Analiza varijabilnosti: funkcionalna varijabilnost, varijabilnost...

Doc. dr Jevrosima Stevanović -----------------------------------------------------------------------------------------------------------

1

Analiza varijabilnosti: funkcionalna varijabilnost,

varijabilnost DNK Genetička varijabilnost Genetička varijabilnost (različitost) potiče iz dva osnovna procesa: mutacija i rekombinacija Mutacije su izvor genetičkih promena, stvaranja sasvim novih oblika genskih alela

(tipovi, mehanizmi nastanka i efekti mutacija obrađeni su u poglavlju 9. knjige „Principi genetike”).

Rekombinacije su procesi tokom kojih dolazi do stvaranja novih kombinacija

genskih alela. Drugim rečima, aleli (uključujući one novonastale procesom mutacija) se rekombinacijama preuređuju, čime se stvara ogroman broj mogućih genotipova. (poglavlje 6. knjige „Principi genetike“).

Obzirom da od genetičke varijabilnosti zavisi i fenotipska varijabilnost, jasno je da procesi mutacija i rekombinacija doprinose stvaranju velikog broja različitih fenotipova. Kada su u populaciji prisutne fenotipski različite jedinke, prirodna selekcija ima šta da odabere, pri čemu će favorizovati jedinke sa većom šansom za preživljavanje i boljim reproduktivnim sposobnostima, odnosno boljim sposobnostima za prilagođavanje ekološkim uslovima (adaptibilnije jedinke). Ukoliko je za opstanak pod promenjenim uslovima sredine „zaslužna” neka mutacija, onda se putem prirodne selekcije favorizuju mutacije koje su u skladu sa ekološkim uslovima (npr. mutacije koje obezbeđuju opstanak u zagađenoj životnoj sredini – čak i nakon ekoloških katastrofa, eksplozija nuklearnih elektrana). Procesi koji stoje u osnovi genetičke varijabilnosti omogućavaju da se kroz generacije menja genetička struktura populacije u skladu sa promenama uslova u životnoj sredini. Mutacije predstavljaju osnovni izvor genetičkih novina u populacijama i proces biološke evolucije nezamisliv je bez povremenih promena u nukleotidnim sekvencama ili nekih drugih genetskih rearanžmana, a kroz proces prirodne selekcije vrši se favorizovanje onih mutacija koje su u skladu sa ekološkim uslovima u određenom vremenskom periodu. Sa druge strane, mutacije su često uzrok anomalija, ali posledice mutacija nisu uvek očigledne, odnosno, fenotipski efekti mutacija se u mnogim slučajevima mogu detektovati samo delikatnim biohemijskim ili genetičkim analizama, a samo u nekim slučajevima mutacije dovode do velikih morfoloških promena i letalnih efekata. Nažalost, u stočarstvu, selekcija je jako dugo obavljana na osnovu fenotipa i primenom metoda selekcijskog ukrštanja. Ove procedure selekcije primenjivane su u velikom obimu bez detaljnog znanja o broju gena koji su uključeni u ekspresiju datih osobina, kao i bez ikakvog znanja o efektu tih gena na objektima selekcije i njihovom učešću u plejotropnom efektu ili vezanom delovanju na druge osobine. Primena ovakvog pristupa pokazala se


2

korisnom u velikoj meri u poboljšanju prosečne količine mleka po laktaciji kod mnogih populacija mlečnih krava. Međutim, pri korišćenju ovakvih odgajivačkih šema dešava se da najbolje rangirani bikovi, koji se dalje koriste u programima veštačkog osemenjavanja, budu nosioci mutiranih alela. Čak i kada su fenotipski normalni, bikovi koji u genotipu nose mutirane alele značajno doprinose širenju naslednih anomalija kod potomaka. Korišćenjem molekularno-genetičkih analiza moguće je identifikovati mutacije koje su uzrok anomalijama (koje se nekad manifestuju odmah po rođenju, a nekad kasnije tokom života, naročito ako su vezani za reprodukciju) i sprečiti dalekosežno širenje mutiranih alela. Nakon identifikacije lokusa koji su odgovorni za nasledne anomalije, dizajniraju se molekularni markeri za otkrivanje mutiranih alela čime je omogućeno da se nosioci tih alela isključe iz daljeg programa selekcije.

Analiza genetičke varijabilnosti Proučavanje fenotipskih razlika među jedinkama jedne populacije predstavlja jedan od najjednostavnijih načina analize genetičke varijabilnosti (raznovrsnosti). Pod fenotipskim razlikama podrazumevamo npr. razlike u građi tela, visini i težini, pigmentaciji kože (dlake, perja), krvnim grupama, ponašanju, dužini života, zdravstvenom stanju ali i razlike u tzv. proizvodnim osobinama gajenih životinja - dnevni prirast, plodnost, kvalitet trupa i ukus mesa, kvantitet trupa i prinos mesa, mlečnost, odnosno kvantitet i kvalitet mleka kod krava, produkcija jaja kod živine, mesnatost kod svinja itd. Fenotipska varijabilnost je veoma česta pojava u prirodi, ali najvažnije pitanje je koliko je za tu varijabilnost odgovorna nasledna osnova, a koliko faktori sredine (videti: Box 1). Prethodno navedene proizvodne osobine, odnosno ekonomski značajne osobine (economically relevant traits-ERT) su kompleksne, odnosno pod kontrolom velikog broja gena i pod uticajem faktora spoljašnje sredine. Kod goveda su to, na primer, osobine vezane za rast, unos hrane, mlečnost, karakteristike trupa (mesnatost, količina masti) i reprodukciju. Markeri koji su otkriveni za te osobine, vezani su za samo jedan gen od brojnih gena koji kontrolišu kompleksnu osobinu. Međutim, ekspresija ženjenog fenotipa (npr. povećana mlečnost, bolji kvalitet mleka i mesa) zavisi i od brojnih drugih “nemarkiranih” gena, ali i brojnih faktora sredine. Zbog toga je pri donošenju odluke o selekciji uvek neophodno uzeti u obzir očekivane razlike u potomstvu (Expected Progeny Differences-EPDs), čak i kada postoje podaci dobijeni primenom markera. Selekcija goveda u kojoj se koriste molekularni markeri je prihvaćena i preporučena kao dopuna tradicionalnim metodama selekcije. Najveća korist molekularnih markera u selekciji je pre svega kod osobina koje imaju jednostavan način nasleđivanja (boja krzna, genetičke anomalije), a zatim kod kompleksnih osobina kao što su: kvalitet trupa i ukus mesa, kvantitet trupa i prinos mesa, mlečnost, odnosno kvantitet i kvalitet mleka, fertilnost i reproduktivna efikasnost, sposobnost za materinstvo, unos hrane, ponašanje vezano za ishranu i prirast. Ipak, u svetu postoje standardizovani testovi za k-kazein, beta-laktoglobulin i alfa S1 kazein na osnovu kojih se može odrediti kvalitet mleka krave čiji je uzorak analiziran, ali i genotip za te osobine, što je značajno za procenu količine i kvaliteta mleka koji se može očekivati kod potomaka. Na primer, krave BB genotipa za k-kazein, proizvode veću količinu mleka sa većim sadržajem proteina nego krave AB ili AA genotipa. Osim toga, mleko krava BB genotipa je bolje za proizvodnju sira. Krave B genotipa za beta-laktoglobulin, glavnu komponentu surutke, proizvode mleko sa većim sadržajem masti i kazeina, komponenti koje su poželjne za


