Alex, Marie Edith CHIMIER

ÉCOLE NATIONALE VETERINAIRE D’ALFORT

Année 2006

CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA PREVALENCE

DE L’INFECTION A ANAPLASMA

PHAGOCYTOPHILUM DANS LA FAUNE SAUVAGE

EN FRANCE

THESE

Pour le

DOCTORAT VETERINAIRE

Présentée et soutenue publiquement devant

LA FACULTE DE MEDECINE DE CRETEIL

Le

par

Alex, Marie Edith CHIMIER Né le 13 août 1981 à Chartres (Eure-et-Loir)

JURY

Président : M. Professeur à la Faculté de Médecine de CRETEIL

Membres

Directeur : Henri-Jean BOULOUIS Professeur à l’ENVA

Assesseur : Renaud MAILLARD Maître de conférences à l’ENVA

Remerciements

A Monsieur le professeur

Professeur à la faculté de médecine de Créteil Qui m’a fait l’honneur d’accepter la présidence de mon jury de thèse Hommage respectueux

A Monsieur le professeur Henri-Jean BOULOUIS Mon directeur de thèse Pour ses conseils avisés lors de la réalisation de ce travail et son humour sans égal lors de ses cours Sincère reconnaissance

A Monsieur le Docteur Renaud MAILLARD Pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse et pour la qualité de son enseignement clinique sur les animaux de rente Profonde gratitude

A Monsieur le Docteur Guy JONCOUR

Sans toi, je n’aurais jamais choisi ce sujet pour ma thèse.

A l’irréductible Loup blanc que tu es.

Profond respect et amitiés

A la SNGTV, la FDC et les laboratoires mécènes

L’argent étant toujours le nerf de la guerre,

Sans votre soutien cette étude expérimentale n’aurait vu le jour

Remerciements sincères

A tous les enseignants de l’Ecole d’Alfort.

A tous les enseignants que j’ai eus dans ma vie (y compris mes professeurs de musique Mme Billard, M. Mounier…) Parce que vous faites un travail extraordinaire auprès de vos élèves, dans des conditions qui ne sont pas toujours idéales. Parce que vous jouez un rôle fondamental dans notre société. Profond respect et profonde reconnaissance.

Remerciements

A… -Toi, J-C,

sans qui je ne serais pas devenu ce que je suis

-Toi, Mémé,

-Vous deux, Maman et Papa,

qui m’avez toujours soutenu

- Vous, Jean-Charles et Elie,

mes deux grands frères préférés, mes complices

et Toi, Virginie, qui est venu compléter le trio avec brio !

-Vous, Jennifer et Sulyvan,

-Vous, toute ma famille : tantes, oncles, cousines, cousins,…

-Vous, tous mes amis, d’Alfort (mon groupe de clinique, celui des JMJ, la CCA, toute ma

promo) et de Province (CHL, Tibériades et les autres…)

-Vous, tous les vétérinaires et éleveurs

-Vous, enfin, toutes les bêtes et vos maîtres

Vous qui avez suscité ma vocation et sans qui, l’Art Vétérinaire ne serait rien.

A tous ceux que j’ai assistés à la naissance, que j’ai soignés, que j’ai opérés et même que j’ai

euthanasiés. A mes futurs patients et à leurs maîtres.

-Toi, celle que je ne connais pas, mais qui j’en suis sûr me comblera…

A vous tous, je dédie cette thèse. Mille mercis d’être.

Je vous aime.

1

Table des matières

Introduction .............................................................................................................................. 5

I. Une bactérie nommée Anaplasma phagocytophilum .......................................................... 7

1. Une appellation qui a varié au fil du temps.................................................................... 7

2. Les caractéristiques de la bactérie .................................................................................. 9

3. La transmission de l’agent pathogène .......................................................................... 11

4. L’étiopathogénie de l’infection .................................................................................... 17

5. Les espèces infectées.................................................................................................... 19

II. Présence de la bactérie chez le chevreuil......................................................................... 23

1. Méthodes de détection de la bactérie et/ou de son passage.......................................... 25

2. Données bibliographiques ............................................................................................ 28

3. Etude nationale SNGTV/FNC 2005-2006 ................................................................... 33

4. Discussion .................................................................................................................... 42

III. Prévalence de l’infection chez les micromammifères ................................................... 45

1. Données bibliographiques ............................................................................................ 46

2. Investigations en milieu clos : étude au Zoodyssée de Chizé ...................................... 48

3. Discussion .................................................................................................................... 53

Conclusion............................................................................................................................... 57

Bibliographie........................................................................................................................... 61

Annexes ................................................................................................................................... 67

3

Préambule

Quand je suis entré dans cette merveilleuse Ecole

d’Alfort, à vrai dire, je ne savais rien sur ce qui m’attendait, à

part que j’allais y passer un certain temps. Si j’étais convaincu

d’une chose, c’était que j’allais devenir vétérinaire. Mais de ma

future profession, je n’entrevoyais qu’un aspect : soigner des

animaux. Tout au long de ma scolarité et de mes

enseignements cliniques, j’y ai découvert un rôle et une valeur

supérieurs (à mon humble avis) : être utile à l’Homme ; c’est-à-

dire aider et accompagner maîtres et éleveurs du mieux que je

le pourrais.

« Le seul animal sauvage que je connaisse, c’est l’Homme »

Dr Michel Klein

5

Introduction

L’infection à Anaplasma phagocytophilum, ou la bactérie elle même, sont des sujets

d’intérêt (international) grandissant, comme le montrent le nombre de publications. Bien que la

bactérie soit connue depuis 1932 (GORDON et al), les études publiées dans la presse scientifique

sont rares jusqu’à l’année 1994, date à laquelle le premier cas humain est diagnostiqué. Malgré des

connaissances qui progressent, la bactérie demeure moins étudiée sur le plan de la faune sauvage,

pour des raisons d’approche évidentes. Suite à un stage effectué chez Guy JONCOUR, coordinateur

national SNGTV1 de plusieurs études sur Anaplasma phagocytophilum, il nous a été proposé de

participer à une étude de la bactérie chez les chevreuils tués lors de la saison de chasse 2005-2006.

A celle-ci s’est greffée une autre étude de prévalence chez des micromammifères à piéger dans un

parc animalier des Deux-Sèvres. Comme ce travail répondait à notre exigence de vouloir soutenir

notre thèse avant la fin de l’année 2006, c’est avec joie que nous avons accepté. Ce travail incluant

une partie expérimentale, nous a semblé plus intéressant qu’un travail bibliographique pur. Aussi,

l’objectif de ce présent document est d’approfondir les connaissances sur la présence et la

prévalence de l’infection à Anaplasma phagocytophilum dans la faune sauvage en France.

Tout d’abord, nous étudierons la bactérie en question et ses caractéristiques, ce qui nous

permettra de mieux comprendre l’infection et ses mécanismes et ainsi d’aborder plus sereinement

les deux études expérimentales qui suivent.

Ensuite, nous développerons l’étude soutenue par la SNGTV et la FNC2 sur le chevreuil, qui

correspond à une enquête sur la présence de la bactérie dans 23 départements français encore

« indemnes ». Les résultats obtenus seront comparés avec les données publiées avant d’être

discutés.

Enfin, nous présenterons la deuxième étude expérimentale, réalisée en milieu clos (parc

animalier), qui avait pour objectif de connaître la prévalence de l’infection chez les

micromammifères sauvages. En reprenant le même schéma que celui de l’étude précédente, les

résultats obtenus seront discutés à la lumière des données bibliographiques existantes.

1 Société Nationale des Groupements Techniques Vétérinaires. 2 Fédération Nationale des Chasseurs.

7

I. Une bactérie nommée Anaplasma

phagocytophilum

1. Une appellation qui a varié au fil du temps

Comme de nombreux agents infectieux, cette bactérie n’a pas toujours répondu au nom

d’Anaplasma phagocytophilum. L’excellente bibliographie et le dictionnaire de bactériologie du Pr.

EUZEBY (2005) permettent de retracer l’évolution du nom de la bactérie et de sa classification. Ces

changements ont été liés à une connaissance plus approfondie du germe.

La bactérie a été découverte en 1932, chez des ovins écossais, par GORDON et al et une

description plus détaillée sera faite en 1949. Elle est alors nommée Rickettsia phagocytophila ovis.

Plus tard, le germe est classé dans le genre Ehrlichia, et les Approved Lists of Bacterial Names

conservent la dénomination d’Ehrlichia phagocytophila même si certains l’appellent aussi

Cytoecetes phagocytophila.

Aux Etats-Unis, en 1969, GRIBBLE étudie et rapporte l’existence d’une maladie mortelle

atteignant des chevaux dans la « Sacramento Valley » en Californie. Cette maladie est causée par

une bactérie de type Ehrlichia sp. Dans sa description clinique de la maladie, GRIBBLE précise que

les symptômes sont observés au printemps et en hiver. Un diagnostic direct sur frottis sanguin

révèle la présence de morulas dans les granulocytes, ce qui amène l’auteur à appeler cette maladie

« ehrlichiose granulocytaire équine ». Bien que la taxonomie de l’agent de la maladie ne soit pas

clairement définie, LEWIS et ses collègues (1975) nomment cet agent pathogène Ehrlichia equi,

alors que les Approved Lists of Bacterial Names conservent le terme d’Ehrlichia phagocytophila

jusqu’en 1988, date à laquelle le nom donné par LEWIS est adopté.

En 1994, CHEN et al mettent en évidence chez un patient américain, atteint de troubles

respiratoires importants, une bactérie intracytoplasmique responsable de la formation de morulas

dans les granulocytes spléniques. C’est le premier cas d’ehrlichiose granulocytaire humaine (EGH).

Différentes études (dont celles de WEISBURG et al, 1991 et de SUMNER et al, 1997)

révèlent alors qu’en réalité Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi et l’agent de l’EGH sont très

ressemblants sur le plan de la génétique. Ces études ont pour support le séquençage des ARN

ribosomaux16 S des bactéries, ainsi que le séquençage de gènes possédant de nombreux allèles

(comme groESL, gltA, ou encore ankA). De plus, ces germes bactériens possèdent des

caractéristiques biologiques et étiopathogéniques qui ne sont pas tant éloignées, même si des

8

différences existent. C’est cette proximité phylogénétique qui est à l’origine de la proposition de

DUMLER et de ses collaborateurs (2001) : réorganiser la classification des genres dans les familles

des Rickettsciaceae et Anaplasmataceae. Ils proposent un système de classification taxonomique

fondé sur le séquençage des ARN ribosomaux16 S et du gène groESL. Les pourcentages

d’homologie entre Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi, l’agent de l’EGH, et les autres espèces

d’Anaplasma sont d’au moins 98,2%. Aussi, DUMLER et al proposent de regrouper ces trois

premières bactéries dans la même espèce Anaplasma phagocytophila qui deviendra Anaplasma

phagocytophilum1, tout en introduisant une notion de variants. En effet, si les trois bactéries

semblent très proches, elles ne sont pas identiques, en particulier par rapport aux espèces infectées,

à la répartition géographique et à leur pouvoir pathogène.

La classification de la bactérie semble se stabiliser suite au recours au séquençage de gènes.

Cependant une autre étude, d’INOKUMA et al (2001), remet en cause le regroupement de toutes

ces bactéries dans le genre Anaplasma. L’étude est fondée sur le niveau de similitude entre les

séquences nucléotidique de gltA de différentes Ehrlichiae, le séquençage des gènes gltA2, et le

pourcentage de G+C. Elles rappelle aussi que les tropismes des bactéries sont différents : le

« groupe Anaplasma »3 infecte de façon majoritaire les érythrocytes chez les ruminants, tandis que

l’ancien « groupe Ehrlichia » infecte des cellules de la lignée blanche.

Afin de faciliter la compréhension, nous utiliserons lorsque ce sera nécessaire, la

dénomination reprise par EUZEBY (2005) : Anaplasma phagocytophilum biovar Phagocytophilum,

Anaplasma phagocytophilum biovar Equi, Anaplasma phagocytophilum biovar EGH.

1 La terminaison a été modifiée pour des raisons de déclinaison latine. 2 Le gène gltA est responsable de la synthèse de l’enzyme citrate synthétase. 3 Le « groupe Anaplasma » contient A. marginale et A. centrale. A. marginale existe en France, en particulier chez les bovins : elle infecte les hématies, et possède le même vecteur Ixodes ricinus. C’est une infection sporadique à déclaration obligatoire en direction départementale des services vétérinaires.

9

2. Les caractéristiques de la bactérie

La bactérie est un germe intracellulaire stricte, qui infecte les cellules de la lignée

myéloblastique des mammifères. Elle affectionne tout particulièrement les granulocytes

neutrophiles et, dans une moindre mesure, les granulocytes éosinophiles. Elle n’a pas de tropisme

pour les macrophages.

L’examen au microscope optique de cellules blanches d’un animal infecté, a permis d’établir les

premières caractéristiques de ces bactéries. Ce sont des bactéries qui ne prennent pas la coloration

de Gram (dites Gram négatives). Elles sont petites et leur morphologie varie de la forme ellipsoïde

(alors appelés « corps initiaux ») à coccoïde.

Sur des lames colorées par la méthode May-Grunwald Giemsa, on observe des bactéries isolées

(« corps initiaux denses » ou « corps élémentaires ») ou regroupées sous forme d’inclusions

(appelées morula, à cause de leur ressemblance avec une petite mûre), ou encore clairsemées dans

le cytoplasme (SELLS et al, 1976), comme on peut le voir sur la figure 1.

Figure 1 : Schéma des trois répartitions possibles d’Anaplasma phagocytophilum dans les

granulocytes infectés.

La microscopie électronique a permis de préciser l’ultrastructure des bactéries. Les particules

bactériennes sont enfermées dans des vacuoles. Le diamètre des bactéries observées est en moyenne

de 0,4 à 0,5 µm. Les variations de longueur sont plus importantes, certaines bactéries mesurant plus

10

de 2 µm. C’est cette technologie qui a permis d’affirmer que les morulas observées au microscope

optique sont en réalité des agglomérations de corps élémentaires ou de corps réticulés.

Sur le plan génétique et génomique, les connaissances progressent rapidement. Le génome de la

souche HZ d’Anaplasma phagocytophilum a été séquencé entièrement. Il est constitué de 1 471 282

paires de bases, avec un pourcentage de bases G+C de 41,63%. Au total, cette souche regroupe

1409 gènes, dont 1369 gènes codants pour des protéines. (The Institute of Genomic Research, 2006)

La culture de la bactérie est réalisable, même si elle est fastidieuse (elle nécessite un laboratoire

de sécurité biologique de niveau 31 de type NSB3 et peut prendre plusieurs semaines). Anaplasma

phagocytophilum peut être cultivée in vitro dans des cellules embryonnaires d’Ixodes scapularis2 et

aussi dans des cellules de lignée HL603 (EUZEBY, 2005). Les cellules de cette lignée sont

fréquemment utilisées en recherche, car on peut orienter leur différenciation. En effet, si on les

expose à des agents inducteurs particuliers4, elles s’engagent dans la voie monocytique jusqu’à

constituer des macrophages matures. On peut aussi engager la différenciation dans la voie

granulocytaire en utilisant d’autres agents inducteurs5. Une étude américaine de HEIMER et al

(1997) a démontré la capacité d’Anaplasma phagocytophilum (biovar Equi et EGH) à pousser dans

des granulocytes matures ou immatures, mais pas dans des macrophages. Cette étude a aussi montré

que la croissance bactérienne était plus importante et plus pérenne dans les granulocytes matures

que dans les cellules immatures. Ces données de recherche fondamentale -l’infection des

granulocytes mais pas des macrophages- corroborent celles observées sur le terrain lors de cas

cliniques.

Après avoir décrit les caractéristiques biologiques d’Anaplasma phagocytophilum, attardons-

nous sur quelques aspects de sa génétique, pour essayer de comprendre les mécanismes fins de

l’étiopathogénie.

La réponse immunitaire de l’hôte vis-à-vis du germe bactérien est liée à la présence d’une

protéine majeure de membrane. Cette protéine polymorphe a un poids moléculaire d’environ 44

kDa. Une protéine semblable est présente chez tous les représentants de la famille des

1 Ces laboratoires à confinement fixé par l’arrêté du 13 août 1996 sont qualifiés de L3 ou encore NSB3. 2 Cellules IDE8. 3 Cellules humaines provenant d’une lignée de promyélocytes leucémiques. 4 Esters de phorbols ou vitamine D3. 5 Diméthylsulfoxyde, acide rétinoïque, ou encore butyrate de sodium.

11

Anaplasmataceae. Les trois gènes responsables de la synthèse de cette protéine sont : Msp21, P44,

et omp-1. Ces trois gènes ne sont pas exprimés de la même façon au sein de la famille des

Anaplasmataceae. En effet, omp-1 est codant chez Ehrlichia spp., Msp2 chez Anaplasma marginale

et P44 ou Msp2 chez Anaplasma phagocytophilum. LIN et al (2004) ont aussi démontré que le ratio

d’expression de P44 par rapport à Msp2 varie dans une même souche d’Anaplasma

phagocytophilum en fonction des différents hôtes infectés (mammifère animal, tique, homme) et de

la position géographique. Ce caractère codant ou non des gènes Msp2, P44 et omp-1 serait corrélé à

la réponse immunitaire de l’hôte. Ceci ajouté au polymorphisme génétique serait à l’origine de la

persistance de l’agent pathogène chez les hôtes (mammifères et tiques) par échappement à la

réponse immunitaire.

SCORPIO et ses collègues (2004) ont aussi démontré qu’il existe des variations dans

l’expression du gène Msp2, et cela en dehors de toute pression de sélection2. Ceci a conduit les

auteurs à proposer d’autres fonctions que l’échappement immunitaire pour Msp2. Ainsi, cette

protéine majeure interviendrait dans l’adhésion aux granulocytes3, et dans d’autres interactions avec

celui-ci, qui restent à explorer.

Attardons nous maintenant sur les modalités de transmission d’Anaplasma phagocytophilum

d’un animal à un autre.

3. La transmission de l’agent pathogène

Comme nous l’avons dit précédemment, Anaplasma phagocytophilum infecte uniquement des

cellules de la lignée blanche, et tout particulièrement des granulocytes neutrophiles. L’infection à

Anaplasma phagocytophilum est encore couramment appelée ehrlichiose, bien que le terme ne soit

plus tout à fait exact. La bactérie ne peut traverser seule la barrière cutanée, elle pénètre dans

l’organisme par le biais d’un vecteur. Actuellement, on sait que le vecteur principal est un

arthropode : la tique. On a aussi observé d’autres mécanismes de transmission de l’agent

infectieux, par exemple par des Tabanidés, mais cette transmission est beaucoup plus anecdotique.

Même si cela n’a pas été démontré formellement, on ne peut pas non plus exclure une infection

directe par l’intermédiaire de sang contaminé.

Les tiques les plus connues pour transmettre l’infection sont celles du genre Ixodes. En fonction

de la localisation géographique, les espèces varient, comme le montre le tableau 1.

1 Major surface protein. 2Ils ont comparé les bactéries issues de passages successifs - longs ou courts- sur culture cellulaire. 3 D’où sa qualification d’adhésine.

12

Tableau 1: Répartition géographique des différentes espèces de tiques vectrices d’A.

phagocytophilum.

Localisation géographique Espèce(s) concernée(s)

Europe

Ecosse, France, Suède,

Suisse…

Royaume Uni

Portugal

Autriche

• Ixodes ricinus + + + (ALBERDI et al,

1998)

• Ixodes trianguliceps (BOWN et al, 2003)

• Ixodes ventalloi (SANTOS et al, 2004)

• Dermacentor reticulatus (SIXL et al, 2003)

Tunisie Maroc • Ixodes ricinus (SARIH et al, 2005)

• Hyalomma detritum (SARIH et al, 2005)

Etats-Unis

Tout le territoire

Côte Ouest

• Ixodes scapularis+ + +(TELFORD et al,

1996)

• Ixodes pacificus+ + + (HOLDEN et al,

2003)

• Dermacentor variabilis (HOLDEN et al,

2003)

Sibérie de l’Ouest, Russie • Ixodes persulcatus (RAR et al, 2005)

Chine • Ixodes persulcatus (CAO et al, 2000)

Le cycle biologique des tiques est bien connu. Pour le décrire, nous nous appuierons sur les

descriptions faites par BUSSIERAS et CHERMETTE (1991). Nous insisterons tout

particulièrement sur le genre Ixodes, et en particulier Ixodes ricinus, principal agent de transmission

d’Anaplasma phagocytophilum.

La tique est un arthropode parasite appartenant au sous-embranchement des

CHELICERATES, au groupe des Arachnides, et à l’ordre des Acariens. Elle est classée dans le

sous-ordre des Ixodides.

