzog G P Stricklin R E Burgeson R A Briggaman D J Cronce and E J OKeefe (1988) Burn wounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils Jama 259(17) 2566-71
95 Xu W L Germain F Goulet and F A Auger (1996) Permanent grafting of living skin substitutes surgical parameters to control for successful results J Burn Care Rehabil 17(1) 7-13
83
8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
6
Als weitere Moumlglickeiten des temporaumlren Hautersatzes sind Integrareg (Integra
Lifesciences Corporation USA) und TransCytereg (fruumlher Dermagraft-TC Advanced
Tissue Sciences Inc USA) zu nennen Integrareg ist ein synthetischer Hautersatz der
groumlszligtenteils aus dreidimensionalem feinporigem bovinem Kollagen sowie aus
Chondroitin-6-Sulfat besteht Zusaumltzlich beinhaltet Integrareg eine Silikonschicht als
temporaumlrer Epidermisersatz die vor Austrocknung und Infektion schuumltzen soll
Integrareg wird schon seit laumlngerer Zeit eingesetzt und hat sich in zahlreichen
klinischen Studien bewaumlhrt [Burke et al 1981 Heimbach et al 1988 Berger et al
2000]
TransCytereg besteht aus einer nicht resorbierbaren Nylonmatrix und einer durch
vitale humane Fibroblasten synthetisierten Kollagenmatrix Bei Applikation enthaumllt
das Produkt keine lebenden Fibroblasten mehr lediglich die extrazellulaumlren
Strukturen bleiben erhalten Im Vergleich mit kryokonservierter Leichenhaut zeigte
Transcytereg gleiche Einheilungsergebnisse [Hansbrough et al 1997] Von den
Wunden laumlsst es sich leichter wieder abloumlsen als allogener Hautersatz und fuumlhrt
dabei zu geringeren Blutungen [Purdue et al 1997]
123 Definitiver Hautersatz Zur Gruppe der Hautersatzverfahren die einen definitiven Wundverschluss erzielen
sollen gehoumlren die sogenannten Cultured Epithelial Autografts (CEAlsquos) bestehend
aus mehreren Lagen autologen Keratinozyten Vorteile dieser Methode sind die
Vermeidung einer Abstoszligung sowie der Ausschluss einer Infektionsuumlbertragung
[Gallico et al 1984] Als Nachteile sind die schwierige Handhabung der CEAlsquos
wegen der hohen Fragilitaumlt und die Ausbildung einer mechanisch nur wenig
belastbaren Haut aufgrund des Fehlens der dermalen Komponente mit einer schlecht
ausgebildeten Basalmembran zu nennen Auszligerdem wird eine relativ lange
Zeitdauer zur Herstellung der CEAlsquos benoumltigt [Woodley et al 1988 Munster et al
1990 Kaiser et al 1994 Poumay et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al
1995 Bannasch et al 2000]
Eine moumlgliche Alternative hierzu stellen kultivierte autologe Keratinozyten als
Suspension in Fibrinkleber dar (Keratinocyte-Fibrin-Glue-Suspension bdquoKFGSldquo)
Dieses Verfahren fand bereits mehrfach seine erfolgreiche klinische Anwendung
[Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Die Applikation von
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
7
KFGS ist technisch einfach durchzufuumlhren Weitere Vorteile im Vergleich mit den
CEAlsquos bestehen in der rascheren Verfuumlgbarkeit der subkonfluenten autologen
Keratinozyten durch eine verkuumlrzte Kultivierungszeit und eine erhoumlhte
Proliferationsbereitschaft der nicht kontaktinhibierten Einzelzellen Eine weitere
Applikationsmoumlglichkeit ist das Aufspruumlhen einer Keratinozytensuspension Es wurde
gezeigt dass die Behandlung von Vollhautwunden mit Spalthauttransplantaten und
einer aufgespruumlhten Keratinozytensuspension zu einer schnelleren Reepithelisierung
fuumlhrte als die Verwendung von Spalthauttransplantaten die nur mit Kulturmedium
ohne Zellen bespruumlht wurden [Wood und Stoner 1996 Navarro et al 2000] Vorteile
gegenuumlber der Verwendung herkoumlmmlicher CEArsquos die in Plastikkulturflaschen
kultiviert werden bestehen in der Verwendung einer Fibrinmatrix auf der die
Keratinozyten ebenfalls kultiviert werden koumlnnen Hierbei entfaumlllt das komplizierte
Abloumlsen der fragilen Haumlutchen vom Flaschenboden und die Handhabung wird
erheblich erleichtert [Ronfard et al 1991 De Luca et al 1992]
124 Bedeutung der dermalen Matrix Neben dem epidermalen Anteil eines Hautersatzes spielt auch der dermale Anteil
eine wichtige Rolle Die Bedeutung einer dermalen Matrix bei der Behandlung von
drittgradigen Verbrennungswunden bei denen die Lederhaut zerstoumlrt ist wurde
durch zahlreiche wissenschaftliche Arbeiten und klinische Studien bestaumltigt [Livesey
et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Durch den Einsatz einer
dermalen Matrix wird die Bildung von Granulationsgewebe gehemmt und die
Wundkontraktion reduziert Auszligerdem fuumlhrt sie durch die Bildung von
Verankerungsstrukturen zwischen Oberhaut und Lederhaut zu einer mechanisch
belastbaren Neodermis [Brown et al 1990 Medalie et al 1997 Coulomb et al
1998]
Das in der vorliegenden Studie verwendete AlloDermreg (LifeCell Corporation USA)
wird aus dezellulierter Leichenhaut durch ein patentiertes Verfahren gewonnen und
ist durch die Moumlglichkeit der Gefriertrocknung langfristig haltbar gemacht worden
[Wainwright 1995] Eine Abstoszligungsreaktion findet aufgrund des Fehlens von MHC-I
und MHC-II-Antigenen nicht statt Auf das Wundbett aufgebracht soll die Matrix von
ortsstaumlndigen Bindegewebszellen besiedelt und vaskularisiert werden [Nanchahal
und Ward 1992] und die Bildung von Granulationsgewebe wird verhindert
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
8
[Ruszczak und Schwartz 2000] Ein Nachteil besteht darin dass das AlloDermreg
wegen der geringen Spenderanzahl nicht unbegrenzt zur Verfuumlgung steht Moumlgliche
Indikationen fuumlr AlloDermreg sind drittgradige Verbrennungswunden ausgedehnte
vollschichtige Hautdefekte und die Unterfuumltterung von Weichteilkonturdefekten in der
aumlsthetisch plastischen Chirurgie
125 Komposit-Hautersatz Da die Anspruumlche an einen kuumlnstlichen Hautersatz immer houmlher werden gewinnen
die vielversprechenden Komposit-Verfahren zunehmend an Bedeutung Sie
bestehen aus einem epidermalen und einem dermalen Anteil und haben von allen
Ersatzverfahren mit der Architektur der gesunden Haut die groumlszligte Aumlhnlichkeit
Untersuchungen belegten die wechselseitige stimulierende Wirkung von Epidermis
und Dermis und fuumlhren zur Ausbildung einer stabilen neuen Haut [Woodley et al
1988] Zwar sind diese Verfahren bislang technisch sehr aufwaumlndig und mit hohen
Kosten verbunden doch sprechen die Vorteile einer rascheren Reepithelisierung und
einer verminderten Wundkontraktion fuumlr sich [Cuono et al 1986 Wainwright 1995
Medalie et al 1996 Rennekampff et al 1997 Walden et al 2000] Ein noch
ungeloumlstes Problem dieser Verfahren stellt die Vaskularisierung des Transplantates
dar die im Wesentlichen von deren Dicke abhaumlngt [Kremer und Berger 2000]
Duumlnnere Transplantate werden schneller revaskularisiert und sichern somit die
Durchblutung des Praumlparates und das Uumlberleben der oberflaumlchlichen epidermalen
Zellen [Xu et al 1996] Dickere Transplantate fuumlhren jedoch zu besseren
Wundheilungsergebnissen mit beispielsweise einer geringeren Wundkontraktion und
besseren aumlsthetischen Ergebnissen
13 Versuchstier Schwein
Anatomisch und physiologisch gesehen ist die Haut und die Wundheilung des
Schweines der des Menschen sehr aumlhnlich Andere Saumlugetiere wie beispielsweise
Maumluse haben nach wie vor ihren unbestrittenen Platz in der wissenschaftlichen
Erforschung der Grundlagen des Hautersatzes Allerdings spielt bei ihnen die
Wundkontraktion die groumlszligte Rolle in der Wundheilung beim Schwein wie auch beim
Menschen steht jedoch die Reepithelisierung im Vordergrund Weitere
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
9
Gemeinsamkeiten zwischen porciner und humaner Haut sind eine aumlhnlich dicke
Epidermis und Dermis mit einem vergleichbaren Verhaumlltnis zueinander (zwischen
110 und 113) gut ausgebildete Reteleisten im Bereich des dermo-epidermalen
Uumlberganges und biochemisch vergleichbares porcines und humanes dermales
Kollagen [Vardaxis et al 1997 Sullivan et al 2001] Zudem kann pro Tier eine
groumlszligere Anzahl Biopsate und damit erheblich mehr wissenschaftlicher Aufschluss
gewonnen werden So koumlnnen mit einem solchen Modell nicht nur interindividuelle
sondern auch intraindividuelle Probenvergleiche erfolgen
14 Fragestellung
Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung eines Vollhautersatzes durch
bdquoTissue Engineeringldquo am Wundheilungsmodell des Schweines
Die Arbeitsgruppe untersuchte bereits in der Vergangenheit die Moumlglichkeit des
Hautersatzes durch die einzeitige Applikation von kultivierten Keratinozyten als
Suspension in Fibrin in Kombination mit einer dermalen Matrix Die hierbei etablierte
Methode sollte in der vorliegenden Arbeit weiterentwickelt und -wenn moumlglich-
optimiert werden Fuumlr die Vertiefung dieser Methode spricht die Moumlglichkeit der
vergleichsweise einfachen Herstellung eines Komposit-Hautersatzes in vivo
bestehend aus einem epidermalen und dermalen Anteil Dies ist vor allem bei einem
klinischen Einsatz von Vorteil Als dermaler Ersatz dient prozessierte Leichendermis
die auf dem freien Markt unter dem Namen AlloDermreg erhaumlltlich ist Der epidermale
Anteil besteht aus einer in vitro einfach herzustellenden Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Beide Anteile werden erst intraoperativ zusammengebracht Auf die
Konstruktion aufwendiger Konstrukte in vitro kann somit verzichtet werden
Zur Optimierung des bestehenden Verfahrens wurden die Transplantate mit
autologen dermalen Fibroblasten inokuliert Somit entstand ein Hautersatz aus
dermaler Matrix inklusive Fibroblasten kombiniert mit einer Keratinozyten-Fibrin-
Suspension Untersucht werden sollte ob und wie die zusaumltzliche Applikation der
Fibroblasten den Prozess der Wundheilung beeinflusst Mehrere Studien weisen auf
einen positiven Einfluss von Fibroblasten auf die Wundheilung wie beispielsweise
die Reepithelisierung und Wundkontraktion hin [Lamme et al 1998 Svensjo et al
2002]
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
10
Auszligerdem kam neben der bereits untersuchten dermalen Matrix humanen Ursprungs
ein porciner Dermisersatz zum Einsatz Hierbei sollte durch den Vergleich eines
humanen Produkts mit einem porcinen Produkt am Schweinemodell untersucht
werden ob die Verwendung der homologen Matrix im Vergleich zu der heterologen
Matrix zu besseren Heilungsergebnissen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Des Weiteren sollten neue Erkenntnisse aus einem Langzeitversuch gewonnen
werden Vergleichbare tierexperimentelle Studien wurden bisher uumlberwiegend uumlber
Versuchszeitraumlume von 4 Wochen durchgefuumlhrt In dieser Studie wurde der
Wundheilungsverlauf erstmalig uumlber einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht um
festzustellen wie die bdquoneueldquo Haut uumlber einen laumlngeren Zeitraum hinweg den
alltaumlglichen Belastungen standhaumllt Vor Beendigung des Versuchs wurde die
Hautqualitaumlt mit Hilfe eines biomechanischen Tests untersucht
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-
11
2 Methodik
21 Uumlberblick
In der vorliegenden Studie wurden kultivierte Keratinozyten in Form einer
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) zusammen mit einer dermalen Matrix
auf Vollhautwunden von Hausschweinen transplantiert Als dermale Matrix diente
AlloDermreg humanen Ursprungs (hAD) und AlloDermreg porcinen Ursprungs (pAD)
Zusaumltzlich wurde ein Teil der dermalen Matrices sowohl humanen als auch porcinen
Ursprungs vor der Transplantation mit kultivierten autologen dermalen Fibroblasten
inokuliert (hAD+F und pAD+F)
Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS bzw nur mit einer Fibroblasten-
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) behandelt wurden
Es ergaben sich folgende Transplantatgruppen
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS)
- Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS)
- humanes AlloDermreg mit KFGS (hAD KFGS)
- humanes AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (hAD+F KFGS)
- porcines AlloDermreg mit KFGS (pAD KFGS)
- porcines AlloDermreg plus Fibroblasten mit KFGS (pAD+F KFGS)
Insgesamt wurden 9 Tiere operiert mit je 6 Wunden pro Tier
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt (s Abb 2-1) Die
Anordnung der Transplantate erfolgte randomisiert
12
Schwanz Kopf pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS
Abb2-1 Schematische Darstellung zur Anordnung der Transplantate auf dem Ruumlcken eines Schweines KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Bei allen Tieren erfolgte fuumlr mindestens 4 Wochen nach der Transplantation eine
Wunddokumentation 5 Tiere schieden nach diesem Zeitraum aus dem Versuch aus
4 Tiere wurden fuumlr weitere 5 Monate beobachtet (Langzeittierversuch uumlber insgesamt
6 Monate)
Zur Gewinnung der Zellen wurde jedem Tier eine spindelfoumlrmige etwa 10 cmsup2 groszlige
Hautprobe an der Flanke entnommen Die Epidermis wurde enzymatisch von der
Dermis separiert Aus der Epidermis wurde unter serumfreien Kulturbedingungen
eine Keratinozyten-Primaumlrkultur angelegt Die Dermis diente der Gewinnung der
Fibroblasten die in serumhaltigen Medium kultiviert wurden Nach einer
Kultivierungszeit von 14 ndash 21 Tagen wurden die Transplantation vorbereitet Die
Fibroblasten wurden 4 Tage vor der Transplantation auf die Unterseite einer dermale
Matrix (AlloDermreg) ausgesaumlt Die Fibrin-Zell-Suspension wurde am Tag der
Transplantation hergestellt In die Thrombinkomponente eines handelsuumlblichen
Fibrinklebers wurden die Keratinozyten und die Fibroblasten aufgezogen und somit
die Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (F-KFGS) und die
Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hergestellt
In Inhalationsnarkose wurden die Wundraumlnder mittels einer Taumltowiermaschine
markiert um somit eine Verlaufskontrolle der Wundkontraktion zu haben
Anschlieszligend wurden pro Tier jeweils sechs 5 x 5 cm groszlige Exzisionswunden bis
auf die Muskelfaszie auf dem Ruumlcken gesetzt die eine Nekrektomie von tiefen
13
Verbrennungswunden simulierten Die Behandlung der Exzisionswunden erfolgte mit
den bereits beschriebenen Transplantatgruppen (s oben Abb 2-1)
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde bei allen Tieren fotografisch und
planimetrisch uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Mit diesen Daten
wurden die Einheilung der Transplantate der Wundverschluss und die
Wundkontraktion ausgewertet
Die mikroskopische Beurteilung erfolgte mittels Biopsien die an den post-OP Tagen
7 14 und 28 bzw bei den Tieren des Langzeitversuchs zusaumltzlich nach 6 Monaten
entnommen wurden Zur klassischen Lichtmikroskopie wurden fuumlr Haumlmatoxilin-Eosin
Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen Biopsieproben formalinfixiert
Auszligerdem wurde von den in fluumlssigem Stickstoff schockgefrorenen Biopsieteilen
Kryoschnitte fuumlr immunhistochemische Untersuchungen angefertigt Mit der
indirekten Immunperoxidasetechnik wurde zum Nachweis der rekonstituierten
Basalmembran Kollagen-VII zum Nachweis von Myofibroblasten αminussm-Aktin
angefaumlrbt
Zudem wurde die Elastizitaumlt der verschiedenen Transplantat-Gruppen bei den Tieren
des Langzeitversuchs nach 6 Monaten mittels eines biomechanischen Tests
(Cutometerreg MPA580 Fa CourageampKhazaka Koumlln) untersucht
14
Abbildung 2-2 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus
Histologische und morphometrische Auswertung aller Tiere
Langzeittiere auf dem Bauernhof
Applikation der Fibrin-Zell-Suspension auf die bereits eingenaumlhte dermale Matrix
Zellkultivierung fuumlr 21 Tage
bdquoZellernteldquo nach Trypsinierung
Wundverschluszlig der einzelnen Gruppen d28
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K K+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Gruppen
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt5050-100100
Biopsieentnahme an post-OP Tag 7 14 28 (dagger Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten
Trennung der Epidermis von der Dermis
Entnahme der Hautprobe
Bestimmung der Hautqualitaumlt nach 6 Monaten
15
22 Zellkultivierung
221 Kultivierung der Schweinekeratinozyten
Hautentnahme und Hautverarbeitung
Unter Vollnarkose (Beschreibung siehe Seite 23) wurde dem Versuchstier
(Hausschwein deutsche Landrasse Alter 5 Wochen Geschlecht weiblich
Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem Abwaschen der Entnahmestelle
mit Jodobacreg (Bode Chemie Hamburg) an der Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges
spindelfoumlrmiges Hautresektat entnommen Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch
Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial verschlossen
Die Probe wurde anschlieszligend an einer sterilen Werkbank (bdquolaminar air flowldquoNalge
NUNC International Wiesbaden-Biebrich Deutschland) in mit Phosphatpuffer (1x
PBS Biochrom KG) gefuumlllten Petrischalen praumlpariert Nach dem Entfernen des
Subkutangewebes mit sterilen Instrumenten folgte zur Reinigung und der weiteren
Desinfektion das jeweils zweimalige Schwenken in 70 Alkohol und PBS Das
soweit vorbereitete Hautstuumlck wurde nun in eine Petrischale mit 1 Dispase (Fa
Boehringer Mannheim) gelegt der 10 microg Gentamycin zugesetzt waren und uumlber
Nacht bei 4 degC inkubiert Die Proteinase Dispase zerstoumlrt im Bereich der
Basalmembran Kollagen IV und somit den Dermo-Epithelialen-Zusammenhalt Die
Desmosomen der Epidermis bleiben allerdings erhalten [Poumay et al 1994] Vor
der weiteren Praumlparation erfolgte anschlieszligend an die Aufbewahrung im Kuumlhlschrank
eine weitere zweistuumlndige Inkubation im Brutschrank bei 37 degC um den Verdau zu
unterstuumltzen Der Verdau galt als abgeschlossen wenn sich die Epidermis als
Ganzes von der Dermis abloumlsen lieszlig
Keratinozytenisolierung
Das abgeloumlste Epithel wurde mit einer sterilen Schere zerkleinert und anschlieszligend
in sterilen Roumlhrchen mit 5 ml TrypsinEDTA (025 Fa Sigma BRD) 20 min im 37
degC warmen Wasserbad inkubiert wobei sie alle 5 min geschuumlttelt wurden Dadurch
wurde sowohl eine mechanische als auch enzymatische Zelldissoziation unter
Zerstoumlrung der Desmosomen ermoumlglicht Durch Resuspension mit 7 ml 10 -igem
NCS (neonatales Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) wurde der
enzymatische Vorgang gestoppt und somit eine Schaumldigung der Zellen vermieden
16
Diese Loumlsung wurde durch ein feines Zellsieb mit 70 microm Porengroumlszlige (Fa Falcon-
Becton-Dickinson UK) filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Der erhaltene Uumlberstand wurde verworfen und das gewonnene Zellpellet in
Komplettmedium resuspendiert Dieses setzte sich zusammen aus serumfreien
Keratinozytenmedium EGF (Epithelial Growth Factor) Rinderhypophysenextrakt
(alles Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 microgml Gentamycin Nach der
Untersuchung der Vitalitaumlt der Zellen mittels Trypanblau 04 (Fa Sigma Irvine
Groszligbritannien) und der Ermittlung der gewonnen Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-
Zaumlhlkammer erfolgte die Aussaat in einer Dichte von 3 Mio Zellen pro 13 ml Medium
in einer 75 cmsup2 kollagenbeschichteten Zellkulturflasche (Fa Falcon BRD) mit
Ventilationsdeckel (Fa Costar Corporation Cambridge MA USA) Die
anschlieszligende Inkubation erfolgte in einem Brutschrank (HeraCell Fa
HeraeusKendro Laboratory Products Hanau Deutschland) bei 37 degC und 5 -iger
CO2 Begasung Der Mediumwechsel fand alle 2-3 Tage statt Von den urspruumlnglich
inokulierten Zellen waren etwa noch 1-5 mitosefaumlhig [Rheinwald und Green 1975]
Zellen aus den oberen Schichten der Epidermis wie zB Stratum corneum und
Stratum granulosum erlangten keine Adhaumlrenz und wurden bei den Mediumwechsel
abgesaugt Die restlichen mitosefaumlhigen Zellen lagerten sich in Form von Klonen ab
und breiteten sich einlagig auf dem Flaschenboden als sogenannter bdquoMonolayerldquo
aus Da die Zellen bei zu hoher Dichte ihre mitotische Potenz durch Kontaktinhibition
verlieren [Freshney 1992] war es noumltig die Zellen bei 70-80 iger Konfluenz nach
ca 10 Tagen zu passagieren Hierfuumlr wurden die Zellen mit 4 ml TrypsinEDTA (005
FaSigma) fuumlr ca 7 min bei 37 degC inkubiert Zusaumltzliches Abklopfen erleichterte
das Abloumlsen der Zellen vom Flaschenboden Nach Abstoppen der Trypsinierung mit
neonatalem Kaumllberserum und Zentrifugation war es ausreichend die Zellen mit einer
Dichte von 1 Mio pro Kulturflasche erneut auszusaumlen Aus einer 75 cmsup2 Kulturflasche
waren bei 80 Konfluenz ca 3 Mio Zellen zu gewinnen Diese Vermehrung ist nicht
unbegrenzt durchfuumlhrbar da die Keratinozyten in der Kultur einen houmlheren
Stoffwechsel als in vivo aufweisen Nach 80-100 Mitosen was etwa 6 Passagen
entspricht geht die Wachstumskurve gegen null und Fibroblasten uumlberwuchern die
Kultur [Leigh 1994] Vermutlich fehlen den Keratinozyten in vitro langfristig parakrine
Stimuli die fuumlr die Persistenz von Basalzellen essentiell sind [Pittelkow und Scott
1986] Der guumlnstigste Zeitpunkt fuumlr eine Transplantation ist nach 2-3 Wochen
17
erreicht wenn schon eine betraumlchtliche Vermehrung stattgefunden hat die meisten
Zellen sich aber noch in der exponentiellen Wachstumsphase befinden
2211 Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
Fuumlr die Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurden
proliferierende Zellen einer subkonfluenten und somit nicht kontaktinhibierten Kultur
benoumltigt um einen moumlglichst hohen Anteil an Stammzellen zu erhalten [Kaiser et al
1994] Die Zellkulturen wurden wie bei Durchfuumlhrung einer Passage abzentrifugiert
resuspendiert und ausgezaumlhlt Durch erneute Abzentrifugation einer definierten
Menge Medium samt Zellen erhielt man so ein Zentrifugat mit bekannter
Keratinozytenanzahl Dieses Pellet konnte nun in der gewuumlnschten Konzentration in
einem handelsuumlblichen Fibrinkleber (Tissucol Duo Sreg Packungsgroumlsse 05 ml Fa
Immuno Heidelberg) resuspendiert werden
Der biologische Zweikomponentenkleber besteht aus einer Fertigspritze
Kleberproteinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt Humanplasmaproteinfraktion mit
Fibrinogen Blutgerinnungsfaktor XIII Plasmafibronectin Plasminogen und bovines
Aprotinin) und einer Fertigspritze Thrombinloumlsung (hier 05 ml enthaumllt 250 IE
humanes Thrombin und Calciumchlorid-Dihydrat) Mit dem System Duploject koumlnnen
die beiden Spritzen parallel entleert werden so dass die Vermischung der beiden
Komponenten unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Wunde erfolgt
Zur Resuspension des Pellets wurde die Thrombinloumlsung aufgrund ihrer geringeren
Viskositat gewaumlhlt Unter sterilen Kautelen wurde das definierte Keratinozytenpellet
(hier zwischen 18 ndash 72 Mio gesamt fuumlr alle 6 Wunden dh 03 ndash 12 Mio pro
Defekt) in die Spritze mit der Thrombinloumlsung aufgezogen So ergab sich eine
Zellkonzentration von 03 ndash 12 Mio Keratinozyten pro ml Endvolumen Fibrinkleber
wobei auf jede Wunde 1 ml Fibrinkleber appliziert wurde Das fertig installierte
Applikationsset wurde bis zur Operation in steriler Verpackung bei 4 ordmC gelagert Die
Durchfuumlhrung der Passage bis zum Aufbringen des KFGS auf die Wunden erfolgte
binnen 3 Stunden was den Anforderungen des Herstellers entsprach
18
Abb 2-3 Subkonfluente Keratinozytenkultur wie sie zur Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFGS) verwendet wurde
222 Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
Die nach dem Abloumlsen der Oberhaut verbliebene Lederhaut wurde an der sterilen
Werkbank mit einer sterilen Schere zerkleinert und fuumlr 2 h in Kollagenase II (35 mg
Fa Biochrom 268 Umg aufgeloumlst in 45 ml PBS und steril filtriert) bei 37 ordmC im
Schuumlttelbad inkubiert Die Kollagenase eine Proteinase spaltet die Dreifach-Helix
der Kollagenmolekuumlle und loumlst somit die Zellen aus ihrer extrazellulaumlren Matrix Um
die Enzymaktivitaumlt zu stoppen wurde neonatales Kaumllberserum im Uumlberschuss
zugegeben Der fluumlssige Uumlberstand wurde durch ein Zellsieb der Porengroumlszlige 70 microm
in sterile Roumlhrchen filtriert und bei 4 degC und 1200 Umin fuumlr 10 min zentrifugiert
Das so gewonnene Pellet wurde in DMEndashMedium (Dulbeccoacutes Modified Eagles
Medium mit 45 gl Glucose Biowitthaker Belgien) mit 10 -igem NCS (neonatales
Kaumllberserum Fa Gibco Eggenstein BRD) und 1 -igem PenicillinStreptomycin
resuspendiert und die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zaumlhlkammer bestimmt Die
Aussaat der Zellen erfolgte in einer Konzentration von 3-4 Mio Zellen pro 75 cmsup2
Kulturflasche Mediumwechsel erfolgte alle 2-3 Tage Die Zellen erreichten nach
etwa 5 Tagen eine 70-80 -ige Konfluenz und wurden passagiert (Abb 2-3) Nach
ca 3 Passagen wurden die Zellen fuumlr die Transplantation vorbereitet
19
Abb 2-4 Subkonfluente Fibroblastenkultur wie sie zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber- Suspension (F-KFGS) verwendet wurden
2221 Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
(F-KFGS)
Zur Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension wurde am
Tag der Transplantation der Teil der Fibroblasten verwendet der bereits zuvor zum
Zeitpunkt der Inokulierung der Kollagenmatrix mit Fibroblasten separiert und
weiterkultiviert wurde Die Inokulierung auf der Unterseite der dermalen Matrix fand
stets 4 Tage vor der Transplantation mit ca 200000 ndash 700000 Fibroblasten pro
Defekt statt Die gleiche Anzahl an Zellen wurde weiterkultiviert und fuumlr die F-KFGS-
Gruppe verwendet Die Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert Das Pellet
wurde mit 05 ml der bereits praumlparierten Keratinozyten-Thrombin-Mischung
resuspendiert und in einer separaten Spritze steril bis zur Transplantation
aufbewahrt
2222 Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
Die Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten erfolgte mit Fluospheresreg (Molecular
Probes Oregon USA) Dies sind fluoreszierende Micropartikel die in die Zelle
inkorporiert werden und auf diese nicht toxisch wirken Diese Markierung diente
dazu um in einem in vitro Ansatz herauszufinden wie die Fibroblasten nach der
Inokulierung auf der dermalen Matrix in diese integriert werden und ob hierbei
20
Unterschiede zwischen der duumlnneren humanen Dermis (01-05 mm) und der
dickeren porcinen Dermis (0675 mm) bestanden
Fuumlr die Markierung der Fibroblasten wurden Fluospheresreg in Medium (15000 05
microM) gegeben und die Zellen damit in der Kulturflasche uumlber Nacht im Brutschrank
inkubiert Mit dem Fluoreszenzmikroskop (Fa Zeiss Jena) wurde am naumlchsten Tag
uumlberpruumlft ob die Fluospheresreg von den Fibroblasten aufgenommen wurden
Die so markierten Zellen wurden etwa 5 Tage weiterkultiviert und anschlieszligend auf
die Unterseite der dermalen Seite von 1 cmsup2 groszligen Stuumlckchen humanem und
porcinem AlloDermreg in einer 12 well Platte aufgetragen (40000 Zellen geloumlst in 300
microl Medium pro 1 cmsup2) Nachdem die Zellen nach 45 min auf der Matrix adhaumlrent
wurden wurden die wells mit DME-Medium aufgefuumlllt Die Probeentnahme und
histologische Aufarbeitung erfolgte an den Tagen 1 4 7 und 10
Abb 2-5 b Abb 2-5 a
Abb 2-5 a und b Ein mit Fluospheresreg fluoreszenzmarkierter Fibroblast AlloDermreg wurde in vito mit markierten Fibroblasten besiedeln um deren Verbleib innerhalb der Matrix besser verfolgen zu koumlnnen
223 Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (AlloDermreg)
Die Verwendung eines dermalen Ersatzes findet insbesondere bei der Behandlung
von schwerstverbrannten Patienten bereits eine weitreichende klinische Anwendung
[Livesey et al 1995 Wainwright 1995 Gustafson und Kratz 1999] Im Rahmen
dieser Arbeit wurde das Produkt AlloDermreg (Fa Lifecell Texas USA) verwendet
das schon seit vielen Jahren weltweit frei auf dem Markt erhaumlltlich ist und neben der
21
Verwendung als Dermisersatz in der plastischen Chirurgie zur Gewebeaugmentation
beispielsweise Lippenaugmentation eingesetzt wird Hierbei handelt es sich um
humane Leichenhaut die mittels eines mehrere Pozessierungsschritte umfassenden
Verfahrens bearbeitet wird um epidermale und dermale Zellen herauszuloumlsen ohne
dabei die biologische dermale Matrix zu zerstoumlren Als Erstes wird die Epidermis von
der Dermis getrennt Dann werden die zellulaumlren Bestandteile der verbleibenden
Dermis (zB Endothelzellen) die eine immunologische Abstoszligungsreaktion bewirken
koumlnnten herausgeloumlst Als letzter Schritt erfolgt eine moumlglichst gewebeschonende
Gefriertrocknung Von Bedeutung fuumlr die spaumltere Transplantation der Keratinozyten
und die Reepithelisierung ist die Tatsache dass bei der Herstellung die aus Lamina
lucida und Lamina densa bestehende Basalmembran intakt bleibt Vor dem
Versterben des Spenders werden Blutproben auf Hepatitis B und C HIV-I HIV-2
HTLV-I HTLV-II Antikoumlrper und Syphilis hin untersucht um das Risiko der
Uumlbertragung von Erregern so gering wie moumlglich zu halten Der Hersteller garantiert
ein von zellulaumlren Bestandteilen freies und somit ein als immunologisch inert
geltendes Produkt
Neben dem humanen Dermisersatz kam auch ein analoger porciner Dermisersatz
zum Einsatz Diese homologe porcine Matrix wurde nach demselben Verfahren wie
auch das AlloDermreg humanen Ursprungs hergestellt Die Dicke der humanen
Dermis betrug laut Hersteller 0007-002 Zoll (01-05 mm) die des porcinen ca
0027 Zoll (0675 mm) Trotz der Herausloumlsung der zellulaumlrer Bestandteile wird der
Einfluszlig der Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung kontrovers
diskutiert So gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren
dermalen Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate
und erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
Sowohl das humane als auch das porcine Allodermreg wurde vor der Transplantation
geschlitzt Durch die Schlitze gelangt das naumlhrstoffhaltige Wundsekret zu den
transplantierten Keratinozyten
Beimpfen der azellulaumlren Matrix (AlloDermreg) mit den praumlkultivierten Fibroblasten
Zunaumlchst wurden die gefriergetrockneten Dermisstuumlcke (5 x 5 cm) in isotoner
Kochsalzloumlsung 3 mal rehydriert Das porcine AlloDermreg musste im Gegensatz zu
dem praumlparierten humanen AlloDermreg nach dem Rehydrieren mit einem Skalpell
geschlitzt
22
Die praumlkultivierten Fibroblasten wurden trypsiniert zentrifugiert und ausgezaumlhlt Ein
Drittel der Zellen (200000-700000 Fibroblasten geloumlst in 05 ml DMEM) wurden auf
die Unterseite eines Dermisstuumlcks aufgetragen Nach einer Stunde Inkubationszeit
wurde Medium zugegeben und die Komposit-Konstrukte fuumlr 4 Tage bis zum
Operationstag kultiviert Somit hatten die Zellen Zeit in dem dermalen Konstrukt
adhaumlrent zu werden und einzuwachsen Ein Drittel der Fibroblasten und somit die
gleiche Anzahl an Zellen die auch auf die Transplantate gebracht wurde wurde in
einer Kulturflasche bis zum Operationstag weiterkultiviert Diese Zellen waren fuumlr die
Fibroblasten-KFGS-Gruppe bestimmt Somit konnte von einer aumlhnlichen Zellzahl auf
allen mit Fibroblasten behandelten Wunden ausgegangen werden da sowohl die
Zellen auf dem vorbeimpften Transplantat als auch in der Kulturflasche bis zum
Zeitpunkt der Operation weiter proliferieren konnten
Abb 2-6 a Kollagen VII-Faumlrbung Abb 2-6 b Elastica-van-Gieson-Faumlrbung
Abb 2-6 a und b Der verwendete azellulaumlre dermale Ersatz (AlloDermreg) enthaumllt eine intakte kontinuierliche Basalmembran (Pfeil Abb 2-5 a Kollagen VII-Faumlrbung) Die Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (Abb 2-5 b) zeigt die vorhandenen kollagenen (rot) und elastischen (schwarz) Fasern (Vergroumlszligerung beide x 100)
23
23 Tierversuchsdurchfuumlhrung
Nach Genehmigung durch die Tierversuchskommission des Regierungspraumlsidiums
Freiburg (Aktenzeichen 35-9185811591) wurden insgesamt 10 Schweine
(deutsche Landrasse Geschlecht weiblich Zuchtbetrieb Rein Breisach-Guumlndlingen)
