Analiza varijabilnosti: funkcionalna varijabilnost...

Dr Jevrosima Stevanović, van. prof. Prof. dr Zoran Stanimirović -----------------------------------------------------------------------------------------------------------

1

Analiza varijabilnosti: funkcionalna varijabilnost,

varijabilnost DNK

Genetička varijabilnost (različitost) potiče iz dva osnovna procesa: mutacija i rekombinacija.

Mutacije su izvor genetičkih promena, stvaranja sasvim novih oblika genskih alela.

Rekombinacije su procesi tokom kojih dolazi do stvaranja novih kombinacija genskih

alela. Drugim rečima, aleli se rekombinacijama preuređuju, čime se stvara ogroman

broj mogućih genotipova.

Preživljavanje bioloških vrsta obezbeĎeno je mehanizmima održavanja genetičkog integriteta i

verodostojnog prenošenja genetičke informacije iz generacije u generaciju.

Ipak, proces biološke evolucije nezamisliv je bez povremenog unošenja promena u sekvenci

nukleotida ili drugih oblika genetskih rearanžmana.

Osnovni izvor genetičkih novina u populacijama su mutacije i one obezbeĎuju nastanak

„novog“ („sirovog“) materijala, pri čemu se kroz proces prirodne selekcije vrši favorizovanje

onih mutacija koje su u skladu sa ekološkim uslovima u odreĎenom vremenskom periodu.

Ukoliko ne bi postojale mutacije, svi geni bi egzistirali samo u jednom obliku, ne bi imali

alternativne oblike – genske alele.

Rekombinacije gena samo preuređuju genetičku varijabilnost do novih kombinacija, dok

selekcija vodi ka favorizovanju najbolje prilagoĎenih kombinacija u odnosu na postojeće

uslove u sredini.

Obzirom da od genetiĉke varijabilnosti zavisi i fenotipska varijabilnost, jasno je da procesi

mutacija i rekombinacija doprinose stvaranju velikog broja razliĉitih fenotipova. Kada su

u populaciji prisutne fenotipski različite jedinke, prirodna selekcija ima šta da odabere, pri

čemu će favorizovati jedinke sa većom šansom za preživljavanje i boljim reproduktivnim

sposobnostima, odnosno boljim sposobnostima za prilagoĎavanje ekološkim uslovima

(adaptibilnije jedinke). Ukoliko je za opstanak pod promenjenim uslovima sredine „zaslužna”

neka mutacija, onda se putem prirodne selekcije favorizuju mutacije koje datim uslovima

obezbeĎuju opstanak (npr. mutacije koje obezbeĎuju opstanak u zagaĎenoj životnoj sredini –

čak i nakon ekoloških katastrofa, eksplozija nuklearnih elektrana).

Procesi koji stoje u osnovi genetičke varijabilnosti omogućavaju da se kroz generacije menja

genetička struktura populacije u skladu sa promenama uslova u životnoj sredini.


2

Sa druge strane, mutacije su često uzrok anomalija, ali posledice mutacija nisu uvek očigledne,

odnosno, fenotipski efekti mutacija se u mnogim slučajevima mogu detektovati samo

delikatnim biohemijskim ili genetičkim analizama, a samo u nekim slučajevima mutacije

dovode do velikih morfoloških promena i letalnih efekata.

Nažalost, u stočarstvu, selekcija je jako dugo obavljana na osnovu fenotipa i primenom metoda

selekcijskog ukrštanja. Ove procedure selekcije primenjivane su u velikom obimu bez

detaljnog znanja o broju gena koji su uključeni u ekspresiju datih osobina, kao i bez ikakvog

znanja o efektu tih gena na objektima selekcije i njihovom učešću u plejotropnom efektu ili

vezanom delovanju na druge osobine. Primena ovakvog pristupa pokazala se korisnom u

velikoj meri u poboljšanju prosečne količine mleka po laktaciji kod mnogih populacija mlečnih

krava. MeĎutim, pri korišćenju ovakvih odgajivačkih šema dešava se da najbolje rangirani

bikovi (odabrani isključivo na osnovu fenotipa), koji se koriste u programima veštačkog

osemenjavanja, budu nosioci mutiranih alela. Takvi bikovi značajno doprinose širenju

naslednih anomalija kod potomaka.

Korišćenjem molekularno-genetičkih analiza moguće je identifikovati mutacije koje su uzrok

anomalijama (koje se nekad manifestuju odmah po roĎenju, ali često tek kada stupe u proces

reprodukcije) i sprečiti dalekosežno širenje mutiranih alela.

Nakon identifikacije mutacije, dizajniraju se molekularni markeri za njihovu detekciju, čime je

omogućeno da se nosioci tih alela isključe iz daljeg programa selekcije.

Analiza genetiĉke varijabilnosti

Prouĉavanje fenotipskih razlika meĎu jedinkama jedne populacije predstavlja jedan od

najjednostavnijih naĉina analize genetiĉke varijabilnosti (raznovrsnosti). Pod fenotipskim

razlikama podrazumevamo npr. razlike u graĎi tela, visini i težini, pigmentaciji kože (dlake,

perja), krvnim grupama, ponašanju, dužini života, zdravstvenom stanju ali i razlike u tzv.

proizvodnim osobinama gajenih životinja - dnevni prirast, plodnost, kvalitet trupa i ukus

mesa, kvantitet trupa i prinos mesa, mlečnost, odnosno kvantitet i kvalitet mleka kod krava,

produkcija jaja kod živine, mesnatost kod svinja itd.

Fenotipska varijabilnost je veoma česta pojava u prirodi, ali najvaţnije pitanje je koliko je za

tu varijabilnost odgovorna nasledna osnova, a koliko faktori sredine (videti: Box 1).

Prethodno navedene proizvodne osobine, odnosno ekonomski znaĉajne osobine

(economically relevant traits-ERT) su kompleksne, odnosno pod kontrolom velikog broja

gena i pod uticajem faktora spoljašnje sredine. Kod goveda su to, na primer, osobine vezane

za rast, unos hrane, mlečnost, karakteristike trupa (mesnatost, količina masti) i reprodukciju.

Markeri koji su otkriveni za te osobine, vezani su za samo jedan gen od brojnih gena koji

kontrolišu kompleksnu osobinu. MeĊutim, ekspresija ţenjenog fenotipa (npr. povećana

mleĉnost, bolji kvalitet mleka i mesa) zavisi i od brojnih drugih “nemarkiranih” gena, ali

i brojnih faktora sredine. Zbog toga je pri donošenju odluke o selekciji uvek neophodno

uzeti u obzir oĉekivane razlike u potomstvu (Expected Progeny Differences-EPDs), čak i


3

kada postoje podaci dobijeni primenom markera. Selekcija goveda u kojoj se koriste

molekularni markeri je prihvaćena i preporuĉena kao dopuna tradicionalnim metodama

selekcije. Najveća korist molekularnih markera u selekciji je pre svega kod osobina koje

imaju jednostavan naĉin nasleĊivanja (boja krzna, genetiĉke anomalije), a zatim kod

kompleksnih osobina kao što su: kvalitet trupa i ukus mesa, kvantitet trupa i prinos

mesa, mleĉnost, odnosno kvantitet i kvalitet mleka, fertilnost i reproduktivna efikasnost,

sposobnost za materinstvo, unos hrane, ponašanje vezano za ishranu i prirast. Ipak, u

svetu postoje standardizovani testovi za k-kazein, beta-laktoglobulin i alfa S1 kazein na

osnovu kojih se može odrediti kvalitet mleka krave čiji je uzorak analiziran, ali i genotip za te

osobine, što je značajno za procenu količine i kvaliteta mleka koji se može očekivati kod

potomaka. Na primer, krave BB genotipa za k-kazein, proizvode veću koliĉinu mleka sa

većim sadrţajem proteina nego krave AB ili AA genotipa. Osim toga, mleko krava BB

genotipa je bolje za proizvodnju sira. Krave B genotipa za beta-laktoglobulin, glavnu

komponentu surutke, proizvode mleko sa većim sadrţajem masti i kazeina, komponenti

koje su poţeljne za proizvodnju sira. Sa druge strane krave AA genotipa daju veće

koliĉine mleka. Alfa S1 kazein takoĊe utiĉe na prinos mleka. Krave BB genotipa za alfa

S1 kazein daju više mleka nego krave reĊe prisutnog BC genotipa. Genetičke analize

navedenih parametara obavnjaju se iz korena dlake ili uzoraka krvi. Preciznost rezultata je

99%. Najznačajniji faktor koji je povezan sa praktično svim produktivnim, reproduktivnim, pa

i imunim karakteristikama goveda jeste hormon leptin, proizvod leptin gena („gena za

gojaznost”). Leptin sintetišu i luče uglavnom adipocite belog masnog tkiva. Leptin ima ulogu u

regulisanju apetita, unosa hrane, telesne težine, telesnog sastava i potrošnje energije. TakoĎe

utiče reprodukciju i neke funkcije imunog sistema. Koncentracija leptina u serumu povezana sa

depoima masti u trupu i ekonomski značajnim karakteristikama goveĎeg mesa. U cilju

ispitivanjem molekularnih mehanizama koji stoje u osnovi uticaja leptina, najpre je mapiran

gen za leptin na hromozomu 2, a zatim je utvrĎeno da u kodirajućem regionu leptin gena

postoji polimorfizam koji je značajan za koncentraciju leptina u serumu. Polimorfizam u

kodirajućem regionu leptin gena ima veliki uticaj na ekonomski značajne karakteristike

goveda: na unos hrane, na vrednosti trupa, odnosno utovljenost i kvalitet mesa, kvantitet i

kvalitet mleka. Osim toga, postoje dokazi da polimorfizam u regulatornom regionu

(promotoru) gena za leptin utiče na koncentraciju leptina u serumu, prirast, telesnu težinu,

pokazatelje vrednosti trupa, unos hrane i ponašanje vezano za ishranu. Predloženi SNP markeri

za navedene osobine su UASMS2 i UASMS3. Polimorfizam u promotoru leptin gena može

uticati i na prinos i sastav mleka. SNP markeri UASMS1 i UASMS3 u promotoru leptin gena

imaju signifikantan uticaj na prinos masti, ali za UASMS2 nije potvrĎena signifikantna

povezanost ni sa jednom osobinom vezanom za kvalitet mesa goveda. MeĎutim, definisani su

molekularni SNP markeri unutar leptin gena za sledeće ekonomski značajne osobine goveda.