3

proizvodnju sira. Sa druge strane krave AA genotipa daju veće količine mleka. Alfa S1 kazein takođe utiče na prinos mleka. Krave BB genotipa za alfa S1 kazein daju više mleka nego krave ređe prisutnog BC genotipa. Genetičke analize navedenih parametara obavnjaju se iz korena dlake ili uzoraka krvi. Preciznost rezultata je 99%. Najznačajniji faktor koji je povezan sa praktično svim produktivnim, reproduktivnim, pa i imunim karakteristikama goveda jeste hormon leptin, proizvod leptin gena („gena za gojaznost”). Leptin sintetišu i luče uglavnom adipocite belog masnog tkiva. Leptin ima ulogu u regulisanju apetita, unosa hrane, telesne težine, telesnog sastava i potrošnje energije. Takođe utiče reprodukciju i neke funkcije imunog sistema. Koncentracija leptina u serumu povezana sa depoima masti u trupu i ekonomski značajnim karakteristikama goveđeg mesa. U cilju ispitivanjem molekularnih mehanizama koji stoje u osnovi uticaja leptina, najpre je mapiran gen za leptin na hromozomu 2, a zatim je utvrđeno da u kodirajućem regionu leptin gena postoji polimorfizam koji je značajan za koncentraciju leptina u serumu. Polimorfizam u kodirajućem regionu leptin gena ima veliki uticaj na ekonomski značajne karakteristike goveda: na unos hrane, na vrednosti trupa, odnosno utovljenost i kvalitet mesa, kvantitet i kvalitet mleka. Osim toga, postoje dokazi da polimorfizam u regulatornom regionu (promotoru) gena za leptin utiče na koncentraciju leptina u serumu, prirast, telesnu težinu, pokazatelje vrednosti trupa, unos hrane i ponašanje vezano za ishranu. Predloženi SNP markeri za navedene osobine su UASMS2 i UASMS3. Polimorfizam u promotoru leptin gena može uticati i na prinos i sastav mleka. SNP markeri UASMS1 i UASMS3 u promotoru leptin gena imaju signifikantan uticaj na prinos masti, ali za UASMS2 nije potvrđena signifikantna povezanost ni sa jednom osobinom vezanom za kvalitet mesa goveda. Međutim, definisani su molekularni SNP markeri unutar leptin gena za sledeće ekonomski značajne osobine goveda. To su dva SNP markera (E2JW, E2FB) značajna su za prinos i raspoređenost masti i za prinos posnog mesa i posredno za mekoću mesa. Sa druge strane, najnovija istraživanja otkrila su da SNP markeri UASMS2 i R25C imaju značajan uticaj na parametre porasta, telesne težine i leđne slanine. Navedeni markeri omogućavaju identifikaciju goveda koja imaju željenu genetsku predisponiranost u odnosu na navedene osobine Savremene analize su pokazale da je mnogo veći stepen genetičke varijabilnosti nego što bi se očekivalo na osnovu analize fenotipske varijabilnosti.


4

Metode analize genetičke varijabilnosti kvalitativnih osobina:

− MORFOMETRIJSKE METODE - analize morfoloških karakteristika, koje je moguće koristiti ukoliko se zna priroda genetičke determinacije posmatrane osobine;

− CITOGENETIČKE METODE – analize kariotipa (hromozoma), kojima se mogu otkriti promene u broju ili strukturi hromozoma kod jedinki ispitivane populacije;

Morfološki i hromozomski markeri obično pokazuju nizak nivo polimorfizma i stoga nisu posebno korisni kao genetički markeri. − BIOHEMIJSKE METODE - analize proteina, jer zbog kolinearnosti između gena i

proteina, promene nukleotidne sekvence DNK (tj. gena) mogu da dovedu do izmene primarne strukture kodiranog proteina.

Iako su proteinski polimorfizmi bili prvi markeri za genetička istraživanja (koji su se veoma dugo i obimno koristili u stočarstvu), analize proteina se danas smatraju prevaziđenom metodom zbog veoma niske rezolucije, odnosno zbog velikih ograničenja u ispitivanju genetičke varijabilnosti. Naime, analizom proteina mogu se detektovati samo neki genetički polimorfizmi i nivo polimorfizma koji se detektuje je najčešće nizak. Određivanje amino-kiselinske sekvence proteina je veoma zahtevno (vremenski i finansijski), tako da se najčešće analize proteina obavljaju gel-elektroforezom, koja se zasniva na tome da proteini imaju različitu elektropokretljivost (na gelu u rastvoru slabog elektrolita) ukoliko se razlikuju po sekvenci aminokiselina (drugim rečima, elektroforetska separacija proteina zasniva se na razlikama u električnom naboju ili razlikama u molekulskim masama kod različitih proteina). Međutim, čak i analiza amino-kiselinske sekvence ne može otkriti svaku promenu u genomu, jer postoje mutacije koje NE DOVODE do promene amino-kiselinske sekvence usled izrođenosti genetskog koda (tzv. tihe mutacije). Sa druge strane, elektroforetska analiza proteina ima još manju rezoluciju, jer ne može otkriti čak ni svaku promenu u sekvenci amino-kiselina, jer se neke zamene amino-kiselina ne odražavaju na elektroforetsku pokretljivost proteina (ukoliko se jedna amino-kiselina u proteinu zameni nekom hemijski bliskom amino-kiselinom).

Konačno, navedeni markeri odražavaju varijabilnost u sekvencama koje ih kodiraju, a koje predstavljaju manje od 10% ukupnog genoma.

− MOLEKULARNE METODE – predstavljaju metode izbora za analizu genetičke

varijabilnosti, obzirom da se njima otkrivaju razlike u samom molekulu DNK (tzv. DNK polimorfizmi koji podrazumevaju svaku razliku u nukleotidnoj sekvenci (unutar gena i/ili nekodirajućih regiona DNK). Markeri kojima se detektuju razlike na nivou DNK nazivaju se molekularni ili DNK markeri.