Comme tout arthropode, la croissance de la tique est inféodée à différentes mues, à cause de la

cuticule rigide en chitine. On observe trois stades larvaires, séparés par deux mues, dans le cycle

évolutif du parasite : larve, nymphe puis adulte. Chaque stade est facilement distinguable à l’œil

nu, comme on peut le voir sur la figure 2.

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Figure 2 : Les différents stades de tiques

Ixodes est une tique dure1, parasite strictement hématophage à tous stades : larve, nymphe,

adulte (sauf le mâle d’Ixodes ricinus qui ne se nourrit pas). Le parasite est dit intermittent, car il

n’est fixé à son hôte que lors du repas sanguin, le reste du temps il est libre dans le milieu extérieur.

On parle de tique exophile, car lors de ce temps libre, elle se fixe à l’affût sur des végétaux. Le

genre Ixodes est télotrope2, ce qui signifie qu’habituellement, larves et nymphes se nourrissent sur

tout vertébré terrestre disponible, tandis que les adultes se nourrissent majoritairement sur des

grands mammifères.

• Fixation de la tique :

Une fois sur son hôte, la tique va se fixer dans une zone plus ou moins glabre où la peau est

fine. Ainsi elle affectionne tout particulièrement les oreilles et leur base, le pourtour des yeux, l’ars,

la région inguinale, le scrotum ou la mamelle, l’extrémité des membres. La tique se fixe alors à

l’aide de ses chélicères, avant de sécréter une salive qui pré-digère les tissus de l’hôte. Ensuite, son

hypostome pénètre dans les tissus, le rostre est alors fixé. Cette fixation est renforcée par un cément,

produit par une salive spéciale secrétée par la tique. On parle de morsure de tique. Le repas sanguin,

1 Par opposition aux tiques dites molles. 2 La plupart des Dermacentor et Hyalomma sont ditropes : larves et nymphes se nourrissent sur des petits mammifères, oiseaux ou reptiles, et les adultes se nourrissent sur des grands mammifères.

14

appelé aussi buvée sanguine s’ensuit. Il est facilité par l’injection d’une salive aux propriétés

anticoagulantes. On observe deux phases : un gorgement lent1, puis un gorgement rapide2. Après

avoir absorbé du sang, la tique concentre celui-ci et rejette dans l’hôte de la salive et des déchets

métaboliques. C’est à cette occasion que la tique peut aussi injecter des agents pathogènes

(protozoaires, bactéries, virus). Lors du repas sanguin, larves et nymphes ne prélèvent que peu de

sang, tandis que la tique femelle peut doubler de longueur et décupler son poids. La buvée sanguine

peut durer de trois à quinze jours. Chaque stade du parasite n’effectue qu’un seul et unique repas

sanguin. Si les mâles du genre Ixodes ne se nourrissent pas, des mâles d’autres genres prennent des

repas sanguins plus courts, et peuvent se nourrir plusieurs fois. Après le repas sanguin, la tique

excrète une autre salive particulière, qui va affaiblir le cément et permettre à l’acarien de quitter son

hôte.

• Description du cycle évolutif :

Le cycle d’Ixodes est triphasique, ce qui signifie que trois hôtes sont nécessaires à son bon

déroulement, comme schématisé sur la figure 3. Chaque stade ira se fixer sur un hôte différent.

1 Cette phase débute en général dans les 24 heures qui suivent la fixation. 2 Lors de cette deuxième phase, la tique peut ingérer jusqu’à plusieurs millilitres de sang.

15

L’éclosion d’un œuf de tique1 libère une larve. Cette larve grimpe sur un végétal (brin d’herbe,

petite branche…) pour s’y fixer et attendre le passage d’un vertébré (le plus souvent un

mammifère). Lorsque celui-ci vient à passer, elle se décroche de son affût et se laisse tomber sur

son hôte. Elle se fixe alors par ses pattes puis par son rostre, et prend son repas sanguin. Ce dernier

dure quelques jours, après quoi la larve se décroche et se laisse tomber sur le sol. Arrive alors la

première mue, qui la transforme en nymphe.

Cette nymphe va à son tour grimper sur une plante, attendre le passage d’un hôte favorable pour

se mettre à table, prendre son repas sanguin, se décrocher et se laisser tomber au sol. Cette fois-ci, la

deuxième mue transforme la nymphe en adulte (mâle ou femelle).

Cet adulte va lui aussi grimper au sommet d’une plante (il peut monter plus haut que les stades

précédents : jusqu’à 1m50, car il est plus fort) et attendre un dernier hôte. Lorsque celui-ci passe à

proximité, la tique se laisse tomber dessus.

1 Après une incubation durant de 2 à 36 semaines.

Source : http://www.tiques.fr

Figure 3 : cycle évolutif d’Ixodes.

16

Par le jeu des phéromones, cette tique adulte peut rencontrer un partenaire du sexe opposé pour

s’accoupler. La fécondation s’effectue le plus souvent sur l’hôte, et rarement au sol. Si c’est une

tique mâle, il ne va pas effectuer de repas sanguin. Si c’est une femelle, elle se fixe sur l’hôte pour

le dernier repas sanguin. Une fois gorgée, elle se laisse choir au sol, puis recherche un lieu sombre

et abrité pour pondre. La ponte intervient après une semaine de repos, et dure plusieurs semaines,

jusqu’à ce que mort s’ensuive pour la femelle. Les œufs, au nombre de 500 à 7000, sont enduit

d’une cire imperméable, et restent agglutinés.

Ce cycle est long (de quelques mois à trois ou quatre ans), mais les périodes de vie parasitaire

sont relativement courtes (de l’ordre de quelques semaines).

La période de plus grande activité des tiques correspond à des conditions climatiques douces

et humides. En France, on observe deux pics d’activité : au printemps et à l’automne. D’après

JONCOUR et COLLIN (2003), les tiques ne se mettent pas à l’affût au-delà de 23°C, et

l’hygrométrie minimale nécessaire est de 75%. Ceci explique que les localisations préférentielles

des tiques sont les haies, les talus, les bordures de bois et l’ombre des arbres. En dehors des

périodes d’activité, la tique reste à l’abri (sous un tas de feuilles mortes, par exemple).

• Anaplasma phagocytophilum chez la tique

Anaplasma phagocytophilum infecte uniquement des mammifères, les animaux domestiques et

sauvages servant de réservoirs de germes. La transmission de la bactérie entre les animaux

s’effectue par le biais du vecteur qu’est la tique. Chez les tiques, il n’existe pas de transmission

transovarienne de la bactérie, mais une transmission transstadiale. Pour qu’une morsure de tique

soit infectante (vis-à-vis d’Anaplasma phagocytophilum), il faut que la tique reste fixée sur son hôte

plus de 24 heures. Et le nombre de bactérie qui est inoculé est directement proportionnel à la durée

de l’attachement.

On observe, chez la tique contaminée, la multiplication de la bactérie lors de la mue larvaire et

lors des différents gorgements de la tique. Les tiques jouent donc un rôle d’amplification.

Cependant, ce ne sont pas des réservoirs, car elles ne permettent pas la survie de la bactérie (pas de

transmission transovarienne). Chez les tiques contaminées, Anaplasma phagocytophilum est

17

localisée dans les cellules de glandes salivaires. Ceci explique que la transmission de l’agent

pathogène à son hôte ne nécessite pas une fixation très longue1.

Enfin, les larves, nymphes et adultes ont une aire d’activité réduite dans l’espace, et plutôt

verticale (déplacements sur les végétaux pour se mettre à l’affût). La dissémination horizontale est

réalisée par les hôtes des tiques, et elle est restreinte au territoire vital de l’hôte dans son biotope.

Ceci explique la forte densité de tiques infestées sur les chemins ou sur les coulées de gibier.

Il convient aussi d’ajouter que les tiques peuvent transmettre conjointement d’autres agents

pathogènes. Ces germes sont alors soit d’autres bactéries (Ehrlichia chaffeensis, Borrelia

burgdorferi, Bartonella spp.,…), soit des virus (virus de la Méningo-Encéphalite à Tique,…), soit

des protozoaires (Babesia spp.,…)

4. L’étiopathogénie de l’infection

Les recherches sur les mécanismes de la pathogénie de l’infection à Anaplasma

phagocytophilum se multiplient, aussi les connaissances dans ce domaine s’affinent.

Après avoir pénétré dans l’organisme hôte, grâce au concours de la tique, la bactérie se retrouve

dans la circulation sanguine périphérique. Les germes bactériens sont alors essentiellement détectés

par les granulocytes neutrophiles. Ceux-ci, avec les monocytes macrophages, constituent les

cellules effectrices primaires des défenses antimicrobiennes : ils appartiennent à la réponse

immunitaire non spécifique. La bactérie se retrouve enfermée dans une vacuole cytoplasmique2,

suite à sa phagocytose par le granulocyte. Habituellement, cette vacuole d’endocytose est amenée à

fusionner avec les lysosomes3 du granulocyte. Or dans le cas de l’infection à Anaplasma

phagocytophilum, GOKCE et al (1999) ont démontré que cette bactérie inhibe la fusion entre le

phagosome et le lysosome. Cette inhibition est un processus bactérien actif, qui n’est pas dû à un

dysfonctionnement lysosomal. En effet, ces auteurs ont prouvé que lors d’infection, la production

d’enzymes lysosomales n’est pas affectée, et que ces enzymes fonctionnelles sont retrouvées dans le

sérum à des taux élevés. Cependant, ils ont aussi observé que cette inhibition est facilement levée

par utilisation d’oxytétracycline4. Ceci suggère qu’après son entrée dans la cellule, la bactérie libère

1 Une durée d’attachement de 30 heures en moyenne suffit pour transmettre l’infection. 2 La vacuole d’endocytose est aussi appelée « vacuole parasitophore ». 3 Ces lysosomes contiennent de nombreuses enzymes (lysozymes : protéases, défensines, et autre facteurs inducteurs de perméabilité) et agents super-oxydants (par l’activité de NADPH oxydase et myéloperoxidase), qui détruisent en général les antigènes phagocytés. 4 Cet antibiotique inhibe la synthèse de protéines bactériennes en empêchant la liaison amino-acyl ARNt à l’unité 30S des ribosomes.

18

en continu une substance inhibant la fusion phagosome-lysosome. Cette protéine peut, soit être

sécrétée, soit être un constituant de la paroi bactérienne.

D’autres fonctions des granulocytes neutrophiles se dégradent aussi. WOLDEHIWET (1987) a

démontré que dès le début de l’infection, la capacité à la phagocytose, à la diapédèse et à se

débarrasser de Staphylococcus aureus sont diminuées.

A l’abri dans sa vacuole d’endocytose, la bactérie peut alors se multiplier. Les morulas, visibles

par microscopie optique correspondent à des micro-colonies. La phase exponentielle de la

multiplication d’Anaplasma phagocytophilum débute entre 48 et 72 heures après l’entrée dans le

granulocyte neutrophile. Et le nombre maximal de bactéries est obtenu après 5 à 7 jours de culture.

Or les granulocytes neutrophiles sont des cellules à courte durée de vie normalement, et possèdent

un taux élevé d’apoptose1 spontanée. Leur durée de demi-vie dans la circulation sanguine est de 6 à

12 heures (2 à 3 jours dans les tissus). Cette durée de demi-vie peut être considérablement

augmentée in vitro (par l’usage de cytokines) et in vivo lors de l’inflammation. Ces conditions

restent tout de même peu compatibles avec la multiplication d’Anaplasma phagocytophilum. En

réalité, des études menées in vitro et in vivo (SCAIFE et al, 2003) démontrent que la bactérie

retarde l’apoptose des granulocytes neutrophiles, ce qui permet sa multiplication. L’ajout

d’oxytétracycline ne permet pas de lever ce retardement des mécanismes apoptotiques (YOSHIIE et

al, 2000), ce qui suggère que la synthèse de protéines nouvelles ou la multiplication bactérienne

n’en sont pas la cause. Cette cause serait à rechercher du côté de la pénétration de la bactérie et de

son attachement à des protéines membranaires des granulocytes. Il faut cependant préciser que

l’infection des granulocytes n’est pas indispensable pour retarder leur apoptose. Chez des bactéries

non infectantes2, YOSHIIE et al (2000) ont décelé l’existence d’une activité anti-apoptotique,

même si elle est plus faible que chez les bactéries infectantes.

Après multiplication, les bactéries sont libérées dans le compartiment extracellulaire,

vraisemblablement suite à une exocytose ou à la mort de la cellule : c’est la phase de bactériémie,

pendant laquelle on peut retrouver Anaplasma phagocytophilum dans le sérum. Si la bactérie ne

pénètre pas dans un nouveau granulocyte neutrophile dans les 3 heures, elle perd son pouvoir

infectant.

Anaplasma phagocytophilum appartient au groupe des bactéries à Gram négatif, mais

différentes études semblent montrer qu’elle ne possède pas un lipo-polysaccharide comme

Escherichia coli par exemple. Malgré tout, des protéines synthétisées par Anaplasma

1 L’apoptose correspond à un ensemble de mécanismes programmés qui aboutissent à la mort de la cellule. On parle encore de « suicide cellulaire ». 2 La bactérie perd son pouvoir pathogène en 3 heures après avoir quitté la cellule.

19

phagocytophilum, en particulier des protéines membranaires, stimulent la synthèse de cytokines

pro-inflammatoires (TNF α, IL-6,…) à l’origine des symptômes observés.

Dans de nombreux cas, l’infection à Anaplasma phagocytophilum est inapparente ou

subclinique. Dans les cas cliniques, les périodes d’incubation sont de 10 à 15 jours. Le premier

symptôme est la fièvre, de durée variable, qui s’explique par la libération de cytokines pro-

inflammatoires suite à l’infection. Lors de cette période fébrile, 90% des granulocytes observés

présentent des morulas, chiffre effondré par la suite. On observe aussi une anorexie, associée à une

perte de poids. Le malade est plus ou moins léthargique, et peut présenter des douleurs articulaires

ou musculaires et/ou des œdèmes des membres. On constate aussi chez plusieurs espèces un

syndrome pseudo-grippal, avec en particulier des difficultés respiratoires.

On observe une thrombocytopénie et une leucopénie sévère, due à une lymphocytopénie

précoce, et à une neutropénie prolongée. D’après WOLDEHIWET (1991), la lymphocytopénie

concerne les lymphocytes T1 et les lymphocytes B. Elle apparaît 6 jours après le début de

l’infection, ce qui coïncide avec la période de bactériémie. Dans son étude, on observe une

normalisation des taux de lymphocytes dans les 13 à 16 jours après l’infection. En ce qui concerne

Anaplasma phagocytophilum biovar EGH, on observe aussi une augmentation modérée des

enzymes hépatiques. Tout ceci conduit à une immunodépression favorisant les infections

concomitantes.

Les autres symptômes, spécifiques à chaque espèce, seront repris dans le paragraphe suivant.

5. Les espèces infectées

De nombreux mammifères sont sensibles à cette bactérie. Le tableau 2 fait la synthèse des

espèces affectées par les différents biovar d’Anaplasma phagocytophilum, et rappelle les différents

synonymes de la maladie. Les noms des espèces sauvages sont rapportés dans le tableau 3, avec leur

répartition géographique. Il convient de souligner que cette infection touche aussi l’homme : c’est

une zoonose, classée « mineure » par l’InVS (Institut de Veille Sanitaire Français). C’est la

découverte de cet aspect zoonotique de la maladie -particulièrement grave pour les personnes

jeunes, âgées ou immunodéprimées- qui a stimulé les recherches scientifiques concernant

Anaplasma phagocytophilum.

1 La diminution des LT concerne en particulier les CD4+ (auxiliaires), les CD8+ (cytotoxiques) et les CD5+.

20

Tableau 2 : Les différents mammifères affectés par Anaplasma phagocytophila et les synonymes de

la maladie.

Agent responsable Mammifères

affectés

Nom de la maladie

(si spécifique)

Anaplasma phagocytophilum

biovar Phagocytophilum

• Ovins

• Bovins

• Caprins

• Cervidés sauvages

• Rongeurs (Muridae)

• fièvre-à-tiques 1, Belar Joa2( ?)

• fièvre des pâturages, maladie

des gros pâturons, Ehrlichiose

granulocytaire bovine (EGB)


biovar Equi

• Equidés Ehrlichiose granulocytaire équine,

anaplasmose granulocytaire

équine


biovar EGH

• Homme

• Cervidés sauvages

• Rongeurs (Muridae)

• Cheval

• Chien

Ehrlichiose granulocytaire

humaine, anaplasmose

granulocytaire humaine

En l’état des connaissances actuelles, les principales espèces sauvages pouvant être infectées

par Anaplasma phagocytophilum sont des micromammifères rongeurs, de la famille des Muridae en

particulier et des cervidés sauvages. La notion de réservoir sera rediscutée à la fin de la troisième

partie de cette thèse.

Ajoutons qu’une espèce est qualifiée de réceptive à un agent pathogène lorsqu’elle peut être

infectée par celui-ci. Si en plus elle présente les symptômes d’une maladie suite à cette infection,

elle est qualifiée de sensible à l’agent pathogène en question.

1 De l’anglais « Tick-Born Fever ». 2 On suspecte fortement que la bactérie soit l’agent responsable de la Belar Joa (maladie basque) même si ce n’est pas encore démontré (RAZIMBAUD, 2006).

21

Tableau 3 : Répartition géographique des espèces sauvages réceptives.

Localisation Espèce de micromammifère Espèce de grand mammifère

Europe Apodemus sylvaticus

Apodemus flavicollis

Clethrionomys glareolus

Sorex araneus

Capreolus capreolus

Rupicapra rupicapra

Cervus elaphus

Etats Unis Peromyscus leucopus

Neotoma fuscipes

Tamias striatus

Clethrionomys gapperi

Odocoileus virginianus

Si le tableau clinique le plus communément observé chez les espèces sensibles est celui

décrit précédemment, on peut relever des symptômes particuliers à certaines espèces. Cette synthèse

est présentée dans le tableau 4.

Tableau 4 : Particularités cliniques chez certaines espèces.

Espèce Particularités cliniques

Bovin

(JONCOUR et

COLLIN, 2003)

- incubation de 4 à 17 jours

- fièvre élevée (39,5 à 42,0°C) à durée variable

- chute de production laitière, souvent brutale

- syndrome grippal estival

- œdème froid du tarso-métatarse (10 % des cas), et troubles locomoteurs

- avortements

- infection in utero donnant naissance à des veaux infectés

- infertilité mâle

Ovins

(RAZIMBAUD,

2006)


- fièvre élevée pouvant dépasser 41°C, durant 2 à 3 semaines

- avortements

- infertilité mâle

- porteurs plus longtemps que les bovins (jusqu’à 2 ans)

Equidés

(MADIGAN et

GRIBBLE

1987)

- incubation de 10 à 20 jours.

- fièvre de 37,8 à 41,6°C

- ataxie

- oedèmes des membres et troubles locomoteurs

22

- ictère

- pétéchies

- adénopathies

- symptômes durant 1 à 3 semaines, plus marqués chez équidés > 4 ans

Chien

(DAVOUST,

2003)

- fièvre aiguë

- apathie

- splénomégalie

- difficultés locomotrices

- diarrhée dans quelques cas

- déficit proprioceptif

- augmentation de l’activité des transaminases hépatiques

- dans des cas graves : hémorragies et état de choc

Chat

(DAVOUST,

2003)

- fièvre

- tachypnée

Homme

(BROUQUI,

2003)


- syndrome pseudo grippal estival (mai ou octobre) composé

d’arthralgies, de myalgies et de céphalées

- toux sèche (plus de 30% des patients) et pneumopathie interstitielle

(clinique et radiologique)

- éruptions érythémateuses à pustuleuses (dans 11% des cas)

- augmentation modérée des enzymes hépatiques

- durée de la maladie de quelques jours (jusqu’à 60 si pas de traitement)

Dans ce tableau 4, n’apparaissent aucune donnée clinique sur des espèces sauvages, et ce

pour des raisons d’approche évidentes. Leur mode de vie ne permet pas d’avoir autant de données

scientifiques que lors d’infection des animaux domestiques. Pourtant, la faune sauvage est aussi

parasitée par les tiques, et de ce fait par Anaplasma phagocytophilum. Nous allons donc étudier plus

en détails l’infection des animaux sauvages, ainsi que les moyens d’investigation.

23

II. Présence de la bactérie chez le chevreuil

Figure 4 : Dessin de chevreuil.

Figure 5 : Rappel sur la position taxonomique du Chevreuil.

Classe : Mammalia

Sous-classe : Theria

Ordre : Artiodactyla

Sous-ordre : Ruminantia

Famille : Cervidae

Sous-famille : Capreolinae

Genre : Capreolus

Espèce : capreolus

24

Le chevreuil (représenté sur la figure 4) est le plus petit représentant des cervidés européens,

mais fait partie en France du grand gibier. Sa position taxonomique est rappelée sur la figure 5. Il

mesure 70 cm au garrot en moyenne, pour un poids moyen de 27 kg. L’effectif national est de

l’ordre de 1.500.000 animaux, avec une progression de plus de 6 % de la population sur les 20

dernières années. A tel point que l’on observe des phénomènes de saturation dans certaines zones

géographiques. De manière globale, le chevreuil est bien réparti sur toute la France, avec des

populations très présentes au Nord-Est et au Sud-Est. Sur le plan alimentaire, le chevreuil fait partie

des herbivores sélectifs : il consomme prioritairement des végétaux ligneux et semi- ligneux (lierre,

ronces, framboisiers…). Il est plus actif à la tombée de la nuit et au lever du jour. Sur le plan de la

reproduction, le rut a lieu en fin d’été entre la mi-juillet et fin août. La gestation dure environ neuf

mois et demi avec une hypobiose de quatre mois et demi, la gestation vraie durant cinq mois. La

mise bas se produit entre le 15 mai et le 15 juin et la chevrette (figure 6) donne fréquemment

naissance à deux faons. Les chevrillards quitteront leur mère vers l’âge de 9-10 mois.

L’organisation sociale du chevreuil est centrée autour de la cellule familiale : la mère et ses jeunes

de l’année, voire des jeunes des années passées si la population est très dense. Afin de réguler les

populations, le chevreuil est soumis à un plan de chasse obligatoire (Article 17 de la loi du 29

décembre 1978 – JO du 30 décembre 1978), ce qui aboutit à un prélèvement annuel d’environ 450

000 chevreuils. C’est donc un gros gibier intéressant pour effectuer des études sur la faune sauvage,

puisqu’il est présent sur quasiment tout le territoire français, et qu’il est prélevé en nombre suffisant

et de façon contrôlée.

Avant de présenter les différentes études sur le chevreuil qui ont été réalisées, il m’a paru

important de refaire le point sur les techniques de laboratoire qui permettent de mettre en évidence

l’infection –contemporaine au prélèvement, ou passée- à Anaplasma phagocytophilum. Ces tests

présentés dans le paragraphe1.) ne sont pas spécifiques au chevreuil, mais sont utilisés pour maintes

espèces, y compris pour l’homme.

25

Figure 6 : Dessin de chevrette.

1. Méthodes de détection de la bactérie et/ou de son passage

Méthode directe1 :

-l’examen cytohématologique (nécessite de travailler avec du sang non coagulé, sang

collecté sur EDTA ou sur tube hépariné). Après réalisation d’un frottis sanguin coloré au May

Grünwald Giemsa, on peut observer la présence de morulas dans le cytoplasme des granulocytes.

La sensibilité du test est dépendante de l’opérateur, et varie au cours du temps. En effet, comme

nous l’avons dit précédemment, on observe des morulas dans 90% des granulocytes au cours du pic

d’hyperthermie, mais cette observation devient difficile dans les 3 jours après l’infection. Cette

méthode est donc recommandée dans la période fébrile (dans les 48 heures après l’infection). C’est

une méthode rapide et la moins onéreuse.

-Bactériologie par la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction). On cherche à mettre

en évidence la présence d’ADN bactérien dans du sang (Buffy-coat ou sang total) ou des tissus (rate

en particulier, ou tiques). Différentes techniques ont été mises au point. Le principe général reste

cependant le même : on extrait l’ADN du prélèvement, on amplifie la séquence d’ADN recherché

par utilisation de sondes moléculaires spécifiques, puis on révèle le produit de l’amplification. Cette

1 L’examen de laboratoire est qualifié de direct lorsque la présence de la bactérie, de ses antigènes ou de son génome sont mises en évidence.

26

technique permet la détection de très faible quantité d’agent pathogène, car l’ADN présent est

amplifié. C’est donc un test très spécifique, et avec une bonne sensibilité. On peut l’utiliser lors de

la période fébrile, jusque dans les 15 jours qui suivent l’infection si on travaille à partir du sang, et

plus longtemps si on travaille à partir d’organes. C’est une méthode rapide mais onéreuse.

-Culture cellulaire. Cette technique existe mais n’est pas utilisée en routine. En effet, la

culture est difficile à mettre en œuvre (car elle nécessite des conditions particulière, avec

notamment l’utilisation d’un laboratoire de type L3), et requiert des lignées cellulaires de type

spécialisées (par exemple, des cellules de lignée HL 60). Cette technique est donc presque

exclusivement utilisée en recherche.

Méthode indirecte1 :

-Sérologie par Immunofluorescence Indirecte (IFI) (travail sur sérum provenant de

sang prélevé sur tube sec). L’utilisation de cette technique permet de mettre en évidence le passage

de la bactérie : on recherche, dans le sérum, la présence d’anticorps dirigés spécifiquement contre

Anaplasma phagocytophilum. Cette technique nécessite un taux d’anticorps suffisamment élevé

chez l’individu. Elle donnera donc obligatoirement un résultat négatif juste après l’infection et très

longtemps après celle-ci (dans la mesure ou il n’y a pas de nouvelle inoculation). Aussi, un résultat

positif permet seulement d’affirmer que la bactérie a été présente à un moment donné dans le passé.

Par contre un résultat négatif ne permet en aucun cas d’affirmer que l’animal n’est pas infecté, ni de

certifier qu’il n’a jamais été en contact avec elle. C’est une méthode qui n’a pas un coût prohibitif,

qui nécessite un peu de temps (utilisation de réactifs successifs et de lavages avant lecture). De plus,

elle possède une bonne spécificité et sensibilité, même si inférieures à celle de la PCR.

1 L’examen de laboratoire est qualifié d’indirect lorsque l’on révèle une preuve du passage de la bactérie, mais pas la présence de cette bactérie elle-même au moment du prélèvement.

27

Tableau 5 : Comparaison des analyses de laboratoire et de leurs caractéristiques.

Méthode Prélèvement Période

d’efficacité

(après

inoculation)

Sensibilité Spécificité Durée de

l’analyse

Coût (moyennes obtenues à

partir des tarifs des

LDV 14, LDV 22 et

LDV 79)

Cyto-

hématologie

Frottis de sang frais ou

conservé sur EDTA,

frottis d’organe frais

(rate…)

J0- J4

+ ou ++ dépend de

l’opérateur (20

à 80 %)

+++

quelques minutes

Modéré

12,5 €

Sérologie

par IFI

Sérum

J20- J120

++

+++

Quelques heures à

une journée

Modéré

17,5 €

PCR

Sang, organe, tique

J0- J5

J15

+++

++++

Quelques heures à

une journée

Elévé

31,3 €

Source : d’après JONCOUR et COLLIN (2003) et comm. pers.

28

2. Données bibliographiques

Les premières études s’intéressant à la prévalence de l’infection à Anaplasma

phagocytophilum dans la faune sauvage ont eu lieu aux Etats-Unis. Ces études ont été

réalisées sur des animaux constituant le grand gibier, comme le cerf de Virginie (Odocoileus

virginianus), le wapiti (Cervus elaphus) et l’élan (Alces alces). En Suisse, LIZ et al (2000) ont

étudié l’infection chez le chevreuil (Capreolus capreolus) ou encore le chamois (Rupicapra

rupicapra). Ces espèces ont été choisies à cause de la taille de leur population, et donc du taux

de chasse élevé. Ces espèces sont aussi des réservoirs au sens épidémiologique du terme.

Ainsi, d’après le glossaire d’épidémiologie animale de TOMA et al (1991) un réservoir est

défini comme « espèce(s), milieu(x), ou mécanisme(s) permettant la survie d’un agent

pathogène considéré en tant qu’espèce ». La compétence du réservoir correspond à sa

capacité à être infecté et à retransmettre l’agent pathogène à un autre individu. Celle du

chevreuil reste encore contestée, notamment en ce qui concerne la capacité à être à l’origine

de tiques infectantes. Les partisans de cette incompétence s’appuient en particulier sur

l’incompétence du chevreuil vis à vis de la borréliose de Lyme, démontrée par JAENSON et

al (1992). Un autre argument expliquant que le chevreuil est un cul-de-sac épidémiologique,

est que cette espèce est très majoritairement infestée par des tiques adultes. Or même si

ces adultes s’infectent, ils ne le transmettront sans doute pas (une seule buvée sanguine par

stade et pas de transmission transovarienne de la bactérie). De plus WILSON et al (1990)

ont prouvé que la densité de chevreuils est corrélée positivement avec le nombre de larves et

nymphes de tiques fixées sur des micromammifères. En somme, le grand gibier ruminant (en

particulier le chevreuil), même s’il n’est pas un bon réservoir, est un animal très intéressant à

étudier sur le plan de l’infection à Anaplasma phagocytophilum, d’autant qu’il peut servir de

bio-indicateur pour l’infection humaine EGH.

BELONGIA et al (1997) ont étudié la prévalence de la bactérie chez le cerf de

Virginie, dans le Wisconsin et l’Iowa. Ils ont recherché l’agent de l’ehrlichiose granulocytaire

humaine (EGH) par technique de PCR sur sang total, et le passage d’Anaplasma

phagocytophilum biovar equi par immunofluorescence indirecte. Ils ont travaillé par IFI sur

217 sérums venant du Wisconsin (dont 30 inexploitables) et 60 sérums venant de l’Iowa. Des

anticorps étaient présents dans 14 des 187 sérums du Wisconsin, et aucun des 60 sérums

provenant de l’Iowa ne s’est révélé positif par cette même technique. La technique de PCR a

29

permis de révéler 27 sangs positifs sur 181 (15%). Ces chercheurs rapportent que Ixodes

ricinus n’est pas présente dans l’Iowa, où les animaux ont été prélevés. Ceci permis

d’expliquer l’absence de traces de la présence ou du passage d’Anaplasma phagocytophila

dans cet Etat. Par contre, ils signalent aussi que le Wisconsin correspond à une zone où ont été

diagnostiqués un certain nombre de cas humains d’EGH. Ceci permet d’insister sur le fait que

les artiodactyles grand gibier peuvent être sentinelle de l’infection humaine à Anaplasma

phagocytophilum.

Cette étude permet aussi de rappeler l’interprétation des résultats obtenus par les

techniques d’immunofluorescence indirecte sur sérum et de PCR. La première technique, IFI,

permet de mettre en évidence la présence d’anticorps IgG anti- Anaplasma phagocytophilum.

Un résultat positif signifie donc que l’organisme hôte a été infecté précédemment par cette

bactérie et que son système immunitaire a réagit en synthétisant des anticorps. Cette réponse

humorale met un certain temps à s’établir (15 jours à 3 semaines), ce qui signifie qu’un

animal contrôlé positif en IFI peut être porteur de la bactérie s’il a été infecté dans les 15

derniers jours, alors qu’il n’a pas encore fabriqué d’anticorps. Et cette réponse humorale

persiste pendant un certain temps, même après que l’organisme a éliminé la bactérie (les

anticorps sont détectables jusqu’à 4 mois après infection, chez les bovins, d’après le

laboratoire départemental d’analyse des Côtes d’Armor (LDA 22)) ce qui signifie qu’un

animal révélé positif par la technique IFI a été infecté par la bactérie dans les mois précédents.

Ce qui ne veut pas forcément dire qu’il est encore infecté : il peut avoir éliminé la bactérie

tandis que des anticorps persistent. De plus, pour que la synthèse d’anticorps anti- Anaplasma

phagocytophilum, il faut que le système immunitaire soit fonctionnel, et pas trop sollicité : les

auteurs précisent qu’une coinfection (Maladie de Lyme, babésiose,…) peut cacher la réponse

humorale.

La technique de PCR, quant à elle, met en évidence l’ADN bactérien (dans l’étude de

Belongia et al, c’est le gène codant pour l’ARN ribosomal 16 S qui était recherché), la

bactérie étant morte ou vivante. Or quand la bactérie est morte, elle est très rapidement

éliminée par l’organisme (par le système des macrophages en particulier).Un résultat positif

en PCR signifie donc que la bactérie est présente chez l’animal au moment du prélèvement,

donc que l’animal est infecté. Ici, une coinfection n’interfère pas avec l’analyse.

Cette étude, et d’autres ayant eu lieu dans le Wisconsin (MASSUNG et al en 1998, et

WILSON et al en 1990) révèlent une séroprévalence entre 8 et 60% chez les cerfs de Virginie,

et de 15 à 64 % par PCR sur sang. Une étude effectuée chez ce même gibier dans le Maryland

par WALLS et al en 1998 relève une prévalence de 25 % par IFI et 9,4 % par PCR sanguine.

30

Plus près de nous, en Europe, quelques rares études ont été effectuées. Ainsi, au

Royaume Uni, ALBERDI et al (2000), ont étudié la prévalence de l’infection chez le

chevreuil. Ils ont étudié des prélèvements de sang et de rate provenant de chevreuils tués à la

chasse. Ces auteurs ont effectué ces recherches à partir de 9 sites de prélèvements. En

moyenne, 58 % des 102 plasma ou sérums étaient positifs par IFI. Les analyses PCR ont

révélé une positivité de 38% sur 84 prélèvements de sang et 29 % sur 82 rates. Cette étude

confirme aussi la corrélation positive entre la distribution d’Anaplasma phagocytophilum dans

les populations de chevreuils et la distribution des sites ayant une haute densité de tiques

Ixodes ricinus. Les auteurs ont aussi montré que l’infection sanguine des chevreuils par la

bactérie coïncide avec l’infestation des chevreuils par les tiques, de mars à novembre.

Toujours en Europe (géographique), LIZ et ses collègues ont étudié en 2002 la

prévalence de l’infection chez le grand gibier en Suisse. Ils se sont intéressés au Chevreuil et

au Chamois. Ils ont obtenu les résultats regroupés dans le tableau 6 suivant.

Tableau 6 : Prévalence de l’infection à Anaplasma phagocytophilum chez le Chevreuil et

le Chamois en Suisse (d’après LIZ et al, 2002).

Positifs en IFI sur sérums

Positifs en PCR sur sang total

Chevreuil 60,9 % (81 / 133) 18,4 % (19 / 103)

Chamois 28,2 % (11 / 39) 0 % (0 / 24)

Les auteurs expliquent les différences de prévalences entre chamois et chevreuils par

l’altitude de leurs biotopes respectifs. En effet, en Suisse, les populations de tiques diminuent

rapidement à partir de 1000 m d’altitude, pour disparaître complètement au delà de 1500 m.

Les chamois vivent quant à eux, au dessus de 3500 m d’altitude, d’où ils descendent en hiver

pour atteindre les zones forestières au dessous de 1500 m d’altitude, et au dessous de 1800 m

d’altitude les mois d’été.

En Autriche aussi, des études sérologiques de prévalence chez le chevreuil ont été

réalisées. L’une d’elle rapporte une séroprévalence de 74% (PETROVEC et al, International

Conference on Rickettsiae and Rickettsial Disease, 2002), tandis que l’autre plus récente

31

(POLIN et al, 2004) a publié un taux de séroprévalence de 43 % (52 / 121). Ce dernier

résultat se rapproche de celui de 42 % obtenu lors d’une étude sur le chevreuil en République

Tchèque (PETROVEC et al, International Conference on Rickettsiae and Rickettsial Disease,

2002). L’étude de POLIN et al (2004), a montré aussi qu’il n’y avait pas de différence

significative entre les prévalences d’infection chez les mâles et les femelles.

Enfin, une étude française sur Anaplasma phagocytophilum a eu lieu de 1999 à 2003,

sous la houlette du vétérinaire coordinateur Guy JONCOUR, et du collectif URGTV Bretagne

(JONCOUR, 2003). Un volet de cette étude était consacré à l’infection de la faune sauvage

française par la bactérie. L’objectif de l’étude était d’acquérir de meilleures connaissances

sur cette maladie afin de lutter plus efficacement, à termes, contre l’infection chez les bovins.

Lors de sa troisième phase (de 2002 à 2003), l’étude s’est intéressée entre autres au chevreuil

qui apparaissait comme grand réservoir potentiel. Sur 103 chevreuils prélevés, 83 sérums et

53 rates associées étaient exploitables et ont été analysées. Ces prélèvements ont été effectués

du 10 novembre 2002 au 28 février 2003. Les sérums ont été testés par technique IFI

(recherche des IgG dirigées contre Anaplasma phagocytophilum), et les rates ont été

analysées par la technique de PCR.

Les résultats1 sont résumés dans le tableau 7.

Tableau 7 : Résultats des analyses effectuées sur chevreuils en Bretagne de novembre 2002 à

février 2003 (d’après JONCOUR G. 2003).

Département Positifs en IFI sur sérums

Positifs en PCR Sur rate

22 70,4 % ( 38 / 54 ) 34,2 % ( 13 / 38 )

29 ( 6 / 8 ) ( 4 / 7 )

56 81,8 % ( 18 / 22 ) ( 3 / 7 )

35 ( 1 / 1 ) ( 0 / 0 )

Total 74,1 % ( 63 / 85 ) 37,7 % ( 20 / 53 )

1 Les pourcentages apparaissant dans le tableau ne sont exprimés que lorsque les échantillons testés sont supérieurs à 10.

32

Rétrospectivement, lors de ces cinq années de l’étude (1999 à 2003), les auteurs

décrivent un total de 230 chevreuils séropositifs sur les 306 testés, ce qui correspond à une

séroprévalence de 75% (230 / 306) pour l’Ouest de la France. La troisième partie de

l’étude (novembre 2002 à février 2003) décrit une prévalence de 38 % par PCR sur rate

en Bretagne. Les taux d’infection à Anaplasma phagocytophilum observés sont plus élevés

que ceux de nos voisins suisses, anglo-saxons et américains.

En guise de synthèse, les données disponibles de prévalence de l’infection à

Anaplasma phagocytophilum chez le chevreuil sont regroupées dans le tableau 8. Il convient

de ne pas oublier que la répartition des populations de chevreuils n’est pas homogène au sein

des différents pays cités. Aussi, les valeurs chiffrées affichées dans ce tableau ne sont pas à

prendre au sens strict comme une séroprévalence nationale, mais plutôt comme des données

d’études réalisées dans ces pays respectifs. Ceci est d’autant plus vrai que le nombre d’études

de séroprévalence est plus ou moins important dans les différents pays cités.

Tableau 8 : Synthèse des séroprévalences de l’infection à Anaplasma phagocytophilum chez

les ruminants grand gibier dans différents pays (d’après WALLS et al (1998), BELONGIA et

al (1997), ALBERDI et al (2000), LIZ et al (2002), POLIN et al (2004), PETROVEC et al

(2002), JONCOUR (2003)).

Localisation Prévalence par sérologie

Prévalence par PCR

Etats Unis 8 à 60 % 9 à 64 % (sang)

Royaume Uni 58 % 38 % (sang),

29 % (rate)

Suisse 61 % 18 %

Autriche 43 % à 74 %

République Tchèque 42 %

France 75 % 38 %

33

3. Etude nationale SNGTV/FNC 2005-2006

Objectifs de l’étude :

L’objectif initial principal de l’étude était d’enquêter sur la présence ou l’absence

d’infection animale à Anaplasma phagocytophilum dans les départements de France

métropolitaine où la bactérie n’avait pas encore été détectée au 17 novembre 2005.

Cette étude avait aussi pour but de démontrer qu’un réseau d’investigation vétérinaire

étendu, de niveau national -et pluridisciplinaire- pouvait mener à terme à des études

scientifiques concernant la santé publique.

Les données de cette étude étaient aussi susceptibles d’être utilisées ultérieurement

pour la réalisation de cartes indiquant la répartition de cet agent potentiel de zoonose.

Enfin, les sérums collectés en sérothèque pourraient être utilisés pour d’autres

recherches : Pestiviroses, Coxiellose, Chlamydiose, Néosporose…

Protocole :

• Zone de l’étude : L’étude concernait un total de 23 départements de France métropolitaine à tester.

21 départements où la bactérie (ou son passage) n’a été détectée chez aucune espèce, et 2

départements où Anaplasma phagocytophilum (ou son passage) n’a été mise en évidence que

chez l’Homme. Pour plus de détails, se reporter au protocole complet de l’étude, qui figure en

annexe 1.

Le tableau 9 liste les départements à tester, tandis que la figure 7 indique les

départements où des cas d’infection à Anaplasma phagocytophilum ont été détectés au 17

novembre 2005.

34

82 48 46 05

45

90

28

59

02

51

08

10 77

62

60 27

76

61 14 50

55 54

57 67

68

71 03

21 89

58 18

63

43 42

07

30

26

84 13 83

06 04

69 38 73

74 01

36

19

87 23

81

12

15

34 31

09 66

11

17

40

64 65

47

32

33 24

16

25

52 88

70

39

29 22 56 35 53 72

41 44 49 37

85 79 86

Figure 7 : Présence d’Anaplasma phagocytophilum en France, de 1991 à novembre 2005

2, Homme 58, Bovin

12, Equin2, Ongulé sauvage

2B 2A

Côtes d’Armor :

2 premiers troupeaux

46

28 78

Source: JONCOUR G.

Légende:

(nb dépt, espèce concernée)

22, Aucune détection

80

92 95

(Paris inclus)

35

Tableau 9 : Liste des 23 départements français inclus dans l’enquête.

Code administratif Département

02 Aisne

2 A Corse du Sud

2 B Haute Corse

04 Alpes de Haute Provence

05 Hautes Alpes

07 Ardèche

10 Aube

11 Aude

16 Charente

26 Drôme

30 Gard

32 Gers

34 Hérault

37 Indre et Loire

40 Landes

48 Lozère

55 Meuse

66 Pyrénées Orientales

67 Bas Rhin

68 Haut Rhin

70 Haute Saône

92 Hauts-de-Seine

95 Val d’Oise

36

• Animaux prélevés:

Le chevreuil est connu pour être réceptif à l’infection par Anaplasma phagocytophilum,

et c’est un représentant de la faune sauvage qui est présent sur l’ensemble du territoire national

(sauf exceptions). C’est donc un des grands gibiers les plus prélevés. De plus, c’est un animal qui

possède un territoire vital relativement petit, de 1 à 2 km² (soit l’équivalent de 10 à 20 ha)

[données fournies par l’Office national de chasse et de la faune sauvage et par G. JONCOUR,

Comm. Pers.] qui est plus ou moins grand en fonction de l’environnement et de la saison, en

raison de la recherche de nourriture. En effet, en milieu forestier, le domaine vital sera petit, tandis

qu’en milieu agricole, il sera plus étendu ; et en hiver le domaine vital est plus étendu qu’en été.

Enfin, il vit souvent en sympatrie avec les ovins et les bovins, à l’herbage. Toutes ces

caractéristiques font du chevreuil (Capreolus capreolus) un animal de choix pour l’étude de la

présence d’Anaplasma phagocytophilum dans la faune sauvage française. A défaut, d’autres

artiodactyles sauvages peuvent être prélevés : le cerf élaphe (Cervus elaphus), le daim (Dama

dama), l’isard-chamois (Rupicapra rupicapra), le mouflon (Ovis sp.), le bouquetin (Capra

ibex). Ces trois dernières espèces peuvent être intéressantes, car elle vivent généralement au

dessus de 700 m d’altitude, limite supérieure de la répartition d’Ixodes ricinus. Sont inclus dans

l’étude, les artiodactyles autres que le sanglier (Sus scrofa), même exotiques, des collections

privées ou publiques.

• Moyens humains et financiers, calendrier :

Afin de mener à bien cette étude d’envergure nationale, il nous fallait nous appuyer sur

des réseaux nationaux : le réseau des vétérinaires praticiens, avec en particulier la SNGTV

(Société Nationale des Groupements Techniques Vétérinaires, qui correspond à la représentation

technique professionnelle des vétérinaires exerçant en productions animales) et la Fédération

nationale des Chasseurs et tous ses adhérents. Dans le cadre de cette collaboration, une

convention a été rédigée. Celle-ci est consultable en annexe 5. D’autres organismes nous ont

aidé, tout particulièrement l’ONCFS (Office National de la Chasse et de la Faune Sauvage). Cet

établissement public national, à caractère administratif, sous la double tutelle des ministres

chargés de la chasse et de l'agriculture, est implanté dans tous les départements métropolitains et

d'outre-mer. Il contribue à la définition, à la mise en œuvre et au contrôle des mesures de gestion,

en particulier par la chasse, destinées à préserver la faune sauvage et ses habitats et compatibles

avec les autres activités humaines. Son réseau SAGIR est le système de surveillance sanitaire de

la faune sauvage nationale. Son premier objectif est la mise en évidence des principales causes

de mortalité de la faune (épizooties, intoxications,...) afin de proposer des mesures pour les

37

éliminer ou en réduire l’impact. Il débouche sur une meilleure connaissance de la pathologie de

la faune sauvage et de son impact sur les populations.

Les prélèvements ont été acheminés vers le Laboratoire Départemental d’Analyses

vétérinaire des Cotes d’Armor (LDA 22), où ils ont été stockés et traités.

Pour plus de détails, consulter le protocole complet qui figure en annexe 1.

Le financement des analyses et autres frais inhérents à l’étude a été réalisé par la

SNGTV, la FNC/FDC ainsi que quelques laboratoires pharmaceutiques.

La durée de l’étude s’est étendue initialement sur la saison de chasse 2005/20061,

exception faite pour les prélèvements du réseau SAGIR (animaux morts, ou trouvés accidentés).

Les prélèvements ont été effectués : soit par un vétérinaire s’il était présent juste après la

mort de l’animal, ou si on lui présentait l’animal, soit par un technicien (appelé ITD2 pour

l’ONCFS ou la FNC), soit par un chasseur.

• Protocole de prélèvement :

Les prélèvements devaient être effectués le plus tôt possible après la mort de l’animal. Ils

sont indiqués par ordre d’importance dans le tableau 10.

Tableau 10 : Prélèvements demandés, conditionnements et analyses envisagées.

Conditionnement Prélèvement Destination

Tubes n° 1

et n° 2

5mL de sang total, sur tube sec

stérile

si possible, centrifuger avant

envoi au LDA22

Un tube testé en IFI pour A.

phagocytophilum,

L’autre utilisé pour des analyses

complémentaires (BVD MD,

Border D., Coxiellose,

Néosporose…)

Tube n° 3 Les tiques fixées sur l’animal,

dans tube rempli d’alcool à 70°

PCR pour rechercher

A. phagocytophilum

Tubes n° 4

et n° 5

Deux lanières de rate :

1cm x0,5cm x4cm

dans tube rempli d’alcool à 70°

Un tube testé en PCR pour

rechercher A. phagocytophilum,

l’autre tube stocké en vu d’autres

recherches

1 La période de chasse varie selon les départements. Elle se termine en général entre fin janvier et fin février. 2 Intervenant Technique Départemental.

38

Le matériel nécessaire aux prélèvements figurant dans le tableau 11, pouvait être récupéré

chez un vétérinaire, ou dans un LDA.

Tableau 11 : Matériel requis pour effectuer les prélèvements.

- 1 scalpel ou couteau de chasse, une paire de gants d’examen

- 1 à 2 seringues de 20 ml. Avec aiguille

- 2 tubes secs stériles (rouge) : sang

- 3 tubes secs préalablement remplis d’alcool à 70° : 2 lamelles de rate (1 x 0.5 x 4cm) et les

tiques présentes.

• Taille de l’échantillon :

Si l’objectif de l’étude avait été de déterminer une prévalence dans les départements

testés, la taille de l’échantillon à prélever aurait été déterminée comme suit. Tout d’abord, nous

aurions fixé une valeur de précision relative souhaitée. Afin de limiter au maximum la taille de

l’échantillon à prélever, pour des raisons financières, nous aurions choisi une précision relative

de 100 %. D’après la bibliographie, en particulier l’étude française (JONCOUR 2003), la

prévalence de l’infection à Anaplasma phagocytophilum chez le chevreuil est proche de 75 %.

L’utilisation du Tableau III.4 (p.136) du livre d’épidémiologie appliquée de TOMA et al (2001)

permet de définir une taille d’échantillon minimale de 8 individus à prélever (en considérant la

population de chevreuils infinie, le taux de sondage étant largement inférieur à 10 %), ce pour

une précision relative de 100 %.

L’objectif principal de l’étude étant de nature plus qualitative que quantitative (définir si

le département est infecté et non pas établir une prévalence), et les moyens financiers étant

limités, nous avions fixé le nombre d’échantillons à 4 animaux par départements. Afin

d’obtenir un résultat exact au sens épidémiologique, les animaux devaient être prélevés de

façon la plus homogène possible sur tout le département.

Réalisation du projet :

Une fois le projet établi, l’étude a débuté par la rédaction d’un protocole détaillé (annexe

1). Celui-ci contient des fiches qui étaient destinées aux préleveurs : une fiche de commémoratifs

(annexe 2) et une fiche de réalisation des prélèvements - avec explications pour la dissection

jugulaire et splénique - (annexe 3). Une lettre d’information destinée aux Fédérations

Départementales des Chasseurs (FDC) a également été rédigée (annexe 4). Celle-ci a été

39

distribuée par le biais de la Fédération Nationale des Chasseurs et du réseau SAGIR. De son

côté, la FNC a aussi rédigé une lettre à l’intention de ses FDC (annexe 6). Cette première phase

de travail s’est achevée début septembre 2005. A partir de là, les acteurs locaux ont reçu

l’ensemble des dossiers et informations vers la fin du même mois. Après cela, chaque FDC

sollicitée a été recontactée (par messages électroniques et téléphoniques) afin de confirmer la

bonne réception des dossiers. Cette prise de contact a aussi permis de s’assurer de la bonne

compréhension du protocole par ces acteurs locaux, et de les mobiliser à participer à notre étude,

bien que les plans de chasse soient en cours. Bien entendu, nous restions à disposition des

chasseurs, vétérinaires, ou autres interlocuteurs intéressés par l’étude, de manière à pouvoir leur

fournir des renseignements supplémentaires, de répondre à leurs interrogations ou problèmes

éventuels. Après réceptions des résultats par le laboratoire (cf. infra) les données ont été

compilées au format informatique puis discutées.

Techniques du laboratoire : Tous les prélèvements ont été traités au laboratoire départemental d’analyse des Côtes

d’Armor (LDA 22).

Les sérums ont été analysés par immuno-fluorescence indirecte. Le seuil de dilution

retenu pour la positivité était le 1/80ème. Peu de réactions croisées sont rencontrées avec la

technique utilisée. Cependant, celles-ci existent avec certaines souches d’Ehrlichia ruminantium,

mais jamais avec Ehrlichia chaffeensis, Coxiella burnetti, ni avec Chlamydophila abortus. La

technique utilisée au LDA 22 permet de détecter des anticorps jusqu’à quatre mois après

infection.

Les échantillons de rates ont été analysés par la technique de PCR. Le LDA utilise pour

cela un kit spécifique d’Anaplasma phagocytophilum, qui a été développé par la société

Adiagène® spécialement pour l’étude URGTV 1999-2003. C’est un test PCR simple, utilisant un

seul couple d’amorces issu des travaux de MASSUNG et al (1998).

Les responsables du service immunologie du LDA 22 n’ont pas fourni plus de détails,

quant aux protocoles utilisés pour ces analyses.

Un exemple de compte rendu qui nous a été envoyé par le LDA 22 est consultable en

annexe 7.

40

Résultats : Quatre départements nous ont fait parvenir des prélèvements, et ce grâce à une

excellente motivation au niveau local. Ces départements sont : l’Aube (10), la Charente (16),

les Hautes-Alpes (05) et l’Isère (38). Les prélèvements se répartissent de la façon suivante : 5

en provenance de Charente, 4 en provenance de l’Aube, 9 en provenance de l’Isère (une bonne

part provient ici du réseau SAGIR) et 5 en provenance des Hautes-Alpes. Soit un total de 23

animaux testés. L’ensemble des résultats est rapporté dans le tableau 12.

Hormis les prélèvements des Hautes-Alpes, tous les animaux qui ont été prélevés sont des

chevreuils (Capreolus capreolus), 13 adultes et 1 jeune, répartis en 5 mâles et 9 femelles -dont

une gestante-. Le sexe et l’âge des animaux n’étaient pas spécifiés pour 4 individus de ces trois

départements, ni pour les 5 individus des Hautes-Alpes. Dans ce dernier département, des

chevreuils et des chamois (Rupicapra rupicapra) ont été prélevés. Par contre, la répartition des

espèces ne figure pas dans les commémoratifs.

Dans l’Aube, tous les chevreuils (4/4) sont positifs par test sérologique sur sang (par la

technique d’immunofluorescence indirecte) et par PCR sur la rate.

En Charente, tous les chevreuils (5/5) sont positifs sur le sang (4 testés par IFI et 1 par

PCR, car le sang n’était pas centrifugeable), et 3 chevreuils sur 4 sont positifs sur rate par

PCR (1 non testé en PCR sur rate).

Dans l’Isère, tous les chevreuils testés en IFI sur sang sont positifs (2/2), et 6

chevreuils sur 9 sont positifs par PCR sur rate.

Dans les Hautes Alpes, 4 chevreuils et/ou chamois sur 4 sont négatifs en PCR sur

rate, et un test PCR sur rate (chevreuil ou chamois) est inexploitable car inhibé.

Si on ne tient pas compte des Hautes Alpes (on ne sait combien de prélèvements

proviennent de chamois et combien de chevreuils), sur l’ensemble des chevreuils testés,

100% des sérums (10/10) étaient positifs, et 78 % des rates et sang (14/18) étaient positifs en

PCR.

Parmi les chevreuils positifs en IFI sur sang, 90 % (9/10) sont aussi positifs en PCR sur

rate.

41

Tableau 12 : Résultats des analyses sur les 23 chevreuils et chamois.

Code postal Ville Lieu-dit Réception au LDA 22

le Espèce Genre IFI sur

sang PCR sur

rate PCR sur

Sang 05 19 05 2006 NT N NT 05 19 05 2006 NT N NT 05 19 05 2006 NT N NT 05 19 05 2006 NT N NT 05 19 05 2006

Chevreuil (Capreolus capreolus) ou chamois (Rupicapra

rupicapra) NT Inhibé NT

10 09 02 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) P P NT 10140 MESNIL ST PERE 09 02 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) P P NT 10200 MEURVILLE 01 02 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte P P NT

10310 CLAIRVAUX 23 01 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) M adulte 26 kg P P NT

16 11 02 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) NT NT P 16 Lumerac 12 02 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) P N NT

16250 LA TACHE La brousse 01 03 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte gestante P P NT

16330 BOIXE Maine de boixe 01 03 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte P P NT 16330 BOIXE St amant 01 03 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte P P NT

38080 St MARCEL BEL ACCUEIL Bois du Cumon 01 02 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte P P NT

38080 St MARCEL BEL ACCUEIL Bois du Cumon 01 02 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte P P NT

38114 ALLEMONT 21 04 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) M adulte NT P NT

38380 St PIERRE DE CHARTREUSE 18 05 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte NT P NT

38570 THEYS 21 04 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) M adulte NT N NT

38650 GRESSE EN VERCORS 21 04 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte NT P NT

38650 GRESSE EN VERCORS 21 04 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) M jeune NT P NT

38651 GRESSE EN VERCORS 21 04 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) M adulte NT N NT

38930 LE PERCY 21 04 2006 Chevreuil (Capreolus capreolus) F adulte NT N NT

Note : les abréviations utilisées sont les suivantes: F pour femelle, M pour mâle, P pour positif, N pour négatif et NT pour non testé.

42

4. Discussion

Tout d’abord, il nous a été nécessaire, pour mener à bien cette enquête qui s’inscrit

dans une évaluation nationale, de nous appuyer sur des structures de même échelle. En effet,

la Fédération Nationale des Chasseurs et la Société Nationale des Groupements Techniques

Vétérinaires nous ont permis, en plus de leur participation financière, de relayer l’information

auprès des hommes de terrain (vétérinaires et chasseurs). L’Office National de la Chasse et de

la Faune Sauvage nous a aussi aidé dans ce sens grâce à son réseau SAGIR.

Beaucoup de départements contactés parmi les 23 ont répondu qu’ils étaient intéressés

par cette étude, et acceptaient de participer…pour la prochaine saison de chasse (c’est à dire

2006-2007). Mais seuls quatre départements nous ont envoyé des prélèvements. En effet, le

dossier de l’étude leur est parvenu tardivement, alors que leur plan de chasse était déjà établi,

et que la majorité des réunions avec les chasseurs avait déjà été réalisée. Ceci est lié à un

contre temps afin d’obtenir tous les accords de soutien financiers. D’autre part, l’implication

des diverses structures mettait en œuvre des intervenants relativement hétérogènes en termes

d’objectifs (coordinateur SNGTV, vétérinaires membres des GTV départementaux, réseau

SAGIR, ONCFS, Pôle sanitaire de la FNC, chasseurs et FDCs). Le protocole de l’étude était

finalisé, avant l’été 2005, mais il nous aura fallu attendre le mois de Novembre pour que

soient obtenus tous les accords de participation aux frais de l’étude, et pour que tous les

protagonistes reçoivent l’information. Il est prévu que l’étude soit reconduite pour la

prochaine saison de chasse (2006-2007), sur les départements restés « indemnes ».

Comme nous l’avons évoqué dans la sous partie précédente, cette étude ne nous fourni

que des résultats qualitatifs, de présence de la bactérie dans un département. Si nous avions eu

plus de moyens financiers, il aurait été intéressant d’augmenter la taille de nos échantillons

par départements. Ce qui nous aurait permis d’établir un taux de prévalence, et de déterminer

si la prévalence était significativement différente ou non entre les différents départements.

Même si les pourcentages ne sont pas interprétables, au vu du nombre de résultats (100% de

positifs en IFI et 78 % en PCR), on peut supposer que la prévalence de l’infection chez le

chevreuils est au moins de l’ordre des 75 % trouvée dans l’Ouest (JONCOUR 2003), si on ne

tient pas compte des résultats fournis par les Hautes-Alpes (les commémoratifs ne précisent

pas si les prélèvements proviennent de chevreuils ou de chamois). L’absence de résultats

positifs dans ce département peut-être liée à l’altitude, mais c’est impossible à vérifier car

nous ne disposons pas du lieu de capture, ni de l’espèce. En effet, l’étude de LIZ et al (2003)

rapporte que le chevreuil est plus infesté par les tiques que le chamois (p<0,000001). Ces

43

mêmes auteurs ont aussi montré que les chevreuils abattus dans les régions situées en dessous

de 1000 mètres d’altitude sont significativement plus infestés par des tiques que ceux abattus

à des altitudes supérieures (p<0,015).

On peut aussi remarquer que l’utilisation des délimitations départementales pour

définir les zones étudiées n’était pas forcément la plus judicieuse. En effet, la répartition

géographique des populations de chevreuils ne correspond pas à ces délimitations

administratives. Par exemple, le département de l’Aube ne possède pas une répartition

homogène de ses chevreuils : l’ouest du département qui est une zone de plaine comporte

beaucoup moins de chevreuils que l’est qui est une zone forestière. Cependant la zone d’étude

par départements se justifie pleinement par l’objectif initialement affiché : établir le statut

épidémiologique (infecté ou non) des départements encore « indemne » de l’infection à

Anaplasma phagocytophilum.

Finalement, cette étude a tout de même permis d’approfondir la répartition de la

bactérie en France (voir la carte de présence mise à jour au 1er juin 2006 en annexe 8). Même

si la quantité de prélèvements reçus a été faible par rapport à celle escomptée, l’étude devrait

se poursuivre lors de la saison de chasse prochaine. Cette étude devrait aussi permettre de

fournir des données destinées à réaliser une localisation géographique précise des foyers

d’infections à Anaplasma phagocytophilum. C’est pour cette dernière raison, que nous avons

demandé aux préleveurs de localiser l’endroit d’abattage le plus précisément possible (nom du

lieu-dit, hameau, village, code postal : voir feuille de commémoratifs en annexe 2).

Un des intérêts de cette étude est qu’elle confirme la forte infection par Anaplasma

phagocytophilum des chevreuils en France. Or le chevreuil porte des tiques adultes le plus

souvent. Les larves et les nymphes de tiques, quant à elles, se nourrissent préférentiellement

du sang de micromammifères sauvages (rongeurs). Ces derniers sont donc de meilleurs

réservoirs, et non pas des culs-de-sac épidémiologiques. C’est une des raisons qui nous a

conduit à réaliser l’étude développée dans la partie suivante.

45

III. Prévalence de l’infection chez les

micromammifères

Figure 8 : Dessin de mulot sylvestre.

Figure 9 : Dessin de campagnol roussâtre.

Figure 10 : Rappel sur la position taxonomique des principaux micromammifères étudiés.

Mulot sylvestre

Classe : Mammalia

Ordre : Rodentia

Famille : Muridae

Genre : Apodemus

Espèce : sylvaticus

Campagnol roussâtre

Classe : Mammalia

Ordre : Rodentia

Famille : Muridae

Genre : Clethrionomys

Espèce : glareolus

46

La position taxonomique des petits mammifères recherchés, mulots sylvestres (figure 8) et

campagnol roussâtres (figure 9), a été rappelée dans la figure 10. Ceux-ci mesurent en moyenne 10

cm, queue non comprise (celle-ci est plus courte chez le campagnol). Ils habitent des milieux variés,

tels que la forêt, les sous-bois, les haies, les talus, les prairies et les jardins. Ils ont une activité

principalement nocturne. Leur régime se compose de graines (sauvages ou issues de l’agriculture),

de baies, de plantes, de fruits secs et même de vers de terre et escargots. Le domaine vital de ces

petits mammifères varie selon le couvert : il est plus restreint en forêt que dans les champs ou

prairies. En forêt, il est en moyenne de 0,2 ha pour les femelles et de 0,6 ha pour les mâles. La

densité des animaux est très variable : de 1 à 100 individus par hectare. Celle-ci est à relier à trois

facteurs essentiels : présence de nourriture, couvert végétal et pression de prédation. La période de

reproduction s’étend principalement d’avril à octobre, mais peut s’étaler sur toute l’année si le

temps est clément. La gestation dure 18 à 20 jours en moyenne, par contre, le nombre de portées et

de petits par an est variable selon les espèces (1 à 2 portées annuelles de 4 à 7 petits pour le mulot

sylvestre, 4 à 5 portées annuelles de 4 à 5 petits pour le campagnol roussâtre). Enfin, l’espérance de

vie maximale de ces animaux est de 18 mois.

1. Données bibliographiques

Les petits mammifères sauvages sont des hôtes de prédilection pour les stades immatures de

tiques (en particulier Ixodes scapularis aux Etats-Unis, et Ixodes ricinus en Europe). Ils représentent

donc des réservoirs naturels potentiels pour Anaplasma phagocytophilum.

Le nombre d’études traitant de l’infection des micromammifères sauvages par Anaplasma

phagocytophilum est relativement faible. Une des premières études dans ce sens a été effectuée aux

Etats Unis. En effet, WALLS et al (1997) ont piégé des rongeurs dans la périphérie de Minnéapolis

et St Paul afin de tester le sang et le sérum de ces animaux par rapport à la bactérie d’intérêt. Les

micromammifères récoltés appartiennent aux espèces suivantes : Peromyscus leucopus, Tamias

striatus, Clethrionomys gapperi, Blarina brevicauda, et Sorex cireneus. Ces espèces ne sont pas

présentes en Europe, mais permettent d’avoir une idée de la présence de la bactérie chez les

micromammifères sauvages. Les auteurs ont testé 190 animaux. Par la technique de PCR, 10,5%

(20 / 190) de ces animaux sont positifs. Parmi les sérums P. leucopus, 10,1% (12 / 119)

contiennent des anticorps anti-Anaplasma phagocytophilum.

Dans le Nord-Ouest du Royaume-Uni, OGDEN et al (1998) ont recherché la présence de la

bactérie chez des tiques ixodidées et des rongeurs. L’étude a montré que 20% (5 / 25) des tiques

47

Ixodes trianguliceps (adultes gorgées) prélevées sur 5 Clethrionomys glareolus et 8 Apodemus

sylvaticus étaient positives en PCR pour Anaplasma phagocytophilum. Le sang d’un Clethrionomys

glareolus était également positif (il portait une tique infectée). Par contre, aucune des 365 larves

Ixodes ricinus qui se sont gorgées avec succès sur 40 Clethrionomys glareolus et Apodemus

sylvaticus capturés, n’est devenue positive. Ceci suggère qu’aucun de ces rongeurs n’était infecté

par Anaplasma phagocytophilum.

En 2000, LIZ et al, ont étudié la prévalence de l’infection chez les petits mammifères de

différentes zones de la Suisse. Au total, 201 mammifères représentant 5 espèces ont été piégés : le

mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), le mulot à collier (Apodemus flavicollis), le campagnol

souterrain (Pitymys subterraneus), le campagnol roussâtre (Clethrionomys glareolus) et une espèce

insectivore, la musaraigne carrelet (Sorex araneus). Dans ces micromammifères, 116 possédaient

des tiques Ixodes ricinus fixées (exclusivement des larves, sauf 3 Apodemus sylvaticus avec des

nymphes). Les analyses PCR de cette étude ont permis de démontrer que la prévalence de

l’infection à Anaplasma phagocytophilum est significativement plus élevée chez Clethrionomys

glareolus (15 / 78 soit 19%) que chez Apodemus sylvaticus (2 / 48 soit 4,2 %, avec p=0,01) ou

chez Apodemus flavicollis (2 / 69 soit 2,9 %, avec p=0,001). Par l’étude de l’infection des tiques,

les auteurs ont aussi démontré que la prévalence des hôtes hébergeant des tiques infectées est

significativement supérieure chez Clethrionomys glareolus (33,3%) que chez Apodemus sylvaticus

(7,4 % ; avec p<0,05). Les auteurs ont aussi rapporté que lors d’analyses de tissus de

micromammifères par la technique de PCR, les différents organes prélevés apparaissent plus

ou moins infectés. Le sang est le moins souvent infecté (7 / 20 soit 35 % des cas), peut-être parce

que la bactériémie est brève. Par contre, la rate et les oreilles (circulation périphérique) sont les

échantillons les plus souvent infectés (14 / 20 soit 70 %). Cette constatation est à relativiser, car

les échantillons sont petits et la sensibilité de la PCR sur différents types de prélèvements est

difficilement comparable.

En France, les seules données sur des petits mammifères sauvages proviennent du volet faune

sauvage d’une étude sur l’ehrlichiose granulocytaire bovine (JONCOUR et al, 2003). Dans cette

étude, 128 mulots sylvestres (Apodemus sylvaticus) ont été piégés dans les Côtes-d’Armor et dans

le Finistère. Le sang collecté sur anticoagulant (EDTA) et les rates de 74 % de ces animaux1 (95 /

128) ont été analysés par PCR. Tous les résultats se sont révélés négatifs.

1 Les mulots ayant été parasités par des tiques ont été choisis en priorité, les micromammifères ont été répartis en lots de 5 pour l’analyse.

48

2. Investigations en milieu clos : étude au Zoodyssée de Chizé

Objectifs de l’étude :

Dans cette étude très localisée, l’objectif était de rechercher la prévalence de l’infection à

Anaplasma phagocytophilum dans la faune sauvage de proximité (petits mammifères sauvages)

sachant qu’il y avait eu des cas cliniques d’animaux dans la zone étudiée.

Protocole et résultats du piégeage :

• Zone de l’étude : Pourquoi avoir choisi le Zoodyssée, parc zoologique, comme lieu d’enquête sur la présence

d’Anaplasma phagocytophilum chez les petits mammifères sauvages?

Ce site, anciennement baptisé Zoorama, est un parc à vocation pédagogique, qui se situe au cœur

de la forêt de Chizé dans le département des Deux-Sèvres (79) (cf. site Internet :

http://www.zoodyssee.org ). Dans ce parc de 25 hectares vivent et se reproduisent près de 500

animaux appartenant à 67 espèces différentes. Les animaux présents appartiennent essentiellement à

ceux de la faune européenne (Loups, lynx, ratons laveurs, rapaces, loutres, chevreuils, cerfs,

sangliers, aurochs, bisons d’Europe, baudets du Poitou, moutons d’Ouessant…).

En février 2002, des prélèvements sanguins sont effectués dans le cadre d’une translocation de

chevreuils de la forêt de Chizé par l’ONCFS1. Les sérums obtenus sont analysés par technique IFI2

à l’AFSSA3 (LERPAS) de Nancy. 15 sérums sur 20 (75%) présentent des anticorps à Anaplasma

phagocytophilum, ce qui marque la présence de la bactérie dans cette zone géographique.

En mai 2003, un vétérinaire (Groupe vétérinaire de CHICHE / 79) établit, plus d’un an après les

résultats positifs des sérologies sur le lot de chevreuils, le premier diagnostic d’ Ehrlichiose

Granulocytaire Bovine dans le département, à Chiché.

1 Office National de la Chasse et de la Faune Sauvage. 2 Immuno Fluorescence Indirecte. 3 Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (Laboratoire d’Etude de la Rage et de Pathologie des Animaux Sauvages).

49

Le 21 avril 2005, un jeune chevreuil meurt au Zoodyssée. Le vétérinaire traitant (Dr C.

UBERTI, qui est aussi adhérent à la FDC de Charente) fait parvenir le cadavre au LDV 79 où P.

NICOLLET (docteur en médecine vétérinaire et directeur adjoint du LDV 79) diagnostique post-

mortem une entérotoxémie colibacillaire. On note la présence de tiques très nombreuses sur le corps

de l’animal. A l’autopsie, l’animal présente des lésions d’entérite, d’ascite, et une splénomégalie.

Des examens complémentaires mettent en évidence la présence de morulas dans des leucocytes

spléniques. Toutes ces informations apparaissent sur le rapport d’autopsie effectué au LDV 79,

consultable en annexe 9.

Fin avril de la même année, un jeune baudet du Poitou femelle -nommée Résine- tombe malade.

Le vétérinaire attitré aux animaux de rente domestiques, F-X MARTIN est appelé à son chevet.

Elle présente une hyperthermie ainsi qu’une asthénie et des signes d’essoufflement. Un premier

traitement antibiotique au ceftiofur (EXCENEL ND) sur quatre jours est prescrit. Au troisième jour

de traitement, l’animalier le rappelle car l’état de Résine ne s’est pas amélioré. Il lui signale alors la

mortalité récente du jeune chevreuil et les conclusions du diagnostic de laboratoire. Suspectant une

« ehrlichiose », le vétérinaire effectue les prélèvements sanguins adaptés et un traitement de

première intention. Suite à des tests sérologiques et à une PCR, le diagnostic d’infection à

Anaplasma phagocytophilum est établi. La guérison survient après le deuxième jour de traitement à

l’oxytétracycline à 10%, à la dose de 1ml par kg / j, administré par voie intraveineuse.

Le Zoodyssée apparaît donc un lieu privilégié pour l’étude de l’infection à Anaplasma

phagocytophilum, de par son biotope et son historique de cas cliniques.

• Animaux prélevés, moyens humains et calendrier :

Notre objectif, établi avec Guy JONCOUR, était de capturer une soixantaine de

micromammifères, vivant autour de deux enclos : celui des chevreuils, et celui des Baudets du

Poitou (cf. commémoratifs précédents).

Les micromammifères recherchés étaient des mulots, souris, ou campagnols. Les

musaraignes ont toutes été relâchées, à cause de leur régime insectivore bénéfique. Nous

souhaitions aussi capturer quelques mammifères de plus grosse taille (rats ou loirs, dont les

animaliers nous avaient informé de la présence). Nous voulions aussi collecter les tiques présentes

sur ces rongeurs et celles à l’affût sur les végétaux environnants.

L’ensemble du piégeage de micromammifères a été effectué lors de deux campagnes :

- du 1er au 6 novembre 2005

- du 2 au 10 avril 2006.

50

Après accord de la part de la SNGTV et FNC, une partie des fonds accordés pour l’étude

précédente a été utilisée pour couvrir les frais d’analyse de cette étude sur les micromammifères.

• Protocole de piégeage et prélèvements :

Vincent BRETAGNOLLE travaillant au CNRS-CEBAS de Chizé a mis à notre disposition

204 pièges en tôle galvanisée ou aluminium de type INRA. Dominique GUERINEAU, du

Zoodyssée nous a prêté deux pièges à loirs et nous disposions aussi de deux ratières personnelles

à trappe.

L’ensemble des pièges a été disposé autour de deux enclos: une moitié autour de l’enclos

des chevreuils, et l’autre moitié autour de l’enclos des Baudets du Poitou (se reporter à l’annexe 10

pour le plan des enclos et la répartition des pièges). Le premier enclos étant plus petit, les pièges

étaient placés tous les 2 mètres, et autour du second enclos, tous les 3 mètres. La densité des pièges

était volontairement augmentée autour des points d’affourragement des animaux.

Les pièges, appâtés avec un mélange de flocons d’avoine, de sardines en boîte de

conserves et d’huile d’arachide1, étaient tendus chaque soir, vers 17h00. L’appât n’était pas

destiné à attirer les micromammifères dans les pièges (leur curiosité suffit pour cela), mais bien à

les maintenir en vie toute la nuit2, afin de pouvoir prélever le sang le lendemain. Les pièges

n’étaient pas tendus la journée, car les rongeurs recherchés ont une activité essentiellement

nocturne. De plus, en journée, les visiteurs auraient fait fuir les micromammifères, voire déclenché

les pièges. Le lendemain matin, les pièges étaient relevés vers 9h00. L’état des pièges était noté.

Lorsque le piège contenait un rongeur, celui-ci était assommé, puis euthanasié par la technique de

dislocation cervicale. Ensuite, le sang était collecté par ponction cardiaque (environ100 à 500

µL) au moyen d’une seringue à insuline (à usage unique) et stocké dans un tube contenant de

l’EDTA3. Après dissection, chaque rate était prélevée et conservée dans un tube rempli d’alcool à

70°. Après cela, les cadavres étaient stockés individuellement au congélateur, ce qui permettait

de récolter le jour suivant les éventuelles tiques qu’ils portaient. Ces ectoparasites étaient eux aussi

conservés dans de l’alcool à 70°. L’ensemble des prélèvements était identifié de manière indélébile.

Les cadavres ont été stockés au congélateur, dans la perspective de recherches futures.

Dans le but d’effectuer des captures de tiques libres dans le milieu extérieur, nous avons

prospecté autour des enclos avec la méthode dite « du drapeau ». Cette technique consiste à

1 D’après les recommandations de M. PASCAL, section faune sauvage de l’INRA. 22 En effet, les rongeurs ont un métabolisme très actif, qui est amplifié par le stress lié à la capture. Sans l’apport énergétique de l’appât, les rongeurs sont retrouvés morts le lendemain. 3 Les tubes ont été fournis gracieusement par la société Kitvia®, le reste du petit matériel a été financé par la SNGTV et la FNC.

51

traîner un tissu blanc de type feutrine, de dimension 1mx1,5m, sur la végétation et sur le sol. Toutes

les dizaines de mètres, le tissu est retourné pour rechercher les différents stades larvaires de tiques

qui se sont fixés dessus. Les tiques ainsi récoltées devaient être conservées dans des tubes d’alcool à

70°.

• Résultats :

Les deux campagnes ont permis de capturer du sang et des rates de 62 rongeurs : 60 mulots

sylvestres (Apodemus sylvaticus) et 2 campagnols roussâtres (Clethrionomys glareolus).

Les prises étaient réparties comme suit : 31 mulots et 1 campagnol autour de l’enclos des

Baudets du Poitou, et 29 mulots et 1 campagnol autour de l’enclos des chevreuils. (Le détail des

relevés de pièges figure en annexe 11).

Les espèces non visées par le protocole initial ont été relâchées : musaraignes (Crocidura

suaveolens), oiseaux [Mésanges bleues (Parus caeruleus), Sitelles torchepot (Sitta europaea), etc]

et un crapaud commun (Buffo buffo)…

Nous n’avons pas réussi à capturer de rat [noir (Rattus rattus) ou gris (Rattus norvegicus)] ni

de loir gris (Glis glis).

Au total, 15 des rongeurs se sont révélés porteurs de tiques Ixodes ricinus de différents

stades (larves et nymphes le plus souvent, ainsi qu’une tique adulte).

Tous les essais de capture de tiques libres, par la technique dite « du drapeau », se sont

révélés infructueux.

Protocole et résultats des analyses de laboratoire :

Recherche d’ADN par la technique de PCR dans les sangs, rates et tiques.

• Le laboratoire : tous les prélèvements de cette étude ont été analysés au laboratoire

départemental vétérinaire des Deux-Sèvres (LDV 79).

• L’échantillonnage s’est effectué de la façon suivante : chaque rate a été analysée de façon

individuelle ; les sangs en trop petite quantité pour être analysés seuls ont été regroupés en lots1

(soit 9 regroupements de sangs), les autres ont été analysés de façon individuelle (31) en particulier

les sangs des deux mulots retrouvés positifs sur rate2 ; enfin les tiques ont été regroupées en lots3.

1 Ces lots sont encore appelés « pools ». 2 Ce choix a permis de ne pas perdre de sensibilité sur le test. 3 Les regroupements ont été effectués selon les recommandations du kit Adiagene®.

52

• La technique utilisée est celle de la PCR en temps réel. Dans cette technique, la quantité

d’ADN amplifiée est visualisée sur un écran au fur et à mesure, ce qui rend la quantification de

l’ADN initial possible. Le résultat positif ou négatif est donné par une valeur spécifique : le C(t) (de

l’anglais « Cycle treshold »). Cette valeur correspond au nombre de cycles de PCR nécessaires pour

atteindre un niveau de fluorescence défini par l’utilisateur. Ce niveau traduit le seuil à partir duquel

un échantillon est considéré comme positif. Donc la valeur du C(t) est inversement proportionnelle à

la charge bactérienne (plus le C(t) est faible, plus la quantité d’ADN au départ était importante).

• Le protocole : l’extraction de l’ADN à partir des prélèvements a été réalisée à l’aide du kit

QIAamp DNA mini® de l’entreprise Qiagen©. Pour plus d’informations, le protocole détaillé est

consultable sur le site http://www.qiagen.com . Le reste de la technique de PCR en temps réel

utilisé par le laboratoire départemental des Deux-Sèvres a été développé à partir de celle mise au

point par PUSTERLA et al (1999). Les amorces et la sonde PCR diffèrent légèrement, ainsi que le

protocole de thermocyclage. En effet, la dénaturation de l ‘ADN cible dure 10 minutes à 95°C.

Après cette étape, l’amplification (45 cycles) est effectuée dans les conditions suivantes : 15

secondes à 94 °C puis 1 minute à 60°C.

• Résultats : Le tableau des résultats individuels figure en annexe 12. L’ensemble des sangs

s’est révélé négatif en PCR. Deux rates de mulots ont été détectées positives individuellement en

PCR : un des prélèvements provenait de l’enclos des chevreuils et l’autre de l’enclos des baudets du

Poitou. Ces deux rates provenaient de rongeurs capturés en avril. Le seuil de positivité était

comparable au témoin positif issu du mélange des ADN des sangs du baudet et du chevreuil du

Zoodysée. Le seul lot de tiques positif contient les tiques retrouvées sur le mulot positif de

l’enclos des chevreuils. Sur l’autre mulot retrouvé positif, aucune tique n’avait été décelée. Une

synthèse des résultats est présentée dans le tableau 13 :

Tableau 13 : Résultats obtenus au Zoodyssée.

Nombre de captures

Nombre de rongeurs positifs

Enclos des chevreuils

30 (29 mulots et 1 campagnol)

1 mulot

(PCR rate + PCR tiques fixées)

Enclos des baudets

32 (31 mulots et 1 campagnol)

1 mulot

(PCR rate)

53

Ces résultats nous renseignent sur la prévalence de l’infection à Anaplasma

phagocytophilum dans la population des micromammifères. En effet, si on se réfère à la zone de

l’enclos des Baudets, on obtient une prévalence de 3,2 % (1 / 31) chez les mulots. Si on

s’intéresse uniquement à la zone de l’enclos des chevreuils, on obtient une prévalence de 3,4 % (1

/ 29) chez les mulots. En considérant les deux enclos, qui sont séparés d’environ 600 mètres (donc

pour lesquels le territoire vital des micromammifères capturés se chevauchent), on observe une

prévalence de 3,3 % chez les mulots (2 / 60). Le nombre de campagnols capturés (2) ne permet

pas de donner une prévalence de l’infection dans cette espèce.

3. Discussion

Les objectifs de notre étude ont été atteints, puisque nous projetions de capturer une soixantaine

de micromammifères, alors que nous en avons capturé 62. Cependant, une capture plus importante

de campagnols nous aurait aussi permis d’effectuer des comparaisons entre les taux de prévalences

chez différentes espèces de rongeurs (la majorité des animaux capturés étaient des mulots

sylvestres : 60 / 62) et de confirmer l’existence ou non de différences significatives. Ce choix de 60

individus à tester a été fixé en fonction des moyens financiers obtenus pour l’étude. La prévalence

attendue étant au minimum de l’ordre de 4 % (pour le mulot sylvestre, LIZ 2000), il aurait

idéalement fallu prélever 125 individus, pour obtenir une précision relative de 90 % (TOMA et al,

2001). Cela dit, la taille de notre échantillon reste de l’ordre de ceux utilisés par LIZ et al en Suisse

(2000) : ils avait capturé 78 campagnols roussâtres, 48 mulots sylvestres et 69 mulots à collier.

Notre étude fournit donc un ordre de grandeur de prévalence de l’infection chez les

micromammifères sauvages.

Sur le plan technique, le test de laboratoire que nous avons utilisé (la PCR), est celui qui fournit

actuellement les meilleures caractéristiques intrinsèques (voir tableau 5) : très bonne sensibilité et

spécificité excellente. L’ensemble des analyses a été effectué dans un seul site : le laboratoire

départemental vétérinaire des Deux Sèvres. De plus, toutes les analyses ont été effectuées en même

temps. Ceci nous garantit une bonne homogénéité des résultats. De plus, le témoin positif pour la

PCR a été développé à partir de l’ADN bactérien extrait du sang du chevreuil (mort) et du baudet

(malade) suite à une infection par Anaplasma phagocytophilum.

54

En ce qui concerne les résultats, on ne peut pas dire que ceux-ci soient exacts au sens

épidémiologique du terme. En effet, le choix des micromammifères parmi l’ensemble de la

population n’est pas complètement aléatoire, car nous nous sommes focalisés sur les enclos des

chevreuils et des Baudets du Poitou.

La prévalence de l’infection à Anaplasma phagocytophilum observée chez les mulots du

Zoodysée est donc de 3,3 %. Cette valeur est proche de celle obtenue chez nos homologues

helvétiques (4,2% ; LIZ et al en 2000). Notre étude s’est déroulée dans un lieu où la présence de la

bactérie était connue depuis peu, tout comme l’étude suisse a été réalisée dans des régions où l’EGB

était enzootique. Il serait intéressant que d’autres études françaises confirment ces résultats. Nous

n’avons capturé que 2 campagnols roussâtres, ce qui ne permet pas de tirer de conclusions quant à

la prévalence de l’infection dans cette espèce. Mais on peut supposer que nous aurions obtenu une

prévalence plus élevée. En effet, LIZ et al (2000) ont démontré que la prévalence de l’infection à

Anaplasma phagocytophilum chez le campagnol roussâtre est significativement plus élevée que la

prévalence chez le mulot sylvestre (avec p=0,01).

Un deuxième point intéressant à souligner est que toutes les PCR effectuées sur les sangs des

micromammifères se sont révélées négatives, tandis que deux PCR de rates sur ces mêmes animaux

se sont révélées positives. Ceci est en faveur d’une bactériémie très rapide et/ou d’un portage

chronique de la bactérie dans la rate. Il eût été intéressant d’avoir aussi les sérologies de ces

mulots, afin de savoir s’ils possédaient ou non des anticorps IgG anti-Anaplasma phagocytophilum.

Cette constatation confirme celle de LIZ et al en Suisse : les auteurs avaient décrit que les

prélèvements de sang étaient moins souvent infectés que les prélèvements de rates ou d’oreilles par

la technique de la PCR. De même, nous aurions pu analyser les oreilles de nos mulots positifs afin

de voir si la bactérie était aussi retrouvée dans le sang périphérique. En effet, les tiques positives

récoltées sur un des mulots positifs ont été infectées de deux façons possibles : soit en se gorgeant

sur ce mulot (ce qui implique que la bactérie était présente dans le sang périphérique), soit elles

étaient infectées au stade précédent (ce sont alors des nymphes ou adultes).

Dans le cadre d’une recherche par PCR d’Anaplasma phagocytophilum chez des

micromammifères sauvages, il est donc préférable de prélever en priorité la rate et une oreille,

organes dans lesquels on retrouve le plus d’ADN bactérien.

Il est admis que les mulots et campagnols sont d’importants hôtes pour les larves et dans une

moindre mesure, nymphes d’Ixodes ricinus. Il est aussi rapporté que les micromammifères

n’hébergent que très rarement des adultes de tiques. Or dans notre étude, nous avons récolté

sensiblement le même nombre de nymphes et de larves d’Ixodes ricinus. Nous avons aussi prélevé

une tique adulte (femelle gorgée) fixée au niveau de la tête d’un mulot, entre l’œil et la base de

55

l’oreille droite. G. Joncour a fait ce type d’observation à 4 reprises pour 132 mulots capturés en

2003 (Comm. Pers.).

Ce travail de recherche sur l’étude d’ Anaplasma phagocytophilum dans la faune sauvage en

France, nous a permis d’explorer différents aspects de l’infection. Ainsi, la première étude sur les

chevreuils répondait à une démarche qualitative : nous souhaitions savoir si la bactérie était présente

ou non dans des départements où sa présence n’avait jamais été mise en évidence. La deuxième

étude, qui a été réalisée dans un milieu où la présence de la bactérie était connue, relevait d’une

démarche de quantification : nous souhaitions connaître la prévalence de la bactérie chez les

micromammifères. A ce stade, il nous a semblé important de réaliser une synthèse sur la notion de

réservoir et de sentinelle ou bio-indicateur.

La définition de réservoir (préalablement citée dans la deuxième partie de cette thèse1) nous

permet d’affirmer que les tiques ne sont pas des réservoirs, car l’absence de transmission

transovarienne empêche toute survie de la bactérie au delà du stade adulte. Ceci explique le faible

taux (quelques pourcents) de tiques porteuses.

Les micromammifères, par contre, sont des hôtes importants de la bactérie et permettent sa

survie. Comme l’ont démontré plusieurs études, ce sont des réservoirs naturels à Anaplasma

phagocytophilum. La faible prévalence rencontrée chez ces animaux s’explique par le faible taux

de tiques porteuses et par le fait que les tiques qui s’y fixent sont majoritairement des larves (donc

non infectées, car il n’y a pas de transmission transovarienne) voire des nymphes. Parmi ces

micromammifères, certaines espèces apparaissent de meilleurs réservoirs que d’autres, car plus

infectées (exemple : Clethrionomys glareolus vs Apodemus sylvaticus). Il se peut très bien que

d’autres petits mammifères participent à la survie de la bactérie dans l’environnement, mais ne

soient pas encore connus comme tels.

1 Cf. page 30

56

Enfin, les cervidés sauvages (en particulier le chevreuil) sont souvent cités comme réservoirs,

comme nous l’avons vu précédemment. Or, ce terme est inapproprié dans le cas précis. En effet,

les chevreuils et autres cervidés sont essentiellement parasités par des tiques de stade adulte, moins

souvent par des nymphes. La bactérie peut donc se multiplier chez son hôte, mais celui ci restera un

cul-de-sac épidémiologique pour elle, car les tiques adultes meurent après leur unique buvée

sanguine. Pour citer ARTOIS et al (2003), « le chevreuil ne joue pas de rôle épidémiologique dans

le cycle de transmission, il est victime mais pas vecteur, ni réservoir d’infection ; sa place dans le

cycle épidémiologique est identique à celle de l’homme ». Ces auteurs, comme G. JONCOUR

(Comm. Pers.), ajoutent que si un marqueur d’infection existe (anticorps, ou détection de l’ADN

bactérien par PCR), le chevreuil peut être utilisé comme traceur du risque infectieux. Il est alors

qualifié de sentinelle ou bio-indicateur vis-à-vis d’autres espèces, comme l’homme ou le bovin.

La prévalence de l’infection chez le chevreuil est alors un « indicateur de l’exposition dont la

localisation géographique précise permet l’analyse géographique et temporelle du risque

infectieux », toujours d’après les mêmes auteurs. Le chevreuil est une sentinelle d’autant plus

intéressante que TATE et al (2005) ont montré que l’exposition répétée de cet animal à la bactérie

induit une réponse sérologique relativement longue. La réalisation de cartes géographiques de la

prévalence de l’infection à Anaplasma phagocytophilum serait donc un outil de santé publique à

développer.

57

Conclusion

Nous avons d’abord étudié les différentes caractéristiques d’Anaplasma phagocytophilum. Cette

bactérie, transmise par les tiques, infecte les granulocytes neutrophiles et provoque ainsi une

dépression immunitaire. Puis nous nous sommes penchés sur ses hôtes de prédilection naturels.

Pour cela, nous avons d’abord réalisé une étude visant la mise en évidence de l’infection chez des

ruminants sauvages (essentiellement des chevreuils) tués lors de la saison de chasse 2005/2006.

Cette étude soutenue par la SNGTV et la FNC a été réalisée dans les départements français qui

n’étaient pas encore connus pour « héberger » de cette bactérie. Sur les 4 départements nous ayant

fourni des prélèvements (Aube, Charente, Isère, Hautes-Alpes), les trois premiers se sont révélés

infectés par la bactérie (grâce à des tests IFI et PCR), tandis que le dernier n’a pas fourni de résultat

positif. La deuxième étude expérimentale, quant à elle, s’est intéressée à la prévalence de l’infection

chez des micromammifères sauvages (mulots, campagnols) présents dans un parc animalier des

Deux-Sèvres. En ce lieu, la présence de cette bactérie avait été mise en évidence par PCR suite à la

découverte d’un jeune chevreuil mort puis d’un baudet du Poitou atteint d’ « ehrlichiose ». Nous y

avons capturé 62 rongeurs (dont 60 mulots). Les rates de 2 de ces mulots se sont révélées positives.

La prévalence est donc de 3,3 % dans cette espèce, ce qui confirme les données observées en Suisse

dans des zones où l’ehrlichiose granulocytaire bovine est enzootique. L’ensemble de ce travail nous

a permis de nous familiariser avec l’épidémiologie, les protocoles de terrain, les contacts avec

diverses catégories socio- professionnelles, dont les vétérinaires de laboratoire et de terrain.

Il nous a aussi permis d’insister encore une fois sur le rôle de réservoir et de sentinelle que

peuvent jouer certaines espèces sauvages, de la place des vétérinaires travaillant en réseaux, en

équipes multidisciplinaires, quand il s’agit d’améliorer des connaissances en santé animale et

publique : l’infection à Anaplasma phagocytophilum est en effet une zoonose. Cette bactérie a été

décelée dans 77 départements de France métropolitaine. Aussi, il paraît essentiel de sensibiliser la

population sur la possibilité d’infection humaine, notamment dans biotopes favorables aux tiques.

Les tiques peuvent aussi transmettre d’autres maladies à l’homme (comme la borréliose de Lyme, la

Méningo-encéphalite à tiques,…). Et comme le dit si bien l’adage latin « bis repetita placent », on

peut donc réitérer des conseils simples de prévention vis-à-vis des tiques. Ces conseils sont

rapportés sur la page suivante.

59

Conduite à tenir afin d’éviter les morsures de tiques et les

maladies transmises par celles-ci :

Si possible, porter des vêtements longs lors de sorties en forêt pendant la période d’activité maximale des tiques (printemps et automne).

Pour les travailleurs exposés et les chasseurs, mettre des guêtres.

Après une sortie en forêt, inspecter son corps, celui de son(ses) enfant(s) et de son(ses) chien(s) en recherchant d’éventuelles tiques.

En cas de morsure de tique : 1-retirer la tique (de préférence avec un instrument de type Tire

Tic® ou O’Tom®, voire avec une pince à épiler. Il faut attraper

le corps de la tique sans le presser trop fort, puis tourner dans le

sens inverse des aiguilles d’une montre : la tique se « dévisse ».

Ne pas utiliser d’éther ou autre produit qui stresse la tique, et

favorise le relarguage d’agent infectieux)

2-désinfecter avec de l’alcool à 70°

3-noter la date du retrait de la tique (à communiquer à votre

médecin si une consultation s’ensuit)

4-surveiller des symptômes éventuels dans les 10 jours suivants :

« auréole rouge autour du point de morsure », fièvre, voire

syndrome grippal. Dès le moindre symptôme, consulter votre

médecin.

61

Bibliographie

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67

Annexes

69

Annexe 1 : Protocole détaillé de l’étude SNGTV/FNC PROTOCOLE d’enquête sur la prévalence nationale de l’ehrlichiose granulocytaire bovine

(EGB) dans 23 départements français : par sérologie et/ou PCR sur prélèvements sanguins et

rate de petits ruminants sauvages.

L’ehrlichiose granulocytaire bovine à Anaplasma phagocytophilum est une zoonose émergente, infectieuse, inoculable, non contagieuse évoluant sous forme aiguë ou inapparente et selon un tableau épidémiologique sporadique ou anadémique, en foyers. Les troupeaux affectés exploitent des biotopes favorables à Ixodes ricinus. Largement méconnue, sous-évaluée et sous-diagnostiquée en France, sa méconnaissance, en « humaine », est comparable à celle constatée chez les vétérinaires. Ce réseau sanitaire a pourtant bénéficié d’informations larges depuis 1999 (URGTVB-SNGTV). La vache est une espèce sentinelle pour l'homme, en terme d’EGB : par visualisation biologique de la présence (effective ou récemment passée) d’une rickettsie, Anaplasma phagocytophilum dans les foyers identifiés, petite bactérie intracellulaire stricte, pathogène et très ubiquiste.Tout comme son vecteur biologique principal et réservoir, une tique du genre Ixodes ricinus est susceptible de parasiter un grand nombre d’espèces. Les révélateurs sont l’ examen clinique, la cyto-hématologie, la sérologie spécifique par IfI ou la PCR. L’étude épidémiologique 1999-2003 réalisée par l’Union Régionale des Groupements Techniques Vétérinaires de Bretagne (URGTV B) a mis en évidence le rôle important joué par le chevreuil (Capreolus capreolus) dans cette entité pathologique. Sinon en termes de réservoir ou de vecteur biologique. Plutôt en tant qu’espèce-hôte permanent et véhicule de dissémination passive des tiques : elles, vecteurs actifs et réservoirs de l’agent pathogène étudié (seules les larves et nymphes gorgées, tout comme les femelles I. ricinus non gorgées sont des stases « infectantes » : il n’y a pas de transmission trans-ovarienne). Le volet Faune Sauvage de cette étude a conclu à des séroprévalences positives de 70 à 75%, spécifiques "A. phagoytophilum" par Immunofluorescence Indirecte (IfI) -et pour 400 animaux testés-, de 1999 à 2003. Ce pourcentage régional est confirmé au niveau national. Le chevreuil espèce commensale des animaux de rente, en contact permanent avec ces ectoparasites, peut être une sentinelle pour la vache. Cette espèce sauvage, de répartition géographique étendue sur tout le territoire national, en expansion et dont le petit territoire vital moyen peut être estimé à 1 km2 constitue un cul de sac épidémiologique pour le « parasite » (tout comme en termes de borréliose de Lyme Bibliographie). Il ne joue pas un rôle de vecteur de la maladie mais peut « servir » de révélateur biologique d’utilisation aisée.

L’étude URGTV B, initiée par les vétérinaires de terrain, dans l’Ouest, a permis de localiser (1999-2005), par extension, 74 départements où une « trace » biologique de l’agent pathogène a pu être visualisée, et grâce aux Laboratoires de développement et d’analyses Départementaux (LDA22, surtout, LDA14, LDV54 et LDV79). Elle se prolonge actuellement (2005) par une enquête nationale sur cas cliniques confirmés par le laboratoire de diagnostic de référence, le Laboratoire de Développement et d’Analyses des Côtes d’Armor (LDA22). Sous l’égide de la Société Nationale des GTV (SNGTV) : ces investigations démontrent l’efficacité de ces réseaux conduits par un comité scientifique de pilotage pluridisciplinaire associant, en particulier, des vétérinaires et des médecins. En effet, l’EGB est une zoonose infectieuse, mais non contagieuse, de mammifère à mammifère.

70

Principe :

Il nous paraît pertinent, opportun et intéressant d’utiliser, en priorité, cette espèce en tant qu’indicateur

biologique de présence, dans le cadre du prolongement de l’enquête de prévalence qualitative nationale,

dans les Départements français où la présence d’ A. phagocytophilum n’a pas encore été prouvée. D’autres

biotopes peuvent être aussi étudiés grâce à d’autres espèces plus spécifiques de ces milieux.

En effet,

• la séropositivité (IFI), associée à une PCR positive sur buffy coat et sur les tiques (I. ricinus) prélevés sur une chevrette accidentée (Plourin-les-Morlaix, 29N, août 2000) a permis d’identifier la présence en FINISTERE (29), près de deux ans (juin 2002) avant la découverte de foyers sur bovins d’élevage. En décembre 2001, un Cerf élaphe (Cervus elaphus) sur 9, en ranching (Guerlesquin-29) s’est révélé positif.

• En décembre 2001, 20 sérums sur 20 chevreuils prélevés en 4 massifs distincts d’ ILLE-ET-VILAINE (35) sont positifs en IFI. En février 2002, 6 cerfs en ranching, d’un lot de 10 étaient aussi positifs, en lisière de Forêt de Paimpont. Le premier diagnostic sur bovin date d’avril 2002.

• De même, les DEUX-SEVRES (79) ont été déclarés « infectés » grâce à des sérologies positives sur chevreuils de translocation (ONCFS-LERPAS, Forêt de C.) en février 2002 , un an avant l’identification d’un foyer bovin à Chiché, en 2003.

• En MARNE (51), 30 sangs positifs en IFI dans un lot de 40 chevreuils de translocation (ONCFS, « Réserve de Trois Fontaines ») ont permis d’en prouver la présence (février 2002). A février 2004, il n’a pas encore été possible d’identifier la rickettsie chez d’autres mammifères, dans ce département.

Département 1ière identif. FS 1ière identif. Bovin ou …

29 août 2000 juin 2002

35 décembre 2001 avril 2002

79 (ONCFS/LERPAS) février 2002 mai 2003

51 (ONCFS) février 2002 Aucune

Les Cervidés en général, et en particulier le chevreuil, et, par extension, les Artiodactyles (Sanglier [Sus scrofa] excepté) sont donc de très bonnes sentinelles pour les autres espèces sensibles, domestiques. Et pour l’Homme. Objectifs :

• Sur la base de coordonnées topographiques précises du lieu de capture de l’animal ( Fiche N° 1 : feuille de commémoratifs), il peut être intéressant de prendre en compte les résultats positifs et négatifs à l’analyse dans des Départements jusqu’à présent indemnes, afin d’obtenir des cartes géographiques de haute définition à l’échelon national. • Mieux connaître la répartition géographique de cet agent pathogène zoonotique potentiel. • Valider un type d’enquête visant à déterminer des prévalences qualitatives dans les départements « indemnes » à février 2005. Par des outils simples et une méthodologie mettant à contribution des éléments « indicateurs biologiques de présence » au sein de la faune sauvage. • Compléter l’enquête épidémiologique URGTV Bretagne- SNGTV en cours depuis 1999. Ce sondage, essentiellement sérologique, et visant les Départements jusque là indemnes par manque de résultats de laboratoire positifs, permettra d’identifier sans aucun doute de nouveaux Départements « infecté s ». • En s’articulant sur le réseau des praticiens, parfois amenés à prendre en soin des petits Cervidés

71

• malades ou blessés, dans le cadre de leur exercice de soins à la faune sauvage ( Réseau Français des Vétérinaires Praticiens de Faune Sauvage [RFVPFS] et autres, dont la section SNGTV-FS), les Vétérinaires chasseurs des départements retenus, en contact avec les Fédérations Départementales des Chasseurs, ceux investis dans le fonctionnement de la Fédération Nationale des Chasseurs (DMV Charlotte DUNOYER et Pierre MENEZ) et, pour les Cervidés malades relevant du Bureau Sanitaire de l’ONCFS, sur le réseau SAGIR / DMV Jean-Roch GAILLET et ses partenaires, dont le GEEFSM et l’AFSSA- LERPAS, l’enquête visera à mieux faire connaître ces « outils » et à démontrer qu’un réseau d’investigation vétérinaire étendu, national -et pluridisciplinaire- peut mener à terme des investigations à connotation scientifique, concernant une Maladie Vectorielle à Tiques (MVT) et, plus généralement, la Santé Publique. • Contribuer à une évaluation de l’impact potentiel de l’agent Anaplasma phagocytophilum sur la santé de cette faune sauvage (effet immunodépressif induit et pouvoir abortif avérés de l’infection à A. phagocytophilum dans d’autres espèces, surtout domestiques). En particulier concernant la « MAC » et les constats fréquents -au moins dans l’Ouest (G. Joncour. comm. pers.)- de naissances d’automne tardives chez le chevreuil : celles-ci peuvent laisser supposer des troubles de reproduction chez les chevrettes. • Obtenir enfin une banque de sérums représentative et utilisable dans le cadre d’autres recherches (Pestiviroses / Border Disease.-BVD, Coxiellose/fièvre Q, Chlamydophilose /C. abortus., Néosporose, …). En outre une partie du prélèvement splénique sera dédiée aux recherches associées, par biologie moléculaire (PCR), d’hémoparasites du genre Babesia ou autres. Moyens humains et techniques :

• Comité scientifique de pilotage : Pr Claude Chastel (Doyen honoraire UER Brest), Jean-Claude George (médecin généraliste en Meuse), Jeanne Brugère-Picoux (ENVA), François Moutou (AFSSA), Marie-Eve Terrier (AFSSA-LERPAS Nancy) sous réserves, Claude Guiraud (GEEFSM), Dominique Gauthier (GEEFSM), Eric Collin (Comm. épidémiologie SNGTV), Philippe Camuset (SNGTV), Guy Joncour (URGTVB et Section Faune Sauvage / Comm. Environnement SNGTV) coordinateur, Jean-François Labbé (URGTVB), Jacques Devos (SNGTV), Nathalie Vassallo / Rosine Danguy-des-Déserts / Pascale Lamanda (LDA22), François Lamarque (ONCFS), Jean-Roch Gaillet-Jean Hars / Sagir-ONCFS, Pr Marc Artois (ENVL, sous réserves), Pr H-J Boulouis (ENVA), Didier FATOSME (Janssen Santé Animale), Charlotte Dunoyer et Philippe Vuillaume (UNFDC. Réseau sanitaire). • La Fédération Nationale des Chasseurs / pôle-relais maladies et intoxications de la faune sauvage, les

Délégations Régionales et Départementales, les membres du réseau ONCFS-SAGIR, des Départements concernés,

• Les consœurs et confrères collaborateurs et chargés de prélèvements pour les Départements retenus, des GTV régionaux et départementaux (ou non), ainsi que les Laboratoires Départementaux Vétérinaires (LDA/LDV) volontaires, déjà impliqués dans « Sagir », souvent.

• La SNGTV, maître d’œuvre, le réseau RFVPFS, Le GEEFSM, • Un étudiant d’ENV, Alex Chimier, centralisation-compilation et « pré-traitement » des données - Thèse de Doctorat Vétérinaire. Etude statistique. Au 1ier Trim. 2006. • Laboratoires de référence destinataires : Le LDA22 recevra l’ensemble des prélèvements biologiques et les conditionnera accompagnés d’une feuille

de commémoratifs (fdc) (Fiche N°1) N. Vassallo / R. Danguy-des-Déserts / Service d’Immunologie

sérologies spécifiques A. phagocytophilum par IfI centrifugation du tube « sec » et mise en banque,

stockage des ectoparasites (I. ricinus) si prélevés, stockage et traitement du tissu splénique (rate / PCR).

Envoi de ceux-ci, éventuellement, vers d’autres laboratoires partenaires (ex. : Pr Henri-Jean Boulouis /

ENVA sonde PCR multi- spécifique).

72

De nombreuses séances de battues ont lieu le Dimanche. Les prélèvements seront réalisés,

préférentiellement, par un vétérinaire, volontaire dépendant ou non de l’équipe de chasse-battue, le plus

proche du site, à défaut d’un confrère référent pour le Département ou d’un Technicien habilité. Dans la

mesure du possible, faire transiter l’animal à contrôler par le Cabinet du vétérinaire. A charge, pour les

Fédérations (Nationale et Départementale) d’informer leurs adhérents.

Moyens financiers :

Un budget global incluant les frais pour une réunion au LDA22 de préparation, au second semestre 2005,

de collecte et d’envoi des prélèvements, des frais de dossier et coordination URGTV-SNGTV, une bourse de

thèse ( 6 500 eu) et le coût des analyses (non comptés les conditionnements annexes et les envois demandés

au LDA22 et PCRs éventuelles sur tiques) (4 500 eu) : Soit un budget global prévisionnel de 11 000 euro

HT.

Nota : le stockage-congélation des échantillons qui ne seraient pas analysés par insuffisance budgétaire aura

de toute façon un coût. Nous sommes actuellement en contact étroit avec l’Union Nationale des Fédérations

Départementales des Chasseurs (DMV Pierre MENEZ et Charlotte DUNOYER) et les Fédérations

Régionales et Départementales : ces prélèvements concerneront surtout des animaux des plans de chasse (

pas le réseau SAGIR, dans un premier temps).

Protocole :

Durée de l’étude : la saison de chasse 2005-2006.

Prélèvements biologiques : dans l’ordre d’importance : (Fiche N°2 : protocole de prélèvement sanguin sur

cadavre frais par dissection de la zone jugulaire).

• Tube n°1 et n°2 : Deux tubes de sang total de 5 ml. à « bouchon rouge » (si possible). Bien pleins. Si on y associe d’autres investigations du type « BVD-MD », « Border D. », Coxiellose, Néosporose,…). Idéal, si possibilité locale : centrifugation et envoi des sérums au LDA22. • Tube n°3 : les tiques ectoparasites dans alcool à 70° ( PCR) identification. (Fiche N°2 : oreilles, nuque rétro-auriculaire, fanon, cuisses-intérieur, scrotum, flancs Attention : des mélophages du genre Lipoptena cervi, sont souvent nombreux sur les Cervidés. Et

confondus avec des tiques (Ixodes). Ils ressemblent aux mélophages du mouton, Melophagus ovinus.

• Prélèvement n° 4 : la rate. Découper deux lanières de rate de 1cm. x 0,5cm. x 4cm. Dans deux tubes de « 5 ml. à bouchon rouge », n° 4 et n° 5. Rajouter de l’alcool à 70°, en vidant l’air « sous le bouchon » à l’aiguille et seringue montée, en aspirant. Bien identifier tous les tubes. Les joindre à la Fiche N°1 , avant envoi au Laboratoire / LDA22

Liste des départements où devront s’effectuer les prélèvements biologiques (= ceux où pas de « POS »

Bovins, Equidés, Chevreuil. Même Lama [Lama glama] ou Chiroptères ….) :

02, (2A,) 2B, 04, 05, 07, 10, 11, 16, 26, 30, 32, 34, 37, 40, 48, 66, 68, 70, 92 et 95 21 Départements + les deux

où des cas humains ont été diagnostiqués, Meuse (55) et Bas-Rhin (67). Soit 23 à tester. (voir Carte).

73

Taille de l’échantillon attendue en vue d’analyses IfI : Quatre analyses par IfI et par Département,

100 tubes n°1 et n°2. Un maximum de n° 3, 4 et 5.

On peut estimer la nécessité de tester 8 animaux par Département, soit environ 180 Cervidés, en fonction

d’hémolyses fréquentes dans ces types de prélèvements in Natura, et de pollutions bactériennes et fungiques

inhérentes à divers modes de prélèvements sanguins. Un petit échantillon de 4 animaux rend difficile une

interprétation épidémiologique sur une population donnée : des contraintes budgétaires nous y contraignent

et ce choix ne grève pas nos objectifs ci-dessus. Tout complément financier permettrait un accroissement

des tailles d’échantillon. Une répartition homogène sur tout le Département est un élément important à prendre en compte.

Discussion : Critères d’inclusion, d’exclusion.

Zone d’étude : le territoire national des 23 départements signalés plus haut.

Les espèces à prélever : d’abord, en priorité,

• le chevreuil (Capreolus capreolus), des plans de chasse et inclus dans les animaux répertoriés par fiches Sagir (Réseau national, fiches 2002 : 555 chevreuils et 82 « autres ruminants », fiches 2003 : 488 chevreuils et 86 « autres ruminants »), puis le cerf élaphe (Cervus elaphus), de plans de chasse, capture « administrative »-translocations ou en ranching, le daim (Dama dama). • l’isard-chamois (Rupicapra rupicapra), le mouflon (Ovis sp.) ou le bouquetin (Capra ibex), Nota : ces trois espèces vivent généralement à plus de 700 mètres d’altitude, limite supérieure de la

répartition altitudinale d’Ixodes ricinus). Il serait donc intéressant de les tester, également.

• Sont inclus les Artiodactyles autres que le Sanglier (Sus scrofa), même exotiques, des collections privées ou publiques (parcs de vision, safari-parcs, parcs zoologiques, et autres zoos. Nota : Le Lama [Lama glama] est sensible à l’EGB). • Concernant la Corse (2A/2B), des informations issues des milieux cynégétiques indiquent une présence non anecdotique de tiques sur les sangliers chassés. Afin de réaliser les objectifs, des prélèvements du même type seront donc effectués sur 2 x 4 animaux de chasse et envoyés, selon le même protocole, au LDA22 (en indiquant « Sanglier », aux commémoratifs, à la case « Autre »). • Sont exclus tous les prélèvements effectués dans les autres Départements non cités plus haut et les envois dont les commémoratifs ne seraient pas transmis à la Coordination (fax. 02 96 45 91 58)

Nota : la congélation-conservation permettra des analyses complémentaires, dans l’attente de financements

complémentaires.

Callac, le 10 mai 2005, revu le 17 novembre 2005

Guy JONCOUR Coordinateur de l’étude nationale SNGTV sur l’Ehrlichiose Granulocytaire Bovine (EGB).

[email protected] http://www.zoopole.com/ispaia/urgtvbretagne2003.htm.

75

Annexe 2 : Fiche de commémoratifs. FICHE N° 1 du protocole

COORDONNEES : Responsable de battue ou « Inventeur »……

Nom……………….

Prénom……………………Adresse……………

Tél.……………………… Fax ……………….

Ville………………. Code Postal……………… Vétérinaire « préleveur » (ou Tampon) Nom…….

Adresse………………….………………………

………………………………………………….. Facturation des prélèvements par un vétérinaire GTV Dr J-F LABBE, Trésorier SNGTV, Groupe Vétérinaire

de Broons, BP 28. 2250 Broons.

Votre envoi au LDA22 : colis résistant aux chocs (normes) et identifié avec la mention suivante : ETUDE Ehrlichiose Faune sauvage - SNGTV. LDA des Côtes d’Armor. Zoopôle. 7rue du Sabot. B.P. 54. 22440 PLOUFRAGAN.

Tubes n° 1 et n°2 (Sang total) 1 tube sec n°1 (ou sérum) 1 tube sec n°2 (ou sérum)

Tube n° 3 (Tiques) avec alcool à 70° 1 tube n°3

Tubes n° 4 et n°5 (Rate : 1 x 0,5 x 4 cm) avec alcool à 70°

1 tube n° 4 1 tube n° 5

-les tubes n°1 et n°2 sont : centrifugés et décantés* juste décantés

* A minima, laisser coaguler à température ambiante avant envoi, si centrifugation impossible

ANIMAL PRELEVE

Espèce :

Chevreuil, Cerf, Cerf sika, Daim, Autre

Chamois, Isard, Mouflon, Bouquetin. Sexe: Mâle, Femelle Âge : Jeune (moins d’un an), Adulte (plus d’un an). Poids, éventuellement :

Conditions de capture :

Plan de chasse, Translocation, Police sanitaire (cerfs / ranching) Accident routier,

Pathologie (si oui, laquelle ? et fiche Sagir -copie éventuelle)……………………………………………………………………………………………….

Date de la collecte :

Lieu de la collecte : (si possible [ ?] « latitude et longitude » ou coordonnées GPS / UTM. Ou les plus précises possibles… ) Lieu-dit le plus proche : Bois : Commune : Code postal :………….. Département :

77

Annexe 3 : Fiche d’aide à la réalisation des prélèvements sur cadavres frais (jugulaire, rate et tiques). FICHE N° 2 du protocole

1) Zone de ponction jugulaire après dissection d’un

rabat cutané. Encolure gauche, ici.

Position idéale : tête pendante et corps de l’animal

sur une surface plane ou pentue. Ou animal pendu, tête

en bas... Ponction très proche de l’entrée de la poitrine.

2) Les deux zones de prélèvement : gouttière jugulaire

et zone rétro-costale gauche avec localisation de la rate,

sous-costale, attenante au diaphragme et en avant de la

panse (rumen).

3) Détail : position de la rate, sous-costale gauche

(l’abord rétro-costal est possible. Ici, forte hémorragie :

le rumen est rompu choc de collision routière, cause

de la mort).

4) Rate discoïde disséquée (déplétion). Pièces d’un et

deux euro, comparatives.

5) Zones préférentielles d’implantation des tiques.

Matériel nécessaire aux prélèvements sur un animal :

- 1 scalpel ou couteau de chasse, une paire de gants

- 1 à 2 seringues de 20 ml. Avec aiguille

- 2 tubes secs (rouge ) : sang

- 3 tubes secs préalablement remplis d’alcool à 70° :

2 lamelles de rate (1 x 0.5 x 4cm) et les tiques présentes.

Tête

79

Annexe 4 : Lettre d’information à l’intention des Fédérations Départementales de Chasse.

• Le point sur l’ehrlichiose : L’ehrlichiose est une maladie causée par une bactérie (Anaplasma phagocytophilum), qui infecte les globules blancs, et donc affaiblit les défenses immunitaires. Elle est transmise par les Tiques (Ixodes ricinus). Les grands ruminants (bovins), les équidés, les petits ongulés domestiques (ovins, caprins) et sauvages (chevreuil, cerf élaphe, isard, chamois, mouflon, bouquetin), les chiens, les chevaux, mais aussi l’homme sont des hôtes possibles : c’est une zoonose non contagieuse d’animal à animal ou d’animal à l’homme, mais via les morsures de tiques. • Le principe de l’étude à réaliser sur la saison de chasse 2005-2006 : Lors des actions de chasse, de soins ou de captures, essentiellement, du sang de Chevreuil, des tiques, et des lambeaux de rate de l’animal seront prélevés selon un protocole à respecter, dans le cadre des divers réseaux départementaux concernés (GTV, Fédérations départementales, réseau ONCFS-SAGIR). Puis acheminés au Laboratoire de référence, afin d’y être stockés puis analysés. • Objectifs de l’étude : Cette étude, dont le maître d’œuvre est la société nationale des groupements Techniques vétérinaires (SNGTV), associée à la fédération nationale des chasseurs (FNC), essentiellement, vise en premier lieu à mieux connaître la répartition géographique fine de l’ehrlichiose en France. Elle permettra aussi d’évaluer l’impact de cette bactérie sur la santé de la faune sauvage, et en particulier d’apprécier les relations éventuelles entre l’ehrlichiose et des pathologies du Chevreuil mal cernées. Dans un premier temps, nous nous limitons à 4 prélèvements sanguins exploitables (sérologie) par Département couplés à des prélèvements de lambeaux de rates. Soit environ 8 animaux à prélever parmi les espèces d’ongulés citées plus haut, sanglier exclu. • Où sont envoyés les prélèvements ? En cas d’impossibilité de réalisation par un vétérinaire de proximité ou participant à l’action de chasse, les prélèvements seront identifiés, et envoyés le plus rapidement, accompagnés de la feuille de commémoratifs au Laboratoire Départemental d’Analyse des Côtes d’Armor, avec la mention : ETUDE Ehrlichiose Faune sauvage - SNGTV.

LDA des Côtes d’Armor. Zoopôle. 7 rue du Sabot. B.P. 54. 22440 PLOUFRAGAN.

La feuille de commémoratifs sera, avant l’envoi, faxée au coordinateur, au 02 96 45 91 58. • Ce qui est attendu des FRC et FDC : Il est important que les Fédérations contactées diffusent l’information au sein des différentes sociétés de chasse et en particulier des responsables des Plans de Chasse, afin que nous puissions obtenir suffisamment de prélèvements. • Qui fera les prélèvements ? En cas de non disponibilité d’un vétérinaire « de proximité », un technicien cynégétique ou, à

défaut, un responsable de l’action de chasse effectuera les prélèvements (voir fiche « pièces anatomiques »). Matériel à demander au Cabinet Vétérinaire le plus proche : ciseau, scalpel, gants, 2 seringues montées de 20 ml., 5 tubes secs de vacutainer (dont trois avec alcool à 70°).

81

Annexe 5 : Convention SNGTV/ FNC

CONVENTION DE RECHERCHE DANS LE CADRE

D’UNE THESE VETERINAIRE SUR L’EHRLICHIOSE

1 : Contexte de l’étude L’ehrlichiose est une maladie causée par une bactérie (Anaplasma phagocytophilum), qui infecte les globules blancs, et donc affaiblit les défenses immunitaires. Elle est transmise par les Tiques (Ixodes ricinus). Les grands ruminants (bovins), les équidés, les petits ongulés domestiques (ovins, caprins) et sauvages (chevreuil, cerf élaphe, isard, chamois, mouflon, bouquetin), les chiens, les chevaux, mais aussi l’homme sont des hôtes possibles : c’est une maladie non contagieuse d’animal à animal ou d’animal à l’homme, qui se transmet via les morsures de tiques : une maladie vectorielle à tiques. L’étude URGTV B, initiée par les vétérinaires de terrain, dans l’Ouest, a permis de localiser (1999-2005), 65 départements où une « trace » biologique de l’agent pathogène a pu être visualisée. Elle se prolonge actuellement (2005-2006) par une enquête nationale sur cas cliniques confirmés par les laboratoires de diagnostic de référence, le Laboratoire de Développement et d’Analyses des Côtes d’Armor (LDA22) et le LDV des Deux-Sèvres (LDV79). L’ubiquité de son vecteur principal (la tique) n’a d’égale que celle de l’agent pathogène, A. phagocytophilum présent chez de nombreuses espèces et dans la majorité des départements français. Ainsi, à ce jour, 76 départements sont concernés, dont 58 à foyers « bovins », 12 « équins », 3 à foyers sur « chevreuil », un sur « isard » et 2 chez l’Homme.

2 : Présentation de l’étude Cette nouvelle étude, dont le maître d’œuvre est la société nationale des Groupements Techniques Vétérinaires (SNGTV), vise en premier lieu à mieux connaître la répartition géographique fine de l’ehrlichiose en France et à améliorer les connaissances sur l’épidémiologie de la maladie. Une étude épidémiologique, sur les vecteurs, en particulier, et les petits réservoirs sauvages et les bio-indicateurs (« marqueurs »), cul-de-sac épidémiologiques pour cette zoonose mineure, constitués par les Artiodactyles sauvages -le Chevreuil (Capreolus capreolus) en particulier- a été jugée pertinente par la Société Nationale des Groupements Techniques Vétérinaires (SNGTV), à l’initiative du Dr JONCOUR, coordinateur de cette étude. Ce travail constitue la base de la réalisation d’une Thèse pour l’obtention du titre de Docteur Vétérinaire, de la part du stagiaire, Alex CHIMIER, sur le « rôle de bio-indicateur du Chevreuil (Capreolus capreolus) pour les animaux domestiques, dont ceux de rente, au niveau national » (2005-2006). 2 champs d’investigation sont envisagés : - Le parc ZOODYSSEE de CHIZE au sein duquel des investigations seront menées sur les milieux, les tiques et les petits mammifères, dans l’environnement immédiat des enclos de chevreuils et de baudets du Poitou (en fonction de manifestations pathologiques sur les deux espèces et où le Chevreuil a permis un diagnostic sur un jeune baudet).

82

- Les chevreuils tirés à la chasse ou repérés par le réseau SAGIR, sur lesquels des analyses seront pratiquées à partir de sang, rates et tiques prélevés sur les animaux , avec la collaboration technique et financière des Fédérations Départementales des Chasseurs 3 : Eléments de protocole Zoodyssée de Chizé (79) En ce qui concerne l’étude des vecteurs (tiques, par collecte) et des réservoirs (milieux, tiques, petits mammifères), sont prévus : - collecte de micromammifères (rats, souris, surmulots) : piégeage de micromammifères aux abords des enclos, avec des pièges à petits mammifères et des ratières. Objectif : collecte d’environ 30 animaux par enclos et en lisière - collecte de tiques : récolte de tiques au drapeau (1 semaine au Printemps). Objectif : 100 à 200 tiques par enclos. La proximité, aux frontières orientales des Deux-Sèvres (79), de trois Départements jusqu’à présent « indemnes », la Charente (16), l’Indre-et-Loire (37) et la Vienne (86) serait un facteur susceptible de sensibiliser Vétérinaires et Médecins à des investigations cliniques ciblées sur cet agent vectorisé par Ixodes ricinus, en raison du caractère pionnier de ce type d’étude. Nota : ces prélèvements seront traités au LDV 79 (DMV Philippe Nicollet). Fédérations de Chasseurs Lors des actions de chasse, du sang de chevreuil, essentiellement, des tiques et la rate de l’animal seront prélevés selon un protocole à respecter, dans le cadre des Plans de Chasse et dans le cadre du Réseau SAGIR des Départements concernés. Les prélèvements peuvent aussi porter sur le cerf élaphe sauvage, l’isard, le chamois, le mouflon, le bouquetin ou le daim. 23 Départements concernés (où il n’existe actuellement pas de connaissance sur la prévalence de l’ehrlichiose) : 02, 2A, 2B, 04, 05, 07, 10, 11, 16, 26, 30, 32, 34, 37, 40, 48, 55, 66, 67, 68, 70, 92, 95. 8 animaux à prélever par département, dans l’objectif d’obtenir au moins 4 prélèvements sanguins exploitables. Les vétérinaires correspondants des GTV sont sollicités pour effectuer l’ensemble de ces prélèvements et les envoyer au Laboratoire Vétérinaire Départemental (LDA 22). Ces opérations étant obligatoirement dépendantes des dates de chasse, seule une amorce de ce protocole pourra être entrepris dans le cadre de la thèse vétérinaire d’Alex Chimier, nécessitant une poursuite des investigations à la saison de chasse 2006-2007. 4 : Convention FNC-SNGTV Entre la Fédération Nationale des Chasseurs (FNC), siégeant 13, rue du Général Leclerc, 92136 ISSY les MOULINEAUX Cedex d’une part, et la Société Nationale des Groupements Techniques Vétérinaires (SNGTV), siégeant 5 rue Moufle, 75011 PARIS d’autre part, Il est convenu ce qui suit : - La SNGTV est maître d’œuvre de la thèse vétérinaire d’Alex CHIMIER sur le « rôle de bio-indicateur du Chevreuil (Capreolus capreolus) pour les animaux domestiques, dont ceux de rente, au niveau national ». Le coordinateur de ces travaux, reconnu par les deux parties est le Dr Guy JONCOUR. La thèse se déroule sur la période 2005-2006.

83

- La FNC, par l’intermédiaire de son Pôle-Relais « Maladies et Intoxications de la Faune Sauvage » est partenaire de cette recherche et s’engage à sensibiliser les Fédérations Départementales des Chasseurs des 23 départements concernés, afin qu’elles acceptent de mettre en œuvre la recherche de chevreuils à des fins de prélèvements et qu’elles acceptent de participer financièrement au projet, en prenant en charge les frais d’analyses engagés au titre de cette thèse dans leur département, à concurrence de 196 € par Fédération. - Le Pôle-Relais « Maladies et Intoxications de la Faune Sauvage » de la FNC participe financièrement à la thèse vétérinaire en prenant en charge une partie de la coordination et les frais d’analyses engagés par la mise en œuvre du protocole au Zoodyssée de Chizé, à concurrence de 3500 €. - Le Pôle-Relais règlera à la SNGTV sa participation sur présentation d’une facture globale de la SNGTV, accompagnée des différents justificatifs (frais d’analyses, etc …) - La FNC fait partie du Comité de pilotage mis en place pour la durée de cette thèse vétérinaire. - Toute communication, même partielle, sur les résultats de cette thèse ne pourra se faire sans l’accord écrit de la FNC et devra mentionner la participation de la FNC . Il en sera de même concernant la SNGTV .

Dr Pierre MENEZ Dr Christophe BRARD

Président du Pôle-Relais Président de la SNGTV

« Maladies et Intoxications

de la Faune Sauvage »

FNC

Signature Signature

Lu et approuvé Lu et Approuvé

85

Annexe 6 : Lettre d’information des FDC par la FNC Issy les Moulineaux, le 6 décembre 2005

Pôle-Relais Maladies et Intoxications de la Faune Sauvage

Présidents des FDC concernées

Objet : Recherches sur l’Ehrlichiose

chez les petits ruminants sauvages :

sollicitation des Fédérations de Chasseurs

Monsieur le Président, Le Pôle-relais Maladies et Intoxications de la Faune Sauvage a été sollicité dernièrement pour soutenir un protocole de recherche sur l'Ehrlichiose chez le chevreuil (ou autre ruminant sauvage : cerf élaphe, daim, isard-chamois, mouflon, bouquetin). Peut-être avez-vous déjà été contacté pour ce projet. Ce programme est le prolongement d'une première recherche menée en 1999-2003 en Bretagne, par un vétérinaire : le Docteur Guy JONCOUR. Son objectif est d'établir la cartographie de l'Ehrlichiose en France. Cette affection bactérienne, transmise par les tiques, est commune à différents mammifères et notamment aux bovins et aux chevreuils. Chez les bovins, elle touche essentiellement les vaches laitières et se traduit surtout par une forte et longue chute de la production laitière. Chez les ruminants sauvages, la maladie ne semble pas très pathogène. Toutefois, certains s'interrogent sur l'affaiblissement qu'elle pourrait provoquer chez ces animaux, favorisant ainsi l'apparition d'autres maladies et sur l’effet négatif éventuel de cette infection en matière de fertilité. Enfin, il faut signaler que la maladie peut être transmise à l'homme (toujours par les tiques). Les cas humains détectés sont très peu nombreux aujourd'hui. Mais la situation est sous surveillance. Aujourd'hui, le chevreuil (et les autres ruminants sauvages) est plus considéré comme un indicateur biologique de la présence de cette maladie que comme un vecteur ou un réservoir. Il se débarrasse en effet assez vite du pathogène et ne constitue donc pas un réservoir propice à la réinfestation des tiques (les réservoirs pour les tiques sont les petits mammifères). Dans les zones déjà explorées, il s’est avéré que le chevreuil était positif à l’Ehrlichiose avant que les bovins ne le soient, d’où son rôle d’indicateur biologique. Le projet de recherche élaboré par le Dr Guy JONCOUR est de déterminer, par des prélèvements sanguins, de rates et de tiques sur ruminants sauvages, la présence ou non de la bactérie dans les différents départements de France. Tous les départements ne sont pas à tester, dans la mesure où, parallèlement à cette recherche, il existe également une surveillance sérologique des vaches laitières qui manifestent des symptômes d'ehrlichiose, contribuant aussi à déterminer la présence de la maladie dans certains départements.

86

23 départements, dont le vôtre, sont concernés par le protocole du Dr Guy JONCOUR. Le Pôle-Relais Maladies de la FNC a examiné avec attention ce projet et a choisi de le soutenir, dans le cadre d'une Convention qui, notamment, donnera un droit de regard sur la communication et la publication des résultats. Il est en effet important que ces programmes de recherche sanitaire soient maîtrisés quant à l'utilisation qui pourrait être faite des données, ultérieurement. En dehors du soutien de la FNC (qui se traduit notamment par la participation financière du Pôle-relais à hauteur de 3500 €), celui des Fédérations des départements concernés est également sollicité de 2 manières : - diffuser l’information et sensibiliser les associations ou sociétés de chasse pour la fourniture de prélèvements sur ruminants sauvages tirés à la chasse, ou ramassés dans le cadre du Réseau SAGIR, ou accidentés (2 tubes de sang + 2 lamelles de rate + tiques, ces prélèvements étant à répéter sur 8 ongulés (sanglier exclu) par département) - participation financière aux frais d'analyse (196 € par Fédération départementale). Bien entendu, le soutien du projet par le Pôle-relais Maladies de la FNC, ne vous lie pas à ce programme. Votre Fédération reste souveraine dans sa décision d'y participer ou non. L'objectif de notre Pôle-Relais est avant tout d'apporter une certaine expertise vis-à-vis de la pertinence des programmes proposés, tant dans le domaine scientifique qu'au regard des intérêts des chasseurs dans ce domaine sanitaire, souvent à "double tranchant". Un étudiant en thèse vétérinaire est chargé de mener à bien ce programme. Il sera votre contact :

Alex CHIMIER, tel : 06 33 60 67 07 Important à noter : le protocole prévoit que ces prélèvements soient effectués par un vétérinaire dans la mesure du possible. Soit les équipes de chasse volontaires pour cette étude disposent de vétérinaires-chasseurs, soit elles font appel à des vétérinaires locaux. Attention ! L’acte des vétérinaires pour ces prélèvements serait à rétribuer SAUF s’il s’agit d’un vétérinaire adhérent au Groupement Technique Vétérinaire (GTV). En effet, pour ces derniers, le Dr Guy JONCOUR a pu obtenir une subvention. Pour votre département, le vétérinaire du GTV est : …………………………………. Une note technique élaborée par le Dr JONCOUR et Alex CHIMIER est jointe à notre lettre vous permettant de connaître l'ensemble des détails. La mise en place de cette étude et notamment de son financement a pris un temps important, ce qui amène Messieurs JONCOUR et CHIMIER à entreprendre cette campagne de prélèvements, à un moment déjà avancé de la période de chasse. Nous sommes conscients que cela vous rendra la tâche plus difficile. Nous espérons néanmoins que, pour les Fédérations qui accepteront de participer à l’étude, les choses se passeront au mieux. Nous restons à votre disposition pour tout complément d’information et vous prions, Monsieur le Président, de recevoir l’expression de nos meilleures salutations,

Pierre MENEZ Président du Pôle-Relais Maladies de la FNC

p/o Charlotte DUNOYER

87

Annexe 7 : Exemple de compte rendu d’analyse.

89

Annexe 8 : Carte de présence d’Anaplasma phagocytophilum en France, au 1er juin 2006.

82

46 05

4590

28

59

02 08

77

62

8060

27

76

611450

5554

5767

68

7103

2189

5818

63

4342

07

30

26

8413 83

0604

6938 73

7401

36

19

8723

81

12

15

3431

0966

11

17

40

64

47

32

3324

25

52 8870

39

29 2256 35 53 72

4144 49 37

85 79 86

Présence de l’agent de l’ ehrlichiose en France, de 1991 au 01 06 2006

77 départements

Enquête « piroplasmose » (Babesia) 1987-1989

L’hostis 94

2 / Homme (55-67)59 / Bovins

12 / Cheval4 / Ongulées sauvages

2B

2A

Côtes d’Armor : 2 premiers troupeaux

46

2878

48

16

65

51

10

Source : Guy JONCOUR

91

Annexe 9 : Rapport d’autopsie du chevreuil mort au Zoodyssée Propriétaire : Vétérinaire préleveur :

ZOODYSSEE

Virollet /

79360 VILLIERS EN BOIS

- Date de réception labo : 21/04/05

- Référence labo : 7973-01

- N° de cheptel : /

- Nature du prélèvement :

1 chevreuil mâle d’un an

AUTOPSIE

EXAMEN EXTERNE :

- 1 brocard reçu mort en état de conservation correcte - Bon état d’engraissement - Présence importante de tiques

EXAMEN CAVITE GENERALE :

- Tissu sous-cutané et muscles : RAS - Ascite, présence de liquide rosé dans la cavité abdominale

APPAREIL DIGESTIF :

Cavité buccale et œsophage : RAS

Estomac : Réplétion correcte, muqueuse normale

(Pré)-Estomacs – Caillette : RAS

Intestins : Entérocolite hémorragique,

muqueuse et contenu fortement hémorragique

Foie : friable, présence de quelques abcès de 2 à 3 mm de diamètre à l’intérieur du

parenchyme

92

APPAREIL RESPIRATOIRE :

Cavités nasales : RAS

Trachée : RAS

Poumons : RAS

APPAREIL CIRCULATOIRE ET HEMATO – LYMPHOPOIETIQUE :

Cœur : RAS

Rate : Splénomégalie,

rate de couleur noirâtre,

fortement hémorragique

ganglions : ganglions mésentériques hémorragiques

PARASITISME :

Examen macroscopique : négatif

Examen microscopique direct : absence d’œufs et d’ookystes

AUTRES OBSERVATIONS

- Frottis sanguin : présence de morulas d’Ehrlichia dans plusieurs monocytes - Ehrlichiose monocytaire - Envoi de la rate à AFSSA Maisons Alfort pour rechercher la Tularémie.

CONCLUSION

Scepticémie Colibacilaire d’origine intestinale.

Ehrlichiose (action immunodepressive des Ehrlichia)..

Niort, le 13 novembre 2006

P/O le Directeur du Laboratoire,

Dr Philippe NICOLLET Mme Marie–Alice BITAT M. Francis BERNARD

93

Annexe 10 : situation des enclos (chevreuils et baudets) et position des pièges.

Source : d’après un prospectus du Zoodyssée 87

95

Annexe 11 : Relevé du piégeage au Zoodysée. Pour faciliter la lecture, seules les données concernant les pièges fermés avec capture apparaissent ici.

Légende : Enclos I=chevreuil, II=baudets du Poitou

Etat du piège: F=fermé, R=renversé

Captures du 2 novembre 2005

enclos

n°

piège

état du

piège n° capture Espèce

I 45 F 1 MULOT

I 46 F 2 MULOT

enclos

n°

piège

état du


II 4 F 3 MULOT

II 22 F 4 MULOT

II 37 F 5 MULOT

II 41 F 6 MULOT

II 44 F 7 MULOT

II 56 F 8 MULOT


enclos

n°

piège

état du


I 76 F Crapaud

Pas de capture ce jour autour de l’enclos des Baudets.


enclos

n°

piège

état du


I 2 F musaraigne

I 12 F 9 MULOT

I 43 F 10 MULOT

I 71 F 11 MULOT

enclos

n°

piège

état du


II 56 F 12 MULOT


enclos

n°

piège

état du


I 51 R 13 MULOT

Pas de capture ce jour autour de l’enclos des Baudets.

Captures du 4 avril 2006

enclos

n°

piège

état du


I 17 F 14 MULOT

I 19 F 15 MULOT

I 53 F 16 MULOT

enclos

n°

piège

état du


II 31 F 17 MULOT

II 40 F 18 MULOT

II 50 F 19 MULOT


enclos

n°

piège

état du


I 4 F 20 MULOT

I 9 F 21 MULOT

I 13 F 22 MULOT

I 22 F 23 MULOT

I 26 F 24 MULOT

I 55 F 25 MULOT

I 59 F 26 MULOT

I 84 F 27 MULOT

I 92 F 28 MULOT

I 100 F 29 MULOT

96

enclos

n°

piège

état du


II 3 F 30 MULOT

II 27 F 31 MULOT

II 28 F 32 MULOT

II 34 F 33 MULOT

II 48 F 34 MULOT

II 83 F 35 MULOT


enclos

n°

piège

état du


I 98 F 36 MULOT

Pas de capture ce jour autour de l’enclos des baudets.


enclos

n°

piège

état du


I 87 F

rouge

gorge

enclos

n°

piège

état du


II 23 F sitelle torchepot


enclos

n°

piège

état du


I 24 F 37 MULOT

I 77 F 38 MULOT

I 82 F 39 MULOT

I 92 F 40 MULOT

I 98 F 41 MULOT

enclos

n°

piège

état du

piège

n°

capture Espèce

II 31 F 42 MULOT

II 58 F 43 MULOT

II 59 F 44 CAMPAGNOL

II 71 F 45 MULOT

II 73 F 46 MULOT

II 80 F 47 MULOT

II 96 F

mésange

charbonnière


enclos

n°

piège

état du

piège

n°

capture Espèce

I 1 F 48 MULOT

enclos

n°

piège

état du

piège

n°

capture Espèce

II 32 F 49 MULOT

II 39 F 50 MULOT

II 51 F 51 MULOT


enclos

n°

piège

état du

piège

n°

capture Espèce

I 12 F 52 MULOT

I 14 F 53 MULOT

I 36 F sitelle torchepot

I 86 F 54 CAMPAGNOL

I 96 F 55 MULOT

enclos

n°

piège

état du

piège

n°

capture Espèce

II 3 F 56 MULOT

II 8 F 57 MULOT

II 63 F 58 MULOT

II 72 F 59 MULOT

II 89 F 60 MULOT

II 90 F 61 MULOT

II 91 F 62 MULOT

97

Annexe 12 : Résultats d’analyse des prélèvements du Zoodysée. Well Dye Content Description C(t) Interprétation

A1 FAM Sample T+ EHRL 30.03 POSITIF

B1 FAM Blank T- EHRL >45 NEGATIF

D1 FAM Sample RATE1 >45 Négatif

E1 FAM Sample R2 >45 Négatif

F1 FAM Sample R3 >45 Négatif

G1 FAM Sample R4 >45 Négatif

H1 FAM Sample R5 >45 Négatif

A2 FAM Sample R6 >45 Négatif

B2 FAM Sample R7 >45 Négatif

C2 FAM Sample R8 >45 Négatif

D2 FAM Sample R9 >45 Négatif








D3 FAM Sample R17 32.24 POSITIF



G3 FAM Sample R20 33.06 POSITIF
















98




























C9 FAM Sample SANG1 >45 Négatif

D9 FAM Sample S2 >45 Négatif

E9 FAM Sample S3 >45 Négatif

F9 FAM Sample S4 >45 Négatif

G9 FAM Sample S5 >45 Négatif

H9 FAM Sample S6 >45 Négatif

A10 FAM Sample S7 >45 Négatif

B10 FAM Sample S8 >45 Négatif

C10 FAM Sample S9 >45 Négatif





99




























G2 FAM Sample TIQUES1 >45 Négatif

H2 FAM Sample T2 >45 Négatif

A3 FAM Sample T3 >45 Négatif

B3 FAM Sample T4 >45 Négatif

C3 FAM Sample T5 38.98 POSITIF

D3 FAM Sample T6 >45 négatif

E3 FAM Sample T7 >45 négatif

F3 FAM Sample T8 >45 négatif

100

Échantillonnage :

S=sang, T=tique, R=rate. Les numéros utilisés sont ceux de l’identification des

prélèvements (ordre de capture : se reporter à l’annexe 11)

• Pool Sang total n°1 = S1 = Sang total n°4 + sang total n°5

S2 = 7+9+11+12

S3 = 14+15

S4 = 16

S5 = 17

S6 = 18

S7 = 19+21

S8 = 20

S9 = 22+23+31

S10 = 24

S11 = 25

S12 = 26

S13 = 27

S14 = 28

S15 = 29

S16 = 30

S17 = 32+35

S18 = 33

S19 = 34

S20 = 36

S21 = 37

S22 = 38+39

S23 = 40

S24 = 41

S25 = 42

S26 = 43

S27 = 44+46+55

S28 = 45

S29 = 47

S30 = 48

S31 = 49

S32 = 50

S33 = 51+57+61+62

S34 = 52

S35 = 53

S36 = 54

S37 = 56

S38 = 58

S39 = 59

S40 = 60

• Pool Tiques n°1 = T1 = Tiques n°1

T2 = 2

T3 = 3+4+5

T4 = 7+8+9+11

T5 = 12+20+23+24

T6 = 26+29+30

T7 = 31+34+39+43

T8 = 45+46+49

• Pas de Pools de rates = individuellesSource : LDV des Deux-Sèvres.

101

Contribution à l’étude de la prévalence de l’infection à Anaplasma phagocytophilum

dans la faune sauvage en France

NOM et Prénom : CHIMIER Alex

Résumé

L’infection à Anaplasma phagocytophilum, anciennement appelée ehrlichiose, reste encore

peu étudiée actuellement en ce qui concerne la faune sauvage. Ce travail rapporte les résultats

de deux études expérimentales que nous avons réalisées. La première concernait les

départements français où la bactérie n’avait pas été détectée : des prélèvements de chevreuils

tués lors de la saison de chasse 2005/2006 ont été analysés par sérologie et PCR. Sur les 4

départements ayant participé à l’enquête, la présence de bactérie a été démontrée dans 3

départements. La seconde étude concernait des micromammifères (mulots et campagnols)

piégés dans un parc animalier des Deux-Sèvres connu pour ses antécédents vis-à-vis de la

bactérie. Là, 62 micromammifères ont été capturés et après analyse PCR de rates, 2 des 60

mulots se sont révélés positifs, de même qu’un lot de tiques fixé sur un de ces deux mulots.

Nous avons ainsi obtenu une prévalence de 3,3 % chez le mulot.

Mots clés :

ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM

PREVALENCE

SEROLOGIE

PCR

FAUNE SAUVAGE

CHEVREUIL

MICROMAMMIFERE

TIQUE

DEUX-SEVRES

FRANCE

Jury :

Président : Pr……………

Directeur : Pr. Henri-Jean BOULOUIS

Assesseur : Dr. Renaud MAILLARD

Adresse de l’auteur :

M. Alex CHIMIER

7 rue de la croix brûlard

28700 Saint SYMPHORIEN le Château

102

Contribution of the study of Anaplasma phagocytophilum

infection’s prevalence among wildlife in France

SURNAME: CHIMIER

Given name: Alex

Summary

Anaplasma phagocytophilum infection, formerly named ehrlichiosis, is actually very little

documented in wildlife.

This work gives the results of two experimental studies that we realized. The first one concerned

different French departments where the bacteria wasn’t known: samples of roe deer during the

2005/2006 hunting season tested by serology and PCR. The bacteria was detected in three out of the

four departments which have participated in the survey. The second one deals with small wild

mammals (wood mouse and bank vole) which were captured in a zoological park in Deux-Sèvres

(France). This park was well known for Anaplasma phagocytophilum infection. 62 small wild

mammals where captured. 2 out of 60 wood mouse were positives by PCR on spleen and ticks

which was fixed on one of these two positive wood mouse too. So we obtained here the prevalence

of 3,3% in wood mouse.

Keywords

ANAPLASMA PHAGOCYTOPHILUM

PREVALENCE

SEROLOGY

PCR

WILDLIFE

ROE DEER

SMALL WILD MAMMALS

TICK

DEUX-SEVRES

FRANCE

Jury :

President : Pr……………..

Director : Pr. Henri-Jean BOULOUIS

Assessor : Dr. Renaud MAILLARD

Author’s address:

Mr. Alex CHIMIER

7 rue de la croix brûlard

28700 Saint SYMPHORIEN le Château

Alex, Marie Edith CHIMIER

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