To su dva SNP markera (E2JW, E2FB) značajna su za prinos i rasporeĎenost masti i za prinos

posnog mesa i posredno za mekoću mesa. Sa druge strane, najnovija istraživanja otkrila su da

SNP markeri UASMS2 i R25C imaju značajan uticaj na parametre porasta, telesne težine i

leĎne slanine. Navedeni markeri omogućavaju identifikaciju goveda koja imaju željenu

genetsku predisponiranost u odnosu na navedene osobine

Savremene analize su pokazale da je mnogo veći stepen genetiĉke varijabilnosti nego što

bi se oĉekivalo na osnovu analize fenotipske varijabilnosti.


4

Metode analize genetiĉke varijabilnosti

kvalitativnih osobina:

MORFOMETRIJSKE METODE - analize morfoloških karakteristika, koje je

moguće koristiti ukoliko se zna priroda genetičke determinacije posmatrane osobine;

CITOGENETIĈKE METODE – analize kariotipa (hromozoma), kojima se

mogu otkriti promene u broju ili strukturi hromozoma kod jedinki ispitivane populacije;

Morfološki i hromozomski markeri obiĉno pokazuju nizak nivo polimorfizma i stoga

nisu posebno korisni kao genetiĉki markeri.

BIOHEMIJSKE METODE - analize proteina, jer zbog kolinearnosti izmeĎu gena i

proteina, promene nukleotidne sekvence DNK (tj. gena) mogu da dovedu do izmene

primarne strukture kodiranog proteina.

Iako su proteinski polimorfizmi bili prvi markeri za genetiĉka istraţivanja (koji su se

veoma dugo i obimno koristili u stočarstvu), analize proteina se danas smatraju

prevaziĊenom metodom zbog veoma niske rezolucije, odnosno zbog velikih ograniĉenja

u ispitivanju genetiĉke varijabilnosti.

Naime, analizom proteina mogu se detektovati samo neki genetiĉki polimorfizmi i

nivo polimorfizma koji se detektuje je najĉešće nizak.

OdreĎivanje amino-kiselinske sekvence proteina je veoma zahtevno (vremenski i

finansijski), tako da se najĉešće analize proteina obavljaju gel-elektroforezom, koja se

zasniva na tome da proteini imaju razliĉitu elektropokretljivost (na gelu u rastvoru

slabog elektrolita) ukoliko se razlikuju po sekvenci aminokiselina (drugim rečima,

elektroforetska separacija proteina zasniva se na razlikama u električnom naboju ili

razlikama u molekulskim masama kod različitih proteina).

MeĎutim, ĉak i analiza amino-kiselinske sekvence ne moţe otkriti svaku promenu u

genomu, jer postoje mutacije koje NE DOVODE do promene amino-kiselinske

sekvence usled izroĊenosti genetskog koda (tzv. tihe mutacije).

Sa druge strane, elektroforetska analiza proteina ima još manju rezoluciju, jer ne moţe

otkriti ĉak ni svaku promenu u sekvenci amino-kiselina, jer se neke zamene amino-

kiselina ne odraţavaju na elektroforetsku pokretljivost proteina (ukoliko se jedna

amino-kiselina u proteinu zameni nekom hemijski bliskom amino-kiselinom).

Konaĉno, navedeni markeri odraţavaju varijabilnost u sekvencama koje ih kodiraju, a

koje predstavljaju manje od 10% ukupnog genoma.

MOLEKULARNE METODE – predstavljaju metode izbora za analizu genetiĉke

varijabilnosti, obzirom da se njima otkrivaju razlike u samom molekulu DNK (tzv.

DNK polimorfizmi koji podrazumevaju svaku razliku u nukleotidnoj sekvenci

(unutar gena i/ili nekodirajućih regiona DNK). Markeri kojima se detektuju

razlike na nivou DNK nazivaju se molekularni ili DNK markeri.


5

Molekularni markeri, sposobni da detektuju genetiĉke varijacije na nivou sekvenci DNK,

ne samo da su prevazišli ograniĉenja prethodno korišćenih metoda (morfometrijske,

citogenetiĉke, biohemijske), nego poseduju i jedinstvena genetiĉka svojstva koja ih ĉine

mnogo korisnijim od ostalih genetiĉkih markera. Oni su brojni i rasporeĎeni svuda po

čitavom genomu. NasleĎuju se po tipičnom Mendelovom načinu nasleĎivanja koji se obično

ispoljava u ko-dominantnom obliku i često su multialelni tako da se u proseku heterozigotnost

ostvaruje u više od 70%. Na njih ne utiču faktori spoljašnje sredine i generalno nemaju

plejotropni efekat na lokuse za kvantitativne osobine (quantitative trait loci-QTL). Obzirom da

genska ekspresija nije preduslov, korišćenjem molekularnih markera moţe se vizuelizovati

praktiĉno celokupan genom ukljuĉujući nekodirajuće regione.

Osim znatno veće preciznosti, molekularni markeri nude i brojne metodološke prednosti:

- mogućnost korišćenja bilo kog uzorka koji sadrži DNK životinje (ne samo krv, nego i

dlake, briseve bukalne ili vaginalne sluznice, mleko, sperma, arhivirani preparati);

- mogućnost retrospektivne analize u slučajevima kada životinje više nisu dostupne (iz

sačuvanih uzoraka tkiva ili sperme),

- uzorkovanje za DNK analize je neinvanzivno

- uzorci DNK se mogu jako dugo čuvati u laboratoriji bez nekih posebnih uslova i lako

se mogu transportovati izmeĎu laboratorija,

- analiza DNK može se obaviti u veoma ranima fazama života jedinke, odnosno čak i na

stupnju embriona (prenatalna dijagnostika), nezavisno od pola,

- kada se jednom prenese na čvrstu podlogu, kao što su filter membrane, može se više

puta koristiti za hibridizaciju sa različitim probama, a mogu se koristiti heterologe

probe i in vitro-sintetizovane oligonukleotidne probe,

- metode bazirane na PCR metodologiji mogu se automatizovati.

Postoje brojne mogućnosti primene molekularnih markera u programima poboljšanja

stoke kako u konvencionalnim, tako i u transgenim strategijama gajenja. U programima

poboljšanja putem konvencionalnih strategija gajenja, primena molekularnih markera može biti

kratkoročna ili neposredna (za odreĊivanje roditeljstva, procenu genetiĉke distance,

determinaciju tipa blizanaĉke zigotije i frimartinizma, odreĊivanja pola embriona pre

implantacije, kao i za identifikaciju nosioca bolesti), ali i dugoročna (u postupcima

mapiranja gena, kao i za selekciju u kojoj se koriste markeri, za koju se koristi termin:

marker-assisted selection-MAS). Kod transgenog gajenja, molekularni markeri se mogu

koristiti kao referentne tačke za identifikaciju, izolaciju i kloniranje relevantnih gena,

manipulaciju tim genima i identifikaciju životinja koje nose transgene. Ovde je značajno

napomenuti značaj molekularnih markera u identifikaciji genetički modifikovanih životinja

(GMO) i proizvoda od GMO životinja. Osim toga, progres u razvoju molekularnih markera

ukazuje na mogućnost njihove primene za genetičko poboljšanje gajenih vrsta životinja.


6

Najznaĉajnije molekularne metode koje se koriste za analizu genetiĉke i

funkcionalne varijabilnosti

Postupak analize genetičke i funkcionalne varijabilnosti putem molekularnih markera

počinje izolacijom (ekstrakcijom) i multiplikacijom (kloniranjem) DNK ili RNK iz

bioloških uzoraka.

Izolacija DNK iz ćelije podrazumeva oslobaĎanje DNK iz jedra (nuklearna DNK) ili

organela (mitohondrijalna). Pri tome se koriste hemikalije kojima se razbijaju i liziraju: ćelijska

membrana (animalnih ćelija), ćelijski zid (kod biljaka i gljiva) i membrane organela

(mitohondrija i plastida). http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/

Nakon izolacije DNK (ili RNK) iz ćelije, sledeći korak je amplifikacija (kloniranje) željenog

(ciljanog) gena ili fragmenta DNK, što se može obaviti in vivo i in vitro.

U slučaju in vivo kloniranja željenog (ciljnog) fragmenta DNK, najpre se restrikcionim

enzimima (videti Box 2) „iseĉe” ciljani deo DNK, a zatim taj deo ugradi u DNK vektora

(plazmida ili virusa), odnosno stvori se rekombinantna DNK. Da bi ona mogla da se

umnoţava, neophodno je da se vektor ubaci u ćeliju domaćina (najčešće u bakteriju

Escherichia coli). DNK vektora je u mnogim slučajevima cirkularna i dvolančana. Pri svakoj

replikaciji DNK vektora, istovremeno se umnoţava i ugraĊeno parĉe DNK, odnosno

replikuje se ĉitava rekombinantna DNK. Na ovaj način se još od 1982. godine proizvodi

humani insulin u ćelijama bakterija – ubacivanjem dela humane DNK koji sadrži gen za insulin

u vektor, a zatim u bakterije čijim umnožavanjem se obezbeĎuje proizvodnja sintetskog

humanog insulina. To je, inače, prvi lek dobijem primenom metoda genetičkog inžinjeringa.

