Area Tematica 2 Bioterapie dei tumori Sottoprogetto NUOVE...
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Area Tematica 2 Bioterapie dei tumoriSottoprogetto NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE:
TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE
Convegno ACC Roma , 10 Febbraio 2009
IRCCS Humanitas
IRCCS INT Milano
IRCCS Bari
Univ. Milano Bicocca
IRCCS HSR-MI
Osp. Riuniti BG
Univ. Tor Vergata
IRCCS Istituto Clinico Humanitas, Milano – Alberto Mantovani
NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE: TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE
An integration to: - Hanahan and Weinberg Cell, 2000- Mantovani et al. Nature 2008
An inflammatorymicroenvironment
Inflammatory leukocytes, cytokines, chemokines, enzymes,reactive stroma, neo‐angiogenesis
IRCCS Humanitas, Milano
Bersaglio Mediatori infiammatori espressi nel micro-ambiente tumorale : PTX3, recettori per chemochine (CX3CR1), modulatori dell’infiammazione (TIR8)
Obbiettivo • Definizione del ruolo della proteina di fase acuta PTX3 nella prevenzionedi infezioni fungine in pazienti con neoplasie ematologiche
• Definizione del ruolo del recettore per chemochina CX3CR1 nelladisseminazione dell’adeno- carcinoma del pancreas
Obbiettivotraslazionale
• Valutare il potenziale profilattico/terapeutico di PTX3 in pazienti con neoplasie ematologiche a rischio di infezioni opportuniste.
• Utilizzo del recettore CX3CR1 per identificare i pazienti con adeno-carcinoma del pancreas a piu’ alto rischio di recidiva locale dopo chirurgia
Identificazione di mediatori infiammatori da utilizzarsi quali potenziali biomarcatoridiagnostici/prognostici e co-adiuvatori delle terapie anti-tumorali convenzionali
PTX3CRP/SAP
IL-6 DC, Mø, EC, PMN
Liver
short pentraxins long pentraxins
Microbial sensing,tissue damage
Inflammatorycytokines
(Bottazzi et al Curr Opinion Immunol, 2006)
OPSONIZATION,AGGLUTINATION,
COMPLEMENT ACTIVATION,INNATE RESISTANCE TO
PATHOGENS
TUNINGINFLAMMATION
EDITINGSELF-NONSELF
DISCRIMINATION
EXTRACELLULARMATRIX AND
FAMALEFERTILITY
PENTRAXINS, MULTIFUNCTIONAL SOLUBLE PATTERN RECOGNITION RECEPTORS
DIAGNOSTIC MARKER ?
Blood PTX3 levels in AML at diagnosis, end of first chemotherapy cycle and during infection.
PTX3
CRP
Blood levels of PTX3 during the course of therapy in patients with AML and during fungal infections
05
1015
A c u t e M y e lo id L e u k e m ia sN = 3 6
D ia g n o s is E n d o f 1 s t c h e m o t h e r a p y c y c le
I n f e c t io n
PCR
(mg/
dL)
020
4060
8010
012
0
A c u te M y e lo id L e u k e m iaN = 3 6
D ia g n o s is E n d o f 1 s t c h e m o th e r a p y c y c le
In fe c t io n
p = 0 .0 1 0
PTX
-3 n
g/m
l
1. PTX3 levels at diagnosis are more elevated compared to healthy subjects.
2. Levels at the end of the first cycle of chemotherapy are significantly enhanced compared to values at diagnosis.Thisincrease can be reasonably interpreted as a direct release of PTX3 by neoplastic cells, consequent to therapy or via induction of cytokines activating paracrine circuits of PTX3 release.
3. Both PTX3 and PCR levels are markedly elevated when patients experience an infection, most frequently by fungi.
Prospective study in 62 patients. This study will allow us to correlate:1. PTX3 values and the clinical response to therapy 2. the potential protective role of PTX3 against the
development of fungal infections
Unit: Rambaldi, Ospedali Riuniti Bergamo
Plasmatic levels of PTX3 correlates with evolution of disease and response to antifungal treatment.