im Alter von 8-12 Wochen und einem Ausgangsgewicht von 30-35 kg als
Versuchstiere verwendet
231 Operation
Insgesamt wurden 10 Tiere operiert wobei ein Tier kurz nach Entnahme der
Hautprobe verstarb Die Transplantation erfolgte somit bei 9 Tieren mit je 6 Wunden
Auf allen Tieren wurden 2 der 6 Wunden mit den Kontrollgruppen versehen (KFGS
und F-KFGS ohne dermale Matrix) Die restlichen 4 Wunden wurden mit den
dermalen Matrices mit und ohne Fibroblasten und KFGS behandelt Die Anordnung
der Transplantate erfolgte randomisiert
5 Tiere blieben fuumlr 4 Wochen post-OP im Versuch
4 Tiere blieben fuumlr 6 Monate post-OP im Versuch
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber den Versuchszeitraum von 4 Wochen
Bei 4 Tieren kam nur die dermale Matrix humanen Ursprungs (hAD) zum Einsatz (s
Abb 2-7 2-9)
Bei 1 Tier kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die Matrix
porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
hAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
hAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-7 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten
24
Transplantatverteilung bei den Tieren uumlber einen Versuchszeitraum von 6 Monaten
Bei allen 4 Tieren kam sowohl die Matrix humanen Ursprungs (hAD) als auch die
Matrix porcinen Ursprungs (pAD) zum Einsatz (s Abb2-8 2-9)
Schwanz Kopf
pAD KFGS
hAD KFGS
F-KFGS
pAD+F KFGS
hAD+F KFGS
KFGS Abb 2-8 Schematische Darstellung der Transplantatanordnung der Tiere die mit der humanen und der porcinen Dermis behandelt wurden KFGS = Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension F-KFGS = Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension hAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg plus Fibroblasten pAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg plus Fibroblasten
Insgesamt ergab sich folgende Verteilung bei der Anzahl der Transplantatgruppen
Wunden gesamt
alle Tiere 54
davon Langzeitversuch uumlber 6 Monate 24
KFGS 9 4
KFGS+F 9 4
hAD+F KFGS 13 4
hAD KFGS 13 4
pAD+F KFGS 5 4
pAD KFGS 5 4
25
KFGS
Muskel
Dermis
Epidermis
Fibrinkleber mit Keratinozten Praumlinkubiertes
AlloDermreg Vollhauzexzisionswunde
hAD+F KFGShAD KFGSF+KFGS
Keratinozyten
Abb 2-9 Schematische Darste KFGS = Keratinozyten-FibrinkleF-KFGS = Fibroblasten-KeratinohAD = humanes AlloDermreg hAD+F = humanes AlloDermreg ppAD = porcines AlloDermreg pAD+F = porcines AlloDermreg p
Die im Rahmen der Versuch
Anleitung und Aufsicht eines T
den Rahmen einer Wundins
Verbaumlnde mit fotografisc
beziehungsweise Sedierung
Hautentnahme zur Kultivierun
Transplantation und die spaumlt
Arealen zur histologischen Un
pAD KFGS
Fib
llung der Wundbehandlu
ber-Suspension zyten-Fibrinkleber-Susp
lus Fibroblasten
lus Fibroblasten
sdurchfuumlhrung erfor
ierarztes Saumlmtliche
pektion uumlberschritte
her Dokumentatio
durchgefuumlhrt Hie
g der autologen Ke
ere Entnahme der
tersuchung
pAD+F KFGS
roblasten
ng
ension
derlichen Eingriffe erfolgten unter
Manipulationen an den Tieren die
n (Uumlberpruumlfung auf Integritaumlt der
n) wurden unter Narkose
rzu zaumlhlten insbesondere die
ratinozyten und Fibroblasten die
Biopsien aus den transplantierten
26
Vor den geplanten Eingriffen erfolgte die sedative Praumlmedikation mit Flunitrazepam
im und Ketamin im Anschlieszligend wurde unter laryngoskopischer Kontrolle
intubiert und mittels Vecuronium iv muskelrelaxiert Die Narkose wurde mit
SauerstoffLachgas und Flunitrazepam iv Propofol iv Fentanyl iv und
Vecuronium iv aufrechterhalten Zur Volumensubstitution erfolgte eine basale Gabe
von Ringer-Loumlsung iv Die Toumltung der Tiere nach Abschluss der Experimente
erfolgte durch eine letal wirkende Bolusgabe von KCl iv
232 Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
Unter Vollnarkose wurde dem Versuchstier (Hausschwein deutsche Landrasse Alter
5 Wochen Geschlecht weiblich Ausgangsgewicht 35 kg) nach Rasur und sterilem
Abwaschen der Entnahmestelle mit Jodobac (Bode Chemie Hamburg BRD) an der
Flanke ein ca 10 cmsup2 groszliges spindelfoumlrmiges Hautstuumlck entnommen (Abb 2-10)
Der Entnahmedefekt wurde primaumlr durch Ruumlckstichnaumlhte mit nichtresorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilonreg II 2-0 Fa Ethicon Norderstedt BRD) spannungsfrei
verschlossen
Abb 2-10 Wunde nach Entnahme eines spindelfoumlrmigen Hautresektats zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblasten
27
233 Taumltowierung und Transplantation
Die Taumltowierung der Wundraumlnder wurde eingefuumlhrt um waumlhrend des
Versuchverlaufs die Kontraktionsmessungen einheitlich durchfuumlhren zu koumlnnen
Dabei verwendeten wir eine bei plastisch-rekonstruktiven Operationen
herangezogene Taumltowiermaschine (Fa Voltkraft BRD) und graues Taumltowierpigment
(bdquoAccentsldquo Micropigmentation grey pigment San Luis Obispo CA USA Abb 2-11
2-12)
Abb 2-11 Die zur Markierung der Wundraumlnder eingestzte Taumltowiermachine mit Pigment
Abb 2-12 Nach Auftragen des Taumltowierpigments erfolgte die Taumltowierung
Nach der Taumltowierung wurden unter sterilen OP-Bedingungen auf dem Ruumlcken jedes
Versuchstieres 6 Vollhautdefekte mit einer Groumlszlige von 5 x 5 cm bis auf die
Muskelfaszie ausgeschnitten Nach sorgfaumlltiger Blutstillung und ausgiebiger
28
Rehydrierung der Dermis-Stuumlcke die nicht mit Zellen beimpft worden waren wurde
die Dermis mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 4-0 Fa Ethicon Norderstedt
BRD) an den Wundraumlndern in die Exzisionswunden eingenaumlht und die Keratinozyten-
Fibrinkleber-Suspension aufgetragen (Abb 2-13) Auf eine Wunde wurde als
Kontrolle die reine Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension auf eine andere die
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrin-Suspension jeweils ohne dermale Matrix
aufgetragen
Nach Aushaumlrten des Fibrins was etwa 20-30 sec dauerte wurde eine stabile
Fettgaze (Grassolindreg Fa Hartmann BRD) auf die Defekte aufgebracht und die
Wundraumlnder mit einer NeomycinBacitracin- haltigen Salbe bestrichen (Polyspectran-
Salbereg Fa Alcon BRD) Durch die Gaze konnte ein feuchtes die Wundheilung
foumlrderndes Milieu geschaffen werden und das Verkleben des Verbandes mit den
Transplantaten verhindert werden Zusaumltzlich wurde die Gaze mit einer
semipermeablen Siliconfolie (Biobranereg Bertel Pharmaceuticals Inc Texas USA)
bedeckt und an den Wundraumlndern mit nicht resorbierbarem Faden (Ethilonreg II 5-0
Fa Ethicon Norderstedt BRD) fixiert Biobranereg aus einem Silikonfilm und einem
Nylonnetzwerk bestehend foumlrdert die Wundheilung und stellt eine Barriere fuumlr
Bakterien dar Auszligerdem folgte eine mehrlagige Abdeckung mit Kompressen und
einer Schaumstoffplatte die mit Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa
Beiersdorf AG Hamburg BRD) fixiert wurden Dies gewaumlhrleistete eine
Wundkompression und einen mechanisch-hygienischen Schutz Postoperativ wurden
die Tiere taumlglich bis zum kompletten Wundverschluss auf Integritaumlt der Verbaumlnde
sowie auf etwaige Wundinfektionen hin untersucht
Abb 2-13 Auftragen der Fibrinkleber-Zellsuspension mit einer Zweikomponentenspritze
29
234 Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
Die Versuchsdauer fuumlr die Kurzzeittiere betrug 28 Tage die der Langzeittiere 6
Monate Die Tiere waren in einer fuumlr sie eigens eingerichteten Stallbox
untergebracht die taumlglich gereinigt wurde Auszligerdem wurden die Langzeittiere nach
komplettem Wundverschluszlig paarweise in mit frischem Stroh ausgelegten Staumlllen auf
einem landwirtschaftlichen Universitaumltslehrbetrieb untergebracht Um Infektionen
vorzubeugen wurden die angelegten Verbaumlnde engmaschig auf ihre Integritaumlt hin
untersucht
Der makroskopische Wundheilungsverlauf wurde zu den Probeentnahmen an Tag 7
14 und 28 sowie bei den Langzeittieren nach 42 Tagen 3 und 6 Monaten
protokollarisch und photographisch festgehalten
Um den Wundheilungsverlauf auch mikroskopisch beurteilen zu koumlnnen wurde zu
definierten Zeitpunkten (post-OP Tage 7 14 28) je eine Stanzbiopsie (6mm
Durchmesser) aus der Mitte der Wunde entnommen Durch die Entnahme der
Biopsie aus der Wundmitte konnte sichergestellt werden dass es sich um die
transplantierten Zellen handelte und nicht um von den Wundraumlndern her
einwachsendes Epithel Zum jeweiligen Zeitpunkt des Versuchendes am post-OP
Tag 28 (Kurzzeittiere) und nach 6 Monaten (Langzeittiere) wurde die komplette
Wunde exzidiert Saumlmtliche Probeentnahmen fanden unter Vollnarkose statt
Um den Wundheilungsverlauf nicht zu sehr zu beeinflussen wurde allerdings nicht
jede Wunde nach 7 und 14 Tagen bzw nach 28 Tagen biopsiert Durch die
Probeentnahme kommt es zur zusaumltzlichen Bildung von Granulationsbewebe um das
entnommene Areal herum und somit zur Beeintraumlchtigung der Wundkontraktion
Die gewonnenen Proben wurden mit einem Mikrotommesser halbiert Ein Teil wurde
daraufhin fuumlr die klassische Lichtmikroskopie in 4 -igem Formalin (Fa Merck
Darmstadt BRD) fixiert und die zweite Haumllfte fuumlr die immunhistochemischen
Untersuchungen in fluumlssigem Stickstoff schockgefroren wodurch die Zerstoumlrung von
antigenen Epitopen verhindert wird [Luppa 1987]
235 Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
Von Hunt und Dunphy (1969) wird die Wundkontraktion als bemerkenswerter
physiologischer Vorgang bezeichnet durch den sich bdquooffene Wunden spontan
schlieszligen Im Gegensatz zur Bildung des Granulationsgewebes ist der Prozeszlig der
30
Kontraktion weniger vom Gesamtorganismus abhaumlngig und stellt damit eine
Ausnahme im Heilvorgang dar
Die Wundkontraktion fuumlhrt durch die zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten zu
einer Annaumlherung der nicht zerstoumlrten Gewebssubstanzen Myofibroblasten
entwickeln sich im Wundgebiet aus eingewanderten Fibroblasten und aumlhneln mit
ihren aktinhaltigen Mikrofilamenten den glatten Muskelzellen Folglich wird das
Gebiet der unvollstaumlndigen Reparation so klein wie moumlglich gehalten Durch diesen
Prozess wird bei Tieren die erforderliche Neubildung von Bindegewebe und Epithel
um 50-90 reduziert Sie wirkt sich um so mehr aus je beweglicher die Haut
gegenuumlber der Unterlage ist Die Langerschen Linien bestimmen dabei den Verlauf
der Zugkraumlfte [Sedlarik und Weidenbach 1993 Singer und Clark 1999]
Auswertung der Planimetrie
Zur Bestimmung der Kontraktion wurde eine Planimetrie durchgefuumlhrt Dazu wurden
die mittels der Tatowierung definierten Wundraumlnder auf eine Wundschablone
uumlbertragen Diese Kopie der Wunden wurde mit einem Flachbettscanner eingescannt
und das digitalisierte Bild mit einem Rechner zur Flaumlchenberechnung mit dem
Programm bdquoScion Imageldquo bearbeitet werden Dieses Programm ist eine kostenlose
Version des von den National Institutes of Health entwickelten Programms NIH
Image und kann im Internet unter httprsbinfonihgovnih-image heruntergeladen
werden Die von dem Programm ermittlete Anzahl an Pixel jeder Flaumlche wurde
automatisch in cmsup2 umgerechnet Somit konnte die prozentuale Verkleinerung der
Wundflaumlchen im Vergleich zur urspruumlnglichen Transplantationsflaumlche am OP-Tag zu
jedem Zeitpunkt der Datenerhebung ermittelt werden
Fragestellung war ob sich die verschiedenen Transplantatgruppen untereinander
hinsichtlich der Inhibition der Wundkontraktion unterscheiden Wie schon von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden konnte fuumlhrt die Verwendung eines
dermalen Ersatzes zu einer Reduktion der Kontraktion Fuumlr uns stellte sich weiterhin
die Frage ob es einerseits durch die zusaumltzliche Applikation von autologen
Fibroblasten zu einer verminderten Wundkontraktion kommt [Lamme et al 2000]
Auszligerdem fuumlhrten wir Transplantatgruppen ein bei denen die xenogene humane
dermale Matrix mit einer homologen porcinen Matrix ersetzt wurde Der Einfluszlig der
Xenogenitaumlt auf mehrere Parameter der Wundheilung wird kontrovers diskutiert So
gibt es Anzeichen dass die Verwendung einer xenogenen azellulaumlren dermalen
31
Matrix zu einer verstaumlrkten Kontraktion einer verminderten Einheilungsrate und
erhoumlhten Entzuumlndungsreaktionen fuumlhrt [Srivastava et al 1999]
236 Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
Neben der Wundkontraktion wurden auch die Einheilungsraten und der
Wundverschluss der einzelnen Gruppen miteinander verglichen
Die Einheilungsrate wurde definiert als der Nachweis eines sowohl makroskopisch
wie auch mikroskopisch sichtbaren Neoepithels Hierzu wurden die Ergebnisse des
post-OP Tages 14 herangezogen da dies der fruumlheste Zeitpunkt darstellte an dem
eine makroskopische Neoepithelbildung nachweisbar war War zu diesem Zeitpunkt
eine Epithelbildung mit Stratum corneum ersichtlich so wurde die Einheilung als
positiv gewertet
Der Wundverschluszlig wurde makroskopisch am post-OP Tag 28 beurteilt Hier wurde
besonders auf drei moumlgliche den Wundverschluszlig beeinflussende Faktoren geachtet
Zum einen der Einsatz einer demalen Matrix an sich zweitens der Austausch der
xenogenen humanen mit einer homologen porcinen Dermis und drittens die
Applikation von autologen Fibroblasten [Lamme et al 1998 Srivastava et al 1999
Svensjo et al 2002]
237 Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
Mit dem CutometerregMPA 580 (Fa Courage amp Khazaka Koumlln) lassen sich
verschiedene biomechanische Parameter der Haut wie zB die Elastizitaumlt reliabel
und valide bestimmen [van Zuijlen et al 2000] Da die Haut visko-elastisch ist
beinhaltet sie sowohl elastische als auch plastische Komponenten die sich im
Verlauf der Hautalterung und bei bestimmten pathologischen Veraumlnderungen der
Haut (Narbenbildung Hautkrankheiten wie zB Sklerodermie) erheblich veraumlndern
Starke Verluste der elastischen Hauteigenschaften sind in der Regel die Folge von
Anomalien der Kollagen-Biosynthese zB bei einer hypertrophen Narbenbildung
oder Sklerodermie Um die Steifheit der Haut zu evaluieren und eine Korrelation mit
dem Krankheitsverlauf zu finden sind Elastizitaumltsmessungen in vivo von groszligem
Interesse Ebenso liefert die Elastizitaumltsmessung wichtige Erkenntnisse uumlber den
Heilungsprozess
32
Das Messprinzip dieses Geraumltes basiert auf der Saugmethode Im Geraumlt wird ein
konstanter Unterdruck erzeugt der zwischen 20 und 500 mbar variabel einstellbar
ist Die zu messende Hautstelle wird waumlhrend der Messung durch den Unterdruck in
die Oumlffnung der Messsonde gezogen Die Eindringtiefe der Haut in die Oumlffnung
(Elongation) wird durch ein optisches Messsystem beruumlhrungslos erfasst (Abb 2-14)
Das optische Messsystem besteht aus einem Lichtsender und einem Lichtempfaumlnger
sowie zwei gegenuumlberliegenden Glasprismen die das Licht vom Sender zum
Empfaumlnger leiten Das Lichtverhaumlltnis wird durch die Eindringtiefe der Haut
proportional veraumlndert
Fuumlr die Messungen wurde ein konstanter Unterdruck von 500 mbar bei einer
Ansaugzeit von einer Sekunde und einer Relaxationszeit von ebenfalls einer
Sekunde gewaumlhlt Die Messungen wurden 8 mal hintereinander wiederholt an
insgesamt 3 unterschiedlichen Messtagen Die Messungen wurden einmal mit einer
2 mm Sonde und ein weiteres mal mit einer 8 mm Sonde durchgefuumlhrt Durch die
Verwendung der verschiedenen Sondendurchmesser war es moumlglich verschiedene
Anteile der Haut gezielt zu untersuchen So misst die 2 mm Sonde besonders den
epidermalen Anteil und die 8 mm Sonde hauptsaumlchlich den dermalen Anteil der Haut
Als Messergebnisse erhielten wir die maximale Auslenkung beim Erreichen eines
Unterdruckes von 500 mbar und die Elastizitaumlt als Quotient aus Retraktion
(Ruumlckbildung nach max Auslenkung) und maximaler Auslenkung
Abb 2-14 Das zur Bestimmung der H(Cutometerreg MPA 580) mit MessprinzipVakuumsonde hineingezogenen Haut wirerfasst
autqualitaumlt verwendete Geraumlt Die Auslenkung der in die d uumlber ein optisches System
33
24 Histologische Untersuchungen
241 Klassische Lichtmikroskopie
Die Aufarbeitung der Biopsien erfolgte nach der Paraffinmethodik mit den folgenden
Faumlrbungen Haumlmatoxilin-Eosin (HE) als Standardfaumlrbung Elastica-van-Gieson (EvG)
und Trichrom-Goldner Protokolle der hier durchgefuumlhrten Standardtechniken siehe
Romeis Mikroskopische Technik [Romeis]
242 Immunhistochemie
Saumlmtliche immunhistochemischen Untersuchungen wurden an Kryoschnitten
durchgefuumlhrt Dazu wurden die schockgefrorenen Nativproben im Kryostaten (Fa
Jung Heidelberg) bei ndash 20 degC in Gefriermedium (Fa Leica Nussloch) eingebettet
und geschnitten Die 5 microm dicken Schnitte wurden auf Objekttraumlger aufgezogen
Nach einstuumlndiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur konnten die Schnitte gefaumlrbt
werden Dies geschah immer in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur um ein
Austrocknen der Schnitte zu verhindern Bei jeder Faumlrbung wurden Positiv- und
Negativkontrollen durchgefuumlhrt um Qualitaumlt und Spezifitaumlt der Antikoumlrper zu
uumlberpruumlfen [Luppa 1987]
2421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Die Etablierung und Wiederherstellung der Basalmembran ist wesentlich fuumlr eine
erfolgreiche Einheilung von kultivierten Hauttransplantaten Schon die unzureichende
Entwicklung von einzelnen Komponenten der Basalmembran wie zB der
Ankerfibrillen fuumlhrt zu einer verstaumlrkten Fragilitaumlt und Blasenbildung der Haut
[Woodley et al 1988 Aumailley und Smyth 1998] Kollagen VII gilt als
Hauptbestandteil der Ankerfibrillen wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen
sind mitverantwortlich fuumlr die Vernetzung zwischen basalen Epithelschichten und
dem laminaumlren Anteil der Basalmembran Der Nachweis dieses Proteins zeigt die
epithelial-mesenchymale Interaktion in Form einer sich rekonstituierenden
Basalmembran
Die Faumlrbung gegen Kollagen Typ VII wurde in der indirekten
Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Als Primaumlrantikoumlrper wurde ein monoklonaler
34
Mausantikoumlrper (Fa Sigma Steinheim BRD) verwendet der mit den
Basalmembranen von Mensch Schwein Meerschweinchen Rind Schaf und Ziege
kreuzreagiert
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation Carpinteria CA USA) inkubiert um
endogene Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen
Substratumsetzung fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen
Bindungsstellen des zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min
geblockt Dann erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-Kollagen VII
Primaumlrantikoumlrper in einer Verduumlnnung von 1200 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren
Waschvorgang wurden die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG
Sekundaumlrantikoumlrper (Fa DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet
Nach nochmaligen Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-
Chromogen (Fa DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der
Peroxydase zu einem purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste
unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen
Abschlieszligend wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu
machen Die Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD)
eingedeckelt
2422 Nachweis von Myofibroblasten
Entgegen der fruumlheren Vorstellung dass die Wundkontraktion durch die
Schrumpfung der Kollagenfasern zustande kommt weiszlig man heute dass dies nur
eine untergeordnete Rolle spielt Verantwortlich fuumlr die Kontraktion sind vielmehr die
Fibroblasten im Granulationsgewebe die sich unter besonderen Bedingungen
strukturell und funktionell in einen Zelltyp umwandeln der den Zellen der glatten
Muskulatur aumlhnelt und wie diese den kontraktionsfaumlhigen Muskeleiweiszligkoumlrper
Actomyosin enthaumllt [Gabbiani et al 1971 Hirschel et al 1971 Singer und Clark
1999] So steht das Auftreten von Myofibroblasten mit der Wundkontraktion in
Zusammenhang
Die Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde wie die Anti-Kollagen VII-Faumlrbung mit der
indirekten Immunperoxydasetechnik durchgefuumlhrt Der monoklonale Primaumlrantikoumlrper
stammte von der Maus und wurde in einer Verduumlnnung von 1100 verwendet
35
Zunaumlchst wurden die Schnitte in PBS rehydriert und fuumlr 10 min mit dem Peroxidase
Blocking Reagent (Fa DakoCytomation CA USA) inkubiert um endogene
Gewebsperoxidasen zu blockieren die zu einer unspezifischen Substratumsetzung
fuumlhren koumlnnten Anschlieszligend wurden die unspezifischen Bindungsstellen des
zweiten Antikoumlrpers mit 5 -igem Ziegenserum fuumlr 15 min geblockt Dann erfolgte
die Inkubation der Schnitte mit dem Maus-Anti-α-sm-Aktin Primaumlrantikoumlrper in einer
Verduumlnnung von 1100 fuumlr 1 Stunde Nach einem weiteren Waschvorgang wurden
die Schnitte mit einem Ziege-Anti-Maus-IgG Sekundaumlrantikoumlrper (Fa
DakoCytomation CA USA) fuumlr eine Stunde uumlberschichtet Nach nochmaligen
Waschen in PBS konnten die Schnitte dann mit dem AEC-Chromogen (Fa
DakoCytomation CA USA) uumlberschichtet werden das von der Peroxydase zu einem
purpurroten Farbstoff umgesetzt wird Diese Reaktion musste unter dem
Lichtmikroskop verfolgt werden um sie rechtzeitig stoppen zu koumlnnen Abschlieszligend
wurde mit Haumlmalaun gegengefaumlrbt um die Zellkerne sichtbar zu machen Die
Schnitte wurden mit Aquatexreg (Fa Merck Darmstadt BRD) eingedeckelt
243 Bewertung der Reteleisten
Reteleisten mit ihren papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind
von Bedeutung fuumlr die mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
aber auch fuumlr die Ernaumlhrung der auf Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland et
al 1995] Anhand der Histologien nach 6 Monaten wurde die Ausbildung der
Reteleisten bestimmt Hierzu wurden 31 Schnitte von 3 unabhaumlngigen Beobachtern
begutachtet Von jeder Wundgruppe lagen etwa 5 Schnitte (keine Serienschnitte)
vor Es galt die Ausbildung der Reteleisten jedes Schnittes auf einer Skala von 1 (=
keine Reteleisten vorhanden) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) zu beurteilen Die
statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test ermittelt
25 Statistik und Computerprogramme
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte +- Standardfehler des Mittelwertes dargestellt
(SEM) Die Auswertung aller Rohdaten erfolgte mittels des Programms MS-Excel
(MS-Office 97 Fa Microsoft USA) Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels
des Programms StatView for Windows 50 (Abacus Concepts Berkley USA)
36
3 Ergebnisse
31 Praumloperative Zellkultivierung
Die Keratinozyten konnten problemlos aus der Epidermis nach dem Abloumlsen von der
Dermis und der Behandlung mit Trypsin gewonnen werden Die Verwendung des
houmlher konzentrierten Trypsins (025 anstelle 005 ) fuumlhrte zu einer besseren
Zellausbeute und hatte keinen negativen Einfluss auf die Vitalitaumlt der Zellen Bei der
Kontrolle mittels der Trypanblau Faumlrbung zeigte sich keine verstaumlrkte Anfaumlrbbarkeit
der Zellen da nur lysierte bzw abgestorbene Zellen den blauen Farbstoff
aufnehmen Die ausgesaumlten Keratinozyten zeigten auf mit Kollagen Typ I
beschichteten Kulturflaschen eine schnellere Adhaumlrenz und verbesserte
Wachstumseigenschaften als auf unbeschichteten Kulturflaschen Durch die
beguumlnstigte Adhaumlrenz konnte der Zellverlust beim ersten Mediumwechsel nach 2
Tagen reduziert werden
Die Kultivierung der Fibroblasten erwies sich ebenfalls als problemlos Aufgrund des
guten Wachstums der Fibroblasten war die Verwendung der teureren mit Kollagen
beschichteten Kulturflaschen nicht notwendig
32 Verlauf des Tierversuchs
321 Operation
Bei der Verwendung des handelsuumlblichen Fibrinklebers musste darauf geachtet
werden die Fibrinogen-Komponente vor der Herstellung der Suspension im
Waumlrmebad auf 37 degC zu erwaumlrmen da das Fibrinogen ansonsten zur Erstellung der
Suspension zu viskoumls war
Beim Auftragen der zwei Komponenten mit Hilfe der Doppelspritze auf die Wunden
war es wichtig die zuvor wegen der Zellen auf Eis gelagerten Spritzen auf
Raumtemperatur zu bringen da ansonsten die zwei Komponenten nur unzureichend
zu Fibrin aushaumlrteten
Nach der Exzision der Vollhautwunden war auf eine suffiziente Blutstillung zu achten
um die Bildung von Haumlmatomen unter den Transplantaten zu vermeiden Bei einigen
Wunden konnte am 7 post-OP Tag eine Serombildung beobachtet werden Die
37
Entlastung durch das vorsichtige Eroumlffnung mit einem spitzen Skalpell fuumlhrte zu
einem komplikationslosen weiteren Wundheilungsverlauf
Bei der Wahl der Wundgroumlszligen und der Verbandstechnik konnte auf die Erfahrungen
von Versuchen aus der eigenen Arbeitsgruppe zuruumlckgegriffen werden Die
Defektgroumlszlige musste groszlig genug gewaumlhlt werden um das Transplantat in der Mitte
mit etwas Abstand zu den Wundraumlndern aufzutragen Eine Groumlszlige von 5 x 5 cm
erwies sich hierzu als geeignet (Abb3-1 3-2) Somit wurde erreicht dass sich zentral
ein neues Epithel bilden konnte bevor die vom Rand einwachsende Haut das
Transplantat erreichte [Compton et al 1989]
Bei der Verbandstechnik war es wichtig ein fuumlr die Wundheilung optimales Milieu zu
schaffen und gleichzeitig die fragilen Transplantate vor mechanischen Belastungen
die zB beim ldquoSich-Scheuernldquo der Tiere entstanden zu schuumltzen Die Verwendung
von direkt auf die Transplantate aufgetragener Fettgaze (Grassolindreg Fa Hoffmann
BRD) und einer darauf angebrachten durchlaumlssigen Siliconfolie (Biobranereg)
verhinderte ein Austrocknen der Wunden und ein Sekretstau Die Silikonfolie wurde
an den Wundraumlndern mit einem nicht resorbierbarem Faden fixiert und nach einer
Woche beim ersten Verbandswechsel entfernt
Abb 3-1 Nach sorgfaumlltiger Blutstillung wurden die Transplantate an den Raumlndern der Exzisionswunden eingenaumlht
38
Abb 3-2 Nach erfolgter Transplantation sieht man den bereits ausgehaumlrteten Fibrinkleber als glaumlnzende geleeartige Schicht Auf Wunde V ist das geschlitzte AlloDermreg sichtbar (Pfeil)
322 Versuchsverlauf
Bis zum kompletten Verschluss der Wunden war entscheidend dass die Verbaumlnde
stabil genug waren um den taumlglichen Belastungen standzuhalten Die gewaumlhlte
Methode die Wundflaumlchen zusaumltzlich mit einer Schaumstoffplatte die mit
Verbandsklebestreifen (FixomullHaftreg Fa Beiersdorf) fixiert wurde zu schuumltzen
erwies sich hierzu als hilfreich Bei einem Versuchstier konnte jedoch nicht verhindert
werden dass sich der Verband einige Tage nach der Transplantation auf einer Seite
abscherte und es bei 3 Wunden daraufhin zu Wundinfektionen kam Diese Wunden
konnten daher nicht in die Auswertung mit einbezogen werden Ein weiteres Tier
wurde 2 Tage nach erfolgter Hautentnahme tot im Stall aufgefunden Die
Entnahmestelle zeigte keine Anzeichen einer Infektion Bei der Obduktion durch eine
Tieraumlrztin wurde ein Strangulationsileus diagnostiziert
Insgesamt gingen 9 Tiere in die Bewertung ein 5 Tiere fuumlr den Kurzzeitversuch 4 fuumlr
den Langzeitversuch
39
33 Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumltsbestimmung
331 Einheilung der Transplantate
Von insgesamt 51 in die Auswertung einbezogene Wunden zeigten 42 (823 ) am
post-OP-Tag 14 eine positive Einheilungsrate Bei der KFGS-Gruppe zeigten am 14
post-OP Tag 7 von 9 Wunden eine Neoepithelbildung und somit eine positive
Einheilung (778) Bei der F-KFGS-Gruppe waren es 6 von 8 Wunden (75 ) Bei
der Verwendung der humanen dermalen Matrix heilten alle 12 Wunden ein (100)
In der hAD+F Gruppe waren es 12 von 13 Wunden (923 ) die eine positive
Einheilungsrate aufwiesen Am schlechtesten schnitten die Gruppen ab bei denen
porcine Dermis zum Einsatz kam Diese stand bei 5 Tieren zur Verfuumlgung Porcines
AlloDermreg mit Fibroblasten heilte bei 3 von 5 Wunden (60 ) nach 14 Tagen ein
porcines AlloDermreg ohne Fibroblasten bei 2 von 4 Wunden (50 )
Die besten Einheilungsraten erzielten die Gruppen die mit humanem AlloDermreg
behandelt wurden Sowohl die hAD als auch die hAD+F Gruppe hatte eine Rate von
uumlber 90 (Abb 3-3)
Einheilungsraten
823 778 75
100923
5060
0102030405060708090
100
gesamt KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Einh
eilu
ng in
Abb 3-3 Einheilungsraten am post-OP Tag 14 Gesamt sind 42 von 51 Wunden eingeheilt KFGS 7 von 9 KFGS+F 6 von 8 hAD 12 von 12 hAD+F 12 von 13 pAD 2 von 4 und pAD+F 3 von 5
40
332 Wundverschluss Zur Beurteilung des Wundverschlusses am Tag 28 post-OP wurde folgende
Einteilung durchgefuumlhrt
a) Von der Wundflaumlche ist weniger als die Haumllfte verschlossen (lt50 )
b) Mindestens die Haumllfte der Flaumlche weist einen Verschluss auf (50-100 )
c) Es liegt ein kompletter Wundverschluss vor (100 )
Grundlegend lieszlig sich feststellen dass die Wunden der Transplantatgruppen die
kultivierte Fibroblasten enthielten am 28 post-OP Tag einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufwiesen als die Gruppen ohne Fibroblasten
Bei der KFGS-Gruppe waren zum definierten Zeitpunkt 2 Wunden komplett
verschlossen und 5 Wunden zeigten einen uumlber 50 -igen Wundverschluss Im
Vergleich dazu waren bei der F-KFGS-Gruppe 4 Wunden vollstaumlndig und 2 uumlber 50
verschlossen
Auch bei der Verwendung des humanen Dermisersatzes ergaben sich durch die
zusaumltzliche Verwendung von Fibroblasten deutliche Unterschiede In der Gruppe mit
Fibroblasten waren 8 Wunden komplett und 4 zwischen 50-100 verschlossen
Ohne Fibroblasten wiesen 5 Wunden einen 100 Wundverschluss auf 6 waren
uumlber 50 und eine unter 50 verschlossen
Bei der Verwendung von porcinem AlloDermreg mit Fibroblasten waren nach 28
Tagen 2 Wunden ganz und eine mehr als zur Haumllfte verschlossen Ohne Fibroblasten
erreichte zu diesem Zeitpunkt keine Wunde einen kompletten Verschluss 2 Wunden
waren zwischen 50-100 geschlossen
Der Wundverschluss wurde vor allem durch die autologen Fibroblasten positiv
beeinflusst Die Verwendung einer dermlen Matrix hatte keinen zusaumltzlichen
positiven Effekt Die besten Ergebnisse zeigten die Gruppen hAD+F und F+KFGS
(Abb 3-4)
41
Wundverschluss nach 28 Tagen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
KFGS KFGS+F hAD hAD+F pAD pAD+F
Anz
ahl d
er W
unde
n ab
solu
t
lt50
50-100
100
Abb 3-4 Wundverschluss aller Gruppen 28 Tage nach der Transplantation 100 = kompletter Wundverschluss 50 ndash 100 = mehr als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen 50 = weniger als die Haumllfte der Flaumlche einer Wunde ist verschlossen Beispiel hAD+F Von insgesamt 12 eingeheilten Wunden weisen nach 28 Tagen 8 einen kompletten Wundverschluss auf 4 Wunden sind zu 50-100 verschlossen
333 Die makroskopische Wundheilung Die makroskopische Wundheilung im Uumlberblick
7 Tage nach der Transplantation sieht man auf allen Wunden ein frisches gut
vaskularisiertes Granulationsgewebe Bei den mit einer dermalen Matrix behandelten
Wunden ist diese teilweise unter dem Granulationsgewebe noch zu erkennen An
post-OP Tag 14 hat sich teilweise bereits ein Neoepithel gebildet Das
Oberflaumlchenrelief ist unregelmaumlszligig An Tag 28 herrscht ein nahezu kompletter
Wundverschluss mit einer duumlnnen Epithelschicht vor Die bereits stattfindende
Wundkontraktion ist erkennbar Stellenweise sind die Wunden mit Fibrinschorf
bedeckt Nach 6 Monaten sind alle Wunden verheilt Im Gegensatz zur gesunden
Haut weisen sie eine staumlrkere Pigmentierung auf und sind durch das Fehlen der
Hautanhangsgebilde gekennzeichnet Das Ausmaszlig der Kontraktion der
verschiedenen Gruppen wird besonders deutlich (Abb 3-5 a bis d)
42
Abb 3-5 b Abb 3-5 a
Abb 3-5 d
Abb 3-5 c
Abb 3-5 a-d Uumlberblick der makroskopischen Wundheilung An post-OP Tag 7 sieht man ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe auf allen Wunden Bei Wunden die mit AlloDermreg behandelt wurden schimmert die Matrix stellenweise durch (Pfeil Abb 3-5 a) An post-OP Tag 14 hat sich teilweise ein Neoepithel mit mattem Aspekt gebildet (Abb 3-5 b) An post-OP Tag 28 sind alle Wunden durch eine duumlnne Epithelschicht verschlossen Die eingesetzte Wundkontraktion ist deutlich zu erkennen (Abb 3-5 c) Nach 6 Monaten ist die Wundheilung abgeschlossen und das Ausmaszlig der Wundkontraktion wird besonders deutlich Vergleiche die starke Wundkontraktion der mit KFGS behandelten Wunde VI mit der geringeren Kontraktion der hAD+F Wunde IV (Pfeile Abb 3-5 d)