5

Molekularni markeri, sposobni da detektuju genetičke varijacije na nivou sekvenci DNK, ne samo da su prevazišli ograničenja prethodno korišćenih metoda (morfometrijske, citogenetičke, biohemijske), nego poseduju i jedinstvena genetička svojstva koja ih čine mnogo korisnijim od ostalih genetičkih markera. Oni su brojni i raspoređeni svuda po čitavom genomu. Nasleđuju se po tipičnom Mendelovom načinu nasleđivanja koji se obično ispoljava u ko-dominantnom obliku i često su multialelni tako da se u proseku heterozigotnost ostvaruje u više od 70%. Na njih ne utiču faktori spoljašnje sredine i generalno nemaju plejotropni efekat na lokuse za kvantitativne osobine (quantitative trait loci-QTL). Obzirom da genska ekspresija nije preduslov, korišćenjem molekularnih markera može se vizuelizovati praktično celokupan genom uključujući nekodirajuće regione. Osim znatno veće preciznosti, molekularni markeri nude i brojne metodološke prednosti:

- mogućnost korišćenja bilo kog uzorka koji sadrži DNK životinje (ne samo krv, nego i dlake, briseve bukalne ili vaginalne sluznice, mleko, sperma, arhivirani preparati);

- mogućnost retrospektivne analize u slučajevima kada životinje više nisu dostupne (iz

sačuvanih uzoraka tkiva ili sperme);

- uzorkovanje za DNK analize je neinvanzivno - uzorci DNK se mogu jako dugo čuvati u laboratoriji bez nekih posebnih uslova i lako

se mogu transportovati između laboratorija,

- analiza DNK može se obaviti u veoma ranima fazama života jedinke, odnosno čak i na stupnju embriona (prenatalna dijagnostika), nezavisno od pola,

- kada se jednom prenese na čvrstu podlogu, kao što su filter membrane, može se više

puta koristiti za hibridizaciju sa različitim probama, a mogu se koristiti heterologe probe i in vitro-sintetizovane oligonukleotidne probe,

- metode bazirane na PCR metodologiji mogu se automatizovati.

Postoje brojne mogućnosti primene molekularnih markera u programima poboljšanja stoke kako u konvencionalnim, tako i u transgenim strategijama gajenja. U programima poboljšanja putem konvencionalnih strategija gajenja, primena molekularnih markera može biti kratkoročna ili neposredna (za određivanje roditeljstva, procenu genetičke distance, determinaciju tipa blizanačke zigotije i frimartinizma, određivanja pola embriona pre implantacije, kao i za identifikaciju nosioca bolesti), ali i dugoročna (u postupcima mapiranja gena, kao i za selekciju u kojoj se koriste markeri, za koju se koristi termin: marker-assisted selection-MAS). Kod transgenog gajenja, molekularni markeri se mogu koristiti kao referentne tačke za identifikaciju, izolaciju i kloniranje relevantnih gena, manipulaciju tim genima i identifikaciju životinja koje nose transgene. Ovde je značajno napomenuti značaj molekularnih markera u identifikaciji genetički modifikovanih životinja (GMO) i proizvoda od GMO životinja. Osim toga, progres u razvoju molekularnih markera ukazuje na mogućnost njihove primene za genetičko poboljšanje gajenih vrsta životinja.


6

Najznačajnije molekularne metode koje se koriste za analizu genetičke i funkcionalne varijabilnosti

Postupak analize genetičke i funkcionalne varijabilnosti putem molekularnih markera počinje izolacijom (ekstrakcijom) i multiplikacijom (kloniranjem) DNK ili RNK iz bioloških uzoraka. Izolacija DNK iz ćelije podrazumeva oslobađanje DNK iz jedra (nuklearna DNK) ili organela (mitohondrijalna). Pri tome se koriste hemikalije kojima se razbijaju i liziraju: ćelijska membrana (animalnih ćelija), ćelijski zid (kod biljaka i gljiva) i membrane organela (mitohondrija i plastida). Nakon izolacije DNK (ili RNK) iz ćelije, sledeći korak je amplifikacija (kloniranje) željenog (ciljanog) gena ili fragmenta DNK, što se može obaviti in vivo i in vitro. U slučaju in vivo kloniranja željenog (ciljnog) fragmenta DNK, najpre se restrikcionim enzimima (videti Box 2) „iseče” ciljani deo DNK, a zatim taj deo ugradi u DNK vektora (plazmida ili virusa), odnosno stvori se rekombinantna DNK. Da bi ona mogla da se umnožava, neophodno je da se vektor ubaci u ćeliju domaćina (najčešće u bakteriju Escherichia coli). DNK vektora je u mnogim slučajevima cirkularna i dvolančana. Pri svakoj replikaciji DNK vektora, istovremeno se umnožava i ugrađeno parče DNK, odnosno replikuje se čitava rekombinantna DNK. Na ovaj način se još od 1982. godine proizvodi humani insulin u ćelijama bakterija – ubacivanjem dela humane DNK koji sadrži gen za insulin u vektor, a zatim u bakterije čijim umnožavanjem se obezbeđuje proizvodnja sintetskog humanog insulina. To je, inače, prvi lek dobijem primenom metoda genetičkog inžinjeringa. In vitro kloniranje željenog (ciljnog) fragmenta DNK obavlja se putem reakcije lančane polimerizacije, odnosno putem PCR amplifikacije – (Polymerase Chain Reaction – PCR) u aparatu koji ima mogućnost brze promene temperaturnih uslova. Tvorac ove tehnike Kary Mullis je za taj svoj izum dobio Nobelovu nagradu 1993. godine. Ključna komponenta u PCR procesu jeste DNA polimeraza izolovana iz bakterije Thermus aquaticus, koja je rezistentna na visoke temperature (živi i replicira se pri teperaturama do 95°C). Ta termostabilna polimeraza nazvana je Taq polimeraza (po bakteriji domaćinu) i koristi se za replikaciju in vitro čime se omogućava geometrijski porast broja kopija ciljane DNK. Za PCR amplifikaciju potrebne su sledeće komponente: izolovana DNK čiji određeni fragment želimo da amplifikujemo, prajmeri (oligonukleotidne sekvence) koji se dizajniraju tako da budu komplementarni

sekvencama koji okružuju ciljani region DNK (npr. gen) koji želimo da umnožimo, Taq polimeraza, slobodni nukleotidi, odnosno gradivne jedinice za sintezu novih lanaca DNK, u vidu

mešavine deoksiribonukleozid trifosfata (dNTP): adeninskih (dATP), timinskih (dTTP), guaninskih (dGTP) i citozinskih (dCTP),

Magnezijumovi joni (Mg2 +), PCR pufer, sterilna dejonizovana voda.


7

Proces PCR amplifikacije obuhvata sledeće korake: 1. Inicijalna denaturacija DNK u trajanju od dva do četiri minuta (zavisno od udela GC parova).

2. Denaturacija DNK – rasplitanje i razdvajanje lanaca DNK. Obavlja se na 94-96°C u trajanju od 30 sec do nekoliko minuta (zavisno od udela GC parova),

3. Hibridizacija para prajmera sa komplementarnim sekvencama koji okružuju ciljani region DNK. Obavlja se na temperaturi od 45-65°C u trajanju od 30 sekundi do nekoliko minuta,

4. Elongacija prajmera (ekstenzija), odnosno sinteza novih DNK lanaca počev od prajmera, tako što se Taq polimeraza vezuje za mesta hibridizacije prajmera i katalizuje ugrađivanje novih nukleotida komplementarih inicijalnim sekvencama. Ovaj proces se obavlja na 72°C i traje od 45 sec do 1 minuta.

