Alcooloxidaza
Transcript of Alcooloxidaza
-
8/14/2019 Alcooloxidaza
1/7
Alcooloxidaza
(EC 1.1.3.13)
Alcool + O2 -----> aldehida + H2O2
-
8/14/2019 Alcooloxidaza
2/7
Biosinteza alcooloxidazei de origine microbianaSursa de obtinere : celule de Hansenula polymorpha Drojdie metilotrofa
Parametrii biosintezei
volum de lucruraport inoculare
temp de lucru
debit de aer in perioada de lag si in urmatoarele ore
agitare
pH mediu initial
corectie pHantispumant
durata procesului
Caracteristica : alcooloxidaza este inhibata de prezenta apei oxigenate; din aceastacauza este obligatoriu insotita la nivel celular de catalaza, enzima care descompune apa
oxigenata
AlcooloxidazaAlcool + O2 -----> aldehida + H2O2
PeroxidazaH2O2 +DH2 -----> 2 H2O + D unde
D= o-dianisidina oxidata
AlcooloxidazaAlcool + O2 -----> aldehida + H2O2
Catalaza2 H2O2--> 2 H2O + O2
Sistem analiticSistem celular
-
8/14/2019 Alcooloxidaza
3/7
SCHEMA DE LUCRU
Mod de lucru
Preinocul pe tuburi
cu geloza inclinata72 h 370 C
Inocul: cultura agitata
pe mediu la 380 C, 48 h
Mediu minimal de geloza
Mediu nutritiv agarizatColonii izolate din cultur stoc
Selectie naturala infunctie de capacitatea debiosinteza aalcooloxidazei
Biosinteza in culturasubmersa, la 380 C, 36-44 h
Separare prin
centrifugarePurificare parial Celule
Mediu de cultura sterilizat
-
8/14/2019 Alcooloxidaza
4/7
Permeabilizareaperetilor celulari
Tampon fosfat de
sodiu 0,05-0,2 M
pH 7-9
Celule Hansenula polymorpha
Precipitare fractionata cu sulfat de amoniu 0-30% saturatie
Centrifugare
Supernatant
Proteine balast
Debriuri celulare
Temp 50 C
Dezagregare celule in moara cu bile (Dyno-Mill)
Centrifugare
Precipitat 0-30%
saturatie
Sulfat de
amoniu
Cicluri repetate deinghet-dezghet
Supernatant 30% saturatie sulfat de amoniu
-
8/14/2019 Alcooloxidaza
5/7
Precipitare fractionata cu sulfat de amoniu 30-60% saturatie
Centrifugare
Temp 50 C
Precipitat 60% saturatie
Supernatant 60%
saturatie sulfat deamoniu
Solubilizare
Omogenizare prin agitare magnetica
Centrifugare Particule insolubile
Sulfat deamoniu
apa distilata
Solutie de alcooloxidaza in prezenta de catalaza
Filtrare
Dializa Temp 50 C
-
8/14/2019 Alcooloxidaza
6/7
Glicerina
Adsorbtie selectiva
Catalaza adsorbita
Tampon fosfat
de sodiu 0,05-0,2 M pH 7-9 Agitare magnetica
Centrifugare
Solutie de alcooloxidaza fara catalaza
Conditionare
Produs finit: ALCOOLOXIDAZA
Aspect: lichid de culoare galbena, fara rezidii de decantare
Proprietati fizico-chimice: complex solubil in apa
Activitate alcooloxidazica: 32- 166 UI
Activitate catalazica: max 3% din activitatea initiala
Adsorbant pe baza desilice
Regenerare adsorbant
-
8/14/2019 Alcooloxidaza
7/7
Metoda colorimetrica de dozarea activitatii alcooloxidazei
Principiul metodei:cuplare doua reactii enzimatice
Reactivi si solutii:
1. Reactiv 1: peroxidaza+o-dianisidina in HCl+tampon fosfatde sodiu 0,05 M pH 7,5+ metanol
2. Solutie H2O2 0,08 M (solutie
stoc pentru construirea curbei
etalon)
3. Solutie HCl 1,2 N
Determinarea activitatii enzimatice
Proba Martor Blanc
Preparat enzimatic
(ml)
0,5 - -
Apa distilata (ml - - 0,5
Reactiv 1 (ml 1,0 1,0 1,0
Timp de reactie 30 secunde
HCl 1,2 N (ml 1,0 1,0 1,0
Preparat enzimatic(ml - 0,5
Colorimetrare la 446 nm
Calculare rezultate pe baza curbei de etalonare si exprimareaactivitatii in moli H2O2 consumat/ml preparat enzimatic/min
Alcooloxidazametanol+ O2 -----> aldehida formica+ H2O2
Peroxidaza
H2O2 + o-dianisidina redusa -----> 2 H2O + o-dianisidina oxidata