3331 KFGS-Gruppe Wie bei allen Wunden hat sich an post-OP Tag 7 uumlber die gesamte Wunde hinweg
ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe ausgebildet Neoepithel ist zu diesem
Zeitpunkt makroskopisch noch nicht erkennbar (Abb 3-6) Am 28 Tag hat sich
neben der Epitheleinwanderung vom Wundrand her auch eine zentral gelegene
Epithelinsel gebildet Ein kompletter Wundverschluss wird nicht erreicht (Abb 3-7)
43
Abb 3-6 Tag 7 KFGS Man erkennt das gut durchblutete Granulationsgewebe
Abb 3-7 Tag 28 KFGS Man erkennt die beginnende Reepithlisierung vom Wundrand her (Pfeil) und eine zentral gelegene Epithelinsel (Blockpfeil)
3332 F-KFGS-Gruppe An Tag 7 besteht ein stark vaskularisiertes Granulationsgewebe ohne Epithel wie bei
der Mehrheit der anderen Gruppen auch Im Vergleich zur KFGS-Gruppe zeigt sich
ein etwas matter Aspekt was auf eine beginnende Neoepithelisierung hindeutet
(Abb 3-8) An Tag 14 sieht man ein duumlnnes Neoepithel mit mattem Aspekt das sich
uumlber die gesamte Wunde erstreckt (Abb 3-9) Einige Wunden aus dieser Gruppen
sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollstaumlndig mit Neoepithel bedeckt An Tag 28 ist
die Wunde teilweise mit Fibrinschorf bedeckt teilweise bildet sich eine stabile
Epidermis aus Der Wundverschluss ist insgesamt weiter fortgeschritten als bei der
KFGS-Gruppe
Abb 3-8 Tag 7 F-KFGS Zu erkennen ist ein gut vaskularisiertes Granulationsgewebe
Abb 3-9 Tag 14 F-KFGS Zu erkennen ist der matte Aspekt des sich neu bildenden Epithels
44
3333 hAD-Gruppe Im Vergleich zu den Gruppen ohne Dermis kann man hier bereits an Tag 7 eine von
den Wundraumlndern her stattfindende Reepithelisierung und Fibrinreste als milchig-
weiszlige Oberflaumlche erkennen (Abb 3-10) An Tag 14 hat sich auf den meisten mit hAD
behandelten Wunden ein zartes Neoepithel gebildet (vgl Abb 3-9) An Tag 28 ist der
Groszligteil der Wunden zwar komplett verschlossen die unregelmaumlszligige Oberflaumlche
weist jedoch auf noch stattfindende Umbauprozesse mit einer unausgereiften
Epidermis hin (Abb 3-11)
Abb 3-10 Tag 7 hAD Neben dem frischen Granulationsgewebe ist eine von den Wundraumlndern einsetzende Reepithelisierung zu erkennen
Abb 3-11 Tag 28 hAD Der Wundverschluss ist nahezu komplett Die unregelmaumlszligige Oberflaumlche weist auf noch stattfindende Unbauprozesse hin
3334 hAD+F-Gruppe Diese Gruppe weist an Tag 14 eine uumlber die gesamte Wundflaumlche ausgedehnte
Neoepithelbildung auf zT mit einem unregelmaumlszligigen Relief Nach 28 Tagen sind
die Wunden der hAD+F-Gruppe vollstaumlndig verschlossen Die Wunde ist bereits
belastbar (Kneiftest) und weist von allen Gruppen die geringste Kontraktion auf (Abb
3-12) Nach 6 Monaten hat sich eine geschmeidige bdquoneue Hautldquo mit einer glatten
Oberflaumlche gebildet die sich von der gesunden Haut nur noch bezuumlglich der leichten
Hyperpigmentation und fehlenden Hautanhangsgebilde unterscheidet (Abb 3-13)
45
Abb 3-13 6 Monate hAD+F Es hat sich eine belastbare geschmeidige bdquoneueldquo Haut gebildet die sich durch fehlende Hautanhangsgebilde und einer staumlrkeren Pigmentierung von der gesunden Haut unterscheidet
Abb 3-12 Tag 28 hAD+F Die Wunde ist vollstaumlndig verschlossen bei geringer Wundkontraktion Auffallend ist die starke Pigmentierung der Wunde
3335 pAD-Gruppe An Tag 7 ist das dicke porcine AlloDermreg unter dem Granulationsgewebe noch
deutlich zu erkennen An Tag 14 ist die Wunde groumlszligtenteils mit Epithel bedeckt es
liegen jedoch einzelne Stellen des porcinen AlloDermreg frei (Abb 3-14) An Tag 28
zeigt sich eine weitgehend geschlossene zum Teil mit Fibrinschorf bedeckte Wunde
(Abb 3-15)
Abb 3-15 Tag 28 pAD Die Wunde zT mit Fibrinschorf bedeckt ist noch nicht komplett verschlossen
Abb 3-14 Tag 14 pAD Einzelne Stellen der porcinen Matirx liegen noch frei (Pfeil) Die Wunde ist groumlszligtenteils epithelisiert
46
3336 pAD+F-Gruppe Auch hier schimmert an Tag 7 die porcine dermale Matrix durch das
Granulationsgewege durch An Tag 14 faumlllt eine vollstaumlndigere Neoepithelbildung auf
als bei der pAD-Gruppe ohne Fibroblasten Die Oberflaumlche weist ein unregelmaumlszligiges
Relief auf (Abb 3-16) Nach 28 Tagen ist die Wund nahezu vollstaumlndig verschlossen
Nach 6 Monaten ist die Wunde komplett verheilt Der stattgefundene
Kontraktionsvorgang wird anhand der eintaumltowierten Wundraumlndern deutlich Die
Wundoberflaumlche ist glatt und hyperpigmentiert (Abb 3-17)
Abb 3-17 6 Monate pAD+F Die Wunde ist verheilt Deutlich wird die stattgefundene Kontraktion und Hyperpigmentierung der Wunde
Abb 3-16 Tag 14 pAD+F Zu erkennen ist eine von zentral ausgehende Epithelisierung (Pfeil)
334 Planimetrische Auswertung der Kontraktion Die Bestimmung der Wundflaumlchen und somit der Kontraktion erfolgte sowohl bei den
Kurz- wie auch bei den Langzeittieren am 14 und am 28 post-OP Tag sowie bei
den Langzeittieren 3 und 6 Monate nach der Transplantation
Bei allen Wunden kann von einer Ausgangsflaumlche von 25 cmsup2 ausgegangen werden
Wegen dem Groumlszligenzuwachs der Tiere wurden nur die Flaumlchen der Wundgruppen
eines Messtages miteinander verglichen und nicht die Ergebnisse einzelner Gruppen
uumlber den gesamten Verlauf hinweg
47
Bereits nach der ersten Messung am 14 post-OP Tag weisen alle mit Fibroblasten
behandelte Gruppen eine geringere Kontraktion auf als die Gruppen ohne
Fibroblasten Diese Tendenz ist auch am 28 post-OP Tag zu beobachten Zu
diesem Zeitpunkt weist die hAD+F Gruppe die geringste Kontraktion auf Nach 3
Monaten hat sich der Unterschied zwischen den Dermis-Gruppen mit bzw ohne
Fibroblasten zugunsten der Gruppen mit Fibroblasten noch verstaumlrkt Bei den
Messungen nach 3 und 6 Monaten sind keine wesentlichen Unterschiede
festzustellen Die Gruppen mit der geringsten Wundkontraktion nach 3 und 6
Monaten sind hAD+F und pAD+F (Abb 3-18 bis 3-22)
post-OP Tag 14 post-OP Tag 28 post-OP 6 Monate
hAD (n=12) 2005 cmsup2 (plusmn234) 1691 cmsup2 (plusmn145) 1928 cmsup2 (plusmn284)
hAD+F (n=12) 2195 cmsup2 (plusmn215) 2005 cmsup2 (plusmn139) 2377 cmsup2 (plusmn629)
pAD (n=2) 1814 cmsup2 (plusmn346) 1617 cmsup2 (plusmn106) 1548 cmsup2 (plusmn122)
pAD+F (n=3) 1963 cmsup2 (plusmn274) 1765 cmsup2 (plusmn172) 2303 cmsup2 (plusmn622)
KFGS (n=7) 1868 cmsup2 (plusmn358) 1651 cmsup2 (plusmn202) 2052 cmsup2 (plusmn34)
KFGS+F (n=6) 2207 cmsup2 (plusmn399) 1727 cmsup2 (plusmn265) 1640 cmsup2 (plusmn472)
Abb 3-18 Tabellarische Uumlbersicht der Transplantatflaumlchen der einzelnen Gruppen an den verschiedenen Messtagen In Klammern hinter den Flaumlchenangaben die jeweiligen Standardabweichungen
48
Kontraktion d14
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-19 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP Tag 14 Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und KFGS+F (Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspenion) weisen die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
Kontraktion d28
000
500
1000
1500
2000
2500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Wun
dflauml
chen
in c
m2
Abb 3-20 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen am post-OP 28 Die Gruppe hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) weist die geringste Wundkontraktion auf Alle mit Fibroblasten behandelten Gruppen zeigen eine geringere Kontraktion im Vergleich mit den entsprechenden Gruppen ohne Fibroblasten
49
Kontraktion nach 3 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-21 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 3 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
Kontraktion nach 6 Monaten post-OP
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Flaumlc
he in
cm
2
Abb 3-22 Groumlszlige der Transplantatflaumlchen aller Gruppen nach 6 Monaten Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen die geringste Wundkontraktion auf
50
335 Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der Vakuumsonde
Die Elastizitaumltsmessungen erfolgten bei den Langzeittieren nach 6 Monaten bevor
die Tiere aus dem Versuch ausschieden Bei der Bestimmung der maximalen
Auslenkung mit der 8 mm Sonde zeigen die Gruppen hAD+F und pAD+F mit der
Kontrollhaut vergleichbare Ergebnisse (Abb 3-23) Bei der Elastizitaumltsbestimmung
zeigt sich dass alle Gruppen sowohl mit der 2 mm Sonde als auch mit der 8 mm
Sonde ein aumlhnliches Verhalten bezuumlglich der Elastizitaumlt wie die Kontrollhaut
(gesunde Haut auf dem Ruumlcken der Tiere) aufweisen (Abb 3-24 3-25)
max Auslenkung (8mm Sonde)
002040608
112141618
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Aus
lenk
ung
in m
m
Abb 3-23 Maximale Auslenkung gemessen mit einer 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Gruppen hAD+F (humanes AlloDermreg plus Fibroblasten) und pAD+F (porcines AlloDermreg plus Fibroblasten) weisen vergleichbare Ergebnisse wie die Kontrolle (gesunde Haut) auf
51
Elastizitaumlt (8mm Sonde)
0010203040506070809
1
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-24 Elastizitaumlt bei Verwendung der 8 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation)
Elastizitaumlt 2mm Sonde 1sec
0
02
04
06
08
1
12
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F Kontr
Ret
rakt
ion
Elon
gatio
n
Abb 3-25 Elastizitaumlt bei Verwendung der 2 mm Sonde und 1 sec Saugzeit Die Elastizitaumlt wird bestimmt aus dem Quotient von der Ruumlckbildung nach staffgefundener Auslenkung (Retraktion) und der maximalen Auslenkung (Elongation) Alle Gruppen weisen mit der Kontrolle (gesunde Haut) vergleichbare Ergebnisse auf
52
34 Histologische Resultate
341 Klassische Lichtmikroskopie
3411 Ergebnisse der Gruppen
KFGS- F-KFGS-Gruppen
Am 7 post-OP Tag laumlsst sich in einigen Praumlparaten die Fibrinmatrix als homogenes
eosinrotes Netzwerk erkennen Das gebildete Neoepithel ist noch weitgehend
inhomogen mit diffus angeordneten Zellkonglomeraten die stellenweise tief in die
Dermis hineinreichen Das Stratum corneum ist duumlnn ausgebildet Alle Histologien
zeigen eine deutliche Parakeratose und eine leichte Hyperkeratose (Abb 3-26)
Am 14 post-OP Tag bildet sich die anfaumlngliche Parakeratose zuruumlck und die
Hyperkeratose verstaumlrkt sich Die Fibrinmatrix ist nicht mehr nachweisbar
Nach 28 Tagen vollzieht sich eine Ausdifferenzierung des Epithels mit Entwicklung
einer intakten Basalmembran und Praumlservierung der Reteleisten Als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung laumlsst sich die charakteristische Schichtung vom
Stratum basale zum Stratum corneum mit einer mehrlagigen Hornschicht
nachweisen Eine Gefaumlszligbildung ist in der Dermis zu erkennen (Pfeil Abb 3-27) In
der aus dem Randbereich entnommenen Biopsie ist das eingelagerte
Taumltowierpigment nachweisbar (Pfeil Abb 3-28)
Abb 3-26 Tag 7 KFGS HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein inhomogenes parakeratotisches Epithel
Abb 3-27 Tag 28 KFGS HE Faumlrbung Neben dem ausdifferenzierten Epithel ist ein Gefaumlszlig in der Dermis zu sehen (Pfeil)
53
Abb 3-28 Tag 28 KFGS+F HE Faumlrbung Man erkennt das in der Dermis eingelagerte Taumltowierpigment (Pfeil)
hAD- hAD+F- Gruppen
Histologisch laumlsst sich bereits am 7 post-OP Tag ein duumlnnes unverhorntes
Neoepithel erkennen das stellenweise stark hyperproliferiert und eine deutliche
Parakeratose aufweist Aufgrund der geschlitzten Struktur des AlloDermreg kann man
die Einwanderung von Keratinozyten entlang der Schlitze sehen (Pfeil Abb 3-29) In
der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung wird der Verbleib der Dermis anhand der
elastischen Fasern ersichtlich (Pfeil Abb 3-30) Oberhalb der Dermis sieht man eine
epithelartige Keratinozytenanordnung
Am 14 Tag zeigt sich die Einheilung der azellulaumlren Dermis und die Bildung eines
Neoepithels Das Epithel stellt sich teilweise noch inhomogen dar und weist eine
mehrschichtige Verhornung auf Die Hyperkeratose bildet sich zuruumlck Reste des
Fibrinklebers sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-31) Die Vitalitaumlt und die
Ausdifferenzierung der Keratinozyten wird durch die Dermis als Diffusionsbarriere
nicht erkennbar gestoumlrt Die dermale Matrix ist in der Haumlmatoxilin-Eosin-Faumlrbung
nicht deutlich abgrenzbar In der Elastica-van-Gieson-Faumlrbung (EvG) ist das
AlloDermreg anhand seiner elastischen Fasern am 14 Tag noch erkennbar Im
Verlauf ist eine strukturelle Auflockerung sowie ein Verlust an elastischen Fasern zu
verzeichnen In der Trichrom-Faumlrbung lassen sich durch die Anordnung einzelner
Kollagenfasern die sich verstaumlrkt anfaumlrben Ruumlckschluumlsse auf den Verbleib der
Matrix ziehen Die anfaumlngliche Parakeratose bildet sich am 14 post-OP Tag zuruumlck
54
Am 28 Tag hat sich ein durchgaumlngiges Epithel gebildet mit der als Ausdruck einer
abgeschlossenen Differenzierung charakteristischen Schichtung vom Stratum basale
zum Stratum corneum Fasern des AlloDermreg sind nicht mehr nachweisbar (Abb 3-
32)
In saumlmtlichen Biopsien zeigt sich kein Anhalt fuumlr eine stattfindende oder abgelaufene
Abstoszligungsreaktion des AlloDermreg es sind keine perivaskulaumlren Infiltrate oder
groumlszligere Lymphozytenanteicherungen zu erkennen Die erkennbare jedoch zum
physiologischen Wundheilungsprozess gehoumlrende Einwanderung von Granulozyten
in das Wundbett nimmt im Verlauf stetig ab
Abb 3-29 Tag 7 hAD+F HE Faumlrbung Durch das geschlitzte AlloDermreg eingewanderte Keratinozyten
Abb 3-30 Tag 7 hAD+F EvG Faumlrbung Man erkennt die schwarz angefaumlrbten elastischen Fasern (Pfeil) des transplantierten humanen AlloDermreg Daruumlber Epithelbildung (Blockpfeil)
Abb 3-32 Tag 28 hAD+F HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein gut ausdifferenziertes leicht hyperproliferiertes Epitel und regelmaumlszligig ausgebildete Reteleisten (Pfeil)
Abb 3-31 Tag 14 hAD HE Faumlrbung Zu erkennen ist ein mehrschichtig verhornendes Epithel
55
pAD- pAD+F-Gruppen
Die eingeheilten Transplantate zeigen am post-OP Tag 28 ein orthokeratotisches
zT noch hyperproliferiertes Epithel In der Gruppe mit Fibroblasten bilden sich
deutlichere Reteleisten aus (Abb 3-33) als in der Gruppe ohne praumlinkubierte
Fibroblasten (Abb 3-34) In der Trichrom-Faumlrbung sieht man vereinzelte stark
angefaumlrbte Kollagenfasern die einen unregelmaumlszligigen Verlauf zeigen (Pfeil Abb 3-
35) Hierbei koumlnnte es sich um Uumlberreste des transplantierten porcinen
Dermisersatzes handeln
Abb 3-34 Tag 28 pAD HE Faumlrbung Die Parakeratose bildet sich zuruumlck Reteleisten sind nicht nachweisbar
Abb 3-33 Tag 28 pAD+F HE Faumlrbung Es stellen sich ein hyperproliferiertes Epithel und gut ausgebildete Reteleisten dar
Abb 3-35 Tag 28 pAD+F Trichrom Faumlrbung Es heben sich vereinzelt staumlrker angefaumlrbte Kollagenfasern hervor Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Reste des transplantierten porcinen AlloDermreg
56
Langzeitergebnisse nach 6 Monaten
6 Monate nach der Transplantation laumlsst sich in allen Gruppen ein ausdifferenziertes
mehrschichtiges Epithel mit intakter Basalmembran und Praumlservierung der
Reteleisten nachweisen In den Gruppen mit Fibroblasten faumlllt die Ausbildung der
Reteleisten ausgepraumlgter aus als in den Gruppen ohne Fibroblasten (Abb 3-36 3-
37 3-38) Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student-Newman-Keuls-Test
bestimmt Signifikant besser schnitt die Gruppe pAD+F im Vergleich zur pAD Gruppe
ab genauso wie die Gruppe KFGS+F im Vergleich zur KFGS Gruppe Kein
signifikanter Unterschied besteht zwischen hAD+F und hAD Im Vergleich mit pAD
und KFGS schneidet hAD signifikant besser ab dh hAD ohne Fibroblasten fuumlhrt
ebenfalls zu einer besseren Ausbildung der Reteleisten Unterschiede zwischen den