Koraci od 2. do 4. ponavljaju se tokom 25 do 40 ciklusa, kako bi se obezbedilo umnožavanje dovoljnog broja kopija ciljnog fragmenta DNK. Umnoženi ciljni fragmenti DNK nazivaju se amplikoni ili PCR produkti. U svakom ciklusu količina amplikona se duplicira (u prvom ciklusu nastaju 2 aplikona, u drugom 4, u trećem 8, u četvrtom 16, u petom 32, u šestom 64 ...) tako da na kraju PCR procesa nastaje od milion do bilion amplikona. 5. Elongacija preostalih produkata (na 72 °C, u trajanju od dva do čeiti minuta). Po završetku PCR amplifikacije, neophodno je izvršiti vizuelizaciju PCR produkata. Dobijeni amplikoni razdvajaju se elektroforezom na gelu zbog toga što fragmenti DNK različite dužine imaju različitu elektropokretljivost, odnosno putuju različitom brzinom (na gelu u rastvoru slabog elektrolita) pod uticajem električnog polja. Zbog toga za isto vreme kraći fragmenti (koji se kreću brže) pređu duži put u odnosu na duže fragmente. Nakon završene elektroforeze gel se boji etidijum bromidom (koji se interkalira između lanaca DNK) koji fluorescira pod UV svetlošću, te se gel postavlja na UV transiluminator (vizuelizacija PCR produkata), što omogućava očitavanje rezultata. Postoje različite modifikacije PCR metode: Duplex PCR – je varijanta PCR metode u kojoj se, umesto jednog, koriste dva para prajmera, pri čemu oni prepoznaju različite fragmente DNK i omogućavaju diferencijalnu dijagnostiku) (Primer: razlikovanje vrsta Nosema apis i N. ceranae putem duplex PCR uz primenu species-specifičnih prajmera).


8

Multiplex PCR podrazumeva korišćenje većeg broja parova prajmera što omogućava istovremeno umnožavanje većeg broja različitih ciljnih fragmenata. Tako se kod amplifikacije seta mikrosatelita, koji omogućava testiranje roditeljstva, goveda koristi 11 parova prajmera za amplifikaciju 11 mikrosatelita (kod ljudi mnogo više, od 14 do preko 30). (Primer: testiranje očinstva kod goveda). Ovom metodom se takođe može istovremeno utvrditi prisustvo ili odsustvo više različitih genotipova.


9

Repetitivni PCR (rep-PCR) se može koristiti kod bakterija kada u njihovoj DNK postoje kratke repetitivne sekvence (fragmenti DNK koji se ponavljaju više puta), a između njih su umetnute jedinstvene sekvence (koje se samo jednom javljaju u genomu). Na osnovu toga osmišljena je metoda rep-PCR u kojoj se amplifikuju te jedinstvene sekvence DNK (međusobno različite po dužini), tako da se nakon elektroforeze PCR produkata dobija niz traka različite dužine („kao lestvica“), čiji je raspored jedinstven za svaki soj bakterija i naziva se fingerprint, te se zato ova metoda koristi za diferencijaciju različitih sojeva iste vrste bakterija (Primer: genotipozacija Paenibacillus larvae).

ER

IC I

ER

IC II

IE

RIC

IV

ERIC II

500

1000

1500

30002000

ER

IC I

ER

IC II

IE

RIC

IV

ERIC II

500

1000

1500

30002000

500

1000

1500

30002000


10

Real-time PCR (RT-PCR) - Real-time PCR se razlikuje od tradicionalne PCR metode po tome što se uzorci obeleže fluorescentnim markerom, a RT-PCR aparat ima detektor fluorescencije i zahvaljujući tome RT-PCR omogućava kvantifikaciju umnoženog segmenta DNK, a time i zastupljenost u uzorku, kao i detekciju PCR produkta i praćenje kinetike reakcije od samog početka reakcije, odnosno u svakom momentu dok traje reakcija. Ovo su velike prednosti u odnosu na tradicionalni PCR koji je samo kvalitativna metoda bez mogućnosti kvantifikacije PCR produkta i kod koga je postupak mnogo duži jer je potrebno da se ceo postupak završi, pa tek onda očitaju rezultati (najpre je neophodno sačekati da se kompletno završi amplifikacija, pa obaviti eketroforezu PCR produkti, obojiti gel etidijum bromidom i vizuelizovati PCR produkte na transiluminatoru).

Zahvaljujući opisanim karakteristikama RT-PCR pruža mogućnost primene u proceni efikasnosti terapije lekovima, u merenju stepena oštećenja DNK, u kvantifikaciji genske ekspresije, detekciji patogena, genotipovanju, analizi SNPs, kontroli kvaliteta i validaciji testova.

Sekvencioniranje – određivanje redosleda nukleotida. Bazira se na dideoksi metodi u kojoj se pri in vitro sintezi DNK pored normalnih gradivnih jedinica (dNTP), dodaju i dideoksinukleotidi (ddNTP) koji u pentoznom šećeru nemaju OH grupe na pozicijama 2' i 3', te kada se oni ugrade u polinukleotidni lanac na tom mestu se dalja sinteza zaustavlja (jer nema slobodne OH grupe na poziciji 3' za koju bi sledeći nukleotid trebao da se veže). Zato se ova metoda naziva i „metoda prekida lanca“. Dideoksinukleotidi su obeleženi fluorescentnim markerom koji je različite boje za svaki od četiri tipa dideoksinukleotida. Svaki ddNTP fluorescira različitom bojom kada ga osvetli laserski zrak: adeninski (ddATP) zeleno, guaninski (ddGTP) žuto, citozinski (ddCTP) plavo, timinski (ddTTP) crveno, što se automatski zabeleži putem skenera (npr. svaki put kada se regustruje crvena boja – automatski skener registruje da taj nukleotid nosi timin). Obeležavanje ddNTP različitim fluorescentnim bojama omogućava da se koristi samo jedna reakciona smeša i razdvajanje (čitanje rezultata) obavlja na jednom gelu. Čitav proces se odvija u sekvencioneru, aparatu koji sve radi automatski od unošenja uzoraka do čitanja rezultata sa gela.

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAsequencing.html

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAsequencing.html�


11

Molekularni (DNK) markeri

za procenu genetičkog diverziteta 1. NUKLEARNI DNK MARKERI Brojni markeri su danas dostupni za detekciju polimorfizama nuklearne DNK. U proučavanju genetičkog diverziteta i za potrebe genetičke karakterizacije životinja, najčešće korišćeni markeri su mikrosateliti. MIKROSATELITI su specifične sekvence DNK koje se sastoje od kratkih jedinica DNK (tzv. ponovaka) koje se više puta ponavljaju u tandemu - (Short Tandem Repeat - STR loci). Veličina jedinice (ponovka) je od 2 do 6 baznih parova. Najčešći ponovak je CA. Mikrosateliti su hipervarijabilni, često imaju desetine alela po lokusu, pri čemu se različiti aleli razlikuju po broju ponovaka. Raspoređeni su duž čitavog genoma. Na primer, određeni mikrosatelit može obuhvatati 10 ponovljenih jedinica CA (CACACACACACACACACACA). Tokom evolucije, neka mutacija na DNK može dovesti do toga da neke jedinke imaju alel od 8 jedinica CA, dok druge mogu imati alel od 6 ili 12 tih jedinica na istom lokusu. Pošto su mikrosateliti relativno kratke sekvence, lako se amplifikuju putem PCR metode iz prethodno izolovane DNK. Vizuelizacija polimorfizama nakon amplifikacije obavlja se na gelu, a dostupnost automatizovanih sekvencera omogućava detaljnu i preciznu analizu velikog broja uzoraka u isto vreme. Zbog visoke stope mutacije i kodominantne prirode, mikrosateliti su najadekvatniji markeri za:

- proučavanje diverziteta (procenu unutar-rasnog i međurasnog genetičkog diverziteta, kao i procenu mešanja među rasama čak i kada su one blisko srodne);

- analize roditeljstva (najčešće očinstva), kontrolu pedigrea, odnosno individualnu identifikaciju;

- mapiranje lokusa za kvantitativne osobine (Quantitative Trait Loci – QTL). Prosečan broj alela (number of alleles – MNA) po populaciji, uočena (zabeležena) i očekivana heterozigotnost (Ho i He) su parametri koji se najčešće koriste za procenu unutar-rasnog diverziteta. Najjednostavniji parametri za procenu genetičke različitosti između rasa su genetička diferencijacija ili fiksacioni indeksi. Postoji nekoliko načina procene, ali najčešće se koristi FST koji predstavlja meru stepena genetičke diferencijacije subpopulacija putem proračuna standardnih varijansi alelskih frekvenci među populacijama. Organizacija za hranu i poljoprivredu pri Ujedinjenim nacijama (Food and Agriculture Organization of the United Nations - FAO) zvanično preporučuje panele mikrosatelita koje treba koristiti za procenu diverziteta glavnih vrsta domaćih životinja, na osnovu odluke i odobrenja Međunarodnog društva za animalnu genetiku (International Society for Animal Genetics-ISAG) http://www.fao.org/dad-is/ U tabelama ispod su rezultati ispitivanja informativnosti ISAG markera i mogućnosti njihovog korišćenja u verifikaciji roditeljstva YU šarenog govečeta u tipu simentalca.

http://www.fao.org/dad-is/�


12


13

Analiza roditeljstva sastoji se u poređenju DNK profila jedinke (potomka) sa DNK profilima jedinki za koje se ispituje da li su roditelji te jedinke (potencijalnih roditelja). Pozitivan rezultat, odnosno potvrda roditeljstva, dobija se ukoliko za svaki analizirani lokus postoji poklapanje makar jednog alela između potomka i potencijalnog roditelja (tabela ispod).

Mikrosatelit

Bik (otac)

ID 780 392 1516

Tele (sin)

ID 713 295 1116

Tele (sin)

ID 717 278 8208

Tele (sin)

ID 714 558 1406

TGLA227 89 79/89 89/91 89/97 BM2113 131/133 131/135 127/131 133 TGLA53 168 154/168 164/168 168/184 ETH10 217/219 217 217/221 213/219 SPS115 248/256 248/260 248 235/256 TGLA126 115/117 115/123 113/117 115 TGLA122 151/153 147/151 141/151 153 INRA23 208 208/218 208/222 208/214 ETH3 117/125 125 117 89/117 ETH225 150/142 148/150 150 136/142 BM1824 182/188 178/188 180/182 182 Poslednjih godina „konkurenti” mikrosatelita su POLIMORFIZMI POJEDINAČNIH NUKLEOTIDA (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs), kojima se detektuju razlike u pojedinačnim nukleotidima u sekvenci DNK među jedinkama iste vrste. MINISATELITI imaju iste karakteristike kao mikrosateliti, samo što su jedinice (ponovci) duže – od 10 do nekoliko stotina baznih parova. Mikro i minisateliti su takođe poznati i pod nazivom „polimorfizmi u broju tandemskih ponovaka (Variable Number of Tandem Repeats – VNTRs). POLIMORFIZMI POJEDINAČNIH NUKLEOTIDA (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) Polimorfizmi pojedinačnih nukleotida (SNPs) koriste se kao alternativa za mikrosatelite u proučavanju genetičkog diverziteta. Postoji nekoliko načina detekcije ovih polimorfizama (npr. sekvencioniranjem ili putem RFLP, ukoliko je SNP unutar sekvence koju prepoznaje neki restrikcioni enzim). SNPs su kandidati za buduća istraživanja genetičkog diverziteta jer se mogu lako koristiti kako u proceni funkcionalne, tako i neutralne varijabilnosti.


14

POLIMORFIZAM U DUŽINI RESTRIKCIONIH FRAGMENATA

(Restriction Fragment Lenght Polymorphism – RFLP)

Polimorfizam u dužini restrikcionih fragmenata se detektuje nakon tretiranja PCR produkata restrikcionim enzimima (koji seku DNK na tačno određenim „restrikcionim mestima” unutar specifičnih nukleotidnih sekvenci). Na taj način se otkrivaju aleli koji se međusobno razlikuju po prisustvu, odnosno odsustvu restrikcionih mesta.

Nakon tretmana restrikcionim enzimima (digestije), dobijeni fragmenti se analiziraju putem elektroforeze. U zavisnosti od prisutva (broja i položaja) restrikcionih mesta u analiziranom fragmentu, na gelu dobijamo DNK fragmente različite dužine (različite RFLP-profile). Ukoliko je u amplikonu postojalo jedno restrikciono mesto, na gelu će se videti dve trake, ukoliko je sečenje obavljeno na dva mesta, pojaviće se tri trake. Ukoliko nije bilo restrikcionih mesta, amplikon će ostati ceo (jedna traka). Ukoliko se dve vrste razlikuju po prisustvu ili po broju i položaju restrikcionih mesta za neki enzim, poređenjem dva ili više profila (nakon digestije istim enzimom) možemo utvrditi da li je reč o istim ili različitim vrstama. Ukoliko kod različitih vrsta isti DNK fragment ima restrikciona mesta za različite enzime, onda se uzorci tretiraju svim dijagnostičkim enzimima (istovremeno), pa se na osnovu dobijenog profila na gelu utvrđuje kojoj vrsti propada svaki od uzoraka (primer: razlikovanje vrsta Nosema apis i N. ceranae putem PCR-RFLP – slika levo i dve slike dole).


15

Putem RFLP tehnike se mogu otkriti i jedinke nosioci mutiranih alela, čak i kada je uzrok zamena samo jednog nukleotida (Single Nucleotide Polymorphism - SNP), ukoliko je ta promena nastala unutar sekvence DNK koja kod zdravih jedinki poseduje restrikciono mesto.


16

• Primer kada zamena samo jednog nukleotida (SNP) unutar gena nuklearne DNK dovodi do polimorfizma u dužini restrikcionih fragmenata (RFLP).

Kod oboljenja pod nazivom „anemija srpastih ćelija“, zdrave jedinke imaju makar na jednom hromozomu normalni alel za glutaminsku kiselinu na šestom mestu beta lanca hemoglobina (normalni betaA lanac), dok su obolele jedinke homozigoti za mutirani alel i i sintetišu valin (imaju izmenjeni betaS lanac). Mutaciju je izazvala zamena samo jednog A nukleotida sa T nukleotidom, jer je time promenjeno značenje šifre GAG (koja kodira glumatinsku kiselinu) u GTG koja kodira valin), ali istovremeno je nestalo restrikciono mesto koje postoji samo kod normalnog alela.