30
20
10
0Diagnosis 1 2 3 5
weeks after therapy
Plama PTX3
PTX
3 ng
/ml
PTX3 showed significantly higher plasmatic values in patients with infections. The response to antifungal therapy correlated with normalization of PTX3 values.
30
20
10
0
Healthy ALL ALL infection
PTX
3 ng
/mlUnit: Biondi, Uni. Bicocca, Milano
Plasma levels of PTX3 in tumor patients and PTX3 expression in tumor tissues
CD31 PTX3 CD68
Pre-therapy
Post therapy
IL-8
0
10
20
30
T0 T1 T2
pg/m
l med
ian
*
*
IL-6
050
100150200
T0 T1 T2
pg/m
l med
ian
*
*
0
20
40
60
T0 T1 T2
ng/m
l med
ian
Laparotomici Laparoscopici
** *
PTX3
Healthy Liver CRC Lipocancer
PTX3
Involvement of chemokine receptors in the perineuraldissemination of pancreatic cancer cells?
Nerve
Tumor
Nerve
Tumor
Nerve tropism of pancreatic cancer
Endothelial cells
Neural cells
CX3CL1
Mantovani/AllavenaIRCCS Humanitas, Milano
The receptor for CX3CL1 is upregulated in pancreatic cancer and isa significant risk factor for perineural dissemination and early localrecurrence
Normal Tumor
CX3CR1
Marchesi et al, Cancer Res. 2008
CX3CR1 expression correlates with neural invasion and local recurrence in resected pancreatic cancer patients
C
PanIN1 40X PanIN2, 30X PanIN 3, 30X
A B C
CX3CR1 expression in Pancreatic Intraepithelial Neoplasia (PanIN 1->3)
CX3CR1 expression in PanIN with increasing degrees of dysplasia (PanIN 1→3)
47
149
19
27 29
05
101520253035404550
PanIN 1 PanIN 2 PanIN 3
No.
of c
ases
A
B C
A vs B, p=0.0001A vs C, p<0.0001B vs C, p=0.11
CX3CR1 (++) (+)
Laghi, IRCCS Humanitas, Milano
IRCCS San Raffaele, Milano – Manfredi, Rovere
Bersaglio Identificare molecole dell’immunità innata che siano predittive del successo a lungo termine del trattamento neo-adjuvante per ilcarcinoma del colonretto
Obbiettivo • Valutare l’entità e le caretteristiche della morte cellulare in sede dineoplasia a seguito della terapia neoadiuvante
• Valutare le popolazioni dell’immunità innata e I loro prodotti nelle cellule circolanti e infiltranti la neoplasia a seguito della terapia neoadiuvante
Obbiettivotraslazionale
• Utilizzo dell’osservazione sulla morte cellulare per identificareprecocemente i pazienti responder
• Utilizzo della caratterizzazione delle cellule dell’immunità innata e loroprodotti per identificare precocemente i pazienti responder (e distinguerlidai pazienti non-responder)
CD
14
CD86 CD163
+1 +16Caratterizzazione monociti nel sangue periferico
Esempio di paziente che non modifica le caratteristiche dei monociti circolanti durante la CT+RT
Esempio di paziente chemodifica le caratteristiche dei monociti circolanti durante la CT+RT
CD163
Caratterizzazione infiltrato in sede di neoplasia
+1
+16 +1
Esempio di paziente con importante infiltrato macrofagico
Bersaglio Clasterina, una proteina multifunzionale implicata nel controllo dell’infiammazione e nella progressione dei tumori del colon retto.
Obiettivo •Ruolo di mediatori solubili del microambiente (IL-6, TGFβ) nell’induzionedell’isoforma secreta della Clasterina nel carcinoma del colon retto.• Definizione del ruolo della Clasterina secreta come nuova molecola ‘pro-survival’ implicata nella resistenza a trattamenti antineoplastici.