mit Fibroblasten behandelten Gruppen (hAD+F pAD+F KFGS+F) bestehen nicht
Die Zelldichte der Dermis nahm im Vergleich zu den Biopsien am Tag 28 deutlich ab
Reste des transplantierten AlloDermreg sind nicht mehr zu sehen Die Regeneration
der funktionsfaumlhigen Dermis befindet sich in der Reifungs- bzw Endphase die bis zu
einem Jahr oder laumlnger anhalten kann Es kommt zu einer Umbildung der
Kollagenfasern mit Reorganisation des Kollagens
Ausbildung der Reteleisten
000050100150200250300350400450
hAD hAD+F pAD pAD+F KFGS KFGS+F
Bew
ertu
ngss
kala
Abb 3-36 Ausbildung der Reteleisten nach 6 Monaten bewertet anhand einer Skala von 1(=keine Reteleisten ausgebildet) bis 4 (=Reteleisten gut ausgebildet) Die Gruppen die zusaumltzlich mit autologen Fibroblasten behandelt wurden bilden bessere Reteleisten aus als die Gruppen ohne Fibroblasten Bei den Gruppen ohne Fibroblasten weist die hAD (humanes AlloDermreg) Gruppe das beste Ergebnis auf
57
Abb 3-37 6 Monate KFGS HE Faumlrbung Abb 3-38 6 Monate pAD+F HE Faumlrbung
Abb 3-37 und 3-38 Nach 6 Monaten wird die unterschiedlich starke Ausbildung der Reteleisten bei den Gruppen mit und ohne Fibroblasten deutlich Links ein Beispiel einer Gruppe ohne Fibroblasten Hier haben sich keine Reteleisten gebildet Rechts eine mit Fibroblasten behandelte Wunde mit gut ausgebildeten Reteleisten (Pfeile)
3412 Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in vitro
Auf den Fluoreszenzaufnahmen 7 Tage nach Besiedlung ist zu erkennen dass die
Fibroblasten in die Matrix bestehend aus humanem AlloDermreg einwanderten und in
diese integriert wurden (Abb 3-39) Im Vergleich dazu sind bei dem porcinen
dermalen Konstrukt die Fibroblasten nur auf der Oberflaumlche der beimpften Seite zu
sehen Eine Einwanderung der Zellen in die Matrix fand nicht statt (Abb 3-40)
Auszligerdem wird auf diesen Aufnahmen die unterschiedliche Strukturdichte der beiden
Konstrukte deutlich Die humane Matrix erweist sich als lockerer im Vergleich zur
dichten porcinen Matrix
Abb 3-39 Humaner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten FibroblastenDie Fibroblasten wandern in das Konstrukt ein (Pfeile)
58
Abb 3-40 Porciner dermaler Ersatz besiedelt mit fluoreszenzmarkierten Fibroblasten Die Fibroblasten wandern kaum in das Konstrukt ein und lagern sich va an der Oberflaumlche ab (Pfeile)
342 Immunhistochemie
3421 Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
Kollagen VII - Faumlrbung
Bereits am 7 post-OP-Tag laumlsst sich in einigen Biopsien Kollagen VII als Bestandteil
der Ankerfibrillen der Basalmembran eines noch duumlnnen und unverhornten Epithels
anfaumlrben (Abb 3-41) In Biopsien die zu diesem Zeitpunkt noch keine Epithelbildung
aufweisen laumlsst sich ebenfalls eine durchgaumlngige basalmembranaumlhnliche Struktur
anfaumlrben die in der Mitte des Praumlparates vorliegt (Pfeil Abb 3-42) Anhand der
Lokalisation kann am ehesten von dem transplantierten humanen Kollagen
ausgegangen werden Ab Tag 14 laumlsst sich eine durchgehende positive Anfaumlrbung
unterhalb des Epithels nachweisen wobei hier auch neugebildetes
Schweinekollagen vorliegen kann (Abb 3-43) Da eine hohe Kreuzreaktivitaumlt
zwischen humanem und porcinem Kollagen besteht kann man uumlber den
Beobachtungszeitraum von 4 Wochen keine genaue Aussage uumlber den Ursprung
machen Bei Proben ohne dermale Transplantate laumlsst sich in der Fruumlhphase keine
Kollagen VII-Struktur nachweisen
Nach 6 Monaten ist in allen ausgewerteten Gruppen eine intakte kontinuierliche
Basalmembran nachweisbar Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen nicht
(Abb 3-44 3-45)
59
Abb 3-42 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran des transplantierten AlloDermreg (Pfeil)
Abb 3-41 Tag 7 hAD Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung der Basalmembran eines duumlnnen unverhornten Epithels (Pfeil)
Abb 3-44 6 Monate hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-43 Tag 14 hAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembran (Pfeil)
Abb 3-46 Negativkontrolle Kollagen VII Faumlrbung
es laumlsst sich keine Basalmembranstruktur anfaumlrben
Abb 3-45 6 Monate pAD+F Kollagen VII Faumlrbung Anfaumlrbung einer durchgaumlngigen Basalmembean (Pfeil)
60
3422 Nachweis von Myofibroblasten
Die indirekte Immunperoxidase-Faumlrbung gegen α-sm-Aktin wurde durchgefuumlhrt um
den moumlglichen Einfluss der zu Myofibroblasten umgewandelten Fibroblasten auf die
Kontraktion zu zeigen Unterschiede wurden zwischen den Gruppen mit und ohne
Fibroblasten deutlich So kommt es zu einer diffusen groszligflaumlchigen Anfaumlrbung ab
dem 14 Tag von α-sm-Aktin als Bestandteil von Myofibroblasten in den Gruppen
ohne praumlinkubierte Fibroblasten Im Vergleich dazu zeigen die Gruppen deren
dermale Matrices vor der Transplantation mit autologen Fibroblasten inokuliert
wurden weit weniger Bereiche die sich durch die indirekte Immunperoxidasereaktion
rotbraun anfaumlrben lieszligen (Abb 3-47 3-48) Aumlhnliches ist bei den Gruppen mit KFGS
und F-KFGS zu beobachten Auch hier lassen sich in den Gruppen die mit F-KFGS
behandelt wurden weniger Myofibroblasten durch α-sm-Aktin nachweisen als in den
Gruppen mit KFGS
Auch am post-OP-Tag 28 laumlsst sich bei den mit Fibroblasten vorbehandelten
Gruppen eine schwaumlchere α-sm-Aktin Anfaumlrbung nachweisen als bei den Gruppen
ohne Fibroblasten Exemplarisch werden hierfuumlr die Gruppen hAD und hAD+F
dargestellt (Abb 3-49 3-50)
Nach 6 Monaten kommt es lediglich im Bereich von Gefaumlszligen zur Anfaumlrbung von α-
sm-Aktin (Abb 3-51) Gefaumlszligwaumlnde bestehen zum Teil aus glatten Muskelzellen die
in ihrem Zytoplasma α-sm-Aktin enthalten Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen lassen sich nicht mehr beobachten Der
Kontraktionsvorgang ist abgeschlossen
Abb 3-48 Tag 14 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung schwacher Nachweis von Myofibroblasten
Abb 3-47 Tag 14 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung starker Nachweis von Myofibroblasten
61
Abb 3-50 Tag 28 hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Die Anfaumlrbung faumlllt schwaumlcher aus als in der Gruppe ohne Fibroblasten ( vgl Abb 3-52)
Abb 3-49 Tag 28 hAD α-sm-Aktin Faumlrbung Es zeigen sich groszligflaumlchig angefaumlrbte Areale (Pfeile)
Abb 3-52 Negativkontrolle α-sm-Aktin Faumlrbung Abb 3-51 6 Monate hAD+F α-sm-Aktin Faumlrbung Anfaumlrbungr der Glatten Muskelzellen im Bereich der Gefaumlszlige (Pfeile)
62
4 Diskussion
41 Allgemeine Gegebenheiten
Waumlhrend die Mortalitaumlt nach ausgedehnten Verbrennungsverletzungen durch
intensivmedizinische Fortschritte kontinuierlich faumlllt waumlchst der Wunsch die
Morbiditaumlt der entstandenen Wundflaumlchen ebenfalls auf ein Minimum zu reduzieren
Biotechnologisch hergestellter Hautersatz kann mittlerweile zwar zur Behandlung von
Verbrennungswunden in groszligen Mengen produziert werden vermag jedoch nur
ansatzweise die anatomischen Strukturen und physiologischen Funktionen der Haut
wiederherzustellen Bis heute sind ausschliesslich autologe Vollhauttransplantate
freie oder gestielte Lappenplastiken und Gewebeexpansionen zur Wiederherstellung
von anatomisch und funktionell gesunder Haut in der Lage Die unzaumlhligen
Eigenschaften der normalen unverletzten Haut wie protektive perzeptive und
regulatorische Funktionen die den menschlichen Koumlrper mit seiner Umwelt im
Gleichgewicht halten machen es so schwierig den optimalen Hautersatz zu
entwickeln
42 Geschichte
Die ersten Bemuumlhungen auf diesem Gebiet reichen weit in die Vergangenheit zuruumlck
So gelang es Ljunggren bereits im Jahre 1898 Hautstuumlcke bis zu 6 Monate
auszligerhalb des Organismus in Ascitesfluumlssigkeit am Leben zu halten und wieder zu
retransplantieren [Ljunggren 1898] Allerdings gelang es nicht die Oberflaumlche der
Transplantate mit dieser Methode zu vergroumlszligern Weitere Probleme waren die
Kontamination der Kulturen mit Bakterien und die Uumlberwucherung durch Fibroblasten
[Leigh 1994]
421 Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet graftsldquo 1975 waren es Rheinwald und Green die humane Keratinozyten isoliert uumlber
mehrere Passagen hinweg kultivierten Als Ammenzellen dienten bestrahlte
Maumlusefibroblasten die ihre Teilungsfaumlhigkeit verloren hatten Dieses sogenannte
bdquofeeder layerldquo ermoumlglichte die Proliferation der Keratinozyten die zu mehrlagigen
nach oben ausdifferenzierten Klonen heranwuchsen und nach ungefaumlhr 20-50
Generationen (entspricht 6-7 Passagen) abstarben Bis zu dieser Zeit war eine
63
Zunahme der Ausgangsbiopsie-Oberflaumlche um das 6000fache moumlglich [Rheinwald
und Green 1975]
Neben der Verwendung des Trypsins einer Protease die die Zellen enzymatisch aus
ihrem Verband loumlst waren es ua die Verbesserung der Kulturmedien mit
Antibiotikazusaumltzen und die Moumlglichkeit des keimfreien Arbeiten an sterilen
Werkbaumlnken die zu dem Erfolg auf dem Gebiet der dissoziierten Zellkultivierung
fuumlhrte [Rheinwald und Green 1975 Freshney 1992]
Hennings et al fand 1980 heraus dass durch niedrige Calcium-Konzentrationen im
Medium die Keratinozyten keine Desmosomen ausbilden und somit besser
proliferieren Statt dessen formen sie ein Monolayer und differenzieren nicht aus
Wird die Calcium-Konzentration erhoumlht bilden die Keratinozyten innerhalb weniger
Tage ein mehrlagiges Epithel [Hennings et al 1980] Ein weiterer Effekt der
niedrigen Calcium-Konzentration besteht darin dass das Wachstum der Fibroblasten
gehemmt wird Somit kann verhindert werden dass die Keratinozyten von den
Fibroblasten uumlberwuchert werden [De Luca und Cancedda 1992]
Eine weitere Innovation auf diesem Gebiet war die Identifizierung von
Wachstumsfaktoren wie zum Beispiel EGF (bdquoepidermal growth factorldquo) und KGF
(bdquokeratinocyte growth factorldquo) Die Verwendung dieser Faktoren hatte zur Folge dass
auf einen Serumzusatz im Medium und ein bdquofeeder layerldquo verzichtet werden konnte
[Boyce und Ham 1983] Mittlerweile sind zahlreiche bdquoserumfreieldquo
Keratinozytenmedien kommerziell erhaumlltlich denen meist noch
Rinderhypophysenextrakt und Antibiotika hinzugefuumlgt werden [De Luca und
Cancedda 1992]
Die Etablierung und die Standardisierung der Keratinozytenkultivierung und die
daraus entstandene Moumlglichkeit autologe Keratinozyten als konfluente mehrlagige
bdquosheet graftsldquo zu zuumlchten fuumlhrte 1981 durch OrsquoConnor erstmals zur klinischen
Anwendung Die Deckung ausgedehnter Brandwunden mit diesen sogenannten CEA
(bdquocultured epithelial autograftldquo) stellt seit uumlber 20 Jahren das bei weitem am
haumlufigsten geuumlbte Verfahren bei der klinischen Anwendung von Hautersatz durch
bdquoTissue Engineeringldquo dar Diese Methode ist vor allem dann von Bedeutung wenn
Brandopfer mehr als 70 ihrer Koumlrperoberflaumlche verloren haben und eine
Spalthautentnahme fuumlr den Organismus ein zu groszliges weiteres Trauma darstellt
[Hull et al 1990 Gustafson und Kratz 1999] Das Verfahren das mittlerweile
hundertfach bei Patienten weltweit durchgefuumlhrt wurde hat jedoch auch etliche
64
Nachteile [Donati et al 1992] Keratinozyten in differenzierten mehrlagigen
epithelialen Transplantaten repraumlsentieren eher einen ruhenden postmitotischen
Zelltyp als einen aktivierten Zelltyp Es gibt Anzeichen dass die proliferative Potenz
der mehrlagigen bdquosheet graftsldquo eingeschraumlnkt ist [De Luca und Cancedda 1992
Juhasz et al 1993] Auszligerdem entspricht die Integrin-Expressioin von basalen
Keratiozyten in einem CEA eher der von normaler unverletzter Haut Bei der
enzymatischen Abloumlsung aus der Kulturflasche mit Dispase kommt es zur
Kontraktion der Haumlutchen und zu einem voruumlbergehenden Verlust von α6β4-
Integrinen welche fuumlr die Adhaumlsion der Zellen von essentieller Bedeutung sind und
zur Internalisierung der Hemidesmosomen der basalen Zellschicht fuumlhrt [Poumay et
al 1994] Die daraus resultierende Immaturitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs
und die verzoumlgerte Rekonstitution der Basalmembran mit ausbleibender Bildung von
Reteleisten [Woodley et al 1988 Raghunath und Meuli 1997] machen das
Transplantat extrem empfindlich gegen Scherkraumlfte und fuumlhren selbst noch Monate
bis Jahre nach der Transplantation zu spontanen Blasenbildungen [Rennekampff et
al 1996] Durch das doch recht komplizierte Herstellungsverfahren sind die Kosten
fuumlr die bdquosheet graftsldquo sehr hoch Auszligerdem werden 3-5 Wochen benoumltigt um eine 18
msup2 groszlige Zellschicht aus einer 2 cmsup2 groszligen Biopsie zu erhalten Deshalb ist eine
voruumlbergehende Deckung der Wunden mit synthetischen Hautersatzmaterialien oder
Leichenhaut erforderlich Die duumlnne Neoepidermis ist sowohl bei dem Abloumlsen aus
der Kulturflasche als auch bei der Transplantation aumluszligerst schwierig handzuhaben
422 Verschiedene Traumlgermaterialien Zur Umgehung der enzymatischen Abloumlsung und zur Vereinfachung der
chirurgischen Handhabbarkeit wurden Keratinozyten auf verschiedenen
Traumlgermaterialien kultiviert darunter diverse natuumlrliche oder synthetischen
Substanzen wie Polyurethan-Mambranen [Juhasz et al 1993] Silikon-Kollagen-
Membranen Hyaluronsaumlurefolien Kollagenschwaumlmme [Jones et al 2002] und
Fibrinkleber [Hunyadi et al 1988 Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994]
Durch die Verwendung von autologen kultivierten Keratinozyten als
Einzelzellsuspension in Fibrinkleber wird die Kultivierungszeit verkuumlrzt und die Zellen
werden zu einem Zeitpunkt mit optimaler Wachstumspotenz transplantiert Nach nur
zweiwoumlchiger Kultivierungsphase konnte die Anwendung sowohl experimentell als
auch klinisch gezeigt werden [Stark et al 1995 Horch et al 1998]
65
Fibrin als Matrixbaustein und gleichzeitiges Transplantationsvehikel fuumlr Zellen hat in
den letzten Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren Hunyadi stellte 1988
erstmals Fibrinkleber als Applikationsmatrix fuumlr einzelne nicht kultivierte
Keratinozyten in Form einer Suspension zur Behandlung von Vollhautwunden vor
[Hunyadi et al 1988] Dabei spielen die guumlnstigen Eigenschaften des Fibrins eine
wichtige Rolle Als Endprodukt der Gerinnungskaskade unterstuumltzt Fibrin die
Haumlmostase und das Einsprossen von neuen Blutgefaumlszligen im Rahmen der
Wundheilung [Giardino et al 1994] Auszligerdem wurde ein guumlnstiger Effekt auf die
Proliferations- und Migrationsfaumlhigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten
verbesserte Einheilungsraten und reduzierte Infektionen beobachtet [Ronfard et al
1991 Jabs et al 1992 Kaiser et al 1994]
423 Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension Zur Herstellung der Fibrinkleber-Keratinozyten-Suspenion werden kultivierte
Keratinozyten in einem subkonfluenten Stadium in die Traumlgermatrix eingebracht
Somit entgehen sie der Kontaktinhibition und weisen eine houmlhere proliferative Potenz
und damit eine houmlhere Wundheilungspotenz auf als ein konfluenter Zellrasen der
bereits zur Differenzierung angeregt wurde und somit mehr postmitotische Zellen
enthaumllt [Kaiser et al 1994 Stark und Kaiser 1994 Stark et al 1995] Allerdings ist
bei dieser Methode eine houmlhere Zellzahl notwendig Nur die Zellen der
dreidimensionalen Fibrinmatrix die auf dem Wundbett zu liegen kommen bilden ein
Neoepithel Die anderen wachsen zu Zellnestern zusammen und gehen allmaumlhlich
durch Abschilferung verloren Auch im Bereich der Basalmembran brachte die KFGS
Vorteile mit sich Im Vergleich zu sheet-graft-Transplantaten entwickelte sich bereits
in der Fruumlhphase der Wundheilung eine reifere Basalmembran Die Applikation der
Suspension stellt sich einfacher dar als die Transplantation von den fragilen bdquosheet
graftsldquo [Bannasch et al 2000] So koumlnnen auch Stellen abgedeckt werden die mit
herkoumlmmlichen bdquosheet graftsldquo nicht zu behandeln sind
424 bdquocomposite-graftsldquo Ein weiterer Ansatz bei der Herstellung von Hautersatz ist die Entwicklung
sogenannter bdquocomposite graftsldquo welche aus einer bdquoepithelialenldquo und einer bdquodermalenldquo
Komponente bestehen
66
Verschiedenste Materialien wurden bislang als Dermissubstitute eingesetzt ua
prozessierte Leichendermis Kollagenpraumlparate und in vitro hergestellte kultivierte
Substrate [Boyce 2001 Jones et al 2002] In vitro Experimente zeigten die
Wichtigkeit einer intakten Basalmembran von dermalen Strukturen und
proliferierenden Keratinozyten fuumlr optimales Zellwachstum
Erst durch die Kombination von Keratinozyten mit einer dermalen Matrix lassen sich
auch tiefere Wunden mit Verlust der Lederhaut effektiv behandeln Der definitive
Wundverschluss ist einfacher und schneller zu bewerkstelligen und auch die
Einheilungsraten von epidermalen bdquosheetsldquo auf einer Dermis transplantiert sind sehr
zufriedenstellend Es wird bei Anwendung der oben genannten Methode in klinischen
Studien von einer Einheilungsrate von fast 94 berichtet [Hickerson et al 1994] Die
epithelialen und dermalen Komponenten scheinen sich durch gegenseitige
Stimulation positiv auf die Bildung von Basalmembranproteinen auszuwirken
Zwischen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten findet eine Kommunikation statt
die zur fruumlhzeitigen Bildung von Reteleisten und Ankerfibrillen fuumlhrt [Konig und
Bruckner-Tuderman 1991 Compton et al 1993]
Diese Ergebnisse fuumlhrten zur Entwicklung von bdquoVollhaut-Substitutenldquo bestehend aus
kultivierten Keratinozyten extrazellulaumlrer Matrix und aus kultivierten dermalen
Fibroblasten Schon in den achtziger Jahren wurden Hautersatzverfahren bestehend
aus autologen epidermalen Anteilen und einer allogenen Dermis zur Behandlung
schwerer Verbrennungswunden erfolgreich eingesetzt [Cuono et al 1986 Langdon
et al 1988] Allerdings kam in diesen Faumlllen Leichenhaut zum Einsatz deren
allogener epidermaler Anteil einige Zeit nach der Transplantation abradiert und mit
autologen Keratinozyten ersetzt wurde Somit wurde ein definitiver Wundverschluss
mit einer allogenen dermalen Matrix und autologen kultivierten Keratinozyten nach
zweizeitiger operativer Behandlung erreicht
Mittlerweile ist vorbehandelte allogene Dermis kommerziell erhaumlltlich Hierbei
handelt es sich um das auch in der vorliegenden Arbeit verwendete Produkt
AlloDermreg dass mittels eines patentierten Verfahrens von der antigenreichen
Epidermis bei Erhalt der Basalmembran getrennt wird und weiterhin saumlmtliche
zellulaumlren Strukturen wie beispielsweise Endothelzellen aus der Dermis herausgeloumlst
werden Die Bedeutung einer erhaltenen Basalmembran verdeutlichte Ralston 1999
[Ralston et al 1999] Beim Vergleich praumlparierter dermaler Konstrukte mit und ohne
Basalmembran kam es bei der Gruppe mit Basalmembran zur Bildung von
67
Hemidesmosomen Dies fuumlhrte zur besseren Anheftung der epithelialen Zellen an der
Dermis zur weiteren Differenzierung des Epithels und zur bleibenden Bildung von
Basalmembranproteinen wie Laminin und Kollagen IV [Guo und Grinnell 1989
Ralston et al 1999] Neben der Basalmembran bleibt auch die Exrazellulaumlrmatrix mit
kollagenen und elastischen Fasern des AlloDermreg intakt So bleiben beispielsweise
die extrazellulaumlren Strukturen ehemaliger Gefaumlszligsysteme erhalten und dienen bei der
Revaskularisierung der Transplantate als ldquoLeitschienenldquo Durch die Moumlglichkeit der
Gefriertrocknung steht ein gut haltbares und verfuumlgbares Produkt bereit [Ben-Bassat
et al 2001] dass als Vorlage der dermalen Regeneration dient indem es besiedelt
vaskularisiert und von dem umgebenden Gewebe inkorporiert wird [Livesey et al
1995]
Obwohl die dezellulierte Dermis als immunologisch inert gilt und zahlreiche
Arbeitsgruppen eine Abstoszligungsreaktion ausschlieszligen [Heck et al 1985
Matouskova et al 1993] postuliert Srivastava et al dass die Verwendung
xenogener Dermis im Vergleich zu allogener Dermis eine verzoumlgerte Wundheilung
und eine verstaumlrkte Kontraktion aufweist [Srivastava et al 1999]
Kombiniert man AlloDermreg mit duumlnnen Spalthauttransplantaten so erhaumllt man einen
Komposit-Hautersatz der von den Heilungsergebnissen mit denen von dicken
Spalthauttransplantaten vergleichbar ist [Wainwright et al 1996 Lattari et al 1997]
Vorteil dieser Methode ist dass die Morbiditaumlt des Spenderhautareals wesentlich
geringer ausfaumlllt
425 Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung Neben den Keratinozyten spielen auch die Fibroblasten eine bedeutende Rolle im
Prozess der Wundheilung Waumlhrend der proliferativen Phase der Wundheilung
stellen sie sogar die wichtigsten Zellen dar Sie produzieren Matrixproteine wie zum
Beispiel Kollagen was einen entscheidenden Beitrag zur mechanischen Stabilitaumlt
leistet und dienen als Quelle zahlreicher Wachstumsfaktoren
Dass kultivierte Fibroblasten einen Einfluss auf die epidermale Regeneration haben
und in die Dermis integriert werden wurde ua von Svensjouml gezeigt Die
Transplantation von Fibroblasten auf Vollhautwunden beschleunigt die
Reepithelisierung Als Kotransplantation mit kultivierten Keratinozyten bildete sich
eine groumlszligere Anzahl von Keratinozytenkolonien im Vergleich zur Gruppe ohne
Fibroblasten die sich im weiteren Verlauf zur Wundoberflaumlche hin orientierten und
68
dort in Neoepidermis uumlbergingen [Svensjo et al 2002] Vergleichbar ist dieser Effekt
mit den sogenannten bdquofeeder layerldquo aus Fibroblasten die Rheinwald und Green zur
seriellen in vitro Kultivierung von Keratinozyten nutzte [Rheinwald und Green 1975]
Neben der epidermalen Regeneration besteht auch ein Einfluss auf die dermale
Regeneration durch die Fibroblasten Eine mit Fibroblasten besiedelte Dermis wird
verzoumlgert degradiert und es kommt zur Reduktion der Myofibroblastenbildung mit
reduzierter Wundkontraktion [Lamme et al 1998] Der Zelltyp der Myofibroblasten
wurde erstmals durch Gabbiani et al beschrieben [Gabbiani et al 1971]
Myofibroblasten sind sowohl Fibroblasten als auch Glatten Muskelzellen in ihren
morphologischen und biochemischen Eigenschaften sehr aumlhnlich Waumlhrend der
Wundheilung entwickeln sie sich aus Granulationsgewebe-Fibroblasten und
exprimieren voruumlbergehend den Marker der Glatten Muskelzelldifferenzierung α-
smooth-muscle-Aktin Dieser Marker kommt in Glatten Muskelzellen
Myoepithelzellen und in den Glatten Muskelzellen der Gefaumlszlige vor [Desmouliere et
al 1993] Waumlhrend der Wundheilung sind Myofibroblasten Bestandteil des
Granulationsgewebes und korrelieren in Anzahl und Verteilung mit der
Wundkontraktion [Gabbiani et al 1971 McGrath und Hundahl 1982 Gabbiani
1999]
43 Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber in Kombination mit einer dermalen Matrix mit und ohne Fibroblasten
Einen Ansatz im Sinne der Idee bdquoRegeneration statt Reparaturldquo verfolgt die eigene
Gruppe Die Moumlglichkeit der simultanen Applikation von kultivierten Keratinozyten
und einer mit autologen Fibroblasten besiedelten dermalen Matrix in vivo ohne
vorherige Kokultivierung in vitro wurde am Groszligtiermodell des Schweines untersucht
Dahinter steht die Ansicht Zellen und Matrix mit Regenerationspotential direkt in vivo
zu applizieren anstatt aufwendige Konstrukte in vitro zu generieren Auf einen
zweiten operativen Eingriff kann somit verzichtet werden
Wie die Ergebnisse der eigenen Arbeit belegen fuumlhrt die einzeitige Applikation von
kultivierten autologen Keratinozyten in Fibrinklebersuspension in Kombination mit
einer dermalen Matrix bei der Behandlung von Vollhautwunden zum erfolgreichen
Wundverschluss Daruumlber hinaus tragen die kultivierten autologen Fibroblasten
69
zahlreiche positive Einfluumlsse zur Wundheilung bei wie beispielsweise die Reduktion
der Wundkontraktion
431 Wundkontraktion Es konnte gezeigt werden dass bereits bei den ersten Kontraktionsmessungen am
14 post-OP Tag alle Gruppen die mit Fibroblasten vorinkubiert wurden eine
geringere Kontraktion aufwiesen als die Gruppen die nicht mit kultivierten
Fibroblasten vorbehandelt wurden Bei den Gruppen mit dermaler Matrix sowohl
human als auch porcin setzte sich diese Tendenz bis zur letzten Messung nach 6
Monaten fort Stets wiesen die mit Fibroblasten behandelten Wunden eine geringere
Kontraktion auf als die Vergleichsgruppen ohne Fibroblasten
Eine reduzierte Wundkontraktion ist ein wichtiger Schritt bei der Optimierung des
Hautersatzes Eine stark ausgepraumlgte Wundkontraktion fuumlhrt besonders im Bereich
von Gelenken zu Kontrakturen mit erheblichen Funktionseinbuszligen weil der volle
Bewegungsumfang nicht mehr erreicht wird
Lamme zeigte dass die Fibroblastenmigration aus der Subkutis in die Wunde
verzoumlgert stattfindet wenn sich bereits kultivierte Fibroblasten in den transplantierten
Konstrukten befinden [Lamme et al 1998] Es scheint dass die eingewanderten
Fibroblasten mehr zur Differenzierung wirksame Signale erhalten die dann zur
Bildung der zur Kontraktion befaumlhigten Myofibroblasten fuumlhren
Lamme et al fuumlhrte Untersuchungen durch in denen er die Anzahl der
transplantierten Fibroblasten variierte In der mit einer houmlheren Zahl an Fibroblasten
inokulierten Gruppe zeigte sich eine α-sm-Aktin Anfaumlrbung der Myofibroblasten fast
ausschlieszliglich um Gefaumlszligstrukturen herum In Wunden ohne Fibroblasten waren sich
Bereiche mit einer deutlichen Myofibroblastenanfaumlrbung vorhanden [Lamme et al
2000] Ein komplettes Ausbleiben der α-sm-Aktin Anfaumlrbung mit Ausnahme der
Gefaumlszligstrukturen konnte in der vorliegenden Arbeit nicht beochachtet werden Ein
deutlicher Unterschied an Intensitaumlt und Flaumlche der Anfaumlrbung wurde jedoch deutlich
Dass es auch bei den Gruppen mit Fibroblasten zu einer Myofibroblastenanfaumlrbung
kam wenn auch deutlich schwaumlcher mag daran liegen dass die von Lamme et al
eingesetzte maximale Zellzahl nicht erreicht wurde (auch Lamme hatte in Gruppen
mit weniger Fibroblasten α-sm-Anfaumlrbungen jedoch geringer als die azellulaumlren
Gruppen) Nach 6 Monaten lieszligen sich Myofibroblasten in allen Gruppen nur noch
70
um Gefaumlszlige herum anfaumlrben Dies ist damit zu erklaumlren dass zu diesem Zeitpunkt der
Kontraktionsvorgang als abgeschlossen gilt
432 Vaskularisieung des Transplantats Inokulierte kultivierte Fibroblasten verzoumlgern auszligerdem den Abbau der
transplantierten dermalen Konstrukte [Lamme et al 1998] Die verlaumlngerte Praumlsenz
des dermalen Konstrukts koumlnnte fuumlr die Geweberegeneration von Vorteil sein weil
die Matrix als Vorlage fuumlr Zellinfiltration Vaskularisierung und Proliferation dient So
ergeben sich hieraus moumlglicherweise positive Einfluumlsse auf die Ernaumlhrung des neuen
Konstruktes was eines der Hauptprobleme bei der Zuumlchtung von Ersatzgewebe ist
Aufgrund der anfaumlnglich stattfindenden Ernaumlhrung der epidermalen Zellen durch
Diffusion ist die Dicke des Hautersatzes limitiert Je dicker das Transplantat desto
schwieriger ist seine Neovaskularisation durch das Empfaumlngerlager desto groumlszliger ist
jedoch seine mechanische Belastbarkeit desto besser ist seine Sensibilitaumlt und
desto geringer ist seine sekundaumlre Schrumpfungsneigung Je nach
Transplantatdicke bedarf es 2-5 Tage bis zur Neovaskularisation des
Hauttransplantats Bis dahin wird es durch Diffusion aus dem Transplantatlager
ernaumlhrt Eine Diffusionbarriere innerhalb der ersten Stunden fuumlhrt zum
unweigerlichen Absterben der transplantierten Zellen Die schlechten
Einheilungsraten des porcinen AlloDermreg in der vorliegenden Studie koumlnnen damit
erklaumlrt werden Das porcine Kollagenkonstrukt war mit 0675 mm um ein Vielfaches
dicker als das humane AlloDermreg (01-05 mm)
Ein rein mechanischer Ansatz um dieses Problem zu loumlsen besteht in der
Schlitzung der Transplantate wodurch Wundfluumlssigkeit mit Wachstumsfaktoren etc
die Zellen an der Oberflaumlche erreichen kann
In Wunden mit porcinem AlloDermreg fand eine staumlrkere Infiltration von
Entzuumlndungszellen statt Ob es sich hierbei um eine Abstoszligungsreaktion oder ein
lokales Geschehen handelt kann nicht sicher beantwortet werden Aber auch bei
einigen Wunden mit humanem AlloDermreg kam es zur Infiltration von
Entzuumlndungszellen Dies koumlnnte eine Erklaumlrung dafuumlr bieten weshalb die Gruppen
mit Dermis im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Dermis keine wesentlichen
Unterschiede in der Wundkontraktion aufwiesen Bei Wunden mit
Entzuumlndungsreaktion kommt es zu einer verstaumlrkten Wundkontraktion [McGrath und
Hundahl 1982]
71
433 Reepithelisierung Die Beobachtung von Svensjouml dass die Transplantation von kultivierten Fibroblasten
auf Vollhautwunden die Reepithelisierung beschleunigt [Svensjo et al 2002]
bestaumltigt sich ebenfalls in der vorliegenden Arbeit Analysiert man den
Wundverschluss der einzelnen Gruppen nach 28 Tagen so zeigt sich dass die
Gruppen mit Fibroblasten zu diesem Zeitpunkt einen fortgeschritteneren
Wundverschluss aufweisen als die Gruppen ohne Fibroblasten Erst wenn eine
Wunde komplett reepithelisiert ist kommt es zu einem Ruumlckgang der Bildung von
Granulationsgewebe Dies wiederum stellt eine Voraussetzung fuumlr die narbenlose
Wundheilung dar Eine verzoumlgerte Reepithelisierung hat dagegen durch die
verstaumlrkte Bildung von Granulationsgewebe eine Sekundaumlrheilung mit Narbenbildung
zur Folge
Der positive Effekt der kultivierten Fibroblasten auf die Wundheilung laumlsst sich damit
erklaumlren dass die inokulierten Zellen einen oder mehrere Wachstumsfaktoren in die
Wundfluumlssigkeit sezernieren die den Heilungsprozess foumlrdern Sie nehmen
moumlglicherweise aktiv am Wundheilungsprozess teil indem sie auf zahlreiche Stimuli
waumlhrend des Heilungsvorgangs reagieren Studien haben belegt dass inokulierte
Fibroblasten die Faumlhigkeit zur Proliferation besitzen [Lamme et al 1998] und bis zu 5
Wochen nach Transplantation uumlberleben [Bell et al 1981]
434 Basalmembrankomplex Coulomb beschreibt die Entwicklung von Reteleisten nach 3 bis 4 Monaten und die
Neosynthese von elastischen Fasern nach 6 bis 9 Monaten bei Wunden die mit
Fibroblasten besiedeltem Kollagen und kultivierten Keratinozyten behandelt wurden
Im Vergleich kam es bei Wunden die nur mit epidermalen bdquosheetsldquo behandelt
wurden zu einer spaumlteren Ausbildung der Reteleisten Auszligerdem kam es zu
geringeren Schmerzen einer guten Haumlmostase und zu besseren mechanischen und
kosmetischen Eigenschaften [Coulomb et al 1998] Bei den lichtmikroskopischen
Untersuchungen der vorliegenden Studie zeigte sich ebenfalls eine deutlichere
Ausbildung der Reteleisten der Gruppen mit Fibroblasten Reteleisten mit ihren
papillaumlren Verzahnungen zwischen Epidermis und Dermis sind von Bedeutung fuumlr die
mechanische Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs aber auch fuumlr die
Oberflaumlchenvergroumlszligerung der Kontaktzone des gut vaskularisierten Stratum papillare
der Dermis und der auf Ernaumlhrung durch Diffusion angewiesenen Epidermis [Putland
72
et al 1995] Daruumlber hinaus zeigte Pins 2000 in einem in vitro Versuch dass die
Topographie der Basalmembran mit seinen Vertiefungen fuumlr die Differenzierung der
Keratinozyten von Bedeutung ist [Pins et al 2000] Weitere Hinweise auf die
Stabilitaumlt des dermo-epidermalen Uumlbergangs bietet der Nachweis verschiedener
Bestandteile der Basalmembran Kollagen VII als Hauptbestandteil der Ankerfibrillen
wird von Keratinozyten gebildet Die Ankerfibrillen befestigen die Basalmembran in
den Dermispapillen [Regauer et al 1990] Woodley fuumlhrte 1988 die Fragilitaumlt der
Epidermis nach Transplantation von bdquosheet graftsldquo auf die nicht vollstaumlndige
Ausbildung der Ankerfibrillen zuruumlck Bei der angeborenen Hautkrankheit
Epidermolysis bullosa bei der die Ankerfibrillen nur unzureichend ausgebildet
werden beziehungsweise gaumlnzlich fehlen kommt es bereits durch kleinste