Kada je DNK fragment zdrave jedinke (koja nosi normalni alel (betaA) na makar jednom hromozomu), tretira restrikcionim enzimom, nakon elektroforeze se će dobiti obavezno kraća traka (na slici obeležena kao beta-A), jer je u normalnom alelu prisutno restrikciono mesto koje seče odeđeni restrikcioni enzim (videti crvene strelice desno od slike gela). Međutim, kod obolelih jedinki na oba hromozoma je mutirani alel (betaS) i u njemu ne postoji restrikciono mesto, te primenjeni restrikcioni enzim ne nailazi na mesto sečenja i tretirani DNK fragmenti tih jedinki ostaju neiseceni, pa se na gelu vidi samo duža traka (na slici obeležena kao beta-S).

Rodoslovno stablo pokazuje situaciju u porodici gde su heterozigotni roditelji (nosioci jednog betaA i jednog betaS alela) imali prvog sina bolesnog (homozigota za betaS alel), drugo dete je bila heterozigotna ćerka i treće dete normalna homozigotna ćerka (homozigot za betaA alel).

Opisana metoda omogućava prenatalnu dijagnostiku iz uzorka amnionske tečnosti ili horionskih čupica u slučajevima kada su oba roditelja heterozigotna jer je šansa 25% da će dobiti obolelo dete (homozigot za betaS alel), sa teškom, često smrtonosnom, anemijom srpastih ćelija.


17

1. MITOHONDRIJALNI DNK MARKERI Mitohondrijalni DNK (mtDNK) polimorfizmi se veoma široko koriste u analizama filogenije i genetičkog diverziteta. Kod životinja, mtDNK je mali (15-20 kb) cirkularni molekul, koji sadrži oko 37 gena i svi su neophodni za normalno funkcionisanje mitohondrija. Mitohondrijalni genom je uređen veoma efikasno – ne poseduje introne i ima male intergenske spejsere.

Kao molekularni marker, mtDNK ima puno prednosti. MtDNK evoluira brže od nuklearne DNK, verovatno zbog smanjene vernosti replikacije i/ili nedovoljno efikasne reparacije mtDNK. Različiti regioni mitohondrijalnog genoma evoluiraju različitim tempom (brzinom).

Haploidna mtDNK koju sadrže mitohondrije u citoplazmi ćelije ima maternalni oblih nasleđivanja kod većine vrsta (potomak nasleđuje mtDNK isključivo od majke, nikad od oca), ima visoku stopu mutacija i ne podleže rekombinacijama. Ove osobine mtDNK omogućavaju biolozima da rekonstruišu evolucione veze između i unutar vrsta proučavanjem mutacija u mtDNK. Takođe, mtDNK markeri mogu da obezbede brzi način otkrivanja hibridizacije između vrsta ili podvrsta domaćih životinja.

Polimorfizmi u sekvenci hipervarijabilnog regiona D-petlje ili kontrolnog regiona mtDNK značajno su doprineli identifikaciji divljih predaka domestifikovanih vrsta životinja, utvrđivanje geografskih modela genetičkog diverziteta i razumevanje domestifikacije domaćih životinja. Polimorfizmi mtDNK mogu se otkriti ili sekvencioniranjem ili putem RFLP (bez obzira da li se radi o SNPs ili nekim većim razlikama). • Primer: Otkrivanje polimorfizama u COI-COII regionu mtDNK kod

A. mellifera putem sekvencioniranja Tabela ispod: SPSs u COI-COII regionu mtDNK A. mellifera na osnovu kojih se utvrđuje varijabilnost unutar A. mellifera C filogenetske loze (svaki novootkriveni SNP ukazuje na novi haplotip)

Prve analize pokazale su da pčele iz Srbije, BIH i Makedonije dele isti haplotip (C2D) sa pčelama iz Grčke.


18

Kasnijim analizama uzoraka za većeg broja lokaliteta u Srbiji je utvrđena je mnogo veća varijabilnost u COI-COII regionu mtDNK A. mellifera (tabela ispod), odnosno ukupno 7 haplotipova: C1a, C2c, C2d, C2e, C2i (ranije otkrivenih u drugim zemljama) i dva nova haplotipa, C2o i C2p - na osnovu dva novootkrivena polimorfna mesta (jedne transverzije i jedna tranzicije). Table 1. Number of analyzed colonies (n), haplotype frequency and diversity (D) in the honey bee colonies from Serbia and the reference populations. Population n C1a C2c C2d C2e C2i C2o C2p D Banat (Serbia) 13 0.615 0.231 0.077 0.077 0.556 Syenichko-Peshterski (Serbia) 10 0.400 0.400 0.200 0.640 Timok (Serbia) 6 0.167 0.167 0.500 0.167 0.667 South-East (Serbia) 8 0.750 0.250 0.375 A. m. ligustica (Italy) 5 1.000 0.000 A. m. carnica (Croatia, Bosnia-Herzegovina)

10

0.100

0.100

0.500

0.300 0.640

A. m. macedonica (Republic of Macedonia, Albania)

9

0.778

0.222 0.346

• Sekvenca COI-COII regiona mtDNK A. mellifera otkriven u cilju

otkrivanja polimorfizama – slika ispod (SNPs su obeleženi brojevima od 1 do 8).


19

Poređenje sekvence COI-COII regiona mtDNA dva haplotipa A. mellifera – slika ispod (SNPs su obeleženi brojevima od 1 do 8)

1 1 GTATTTTTAAACTTTTATTAAAATTTCCC-ACTTAATTCATATTAATTTAAAAATAAATT 59 2 GTATTTTTAAACTTTTATTAAAATTTCCC-ACTTAATTCATATTAATTTAAAAATAAATT 59 ***************************** ****************************** 2 3 1 AATAACAATTTTTAATAAAATAAATAATTAATTTTATTTTTATATTGAATTTTAAATTCA 119 2 AATAACAATTTTTAATAAAATAAATAATTAATTTTATTTTTATATTGAATTTTAAATTCA 119 ************************************************************ 1 ATCTTAAAGATTTAATCTTTTTATTAAAATTAATAAATTAATATAAAATAAAACAAAATA 179 2 ATCTTAAAGATTTAATCTTTTTATTAAAATTAATAAATTAATATAAAATAAAACAAAATA 179 ************************************************************ 4*5* 6 1 TAACAGAATATATTTATTAAAATTTAATTTATTAAAATTTCCACATGATTCATATTTATA 239 2 TAACAGAATATATTTATAATAATTTAATTTATTAAAATTTCCACATGATTCATATTTATA 229 ***************** * ****************************** ********* 1 TTTCAAGAATCAAATTCATATTATGCTGATAATTTAATTTCATTTCATAATATAGTTATA 299 2 TTTCAAGAATCAAATTCATATTATGCTGATAATTTAATTTCATTTCATAATATAGTTATA 399 ************************************************************ 7* 1 ATAATTATTATTATAATTTCAACATTAACTGTATATATTATTTTAGATTTATTTATAAAC 359 2 ATAATTATTATTATAATTTCAACATTAACTGTATATATTATTTTAGATTT-TTTATAAAC 358 ************************************************** ********* 8 1 AAATTTTCAAATTTATTTTTATTAAAAAATCATAATATTGAAATTATTTGAACAATTATT 419 2 AAATTTTCAAATTTATTTTTATTAAAAAATCATAATATTGAAATTATTTGAACAATTATT 418 ***** ******************************************************


20

• Primer: polimorfizam u COI genskom segmentu mtDNK kod A. mellifera koji se može detektovati putem RFLP uz korišćenje restrikcionih enzima NcoI i StyI, čime je omogućeno razlikovanje podvrsta A. mellifera koje dele isti (C2D) haplotip (tabela ispod).


