Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita

M.Jarošová, A. Mišurcová,M.Vávrová, D. StříteckáI.patologicko-anatomický ústav FN u sv. Anny, Brno

Rožnov pod Radhoštěm, 2007

Žít s epidermolysis bullosa znamená…

            … mít kůži tenkou, křehkou a lehce zranitelnou, jako jsou motýlí křídla.

… vědět, že stačí tlak, tření švu prádla, které způsobí bolavé poranění a puchýře na kůži.

… že při polknutí tuhé stravy mohou být poraněny sliznice v dutině ústní, což

znemožní polknout třeba vlastní sliny … mít puchýře na chodidlech už po deseti

či patnáctiminutové chůzi.… vyřazení z většiny dětských her, protože i

obyčejné hračky mohou neobyčejně ublížit.… denně trávit až tři hodiny ošetřováním

poraněné kůže, bolestivých ložisek.… vyvazovat prsty na rukou, aby se oddálil

jejich srůst.

Epidermolysis bullosa congenita (EBC)

EB je velice vzácné onemocnění kůže Každý z nás může být nosičem vadného genu V současné době neexistuje žádný způsob

léčby Jedná se o onemocnění genetické, ne

nakažlivé, nepostihuje intelekt Největší nadějí je genová terapie Těžká forma může skončit smrtí pacienta v

raném věku Poraněná kůže je velmi citlivá a rány (defekty)

neustále bolí. Dochází k řídnutí a vypadávání vlasů a ke ztrátě nehtů a zubů

Epidermolysis bullosa congenita (EBC)

Tvorba puchýřů na kůži, někdy i na sliznicích

Po drobných traumatech (tření, tlak) nebo i spontánně - mechanobulózní dermatózy

Při postižení sliznic nelze pak polknout ani sliny, sousto jídla, tvoří se puchýře v GIT a dýchacím systému

Typické pro EBC – projevy onemocnění se mohou lišit i v rámci jedné rodiny

Rozlišujeme tři formy – simplex, junkční a dystrofickou, z nichž každá má několik podtypů

Epidermolysis bullosa congenita (EBC)

EB SIMPLEX → rovina štěpení epidermální - uvnitř epidermis jako následek cytolýzy

Je nejběžnější forma onemocnění

Puchýře a rány na rukou a nohou

Je popsána jako nejslabší, neboť kůže nezjizví, ale není možné podceňovat každodenní bolest a omezení

Epidermolysis bullosa congenita (EBC)

EB JUNKČNÍ (ATROFICKÁ ) → štěpení uvnitř lamina lucida (v oblasti dermoepidermální junkce)

Junkční forma EB má několik podtypů, které se liší svou závažností

Bývají postiženy i průdušky a hrtan

Těžký typ junkční formy EB obvykle končí smrtí dítěte během prvních měsíců života

Epidermolysis bullosa congenita (EBC)

EB DYSTROFICKÁ → dochází ke štěpení těsně pod lamina densa v oblasti kotvících fibril (subepidermálně)

Dystrofická forma EB může mít různé projevy

Patří mezi nejzávažnější a velice omezuje běžný život člověka

Epidermolysis bullosa congenita (EBC) - terapie Obecně - antiseptika, lokální

antibiotika, krytí, zvláčňující krémy, pohodlná obuv, minimum švů, volné bavlněné prádlo

EBS – v rodinách vlastní zkušenosti, jak předejít provokujícím vlivům, autosomálně dominantní dědičnost, rodiče předávají dětem vlastní specifické způsoby terapie

EBJ – obecné zásady lokální terapie stejné jako u ostatních, generalizované formy onemocnění se ošetřují snadněji než EBD

Epidermolysis bullosa congenita (EBC) - terapie

EBD – nejnáročnější péče, zahrnuje péči o kůži, prevenci a léčbu komplikací např.

Srůsty prstů → existuje možnost operace - plastická chirurgie – odseparování

Poranění sliznice GIT → tekutá a kašovitá strava

Infekce v dutině ústní → kazivost chrupu, poškozené dásně

Sideropenické anémie → ztráta Fe vlivem krvácení aj.