mechanische Belastungen der Haut oder sogar spontan zur Blasenbildung
Bei den durchgefuumlhrten immunhistologischen Kollagen-VII Faumlrbungen ist ab Tag 14
eine in allen Gruppen einheitlich angefaumlrbte Basalmembran zu erkennen An Tag 7
laumlsst sich noch keine eindeutige Beurteilung treffen Aufgrund der Kreuzreaktivitaumlt
von porcinem und humanem Kollagen laumlsst sich der Ursprung der angefaumlrbten
Ankerfibrillen nur vermuten Da eine Anfaumlrbbarkeit nur in den Gruppen mit
transplantierter Dermis besteht muss wegen der Lage der angefaumlrbten Struktur
davon ausgegangen werden dass es sich um die Basalmembran des
transplantierten AlloDermreg handelt und nicht um eine neu gebildete porcine
Basalmembran Inwieweit die Basalmembran bis zum 14 Tag abgebaut und durch
eine sich neu gebildete ersetzt wird laumlsst sich nicht nachweisen
435 Elastizitaumltsbestimmung Die Elastizitaumltsmessungen nach 6 Monaten fanden statt um festzustellen ob es
zwischen den einzelnen Gruppen einen Unterschied hinsichtlich der
biomechanischen Eigenschaften gibt Die Hautqualitaumlt wurde mit dem Cutometerreg
MPA 580 bestimmt Laut einer Studie uumlber Systemische Sklerose ist das Geraumlt sehr
reliabel Enomoto erzielte mit der 8 mm Sonde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit die
besten Ergebnisse [Enomoto et al 1996] Die duumlnne 2 mm Sonde misst die Qualitaumlt
der Epidermis und der oberflaumlchlichen Dermis die 8 mm Sonde die Dermis
zusammen mit der Beweglichkeit der Grenzschicht zwischen Dermis und
subkutanem Fettgewebe Anzumerken ist der Einfluss von Luftfeuchtigkeit und
Temperatur auf die Elastizitaumlt der Haut Deshalb sollten die Messungen stetes unter
73
gleichen Bedingungen durchgefuumlhrt werden Mittlerweile wird der Cutometerreg
zahlreich zur Evaluation von Verbrennungsnarben [Matsuzaki et al 1995 Fong et
al 1997] und von Hauttransplantaten nach rekonstruktiven Eingriffen verwendet [van
Zuijlen et al 2000]
Die Tatsache dass nach 6 Monaten kein Unterschied zwischen den einzelnen
Gruppen festzustellen war kann an der fortgeschrittenen Narbenreifung liegen Es
zeigten sich auch in den histologischen Untersuchungen nach 6 Monaten keine
wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen Die Epidermis war
mehrschichtig ausdifferenziert und von gleicher Dicke Auch die Dermis war
unauffaumlllig In allen Gruppen waren beispielsweise in der Elastica-van-Gieson
Faumlrbung elastische Fasern gleichermaszligen anfaumlrbbar Die Kollagenstruktur der
einzelnen Gruppen war vergleichbar Uumlberreste der transplantierten Dermis waren
meist nur bis zum 14 post-OP Tag nachweisbar In einer Arbeit von van Zuijlen lieszlig
sich beim Vergleich von Spalthauttransplantaten mit Kollagensubstitut und
Spalthauttransplantaten allein bei rekonstruktiven Eingriffen nach 3 Monaten ein
Elastizitaumltsunterschied feststellen Nach einem Jahr verhielten sich die Gruppen
gleich Bei der Behandlung von Verbrennungswunden bestand bereits nach 3
Monaten kein Unterschied in der Elastizitaumlt zwischen den Gruppen Die gleichen
Messergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen sind auf die fortgeschrittene
Narbenreifung zuruumlckzufuumlhren
74
44 Schlussfolgerungen
bull Die einzeitige Applikation von KFGS und Dermis mit Fibroblasten fuumlhrt zum
Wundverschluss
bull Auf die Konstruktion aufwendiger und kostspieliger in vitro Konstrukte kann
verzichtet werden
bull Ein zweiter operativer Eingriff ist nicht notwendig
bull Die Epithelisierung und die Bildung der Reteleisten bei intakter Basalmembran
wird duch kultivierte autologe Fibroblasten gefoumlrdert
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren in Kombination mit einer dermalen Matrix
zu einer reduzierten Wundkontraktion
bull Kultivierte autologe Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der
Myofibroblastenbildung
bull Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der gesunder Haut
bull Die durch bdquoTissue Engineeringldquo hergestellte Haut haumllt den alltaumlglichen
Belastungen uumlber einen Untersuchungszeitraum von 6 Monaten stand
75
5 Weitere Ansaumltze und Ausblicke
Weitere Ansaumltze im Bereich bdquoTissue Engineeringldquo sind die Veraumlnderungen der Zellen
durch gerichtete Gentherapie mittels diverser Transfektionsarten (liposomal viral
Genkanone Elektroporation) wodurch beispielsweise Keratinozyten bestimmte
Wachstumsfaktoren sezernieren sollen um die Wachstumsbedingungen oder die
Durchblutung der Konstrukte zu optimieren Ein aumlhnlicher Ansatz mit gleicher
Zielsetzung ist die topische Applikation spezifischer Wachstumsfaktoren zB durch
die externe Zufuumlhrung einer mit Wachstumsfaktoren angereicherten Loumlsung
Eines der groumlszligten Probleme beim Einsatz solcher Faktoren ist die Tatsache dass es
aufgrund fehlender Langzeitergebnisse keine gesicherten Hinweise auf eine
moumlgliche Entartungstendenz der genetisch veraumlnderten Zellen gibt Ebenso ist die
topische Applikation von Wachstumsfaktoren nicht hinreichend auf eine moumlgliche
Cancerogenitaumlt untersucht
Mit zunehmender Verbesserung der Anatomie und der Physiologie von
biotechnologisch hergestelltem Hautersatz wird es zu einer immer staumlrkeren
Annaumlherung an die natuumlrlichen Hauttransplantate kommen Verbesserungen auf
diesem Gebiet koumlnnten durch die Hinzunahme weiterer Zelltypen (zB Melanozyten)
und aus Matrixmodifikationen zur verbesserten Einheilung resultieren Weitere
Fortschritte koumlnnten in der Generierung von modifizierten nicht immunogenen
allogenen Keratinozyten bestehen die zu einem jederzeit verfuumlgbaren Epithelersatz
fuumlhren wuumlrden [Jones et al 2002]
Gezuumlchteter Hautersatz wird vielleicht eines Tages dem gegenwaumlrtigen
bdquoGoldstandard Spalthautldquo ebenbuumlrtig sein [Boyce 2001]
76
6 Zusammenfassung
Kultivierte autologe Keratinozyten als Suspension in Fibrinkleber (KFGS) stellen eine
etablierte Therapie bei schwersten Verbrennungen dar In Kombination mit
Fibroblasten findet eine gegenseitige Stimulation statt mit zahlreichen positiven
Einfluumlssen auf die Wundheilung Bei der Behandlung von tiefen drittgradigen
Wunden ist ausserdem der Ersatz des zerstoumlrten dermalen Anteils der Haut ein
wichtiger prognostischer Faktor Die Vollhautregeneration durch die einzeitige
Applikation dieser Bestandteile war Ziel dieses tierexperimentellen Versuchs
Subkonfluente porcine Keratinozyten- und Fibroblastenkulturen wurden nach 2-3
Wochen trypsinert und in Fibrinkleber suspendiert Fibroblasten wurden 4 Tage vor
der Transplantation auf einer azellulaumlren dermale Matrix (AlloDermreg human und
porcin) ausgesaumlt Auf dem Ruumlcken von 9 Hausschweinen wurden jeweils 6
Vollhautdefekte (5 x 5 cm) mit KFGS in Kombination mit azellulaumlrer Dermis
behandelt Die Dermis wurde sowohl mit als auch ohne praumlkultivierte Fibroblasten
transplantiert Als Kontrollen dienten Wunden die nur mit KFGS oder einer
Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension transplantiert wurden Der
Versuchszeitraum betrug 4 Wochen (n=5) bzw 6 Monate (n=4) Der makroskopische
Wundheilungsverlauf und die Wundkontraktion wurden fotografisch und planimetrisch
uumlber den gesamten Versuchszeitraum dokumentiert Die Wunden wurden am post-
OP Tag 7 und 14 biopsiert und nach 28 Tagen bzw nach 6 Monaten exzidiert
Haumlmatoxilin-Eosin- Elastica-van-Gieson- und Trichrom-Faumlrbungen wurden zum
Nachweis der Histomorphologie und der Einheilung der Transplantate durchgefuumlhrt
Immunhistologisch wurden Kollagen-VII und αminussm-Aktin Faumlrbungen zum Nachweis
der rekonstituierten kontinuierllichen Basalmembran und der Myofibroblasten
durchgefuumlhrt Die Qualitaumlt der Haut wurde nach 6 Monaten mittels eines
biomechanischen Tests untersucht
- Die einzeitige Applikation von Dermis und Keratinozyten fuumlhrt zum Wundverschluss
- Die Kombination von azellulaumlrer Dermis und Fibroblasten fuumlhrt zu einer deutlich
reduzierten Wundkontraktion
- Die Epithelisierung und Bildung von Reteleisten bei intakter Basalmembran wird
durch Fibroblasten gefoumlrdert
- Kultivierte Fibroblasten fuumlhren zu einer Reduktion der Myofibroblastenbildung
- Die Elastizitaumlt der bdquoneuenldquo Haut ist vergleichbar mit der normaler Haut
77
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83
8 Veroumlffentlichungen
Im Rahmen der Arbeit entstanden folgende Veroumlffentlichungen Originalpublikationen H BANNASCH M FOEHN T UNTERBERG F KNAM B WEYAND G B STARK (2003) Gewebeersatz (tissue engineering) von Dermis und Epidermis Der Chirurg Band 74 Heft 9 September 2003 Seite 802-807 Vortraumlge M FOEHN F KNAM H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Preleminary Results Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis - experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 120 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Chirurgie 29 April bis 02 Mai 2003 in Muumlnchen F KNAM M FOEHN H BANNASCH RE HORCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 7 Kongress der Deutschen Gesellschaft fuumlr Wundheilung und Wundbehandlung 26-27 Juni 2003 in Augsburg Abstract in Zeitschrift fuumlr Wundheilung Sonderband 2003Seite 19 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Full thickness skin regeneration by combination of an autologous keratinocytes-fibrin-glue-suspension and fibroblasts combined with acellular dermis - an experimental long-term study in a pig model 2nd Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society 03-06 September 2003 in Genua Abstract in Tissue Engineering Volume 9 Number 4 August 2003 Seite 831 F KNAM M FOEHN H BANNASCH GB STARK (2003) Vollhautersatz durch Kombination einer autologen Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension und Fibroblasten in Kombination mit einer azellulaumlren Dermis ndash experimentelle Langzeituntersuchung am Schweinemodell 34 Jahrestagung der Vereinigung der Deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC) 8Jahrestagung der Deutschen Aumlsthetisch-Plastischen Chirurgen (VDAumlPC) 30 September ndash 05 Oktober 2003 in Freiburg Abstract in Plastische Chirurgie Supplement 1 3 Jahrgang September 2003 Seite 17
84
9 Lebenslauf
Friedrich Knam geboren am 02 Oktober 1976 in Baden-Baden Besuch der Grundschule Sasbach von 1983 bis 1987 Besuch der Heinschule Lender Gymnasium von 1987 bis 1996 Erlangung der allgemeinen Hochschulreife 1996 Ableistung eines bdquoAnderen Dienstes im Auslandldquo bei einer juumldischen Sozialarbeiterorganisation in New York City von Februar 1997 bis August 1998 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universitaumlt Freiburg im Oktober 1998 Aumlrztliche Vorpruumlfung im August 2000 Erster Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im August 2001 USMLE step 1 im Oktober 2001 Famulaturen in den Faumlchern Chirurgie Plastische Chirurgie Radiologie und Paumldiatrie in Wien New York City Freiburg und Prag in den Jahren 2001 bis 2003 Arbeit an der Dissertation im Tissue Engineering Labor der Abteilung fuumlr Plastische und Handchirurgie der Universitaumltsklinik Freiburg von Dezember 2001 bis September 2003 Promotionskolloquium im Januar 2004 Zweiter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2004 Praktisches Jahr von April 2004 bis Februar 2005 Innere Medizin am Tampa General Hospital der University of South Florida USA als Stipendiat der Medizinischen Fakultaumlt Freiburg Chirurgie am Diakonissenkrankenhaus in Karlsruhe und Plastische und Handchirurgie als Wahlfach an der Universitaumltsklinik Freiburg Dritter Abschnitt der Aumlrztlichen Pruumlfung im April 2005 Approbation als Arzt und Promotion im Mai 2005
85
10 Danksagung
Fuumlr die Uumlberlassung des Themas bedanke ich mich recht herzlich bei meinem
Doktorvater Herrn Prof Stark Ganz herzlich moumlchte ich mich auch fuumlr die hilfreichen
Anregungen im Rahmen der woumlchentlich stattfindenden Doktorandenseminare und
der Moumlglichkeit die Arbeit auch bei groumlszligeren Veranstaltungen vorstellen zu duumlrfen
bedanken
Auszligerdem bedanke ich mich fuumlr die zuverlaumlssige und unkomplizierte Unterstuumltzung
durch meinen Betreuer Herrn Dr Bannasch der mir stets Vertrauen entgegenbrachte
und mir viel Freiraum lieszlig
Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr Foumlhn der mir waumlhrend der gesamten Zeit stets
herzlich und geduldig beiseite stand mit mir Erfolge und auch Ruumlckschlaumlge teilte und
ohne dessen Mithilfe ich mir einen erfolgreichen Abschluss dieses Projekts nicht
vorstellen kann
Auch der tiermedizinischen Abteilung gilt mein herzlicher Dank besonders Herrn
Prof Haberstroh Frau Andrea Geist sowie dem gesamten tierpflegerischen Team fuumlr
die gewissenhafte und sorgfaumlltige Betreuung unserer Schweine
Ein herzliches Dankeschoumln auch an alle im Labor taumltigen insbesondere an Herrn Dr
Torio Padron die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen
Sehr Dankbar bin ich auch Herrn Alexander Klein der sich fuumlr die Vorkorrektur
meiner Arbeit sehr viel Zeit nahm und mir etliche hilfreiche Tipps gab
Ohne die groszligzuumlgige finanzielle Unterstuumltzung durch die Firma Baxter waumlre das
Projekt nicht realisierbar gewesen Hierfuumlr bedanke ich mich besonders bei Frau Dr
Katharina Bittner
Weiterhin moumlchte ich mich bei meinen Eltern meinen Groszligeltern und meinen
Geschwistern bedanken die mich alle auf ihre ganz besondere Weise waumlhrend der
letzten 2 Jahre unterstuumltzten und begleiteten
- Einleitung
-
- Allgemeines
- Hautersatzstrategien
-
- Anforderungen an einen Hautersatz
- Temporaumlrer Hautersatz
- Definitiver Hautersatz
- Bedeutung der dermalen Matrix
- Komposit-Hautersatz
-
- Versuchstier Schwein
- Fragestellung
-
- Methodik
-
- Uumlberblick
- Zellkultivierung
-
- Kultivierung der Schweinekeratinozyten
-
- Herstellung der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension (KFKS)
-
- Etablierung der Schweinefibroblastenkultur
-
- Herstellung der Fibroblasten-Keratinozyten-Fibrinkleber-Susp
- Fluoreszenzmarkierung der Fibroblasten
-
- Verwendung des humanen und des porcinen Dermisersatzes (All
-
- Tierversuchsdurchfuumlhrung
-
- Operation
- Hautentnahme zur Gewinnung der Keratinozyten und Fibroblaste
- Taumltowierung und Transplantation
- Verlauf des Kurz- und Langzeitexperiments postoperativ
- Planimetrie zur Bestimmung der Wundkontraktion
- Bestimmung der Einheilungsrate und des Wundverschlusses
- Untersuchung der Hautqualitaumlt mit einer Saugsonde
-
- Histologische Untersuchungen
-
- Klassische Lichtmikroskopie
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Bewertung der Reteleisten
-
- Statistik und Computerprogramme
-
- Ergebnisse
-
- Praumloperative Zellkultivierung
- Verlauf des Tierversuchs
-
- Operation
- Versuchsverlauf
-
- Makroskopische Wundheilung Wundkontraktion und Elastizitaumlts
-
- Einheilung der Transplantate
- Wundverschluss
- Die makroskopische Wundheilung
-
- KFGS-Gruppe
- F-KFGS-Gruppe
- hAD-Gruppe
- hAD+F-Gruppe
- pAD-Gruppe
- pAD+F-Gruppe
-
- Planimetrische Auswertung der Kontraktion
- Bestimmung der Elastizitaumlt der Transplantatflaumlchen mit der V
-
- Histologische Resultate
-
- Klassische Lichtmikroskopie
-
- Ergebnisse der Gruppen
- Nachweis der markierten Fibroblasten auf dem Dermisersatz in
-
- Immunhistochemie
-
- Nachweis der rekonstituierten Basalmembran
- Nachweis von Myofibroblasten
-
- Diskussion
-
- Allgemeine Gegebenheiten
- Geschichte
-
- Keratinozytenkultivierung und die Entwicklung von bdquosheet gra
- Verschiedene Traumlgermaterialien
- Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension
- bdquocomposite-graftsldquo
- Bedeutung der Fibroblasten in der Wundheilung
-
- Eigenes Projekt Vollhautersatz durch kultivierte autologe
-
- Wundkontraktion
- Vaskularisieung des Transplantats
- Reepithelisierung
- Basalmembrankomplex
- Elastizitaumltsbestimmung
-
- Schlussfolgerungen
-
- Weitere Ansaumltze und Ausblicke
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Veroumlffentlichungen
- Lebenslauf
- Danksagung
-