21

Box 1.

Razlike u fenotipskoj ekspresiji genotipova – knjiga 28. str Razlike u fenotipskoj ekspresiji genotipova postoje zbog interakcije gena sa sredinom (pod sredinom se podrazumeva kako unutrašnje okruženje u kome se ćelije nalaze, tako i uticaji spoljašnje sredine u kojoj se organizam razvija). Znači, sredina može tokom individualnog razvoja da utiče na stepen ispoljavanja gena. Zbog toga određeni genotip ne mora uvek da se ispolji kod svih jedinki koje su njegovi nosioci. Učestalost ispoljavanja datog gena u populaciji naziva se penetrabilnost. Penetrabilnost zavisi kako od genotipa (prisustvo epistaze ili nekog drugog tipa interakcije), tako i od sredine. Ukoliko se kod klasičnog dominanto-recesivnog tipa naspeđivanja recesivni fenotip ispolji kod svih recesivnih homozigota, a dominantan kod svih dominantnih homozigota i heterozigota, kažemo da je penetrabilnost potpuna (100%) – npr. kod osobina graška koje je Mendel ispitivao i kod ABO sistema krvnih grupa. Međutim, ukoliko manje od 100% jedinki ispolji očekivani fenotip, penetrabilnost je nepotpuna. Kod čoveka gen za brahidaktiliju (kratki prsti) ima penetrabilnost od 50-80%. Smatra se da i mnogi geni koji dovode do predispozicije za nastanak malignih bolesti ispoljavaju nepotpunu penetrabilnost. Pored razlika u ispoljavanju gena na nivou populacije, geni mogu imaju različit stepen ispoljenosti kod jedinke. Ekpresivnost predstavlja stepen do kojeg se penetrabilan gen ili genotip fenotipski ispoljava kod jedinke. Kao i penetrabilnost, ekspresivnost zavisi kako od sredine, tako i od genotipa (tj. genskih interakcija). Kod nasleđivanja prošaranosti dlake nekih rasa domaćeg psa postoji razlika u ekspresivnosti Sp genskog alela, te se uočava gradacija od desetak različitih fenotipova. Konačno, neki geni pokazuju nepotpunu penetrabilnost i varijabilnu ekspresivnost, što umnogome otežava interpretaciju rezultata različitih ukrštanja, kao i analize rodoslovnih stabala. Pod uticajem sredine se ponekad javljaju nenasledne promene fenotipa (fenokopije) koje su jako slične ili identične fenotipovima nastalim usled mutacije gena (iako imaju normalnu genetičku konstituciju, jedinke sa fenokopijom ispoljavaju mutantan fenotip). Fenokopije mogu da nastanu pod uticajem različitih hemijskih agenasa tokom ranog razvića. primer: Katarakta, gluvoća i malformacije srca mogu da budu posledica recesivno homozigotnog stanja određenih gena, ali mogu da se jave i kod osoba normalnog fenotipa ukoliko su njihove majke bile inficirane virusom rubeole tokom prvih nekoliko nedelja trudnoće. primer: Nemogućnost razvoja dugih kostiju ekstremiteta može biti posledica retke dominantne mutacije sa varijabilnom ekspresivnošću, ali može biti izazvana i primenom sedativa talidomida tokom graviditeta. Brojni su uticaji sredine koji menjaju vreme ili stepen ispoljavanja gena. Na stepen ispoljenosti gena utiču: hemijski agensi, hormonski status (različito ispoljavanje kod mužjaka i


22

ženki), period života u kome se gen ispoljava, različiti fizički faktori – npr. temperatura utiče na obojenost dlake kod kunića i sijamskih mačaka). Relativan doprinos genetičke konstitucije i činilaca sredine na razviće određenog fenotipa može dosta da varira zavisno od broja gena uključenih u determinaciju date osobine, kao i od toga u kojoj je meri ispoljavanje osobine pod uticajem spoljašnje sredine. Na visinu, pored većeg broja gena, utiču i brojni spoljašnji faktori (ishrana, fizička aktivnost, zdravstvena zaštita). Zato je za poslednjih 100 godina u razvijenim zemljama povećana prosečna visina ljudi zbog bolje ishrane, sporta i brige o zdravlju. U ovom slučaju, geni daju potencijal za razviće fenotipa u određenim granicama. Raspon mogućih fenotipova koji mogu nastati od jednog istog genotipa pod različitim uslovima sredine naziva se norma reakcije. Za neke genotipove norma reakcije je mala i oni će dati gotovo iste fenotipove u veoma različitim uslovima sredine. Nasuprot tome, neki genotipovi imaju veliku normu reakcije, tako da isti genotip daje niz različitih fenotipova u različitim uslovima sredine. Pored norme reakcije, treba razlikovati fenotipsku plastičnost kao stepen ispoljavanja osobine pod dejstvom faktora spoljašnje sredine. Plejotropnost gena Poligeno nasleđivanje


23

Box 2. Restrikcioni enzimi (endonukleaze) prepoznaju tzv. specifične nukleotidne sekvence (tzv. palindromske sekvence) i seku ih na tačno određenim „restrikcionim mestima”. Naime, za svaki restrikcioni enzim postoji specifična sekvenca koju samo on prepoznaje i seče je na specifičan način. (Mesta sečenja nekih restrikcionih enzima prikazana su na slici dole). Za potrebe sekvencioniranja DNK, neophodno je prethodno iseci DNK u manje fragmente i za tu svrhu se koriste restrikcioni enzimi.

Neki restrikcioni enzimi (kao npr. HaeIII i AluI) seku DNK ravno tako da nastaju fragmenti sa ravnim krajevima. Ako se specifična sekvenca koju prepoznaje i seče npr. enzim HaeIII nalazi na 11 mesta duž cirkularne DNK virusa, nastaće 11 fragmenata različiti po dužini i sekvencama nukleotida. Nastali fragmenti se mogu odvojiti jedan od drugog elektroforezom, a zatim odrediti redosled nukleotida u njima postupkom sekvencioniranja .

Međutim, mnogi restrikcioni enzimi (BamHI, HindIII, Eco RI) seku DNK neravno tako da nastaju fragmenti sa “lepljivim” jednolančanim krajevima. Ukoliko se DNK poreklom iz dva različita izvora tretiraju istim restrikcionim enzimom, nastaće fragmenti sa istim lepljivim krajevima, te ukoliko se dobijeni fragmenti pomešaju, dolazi do njihovog povezivanja, odnosno spajanja njihovih lepljivih krajeva po principu komplementarnosti baza. Konačno, dodaje se DNK ligaza koja spaja mesta prekida kovalentnim vezama (formira kovalentne veze unutar svakog lanca i kao rezultat nastaje “rekombinantna” DNK (rDNA).

Stvaranje rekombinante DNK je revolucionarno otkriće, ne samo zbog toga što je usavršilo genetička istraživanja, nego i zbog velike mogućnosti primene u biotehnologiji i medicini. Humani insulin (za dijabetičare), humani faktor VIII (za hemofiličare) i drugi preparati danas se komercijalno proizvode zahvaljujuću otkriću načina stvaranja rekombinantne DNK.