Obiettivotraslazionale
• Clasterina come nuovo target terapeutico coinvolto nella sensibilità al trattamento antineoplastico•Validazione clinica del metodo nelle feci e nel siero di pazienti oncologici a vario stadio di malattia.
Dipartimento di Biopatologia, Università di Roma Tor VergataLuigi Spagnoli e Sabina Pucci
AUMENTO DELL’ESPRESSIONE DI IL-6 e CLASTERINA SECRETA (sCLU) NELLA TUMORIGENESI DEL COLON
sCLU : NUOVO MARCATORE PROGNOSTICO IN SITU E CIRCOLANTE
IL-6 CD68
IL-6 E MICROAMBIENTE: ESPRESSIONE NELLE CELLULE EPITELIALI TUMORALI E NEI TAM (CD68+)
pT3N1
T
N
T
pT3N0
L’AUMENTO DELL’ESPRESSIONE DI IL-6 e sCLU NEL CARCINOMA DEL COLON CORRELA CON L’AGGRESSIVITÀ TUMORALE (N0 verso N1)T: CARCINOMA DEL COLON; N: MUCOSA SANA.
sClu
T
N
T
pT3N0
pT3N1
IL-6
I LIVELLI DI CLASTERINA SECRETA AUMENTANO SIGNIFICATIVAMENTE NEI SIERI (A) E NEGLI ESTRATTI FECALI
(B) DEI PAZIENTI CON CANCRO DEL COLON (K)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
K C
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
K
K (n =35)
C (n = 25)
C
Ap = 0,0002
K (n =25)
C (n = 27)
p = 0,018
B
IL-6 INDUCE UN AUMENTO DI sCLU IN CELLULE DI CARCINOMA DEL COLON (CACO-2) FAVORENDO I
MECCANISMI DI SOPRAVVIVENZA DEL CLONE NEOPLASTICO
Nt 4h 24h
Ku-70
Bax IP
Bax
IL TRATTAMENTO CON IL-6 INIBISCE LA FUNZIONE PRO-APOPTOTICA DI BAX AUMENTANDO IL LEGAME TRA BAX e KU70 (Bax IP).
β2m
M Nt 6h 24h
200bp
012345
un 6h 24h
Clu
0123456
pre-Clu nClu sClu
Un
IL-6 24hUn IL-6
24h
sClu
nClu
pClu
IL TRATTAMENTO CON IL-6 INDUCE UN AUMENTO DEI LIVELLI DI CLASTERINA.mRNA (A); PROTEINA (B).M: MARKER DI PESO MOLECOLARE; NT/UN: CACO2 CELLS NON TRATTATE; 6h, 24h: TRATTAMENTO CON IL-6.
B
A
Area Tematica2
Bioterapie dei tumori
Sottoprogetto NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE: TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE
Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori MilanoSilvana CanevariMariagrazia Borrello
Fondazione IRCCS
Promozione mediata da oncogeni di un microambiente infiammatorio nel carcinoma tiroideo e ovarico
Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Milano
Bersaglio Promozione mediata da oncogeni di un microambiente infiammatorio neicarcinomi della tiroide e dell’ovaio
Obbiettivo • Caratterizzare il programma pro-infiammatorio e pro-invasivo indotto dagli oncogeni aventi un ruolo causale nella patogenesi dei PTC (RET/PTC, TRK e BRAF).• Identificare marcatori specifici associati al diverso grado di malignità deicarcinomi papillari della tiroide (PTC)
• Analizzare se le precedenti osservazioni (punti 1 e 2) possano essere estese al carcinomi ovarico (EOC) nella cui patogenesi sono coinvolte molecole infiammatorie
Obbiettivotraslazionale
• Valutare l’utilizzo dei marcatori identificati nel PTC e nel EOC per diagnosi differenziale e/o quali bersagli molecolari per nuove terapie
Fondazione IRCCS
Fondazione IRCCS
▼ ▼BRAF
NONE
NORMAL
RASRET
/PTC
(4) (11) (26) (5) (9)
BRAF
NONE
NORMAL
RASRET
/PTC
(4) (11) (26) (5) (9)
Attivazione di un programma pro-infiammatorio da parte di
oncogeni diversi nei tumori papillari della tiroide
Moc
k
RET
/PTC
1s
TRK
T3
BR
AFV
600E
HR
ASG
12V0.0
0.5
1.0 CCL2
Rel
ativ
e Ex
pres
sion
Moc
k
RET
/PTC
1s
TR
KT3
BR
AFV
600E
HR
ASG
12V0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
CXCL8