In vitro kloniranje željenog (ciljnog) fragmenta DNK obavlja se putem reakcije lančane

polimerizacije, odnosno putem PCR amplifikacije – (Polymerase Chain Reaction – PCR)

u aparatu koji ima mogućnost brze promene temperaturnih uslova. Tvorac ove tehnike Kary

Mullis je za taj svoj izum dobio Nobelovu nagradu 1993. godine.

Ključna komponenta u PCR procesu jeste DNA polimeraza izolovana iz bakterije Thermus

aquaticus, koja je rezistentna na visoke temperature (živi i replicira se pri teperaturama do

95°C). Ta termostabilna polimeraza nazvana je Taq polimeraza (po bakteriji domaćinu) i

koristi se za replikaciju in vitro čime se omogućava geometrijski porast broja kopija ciljane

DNK.

Za PCR amplifikaciju potrebne su sledeće komponente:

izolovana DNK čiji odreĎeni fragment želimo da amplifikujemo,

prajmeri (oligonukleotidne sekvence) koji se dizajniraju tako da budu komplementarni

sekvencama koji okružuju ciljani region DNK (npr. gen) koji želimo da umnožimo,

Taq polimeraza,

slobodni nukleotidi, odnosno gradivne jedinice za sintezu novih lanaca DNK, u vidu

mešavine deoksiribonukleozid trifosfata (dNTP): adeninskih (dATP), timinskih (dTTP),

guaninskih (dGTP) i citozinskih (dCTP),

Magnezijumovi joni (Mg2 +

),

PCR pufer,

sterilna dejonizovana voda.

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/


7

Proces PCR amplifikacije obuhvata sledeće korake:

1. Inicijalna denaturacija DNK u trajanju od dva do četiri minuta (zavisno od udela GC

parova).

2. Denaturacija DNK – rasplitanje i razdvajanje lanaca DNK. Obavlja se na 94-96°C u

trajanju od 30 sec do nekoliko minuta (zavisno od udela GC parova),

3. Hibridizacija para prajmera sa komplementarnim sekvencama koji okružuju ciljani

region DNK. Obavlja se na temperaturi od 45-65°C u trajanju od 30 sekundi do

nekoliko minuta,

4. Elongacija prajmera (ekstenzija), odnosno sinteza novih DNK lanaca počev od

prajmera, tako što se Taq polimeraza vezuje za mesta hibridizacije prajmera i katalizuje

ugraĎivanje novih nukleotida komplementarih inicijalnim sekvencama. Ovaj proces se

obavlja na 72°C i traje od 45 sec do 1 minuta.

Koraci od 2. do 4. ponavljaju se tokom 25 do 40 ciklusa, kako bi se obezbedilo

umnožavanje dovoljnog broja kopija ciljnog fragmenta DNK. Umnoţeni ciljni fragmenti

DNK nazivaju se amplikoni ili PCR produkti. U svakom ciklusu količina amplikona se

duplicira (u prvom ciklusu nastaju 2 aplikona, u drugom 4, u trećem 8, u četvrtom 16, u petom

32, u šestom 64 ...) tako da na kraju PCR procesa nastaje od milion do bilion amplikona.

5. Elongacija preostalih produkata (na 72 °C, u trajanju od dva do čeiti minuta).

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

Po završetku PCR amplifikacije, neophodno je izvršiti vizuelizaciju PCR produkata.

Dobijeni amplikoni razdvajaju se elektroforezom na gelu zbog toga što fragmenti DNK

razliĉite duţine imaju razliĉitu elektropokretljivost, odnosno putuju razliĉitom brzinom

(na gelu u rastvoru slabog elektrolita) pod uticajem elektriĉnog polja. Zbog toga za isto

vreme kraći fragmenti (koji se kreću brže) preĎu duži put u odnosu na duže fragmente. Nakon

završene elektroforeze gel se boji etidijum bromidom (koji se interkalira izmeĎu lanaca DNK)

koji fluorescira pod UV svetlošću, te se gel postavlja na UV transiluminator (vizuelizacija PCR

produkata), što omogućava očitavanje rezultata. http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/

Postoje razliĉite modifikacije PCR metode:

Duplex PCR – je varijanta PCR metode u kojoj se, umesto jednog, koriste dva para

prajmera, pri ĉemu oni prepoznaju razliĉite fragmente DNK i omogućavaju

diferencijalnu dijagnostiku) (Primer: razlikovanje vrsta Nosema apis i N. ceranae putem

duplex PCR uz primenu species-specifiĉnih prajmera).

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/


8

Multiplex PCR podrazumeva korišćenje većeg broja parova prajmera što omogućava

istovremeno umnoţavanje većeg broja razliĉitih ciljnih fragmenata. Tako se kod

amplifikacije seta mikrosatelita, koji omogućava testiranje roditeljstva, goveda koristi 11

parova prajmera za amplifikaciju 11 mikrosatelita (kod ljudi mnogo više, od 14 do preko

30). (Primer: testiranje oĉinstva kod goveda). Ovom metodom se takoĎe može istovremeno

utvrditi prisustvo ili odsustvo više različitih genotipova.


9

Repetitivni PCR (rep-PCR) se može koristiti kod bakterija kada u njihovoj DNK postoje

kratke repetitivne sekvence (fragmenti DNK koji se ponavljaju više puta), a izmeĊu njih

su umetnute jedinstvene sekvence (koje se samo jednom javljaju u genomu) specifiĉne za

svaki soj-genotip bakterije. Na osnovu toga osmišljena je metoda rep-PCR u kojoj se

amplifikuju te repetitivne sekvence DNK. Pošto su one različito rasporeĎene kod različitih

sojeva, nakon elektroforeze PCR produkata dobija se niz traka razliĉite duţine („kao

lestvica“), ĉiji je raspored jedinstven za svaki soj –genotip bakterija i naziva se

fingerprint, te se zato ova metoda koristi za diferencijaciju različitih sojeva iste vrste bakterija

(Primer: genotipizacija Paenibacillus larvae).

ER

IC I

ER

IC III

ER

IC I

V

ERIC II

500

1000

1500

3000

2000

ER

IC I

ER

IC III

ER

IC I

V

ERIC II

500

1000

1500

3000

2000

500

1000

1500

3000

2000


10

Real-time PCR - Real-time PCR se razlikuje od tradicionalne PCR metode po tome što se

uzorci obeleţe fluorescentnim markerom, a real-time PCR aparat ima detektor

fluorescencije i zahvaljujući tome Real-time PCR omogućava kvantifikaciju umnoţenog

segmenta DNK, a time i zastupljenost u uzorku, kao i detekciju PCR produkta i praćenje

kinetike reakcije od samog početka reakcije, odnosno u svakom momentu dok traje reakcija.

Ovo su velike prednosti u odnosu na konvencionalni PCR koji je samo kvalitativna metoda

bez mogućnosti kvantifikacije PCR produkta i kod koga je postupak mnogo duži jer je

potrebno da se ceo postupak završi, pa tek onda očitaju rezultati (najpre je neophodno sačekati

da se kompletno završi amplifikacija, pa obaviti elektroforezu PCR produkata, obojiti gel

etidijum bromidom i vizuelizovati PCR produkte na transiluminatoru).

Zahvaljujući opisanim karakteristikama real-time PCR pruža mogućnost primene u proceni

efikasnosti terapije lekovima, u merenju stepena oštećenja DNK, u kvantifikaciji genske

ekspresije, detekciji patogena, genotipovanju, analizi SNPs, kontroli kvaliteta i validaciji

testova.

Sekvencioniranje – odreĊivanje redosleda nukleotida. Bazira se na dideoksi metodi u

kojoj se pri in vitro sintezi DNK pored normalnih gradivnih jedinica (dNTP), dodaju i

dideoksinukleotidi (ddNTP) koji u pentoznom šećeru nemaju OH grupe na pozicijama 2' i 3',

te kada se oni ugrade u polinukleotidni lanac na tom mestu se dalja sinteza zaustavlja (jer nema

slobodne OH grupe na poziciji 3' za koju bi sledeći nukleotid trebao da se veže). Zato se ova

metoda naziva i „metoda prekida lanca“. Dideoksinukleotidi su obeleženi fluorescentnim

markerom koji je različite boje za svaki od četiri tipa dideoksinukleotida. Svaki ddNTP

fluorescira različitom bojom kada ga osvetli laserski zrak: adeninski (ddATP) zeleno,

guaninski (ddGTP) žuto, citozinski (ddCTP) plavo, timinski (ddTTP) crveno, što se automatski

zabeleži putem skenera (npr. svaki put kada se regustruje crvena boja – automatski skener

registruje da taj nukleotid nosi timin). Obeležavanje ddNTP različitim fluorescentnim bojama

omogućava da se koristi samo jedna reakciona smeša i razdvajanje (čitanje rezultata) obavlja

na jednom gelu. Čitav proces se odvija u sekvencioneru, aparatu koji sve radi automatski od

unošenja uzoraka do čitanja rezultata sa gela.

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAsequencing.html

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAsequencing.html


11

Molekularni (DNK) markeri

za procenu genetiĉkog diverziteta

1. NUKLEARNI DNK MARKERI

Brojni markeri su danas dostupni za detekciju polimorfizama nuklearne DNK. U prouĉavanju

genetiĉkog diverziteta i za potrebe genetiĉke karakterizacije ţivotinja, najčešće korišćeni

markeri su mikrosateliti.

MIKROSATELITI su kratke jedinice DNK (tzv. ponovci) koje se više puta ponavljaju u

tandemu - (Short Tandem Repeat - STR loci). Veličina jedinice (ponovka) je od 2 do 6

baznih parova. Najčešći ponovak je CA. Mikrosateliti su hipervarijabilni, često imaju desetine

alela po lokusu, pri čemu se različiti aleli razlikuju po broju ponovaka. RasporeĎeni su duž

čitavog genoma. Na primer, odreĎeni mikrosatelit može obuhvatati 10 ponovljenih jedinica CA

(CACACACACACACACACACA). Tokom evolucije, neka mutacija na DNK može dovesti

do toga da neke jedinke imaju alel od 8 jedinica CA, dok druge mogu imati alel od 6 ili 12 tih

jedinica na istom lokusu.

Pošto su mikrosateliti relativno kratke sekvence, lako se amplifikuju putem PCR metode iz

prethodno izolovane DNK. Vizuelizacija polimorfizama nakon amplifikacije obavlja se na

gelu, a dostupnost automatizovanih sekvencera omogućava detaljnu i preciznu analizu velikog

broja uzoraka u isto vreme.

Zbog visoke stope mutacije i kodominantne prirode, mikrosateliti su najadekvatniji markeri za:

- proučavanje diverziteta (procenu unutar-rasnog i meĎurasnog genetičkog diverziteta,

kao i procenu mešanja meĎu rasama čak i kada su one blisko srodne);

- analize roditeljstva (najčešće očinstva), kontrolu pedigrea, odnosno individualnu

identifikaciju;

- mapiranje lokusa za kvantitativne osobine (Quantitative Trait Loci – QTL).

Prosečan broj alela (number of alleles – MNA) po populaciji, uočena (zabeležena) i očekivana

heterozigotnost (Ho i He) su parametri koji se najčešće koriste za procenu unutar-rasnog

diverziteta. Najjednostavniji parametri za procenu genetičke različitosti izmeĎu rasa su

genetička diferencijacija ili fiksacioni indeksi. Postoji nekoliko načina procene, ali najčešće se

koristi FST koji predstavlja meru stepena genetičke diferencijacije subpopulacija putem

proračuna standardnih varijansi alelskih frekvenci meĎu populacijama.

Organizacija za hranu i poljoprivredu pri Ujedinjenim nacijama (Food and Agriculture

Organization of the United Nations - FAO) zvaniĉno preporuĉuje panele mikrosatelita

koje treba koristiti za procenu diverziteta glavnih vrsta domaćih ţivotinja, na osnovu

odluke i odobrenja MeĎunarodnog društva za animalnu genetiku (International Society for

Animal Genetics-ISAG) http://www.fao.org/dad-is/

U tabelama ispod su rezultati ispitivanja informativnosti ISAG markera i mogućnosti njihovog

korišćenja u verifikaciji roditeljstva YU šarenog govečeta u tipu simentalca.

http://www.fao.org/dad-is/


12


13

Analiza roditeljstva sastoji se u poreĎenju DNK profila jedinke (potomka) sa DNK profilima

jedinki za koje se ispituje da li su roditelji te jedinke (potencijalnih roditelja). Pozitivan

rezultat, odnosno potvrda roditeljstva, dobija se ukoliko za svaki analizirani lokus postoji

poklapanje makar jednog alela izmeĎu potomka i potencijalnog roditelja (tabela ispod).

Mikrosatelit

Bik

(otac)

ID 780 392

1516

Tele

(sin)

ID 713 295

1116

Tele

(sin)

ID 717 278

8208

Tele

(sin)

ID 714 558

1406

TGLA227 89 79/89 89/91 89/97

BM2113 131/133 131/135 127/131 133

TGLA53 168 154/168 164/168 168/184

ETH10 217/219 217 217/221 213/219

SPS115 248/256 248/260 248 235/256

TGLA126 115/117 115/123 113/117 115

TGLA122 151/153 147/151 141/151 153

INRA23 208 208/218 208/222 208/214

ETH3 117/125 125 117 89/117

ETH225 150/142 148/150 150 136/142

BM1824 182/188 178/188 180/182 182

Poslednjih godina „konkurenti” mikrosatelita su POLIMORFIZMI POJEDINAĈNIH NUKLEOTIDA

(Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs), kojima se detektuju razlike u pojedinaĉnim

nukleotidima u sekvenci DNK meĊu jedinkama iste vrste.

MINISATELITI imaju iste karakteristike kao mikrosateliti, samo što su jedinice (ponovci)

duţe – od 10 do nekoliko stotina baznih parova. Mikro i minisateliti su takoĎe poznati i pod

nazivom „polimorfizmi u broju tandemskih ponovaka (Variable Number of Tandem Repeats –

VNTRs).

POLIMORFIZMI POJEDINAĈNIH NUKLEOTIDA (Single Nucleotide Polymorphisms -

SNPs)

Polimorfizmi pojedinaĉnih nukleotida (SNPs) koriste se kao alternativa za mikrosatelite

u prouĉavanju genetiĉkog diverziteta. Postoji nekoliko naĉina detekcije ovih

polimorfizama (npr. sekvencioniranjem ili putem RFLP, ukoliko je SNP unutar sekvence

koju prepoznaje neki restrikcioni enzim). SNPs su kandidati za buduća istraživanja

genetičkog diverziteta jer se mogu lako koristiti kako u proceni funkcionalne, tako i neutralne

varijabilnosti.


14

POLIMORFIZAM U DUŢINI

RESTRIKCIONIH FRAGMENATA

(Restriction Fragment Length Polymorphism

– RFLP)

Polimorfizam u duţini restrikcionih

fragmenata se detektuje nakon tretiranja

PCR produkata restrikcionim enzimima

(koji seku DNK na taĉno odreĊenim

„restrikcionim mestima” unutar specifiĉnih

nukleotidnih sekvenci). Na taj naĉin se

otkrivaju aleli koji se meĊusobno razlikuju

po prisustvu, odnosno odsustvu restrikcionih

mesta.

Nakon tretmana restrikcionim enzimima

(digestije), dobijeni fragmenti se analiziraju

putem elektroforeze. U zavisnosti od prisutva

(broja i položaja) restrikcionih mesta u

analiziranom fragmentu, na gelu dobijamo

DNK fragmente različite dužine (različite

RFLP-profile). Ukoliko je u amplikonu

postojalo jedno restrikciono mesto, na gelu će

se videti dve trake, ukoliko je sečenje obavljeno

na dva mesta, pojaviće se tri trake. Ukoliko nije

bilo restrikcionih mesta, amplikon će ostati ceo

(jedna traka). Ukoliko se dve vrste razlikuju po

prisustvu ili po broju i položaju restrikcionih

mesta za neki enzim, poreĎenjem dva ili više

profila (nakon digestije istim enzimom)

možemo utvrditi da li je reč o istim ili različitim

vrstama. Ukoliko kod različitih vrsta isti DNK

fragment ima restrikciona mesta za različite

enzime, onda se uzorci tretiraju svim

dijagnostičkim enzimima (istovremeno), pa se

na osnovu dobijenog profila na gelu utvrĎuje

kojoj vrsti pripada svaki od uzoraka (primer:

razlikovanje vrsta Nosema apis i N. ceranae

putem PCR-RFLP – slika levo i dve slike

dole).


15

Putem RFLP tehnike se mogu otkriti i jedinke nosioci mutiranih alela, ĉak i kada je

uzrok zamena samo jednog nukleotida (Single Nucleotide Polymorphism - SNP), ukoliko je

ta promena nastala unutar sekvence DNK koja kod zdravih jedinki poseduje restrikciono

mesto.


16

Primer kada zamena samo jednog nukleotida (SNP) unutar gena nuklearne

DNK dovodi do polimorfizma u dužini restrikcionih fragmenata (RFLP).

Genetski predisponirane bolesti često nastaju usled zamene nukleotida (Single Nucleotide

Polymorphisms - SNPs) u kodirajućim regionima DNK.

Na primer, kod poremećaja: deficijencija adhezije leukocita goveda (BLAD), urin nalik sirupu

javora (MSUD), citrulinemija i hiperkalcemijska periodična paraliza (HYPP) zamena samo

jednog jedinog nukleotida (taĉkasta mutacija) moţe imati fatalne posledice (letalni ishod).

Postoji nekoliko naĉina detekcije ovih mutacija (npr. sekvencioniranjem ili putem RFLP,

ukoliko je SNP unutar sekvence koju prepoznaje neki restrikcioni enzim).

A, C, E – detekcija

deficijencija adhezije

leukocita goveda

(BLAD),

odnosno SNP

na poziciji 383 CD18

gena (tranzicija A-G)

B, D, F – detekcija

CITRULINEMIJE,

odnosno SNP na

kodonu 86 unutar

egzona 5 gena za

argininosukcinat

sintazu (tranzicija C–

T).


17

Kod oboljenja pod nazivom „anemija srpastih ćelija“, zdrave jedinke imaju makar na jednom

hromozomu normalni alel za glutaminsku kiselinu na šestom mestu beta lanca hemoglobina

(normalni betaA lanac), dok su obolele jedinke homozigoti za mutirani alel i sintetišu valin

(imaju izmenjeni betaS lanac). Mutaciju je izazvala zamena samo jednog A nukleotida sa T

nukleotidom, jer je time promenjeno značenje šifre GAG (koja kodira glutaminsku kiselinu) u

GTG koja kodira valin), ali istovremeno je nestalo restrikciono mesto koje postoji samo kod

normalnog alela.

Kada je DNK fragment zdrave jedinke (koja nosi normalni alel (betaA

) na makar jednom

hromozomu), tretira restrikcionim enzimom, nakon elektroforeze se će dobiti obavezno kraća

traka (na slici obeležena kao beta-A), jer je u normalnom alelu prisutno restrikciono mesto koje

seče odeĎeni restrikcioni enzim (videti crvene strelice desno od slike gela). MeĎutim, kod

obolelih jedinki na oba hromozoma je mutirani alel (betaS) i u njemu ne postoji restrikciono

mesto, te primenjeni restrikcioni enzim ne nailazi na mesto sečenja i tretirani DNK fragmenti

tih jedinki ostaju neiseceni, pa se na gelu vidi samo duža traka (na slici obeležena kao beta-S).

Rodoslovno stablo pokazuje situaciju u porodici gde su heterozigotni roditelji (nosioci jednog

betaA i jednog beta

S alela) imali prvog sina bolesnog (homozigota za beta

S alel), drugo dete je

bila heterozigotna ćerka i treće dete normalna homozigotna ćerka (homozigot za betaA alel).

Opisana metoda omogućava prenatalnu dijagnostiku iz uzorka amnionske tečnosti ili

horionskih čupica u slučajevima kada su oba roditelja heterozigotna jer je šansa 25% da će

dobiti obolelo dete (homozigot za betaS alel), sa teškom, često smrtonosnom, anemijom

srpastih ćelija.


18

1. MITOHONDRIJALNI DNK MARKERI

Mitohondrijalni DNK (mtDNK) polimorfizmi se veoma široko koriste u analizama

filogenije i genetiĉkog diverziteta. Kod životinja, mtDNK je mali (15-20 kb) cirkularni

molekul, koji sadrži oko 37 gena i svi su neophodni za normalno funkcionisanje mitohondrija.

Mitohondrijalni genom je ureĎen veoma efikasno – ne poseduje introne i ima male intergenske

spejsere.

Kao molekularni marker, mtDNK ima puno prednosti. MtDNK evoluira brže od nuklearne

DNK, verovatno zbog smanjene vernosti replikacije i/ili nedovoljno efikasne reparacije

mtDNK. Različiti regioni mitohondrijalnog genoma evoluiraju različitim tempom (brzinom).

Haploidna mtDNK koju sadrže mitohondrije u citoplazmi ćelije ima maternalni oblih

nasleĎivanja kod većine vrsta (potomak nasleĎuje mtDNK isključivo od majke, nikad od oca),

ima visoku stopu mutacija i ne podleže rekombinacijama. Ove osobine mtDNK omogućavaju

biolozima da rekonstruišu evolucione veze izmeĎu i unutar vrsta proučavanjem mutacija u

mtDNK. TakoĎe, mtDNK markeri mogu da obezbede brzi naĉin otkrivanja hibridizacije

izmeĊu vrsta ili podvrsta domaćih ţivotinja.

Polimorfizmi u sekvenci hipervarijabilnog regiona D-petlje ili kontrolnog regiona

mtDNK znaĉajno su doprineli identifikaciji divljih predaka domestifikovanih vrsta

ţivotinja, utvrĊivanje geografskih modela genetiĉkog diverziteta i razumevanje

domestifikacije domaćih ţivotinja.

Polimorfizmi mtDNK mogu se otkriti ili sekvencioniranjem ili putem RFLP (bez obzira

da li se radi o SNPs ili nekim većim razlikama).

Primer: Otkrivanje polimorfizama u COI-COII regionu mtDNK kod

A. mellifera putem sekvencioniranja

Tabela ispod: Polimorfna mesta (SNPs) u COI – COII regionu mtDNA kod haplotipova pčela

C filogenetske linije (svaki novootkriveni SNP ukazuje na novi haplotip).


19

Sedam SNPs definiše sedam haplotipova pčela A. mellifera u Srbiji: C1a, C2c, C2d, C2e, C2i

(ranije otkrivenih u drugim zemljama) i dva prvi put otkrivena haplotipa, C2o (u

banatskom regionu) i C2p (u sjeniĉko-pešterskom regionu) - utvrĎenih na osnovu dva

novootkrivena polimorfna mesta (jedne transverzije i jedna tranzicije).

Table 1. Broj analiziranih društava (n), učestalost haplotipova i diverzitet (D) u društvima

pčela A. mellifera iz Srbije i referentnim populacijama

Sekvenca COI-COII regiona mtDNK A. mellifera otkriven u cilju

otkrivanja polimorfizama – slika ispod (SNPs su obeleženi brojevima od 1 do 8).


20

PoreĎenje sekvence COI-COII regiona mtDNA dva haplotipa A. mellifera – slika ispod

(SNPs su obeleženi brojevima od 1 do 8)

1

1 GTATTTTTAAACTTTTATTAAAATTTCCC-ACTTAATTCATATTAATTTAAAAATAAATT 59

2 GTATTTTTAAACTTTTATTAAAATTTCCC-ACTTAATTCATATTAATTTAAAAATAAATT 59

***************************** ******************************

2 3

1 AATAACAATTTTTAATAAAATAAATAATTAATTTTATTTTTATATTGAATTTTAAATTCA 119

2 AATAACAATTTTTAATAAAATAAATAATTAATTTTATTTTTATATTGAATTTTAAATTCA 119

************************************************************

1 ATCTTAAAGATTTAATCTTTTTATTAAAATTAATAAATTAATATAAAATAAAACAAAATA 179

2 ATCTTAAAGATTTAATCTTTTTATTAAAATTAATAAATTAATATAAAATAAAACAAAATA 179

************************************************************

4*5* 6

1 TAACAGAATATATTTATTAAAATTTAATTTATTAAAATTTCCACATGATTCATATTTATA 239

2 TAACAGAATATATTTATAATAATTTAATTTATTAAAATTTCCACATGATTCATATTTATA 229

***************** * ****************************** *********

1 TTTCAAGAATCAAATTCATATTATGCTGATAATTTAATTTCATTTCATAATATAGTTATA 299

2 TTTCAAGAATCAAATTCATATTATGCTGATAATTTAATTTCATTTCATAATATAGTTATA 399

************************************************************

7*

1 ATAATTATTATTATAATTTCAACATTAACTGTATATATTATTTTAGATTTATTTATAAAC 359

2 ATAATTATTATTATAATTTCAACATTAACTGTATATATTATTTTAGATTT-TTTATAAAC 358

************************************************** *********

8

1 AAATTTTCAAATTTATTTTTATTAAAAAATCATAATATTGAAATTATTTGAACAATTATT 419

2 AAATTTTCAAATTTATTTTTATTAAAAAATCATAATATTGAAATTATTTGAACAATTATT 418

***** ******************************************************

Primer: polimorfizam u COI genskom segmentu mtDNK kod A. mellifera

koji se moţe detektovati putem RFLP uz korišćenje restrikcionih enzima

NcoI i StyI, ĉime je omogućeno razlikovanje podvrsta A. mellifera koje

dele isti (C2D) haplotip (tabela ispod).


21

Box 1.

Razlike u fenotipskoj ekspresiji genotipova – knjiga 28. str

Razlike u fenotipskoj ekspresiji genotipova postoje zbog interakcije gena sa sredinom (pod

sredinom se podrazumeva kako unutrašnje okruženje u kome se ćelije nalaze, tako i uticaji

spoljašnje sredine u kojoj se organizam razvija). Znači, sredina može tokom individualnog

razvoja da utiče na stepen ispoljavanja gena. Zbog toga odreĊeni genotip ne mora uvek da

se ispolji kod svih jedinki koje su njegovi nosioci.

Učestalost ispoljavanja datog gena u populaciji naziva se penetrabilnost. Penetrabilnost

zavisi kako od genotipa (prisustvo epistaze ili nekog drugog tipa interakcije), tako i od

sredine. Ukoliko se kod klasičnog dominanto-recesivnog tipa naspeĎivanja recesivni fenotip

ispolji kod svih recesivnih homozigota, a dominantan kod svih dominantnih homozigota i

heterozigota, kažemo da je penetrabilnost potpuna (100%) – npr. kod osobina graška koje je

Mendel ispitivao i kod ABO sistema krvnih grupa. MeĎutim, ukoliko manje od 100% jedinki

ispolji očekivani fenotip, penetrabilnost je nepotpuna. Kod čoveka gen za brahidaktiliju

(kratki prsti) ima penetrabilnost od 50-80%. Smatra se da i mnogi geni koji dovode do

predispozicije za nastanak malignih bolesti ispoljavaju nepotpunu penetrabilnost.

Pored razlika u ispoljavanju gena na nivou populacije, geni mogu imaju različit stepen

ispoljenosti kod jedinke. Ekpresivnost predstavlja stepen do kojeg se penetrabilan gen ili

genotip fenotipski ispoljava kod jedinke. Kao i penetrabilnost, ekspresivnost zavisi kako od

sredine, tako i od genotipa (tj. genskih interakcija). Kod nasleĎivanja prošaranosti dlake

nekih rasa domaćeg psa postoji razlika u ekspresivnosti Sp genskog alela, te se uočava

gradacija od desetak različitih fenotipova.

Konačno, neki geni pokazuju nepotpunu penetrabilnost i varijabilnu ekspresivnost, što

umnogome otežava interpretaciju rezultata različitih ukrštanja, kao i analize rodoslovnih

stabala.

Pod uticajem sredine se ponekad javljaju nenasledne promene fenotipa (fenokopije) koje su

jako slične ili identične fenotipovima nastalim usled mutacije gena (iako imaju normalnu

genetičku konstituciju, jedinke sa fenokopijom ispoljavaju mutantan fenotip). Fenokopije

mogu da nastanu pod uticajem razliĉitih hemijskih agenasa tokom ranog razvića.

primer: Katarakta, gluvoća i malformacije srca mogu da budu posledica recesivno

homozigotnog stanja odreĎenih gena, ali mogu da se jave i kod osoba normalnog fenotipa

ukoliko su njihove majke bile inficirane virusom rubeole tokom prvih nekoliko nedelja

trudnoće.

primer: Nemogućnost razvoja dugih kostiju ekstremiteta može biti posledica retke

dominantne mutacije sa varijabilnom ekspresivnošću, ali može biti izazvana i primenom

sedativa talidomida tokom graviditeta.

Brojni su uticaji sredine koji menjaju vreme ili stepen ispoljavanja gena. Na stepen

ispoljenosti gena utiču: hemijski agensi, hormonski status (različito ispoljavanje kod mužjaka i


22

ženki), period života u kome se gen ispoljava, različiti fizički faktori – npr. temperatura utiče

na obojenost dlake kod kunića i sijamskih mačaka).

Relativan doprinos genetičke konstitucije i činilaca sredine na razviće odreĎenog fenotipa

moţe dosta da varira zavisno od broja gena uključenih u determinaciju date osobine, kao i

od toga u kojoj je meri ispoljavanje osobine pod uticajem spoljašnje sredine.

Na visinu, pored većeg broja gena, utiču i brojni spoljašnji faktori (ishrana, fizička aktivnost,

zdravstvena zaštita). Zato je za poslednjih 100 godina u razvijenim zemljama povećana

prosečna visina ljudi zbog bolje ishrane, sporta i brige o zdravlju. U ovom slučaju, geni daju

potencijal za razviće fenotipa u odreĎenim granicama. Raspon mogućih fenotipova koji

mogu nastati od jednog istog genotipa pod različitim uslovima sredine naziva se norma

reakcije. Za neke genotipove norma reakcije je mala i oni će dati gotovo iste fenotipove u

veoma različitim uslovima sredine. Nasuprot tome, neki genotipovi imaju veliku normu

reakcije, tako da isti genotip daje niz različitih fenotipova u različitim uslovima sredine.

Pored norme reakcije, treba razlikovati fenotipsku plastiĉnost kao stepen ispoljavanja osobine

pod dejstvom faktora spoljašnje sredine.

Plejotropnost gena

Poligeno nasleĊivanje


23

Box 2.

Restrikcioni enzimi (endonukleaze) prepoznaju tzv. specifične nukleotidne sekvence (tzv.

palindromske sekvence) i seku ih na tačno odreĎenim „restrikcionim mestima”. Naime, za

svaki restrikcioni enzim postoji specifična sekvenca koju samo on prepoznaje i seče je na

specifičan način. (Mesta sečenja nekih restrikcionih enzima prikazana su na slici dole).

Za potrebe sekvencioniranja DNK, neophodno je prethodno iseći DNK u manje fragmente i za

tu svrhu se koriste restrikcioni enzimi.

Neki restrikcioni enzimi (kao npr. HaeIII i AluI) seku DNK ravno tako da nastaju fragmenti sa

ravnim krajevima. Ako se specifična sekvenca koju prepoznaje i seče npr. enzim HaeIII nalazi

na 11 mesta duž cirkularne DNK virusa, nastaće 11 fragmenata razliĉitih po duţini i

sekvencama nukleotida. Nastali fragmenti se mogu odvojiti jedan od drugog

elektroforezom, a zatim odrediti redosled nukleotida u njima postupkom

sekvencioniranja .

MeĎutim, mnogi restrikcioni enzimi (BamHI, HindIII, Eco RI) seku DNK neravno tako da

nastaju fragmenti sa “lepljivim” jednolanĉanim krajevima. Ukoliko se DNK poreklom iz

dva različita izvora tretiraju istim restrikcionim enzimom, nastaće fragmenti sa istim lepljivim

krajevima, te ukoliko se dobijeni fragmenti pomešaju, dolazi do njihovog povezivanja,

odnosno spajanja njihovih lepljivih krajeva po principu komplementarnosti baza.

Konačno, dodaje se DNK ligaza koja spaja mesta prekida kovalentnim vezama (formira

kovalentne veze unutar svakog lanca i kao rezultat nastaje “rekombinantna” DNK (rDNA).

Stvaranje rekombinante DNK je revolucionarno otkriće, ne samo zbog toga što je usavršilo

genetička istraživanja, nego i zbog velike mogućnosti primene u biotehnologiji i medicini.

Humani insulin (za dijabetiĉare), humani faktor VIII (za hemofiliĉare) i drugi preparati

danas se komercijalno proizvode zahvaljujuću otkriću načina stvaranja rekombinantne DNK.




24

REFERENCE ISTRAŢIVAĈA SA KATEDRE ZA BIOLOGIJU U KOJIMA SU KORIŠĆENE

MOLEKULARNE METODE BAZIRANE NA PCR TEHNOLOGIJI:

1. Kozmus P, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Stojic V, Kulisic Z, Meglic V

(2007) Analysis of mitochondrial DNA in honey bees (Apis mellifera) from Serbia.

Acta Veterinaria 57 (5-6) 465-476.

2. Forsgren E, Stevanovic Jevrosima, Fries I (2008) Variability in germination and in

temperature and storage resistance among Paenibacillus larvae genotype. Veterinary

Microbiology 129 (3-4) 342-349.

3. Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Dimitrijevic V, Stojic V, Fratric N, Lazarevic M

(2009) Microsatellite DNA polymorphism and its usefulness for pedigree verification in

Simmental cattle from Serbia. Acta Veterinaria 59 (5-6) 621-631.

4. Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Dimitrijevic V, Maletic M (2010) Evaluation of

11 microsatellite loci for their use in paternity testing in the Yugoslav Pied cattle (YU

Simmental cattle). Czech Journal of Animal Science 55 (6) 221-226.

5. Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Radakovic Milena, Kovacevic R Sanja (2010)

Biogeographic study of the honey bee (Apis mellifera L.) from Serbia, Bosnia and

Herzegovina and Republic of Macedonia based on mitochondrial DNA analyses. Russian

Journal of Genetics 46 (5) 603-609.

6. Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, Genersch Elke, Kovacevic R Sanja,

Ljubenkovic J, Radakovic Milena, Aleksic Nevenka (2011) Dominance of Nosema

ceranae in honey bees in the Balkan countries in the absence of symptoms of colony

collapse disorder. Apidologie 41 (1) 49-58.

7. Vucicevic M, Stevanov-Pavlovic Marija, Stevanovic Jevrosima, Bosnjak Jasna, Gajic

B, Aleksic Nevenka, Stanimirovic Z (2012) Sex determination in 58 bird species and

evaluation of CHD gene as a universal molecular marker in bird sexing, Zoo Biology 32

(3) 269-276.

8. Muñoz Irene, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, De la Rúa Pilar (2012) Genetic

variation of Apis mellifera from Serbia inferred from mitochondrial analysis. Journal of

Apicultural Science 56 (1) 59-69.

9. Stevanov–Pavlovic Marija, Vucicevic Milos, Bosnjak Jasna, Stevanovic Jevrosima,

Dimitrijevic Vladimir, Resanovic Radmila, Stanimirovic Zoran (2013) Molecular sex

determination of 20 bird species protected in the Republic of Serbia. Acta Veterinaria,

63 (1) 45-51.

10. Vucicevic Milos, Stevanov-Pavlovic Marija, Stevanovic Jevrosima, Bosnjak Jasna,

Gajic Bojan, Aleksic Nevenka, Stanimirovic Zoran (2013) Sex determination in 58 bird

species and evaluation of CHD gene as a universal molecular marker in bird sexing.

Zoo Biology 32 (3) 269-276.

http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2007/0567-83150706465K.pdf

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378113507006153


http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2009/0567-83150906621S.pdf

http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0567-8315/2009/0567-83150906621S.pdf

http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/22005.pdf



http://www.springerlink.com/content/h4311415835x7276/

http://www.springerlink.com/content/h4311415835x7276/

http://www.springerlink.com/content/2446182622672332/fulltext.pdf



http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/zoo.21010/abstract


http://versita.metapress.com/content/7573k18202328075/

http://versita.metapress.com/content/7573k18202328075/

http://www.doiserbia.nb.rs/Article.aspx?id=0567-83151301045S

http://www.doiserbia.nb.rs/Article.aspx?id=0567-83151301045S




25

11. Gajic Bojan, Radulovic Zeljko, Stevanovic Jevrosima, Kulisic Zoran, Vucicevic Milos,

Simeunovic Predrag, Stanimirovic Zoran (2013) Variability of the honey bee mite

Varroa destructor in Serbia based on mtDNA analysis. Experimental and Applied

Acarology 61 (1) 97-105.

12. Stevanovic Jevrosima, Simeunovic Predrag, Gajic Bojan, Lakic Nada, Radovic Dejan,

Fries Ingemar, Stanimirovic Zoran (2013) Characteristics of Nosema ceranae infection

in Serbian honey bee colonies. Apidologie 44 (5) 522-536.

13. Bosnjak Jasna, Stevanov-Pavlovic Marija, Vucicevic Milos, Stevanovic Jevrosima,

Simeunovic Predrag, Resanovic Radmila, Stanimirovic Zoran (2013) Feasibility of

non-invasive molecular method for sexing of parrots. Pakistan Journal of Zoology 45

(3) 715-720.

14. Dimitrijevic Vladimir, Stevanovic Jevrosima, Savic Mila, Petrujkic Branko,

Simeunovic Predrag, Milosevic Ivan, Stanimirovic Zoran (2013) Validation of 10

microsatellite loci for their use in parentage verification and individual identification in

the Yugoslavian Shepherd Dog – Sharplanina, Annals of Animal Science 13 (4) 715-

722.

15. Simeunovic Predrag, Stevanovic Jevrosima, Vidanovic Dejan, Nisavic Jakov, Radovic

Dejan, Stanisic Ljubodrag, Stanimirovic Zoran (2014) A survey of deformed wing virus

and acute bee paralysis virus in honey bee colonies from Serbia using real-time RT-

PCR. Acta Veterinaria 64 (1) 81-92.

16. Glavinic Uros, Stevanovic Jevrosima, Gajic Bojan, Simeunovic Predrag, Đuric

Spomenka, Vejnovic Branislav, Stanimirovic Zoran (2014) Nosema ceranae DNA in

honey bee haemolymph and honey bee mite Varroa destructor. Acta Veterinaria 64 (3)

349-357.

17. Gajic Bojan, Bogunovic Danica, Stevanovic Jevrosima, Kulišić Zoran, Simeunovic

Predrag, Stanimirovic Zoran (2014) Canine and feline thelaziosis caused by Thelazia

callipaeda in Serbia. Acta Veterinaria 64 (4) 447-455.

18. Simeunovic Predrag, Stevanovic Jevrosima, Cirkovic Dragan, Radojicic Sonja, Lakic

Nada, Stanisic Ljubodrag, Stanimirovic Zoran (2014) Nosema ceranae and queen age

influence the reproduction and productivity of the honey bee colony. Journal of

Apicultural Research 53 (5) 545-554.

19. Davitkov Darko, Vucicevic Milos, Stevanovic Jevrosima, Krstic Vanja, Tomanovic

Snezana, Glavinic Uros, Stanimirovic Zoran (2015) Clinical babesiosis and molecular

identification of Babesia canis and Babesia gibsoni infections in dogs from Serbia.

Acta Veterinaria Hungarica 63 (2) 199–208.

20. Stevanov-Pavlović Marija, Dimitrijević Vladimir, Marić Saša, Radović Dejan,

Stevanović Jevrosima, Stanimirović Zoran (2015) Applicability assessment of a

standardized microsatellite marker set in endangered Busha cattle. Slovenian Veterinary

Research 52 (3) 133-139.

21. Özvegy József, Marinković Darko, Vučićević Miloš, Gajić Bojan, Stevanović

Jevrosima, Krnjaić Dejan, Aleksic-Kovacevic Sanja (2015) Cytological and molecular

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10493-013-9683-9

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10493-013-9683-9

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs13592-013-0203-z

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs13592-013-0203-z

../../../../../Users/User/AppData/Local/Microsoft/Windows/SCI_RADOVI_MOJI/Bosnjak_PJZ_2013.pdf

../../../../../Users/User/AppData/Local/Microsoft/Windows/SCI_RADOVI_MOJI/Bosnjak_PJZ_2013.pdf

http://www.degruyter.com/view/j/aoas.2013.13.issue-4/aoas-2013-0047/aoas-2013-0047.xml?format=INT



http://www.actaveterinaria.rs/volume/issue/14/77/655







http://www.ibra.org.uk/articles/Nosema-and-queen-age-influence-on-honey-bee-colony-productivity

http://www.ibra.org.uk/articles/Nosema-and-queen-age-influence-on-honey-bee-colony-productivity

http://www.akademiai.com/doi/abs/10.1556/AVet.2015.017?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed

http://www.akademiai.com/doi/abs/10.1556/AVet.2015.017?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed

http://www.slovetres.si/index.php/SVR/article/view/122

http://www.slovetres.si/index.php/SVR/article/view/122



26

identification of Haemogregarina stepanowi in blood samples of European pond turtle

(Emys orbicularis) from quarantine at Belgrade zoo. Acta Veterinaria 65 (4) 525-533.

22. Davitkov Darko, Vucicevic Milos, Stevanovic Jevrosima, Krstic Vanja, Slijepcevic

Dajana, Glavinic Uros, Stanimirovic Zoran (2016) Molecular detection and prevalence

of Theileria equi and Babesia caballi in horses of central Balkan. Acta Parasitologica

61 (2) 337-342.

23. Vucicevic Milos, Slijepcevic Dajana, Davitkov Darko, Avdalovic Vladimir, Aleksic

Kovacevic Sanja, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Zoran (2016) First report of

Polycystic kidney disease occurrence in Persian cats in Serbia. Veterinaria Italiana 52

(1) 51-56.

24. Stevanovic Jevrosima, Schwarz Ryan S, Vejnovic Branislav, Evans Jay D, Irwin

Rebecca E, Glavinic Uros, Stanimirovic Zoran (2016) Species-specific diagnostics of

Apis mellifera trypanosomatids: a nine-year survey (2007-2015) for trypanosomatids

and microsporidians in Serbian honey bees, Journal of Invertebrate Pathology, DOI:

10.1016/j.jip.2016.07.001

25. Radakovic Milena, Davitkov Darko, Borozan Sunčica, Stojanovic Srdjan, Stevanovic

Jevrosima, Krstic Vanja, Stanimirovic Zoran (2016) Oxidative stress and DNA damage

in horses naturally infected with Theileria equi. The Veterinary Journal 217, 112–118.

26. Stanisic Ljubodrag, Dimitrijevic Vladimir, Simeunovic Predrag, Glavinic Uros,

Jovanovic Biljana, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Zoran (2017) Assessment of 17

microsatellite loci for their use in parentage verification and individual identification in

the balkan donkey breed. Genetika-Belgrade 49 (1) DOI: 10.2298/GENSR1601009E

27. Vucicevic Milos, Vucicevic Ivana, Davitkov Darko, Davitkov Dajana, Stevanovic

Jevrosima, Resanovic Radmila, Stanimirovic Zoran (2017) Detection and analysis of

new psittacine beak and feather disease virus (PBFDv) nucleotide sequences. Journal of

the Hellenic Veterinary Medical Society, in press.

28. Davitkov Dajana, Davitkov Darko, Vucicevic Milos, Stanisic Ljubodrag, Radakovic

Milena, Glavinic Uros, Stanimirovic Zoran (2017) A molecular and hematological

study of Theileria equi in Balkan donkeys. Acta Veterinaria Hungarica 65 (2), in press.

RADOVI SA SKUPOVA

1. Stevanović Jevrosima, Maletić M, Stanimirović M, Stanimirović Z (2008) Molekularno

genetičke metode u ekologiji i menadžmentu divljači. Zbornik radova X Savetovanja iz

kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2005, Sept 1-5, pp 108-109,

Kragujevac, Srbija.

2. Muñoz Irene, Dall’Olio R, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, de la Rúa Pilar

(2009) Diversidad genetica y estructura poblacional de Apis mellifera en Europa

Oriental, Book of abstracts, Secundo Congreso de la Sociedad Espanola de Biologia

Evolutiva, Nov 29-Dec 02, pp. 78, Valencia, Spain.



http://www.degruyter.com/view/j/ap.2016.61.issue-2/ap-2016-0044/ap-2016-0044.xml

http://www.degruyter.com/view/j/ap.2016.61.issue-2/ap-2016-0044/ap-2016-0044.xml

http://www.izs.it/vet_italiana/2016/52_1/51.htm

http://www.izs.it/vet_italiana/2016/52_1/51.htm







27

3. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Radaković Milena, Maletić M, Đelić Н (2009)

Molekularno genetička identifikacija roditeljstva u analizi pedigrea životinja. Zbornik

radova XI Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2009,

Jun 19-21, pp 47-49. Subotica, Srbija.

4. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Radaković M (2009) Species identification of

Nosema microsporidian pathogen in samples of Apis mellifera from Serbia using PCR-

RFLP method, Book of Abstracts, IV Congress of the Serbian Genetic Society, June 1-

5, pp 171, Tara, Serbia.

5. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Đelić N, Radaković M (2009) Parentage

verification and sex determination in cattle using molecular markers, Book of Abstracts,

IV Congress of the Serbian Genetic Society, June 1-5, pp 156, Tara, Serbia.

6. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Radaković M (2009) Investigations of genetic

diversity of Paenibacillus larvae from Serbia using rep-PCR fingerprint technique,

Book of Abstracts, IV Congress of the Serbian Genetic Society, June 1-5, pp 141, Tara,

Serbia.

7. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z, Radaković Milena, Đelić N (2009) UtvrĎivanje

roditeljstva i pola goveda iz uzoraka biološkog materijala primenom molekulskih

markera, Zbornik predavanja sa XXX Seminara za inovacije znanja veterinara, Feb 13,

pp 47-53, Beograd, Srbija.

8. Muñoz Irene, Stevanovic Jevrosima, Stanimirovic Z, de la Rúa Pilar (2010) Molecular

analysis discriminated among Serbian ecotypes of Apis mellifera carnica. Proceedings

of the 4th European Conference of Apidology EurBee 2010. Sept 7-9, pp 132, Metu-

Ankara, Turkey.

9. Maletić M, Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z (2010) Polimorfizam laktoferin i

β4defensin gena i njihov značaj u otpornosti krava na mastitis. Zbornik radova XI

Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2010, Jun 18-20,

pp 55-56, Subotica, Srbija.

10. Vučićević M, Stevanov-Pavlović Marija, Bošnjak Jasna, Stevanović Jevrosima,

Stanimirović Z (2010) Determinacija pola ptica primenom molekularnih markera.

Zbornik radova XI Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica

Veterinaria2010, Jun 18-20, pp 53-54, Subotica, Srbija.

11. Stevanović Jevrosima, Stanimirović Z (2010) Specijska identifikacija mikrosporidija

Nosema apis/N. ceranae korišćenjem molekularnih metoda dupleks PCR i PCR-RFLP.

Zbornik radova XI Savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica

Veterinaria2010, Jun 18-20, pp 45-47, Subotica, Srbija.

12. Gajić Bojan, Radulović Željko, Stevanovic Jevrosima, Kulišić Zoran, Stanimirović

Zoran (2011) Preliminarni rezultati molekularno-genetičkih analiza varijabilnosti

mtDNK Varroa destructor u pčelinjim zajednicama na teritoriji Srbije. Zbornik

plenarnih referata i rezimea, Simpozijum entomologa Srbije 2011, Sep 21-25, p 69.

Donji Milanovac, Srbija.


28

13. Stanimirović Zoran, Stevanović Jevrosima (2012) Primena molekularno-genetičkih

analiza u veterinarskoj medicini. Zbornik predavanja sa XXXIII Seminara za inovacije

znanja veterinara, Feb 24, pp 17-33, Beograd, Srbija.

14. Vučićević Miloš, Stevanović Jevrosima, Simeunović Predrag, Vučićević Ivana, Đelić

Ninoslav, Stanimirović Zoran, Stojić Velibor (2012) Analysis of the CHD gene for sex

determination of protected bird species, Proceedings of the International symposium on

hunting »Мodern aspects of sustainable management of game population«, June 22–24,

pp. 83-86, Zemun-Belgrade, Serbia.

15. Vučićević Miloš, Stevanović Jevrosima, Vučićević Ivana, Pantelić Aleksandar, Đelić

Ninoslav, Resanović Radmila, Stanimirović Zoran (2012) Sex determination in game

birds management, Proceedings of the International symposium on hunting »Мodern

aspects of sustainable management of game population«, June 22–24, pp. 91-94,

Zemun-Belgrade, Serbia.

16. Vučićević Miloš, Stevanović Jevrosima, Stanimirović Zoran (2012) Provera uspešnosti

izolacije DNK iz različitih tkiva ptica, Zbornik radova XIV Regionalnog savetovanja iz

kliničke patologije i terapije životinja Clinica Veterinaria2012, Jun 14-16, pp. 132-133,

Subotica, Srbija.

17. Čobanović Nikola, Vučićević Miloš, Stevanović Jevrosima, Stanimirović Zoran (2012)

Uzorkovanje tkiva i izolacija DNK za molekularna ispitivanja kod gmizavaca, Zbornik

radova XIV Regionalnog savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja Clinica

Veterinaria2012, Jun 14-16, pp.130-131, Subotica, Srbija.

18. Gajić Bojan, Radulović Željko, Stevanović Jevrosima, Kulišić Zoran, Simeunović

Predrag, Stanimirović Zoran (2013) Varijabilnost mtDNK ektoparzita Varroa

destructor u Srbiji: detekcija novih haplotipova. Plenarni referati i rezimei, Simpozijum

entomologa Srbije sa meĎunarodnim učešćem 2013, 18-22. septembar 2013. pp. 31.

Tara, Srbija.

19. Stevanović Jevrosima, Munoz Irene, De la Rua Pilar, Gajić Bojan, Stanimirović Zoran

(2013) Genetički diverzitet medonosne pčele Apis mellifera u Srbiji na osnovu analize

mtDNK. Plenarni referati i rezimei, Simpozijum entomologa Srbije sa meĎunarodnim

učešćem 2013, 18-22. septembar 2013. pp. 33. Tara, Srbija.

20. Vučićević Miloš, Simeunović Predrag, Davitkov Darko, Stanišić Ljubodrag, Stevanović

Jevrosima, Stanimirović Zoran (2014) Analize DNK i RNK u funkciji detekcije i

genotipizacije patogena životinja i njihov značaj u veterinarskoj praksi. Zbornik

predavanja XVI regionalnog savetovanja iz kliničke patologije i terapije životinja

Clinica Veterinari 2014, Jun 23-25, pp. 152-159, Kopaonik, Srbija.

21. Gajić Bojan, Bogunović Danica, Stevanović Jevrosima, Kulišić Zoran, Simeunović

Predrag, Glavinić Uroš, Stanimirović Zoran (2014) Molecular identification of Thelazia

callipaeda in dogs and cats from Serbia. Book of Abstracts, V Congress of the Serbian

Genetics Society, Sept 28-Oct 2, p. 74, Kladovo, Serbia.

22. Gajic Bojan, Stevanovic Jevrosima, Radulovic Zeljko, Glavinic Uros, Kulisic Zoran,

Stanimirovic Zoran (2014) Haplotype determination of Varroa destructor mites in


29

Serbia using ARMS and RFLP methods, Book of Abstracts, Sixth European

Conference of Apidology (EURBEE6). Sept 9-11, pp. 105, Murcia, Spain.

23. Stanimirovic Zoran, Simeunovic Predrag, Stevanovic Jevrosima, Vidanovic Dejan,

Glavinic Uros (2014) Occurrence and distribution of deformed wing virus, acute bee

paralysis virus, sacbrood virus and chronic bee paralysis virus in honey bees (Apis

mellifera) in Serbia – a Real-time RT-PCR based survey, Book of abstracts, Sixth

European Conference of Apidology (EURBEE6). Sept 9-11, pp. 47, Murcia, Spain.

24. Davitkov Darko, Vučićević Miloš, Stevanović Jevrosima, Krstić Vanja, Gajić Bojan,

Glavinić Uroš, Stanimirović Zoran (2014) Značaj PCR-RFLP metode u preciznoj,

specijskoj identifikaciji uzročnika babezioze pasa (plenarni rad). Zbornik radova i

kratkih sadržaja, 25. Savetovanje veterinara Srbije, Sept 11-14, pp. 299-303, Zlatibor,

Srbija.

25. Davitkov Darko, Vučićević Milos, Stevanović Jevrosima, Krstić Vanja, Tomanović

Snežana, Glavinić Uroš, Stanimirović Zoran (2014) Molecular characterization of

Babesia canis and B. gibsoni from naturally infected dogs from Serbia. Book of

Abstracts, V Congress of the Serbian Genetics Society, Sept 28-Oct 2, p. 219,

Kladovo, Serbia.

26. Stevanov-Pavlović Marija, Dimitrijević Vladimir, Marić Saša, Stevanović Jevrosima,

Stanimirović Zoran (2014) Verification of a standardized microsatellite marker set for

paternity testing in endangered Busha cattle. Book of Abstracts, V Congress of the

Serbian Genetics Society, Sept 28-Oct 2, p. 195, Kladovo, Serbia.

27. Radaković Milena, Djelić Ninoslav, Stevanović Jevrosima, Soković Marina, Glavinić

Uroš, Van Griensven L.J.L.D., Stanimirović Zoran (2014) Evaluation of antigenotoxic

potential of Agaricus blazei extract against thymol in the Comet assay. Book of

Abstracts, V Congress of the Serbian Genetics Society, Sept 28-Oct 2, p. 156,

Kladovo, Serbia.

28. Vučićević Milos, Slijepčevic Dajana, Davitkov Darko, Stevanović Jevrosima, Krstić

Vanja, Ilić Vojislav, Stanimirović Zoran (2014) Frequency of Polycystic Kidney

Disease (PKD) in population of Persian cats from Serbia and comparison between

ultrasound diagnosis and genetic testing. Book of Abstracts, V Congress of the

Serbian Genetics Society, Sept 28-Oct 2, p. 76, Kladovo, Serbia.

29. Maletić Milan, Vakanjac Slobodanka, Djelić Ninoslav, Lakić Nada, Stevanović

Jevrosima, Glavinić Uroš, Stanimirović Zoran (2014) Association of lactoferrin gene

polymorphism with mammary gland health and production characteristics of Holstein-

Friesian cows. Book of Abstracts, V Congress of the Serbian Genetics Society, Sept 28-

Oct 2, p. 75, Kladovo, Serbia.

30. Stanimirović Zoran, Simeunović Predrag, Vučićević Miloš, Davitkov Darko, Stanišić

Ljubodrag, Maletić Milan, Gajić Bojan, Glavinić Uroš, Stevanović Jevrosima (2015)

Primena molekularno-genetičkih analiza u forenzici i dijagnostici kod domaćih

životinja i divljači. Zbornik predavanja sa XXXVI Seminara za inovacije znanja

veterinara, Feb 20, pp 137-146, Beograd, Srbija.


30

31. Stevanovic Jevrosima, Schwarz S. Ryan, Vejnovic Branislav, Evans D. Jay, Irwin E.

Rebecca, Glavinic Uros, Stanimirovic Zoran (2016) The earliest record and first report

of Lotmaria passim in Serbian honey bees. Proceedings of the Seventh European

Conference of Apidology (EURBEE7). Sept 7-9, pp. 110-111, Cluj-Napoca, Romania.

32. Stanimirović Zoran, Simeunović Predrag, Stanišić Ljubodrag, Maletić Milan,

Stevanović Jevrosima (2016) Determinacija pola kod domaćih životinja, plenarni

referat, Zbornik predavanja, 7. Naučni Simpozijum Reprodukcija domaćih životinja, 6-

9. Okt, str. 105-116, Divčibare, Srbija.

SVA NAŠA GENOMSKA ISTRAŢIVANJA PUBLIKOVANA U NAUĈNIM

RADOVIMA, KAO I SVE NOVE SEKVENCE DEPONOVANE U GENSKOJ BAZI

nalaze se na internet stranici: http://katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/index.php?option=com_content&view=article&id=4&Itemid=6

http://katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/index.php?option=com_content&view=article&id=4&Itemid=6

Analiza varijabilnosti: funkcionalna varijabilnost...

Documents

Transcript of Analiza varijabilnosti: funkcionalna varijabilnost...