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/�


24

REFERENCE ISTRAŽIVAČA SA KATEDRE ZA BIOLOGIJU KORIŠĆENE ZA PISANJE OVE SKRIPTE:

1. Muñoz Irene, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, De la Rúa Pilar (2012) Genetic variation of Apis mellifera from Serbia inferred from mitochondrial analysis. Journal of Apicultural Science 56 (1) 59-69.

2. Vucicevic M, Stevanov-Pavlovic Marija, Stevanovic Jevrosima, Bosnjak Jasna, Gajic

B, Aleksic Nevenka, Stanimirovic Z (2012) Sex determination in 58 bird species and evaluation of CHD gene as a universal molecular marker in bird sexing, Zoo Biology, DOI: 10.1002/zoo.21010

3. Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Genersch Elke, Kovacevic R Sanja,

Ljubenkovic J, Radakovic Milena, Aleksic Nevenka (2011) Dominance of Nosema ceranae in honey bees in the Balkan countries in the absence of symptoms of colony collapse disorder. Apidologie 41 (1) 49-58.

4. Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Radakovic Milena, Kovacevic R Sanja (2010)

Biogeographic study of the honey bee (Apis mellifera L.) from Serbia, Bosnia and Herzegovina and Republic of Macedonia based on mitochondrial DNA analyses. Russian Journal of Genetics 46 (5) 603-609.

5. Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Dimitrijevic V, Maletic M (2010) Evaluation of

11 microsatellite loci for their use in paternity testing in the Yugoslav Pied cattle (YU Simmental cattle). Czech Journal of Animal Science 55 (6) 221-226.

6. Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Dimitrijevic V, Stojic V, Fratric N, Lazarevic M

(2009) Microsatellite DNA polymorphism and its usefulness for pedigree verification in Simmental cattle from Serbia. Acta Veterinaria 59 (5-6) 621-631.

7. Forsgren E, Stevanovic Jevrosima, Fries I (2008) Variability in germination and in

temperature and storage resistance among Paenibacillus larvae genotype. Veterinary Microbiology 129 (3-4) 342-349.

8. Kozmus P, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Stojic V, Kulisic Z, Meglic V

(2007) Analysis of mitochondrial DNA in honey bees (Apis mellifera) from Serbia. Acta Veterinaria 57 (5-6) 465-476.

RADOVI SA SKUPOVA

1. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z (2010) Specijska identifikacija mikrosporidija Nosema apis/N. ceranae korišćenjem molekularnih metoda dupleks PCR i PCR-RFLP. Zbornik radova XI Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2010, Jun 18-20, pp 45-47, Subotica, Srbija.

2. Vučićević M, Stevanov-Pavlović Marija, Bošnjak Jasna, Stevanović Jevrosima,

Stanimirović Z (2010) Determinacija pola ptica primenom molekularnih markera. Zbornik radova XI Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2010, Jun 18-20, pp 53-54, Subotica, Srbija.

http://versita.metapress.com/content/7573k18202328075/�http://versita.metapress.com/content/7573k18202328075/�http://versita.metapress.com/content/7573k18202328075/�http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/zoo.21010/abstract�http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/zoo.21010/abstract�http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/zoo.21010/abstract�http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/zoo.21010/abstract�http://www.springerlink.com/content/2446182622672332/fulltext.pdf�http://www.springerlink.com/content/2446182622672332/fulltext.pdf�http://www.springerlink.com/content/2446182622672332/fulltext.pdf�http://www.springerlink.com/content/2446182622672332/fulltext.pdf�http://www.springerlink.com/content/h4311415835x7276/�http://www.springerlink.com/content/h4311415835x7276/�http://www.springerlink.com/content/h4311415835x7276/�http://www.springerlink.com/content/h4311415835x7276/�http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/22005.pdf�http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/22005.pdf�http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/22005.pdf�http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2009/0567-83150906621S.pdf�http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2009/0567-83150906621S.pdf�http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2009/0567-83150906621S.pdf�http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113507006153�http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113507006153�http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113507006153�http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2007/0567-83150706465K.pdf�http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2007/0567-83150706465K.pdf�http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2007/0567-83150706465K.pdf�


25

3. Maletić M, Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z (2010) Polimorfizam laktoferin i

β4defensin gena i njihov značaj u otpornosti krava na mastitis. Zbornik radova XI Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2010, Jun 18-20, pp 55-56, Subotica, Srbija.

4. Muñoz Irene, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, de la Rúa Pilar (2010) Molecular

analysis discriminated among Serbian ecotypes of Apis mellifera carnica. Proceedings of the 4th European Conference of Apidology EurBee 2010. Sept 7-9, pp 132, Metu-Ankara, Turkey.

5. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Radaković Milena, Đelić N (2009) Utvrđivanje

roditeljstva i pola goveda iz uzoraka biološkog materijala primenom molekulskih markera, Zbornik predavanja sa XXX Seminara za inovacije znanja veterinara, Feb 13, pp 47-53, Beograd, Srbija.

6. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Radaković M (2009) Investigations of genetic

diversity of Paenibacillus larvae from Serbia using rep-PCR fingerprint technique, Book of Abstracts, IV Congress of the Serbian Genetic Society, June 1-5, pp 141, Tara, Serbia.

7. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Đelić N, Radaković M (2009) Parentage

verification and sex determination in cattle using molecular markers, Book of Abstracts, IV Congress of the Serbian Genetic Society, June 1-5, pp 156, Tara, Serbia.

8. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Radaković M (2009) Species identification of

Nosema microsporidian pathogen in samples of Apis mellifera from Serbia using PCR-RFLP method, Book of Abstracts, IV Congress of the Serbian Genetic Society, June 1-5, pp 171, Tara, Serbia.

9. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Radaković Milena, Maletić M, Đelić Н (2009)

Molekularno genetička identifikacija roditeljstva u analizi pedigrea životinja. Zbornik radova XI Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2009, Jun 19-21, pp 47-49. Subotica, Srbija.

10. Muñoz Irene, Dall’Olio R, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, de la Rúa Pilar

(2009) Diversidad genetica y estructura poblacional de Apis mellifera en Europa Oriental, Book of abstracts, Secundo Congreso de la Sociedad Espanola de Biologia Evolutiva, Nov 29-Dec 02, pp. 78, Valencia, Spain.

11. Stevanović Jevrosima, Maletić M, Stanimirović M, Stanimirović Z (2008) Molekularno

genetičke metode u ekologiji i menadžmentu divljači. Zbornik radova X Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2005, Sept 1-5, pp 108-109, Kragujevac, Srbija.

SVE NAŠE REFERENCE U KOJIMA SU RAĐENA MOLEKULARNO – GENETIČKIH ISTRAŽIVANJA

mogu se naći na internet stranici: http://www.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/Jevrosima-ref-srpski-web.pdf

http://www.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/Jevrosima-ref-srpski-web.pdf�

Polimorfizam u dužini restrikcionih fragmenata (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – RFLP)

Analiza varijabilnosti: funkcionalna varijabilnost, varijabilnost...

Documents

Transcript of Analiza varijabilnosti: funkcionalna varijabilnost, varijabilnost...