345
Rel
ativ
e Ex
pres
sion
Moc
k
RET
/PTC
1s
TRK
T3
BR
AFV
600E
HR
ASG
12V0.0
0.5
1.0
1.5
2.0IL1B
Rel
ativ
e Ex
pres
sion
CCL2
CXCL8
IL1 beta
RET/
PTC
RET/
PTC
RET/
PTC
TRK
TRK
TRK
BRAF
BRAF
BRAF
RAS
RAS
RAS
MOC
KM
OCK
MOC
K
L’analisi bioinformatica di un dataset di tumori papillari della tiroide (PTC), geneticamente caratterizzati, suggerisce che tumori mutati per BRAF o RET/PTC condividono alterazioni di signaling (es: EGFR pathway)
Tramite transfezione con diversi oncogeni associati a PTC si sono identificati sia programmi pro-infiammatori comuni che oncogene-specifici
Fondazione IRCCS
Attivazione di un programma pro-infiammatorio da parte dioncogeni diversi nei tumori papillari della tiroide
EGFR e i suoi ligandi sono una via di segnalazione prevalente nel PTCEGFR e i suoi ligandi emergono tra le vie di segnalazione attive nel PTC e con potenzialità di cooperazione con gli oncogeni noti
Validazione tramite real-time PCR della convergenza di RET/PTC e BRAF su specifici vie di segnalazione utilizzando una casistica di PTC a statomutazionale noto
EGFR
05
1015
2025
HELA
NTHY
TPC1NIM
BCPAP K1
WROFTC13
3
8505
CHOTCH
KAT4BHT
KAT18HTC
/C3
Rel
ativ
e Ex
pres
sion
(hEG
FR) TGF ALPHA
05
101520253035
HELA
NTHY
TPC1NIM
BCPAP K1
WRO
FTC133
8505
CHOTCH
KAT4BHT
KAT18HTC
/C3R
elat
ive
Expr
essi
on (h
TGFA
)
RET
/PTC
1
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
RET
/PTC
1
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
BR
AFV
600E
EGF-R TGFb
Fondazione IRCCS
Cross-talk tra tirosin-chinasi recettoriali attivate e signaling da chemochinenel carcinoma dell’ovaio
L’inibizione della trans-fosforilazione di EGFR è accompagnata da una diminuzione di espressione proteica di CXCR4
Attività in corso in funzione dell’inibizione della trans-fosforilazione di EGFRValutazione dell’attività trascrizionale di NFκB, STAT- 3 and AP-1Analisi dell’epressione di IL-6, CXCL12 ed identificazione di citochine/chemochine dipendenti dal pathway di EGFR
TIME (hr) 24 48 24 48
Control Herbstatin (50 μM)
EGFR (Y1173)
CXCR4
OAW42 cells
Area Tematica 2 Bioterapie dei tumori
Sottoprogetto NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE: TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE
IRCCS Istituto Tumori Giovanni Paolo II BariGirolamo RanieriUniversita’ di BariAngelo Vacca
Validazione di nuovi bersagli terapeutici dell’angiogenesi: i mastociti e il pathway PDGFBB/PDGFRbeta
Bersaglio •Mastociti dello stroma tumorale e loro prodotti angiogenetici :VEGF, Triptasi, Chimasi; fattori dell’angiogenesi: PDGF e VEGF e cellule stromali del microambiente (endotelio e macrofagi)
Obbiettivo • Definizione del ruolo angiogenetico dei mastociti nel microambiente tumoralee nella progressione neoplastica in modelli sperimentali e in pazienti affetti dacarcinomi del colon-retto e mammella
• Studio del ruolo del PDGF e recettore (PDGF-Rbeta) e del VEGF/ VEGF-R2 nella proliferazione, invasione e angiogenesi delle cellule di mieloma multiploe dei macrofagi associati
Obbiettivotraslazionale
• Valutazione dei livelli sierici e plasmatici di chimasi, triptasi e VEGF prima e dopo trattamenti di chemioterapia loco-regionale epatica in pazienti tumorali. Valutazione dell’efficacia anti-angiogenetica di Imatinib mesilato, Nafamostatmesilato, Tranilast.