Epidermolysis bullosa congenita (EBC)

Procentní zastoupení tří skupin EBC

SEB 46%

JEB 10%

DEB 44%

dystrofická simplex

junkční

Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál

a metody Biopsie kůže pacienta

provedena raznicí (punch biopsy) velikosti asi 4 mm

Vzorek ihned po dodání ve vlhké komůrce zmražen v propanu chlazeném tekutým dusíkem a uchován v suchém ledu v mrazničce

Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál

a metody Zhotoveny kryostatové řezy Metodou nepřímé IMF lze

prokázat antigenní komponenty v oblasti dermoepidermální junkce

Inkubace s normálním sérem Inkubace s primární neznačenou

Ab Inkubace se sekundární Ab

konjugovanou s fluoresceinem (FITC)

Hodnocení vždy s pozitivní a negativní kontrolou ve fluorescenčním mikroskopu, dokumentace každého případu

pacientkontroly

Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál

a metody Inkubace s normálním

sérem zvířete, ze kterého je získána sekundární značená protilátka

Například jestliže použijeme jako sekundární protilátku - koza anti králík IgG - FITC,

zvolíme normální kozí sérum k blokaci nespecifických vazeb

Inkubace probíhá 20 minut ve vlhké komořeAnti králík IgG

FITC

Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál

a metody

Inkubace s primární protilátkou ředěnou pufrem TRIS/HCl, pH 7,2 – 7,4

Použita myší, krysí a kozí primární protilátka

Čas a konkrétní ředění je uvedeno v tabulce

Při použití vlhké komory jsme inkubovali za pokojové teploty

Protilátka Protilátka anti-anti-

ImunizovaImunizované zvířené zvíře

Ředění Ředění protilátky - protilátky - μl/100μl μl/100μl TRIS/HClTRIS/HCl InkubaceInkubace

BPAg 1BPAg 1 kozakoza 5/1005/10017h, v ledničce 17h, v ledničce při 4°Cpři 4°C

BPAg 2BPAg 2 kozakoza 5/1005/10017h, v ledničce 17h, v ledničce při 4°Cpři 4°C

Cytokeratin Cytokeratin 55 myšmyš 1/1001/100

60min, vlhká 60min, vlhká komorakomora

Cytokeratin Cytokeratin 1414 myšmyš 3/1003/100

60min, vlhká 60min, vlhká komorakomora

Cytoretatin Cytoretatin 10 10 myšmyš 1/1001/100

40min, vlhká 40min, vlhká komorakomora

Integrin α6Integrin α6 krysakrysa 2/1002/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora

Integrin β4Integrin β4 myšmyš 2/1002/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora

Kolagen IVKolagen IV myšmyš 1/1001/10060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora

Kolagen VIIKolagen VII myšmyš 1/50,1/100,1/2001/50,1/100,1/20060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora

Laminin 5Laminin 5 myšmyš 3/1003/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora

PlectinPlectin kozakoza 1/1001/10060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora

Epidermolysis bullosa congenita

(EBC) – materiál a metody

Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál

a metody Inkubace se sekundární protilátkou

konjugovanou s FITC Pro krysí primární protilátku

používáme koza anti- krysa IgG-FITC Pro kozí primární protilátky

používáme osel anti-koza IgG-FITC Pro myší primární protilátky koza

anti-myš IgG-FITC Ředěno pufrem TRIS/HCl pH 7,2 – 7,4 Inkubace ve vlhké komoře za pokojové

teploty

Ig GFITC

Ig GFITC

Kozí primární protilátka

Krysí a myší

primární protilátka

Sekundární Sekundární protilátkaprotilátka

Ředění v µ/100µl pufru Ředění v µ/100µl pufru TRIS/HClTRIS/HCl Čas inkubace Čas inkubace

Koza anti-krysa Koza anti-krysa IgG FITCIgG FITC 2/1002/100

120 min, vlhká 120 min, vlhká komorakomora

Koza anti-myš IgG Koza anti-myš IgG FITCFITC 1/1001/100

40 min, vlhká 40 min, vlhká komorakomora

Osel anti-koza IgG Osel anti-koza IgG FITCFITC 4/1004/100

120 min, vlhká 120 min, vlhká komorakomora

Epidermolysis bullosa Epidermolysis bullosa congenita congenita

(EBC) – materiál a metody(EBC) – materiál a metody

Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál

a metody

Důkladný oplach destilovanou vodou

Zamontování do DAPI – fluorochrom, váže se na DNA, RNA

Hotové preparáty lze uchovávat v lednici, dle našich zkušeností i po měsíci lze ještě prohlížet

Jádra buněk označena DAPI

Lamina dnesa

Lamina lucida

Cytoskelet

Desmosom CK5,CK 14

BPAg1,Plectin

BPAg2, integriny

Laminin 5

Kolagen IV Kolagen VII

Hemidesmosom

Bazální keratinocyt

Kotvící destička

Epidermolysis bullosa congenita (EBC)

CK 5, CK 14 lLaminin 5

Kolagen VII

Procentní zastoupení tří skupin EBC

SEB 46%

JEB 10%

DEB 44%

Epidermolysis bullosa simplex

snížená nebo chybějící reakce s PL proti CK5 a CK14, mutace v genech pro CK5 nebo CK14

BPAg 1, BPAg 2, laminin 5, kolagen IV v bázi puchýře, nezměněné pozitivní reakce

drobné zbytky bazálních keratinocytů jsou prokazatelně i v bázi puchýře, lze dokázat protilátkami Anti-CK MNF 116 (obsahuje keratiny 5, 6, 8, 18) a Anti-CK HMW (high molecular weight, CK 1, 5, 10, 14)

Epidermolysis bullosa simplex

Pacient, CK 5, fragmentybazálních keratinocytů

Pozitivní kontrola,CK 5

Epidermolysis bullosa junkční

kolagen IV, kolagen VII v bázi puchýře, pozitivní nezměněná reakce

BPAg 1, CK 1, 5, 10, 14 nezměněná pozitivní reakce

reakce s lamininem 5 (GB3) je zeslabena nebo chybí úplně, mutace v genu pro laminin 5

BPAg 2 ve stropu puchýře

Epidermolysis bullosa junkční

Pozitivní kontrolaLaminin 5

Pacient, EBJ,Laminin 5 chybí

Epidermolysis bullosa junkční

Pacient, kolagen VII v bázi puchýřePacient, BPAg 2 ve stropu puchýře

Epidermolysis bullosa junkční

Pacient, kolagen IV v bázi puchýřePacient, junkční puchýř, BPAg1

Epidermolysis bullosa dystrofická

EBD - snížená nebo chybějící rekce s PL anti-kolagenVII, mutace v genu pro kolagen VII (COL7A1)

všechny Ag (antigeny) keratinocytů a Ag lamina lucida (laminin 5 (GB3), α6β4 integrin) pozitívní nezměněná reakce

Kolagen IV (lamina basalis), BPAg1, laminin 5 ve stropu puchýře

Epidermolysis bullosa dystrofická

Pozitivní kontrolaKolagen VII

Pacient EBD Chybí kolagen VII

Epidermolysis bullosa congenita (EBC)

Antigenní mapování slouží k navedení molekulárně-genetické laboratoře ve vyšetřování genetických změn a přesnější subtypizaci onemocnění

ZDROJE INFORMACÍ

Buček, J., Bučková, H., Epidermolysis bullosa congenita, IDVPZ, Brno, 2000

Internetové stránky organizace DEBRA www.debra-cz.org

Internetové stránky Univerzity Groningen, http://dissertations.ub.rug.nl/faculties/medicine/2006/a.m.g.pasmooij/

Weedon, D.: Skin Pathology. Churchill, Livingstone, Edinburgh, 1997, s. 17-28

J.D. Fine, L.T.: Smith,Nonmolecular Diagnostic Testing of Inherited Epidermolysis Bullosa. chapter 3, s.60-73

Děkujeme za pozornost