• Inibizione delle vie di segnale a valle di PDGF/ PDGF-Rbeta e VEGF/ VEGFR-2 per inibire la progressione del mieloma multiplo
• Progettazione di un trial di fase I con dasatinib (e bortezomib) in pazienti conmieloma in recidiva o refrattario
IRCCS Istituto Tumori Giovanni Paolo II Bari - Universita’ di Bari
VEGFR2Real-Time RT-PCR
VEGFR2
bp
496
MediumZA 10 μM
ZA 30 μM
MMECs + Mev 10 μM
+ Mev 30 μM
medium
ZA 10 μM
ZA 30 μM
+ Mev 10 μM
+ Mev 30 μM
medium
ZA 10 μM
ZA 30 μM
+ Mev 10 μM
+ Mev 30 μM
medium
ZA 10 μM
ZA 30 μM
+ Mev 10 μM
+ Mev 30 μM
medium
ZA 10 μM
ZA 30 μM
+ Mev 10 μM
+ Mev 30 μM
VEGF165
bp
367
MediumZA 10 μM
ZA 30 μM
MMECs + Mev 10 μM
+ Mev 30 μMA
B
GAPDH
bp347
MediumZA 10 μM
ZA 30 μM
MMECs + Mev 10 μM
+ Mev 30 μM
%
-100-75
-25-50
0
P < .03P < .05
MMECs EA.hy 926 MMECs EA.hy 926
P < .05 P < .03
%
-100-75
-25-50
0
VEGF165
Scavelli – Vacca, Mol. Cancer Therap. 2007
Identificazione dell’acido zoledronico come molecola inibitoria del VEGF/VEGFR-2, e quindi anti-angiogenica nei pazienti con mieloma multiplo
A B C
VEGF165 alone plus ZA 30 µMConditioned medium of myeloma endothelial cells
Ranieri G. et al International Journal of Oncology 2009
Immunostaining with anti-VEGF ofmicrovessels (arrows) and mast cells (doublearrow) in highly vascularized poorlydifferentiated (G3) mast cell tumor
A) Immunostaining with anti FVIII-RA arrows indicate two microvessels among several pleomorphic bluedegranulated mast cells. B) Monomorphic blue granulated mast cells stained with
Undritz method for mast cells identificationSignificantly correlation between circulatingand cytosol levels of VEGF in mast celltumor model
P= 0.03
Mast cells positive to tryptase correlate to microvascular extension and VEGF levels in tumors
Fondazione IRCCSIST.Tumori MilanoS.Canevari
IRCCS HumanitasRozzano MilanoA. Mantovani
IRCCS FondazioneIST.Tumori MilanoMG. Borrello
IRCCS IST.TumoriGiovanni Paolo IIBari G.Ranieri
Universita’ di Bari A. Vacca
Univ. Milano BicoccaA. Biondi
Osp.Riuniti BergamoA. Rambaldi
IRCCS HSR Milano A. Manfredi
IRCCS HumanitasM. Montorsi
Univ. Tor VergataRoma S.Pucci
IRCCS HumanitasL. Laghi
NUOVE MOLECOLE DELL’INFIAMMAZIONE: TRASFERIMENTO DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE