วภาพ 2554 ิทยาลยศิัากลป - Silpakorn University · 2013-08-15 ·...

การศกษาคณลกษณะของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสจากแกนตะวนเพอนาไปผลต ฟรกโตโอลโกแซคคาไรด

โดย

นางสาวศรสดา เคยอาษา

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

ปการศกษา 2554

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

สำนกหอ

สมดกลาง

CHARACTERIZATION OF FRUCTOSYLTRANSFERASE EXTRACTED FROM

JERUSALEM ARTICHOKE FOR FRUCTOOLIGOSACCHARIDES PRODUCTION

By

Miss Srisuda Keayarsa

A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree

Master of Science Program in BIOTECHNOLOGY

Department of Biotechnology

Graduate School, Silpakorn University

Academic Year 2011

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

สำนกหอ


บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร อนมตใหวทยานพนธเรอง “การศกษาคณลกษณะของเอนไซม ฟรกโตซลทรานสเฟอเรสจากแกนตะวนเพอนาไปผลตฟรกโตโอลโกแซคคาไรด” เสนอโดย นางสาวศรสดา เคยอาษา เปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

……........................................................... (ผชวยศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ)

คณบดบณฑตวทยาลย

วนท..........เดอน.................... พ.ศ............. อาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1. ผชวยศาสตราจารย ดร.บษราภรณ งามปญญา 2. ผชวยศาสตราจารย ดร.พมพชนก จตรพรย 3. อาจารย ดร.สวฒนา พฤกษะศร

คณะกรรมการตรวจสอบวทยานพนธ

.................................................... ประธานกรรมการ

(อาจารย ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม)

............/......................../..............

.................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ

(อาจารย ดร.สนทด วเชยรโชต) (ผชวยศาสตราจารย ดร.บษราภรณ งามปญญา) ............/......................../.............. ............/......................../..............

.................................................... กรรมการ .................................................... กรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.พมพชนก จตรพรย) (อาจารย ดร.สวฒนา พฤกษะศร) ............/......................../.............. ............/......................../.............

สำนกหอ


ง

52401205: สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ

คาสาคญ: แกนตะวน/ เอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส/ฟรกโตโอลโกแซคคาไรด ศรสดา เคยอาษา: การศกษาคณลกษณะของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสจากแกน

ตะวนเพอนาไปผลตฟรกโตโอลโกแซคคาไรด. อาจารยทปรกษาวทยานพนธ: ผศ. ดร.บษราภรณ งามปญญา, ผศ. ดร.พมพชนก จตรพรย, ดร. สวฒนา พฤกษะศร. 102 หนา.

งานวจยนมวตถประสงคเพอ วเคราะหกจกรรมเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสในแกนตะวนภายใตสภาวะ in vitro เพอใชเปนแหลงของเอนไซมสาหรบผลตฟรกโตโอลโกแซคคาไรดจากการศกษา พบวา กจกรรมของเอนไซมมความสมพนธกบปรมาณฟรกโตโอลโกแซคคาไรดในแตละระยะการเจรญเตบโตของแกนตะวน โดยหวสะสมอาหารของแกนตะวนอาย 105- 120 วน มปรมาณฟรกโตโอลโกแซคคาไรดและคากจกรรมของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสสงสด เทากบ 113 มลลกรมตอกรมนาหนกสด และ 0.103 - 0.098 หนวยตอมลลลตร เมอนาเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสมาทาใหบรสทธดวยเทคนคโครมาโตกราฟแบบแลกเปลยนประจลบ โครมาโต กราฟแบบสมพรรคภาพ และการกรองโดยใชเยอบางแบบอลตรา ตามลาดบ พบวา เอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสบรสทธทไดมคากจกรรมจาเพาะเทากบ 44.402 หนวยตอมลลกรมโปรตน มความบรสทธเพมขน 43.275 เทา ทางานไดดทพเอช 5.4 อณหภม 35 องศาเซลเซยส มคา Km และ Vmax

สาหรบซโครส เทากบ 0.372 โมลาร และ 1.218 ไมโครโมลตอมลลลตรตอชวโมง โดยพบการทางานของเอนไซมทเพมมากขนเมอม pyridoxal-HCl ในขณะท KI มผลในการยบยงการทางานของเอนไซม นอกจากการวเคราะหคณลกษณะตางๆ ของเอนไซมแลวยงไดมการศกษาการสงเคราะหฟรกโตโอลโกแซคคาไรดโดยอาศยเอนไซมบรสทธทไดดวย ซงจากการศกษาพบวา เอนไซมบรสทธทได สามารถสงเคราะหฟรกโตโอลโกแซคคาไรดไดเมอใชซโครสเปนสารตงตน และเมอนาฟรกโตโอลโกแซคคาไรดทไดจากการสงเคราะหมาทดสอบคณสมบตความเปนพรไบโอตกพบวาสามารถสงเสรมการเจรญเตบโตของเชอทเปนโพรไบโอตกได

ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ บณฑตวทยาลย มหาวทยาศลปากร ปการศกษา 2554 ลายมอชอนกศกษา............................................................................ ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธ 1.............................2………………..3.................................

สำนกหอ


จ

52401205: MAJOR: BIOTECHNOLOGY KEY WORDS: JERUSALEM ARTICHOKE/ FRUCTOSYLTRANSFERASE/ FRUCTOOLIGOSACCHARIDES

SRISUDA KEAYARSA: CHARACTERIZATION OF FRUCTOSYLTRANSFERASE EXTRACTED FROM JERUSALEM ARTICHOKE FOR FRUCTOOLIGOSACCHARIDES PRODUCTION. THESIS ADVISORS: ASST. PROF. BUDSARAPORN NGAMPANYA, Ph.D. ASST. PROF. PHIMCHANOK JATURAPIREE, Dr.nat.techn. AND SUWATTANA PRUKSASRI, Ph.D. 102 pp. This research aimed to analyze the activity of fructosyltransferase (FTase) in Jerusalem artichoke under in vitro condition in order to use as enzyme source for fructooligosaccharides (FOS) production. The results showed the correlation of enzyme activity and amount of FOS in each growth stage of Jerusalem artichoke. Tuber of 105-120 days old plants gave the highest FOS amount and FTase activity at 113 mg/g FW and 0.103- 0.098 U/ml. When FTase was purified by anion exchange chromatography, affinity chromatography and ultrafiltration in sequentially, the purified FTase with specific activity of 44.402 U/mg proteins and purification fold of 43.275 was obtained. The optimal pH and temperature of purified FTase were 5.4 and 35˚C. The Km and Vmax values for sucrose were 0.372 M and 1.218 μmol. ml-1. h-1. The FTase activity was enhanced by pyridoxal-HCl, while KI had an effect to inhibit the activity of enzyme. In addition to characterize enzyme properties, the synthesis of FOS by action of this purified enzyme was analyzed as well. The results revealed the ability of purified FTase to synthesize FOS when sucrose was used as substrate. Additionally, prebiotic property of the FOS resulted from enzyme reaction was also evaluated and it was found that the FOS products had prebiotic property by promoting the growth of prebiotic bacteria. Department of Biotechnology Graduate School, Silpakorn University Academic Year 2011 Student’s signature……………………............ Thesis Advisors’signature1...................................2………………………3..................................

สำนกหอ


ฉ

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบนไดรบทนอดหนนการวจยจากสานกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต(วช.) และสาเรจไดดวยความกรณาอยางยงของ ผศ.ดร.บษราภรณ งามปญญา อาจารยทปรกษาวทยานพนธทไดใหความร คาปรกษา ขอแนะนา พรอมทงตรวจทานแกไขวทยานพนธฉบบนใหถกตองจนสาเรจสมบรณ และประสบผลสาเรจไปดวยด ผวจยขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ โอกาสน

ขอกราบขอบพระคณ ดร.สวฒนา พฤกษะศร ผศ.ดร.พมพชนก จตรพรย ดร.สนธวฒน ฤทธธรรม และ ดร.สนทด วเชยรโชต ทใหความกรณาเปนกรรมการในการสอบและใหคาปรกษา และขอเสนอแนะเพมเตมในการแกไขปรบปรงวทยานพนธฉบบนใหสาเรจสมบรณ ขอกราบขอบพระคณคณาจารยประจาภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากรทกทาน ทใหคาปรกษา และขอแนะนาอนเปนประโยชนตอการศกษาวจยในครงน ขอขอบคณนกวทยาศาสตร และเจาหนาทภาควชาเทคโนโลยชวภาพทกทานทใหความสะดวกและใหความชวยเหลอในดานเครองมอและอปกรณในการทาวจย

ขอขอบพระคณสานกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต (วช.) ทไดใหทนสนบสนนในการทาวจย

ขอกราบขอบพระคณบดา มารดา ผมพระคณทกทาน และครอาจารยทไดประสทธประสาทวชาความรใหกบผวจยทงในอดตและปจจบน

ขอบคณเพอน พ และนองๆ ทกคนทใหความชวยเหลอและคาแนะนาทเปนประโยชนในการทาวจยน

สำนกหอ


ช

สารบญ หนา บทคดยอภาษาไทย .................................................................................................................... ง

บทคดยอภาษาองกฤษ ............................................................................................................... จ

กตตกรรมประกาศ ..................................................................................................................... ฉ

สารบญตาราง ............................................................................................................................ ซ

สารบญภาพ............................................................................................................................... ญ

บทท 1 บทนา ....................................................................................................................... 1

ความเปนมาและความสาคญของปญหา .................................................... 1

วตถประสงค………………………….. ................................................................ 2

ขอบเขตของงานวจย…………………………………………………... ............... 2

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ……………………………………………………... 2

2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ…………………………………………………… ... 4

แกนตะวน (Jerusalem Artichoke) …………………….. ...................................... 4

ฟรกแทน (Fructans or polyfructosylsucroses) …. ................................................ 6

อนนลน (inulin) และ ฟรกโตโอลโกแซคคาไรด(fructooligosaccharide; FOS). ... 8

เอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส (fructosyltransferase; FTase) ......................... 12

3 วธการทดลอง………………………………………………………... ........................ 16

4 ผลและวจารณผลการทดลอง………………………………………….. ..................... 23

5 สรปผลการทดลอง………………………………………………………………… ... 48

บรรณานกรม………………………………………………………………………………….. 49

ภาคผนวก……………………………………………………………………………………… 54

ภาคผนวก ก……………………………………………………………………….. . 54

ภาคผนวก ข………………………………………………………………………… 58

ภาคผนวก ค………………………………………………………………………... 78 ประวตผวจย .............................................................................................................................. 102

สำนกหอ


ซ

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 ปรมาณอนนลน (เปอรเซนของนาหนกสด) ในพชอาหาร ................................... 5

2 องคประกอบของ Dahlia แกนตะวน (Jerusalem artichoke) และชโคร (chicory) 9

3 ปรมาณนาตาลนอนรดวซในใบ ลาตน ราก และหวสะสมอาหารของแกนตะวน

ทระยะเวลาตางๆ ...................................................................................... 24

4 คากจกรรมของเอนไซม FTase ในอวยวะแตละสวนของแกนตะวนทระยะเวลา ตางๆ .......................................................................................................... 26

5 ขนตอนการทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารแกนตะวน ............... 29

6 ความสมพนธของ Relative activity และพเอช (pH) ทเวลา 0 และ48 ชวโมง ...... 34

7 ความสมพนธของ Relative activity และอณหภมทเวลา 0 และ48 ชวโมง ........... 36

8 อทธพลของไอออนโลหะและรเอเจนต ตอกจกรรมของเอนไซม FTase .............. 38

9 เปรยบเทยบคาคงท Michaelis-Menten (Km) ของเอนไซม FTase กบ 1-SST

จากพชและจลนทรยชนดอน ..................................................................... 40

10 แสดงความสมพนธระหวางนาหนกโมเลกลของโปรตนกบปรมาตรทถกชะออกจาก

คอลมน ...................................................................................................... 66

11 ปรมาณนาตาลในแกนตะวนอายชวงอายตางๆ ..................................................... 79

12 กจกรรมของเอนไซม FTase ของแกนตะวนระยะตางๆ ....................................... 83

13 ผลการทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารแกนตะวน ....................... 85

14 ผลการศกษาพเอชทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม FTase ......................... 86

15 ผลการศกษาพเอชทเสถยรของเอนไซม FTase..................................................... 88

16 ผลการศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม FTase ..................... 90

17 ผลการศกษาอณหภมทเสถยรของเอนไซม FTas ................................................. 92

18 ผลการศกษาไออนของโลหะและรเอเจนตตอการทางานของเอนไซม FTase ...... 93

19 ผลการศกษาคาจนพลศาสตรของเอนไซม FTas .................................................. 95

20 FOS จากเอนไซม FTase ...................................................................................... 97

21 คาพเอชของอาหาร MRS ทเพาะเลยงเชอ Bifidobacterium sp. ............................ 97

22 ปรมาณ Bifidobacterium sp.ในอาหารเลยงเชอ MRS ทมแหลงคารบอนชนดตางๆ

ในเวลาทเปลยนไป .................................................................................... 98

สำนกหอ


ซ

ตารางท หนา 23 นาตาลทงหมดในอาหารเลยงเชอทมแหลงคารบอนชนดตางๆในเวลาทเปลยนไป 99

24 นาตาลรดวซในอาหารเลยงเชอทมแหลงคารบอนชนดตางๆในเวลาทเปลยนไป . 99

สำนกหอ


ญ

สารบญภาพ

ภาพท หนา 1 ดอกแกนตะวน .................................................................................................... 3

2 โครงสรางของฟรกแทนชนดตางๆ ...................................................................... 7

3 เมทาบอลอซมของคารโบไฮเดรตในเซลลพช ..................................................... 8

4 โครงสรางของฟรกโตโอลโกแซกคาไรด ............................................................. 9

5 การสงเคราะห fructans ชนดตางๆ ในพช โดยการทางานของเอนไซม FTase ..... 12

6 แกนตะวน ระยะตางๆ .......................................................................................... 23

7 โครมาโตแกรมของการทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของ

แกนตะวนอาย 105- 120 วนโดยใช anion exchange chomatography ชนด

ตวกลางเปน Q sepharose .......................................................................... 27

8 โครมาโตแกรมของการทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของ

แกนตะวนอาย 105- 120 วนโดยใช affinity chomatography ชนดตวกลาง

เปน con A sepharose................................................................................. 28

9 SDS-PAGE ของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน .................. 30

10 ความสมพนธระหวางคานาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานทง 5 ชนด

กบปรมาตรของบฟเฟอรทโปรตนมาตรฐานถกชะออกมา ........................ 31

11 ผลของคาพเอชทมตอกจกรรมของเอนไซม FTase จากแกนตะวน ...................... 33

12 ผลของอณหภมทมตอกจกรรมของเอนไซม FTase จากแกนตะวน ..................... 35

13 Lineweaver Burk plot ของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน .. 39

14 Michaelis-Menten ของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน ....... 39

15 โครมาโตแกรมของการสงเคราะห FOS ในสภาวะ in vitroโดยใชเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธบมท 0 ชวโมงและ บมท 144 ชวโมง ......... 42

16 การเปลยนแปลงของปรมาณนาตาลรวมในอาหาร MRS ทมแหลงคารบอนท

แตกตางกน ................................................................................................ 44

17 ปรมาณเซลล Bifidobacterium sp. ในอาหาร MRS ทมแหลงคารบอนทแตกตางกน

กบเวลา ...................................................................................................... 45

18 การเปลยนแปลงของพเอชในอาหาร MRS ทมแหลงคารบอนทแตกตางกนกบเวลา 45

สำนกหอ


ฎ

ภาพท หนา 19 การเปลยนแปลงปรมาณนาตาลรดวซ ในอาหาร MRS ทมแหลงคารบอนทแตก

ตางกนกบเวลา ........................................................................................... 46

20 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสโดยการวเคราะหดวยวธ DNS ........................ 60

21 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสโดยการวเคราะหดวยวธ Phenol sulfuric ........ 61

22 กราฟมาตรฐานของ BSAโดยการวเคราะหดวยวธ Bradford ................................ 62

23 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสโดยการวเคราะหดวยวธ Somogyi – Nelson .. 64

24 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสโดยการวเคราะหดวยวธ

Glucose Oxidase –Peroxidase ................................................................ 65

25 โครมาโตแกรมสารมาตรฐานนาตาลซโครสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC ....... 68

26 กราฟมาตรฐานของนาตาลซโครสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC ...................... 69

27 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน 1-kestose จากการวเคราะหดวยวธ HPLC ............. 69

28 กราฟมาตรฐานของ 1-kestose จากการวเคราะหดวยวธ HPLC ............................ 70

29 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน nystose จากการวเคราะหดวยวธ HPLC ................ 71

30 กราฟมาตรฐานของ nystose จากการวเคราะหดวยวธ HPLC ............................... 71

31 โครมาโตแกรมสารมาตรฐานนาตาลฟรกโตสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC .... 72

32 กราฟมาตรฐานของนาตาลฟรกโตสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC ................... 73

33 โครมาโตแกรมสารมาตรฐานนาตาลกลโคสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC ....... 73

34 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคส จากการวเคราะหดวยวธ HPLC ..................... 74

35 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน inulin from chicory จากการวเคราะหดวยวธ HPLC 74

36 กราฟมาตรฐานของ inulin from chicory จากการวเคราะหดวยวธ HPLC ............ 75

37 กราฟมาตรฐานของเชอ Bifidobacterium sp. ........................................................ 77

สำนกหอ


1

บทท 1

บทนา

ความเปนมาและความสาคญของปญหา แกนตะวน หรอ Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) เปนพชทมหวใตดน

(tuber) ทาหนาทสะสมสารอาหารจาพวกฟรกแทน (fructan) ไดแก ฟรกโตโอลโกแซคคารไรด (fructooligosaccharides หรอ FOS) และอนลน (inulin) โดย FOS เปน fructan ทม degree of

polymerization (DP) ตงแต 3 ไปจนถง 7-10 และมหนวยของกลโคสตออยทปลาย (Suzuki 1993)

จดเปนคารโบไฮเดรตชนดทไมสามารถยอยไดโดยเอนไซมในกระเพาะอาหารและลาไสเลก ของคนแตสามารถยอยไดโดยจลนทรยทเปนประโยชนในลาไสใหญ เชน Lactobacillus และ Bifidobacteria จงชวยเสรมสรางภมตานทานและยงสามารถยบยงการเจรญเตบโตของจลนทรยกอโรคบางชนดทาให FOS ถกจดจาแนกเปนสารพรไบโอตก (prebiotic) ทมการนาเอาไปใชประโยชนมากขนในอตสาหกรรมอาหารเสรมสขภาพคนและอาหารสตว (นมต และ สนน 2549;

เยาวมาลย และคณะ 2549) สาหรบการสะสมของ FOS นนพบในพชหลายชนด แตชนดทมการสะสมในปรมาณมากและมการนามาใชประโยชนในระดบอตสาหกรรม ไดแก ชคอร (chicory)

และแกนตะวน จงไดมการสงเสรมใหปลกแกนตะวนในประเทศไทยเพอรองรบอตสาหกรรมทตองใชแกนตะวนเปนวตถดบทกาลงขยายตวและเปนการลดการนาเขา FOS จากตางประเทศ แตการสกดเอา FOS จากแหลงของพชวตถดบทเพาะปลกตามสภาพธรรมชาตมาใชกมกประสบกบปญหาในเรองของการไมสามารถควบคมปรมาณและคณภาพของผลผลตได เชนเดยวกนกบการสกดเอา FOS จากแกนตะวนมาใชประโยชนกพบปญหาตางๆ เชนเดยวกน โดยปรมาณและชนดของ FOS ทไดจะขนกบปจจยตางๆทงทควบคมไดและไมได ไดแก พนธทปลก สภาพภมประเทศ และภมอากาศ (Schorr-Galindo และ Guiraud 1997) การรบกวนของโรคโคนเนาและหวเนา (วสทธ และคณะ 2550) ระยะเวลาการเกบเกยว และสภาวะในการเกบรกษา (Srikhampa และ Uriyapongson 2008) เปนตน ดงนนเพอใหได FOS ทมคา DP ทเหมาะสมตอการนาไปใชประโยชน จงเกดความสนใจทจะผลต FOS ทมความสมาเสมอทงในดานปรมาณและคณภาพเพอนาไปใชประโยชนไดอยางจาเพาะตอไป ซงการนาเอนไซมทเกยวของกบการสงเคราะห FOS ซงกคอ เอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส (fructosyltransferase หรอ FTase) (Van der Meer และคณะ

1998) มาใชกนาจะเปนอกแนวทางหนงทนาจะเขามาชวยไดเพราะเราสามารถกาหนดสภาวะทใชในการผลตได ซงจะพบเอนไซมดงกลาวนไดในจลนทรยและพชบางชนดทมการสะสมสารจาพวก fructan สาหรบหวสะสมอาหารของแกนตะวนนนมการสะสม FOS สงถง 14-19 เปอรเซนต จง

สำนกหอ


2

นาจะเหมาะสาหรบนามาใชเปนแหลงของเอนไซม ดงนน งานวจยนจงสนใจทจะแยกและทาบรสทธเอนไซม FTase จากแกนตะวน ตลอดจนศกษาคณลกษณะตางๆของเอนไซม FTase ทแยกได เพอนามาใชในการผลต FOS ในสภาวะ in vitro ซงหากงานวจยนสาเรจลงไดกจะเปนการเพมชองทางในการผลต FOS โดยอาศยเอนไซม FTase จากแกนตะวนและสามารถควบคมใหไดผลผลตทมคา DP ทตองการเพอนาไปใชในผลตภณฑอาหารเสรมตอไป

วตถประสงค 1. เพอศกษาการแยกและทาบรสทธเอนไซม FTase จากแกนตะวน 2. ศกษาคณลกษณะเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธ 3. ศกษาการสงเคราะห FOS โดยอาศยเอนไซม FTase ทแยกได

ขอบเขตงานวจย

1. ศกษาความสมพนธระหวางการเจรญเตบโตของแกนตะวนกบการสะสม FOS และ คากจกรรมของเอนไซม FTase

2. ศกษาการทาบรสทธเอนไซม FTase จากแกนตะวน

3. ศกษาคณลกษณะดานตางๆ ของเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธ 4. ศกษาการนาเอนไซม FTase จากแกนตะวนไปใชในการสงเคราะห FOS ในสภาวะ in vitro

5. ศกษาคณสมบตความเปนพรไบโอตกของ FOS ทสงเคราะหไดจากเอนไซม FTase

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

1. ทราบถงการทาบรสทธและคณลกษณะของเอนไซม FTase ทแยกไดจากแกนตะวน

2. ทราบแนวทางการนาเอนไซม FTase ทแยกไดจากแกนตะวน ไปใชในการสงเคราะห FOS

สำนกหอ


3

บทท 2

เอกสารและงานวจยทเกยวของ

1. แกนตะวน (Jerusalem Artichoke)

แกนตะวน (Jerusalem Artichoke) มชอทางวทยาศาสตรวา Helianthus tuberosus L. จดอยในวงศ Asteraceae เปนพชลมลก มดอกสเหลองขนาดเลกคลายดอกบวตอง ดงภาพท 1 ลาตนมกงตงขนาดเลกและมขนกระจายทวลาตน ใบมลกษณะเรยวยาวคลายรปไข ขอบใบมรอยหยก มหวใตดนสะสมอาหาร (tuber) ลกษณะเปนตะปมตะปา รปรางคลายขง ผวเปลอกเปนสนาตาลออน เนอในสขาว มอายการเกบเกยวประมาณ 120 วน แกนตะวนมถนกาเนดแถบทวปอเมรกาเหนอ และไดมการนามาปลกในแถบทวปยโรปอยางแพรหลาย ในเขตหนาว เขตกงหนาว และเขตรอน ในประเทศไทยไดมการนาเขามาปลกพบวาสามารถเจรญเตบโตและปรบตวไดดใหผลผลตสงมตนทนในการปลกและดแลรกษานอย แมในบางพนทมความอดมสมบรณของดนตา นอกจากนนยงสามารถนาหวมาปลกเปนแปลงไมดอกประดบ เพอเปนทพกผอนหยอนใจ หวทไดเมอตนแกแลวสามารถนาหวมาใชประโยชนในการเปนอาหารของคนเราไดหลายอยาง (สนน และคณะ 2549)

ภาพท 1 ดอกแกนตะวน

(ทมา: http://www.rakloma.org/popup_contentrakloma.cr.php?id=65)

สำนกหอ


4

ฤดการปลกแกนตะวน สามารถปลกไดทกฤด ตนฤดหรอปลายฤดฝนในพนทไร ควรมการใหนาฝนทงชวง และในสภาพนาใหนาชลประทานในฤดแลง ออกดอกเมออายประมาณ 60-65 วนหลงปลก อายการเกบเกยวประมาณ 100-120 วน หรอสงเกตจากดอกรวงเกอบหมด และลาตนเปลยนเปนสนาตาล และตนเรมแหง

การเจรญเตบโต

การเจรญเตบโตสามารถแบงออกไดเปน 2 ชวง คอ ชวงแรก เรยกวา slow tuber growth คอ นบจากวนปลกจนถงออกดอกแรก และระยะทสอง เรยกวา rapid tuber filling ซงเรมจากดอกแรกบานจนถงเกบเกยว โดยในชวงของการเจรญเตบโตชวงแรกนน อาหารทสรางไดจะสะสมไวทใบและลาตน หลงจากนนใบจะเรมแกและหลดรวง อาหารทสรางและสะสมไวทลาตนและใบจะเคลอนยายไปสหว (นมต และสนน 2549)

การปลกและการดแลรกษา การปลกแกนตะวนจะทาโดยตดหวใหเปนชนขนาด 3-5 เซนตเมตร แลวนามาบมในแกลบดา

ชนเพอชกนาใหเกดตนออน ประมาณ 1 สปดาหนาตนออนมาปลกใหลกประมาณ 1-2 เซนตเมตร ระยะปลก 50x50 เซนตเมตร ดนปลกควรมความชนสง โดยดนทเหมาะสม คอ ดนรวนปนทรายระบายนาด การกาจดวชพชทา 1-2 ครง เมอตนมความสงประมาณ 15 เซนตเมตร ควรใสปย 15-15-15 อตรา 25 กโลกรมตอไร การเกบเกยวโดยทวไปใชพลวขด และถอนดวยมอ ผลผลตหวสด ประมาณ 2-3 ตนตอไร ทงนขนอยกบฤดปลก แหลงปลก และการจดการผลต แกนตะวนมดอกบานเมออายประมาณ 2 เดอน และมดอกทยอยบานอยประมาณ 2 เดอน จงเหมาะปลกเปนไมกระถางหรอปลกเปนแปลงไมดอกในบานเพอใชเปนไมดอกไมประดบบานเรอนใหสวยงามได เมอตนเรมแกกทาการเกบเกยวลางทาความสะอาดหวใสถงพลาสตก เกบไวในตเยนสาหรบใชรบประทานเพอสขภาพ สามารถเกบไวในตเยนไดนาน 6-8 เดอน

โรคทพบในแกนตะวน

1) โรครากเนาโคนเนา ลกษณะอาการ โรคนเกดจากเชอรา จะเกดบรเวณโคนตนใกลกบผวดน อาการเรมแรกคอหวจะ

เปนจดและเปลยนเปนสนาตาล จากนนจะเรมเนา ใบจะเหลองซดรวงหลน กงเรมแหงและตายในทสด การปองกนอาจทาโดยการกาจดวชพชบรเวณโคนตนใหสะอาด และการปลกควรปลกใหมระยะทเหมาะสมเพอใหแสงแดดสองถงโคนตน และอยาใหนาขงบรเวณโคนตนเปนเวลานานๆ

สำนกหอ


5

2) แมลงศตร

เพลยออน ทงตวออนและตวเตมวยสามารถเขาทาลายแกนตะวนโดยการดดกนนาเลยงยอดออนและใบเมอเรมผลออกมา ทาใหใบหงกงอไมเจรญเตบโต จะพบระบาดมากเมอฝนทงชวงโดยมมดเปนพาหนะในการแพรกระจาย

3) เชอโรคทตดมากบหวพนธ เชอ Sclerotium sp. ทกอใหเกดโรคราเมลดผกกาด เมอนาหวทปนเปอนเชอมาขยายพนธจะทา

ใหเกดโรคขน

ประโยชนของแกนตะวน

หวใตดนของแกนตะวนมการสะสมคารโบไอเดรตสวนใหญอยในรปของอนนลน (innulin) และ ฟรกโตโอลโกแซคคารไรด (Fructooligasaccharride หรอ FOS) มากถง 14-19เปอรเซนต เมอเปรยบเทยบกบพชชนดอน ดงตารางท 1 จงทาใหมรสชาตหวานเลกนอย การบรโภคหวแกนตะวนจงเปนประโยชนตอผปวยทเปนโรคเบาหวาน เนองจากไมไปเพมปรมาณนาตาลในเลอด มกากใยอาหารสงทาใหดตอระบบขบถาย และยงพบวา การเสรมสารสกดของพชชนดนในอาหารสตว เพอชวยลดปรมาณแอมโมเนยในระบบทางเดนอาหารและในสงขบถาย ทาใหลดปรมาณสารททาใหเกดกลนเหมนในสงขบถาย (เยาวมาลย และคณะ 2549)

ตารางท 1 ปรมาณอนนลน (%ของนาหนกสด) ในพชอาหาร (Van Loo และคณะ 1995) Source Edible parts Dry solids content Inulin content

Onion Bulb 6.0-12.0 2.0-6.0

Jerusalem artichoke Tuber 19.0-25.0 14.0-19.0

Chicory Root 20.0-25.0 15.0-20.0

Leek Bulb 15.0-20.0* 3.0-10.0

Garlic Bulb 40.0-45.0* 9.0-16.0

Artichoke Leaves-heart 14.0-16.0 3.0-10.0

Banana Fruit 24.0-26.0 0.3-0.7

Rye Cereal 88.0-90.0 0.5-1.0*

Barley Cereal NA 0.5-1.5*

Dandelion leaves 50.0-55.0* 12.0-15.0

Burdock Root 21.0-25.0 3.5-4.0

สำนกหอ


6

ตารางท 1 (ตอ)

Source Edible parts Dry solids content Inulin content

Camas Bulb 31.0-50.0 12.0-22.0

Murnong Root 25.0-28.0 8.0-13.0

Yacon Root 13.0-31.0 3.0-19.0

Salsify Root 20.0-22.0 4.0-11.0

NA, data not available. *Estimated value

2. ฟรกแทน (Fructans or polyfructosylsucroses)

ฟรกแทน (fructans) เปนชอสามญของพอลเมอรของฟรกโตสทพบไดในธรรมชาต การสงเคราะห fructans สามารถพบไดทงในแบคทเรย เชอรา และพชดอกทเปนทงพชใบเลยงค และพชใบเลยงเดยวบางประเภท โดย fructans ทไดจากแบคทเรยและเชอราจะมความแตกตางจาก fructans ทไดจากพชคอ มคา degree of polymerization (DP) ทสงมากทาใหมความยาวของสายโซนาตาลฟรกโตสระหวาง 10,000 - 100,000 หนวย นอกจากนยงมลกษณะโครงสรางเปนกง (branching) มากกวา 15

เปอรเซนต โดยชนดของ fructans ทพบในแบคทเรยและเชอรา เรยกวา ลแวน (levan) สวน

fructans ทผลตจากพชจะมโครงสรางสวนใหญเปนเสนตรง (linear) ยกเวนในพชใบเลยงเดยจะมโครงสรางเปนกงเลกนอย (1 - 2 เปอรเซนต) คา DP ของ fructans ทพบในพชจะตากวาทพบในแบคทเรยและเชอรา โดยจะมความยาวของสายโซนาตาลฟรกโตส ตงแต 2 ไปจนถง 200-300 หนวย

โดยทวไปแลวในพชตางชนดกนจะมปรมาณและชนดของ fructans ทแตกตางกน โดยในพชสกล Asteraceae Liliaceae และ Poaceae จะมการสะสมชนดของ fructans ทเรยกวา อนนลน (inulins) อนนลนชดใหม (inulin neo-series) และ levan หรอ phleins ตามลาดบ โดยโครงสรางทวไปของ fructans ชนดตางๆ มองคประกอบและโครงสรางดงแสดงในภาพท 2

สำนกหอ


7

ภาพท 2 โครงสรางของฟรกแทนชนดตางๆ (a) อนนลน (inulins), (b) อนนลนนโอซรย (inulin

neo-series), (c) ลแวน (levan, phlein), (d) graminan (Ritsema และ Smeekens 2003)

การสงเคราะห fructans ในพชจะเกดในสวนของแวควโอล (vacuole) ดวยการทางานรวมกนของเอนไซม FTase อยางนอยสองชนด โดยสารเรมตนทใชในการสงเคราะหกคอ นาตาลซโครสทไดจากการสงเคราะหดวยแสง (photosynthesis) ดงรายละเอยดทแสดงในภาพท 3 โดยพชจะมการตอบสนองตอสภาวะแวดลอมทเปลยนแปลงไปดวยการปรบเปลยนความยาวเฉลยของสายโซนาตาลฟรกโตสทเปนองคประกอบยอยของ fructans ดงเหนไดจากการทพชจะมการสะสม fructans มากขนเพอปรบคาแรงดนออสโมตก (osmotic potential) เมออยในภาวะแหงแลงและหนาวเยน ซงเปนการแสดงใหเหนอกบทบาทหนงของ fructans ในพชนอกเหนอไปจากการทาหนาทเปนแหลงอาหารสะสม (Vijn

และ Smeekens 1999) สาหรบชนดของ fructans ทไดรบความสนใจและมการนาไปใชประโยชนในอตสาหกรรมอาหารเสรมสขภาพกคอ inulin และ FOS

สำนกหอ


8

ภาพท 3 เมทาบอลซมของคารโบไฮเดรตในเซลลพช (Vijn และ Smeekens 1999)

1 หมายถง fructosyltransferases และ 2 หมายถง invertase

3. อนนลน (inulin) และ ฟรกโตโอลโกแซคคาไรด (fructooligosaccharide; FOS)

inulin และ FOS ประกอบขนจากนาตาลฟรกโตสเชอมตอกนหลาย ๆ โมเลกลเปนเสนตรงดวยพนธะเบตา 2, 1 ไกลโคซดก (β-2,1 glycosidic linkage) โดยโครงสราง inulin และ FOS จะประกอบดวยโมเลกลของกลโคสหนงโมเลกลอยทปลายดานหนงของสายโซ (ภาพท 4) มสตรโครงสรางทางเคมทวไปเปน GFn โดย n แสดงถงคา DP ซงหมายถง จานวนโมเลกลของนาตาล ฟรกโตสทเชอมตอกนภายในสายพอลแซกคาไรด (polysaccharides) สาหรบ FOS ทมคา DP ตาสดคอ GF2 เรยกวา 1-คสโตส (1-ketose) ถดมาคอ GF3 เรยกวา นสโตส (nystose) และ GF4 เรยกวา 1-เบตา-ฟรกโตฟราโนซลนสโตส (1- β-fructofuranosylnystose) ตามลาดบ โดยทวไป inulin จะมคา DP ตงแต 2 ถง 60 (Roberfroid และคณะ 1997; Niness 1999) และ FOS จะมคา DP อยในชวง 2 ถง 10 (Suzuki

1993)โดยคา DP ของ inulin และ FOS จะขนอยกบชนดของพชวตถดบ ดงแสดงในตารางท 2

สำนกหอ


9

ภาพท 4 โครงสรางของฟรกโตโอลโกแซกคาไรด (Van Loo และคณะ 1995) ตารางท 2 องคประกอบของ Dahlia แกนตะวน (Jerusalem artichoke) และชโคร (chicory) (Franck

และ Leenheer 2005)

Dahlia Jerusalem artichoke Chicory

Roots / tubers Tonnes per ha

Range

25 42

35-60

43.5

25-75

DM % Average

Range

18

15-22

22

19-25

22.4

20-25

Inulin (%) Average

Range

11

10-12

16

14-18

16.6

14.9-18.3

Inulin (tonnes per

ha)

2.5-3 4.5-8.5 5-11

Mean DPn 13-20 6-10 10-14

DM, dry matter; DP, degree of polymerization.

สำนกหอ


10

คณสมบตของ inulin และ FOS

1. การไมถกยอยสลายในระบบทางเดนอาหาร

FOS ไมสามารถถกยอยสลายโดยเอนไซมซงอยในระบบยอยอาหารของคนและสตว นอกจากนยงไมถกยอยสลายและดดซมในลาไสเลก แตจะเกดการหมกโดยจลนทรยทเปนประโยชนในลาไสใหญ เชน แลคโตบาซลส (Lactobacillus) และ บฟโดแบคทเรย (Bifidobacteria) ในลาไสใหญ ในกระบวนการหมกนจะเกดกรดไขมนสายสน ๆ (short chain fatty acid หรอ SCFA) ซง SCFA ทออกมาเชน กรดแอซตก กรดบวทวรก และกรดโพรพโนอก อกทงยงเกดคารบอนไดออกไซด มเทน และไฮโดรเจนออกมาเปนผลตภณฑสดทายของกระบวนการหมก กรดไขมนสายสนเหลานจะถกดดซมทางลาไสใหญ และเกดเมแทบอลซมใหเปนพลงงาน เมอเกดการหมกอยางสมบรณทลาไสใหญจะใหพลงงานประมาณ 2 กโลแคลอรตอกรม FOS หรอเทากบเปนครงหนงของพลงงานทไดจากซโครส

ดงนน FOS จงเปนสารใหความหวานทใหพลงงานตา เหมาะสาหรบการใชเปนสวนประกอบในอาหารสาหรบผทตองการควบคมนาหนก

2. ผลของ inulin และ FOS ตอระดบฮอรโมนอนซลน

เนองจาก inulin และ FOS ไมสามารถถกยอยไดโดยเอนไซมของมนษยและสตวจงไมถกดดซมเขาสกระแสเลอด ดงนนจงไมมผลตอระดบนาตาลในเลอด และไมมผลตอฮอรโมนอนซลนของตบออน ดงนน inulin และ FOS สามารถใชเปนสารใหความหวานในอาหารของผปวยโรคเบาหวานได

3. การบรโภค inulin และ FOS ไมกอใหเกดฟนผ Streptococcus mutans เปนจลนทรยทอาศยในชองปากและเปนสาเหตของฟนผเนองจากการ

สรางกรดออกมา และกรดนจะกดผวฟนทาใหฟนกรอน และยงสรางบตากลแคนซงจะยดจบกบตวฟนทาใหเกดคราบจลนทรย (plaque) ซงจลนทรยนไมสามารถใช inulin และ FOS เปนแหลงอาหารได จงทาใหไมสามารถผลตกรดททาใหฟนผ ดงนน inulin และ FOS จงจดเปนสารใหความหวานทไมกอใหเกดฟนผและเหมาะทจะนาไปผสมในผลตภณฑลกอม หมากฝรง เครองดม เปนตน

4. เปนพรไบโอตก (Prebiotic)

ในป 1995 ไดมการทดลองกบมนษย พบวา inulin และ FOS จดเปนพรไบโอตก (prebiotic) ซงตามนยามของ Roberfroid และ Gibson ในป ค.ศ. 1993 โดยคาวา พรไบโอตก มความหมายวาสวนประกอบของอาหารทไมยอยและดดซมในระบบทางเดนอาหาร และสามารถเพมปรมาณแบคทเรยชนดเฉพาะเจาะจงทมอยตามปกตใน ลาไสใหญ เชน บฟโดแบคทเรย และแลคโตบาซลลส และสงผลดตอสขภาพ มการทดลองในมนษยโดยให FOS ทขนาดรบประทาน 5-20 กรมตอวน เปนเวลา 15 วน

สามารถเพมปรมาณแบคทเรยประจาถนทอาศยอยในลาไสใหญของมนษย ชนดบฟโดแบคทเรยและแลกโตบาซลลส ในลาไสได (Roberfroid และ Gibson 1993) และเปนททราบกนอยแลววาบฟโด

สำนกหอ


11

แบคทเรยเปนจลนทรยทมประโยชนตอเจาบาน (host) ทถกอาศย ผลตอสขภาพนรวมถงการกระตนระบบภมคมกน ปองกนการเจรญของจลนทรยกอโรค (pathogen microorganism) (Roberfroid และคณะ 1997)

5. กระตนการดดซมแคลเซยม

ในผสงอายโรคกระดกพรน (Osteoporosis) เปนโรคทสาคญ ซงมผลกระทบตอผหญงวยหลงหมดประจาเดอน เพอตอสกบโรคน การสญเสยมวลกระดกตองนอยทสดเมออายมากขน และมวลกระดกตองมากทสดเมออยในวยรน การรบประทาน inulin และ FOS สามารถทาใหกลไกทงสองดขนโดยการพฒนาการนาแคลเซยมเขารางกายโดยรบจากอาหาร ภาวะหนงในสามของการดดซมแคลเซยมมาจากระบบยอยอาหาร การหมก FOS ในลาไสใหญจะผลตกรดไขมนสายสน ๆ ซงเปนสาเหตใหพเอชในลาไสลดลง โดยแคลเซยมทวไปจะอยในรปเกลอไมละลายนา ซงพเอชทลดลงทาใหแคลเซยมละลายนาได และสามารถถกดดซมไดงายขน

ปจจบน FOS จงมการนาเอาไปใชประโยชนมากขนในอตสาหกรรมอาหารเสรมสขภาพ

ของคนและอาหารสตว (นมต และ สนน 2549; เยาวมาลย และคณะ 2549) สาหรบการสะสมของ ฟรกโตโอลโกแซคคาไรด นนพบในพชหลายชนด แตชนดทมการสะสมในปรมาณมากและมการนามาใชประโยชนในระดบอตสาหกรรม ไดแก ชโคร (Chicory) และแกนตะวน แตการสกดเอา FOS

จากแหลงของพชวตถดบท เพาะปลกตามสภาพธรรมชาตมาใชมกประสบกบปญหาทไมสามารถควบคมปรมาณและคณภาพของผลผลตไดเชนเดยวกบการสกดเอา FOS จากแกนตะวนมาใชประโยชนกพบปญหาตางๆ เชนเดยวกน โดยปรมาณและชนดของ FOS ทไดจะขนกบปจจยตางๆทงทควบคมไดและไมได ไดแก พนธทปลก สภาพภมประเทศและอากาศ (Schorr- Galindo และ Guiraud 1997) การรบกวนของโรคโคนเนาและหวเนา (วสทธ และคณะ 2550) ระยะเวลาการเกบเกยวและสภาวะการเกบรกษาเพอใหได ฟรกโตโอลโกแซคคาไรด ทมคา DP ทเหมาะสมตอการนาไปใชประโยชน (Srikhampa และ Uriyapongson 2008) เปนตน ทาใหเกดความสนใจทจะผลต FOS ทมความสมาเสมอทงในดานปรมาณและคณภาพเพอนาไปใชประโยชนไดอยางจาเพาะตอไป การนาเอนไซมทเกยวของกบการสงเคราะห FOS คอ เอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส (fructosyltransferase หรอ FTase) (van

der Meer และคณะ1998) มาใชกนาจะเปนอกแนวทางหนงทสามารถทาไดเพราะเราสามารถกาหนดสภาวะทใชในการผลตได ซงจะพบเอนไซมดงกลาวนไดในจลนทรยบางชนดและพชบางชนดทมการสะสมสารจาพวก fructans สาหรบหวสะสมอาหาร (tuber) ของแกนตะวนนนมการสะสม inulin และ FOS สงถง 14-19 เปอรเซนต จงนาจะเหมาะสาหรบนามาใชเปนแหลงผลตใหมของเอนไซม FTase

สำนกหอ


12

4. เอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส (fructosyltransferase หรอ FTase)

FTase เปนเอนไซมทเกยวของในกระบวนการสงเคราะห fructans สามารถพบไดในพชท มการสะสม fructans ในเซลล เอนไซมทอยในกลม FTase นนมหลายชนด ไดแก 1-SST, 1-FFT,

6G-FFT, 6-SFT การทางานของเอนไซมแตละชนดจะทาใหได fructans ชนดตางๆ ทมโครงสรางโมเลกลทมความแตกตางกน ดงแสดงในภาพท 5

ภาพท 5 การสงเคราะห fructans ชนดตางๆ ในพช โดยการทางานของเอนไซม FTase

(Van den Ende และคณะ 2002)

โดยแกนตะวนมการสะสม fructans ชนดทเปน inulin ทเกดจากการทางานรวมกนของเอนไซม FTase 2 ชนด ในป ค.ศ. 1968 Elderman และ Jefford ไดศกษาการสงเคราะห inulin จากแกนตะวน (Helianthus tuberosus L.) และเสนอแบบจาลองการสงเคราะห fructansในพชทเกยวของกบเอนไซม FTase 2 ชนดคอ sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase (1-SST, EC 2.4.1.99) และ fructose:

fructose fructosyltransferase (1-SST, EC 2.4.1.100) ขนมา โดยในขนแรก เอนไซม 1-SST จะทาหนาทเรงปฏกรยาการยายหนวยฟรกโตซลจากโมเลกลของนาตาลซโครสตวให (donor) ไปยงโมเลกลของนาตาลซโครสตวรบ (acceptor) ทาใหเกดผลตภณฑตวแรกเปน 1- kestose (GF2) (สมการท1) จากนนเอนไซม 1-FFT จะเรงปฏกรยาการสงเคราะห fructans ใหตอกนเปนโพลเมอรนาตาล ฟรกโตส

สำนกหอ


13

ทมสายยาวขน (สมการท 2) ซงผลจากปฏกรยาทงสองจะทาใหได fructans ทมความยาวของสายโซแตกตางกนผสมกนอย

สมการท 1 การเรงปฏกรยาการสรางไตรแซกคาไรดจาก 2 โมเลกลของซโครส โดยใชเอนไซม

1-SST

1-SST:

G 1-2 F + G 1-2 F G 1-2 F 1-2 F + G

Sucrose + Sucrose 1-kestose + glucose

สมการท 2 การเรงปฏกรยาการยายฟรกโตสจากตวใหไปยงตวรบโดยใชเอนไซม 1-FFT

1-FFT:

G 1-2 F (1-2 F) m + G 1-2 F (1-2 F)n G 1-2 F (1-2 F) m-1 + G 1-2 F (1-2 F)n

donor + acceptor donor + acceptor

m > 0 และ n ≥ 0

จากแบบจาลองการสงเคราะห fructans ของ Elderman และ Jefford ทาใหมพยายามทจะพสจนแบบจาลองดงกลาว โดยนกวทยาศาสตรหลายกลมไดแยกเอนไซมกลม FTase ออกมาจากพชชนดตางๆ ไดแก Jerusalem artichoke (Praznik และคณะ 1990; Luscher และคณะ 1992; Koops และ Jonker 1994;

Koops และ Jonker 1996; Luscher และคณะ 1996) Chicory (Singh และคณะ 1971; Van Den Ende

และVan laere 1993; Van Den Ende และคณะ1996; De Halleux และคณะ 1997; De Roover และคณะ 2000) Onion (Shiomi และคณะ1985) Asparagus (Shiomi และคณะ1980; Shiomi และคณะ 2007)

สาหรบ Jerusalem artichoke หรอ แกนตะวน มงานวจยตางๆ ทไดศกษาเกยวกบเอนไซมทเกยวของการสงเคราะห fructrans ทงในระดบยน (gene) (van der Meer และคณะ 1998) และโปรตน (Praznik และคณะ 1990; Luscher และคณะ 1992; Koops และ Jonker 1994; Koops และ Jonker 1996;

Luscher และคณะ 1996) การศกษาในระดบโปรตนจะเนนทการแยกและทาบรสทธเอนไซมในกลม FTase จากนนจะนามาศกษาคณลกษณะดานตางๆ ดงตวอยางของงานวจยตอไปน

ป ค.ศ. 1990 Praznik และคณะ ไดแยกและศกษาคณลกษณะของ sucrose: sucrose

fructosyltransferase (SST) จากสวนหวสะสมอาหารของ Helianthus tuberosus L. โดยเรมจากการสกดเอนไซมหยาบ แลวนามาตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟต ((NH4)2SO4) ทาใหบรสทธขนดวยเทคนคโครมาโตกราฟฟแบบ Hydrophobic และ gel filtration พบวา เอนไซมทไดมความบรสทธเพมขนถง 39.8 เทา มคา specific activity เทากบ 7.56 หนวยตอมลลกรมโปรตน มคาพเอช และอณหภมท

สำนกหอ


14

เหมาะสมตอการทางานท 5.4 และ 34 องศาเซลเซยส ตามลาดบ นอกจากนจากการศกษาจนพลศาตรของเอนไซมโดยใชซโครสเปนสารตงตน พบวา มคา Km เทากบ 42 มลลโมลาร และ Vmax เทากบ 0.21

ไมโครโมลาร ของนาตาลฟรกโตสทถกโอนยายในเวลา 1 ชวโมง

ป ค.ศ. 1992 Luscher และคณะ ไดศกษาการทาบรสทธเอนไซม Fructan: fructan

fructosyltransferase (FFT) ของ Jerusalem artichoke โดยการตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟต((NH4)2SO4) โครมาโตกราฟฟแบบ lectin chromatography และ ion-exchange chromatography จากนนศกษาถงคณลกษณะตางๆ ของเอนไซมทผานการทาบรสทธพบวา FFT มกจกรรมสงสดท พเอช 6.5

และมกจกรรมเพมมากขน 80 เปอรเซนต เมอนาเอนไซมมาบมทอณหภม 40 องศาเซลเซยส กอนการทาปฏกรยาเปนเวลา 1 ชวโมง และเมอใช 6-kestose, neokestose, maltose, raffinose และ maltotriose เปนสารตงตน จะพบวา เอนไซม FFT จะมการเคลอนยายหม fructosyl จาก oligofructan แตจะไมมการเคลอนยายหม glycosyl การศกษาจนพลศาตรของเอนไซม FFT โดยใชซโครสและโอลโกฟรกแทน (oligofructanss) มคา Km ประมาณ 0.2 มลลโมลาร อตราการเคลอนยายหม fructosyl จะเพมขนโดยขนกบคา DP และ 1-ketose จะเกดขนเมอมการใหหม fructosyl ไปยงซโครส

ป ค.ศ. 1994 Koops และ Jonker ไดทาบรสทธเอนไซม 1-FFT จากหวสะสมอาหารของ

Helianthus tuberosus L. แลวทาการศกษาคณลกษณะดวย electrophoresis พบวา เอนไซม 1-FFT มนาหนกโมเลกลประมาณ 70 กโลดาลตน ทางานไดดทชวงพเอชและอณหภมเทากบ 5.5 – 7.0 และ 25

– 35 องศาเซลเซยส

ป ค.ศ. 1996 Koops และ Jonker ไดศกษาการทาบรสทธและวเคราะหคณลกษณะของเอนไซมทใชการสงเคราะห fructans ในหวสะสมอาหารของ Helianthus tuberosus L. พนธColombia โดยการทาบรสทธเอนไซม 1-SST และศกษาคณลกษณะดวย gel filtration ภายใตสภาวะทอยในรปดงเดม

(native conditions) พบวา เอนไซม 1-SST มนาหนกโมเลกลประมาณ 67 กโลดาลตน ในขณะทการแยกโปรตนดวย SDS-PAGE พบแถบโปรตนทมนาหนกโมเลกลประมาณ 27 และ 55 กโลดาลตน เอนไซม 1-SST ทไดสามารถเรงปฏกรยาการเปลยนซโครสไปเปน trisaccharide 1-kestose (GF2) ได และสามารถเกดปฏกรยาการเปลยน GF2 เปน 1,1-nytose (GF3) ในอตราทตา และเมอนาเอนไซมผสมระหวาง 1-SST และ 1-FFT มาทดสอบการสงเคราะห fructans ในหลอดทดลองแลวพบวา สามารถสงเคราะห fructans ทม DP อยางนอยเทากบ 13

ป ค.ศ. 1996 Luscher และคณะ ไดสงเคราะหอนนลนโดยอาศยการทางานรวมกนของเอนไซม FTase 2 ชนดคอ 1- SST และ 1-FFT ทผานการทาบรสทธจากหวสะสมอาหารของ Jerusalem artichoke ซงเมอนาเอนไซมทง 2 ชนดมาบมรวมกนกบซโครสพบวา สามารถเกดผลตภณฑเปน oligofructosides ทมคา DP ถง 20

สำนกหอ


15

งานวจยทเกยวของกบการแยก การทาบรสทธ และศกษาคณลกษณะของเอนไซม FTase ในแกนตะวนนนมอยมากพอสมควร แตงานวจยทงหมดไดศกษาในแกนตะวนสายพนธทมการปลกในแถบประเทศทมภมอากาศหนาวเยน ซงคณลกษณะและการทางานของเอนไซม FTase คอนขางคลายคลงกน มความแตกตางกนบางเลกนอยเนองมาจากปจจยทางพนธกรรมของพชวตถดบและสภาพภมประเทศและภมอากาศทใชในการเพาะปลก สาหรบแกนตะวนทมการนามาปลกในประเทศไทยซงเปนประเทศในเขตรอนชน ยงไมเคยมการศกษาในลกษณะดงกลาว ดงนน งานวจยนจงสนใจทจะแยกและทาบรสทธเอนไซม FTase จากแกนตะวนสายพนธทไดรบการปรบปรงใหปลกในประเทศไทย ตลอดจนศกษาคณลกษณะตางๆของเอนไซม FTase ทแยกได เพอนามาใชในการผลต FOS ในสภาวะ in vitro ซงหากงานวจยนสาเรจลงไดกจะเปนการเพมชองทางในการผลต FOS โดยอาศยเอนไซม FTase จากแกนตะวนและสามารถควบคมใหไดผลผลตทมคา DP ทตองการเพอนาไปใชในผลตภณฑอาหารเสรมตอไป นอกจากน งานวจยนยงสนใจทจะศกษาการสะสม FOS ตลอดจนการทางานของเอนไซมทเกยวของเพออธบายถงอทธพลของสภาพภมประเทศและภมอากาศทอาจมผลตอการสะสม FOS ในแกนตะวนพนธทไดรบการปรบปรงใหปลกในประเทศไทยได

สำนกหอ


16

บทท 3

วธการทดลอง

1. การปลกแกนตะวน

นาหวพนธแกนตะวนมาตดครอมตาเปนชนขนาด 3-5 เซนตเมตร แลวนามาบมในดนเพอ

ชกนาใหเกดตนออนประมาณ 1 สปดาห รดนาใหชม โดยใหนาทกๆ 2 วน จนครบระยะเวลา 1 เดอน นาตนแกนตะวนท เตรยมไดมาปลกในเรอนทดลอง ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร วทยาเขตพระราชวงสนามจนทร จงหวดนครปฐม ดนทใชปลกเปนดนรวนปนทรายและใหนาสามครงตอสปดาห จากนนใหปยแอมโมเนยมซลเฟต ((NH4)2SO4) เมอยายปลกไดครบ 1 สปดาห และทาการเกบตวอยางทระยะตางๆ เพอศกษาหาความสมพนธระหวางการเจรญเตบโตของแกนตะวนกบการสะสมฟรกโตโอลโกแซคคาไรด (FOS) และคากจกรรมของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส (FTase) เพอหาอายทเหมาะสมของแกนตะวนทมการสรางเอนไซม FTase สงสดเพอทจะใชเปนแหลงวตถดบในการสกดเอนไซมตอไป

2.การวเคราะหปรมาณนาตาลนอนรดวซ (non - reducing sugar) ในตวอยางแกนตะวน

2.1 การสกดนาตาล

นาตวอยางตนแกนตะวนทระยะเวลาตางๆมาสกดนาตาล โดยนาตวอยางมาตดเปนชนเลกๆ

แลวบดใหละเอยด เตมเอทานอล (ethanol) 80 เปอรเซนต ในอตราสวน 1 ตอ 2 โดยนาหนกตอปรมาตร นาไปบมทอณหภม 80 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท จากนนนาสารสกดไปกรองผานกระดาษกรอง Whatman เบอร 1 แลวนากากทไดไปสกดซาอก 2 ครง เทสวนใสทไดรวมกน นาสารสกดไประเหย ethanol ออกโดยใช rotary evaporator

2.2 การวเคราะหปรมาณนาตาลทงหมด (total sugar) โดยวธ Phenol sulfuric acid

(Dubois และคณะ 1956)

นาสารสกดทไดมาเจอจาง จากนนผสมสารสกดปรมาตร 1 มลลลตรกบสารละลายฟนอล

(phenol) 5 เปอรเซนต ปรมาตร 1 มลลลตร เมอผสมเขากนแลวเตมกรดซลฟวรก (sulfuric acid;

H2SO4) ปรมาตร 5 มลลลตร ตงทงไวประมาณ 10 นาท จะไดสารละลายเปนสสม-เหลอง นาไปวด

สำนกหอ


17

17

คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 480 นาโนเมตร คานวณหาปรมาณของนาตาลทงหมดเทยบกบกราฟมาตรฐานกลโคส

2.3 การวเคราะหปรมาณนาตาลรดวซ (reducing sugar) โดยวธ 3,5 - dinitrosalicylic acid

method (DNS method) (Miller 1959)

นาสารสกดทไดมาเจอจาง จากนนผสมสารสกดปรมาตร 1 มลลลตรกบสารละลาย

DNS reagent ปรมาตร 3 มลลลตร เมอผสมเขากนแลว นาไปตมในอางนาควบคมอณหภม

95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท จากนนทาใหเยนทอณหภมหอง นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร คานวณหาปรมาณของนาตาลรดวซเทยบกบกราฟมาตรฐานกลโคส 2.4 การวเคราะหปรมาณนาตาลนอนรดวซ (non-reducing sugar)

คานวณหานาตาลนอนรดวซ โดยนาปรมาณนาตาลทงหมดลบดวยปรมาณนาตาลรดวส

3. การสกดเอนไซม นาตวอยางแกนตะวนมาตดใหเปนชนๆแลวนาไปบดใหละเอยดนามา เตม extraction

buffer (สารละลายโพตสเซยมฟอสเฟตบฟเฟอร (potassium phosphate buffer) ความเขมขน 0.007 โมลาร พเอช 7.0 ประกอบดวย Triton X-100 0.5 เปอรเซนต และ ซสเตอน

0.5 เปอรเซนต) ในอตราสวน 1 ตอ 1 โดยนาหนกตอปรมาตร บมเปนเวลา 16 ชวโมง จากนนนาสารสกดไปกรองผานผาขาวบางและนาของเหลวทไดจากการกรองไปปนเหวยงท 12,000 x g เปนเวลา 20 นาท (ดดแปลงจากวธของ Praznik และคณะ 1990)

4. การหาปรมาณโปรตน

หาความเขมขนโปรตนโดยวธของ Bradford (Bradford 1976) กราฟมาตรฐานของโปรตนเตรยมโดยใชสารละลาย bovine serum albumin

5. การหาคากจกรรมของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส

หาคากจกรรมของเอนไซม โดยนาเอนไซมตวอยางปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมกบสารละลายนาตาลซโครสความเขมขน 0.46 โมลาร ในสารละลาย potassium phosphate buffer

ความเขมขน 0.1 โมลาร พเอช 7.0 ปรมาตร 400 ไมโครลตร บมเปนเวลา 24 ชวโมงทอณหภม

34 องศาเซลเซยส หยดปฏกรยาทอณหภม 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท เพอนาไปวเคราะหตอไป

สำนกหอ


18

18

5.1 การหาคากจกรรมของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสโดยวธ Somogyi-Nelson (Nelson 1944) และ glucose oxidase – peroxidase (Trinder 1969)

วเคราะหหาปรมาณนาตาลรดวซ (R) โดยวธ Somogyi-Nelson และวเคราะหหานาตาลกลโคส (G)

โดยวธ glucose oxidase - peroxidase (GOD/POD) โดยการคานวณหาปรมาณฟรกโตสทถกถายโอน (F’) จากสมการ

F = R – G

F’ = G –F = 2G – R

กาหนดให 1 หนวย (Unit, U) ของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส คอ ปรมาณเอนไซมททาใหเกด 1 ไมโครโมล ของฟรกโตสทถกถายโอน จากซโคส ภายในเวลา 1 นาท ภายใตสภาวะทกาหนด

5.2 การหาคากจกรรมของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสโดยใชเครอง High

Performance Liquid Chromatography

การวเคราะหหา 1-คสโตส (1-kestose) ทเกดขน ดวยเครอง High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) ทาโดยนาสารตวอยางไปกรองดวย nylon syringe filter ทมขนาดเสนผานศนยกลาง 0.22 ไมโครเมตร (μm) จากนนนาไปฉดวเคราะหดวยเครอง HPLC โดยใช Rezek

RNM carbohydrate Column ขนาด 7.8x300 มลลเมตร (Phenomenex) ชะดวย deionized distilled

water ทอตราการไหล (flow rate) เทากบ 0.4 มลลลตรตอนาท อณหภม 45 องศาเซลเซยส และตรวจวดสารทออกจากคอลมนดวย Refractive index detector กาหนดให 1 หนวย (Unit, U) ของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส คอ ปรมาณเอนไซมททาใหเกด 1 ไมโครโมลของ 1-kestose จากซโครส ภายในเวลา 1 นาท ภายใตสภาวะททาการกาหนด

6. การทาบรสทธเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส

6.1 การแยกเอนไซมดวยเทคนคโครมาโตกราฟแบบแลกเปลยนประจลบ (anion

exchange chromatography)

การทาบรสทธเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรสโดยเทคนค โครมาโตกราฟแบบ

แลกเปลยนประจลบ ดวยเครอง Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) (Amersham

Phamacia, Sweden) โดยนาเอนไซมสกดหยาบ ผานคอลมน Q sepharose fastflow, XK 26 ททาสมดลดวยสารละลายบฟเฟอร A (สารละลาย potassium phosphate buffer ความเขมขน 50

สำนกหอ


19

19

มลลโมลาร พเอช 6.5) ทาการชะดวยบฟเฟอร A ดวยอตราการไหล 1 มลลลตรตอนาท และชะโปรตนออกดวยสารละลายบฟเฟอร B ความเขมขน 0-100 เปอรเซนต (สารละลาย potassium

phosphate buffer พเอช 6.5 ความเขมขน 50 มลลโมลารทมโชเดยมคลอไรด (NaCl) ความเขมขน

1 โมลาร) ดวยอตราการไหล 1 มลลลตรตอนาท นา fraction ทมกจกรรมของเอนไซมมารวมกน กาจดเกลอและทาใหเขมขนขนโดยใชอลตราฟวเตรชนทมขนาดรพรน 10 กโลดาลตน นาเอนไซมทไดไปวเคราะหปรมาณโปรตน และหาคากจกรรมของเอนไซม ดงขอ 4 และ 5

6.2 การแยกเอนไซมดวยเทคนคโคมาโตกราฟฟแบบสมพรรคภาพ (affinity

chromatography)

การทาบรสทธเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส โดยเทคนค โคมาโตกราฟฟแบบ สมพรรคภาพ ดวยเครอง FPLC โดยนาเอนไซมทไดจากขอ 6.1 โหลดผานคอลมน Con A

sepharose fastflow, XK 13 ททาสมดลดวยสารละลายบฟเฟอร C (สารละลาย potassium phosphate

buffer พเอช 6.5 ความเขมขน 50 มลลโมลาร ทมโชเดยมคลอไรด (NaCl) ความเขมขน 0.5 โมลาร แมงกานสคลอไรด (MnCl2) ความเขมขน 1 มลลโมลาร และแคลเซยมคลอไรด (CaCl2) ความเขมขน 1 มลลโมลาร) ทาการชะดวยบฟเฟอร C ดวยอตราการไหล 1 มลลลตรตอนาท จากนนชะโปรตนออกดวยสารละลายบฟเฟอร D (potassium phosphate buffer พเอช 6.5 ความเขมขน 50

มลลโมลารทมสารละลาย NaCl ความเขมขน 0.5 โมลาร MnCl2 ความเขมขน 1 มลลโมลาร และ CaCl2 ความเขมขน 1 มลลโมลาร อลฟาเมธทแมนโนไพราโนไซด (C7H14O6) ความเขมขน 0.5 โมลาร) 0-100 เปอรเซนต ดวยอตราการไหล 1 มลลลตรตอนาท จากนนนา fraction ทมกจกรรมของเอนไซมมารวมกน กาจดเกลอและทาใหเขมขนขนโดยใชอลตราฟวเตรชนทมขนาดรพรน 10

กโลดาลตน นาเอนไซมทไดไปวเคราะหปรมาณโปรตน และหาคากจกรรมของเอนไซม ดงขอ 4

และ5

7. การประมาณคานาหนกโมเลกลเอนไซม

7.1 การศกษานาหนกโมเลกลโดยเทคนค Sodium dodecyl sulfate- polyacryamide gel

electrophoresis (SDS-PAGE)

นาเอนไซมมาวเคราะหหาความบรสทธและนาหนกโมเลกลภายใตสภาวะททาใหเสย

สภาพทางธรรมชาต (denaturing conditions) โดยการนาโปรตนตวอยางมาแยกบนแผนโพลอะครลาไมดเจล 12 เปอรเซนต ดวยกระแสไฟฟา 30 มลลแอมป 3-4 ชวโมง ยอมแผนโพลอะครลาไมดเจลดวย coomassie blue เทยบตาแหนงของแถบโปรตนทปรากฏกบแถบโปรตนมาตรฐานททราบนาหนกโมเลกล

สำนกหอ


20

20

7.2 การศกษานาหนกโมเลกลโดยเทคนคเจลฟวเทรชนโครมาโตกราฟฟ (gel filtration

chromatography)

นาเอนไซมมาวเคราะหหาความบรสทธและนาหนกโมเลกลภายใตสภาวะทไมทาใหเสย

สภาพทางธรรมชาต (non-denaturing conditions) โดยการโปรตนตวอยางทได โหลดผานคอลมน, sephacryl S-200, XK 13 ททาสมดลดวยสารละลายบฟเฟอร A ดวยอตราการไหล 0.1 มลลลตรตอนาท นาคาปรมาตรบฟเฟอร A ทใชในการชะโปรตนทมกจกรรมของเอนไซม FTase ออกมาจากคอลมน ไปหาคานาหนกโมเลกลโดยนาไปเทยบกบกราฟมาตรฐานทแสดงความสมพนธระหวางคานาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐาน (Lysozyme; MW 14600, Trypsin; MW 23800, Lipase;

MW 45000, BSA; 66000 และ Amyloglucosidase; MW 97000) กบปรมาตรของบฟเฟอร A ทโปรตนมาตราฐานถกชะออกมา

8. การศกษาคณลกษณะสมบตของเอนไซม 8.1 การศกษาคาพเอชทเหมะสมตอการทางานของเอนไซม

การศกษาผลของ pH ทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซม ทาโดยการบมเอนไซมในบฟเฟอรตางๆ ในชวงพเอส 3.00 – 10.00 บฟเฟอรทใชคอ citrate phosphate buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร (พเอช 3.0-6.0) potassium phosphate buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร (พเอช 6.5-7.5)

Tris buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร (พเอช 7.5-9.0) และ glycine NaOH buffer ความเขมขน 0.1

โมลาร (พเอช 9.0-10.0) จากนนหากจกรรมของเอนไซม ดงขอท 5.1

8.2 การศกษาผลของคาพเอชทมผลตอความเสถยรของเอนไซม

การศกษาผลของพเอชตอความเสถยรของเอนไซม ทาโดยบมเอนไซมในบฟเฟอรเดยวกนกบขอ 8.1 เปนเวลา 48 ชวโมง จากนนหากจกรรมของเอนไซม ดงขอท 5.1

8.3 การศกษาคาอณหภมทเหมะสมตอการทางานของเอนไซม

การศกษาผลของอณหภมทเหมาะสมตอกจกรรมของเอนไซม ทาโดยหากจกรรมของเอนไซม ดงขอท 5.1 ในชวงอณหภม 4 – 70 องศาเซลเซยส

8.4 การศกษาผลของคาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม การศกษาผลของอณหภมตอความเสถยรของเอนไซม ทาโดยการบมเอนไซมในชวงอณหภม 4-70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง จากนนหากจกรรมของเอนไซม ดงขอท 5.1

สำนกหอ


21

21

8.5 ศกษาผลของไอออนโลหะและรเอเจนตตอกจกรรมของเอนไซม

การศกษาผลของไอออนโลหะตอกจกรรมของเอนไซม ทาโดยบมเอนไซมในบฟเฟอรทมไอออนโลหะ (K+, Ca2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Na+, Li2+) และ รเอเจนต (SDS, EDTA, pyridoxal

HCL, mercaptonethanol, PMSF และ isopropanol) จากนนหากจกรรมของเอนไซม ดงขอท 5.1

8.6 หาคาทางจลพลศาสตรของเอนไซม ศกษาคาพารามเตอรทางจลพลศาสตรโดยใชสารตงตนเปนซโครสทความเขมขนชวง

0.26-1.0 โมลาร จากนนหากจกรรมของเอนไซม ดงขอท 5.2 เขยนกราฟระหวางปรมาณ 1-kestose

ทเกดขนกบเขมขนของซโครสทใชทาปฎกรยา เพอหาคา Km และ Vmax โดยใช Michaelis-Menten

equation

9. การสงเคราะหฟรกโตโอลโกแซคคาไรดโดยอาศยเอนไซม FTase

นาเอนไซมทสกดไดจากแกนตะวนมาทดสอบการสงเคราะหฟรกแทนในหลอดทดลอง โดยใช ซโครสเปนสารตงตน โดยนาเอนไซมตวอยางปรมาตร 2 มลลลตร ผสมกบสารละลายซโครสความเขมขน 0.46 โมลาร ในสารละลายฟอสเฟตบฟเฟอร 0.1 โมลาร พเอช 5.4 ปรมาตร 8 มลลลตร บมเปนเวลา 144 ชวโมงทอณหภม 35 องศาเซลเซยส หยดปฏกรยาทอณหภม 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท และนามาวเคราะหผลโดย HPLC

10. การวเคราะหชนดของนาตาลโดยใชเครอง High Performance Liquid Chromatography

การวเคราะหนาตาลชนดตางๆ ดวยเครอง High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ทาโดยนาสารสกดมาเจอจางใหไดความเขมขนทเหมาะสม แลวนาไปกรองดวย nylon

syringe filter ทมขนาดเสนผานศนยกลาง 0.22 ไมโครเมตร (μm) จากนนนาไปฉดวเคราะหดวยเครอง HPLC โดยใช Rezek RNM carbohydrate Column ขนาด 7.8x300 มลลเมตร (Phenomenex)

ชะดวย deionized distilled water ทอตราการไหล (flow rate) เทากบ 0.4 มลลลตรตอนาท อณหภมทใชในการแยกคอ 45 องศาเซลเซยส และตรวจวดสารทออกจากคอลมนดวย Refractive index

detector

สำนกหอ


22

22

11. ทดสอบคณสมบตพรไบโอตกของสารอนนลนทผลตได โดยวเคราะหการกระตนการ

เจรญเตบโตของจลนทรยทมประโยชนภายใตสภาวะ in vitro (ดดแปลงจากวธ Fook และคณะ

2002)

1. เตรยมอาหารเลยงเชอ โดยนา FOS ทสงเคราะหได มาเปนแหลงคารบอนในอาหารเลยงเชอสตร MRS เปรยบเทยบกบอาหารทมแหลงคารบอนเปนซโครส กลโคส ฟรคโตส หรอ อนนลนจากชโคร โดยกาหนดใหอาหารทกชดมปรมาณนาตาลรวมเรมตนเทากบอาหารสตร MRS ทมกลโคส 2% (w/v)

2. เตรยมเชอ Bifidobacterium sp. โดยเลยงในอาหาร MRS broth ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 36 ชวโมง จากนนนาสวนตะกอนเซลลไปละลายนากลนเพอวดคาการดดกลนแสง แลวใสเซลลในปรมาณทมคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 600 นาโนเมตรเทากบ 0.1

ลงในอาหาร MRS broth ชดตางๆ ทเตรยมในขอ 1 จากนนนาไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 36 ชวโมง ภายใตสภาวะไรอากาศ (anaerobic) เกบตวอยาง 3 มลลลตร ทกๆ 3 ชวโมงจนถง 36 ชวโมง และนาไปวเคราะหพารามเตอรตางๆ ดงตอไปน

- วดคาพเอช - วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 600 nm (จากสวนตะกอนเซลล ละลายนากลน) - วดปรมาณนาตาลรดวซโดยวธ DNS และนาตาลรวมทเหลอโดยวธ Phenol sulfuric

acid (จากสวนใสหลงปนเหวยง)

สำนกหอ


23

23

บทท 4

ผลและวจารณผลการทดลอง

1. ความสมพนธระหวางการเจรญเตบโตของแกนตะวนกบการสะสมฟรกโตโอลโกแซคคาไรด (FOS) และ คากจกรรมของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส (FTase)

1.1 การสะสม FOS ของแกนตะวนระยะตางๆ

จากการเกบตวอยางทระยะตางๆ ของแกนตะวน (ภาพท6) มาสกดนาตาลเพอศกษาหาความสมพนธระหวางการเจรญเตบโตของแกนตะวนกบการสะสม FOS โดยการประมาณคาในรปของนาตาลประเภทนอนรดวซ (non reducing sugar) ไดผลการทดลองดงแสดงในตารางท 3

ภาพท 6 แกนตะวน ระยะตางๆ (ก) แกนตะวนอาย 7 วน (ข) แกนตะวนอาย 60 วน

(ค) แกนตะวนอาย 90 วน (ง) แกนตะวนอาย 180 วน

(ก) (ข)

(ค) (ง)

สำนกหอ


24

ตารางท 3 ปรมาณนาตาลนอนรดวซในใบ ลาตน ราก และหวสะสมอาหารของแกนตะวนทระยะตางๆ

อาย แกนตะวน

(วน)

ปรมาณนาตาลนอนรดวซ (มลลกรม /กรมนาหนกสด)*

ใบ ลาตน ราก หวสะสมอาหาร

30 0.435±0.177 12.231±0.534 - -

60 4.263±0.189 9.934±0.347 17.181±1.076 -

90 3.916±0.159 85.037±2.942 31.955±1.932 -

105 6.101±0.143 39.982±2.769 41.851±1.791 113.025±5.058

120 4.742±0.126 40.522±1.111 42.039±0.387 112.885±2.274

135 4.670±0.122 48.234±1.025 25.195±0.798 90.061±2.784

150 6.516±0.147 22.978±1.341 31.654±0.761 59.762±2.053

180 - - - 84.554±0.887

* หมายถง คาเฉลยจากการวเคราะห 3 ซา ± คาเบยงเบนมาตรฐาน (SD)

- หมายถง ไมไดวเคราะหเพราะไมมตวอยางพชวตถดบ

จากตารางผลการทดลองพบวา ในชวง 90 วนแรกของการเพาะปลกมการสะสมนาตาล non

reducing sugar มากในสวนของลาตน โดยชวงดงกลาวแกนตะวนมการพฒนาของสวนใบและลาตน (vegetative parts) ทสง คอ มการสงเคราะหดวยแสง (photosynthesis) ทใบเพอใหไดผลตภณฑนาตาล ซงกคอ นาตาลกลโคส เพอใชในกระบวนการเมตาบอลซมตางๆ จากนนจะมการลาเลยงนาตาลกลโคสหรอเปลยนรปไปเปนนาตาลชนดอนๆ รวมทง non reducing sugar เพอลาเลยงไปยงสวนตางๆ ของพช ทาใหพบปรมาณของ non reducing sugar ทสงในสวนของลาตน โดยในระยะแรกนแกนตะวนจะยงไมมการสะสมอาหารในสวนของราก เรยกระยะนวา slow tuber growth (เรมตงแตวนปลกจนถงออกดอกแรก) และหลงจาก 90 วนของการปลกจะเหนปรมาณของ non

reducing sugar ลดลงในสวนของลาตน แตมปรมาณเพมมากขนในสวนของราก จากนนสวนของรากจะพฒนาไปเปนไหล (stolon) และหวสะสมอาหาร (tuber) ทาใหการสะสมของ non reducing

sugar ยายจากสวนรากไปยงหวสะสมอาหาร ซงการเจรญเตบโตของแกนตะวนในระยะน เรยกวา rapid tuber filling ซงเรมจากดอกแรกบานจนถงเกบเกยว กลาวโดยรวมกคอ ในชวงของการ

สำนกหอ


25

เจรญเตบโตชวงแรกนน อาหารทสรางไดจะอยทใบและลาตน หลงจากนนใบจะเรมแกและหลดรวง อาหารทสรางและสะสมไวทลาตนและใบจะเคลอนยายไปสหว (นมต และ สนน 2549) และจากผลการทดลองจงสามารถบงชไดวา สวนหวสะสมอาหารในระยะ 105-120 วนมการสะสม FOS

สงสด ซงเปนการพฒนาตามปกตของแกนตะวนดงเชนรายงานการวจยอนๆ ทมมากอน 1.2 กจกรรมของเอนไซม FTase ของแกนตะวนระยะตางๆ

นอกจากการวเคราะหความสมพนธระหวางการเจรญเตบโตของแกนตะวนกบการสะสม

FOS แลว ในงานวจยนยงไดศกษาหาความสมพนธระหวางการเจรญเตบโตของแกนตะวนกบคากจกรรมของเอนไซม FTase ดวย ทงนกเพอใชเปนขอมลในการตดสนเลอกระยะทเหมาะสมทสดตอการนามาใชเปนแหลงในการผลตเอนไซมสาหรบสงเคราะห FOS ตอไป และจากการวเคราะหคากจกรรมของเอนไซม FTase โดยการสกดเอนไซมหยาบ (crude enzyme) จากสวนตางๆ ของแกนตะวนในแตละระยะการเจรญเตบโตมาทดสอบในสภาวะ in vitro โดยใชนาตาลซโครสเปน สารตงตนพบวา crude enzyme ทสกดจากหวสะสมอาหารของแกนตะวนในชวงอาย 105-120 วนนน มความสามารถในการเคลอนยายหมฟ รกโตซลจากซโครสมากทสดเมอเปรยบเทยบกบกจกรรมของเอนไซม FTase ทวดไดในสวนอนๆ (ตารางท 4) โดยพบวาหวสะสมอาหารของแกนตะวนในชวงอาย 105-120 วนมคากจกรรมของเอนไซม FTase เทากบ 0.103 – 0.098 หนวยตอมลลลตรเอนไซม

ผลการหาปรมาณ FOS โดยประมาณจากการวเคราะหปรมาณของ non reducing sugar และการวเคราะหคากจกรรมของเอนไซม FTase แสดงใหเหนวา ทงสองคานนมความสมพนธกนโดยปรมาณ FOS จะแปรผนตรงกบคากจกรรมของ FTase ซงตรงกบรายงานวจยของ Van der Meer

และคณะในป ค.ศ. 1998 ทไดศกษาการแสดงออกของเอนไซม FTase จาก Jerusalem artichoke

พนธ Colombia แลวพบวา ในระยะกาลงพฒนาของหว Jerusalem artichoke นนมการแสดงของเอนไซม FTase สงทสดเมอเปรยบเทยบกบอวยะสวนอนๆ จากขอมลทไดอาจชใหเหนวา สวนทมปรมาณ non reducing sugar ทสงคอ หวสะสมอาหารแกนตะวนในชวงอาย 105-120 วนมความเหมาะสมทจะใชเปนแหลงของเอนไซม FTase สาหรบการทดลองตอไป

สำนกหอ


26

ตารางท 4 คากจกรรมของเอนไซม FTase ในอวยวะแตละสวนของแกนตะวนทระยะตางๆ

* หมายถง คาเฉลยจากการวเคราะห 3 ซา ± คาเบยงเบนมาตรฐาน (SD)

- หมายถง ไมไดวเคราะหเพราะไมมตวอยางพชวตถดบ

2. การทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน

ขอมลการทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนอาย 105-120 วนโดยใชการตกตะกอนดวยแอมโมเนยมซลเฟตและ / หรอเทคนคโคมาโตกราฟฟพบวา การใชเทคนคโคมาโตกราฟฟแบบแลกเปลยนประจชนด anion exchange chromatography มตวกลาง (media) เปน Q sepharose ใหคากจกรรมของเอนไซม FTase สงสด (กตตภม 2555) ดงนน การทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนในงานวจยนจงเลอกวธการดงกลาวมาใช โดยเรมจากการสกดเอนไซมสกดหยาบ (crude enzyme) จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนอาย 105-120 วน จากนนนา crude enzyme มาผานขนตอนการทาใหบรสทธดวย anion exchange

chromatography ทม media เปน Q sepharose ชะคอลมนดวยสารละลายบฟเฟอร A (potassium

phosphate buffer พเอช 6.5 ความเขมขน 50 มลลโมลาร) ซงจากผลการทดลองทไดดงแสดงในภาพท 7 พบวา โปรตนทไมสามารถจบกบตวกลางของคอลมนจะถกชะออกมาจากคอลมนในชวง fraction ท 15-80 โดยโปรตนทถกชะออกมาในชวงดงกลาวไปหาคากจกรรมของเอนไซม FTase

อายแกนตะวน (วน)

กจกรรมของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส

(หนวย /มลลลตรเอนไซม)*

ลาตน ราก หวสะสมอาหาร

60 0.060±0.003 - -

90 0.059±0.008 0.026±0.013 -

105 0.063±0.012 0.012±0.003 0.103±0.002

120 0.036±0.008 0.005±0.005 0.098±0.008

135 0.012±0.001 0.001±0.001 0.086±0.004

150 0.017±0.004 - 0.069±0.021

180 - - 0.033±0.004

สำนกหอ


27

ไมพบวามกจกรรมของเอนไซม FTase โปรตนทจบกบ media จะถกชะ (elute) ออกมาจากคอลมนดวยสารละลายบฟเฟอร B (potassium phosphate buffer พเอช 6.5 ความเขมขน 50 มลลโมลารทมโชเดยมคลอไรด (NaCl) ความเขมขน 1 โมลาร) ซงจากการเพมความเขมขนของ NaCl แบบเสนตรงพบวา fraction 108-117 ทมการชะดวยความเขมขนของสารละลายเกลอ NaCl ท 0.45-0.56

โมลารตรวจพบคากจกรรมของเอนไซม FTase แตเมอเพมความเขมขนของสารละลาย NaCl ทสงขนจะตรวจพบคากจกรรมของเอนไซม FTase เพยงเลกนอยเทานน ดงนน จงไดนา fraction ทมกจกรรมของเอนไซม FTase มารวมกน นามากาจดเกลอและเพมความเขมขนดวย ultrafiltration (amicon Ultra 4) ขนาด 10 กโลดาลตน เพอนาไปทาบรสทธในขนตอนตอไป

ภาพท 7 โครมาโตแกรมของการทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนอาย 105- 120 วนโดยใช anion exchange chomatography ชนดตวกลางเปน Q sepharose

โดย ( ) คอ คาการดดกลนแสงของโปรตนทความยาวคลน 280 นาโนเมตร

( ) คอ เปอรเซนตสารละลายบฟเฟอร B ( ) คอ คากจกรรมของเอนไซม FTase

สำนกหอ


28

นาเอนไซมเขมขนทไดมาทาบรสทธตอโดยใชเทคนคโครมาโตกราฟฟแบบสมพรรคภาพ (affinity

chromatography) ชนดตวกลาง (media) เปน con A sepharose ชะคอลมนโดยใชสารละลายบฟเฟอร C (potassium phosphate buffer พเอช 6.5 ความเขมขน 50 มลลโมลาร ทมโชเดยม คลอไรด (NaCl) ความเขมขน 0.5 โมลาร แมงกานสคลอไรด (MnCl2) ความเขมขน 1 มลลโมลาร และแคลเซยมคลอไรด (CaCl2) ความเขมขน 1 มลลโมลาร) พบวา โปรตนทไมสามารถจบกบตวกลางของคอลมนจะออกมาจากคอลมนใน fraction ท 2-6 ซงโปรตนดงกลาวไมมคากจกรรมของเอนไซม FTase และเมอชะโปรตนทจบกบตวกลางในคอลมนโดยใชสารละลายบฟเฟอร D

(potassium phosphate buffer พเอช 6.5 ความเขมขน 50 มลลโมลารทมสารละลาย NaCl ความเขมขน 0.5 โมลาร MnCl2 ความเขมขน 1 มลลโมลาร และ CaCl2 ความเขมขน 1 มลลโมลาร อลฟาเมธทแมนโนไพราโนไซด (C7H14O6) ความเขมขน 0.5 โมลาร) ดวยการเพมความเขนขนของอลฟาเมธทเมลาโนไซด แบบเปนเสนตรงพบวา ใน fraction 13-14 แสดงคากจกรรมของเอนไซม FTase

(ภาพท 8)

ภาพท 8 โครมาโตแกรมของการทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนอาย 105 - 120 วน โดยใช affinity chromatography ชนดตวกลางเปน con A sepharose

โดย ( ) คอ คาการดดกลนแสงของโปรตนทความยาวคลน 280 นาโนเมตร

( ) คอ เปอรเซนตสารละลายบฟเฟอร D ( ) คอ คากจกรรมของเอนไซม FTase

สำนกหอ


29

ซงเกบ fractions ดงกลาวไดเมอใชความเขนขนอลฟาเมธทแมนโนไพราโนไซดเทากบ 0.25- 0.40 โมลาร และไมพบกจกรรมของเอนไซม FTase ใน fractions อนๆ แสดงวา con A sepharose มประสทธภาพในการจบกบเอนไซม FTase ไดด

ตารางท 5 ขนตอนการทาบรสทธของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารแกนตะวน ดวย ion exchange chromatography โดยการผานคอลมน Q sepharose และ affinity chromatography โดยการผานคอลมน conA sepharose และถกทาใหเขมขนขนดวยวธ ultrafiltration นน ทาใหไดคากจกรรมของเอนไซมทสงขน แตมปรมาณโปรตนรวม (total protein) ลดลงเมอเทยบกบ crude

enzyme ซงคา purification ของเอนไซมทผานการทาบรสทธดวย ion exchange chromatography

และ affinity chromatography มคาเพมขนเปน 5.257 และ 43.257 เทาตามลาดบ ผลการทดลองแสดงใหเหนวาเอนไซม FTase หลงผานการทาบรสทธมคา specific activity สงกวากอนทาบรสทธเทากบ 44.402 หนวยตอมลลกรมโปรตน แสดงใหเหนถงประสทธภาพของคอลมนแบบ ion exchange

ชนด Q sepharose และคอลมนแบบ affinity ชนด conA sepharose ทสามารถทาใหเอนไซมมความบรสทธสงขนไดเนองจากคา specific activity ทสงขนนนเองซงคาทไดนนมากกวางานวจยของ Praznik และคณะในป ค.ศ.1990 พบวามคา specific activity เทากบ 7.56 ไมโครกรมตอมลลกรมโปรตนและมความบรสทธเพมขน 39.8 เทา แตยงนอยกวาเมอเปรยบเทยบกบงานวจยของ Koops

และ Jonker ในป ค.ศ.1996 ทมความบรสทธเพมขน 655 เทา

ตารางท 5 ขนตอนการทาบรสทธของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารแกนตะวน

Purification

steps

Activity

(U/ml)

Total

activity

(U)

Protein

(mg/ml)

Total

protein

(mg)

Specific

activity

(U/mg)

Purification

(fold)

Yield

(%)

Crude extract 1.905 38.105 1.857 37.138 1.025 1.000 100.00

Q sepharose +

ultrafiltation 2.455 9.821 0.455 1.821 5.393 5.257 25.773

Con A

sepharose +

ultrafiltation

6.500 6.500 0.146 0.146 44.402 43.275 17.057

สำนกหอ


30

3. การประมาณคานาหนกโมเลกลเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน

3.1 Sodium dodecyl sulfate- polyacryamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

การนาเอนไซม FTase มาวเคราะหดวยเทคนค SDS-PAGE เพอหานาหนกโมเลกลในสภาวะททาใหโปรตนเสยสภาพ ดงแสดงในภาพท 9 จากผลการทดลองแสดงใหเหนวา เอนไซม FTase จากหวแกนตะวนทผานการทาบรสทธแสดงแถบของโปรตนทมนาหนกโมเลกลอยประมาณ 66 และ 25 กโลดาลตน ใกลเคยงกบรายงานของ Luscher และคณะในป ค.ศ.1996 และ Koops และ Jonker ในป ค.ศ.1996 ซงไดศกษาเอนไซม 1-SST จาก Jerusalem artichoke พบวามโครงสรางเปน 2 หนวยยอย คอ 59 และ 26 กโลดาลตน และ 27 และ 55 กโลดาลตน ตามลาดบ

ภาพท 9 SDS-PAGE ของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน โดย แถวท 1 เปนโปรตนบอกขนาด (Maker); แถวท 2 เอนไซม FTase แบบหยาบ; แถวท 3 เอนไซม FTase ผานการทาบรสทธโดยใชเทคนค ion exchange chromatography และ แถวท 4 เอนไซม FTase ผานการทาบรสทธโดยใชเทคนค affinity chromatography

สำนกหอ


31

3.2 เจลฟวเทรชนโครมาโตกราฟฟ (gel filtration chromatography)

การนาเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนทผานการทาบรสทธมาวเคราะห วเคราะหดวยเทคนค gel filtration chromatography เพอหานาหนกโมเลกลในสภาวะทไมทาใหโปรตนเสยสภาพ โดยใชคอลมนบรรจตวกลางเปน sephacryl S-200 เปรยบเทยบกบสารมาตรฐาน คอ Lysozyme; MW 14600 Trypsin; MW 23800 Lipase; MW 45000 BSA; 66000 และ Amyloglucosidase; MW 97000 ไดผลดงภาพท 10

ภาพท 10 ความสมพนธระหวางคานาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานทง 5 ชนดกบปรมาตรของบฟเฟอรทโปรตนมาตราฐานถกชะออกมา

ผลการทดลองพบวาเมอนาเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนทผานการทาบรสทธมาผานคอลมนทมตวกลางเปน sephacryl S-200 โปรตนทถกซะออกมาจากคอลมนโดยใชบฟเฟอร A ปรมาตร 34.63 มลลลตร นนแสดงกจกรรมของเอนไซม FTase และเมอนาคาปรมาตรของบฟเฟอร A ทใชในการชะโปรตนออกจากคอลมนไปหาคานาหนกโมเลกล โดยนาไปเทยบกบกราฟมาตรฐานทแสดงความสมพนธระหวางคานาหนกโมเลกลของโปรตนมาตรฐานกบปรมาตรของบฟเฟอร A ทโปรตนมาตราฐานถกชะออกมา (ภาพท 10) พบวาเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนมนาหนกโมเลกลเทากบ 75,300 ดาลตน เมอเปรยบเทยบกบการศกษานาหนกโมเลกลของเอนไซม 1-SST ในสภาวะทไมทาใหโปรตนเสยสภาพจาก

Amyloglucosidase FTase

BSA

Lipase

Trypsin

Lysozyme

y = -0.0004x + 64.841

R² = 0.9709

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000

volu

me (m

l)

molecular weight (Da)

สำนกหอ


32

Jerusalem artichoke พบวามนาหนกประมาณ 67,000 ดาลตน (Praznik และคณะ 1990; Koops และ Jonker 1996) และในพชชนดอนๆ เชน Allium cepa มนาหนกโมเลกล 68,000 ดาลตน (Shiomi

และคณะ 1985) Asparagus officinalis มนาหนกโมเลกล 67,000 ดาลตน (Shiomi และคณะ 1980) และ Cichorium intybus มนาหนกโมเลกล 69,000 ดาลตน (Van den Ende และคณะ 1996) ซงในงานวจยนพบวาการประมาณคานาหนกโมเลกลของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนนนมคาทใกลเคยงกบนาหนกโมเลกลของเอนไซม 1-SST ในงานวจยทผานมา การประมาณคานาหนกโมเลกลของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนดวยเทคนค gel chromatography และ SDS-PAGE นนใหคานาหนกโมเลกลทมความสอดคลองกน ซงคานาหนกโมเลกลทประมาณไดนนอาจเปนไปไดวาเอนไซม FTase จากหวแกนตะวนอาจมโครงสรางของเอนไซมทมลกษณะเปน heterodimer ประกอบไปดวยหนวยยอย 2 หนวย คอ 66

และ 25 กโลดาลตน

4. การศกษาคณลกษณะของเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธ 4.1 การศกษาคาพเอชทเหมะสมตอการทางานของเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธ การศกษากจกรรมของเอนไซม FTase ทพเอชตางๆ (สารละลาย Citrate phosphate buffer

พเอช 3.0 - 6.0 สารละลาย potassium phosphate buffer พเอช 5.4 - 7.5 สารละลาย Tris-HCl

buffer พเอช 7.5 - 9.0 และสารละลาย glycine NaOH buffer พเอช 9.0 - 10.0) พบวา พเอชทตางกนมผลตอการทางานของเอนไซม FTase ดงแสดงในภาพท 11 ซงคาพเอชทเหมาะสมจะอยในชวง พเอช 5-6 โดยมกจกรรมของเอนไซม FTase มากกวา 70 เปอรเซนต สาหรบเอนไซม FTase จากแกนตะวนนนจะมคากจกรรมสงทสดทพเอช 5.4 ในสารละลาย potassium phosphate buffer โดยคากจกรรมของเอนไซมทวดไดมคาเทากบ 0.535 หนวยตอมลลลตร

สำนกหอ


33

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

100.00

3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10

Relat

ive a

ctivi

ty (%

)

pH

ภาพท 11 ผลของคาพเอชทมตอกจกรรมของเอนไซม FTase จากแกนตะวน โดย ( ) สารละลาย

citrate phosphate buffer; ( ) สารละลาย potassium phosphate buffer; ( ) Tris-HCl buffer และ ( X ) glycine - NaOH buffer

อทธพลของพเอชตอกจกรรมของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน ใหผลเชนเดยวกบรปแบบทคลายคลงกบอทธพลของพเอชตอกจกรรมของเอนไซม sucrose sucrose

1-fructosyltransferase (1-SST) จาก Jerusalem artichoke (Praznik และคณะ 1990 และ Koops และ Jonker 1996) หวหอม (Shiomi และคณะ 1985) และชโคร (Van den ened และ Van laere 1993) และเอนไซม fructose fructose 1-fructosyltransferase (1-FFT) จาก Jerusalem artichoke (Koops

และ Jonker 1994) โดยมคาพเอชทเหมาะสมอยในชวงกรดออน (พเอช 5-6) ซงสามารถอธบายไดวา พเอชทสงหรอตามากมผลทาใหประจของเอนไซมหรอสบสเตรทเปลยนแปลงไปจนไมเหมาะสมทจะทาปฎกรยากนได หรออาจทาใหโครงสรางของเอนไซมเสยสภาพไดตลอดจนโครงสรางสามมตของบรเวณเรงเปลยนแปลงไปดวย เพราะพเอชมผลโดยตรงตอโครงสรางทตยภม ตตยภมและจตรภมของโปรตน ซงเหลานเปนสาเหตหลกของการลดลงของกจกรรมของเอนไซม (สนนทา 2547)

สำนกหอ


34

4.2 การศกษาผลของพเอชทมผลตอความเสถยรของเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธ การศกษาผลของพเอชทมตอความเสถยรของเอนไซม FTase ทพเอชตางๆ (สารละลาย

Citrate phosphate buffer พเอช 4.5- 5.0 สารละลาย potassium phosphate buffer พเอช 5.4-7.0 และ สารละลาย Tris-HCl buffer พเอช 7.5-8.0) เปนเวลา 48 ชวโมง แลวนามาหาคากจกรรมของเอนไซมไดผลการทดลองดงแสดงในตารางท 6 โดยพบวา เอนไซมมความเสถยรทพเอชชวง 5-6.5

ซงอยในชวงทเปนกรด โดยเอนไซมทบมในชวงพเอชดงกลาวนาน 48 ชวโมงยงคงมคากจกรรมเหลออยมากกวา 70 เปอรเซนต สวนทพเอช 7.0 -8.0 ซงอยในชวงความเปนกลางคอนไปทางเบสออนนน คากจกรรมของเอนไซมจะเหลออยนอยกวา 70 เปอรเซนต

ตารางท 6 ความสมพนธของ Relative activity และพเอช (pH) ทเวลา 0 และ48 ชวโมง

pH Relative activity (%)

ทเวลา 0 ชวโมง

Relative activity (%)


4.5 100.00 88.78

5.0 100.00 83.02

5.5 100.00 78.84

6.0 100.00 74.42

6.5 100.00 73.78

7.0 100.00 60.13

7.5 100.00 46.73

8.0 100.00 58.98

จากผลการทดลองสามารถอธบายไดวา พเอชทมความเปนกรด กลาง หรอเบส จะทาใหโปรตนมประจเปลยนแปลงไป บางครงอาจทาใหโปรตนเสยสภาพและตกตะกอนลงมา จนไมสามารถเกด renaturation ได ดงนน การศกษาผลของพเอชทมผลตอความเสถยรของเอนไซมสามารถนามาใชในขนตอนการสกดแยกและการทาโปรตนใหบรสทธ โดยพเอชของสารละลายทใชในการสกดแยกโปรตนนนตองมความเหมาะสมตอโปรตน เพอใหโปรตนอยในสภาพเดม (native protein) (อาภสสรา 2537)

สำนกหอ


35

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

4 10 20 25 30 35 40 45 50 60 70

Relat

ive a

ctivi

ty (%

)

temperature (ºC)

4.3 การศกษาคาอณหภมทเหมะสมตอการทางานของเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธ จากการศกษากจกรรมของเอนไซม FTase ทอณหภมตางๆ คอ 4 10 20 25 30 35 40 45 50

60 และ 70 องศาเซลเซยสในสารละลาย potassium phosphate buffer พเอช 5.4 พบวา เอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน ทางานไดดในชวงอณหภม 35-40 องศาเซลเซยสดงแสดงในภาพท 12

ภาพท 12 ผลของอณหภมทมตอกจกรรมของเอนไซม FTase จากแกนตะวน

โดยทอณหภม 35 องศาเซลเซยสนน เอนไซม FTase จะมคากจกรรมสงสดเทากบ 0.29 หนวยตอมลลลตร ซงเปนอณหภมทเหมาะสมในการทางานของเอนไซม FTase และทอณหภมสงกวา 40 องศาเซลเซยส เอนไซมมกจกรรมลดลงอยางรวดเรว ทงนอาจเปนเพราะอณหภมทเพมขนนนทาใหโครงสรางของโปรตนถกทาลาย จนโปรตนสญเสยสภาพ (denature) ซงอณหภมทเหมาะสมทไดจากการทดลองมคาใกลเคยงกบอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของ เอนไซม

1-SST จาก Jerusalem artichoke คอทอณหภม 34 องศาเซลเซยส (Praznik และคณะ 1990) แต อยางไรกตามในงานวจยของ Koops และ Jonker 1996 ซงไดศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม 1-SST ใน Jerusalem artichoke พนธ Columbia นนกลบพบวา อณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม อยในชวง 20-25 องศาเซลเซยส แสดงใหเหนวาเอนไซมในกลม FTase ทมาจากวตถดบพชเรมตนชนดเดยวกน แตมความแตกตางของสายพนธและอายการ

สำนกหอ


36

พฒนานนสามารถแตกตางกนได คอ ในงานวจยของ Praznik และคณะไดใชหวสะสมอาหารจาก Jerusalem artichoke ระยะพกตว (dormancy stage) แตในงานวจยของ Koops และ Jonker นนไดใชหวสะสมอาหารทอยในระยะสะสม fructans และในงานวจยนไดใชหวสะสมอาหารจากแกนตะวน พนธเบอร 2 ทไดมการนาเขาจากประเทศตนกาเนดทมอากาศหนาว แลวนามาปรบปรงพนธใหสามารถปลกไดในประเทศไทยทมสภาพภมอากาศทรอนชน ดงนน เอนไซมกลม FTase ซงมอยหลาย isoform อาจอาศยอณหภมทเหมาะสมในการทางานทแตกตางกน

4.4 การศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธ

จากการศกษาอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนทผานการทาบรสทธ โดยการนาบม FTase ทอณหภมตางๆ เปนเวลา 48 ชวโมงไดผลดงตารางท 7 โดยพบวา เอนไซมมความเสถยรทอณหภมชวง 4 -30 องศาเซลเซยส ซงในชวงอณหภมดงกลาว เอนไซมยงคงมคากจกรรมเหลออยมากกวา 80 เปอรเซนต ทอณหภม 35 องศาเซลเซยสพบวา เอนไซมมคากจกรรมลดลงตากวา 50 เปอรเซนต และเมอบมเอนไซมทอณหภมตงแต 40

องศาเซลเซยสขนไปพบวา เอนไซมไมมคากจกรรมคงเหลออย

ตารางท 7 ความสมพนธของ Relative activity และอณหภม ทเวลา 0 และ48 ชวโมง

อณหภม (˚C)





4 100.00 88.05

20 100.00 81.43

25 100.00 98.32

30 100.00 83.84

35 100.00 33.57

40 100.00 0.00

45 100.00 0.00

60 100.00 0.00

70 100.00 0.00

สำนกหอ


37

จากผลการทดลองสามารถอธบายไดวาเอนไซม FTase ไมทนตอความรอน ความรอนสามารถทาใหอะตอมภายในโมเลกลของโปรตนเกดการสนสะเทอนดวยความเรว พนธะไฮโดรเจน

(hydrogen bond) หรอพนธะไฮโดรฟอบก (hydrophobic interaction) ของโปรตนถกทาลายจนสามารถทาลายโครงสรางของโปรตนโดยเกดการตกตะกอนและไมสามารถเกด renaturation ได ดงนน การศกษาผลของอณหภมทมผลตอความเสถยรของเอนไซมสามารถนามาใชในการเกบรกษาโปรตนไดโดยอณหภมทใชตองมความเหมาะสมตอโปรตน เพอใหโปรตนอยในสภาพธรรมชาต (อาภสสรา 2537)

4.5 การศกษาผลของไออนโลหะและชนดของรเอเจนตตอกจกรรมของเอนไซม FTase

ผลการศกษาผลของไอออนโลหะทงหมด 9 ชนดและรเอเจนตจานวน 6 ชนดตอกจกรรมของเอนไซม FTase ไดผลดงตารางท 8 โดย MnCl2 และ KNO3 มความสามารถกระตนใหเอนไซมมคากจรรมสงขนเพยงเลกนอยคอ 104.33 และ101.87 เปอรเซนต ตามลาดบ แต MgCl2 CuCl2 KI

LiCl NaCl CaCl2 และ KCl นนกลบมผลในการยบยงกจกรรมของเอนไซม โดย KI นนสามารถยบยงกจกรรมของเอนไซมใหเหลอเพยง 11.91 เปอรเซนต ทงนกเปนเพราะวา เกลอของโลหะสามารถจบกบประจลบของโปรตน (ionic interaction) ทาใหโปรตนตกตะกอนลงมา สงผลใหเกดการเสยสภาพธรรมชาตของโปรตน ซง Koops และ Jonker ในปค.ศ. 1996 รายงานวา Cu2+ ความเขนขน 1 มลลโมลาร สามารถยบยงการทางานของเอนไซม 1-SST ของ Jerusalem artichoke ได 4.47 เปอรเซนต นอกจากน ยงมรายงานวา กจกรรมของเอนไซม 1-SST ในพชชนดอน เชน Allium cepa และ Triticum aestivum ถกยบยงดวย Ca2+ (Shiomi และคณะ 1985; Chevalier และคณะ 1993) และจากการศกษาผลของรเอเจนตตอกจกรรมของเอนไซม FTase พบวา EDTA

mercaptonethanol และ pyridoxal-HCl นนสามารถในการกระตนการทางานใหเอนไซมมคากจรรมสงขนเทากบ 102.95 105.84 และ 115.34 ตามลาดบ ซงตามรายงานอนพบวา pyridoxal-HCl ความเขมขน 20 มลลโมลาร มความสามารถกระตนการทางานของเอนไซม 1-SST จาก Jerusalem

artichoke ไดถง 147 เปอรเซนต (Koops และ Jonker 1996) สวน SDS นนเปนสารทมคณสมบตแอมฟฟาตก (amphiphatic) ทาใหสามารถจบกบเอนไซมได ซงอาจเปนสาเหตใหเอนไซมไมสามารถจบกบสารตงตนไดเตมท กจกรรมของเอนไซมจงลดลงมา

สำนกหอ


38

ตารางท 8 อทธพลของไอออนโลหะและรเอเจนต ตอกจกรรมของเอนไซม FTase

ไอออนโลหะ และ รเอเจนต ความเขมขน 1 mM


control 100

MgCl2 73.943

CuCl2 60.231

MnCl2 104.331

KI 11.913

LiCl 87.236

NaCl 88.033

CaCl2 98.168

KNO3 101.869

KCl 90.721

SDS 74.842

EDTA 102.951

pyridoxal-HCl 115.337

Mercaptonethanol 105.836

isopropanol 96.300

PMSF 41.609

4.6 คาทางจลพลศาสตรของเอนไซม FTase

จากการหาคาพารามเตอรทางจลพลศาสตรของเอนไซม โดยการหาปรมาณนาตาล 1-คโตส (1-kestose) ทเกดขนจากนาตาลซโครส ภายใตสภาวะการทดลองทอณหภม 35 องศาเซลเซยส พเอช 5.4 และประมาณคาพารามเตอรทางจลศาสตร ดงแสดงในภาพท 13 และ 14 พบวา คาคงท Michaelis-Menten (Km) เทากบ 0.372 โมลาร และ อตราเรวสงสดของปฎกรยา (Vmax) เทากบ 1.218

ไมโครโมลตอมลลลตรตอชวโมง

สำนกหอ


39

y = 0.3055x + 0.8224

R² = 0.9921

0

0.5

1

1.5

2

2.5

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

1/V

(um

ol.m

l-1/h

)-1

1/[S] (M-1)

ภาพท 13 Lineweaver Burk plot ของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน

ภาพท 14 Michaelis-Menten ของเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน

y = 0.2566ln(x) + 0.877

R² = 0.9327

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

1-ke

stose

(um

ol.m

l-1.h

-1)

Sucrose (M)

สำนกหอ


40

และเมอเปรยบเทยบคาทไดกบเอนไซม FTase จากพชและจลนทรยชนดอนดงตารางท 9 พบวาเอนไซม FTase ทไดจากพชนนมคา Km ทแตกตางกนไปและเปนคาทคอนขางสง ซงอาจกลาวไดวา การสะสม fructan นนจะพบเฉพาะในพชทมการเกบซโครสความเขมขนสงในแวคควโอล เทานน ดงนนการทพชมคา Km ของเอนไซม 1-SST ทใชซโครสเปนสารตงตนมคาสง จงเปนกลไกลอยางหนงในการหลกเลยงการสะสม fructan ในสภาวะทมความเขมขนของซโครสตา (Ritsema และ Smeekens 2003) และคา Km ยงสามารถบอกถงความสามารถในการจบ (affinity) หรอใชในการกาหนดคาความแขงแรงของพนธะระหวางเอนไซมและสารตงตนได ถาจบกนไดแขงแรงจะมคา Km ทตาคอ การแตกตว (dissociation) ของเอนไซมกบสารตงตนจะตา แตถาจบกนไดไมแขงแรงจะมคา Km ทสง ทาใหการแตกตวระหวางเอนไซมกบสารตงตนจะเกดขนไดงาย

ตารางท 9 เปรยบเทยบคาคงท Michaelis-Menten (Km) ของเอนไซม FTase กบ 1-SST จากพชและจลนทรยชนดอน

พชและจลนทรย สารตงตน K m(mM) หมายเหต อางอง

Helianthus

tuberosus Sucrose 372 - งานวจยน

Allium cepa Sucrose 0.083 - Shiomi และคณะ

1985

Asparagus

officinalis

Sucrose 0.11 - Shiomi และคณะ 1980

Agave veracruz Sucrose 1.8 - Satyanarayana

และคณะ 1976 Festuca

arundinacea

Sucrose 5.8 wild type enzyme Altenbach และคณะ

2009

Aspergillus

aculeatus

Sucrose 27 60°C, pH 5.5, hydrolytic

activity

Ghazi และคณะ

2007

Triticum

aestivum

Sucrose 43 invertase mutant

W23Y/N25S, 30°C, pH 5.0

Schroeven และคณะ

2008

Pennisetum

glaucum

Sucrose 74 - Asthir และคณะ

1995

สำนกหอ


41


พชและจลนทรย สารตงตน K m(mM) หมายเหต อางอง

Triticum

aestivum Sucrose 215 invertase mutant W23Y,

30°C, pH 5.0


2008

Hordeum

vulgare

Sucrose 200 - Simmen และคณะ

1993

Triticum

aestivum

Sucrose 266 - Chevalier และ Rupp

1993

Lolium perenne Sucrose 272 wild type enzyme, in 50

mM sodium acetate buffer,

pH 5.0, at 30°C

Lasseur และคณะ

2009

Aspergillus

aculeatus

Sucrose 535 60°C, pH 5.5, transferase

activity

Ghazi และคณะ

2007

Triticum

aestivum

Sucrose 551 30°C, pH 5.0; wild-type

sucrose:sucrose

1-fructosyltransferase,

30°C, pH 5.0


2008

5. การผลต FOS จากเอนไซม FTase

จากการศกษาความสมพนธระหวางระยะเวลาทเหมาะสมในการบมเอนไซม FTase รวมกบ

นาตาลซโครสของ พบวาการบมเอนไซมรวมกบสารตงตนนาน 144 ชวโมง สามารถให FOS ซงเปนผลตภณฑประมาณรอยละ 50 ของนาตาลทงหมดในปฎกรยา (กตตภม 2555) ดงนนผวจยจงไดนาขอมลดงกลาวมาใชเปนแนวทางในการผลต FOS โดยใชเอนไซมทผานการทาบรสทธ จากการผลต FOS ดวยเอนไซมทผานการทาบรสทธ โดยใชนาตาลซโครสทละลายในสารละลาย potassium phosphate buffer พเอช 5.4 ความเขมขนสดทายเปน 0.46 โมลาร หรอเทากบ 157.320 มลลกรมตอมลลลตร เอนไซม FTase ความเขมขน 0.255 หนวยตอมลลลตร บมทอณหภม 35 องศาเซลเซยส นาน 144 ชวโมง จากนนนาตวอยางทไดไปวเคราะหหาองคประกอบและปรมาณนาตาลทเกดขนโดยวธ HPLC พบวา มการสงเคราะห FOS ขนมาจานวน 3 ชนด โดยสามารถระบได 2 ชนดคอ 1- kestose (DP2) และ nystose (DP3) ทถกชะออกมาจากคอลมน (retention time)

สำนกหอ


42

ทเวลา 11.845 และ 10.697 นาท ซงใหคา retention time เทากบสารละลายมาตรฐาน 1- kestose และ nystose สวนพคทปรากฏท retention time เทากบ 9.919 นาทนน ไมสามารถระบชนดได เพราะไมมสารละลายมาตรฐานมาเปรยบเทยบ แตสณนษฐานวา พคดงกลาวนาจะเปน FOS ทมคา DP

มากกวา 3 เพราะถกชะออกมาจากคอลมนกอน (ภาพท 13)

ภาพท 15 โครมาโตแกรมของการสงเคราะห FOS ในสภาวะ in vitro โดยใชเอนไซม

FTase ทผานการทาบรสทธ บมท 0 ชวโมง และ บมท 144 ชวโมง

B: บฟเฟอร; S: ซโครส; G: กลโคส; F: ฟรกโตส; K: 1-kestose; N: nystose; UF: unkown FOS

0 h

144

h

F

G

S

K N

UF

S

B

สำนกหอ


43

จากภาพท 15 สามารถอธบายไดวา เอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธมบทบาทของการยอย (hydrolysis) และการโอนยายหมฟรคโตซล (fructosyl transfer) โดยเมอเวลาเรมตนของการทาปฏกรยา (0 h) จะพบเพยงพคของนาตาลซโครส (retention time ประมาณ 14 นาท) และบฟเฟอร (retention time ประมาณ 9 นาท) เทานนและเมอทาปฏกรยานาน 144 ชวโมง (144 h) จะพบวา เอนไซมจะยอยซโครสไปเปนกลโคส (retention time ประมาณ 17.6 นาท) และฟรคโตส (retention

time ประมาณ 19.8 นาท) ซงสดสวนของนาตาลฟรคโตสทตากวานาตาลกลโคส เปนสงทบงชวา เอนไซม FTase ทใชมการยายหมฟรคโตซลเพอสงเคราะห FOS ดงจะเหนไดวา มพคของผลตภณฑ FOS ทง 3 ชนดดงกลาวขางตนเกดขน และเมอพจารณาจากชนดของ FOS ทผลตไดคอ 1-kestose

ประมาณ 22.282 มลลกรมตอมลลลตร (15.229 เปอรเซนต) nystose ประมาณ 26.058 มลลกรมตอมลลลตร (16.564 เปอรเซนต) และ unknown FOS ทมคา DP มากกวา 3 อยประมาณ 35.657

มลลกรมตอมลลลตร (22.665 เปอรเซนต) ซงลวนเปน FOS ทมคา DP ตา จงเหมาะตอการนาไปใชเปนสารทดแทนความหวาน อยางไรกตาม เมอพจารณาจากปรมาณนาตาลซโครสท เหลอในการทาปฏกรยาประมาณ 23.958 มลลกรมตอมลลลตร (15.229 เปอรเซนต) ประกอบกบสดสวนของนาตาลฟรคโตสทยงคงตากวานาตาลกลโคส อาจบงชวา เอนไซม FTase ยงคงมกจกรรมในการสงเคราะห FOS ไดอกหากมการใชระยะเวลาในการบมทยาวนานขน

6. การวเคราะหผลของ FOS ทไดจากการสงเคราะหตอการเจรญเตบโตของจลนทรย โพรไบโอตก

เพอใหสามารถวเคราะหผลของ FOS ทไดจากการสงเคราะห ตอการเจรญของ Bifidobacterium sp.จงไดควบคมใหปรมาณนาตาลรวมเรมตนในอาหารทกชดเทากบปรมาณนาตาลรวมในอาหาร MRS ทมกลโคส 2% (w/v) ดงแสดงในภาพท 16

สำนกหอ


44

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

0 5 10 15 20 25 30 35 40

ปรมาณน

าตาลทงหม

ด (m

g/m

l)

เวลา (ชวโมง)

ภาพท 16 การเปลยนแปลงของปรมาณนาตาลรวมในอาหาร MRS ทมแหลงคารบอนทแตกตางกนกบเวลา โดยท ( ) MRS+2% inulin from chicory; ( ) MRS+2% FOS product;

( ) MRS+2% sucrose; ( ) MRS+2% glucose และ ( X ) MRS+2%fructose

เมอนา FOS ทไดจากการสงเคราะหมาเปนแหลงคารบอนหลกในอาหารเลยงเชอ MRS medium ใหมปรมาณนาตาลรวมเทากบอาหาร MRS ทวไป และเตมเชอ Bifidobacterium sp. เรมตนทมคา OD600 = 0.1 (ประมาณ 16 ลานเซลลตอมลลลตร) ลงไป นาไปบมภายใตสภาวะ anaerobic ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 36 ชวโมง จากนนเกบตวอยางมาวเคราะหคา pH ปรมาณเซลล ปรมาณ reducing sugar ปรมาณ total sugar ทกๆ 3 ชวโมง สาหรบในชวง log phase จะเกบตวอยางมาวเคราะหทก 1 ชวโมง ไดผลการทดลองดงแสดงในภาพท 17 และ 18

สำนกหอ


45

ภาพท 17 ปรมาณเซลล Bifidobacterium sp.ในอาหาร MRS ทมแหลงคารบอนทแตกตางกนกบเวลา โดยท ( ) MRS+2% inulin from chicory; ( ) MRS+2% FOS product;


ภาพท 18 การเปลยนแปลงของ pH ในอาหาร MRS ทมแหลงคารบอนทแตกตางกนกบเวลาโดยท ( ) MRS+2% inulin from chicory; ( ) MRS+2% FOS product;


0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 5 10 15 20 25 30 35 40

ปรมาณเซล

ล LN

x 10

7 (C

FU)


3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35 40

pH


สำนกหอ


46

จากผลการทดลองทไดในภาพท 16 และ 17 จะเหนไดวา เมอมการควบคมใหปรมาณนาตาลรวมเรมตนในอาหารทกชดเทากบปรมาณนาตาลรวมในอาหาร MRS ทมกลโคส 2% (w/v)

นน เชอแบคทเรยจะมรปแบบการเจรญทเหมอนกนคอ ปรมาณเชอทเพมมากขนในชวโมงท 1-10

และคา pH เรมลดลงในชวโมงท 1 จนถงชวโมงท 10 และปรมาณนาตาลรวมจะลดลงเมอเชอมการเจรญเตบโตมากขน เชนเดยวกบปรมาณนาตาลรดวซกลดลงเชนเดยวกนดงแสดงในภาพท 19

ภาพท 19 การเปลยนแปลงของปรมาณนาตาลรดวซในอาหาร MRS ทมแหลงคารบอนทแตกตางกนกบเวลาโดยท ( ) MRS+2% inulin from chicory; ( ) MRS+2% FOS product;


หากเปรยบเทยบปรมาณนาตาลรดวซเรมตนในอาหารแตละชดจะพบวา อาหารทมกลโคสและฟรคโตส จะมปรมาณทสงกวาในอาหารชดอนๆ ประมาณ 10 เทา และอาหารทเสรมดวย FOS จากการสงเคราะหจะมนาตาลรดวซสงกวาอาหารทเสรมซโครสและอนลน เพราะมนาตาลกลโคสและฟรกโตสรวมอยดวยนอกเหนอไปจากซโครสและ FOS โดยผลการทดลองทไดอาจแสดงใหเหนวา อาหารทมการเสรมดวย FOS จากการสงเคราะหนนสามารถสงเสรมการเจรญเตบโตของเชอ Bifidobacterium sp.ได แมจะมปรมาณนาตาลรดวซทตากวากลโคสและฟรคโตสอยมาก จงอาจกลาวไดวา FOS ทสงเคราะหไดนนนาจะมคณสมบตความเปน prebiotics และเมอพจารณา

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25 30 35 40

ความเขม

ขนนาตาลรดวซ (

mg/

ml)


สำนกหอ


47

เปรยบเทยบการเจรญของ Bifidobacterium sp.ในอาหารทเสรมดวย FOS ทสงเคราะหซงมคา DP

ไมเกน 10 กบอาหารทเตมอนลนจากชคอรทมคา DP เฉลยประมาณ 10 -14 นาจะแสดงใหเหนวา FOS ท DP ตาๆ เหมาะตอการสงเสรมการเจรญของ Bifidobacterium sp.ไดมากกวา FOS ทมคา

DP สง

สำนกหอ


48

บทท 5

สรปผลการทดลอง

ในงานวจยนไดศกษาความสมพนธระหวางการเจรญเตบโตของแกนตะวนกบการสะสม FOS

คากจกรรมของเอนไซม FTase รวมทงศกษาการทาบรสทธเอนไซม FTase จากแกนตะวน และคณลกษณะดานตางๆ ของเอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธ ตลอดจนการนาเอนไซม FTase จากแกนตะวนไปใชในการสงเคราะห FOS ในสภาวะ in vitro จากการทดลองพบวา

1. ความสมพนธระหวางการเจรญเตบโตของแกนตะวนกบการสะสม FOS และ คากจกรรมของเอนไซม FTase นนมความพนธแบบแปรผนตรง โดยหวสะสมอาหารของแกนตะวนอาย 105-120 วน จะม FOS สงสดและมคากจกรรมของเอนไซม FTase สงทสดดวยเชนกน

จงเหมาะสมทจะนามาใชเปนแหลงของเอนไซมตอไป

2. เอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวนอาย 105-120 วน ทผานการทาใหบรสทธ นนมความบรสทธสงขน 43.275 เทา เมอเทยบกบเอนไซมสกดหยาบ และ เมอหานาหนกโมเลกลเอนไซม FTase โดยวธ SDS-PAGE เทากบ 66 และ 25 กโลดาลตน และ gel filtration เทากบ 75.3 กโลดาลตน

3. เอนไซม FTase ทผานการทาบรสทธนนสามารถทางานไดดทชวงอณหภม 35 องศาเซลเซยส พเอช 5.4 และ มความเสถยรทอณหภม 4 - 25 องศาเซลเซยส พเอช 4.5 - 6.5

4. เอนไซม FTase สามารถถกกระตนการทางานไดเลกนอยโดยไอออนโลหะและรเอเจนตบางชนด เชน Mn 2+ และ pyridoxal-HCl แตจะถกยบยงดวย KI มคาคงท Michaelis-Menten (Km ) เทากบ 0.372 โมลาร และอตราเรวสงสดของปฎกรยา (Vmax)

เทากบ 1.218 ไมโครโมลตอมลลลตรตอชวโมง โดยใชซโครสเปนสารตงตน

5. เอนไซมบรสทธสามารถผลต FOS ทมคา DP นอยกวา 10 จากนาตาลซโครสในสภาวะ

in vitro ไดอยางมประสทธภาพ ซงผลตภณฑทไดนนมความนาสนใจทจะนาไปใชเปนสารแทนความหวานในผลตภณฑอาหารตอไป

6. FOS ทไดจากการสงเคราะหโดยใชเอนไซม FTase มคณสมบตความเปนพรไบโอตก โดยสามารถสงเสรมการเจรญเตบโตของ Bifidobacterium sp.ได

สำนกหอ


49

บรรณานกรม

ภาษาไทย

กตตภม เงนมศร. (2554). การสะสมฟรกโตโอลโกแซคคาไรดและการทาบรสทธเอนไซมฟรกโต

ซลทรานสเฟอเรสจากแกนตะวน. จลนพนธ สาขาเทคโนโลยชวภาพ มหาวทยาลยศลปากร

นมต วรสตร และ สนน จอกลอย. (2549). อนนลน: สารสาคญสาหรบสขภาพในแกนตะวน. แกนเกษตร ปท 34 ฉบบท 2 (เมษายน - มถนายน 2549). หนา 85- 91.

เยาวมาลย คาเจรญ ศรสดา ศรเหลาไพศาล และพฒนพงษ ธสงค .(2549). บทบาทของแกน

ตะวน (Jerusalem artichoke) ในอาหารสตว, แกนเกษตร. 34 หนา 92- 103.

วสทธ กปทอง ประพนธ ประเสรฐศกด วรณา สนสวสด ฟอรเรอร สมาล โพธทอง อดศกด คานวณศลป และสพจน กตตบญญา. (2550). การศกษาการผลตแกนตะวนเพอการผลต

เอทานอล. แกนเกษตร. 34 หนา 187- 193.

ศภวนจกร พลมศกด และ สมชย จนทรสวาง. (2546). ผลการใชจลนทรยผสมและโอลโกแซคคา ไรดจากพชเจรซาเลมอารตโชค ในอาหารสกรรนขนเพอลดกลนเหมนและแอมโมเนยของมลสกร .วารสารสมนไพร 10 หนา 1-17.

สนน จอกลอย วรยา ลาดบวขาว และรชนก มแกว. (2549). แกนตะวน (Helianthus tuberosus L.)

พชชนดใหมใชเปนพลงงานทดแทน. แกนเกษตร. 34 หนา 104-111. สนนทา ภญณาวธน. (2547). ชวเคม 2. (พมพครงท 7). กรงเทพฯ. สานกพมพมหาวทยาลย

รามคาแหง. หนา 376-380

อาภสสรา ชมดท. (2537). ชวเคม. (พมพครงท 2). กรงเทพฯ. โรงพมพ สหมตรออฟเซท. หนา 13-59

ภาษาองกฤษ

Altenbach, D., Rudino-Pinera, E., Olvera, C., Boller, T., Wiemken, A. and Ritsema, T. (2009). An

acceptor-substrate binding site determining glycosyl transfer emerges from mutant analysis of a plant

vacuolar invertase and a fructosyltransferase. Plant Molecular Biology, 69, 47-56.

Asthir, B., Singh, R. and Gupta, A.K. (1995). Sucrose-sucrose fructosyltransferase in relation to

fructans in developing grains of pearl millet, Pennisetum americanum. Indian Journal of

Experimental Biology, 33, 233-235.

สำนกหอ


50

Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of

protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72,

248-254.

Chevalier, P. M. and Rupp, R. A. (1993). Inhibition of sucrose:sucrose fructosyl transferase by

cationic and ionic strength. Plant Physiology, 101, 589-594.

Darwen, C. W. E. and John, P. (1989). Localization of the enzymes of fructan metabolism in

vacuoles isolated by a mechanical method from tubers of jerusalem artichoke (Helianthus

tuberosus L.). Plant Physiology, 89, 658-663.

De Halleux, S. and Van Cutsem, P. (1997). Cloning and sequencing of the 1-SST cDNA from

chicory root. Plant Physiology, 113, 1003.

Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., and Smith, F. (1956). Colorimetric

method for determination of sugar and related substances. Analytical Chemistry, 28 ,

350 - 356.

Edelman, J. and Jefford, T. G. (1968). The mechanisim of fructosan metabolism in higher plants

as exemplified in Helianthus Tuberosus. New Phytologist, 67, 517-531.

Franck, A. and Leenheer, L.D. (2005). Inulin. Polysaccharides and polyamides in the food

industry, 1, 281-322.

Ghazi, I., Fernandez-Arrojo, L., Garcia-Arellano, H., Ferrer, M., Ballesteros, A. and Plou, F. J.

(2007). Purification and kinetic characterization of a fructosyltransferase from Aspergillus

aculeatus. Biotechnology, 128, 204–211.

Kaur, N. and Gupta, A.K. (2002). Applications of inulin and oligofructose in health and nutrition.

Journal of Bioscience, 27, 703-714.

Kolida, S., Tuohy, K., and Gibson, G. R. (2002). Prebiotic effects of inulin and oligofructose.

British Journal of Nutrition, 87, (Suppl.), 193–S197

Koops, A.J. and Jonker, H.H. (1994). Purification and characterization of the enzymes of

fructan biosynthesis in tubers of Helianthus tuberosus ‘Colombia’. Journal of

experimental botany, 45, 1623-1631

Koops, A.J. and Jonker, H.H. (1996). Purification and Characterization of the Enzymes

of Fructan Biosynthesis in Tubers of Helianthus fuberbsus Colombia. II.

Purification of Sucrose:Sucrose 1 -Fructosyltransferase and reconstitution of fructan

สำนกหอ


51

synthesis in Vitro with purified Sucrose:Sucrose 1 -Fructosyltransferase and

Fructan:Fructan 1- Fructosyltransferase. Plant Physiology, 110, 1167-1175. Lasseur, B., Schroeven, L., Lammens, W., Le Roy, K., Spangenberg, G., Manduzio, H.,

Vergauwen, R., Lothier, J., Prudhomme, M.P. and Van den Ende, W. (2009).

Transforming a fructan:fructan 6G-fructosyltransferase from perennial ryegrass into a

sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase. Plant Physiology, 149, 327-339.

Luscher, M., Erdin, C., Sprenger, N., Hochstrasser, U., Boller, T. and Wiemken, A. (1996).

Inulin synthesis by a combination of purified fructosyltransferases from tubers of

Helianthus tuberosus. Federation of European Biochemical Societies, 385, 39-42

Luscher, M., Frehner, M. and Nosberger, J. (1993). Purification and Characterization of

Fructan: Fructan Fructosyltransferase from Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus

L.). New Phytologist , 123, 717-724.

Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.

Analytical Chemistry, 31, 420-428.

Nelson, N. (1944). A photometric adaptation of the somogyi method for the determination of

glucose. The Journal of Biological Chemistry, 153, 375-80.

Niness, K. (1999). Breakfast foods and the health benefits of inulin and oligofructose.

Cereal Foods World, 44, 79-81.

Praznik, W., Beck, R. H. F. and Spies, Th. (1990). Isolation and characterisation of

sucrose:sucrose 1F-β-D-fructosyltransferase from tubers of Helianthus tuberosus L..

Agricultural Biology and Chemistry, 54(9), 2429-2431.

Ritsema, T. and Smeekens, S. (2003). Fructans: beneficial for plants and humans. Current

Opinion in Plant Biology, 6, 223–230.

Robertfroid, M. B., Gibson, G. R. and Delzenne, N. (1993). The biochemistry of oligofructose,

a nondigestible fiber: an approach to caloric value. Nutrition Reviews, 51, 137-146.

Satyanarayana, M.N. (1976). Biosynthesis of oligosaccharides and fructans in Agave vera cruz: I.

Properties of a partially purified transfructosylase. Indian Journal of Biochemistry and

Biophysics, 13, 261-266.

Schorr-Galindo, S. and Guiraud, J.P. (1997). Sugar potential of different Jerusalem artichoke

cultivars according to harvest. Bioresource Technalogy, 60, 15-20.

สำนกหอ


52

Schroeven, L., Lammens, W., Van Laere, A. and Van den Ende, W. (2008). Transforming wheat

vacuolar invertase into a high affinity sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase. New

Phytologist, 180, 822-831.

Shiomi, N., Benkeblia, N., Onodera, S., Omori, T., Takahashi, N., Fujishima, M., Yoshihira, T.

and Kosaka, S. (2007). Saccharide and fructooligosaccharide contents, and invertase,1-KHE,

1-SST, 1-FET and 6G-FFT activities in green asparagus spears during storage: effects of

temperature and spear portion. Journal of Applied Glycosciene, 54, 187-194

Shiomi, N. and Izawa, M. (1980). Purification and characterization of sucrose:sucrose

1-fructosyltransferase from the roots of Asparagus (Asparagus officinalis L.).

Agricultural Biology and Chemistry, 44, 603-614.

Shiomi, N., Kido, H. and Kiriyama, S. (1985). Purification and Properties of sucrose: sucrose

1F-β-D-fructosyltransferase in onion seeds. Phytochemistry, 24, 695-698

Singh, R. and Bhatia, I.S. (1971). Isolation and characterization of fructosyltransferase from

chicory roots. Phytochemistry, 10(3), 495–502.

Srikhampa, W. and Uriyapongson, J. (2008). Determination and extraction of inulin from

Jerusalem artichoke. Journal of Agricultural Science, 39(3) (Suppl.), 373- 376.

Suzuki, M. (1993). Fructans in crop production and preservation. In Science and Technology of

Fructans (Suzuki, M. and Chatterton, N. J, eds). CRC Press, 227- 255.

Trinder, P. (1969). Determination of blood glucose using an oxidaseperoxidase system with a

non-carcinogenic chemogen. Journal of Clinical Pathology, 22, 158-161. Van den Ende, W., Michiels, A., De Roover, J. and Van Laere, A. (2002). Fructan biosynthetic

and breakdown enzymes in dicots evolved from different invertases: expression of

fructan genes throughout chicory development. The Scientifical World Journal, 2,

1273–1287

Van den Ende, W. and Van Laere, A. (1996). Fructan synthesizing and degrading activities in

chicory roots (Cichorium intybus L.) during field-growth, storage and forcing. Plant Physiology, 149,

43–50.

Van der Meer, I. M., Koops, A.J., Hakkert, J.C. and Van Tunen , A.J. (1998). Cloning of the

fructan biosynthesis pathway of Jerusalem artichoke. The Plant Journal, 15(4), 489–500

Van Loo, J., Coussement, P., De Leenheer, L., Hoebregs, H. and Smits, G. (1995). On the

สำนกหอ


53

presence of inulin and oligofructose as natural ingredients in the Western diet. Critical

Reviews in Food Science and Nutrition, 35, 525–552.

Vijn, I. and Smeekens, S. (1999). Fructan: More Than a Reserve Carbohydrate? Plant

Physiology, 120, 351–359.

สำนกหอ


54

ภาคผนวก ก

สำนกหอ


55

ภาคผนวก ก

การเตรยมสารเคม

1. สารละลายทใชในการสกดนาตาล

การเตรยม 80% ethanol จาก 95% ethanol (100 ml)

- จะใช 95% ethanol = = 84.21 มลลลตร

- ปรบปรมาตรดวยนากลนใหไดปรมาตรเปน 100 มลลลตร

2. สารละลายทใชในการสกดเอนไซม 2.1 สารละลาย K2HPO4 (M W. 174.18) ความเขมขน 0.007 โมลาร ปรมาตร 100 มลลลตร

ละลาย K2HPO4 0.129 กรม ในนากลนปรบใหไดปรมาตรเปน 100 มลลลตร

2.2 สารละลาย KH2PO4 (M W. 136.08) ความเขมขน 0.007 โมลาร ปรมาตร 100 มลลลตร

ละลาย KH2PO4 0.095 กรม ในนากลนปรบใหไดปรมาตรเปน 100 มลลลตร

2.3 สารละลาย potassium phosphate buffer ความเขมขน 0.007 โมลาร พเอช 7.0 ปรมาตร 100

มลลลตร

ผสมสารละลาย K2HPO4 ความเขมขน 0.007 โมลาร ปรมาตร 61.5 มลลลตร รวมกบ สารละลาย KH2PO4 ความเขมขน 0.007 โมลาร ปรมาตร 38.5 มลลลตร

2.4 Enzyme extraction buffer ปรมาตร 100 มลลลตร

ละลายซสเตอน (cysteine) 0.5 กรม และ Triton X-100 0.5 มลลลตร ในสารละลาย potassium phosphate buffer ความเขมขน 0.007 โมลาร พเอช 7.0 ปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร

3. สารละลายสาหรบหาคากจกรรมของเอนไซม 3.1 สารละลาย potassium phosphate buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร พเอช 5.4 ปรมาตร 100

มลลลตร

ละลาย KH2PO4 1.3608 กรมในนากลนปรบพเอชใหเทากบ 5.4 ดวย NaOH แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร

3.2 สารละลายนาตาลซโครสความเขมขน 0.575 โมลารปรมาตร 25 มลลลตร

ละลายนาตาลซโครส 4.92 กรม ในสารละลาย potassium phosphate buffer ความเขมขน

0.1 โมลาร พเอช 5.4 ปรบปรมาตรใหได 25 มลลลตร

สำนกหอ


56

4. สารละลายสาหรบการทาบรสทธเอนไซม

4.1 สารละลาย K2HPO4 (M W. 174.18) ความเขมขน 0.050 โมลาร ปรมาตร 1000 มลลลตร

ละลาย K2HPO4 8.709 กรม ในนากลนปรบใหไดปรมาตรเปน 1000 มลลลตร

4.2 สารละลาย KH2PO4 (M W. 136.08) ความเขมขน 0.050 โมลาร ปรมาตร 1000 มลลลตร

ละลาย KH2PO4 6.804 กรม ในนากลนปรบใหไดปรมาตรเปน 1000 มลลลตร

4.3 สารละลาย potassium phosphate buffer ความเขมขน 0.050 โมลาร พเอช 6.5 ปรมาตร 1000 มลลลตร (สารละลายบฟเฟอร A)

ผสมสารละลาย K2HPO4 ความเขมขน 0.050 โมลาร ปรมาตร 300 มลลลตร รวมกบ

สารละลาย KH2PO4 ความเขมขน 0.050 โมลาร ปรมาตร 700 มลลลตร

4.3.1 สารละลายบฟเฟอร B ปรมาตร 1000 มลลลตร

ละลาย NaCl 58.44 กรม ในสารสารละลายบฟเฟอร A ปรบใหไดปรมาตรเปน 1000

มลลลตร

4.3.2 สารละลายบฟเฟอร C ปรมาตร 500 มลลลตร

ละลาย NaCl 14.61 กรม MnCl 0.0629 กรม และ CaCl2.2H2O 0.07351 กรม ในสารสารละลายบฟเฟอร A ปรบใหไดปรมาตรเปน 500 มลลลตร

4.3.2 สารละลายบฟเฟอร D ปรมาตร 500 มลลลตร

ละลาย methyl-α-D-mannopyranoside (MW. 194.18) 9.709 กรม ในสารสารละลายบฟเฟอร C ปรบใหไดปรมาตรเปน 100 มลลลตร

4. สารละลายสาหรบการศกษาคณลกษณะทางพเอช

4.1 สารละลาย potassium phosphate buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร

ละลาย KH2PO41.3608 กรม ในนากลนปรบพเอชไดตามตองการ ดวย NaOH แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร

4.2 สารละลาย Citrate phosphate buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร ละลาย CH3COONa.3H2O 1.280 กรม ในนากลนปรบพเอชไดตามตองการ ดวยสารละลายกรดอะซตก แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร

4.3 สารละลาย Tris-HCl buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร ละลาย Tris (Hydroxylmethyl) – aminomethane 0.32 กรม ละลายดวยนากลนปรบพเอชไดตามตองการ ดวยสารละลายกรดไฮโดรคลอรก แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร

4.4 สารละลาย glycine-NaOH buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร

สำนกหอ


57

ละลาย glycine 0.184 กรม ละลายดวยนากลนปรบพเอชไดตามตองการ ดวย NaOH แลวปรบปรมาตรใหได 100 มลลลตร

5. การเตรยมอาหารเลยงเชอสตร MRS (Carbohydrate-free Man-Rogosa-Sharp) 1 ลตร - Peptone (Oxoid L34) 10 กรม

- Sodium acetate 3H2O 5 กรม

- Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 2 กรม

- Magnesium sulphate (MgSO4.7H2O) 0.2 กรม

- Manganese sulphate (MnSO4.4H2O) 0.05 กรม

- Lab lemco powder (Oxoid L29) 8 กรม

- Citrate 2 กรม

- Dextrose 20 กรม

- Yeast extract 4 กรม

- Tween 80 1 มล.

- นากลน 1000 มล.

สำนกหอ


ภาคผนวก ข

สำนกหอ


ภาคผนวก ข

กราฟมาตราฐานและการคานวน

1. การวเคราะหดวยวธ DNS

1.1 การเตรยมสารละลาย 3,5-Dinitrosalisylic acid (DNS) (100 มลลลตร) - ชง DNS 1 กรม

- ปเปต 2M NaOH 20 มลลลตร

- ชง Potassium sodium tartate 30 กรม

ละลาย DNS ในนากลนกอน โดยใชนาปรมาตรเลกนอย ตองใหสารละลายทไดมสเหลองใส จากนนจงคอยๆ เตม 2โมลาร NaOH กวนใหสารละลายเปนเนอเดยวกน จากนนคอยๆ เตม potassium sodium tartate กวนใหสารละลายสม-เหลองใส สามารถใหความรอนไดเลกนอย เกบ

DNS reagent ในขวดสชา 1.2 วธการทดลอง

นาสารสกดทไดมาเจอจาง จากนนผสมสารสกดปรมาตร 50 ไมโครลตรกบสารละลาย DNS ปรมาตร 150 ไมโครลตร ผสมใหเขากน นาไปตมท 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท จะเหนสารละลายเปนสเหลอง นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร คานวณหาปรมาณของนาตาลทงหมดเทยบกบกราฟมาตรฐานกลโคส

1.3 การหาปรมาณ reducing sugar ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของกลโคส จะไดสมการ y = 0.1213x

โดย y คอคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 550 นาโนเมตร

x คอความเขมขนของ reducing sugar (umole/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณ reducing sugar ไดดงน reducing sugar (μmol/ml) = x dilution factor

สำนกหอ


60

y = 0.1213x

R² = 0.9964

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00

OD.

550

glucose (μmol/ml)

ภาพท 20 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสโดยการวเคราะหดวยวธ DNS

2. การวเคราะหดวยวธ Phenol sulfuric

2.1 การเตรยมสารละลาย 5 %( w/v) Phenol

- ชง Phenol 5 กรม

- ละลายในนากลน 100 มลลลตร จะไดสารละลาย 5 %( w/v) Phenol 100 มลลลตร

2.2 วธการทดลอง

นาสารสกดทไดมาเจอจาง จากนนผสมสารสกดปรมาตร 1 มลลลตรกบสารละลายฟนอล

(phenol) 5 เปอรเซนต ปรมาตร 1 มลลลตร เมอผสมเขากนแลวเตมกรดซลฟวรก (sulfuric acid,

H2SO4) ปรมาตร 5 มลลลตร ตงทงไวประมาณ 10 นาท จะเหนสารละลายเปนสสม-เหลอง นาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 480 นาโนเมตร คานวณหาปรมาณของนาตาลทงหมดเทยบกบกราฟมาตรฐานกลโคส

2.3 การหาปรมาณ total sugar ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของกลโคส จะไดสมการ y = 0.0099x


x คอความเขมขนของ total sugar (umole/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณ total sugar ไดดงน

สำนกหอ


61

total sugar (umole/ml) = x dilution factor

ภาพท 21 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสโดยการวเคราะหดวยวธ Phenol sulfuric

3. การวเคราะหดวยวธ โปรตนดวยวธ Bradford

3.1 การเตรยม Bradford dye reagent

เจอจาง Bradford dye reagent (Bio-Rad) เขมขน 1 สวน ดวยนากลน 4 สวน นาไปกรองผานกระดาษกรอง whatman no. 1 เกบในขวดสชา

3.2 วธวเคราะห นาตวอยาง 10 ไมโครลตร ผสมกบ Bradford dye reagent 200 ไมโครลตร ทงไวนาน 5 นาท นาไปวดคาการดดกลนแสงท 595 นาโนเมตรคานวณหาปรมาณของโปรตนทงหมดเทยบกบกราฟมาตรฐาน BSA

3.3 การหาปรมาณโปรตนในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ BSA จะไดสมการ y = 1.1551x


x คอความเขมขนของ BSA (mg/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณโปรตนไดดงน

y = 0.0099x

R² = 0.9965

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

0 20 40 60 80 100

OD.

480

nm

glucose (μg/ml)

สำนกหอ


62

โปรตน (mg/ml) = x dilution factor

ภาพท 22 กราฟมาตรฐานของ BSAโดยการวเคราะหดวยวธ Bradford

4. การวเคราะหนาตาลรดวซดวยวธ Somogyi – Nelson

4.1 การเตรยมสารเคม Nelson’s Reagent A - ชง Na2CO3 (anhydrous) 6.25 กรม

- Potassium sodium tartrate 6.25 กรม - NaHCO3 5.00 กรม

- Na2SO4 (anhydrous) 50 กรม

- ละลายในนากลนและปรบปรมาตรสารละลายดวยนากลนเปน 250 มลลลตร

Nelson’s Reagent B

- CuSO4.5H2O 7.5 กรม

- Conc. H2SO4 1 หยด

- ละลายในนากลนและปรบปรมาตรสารละลายดวยนากลนเปน 50 มลลลตร

Arsenomolybdate Reagent - (NH4)6.MO7O24.4H2O 12.5 กรม

y = 1.1551x

R² = 0.9856

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

OD.

595

nm

BSA (mg/ml)

สำนกหอ


63

- H2SO4 10.5 มลลลตร

- ละลายในนากลน 225 มลลลตร (สารละลาย 1)

- Na2HAsO4.7H2O 1.5 กรม

- ละลายในนากลน 12.5 มลลลตร (สารละลาย 2)

- ผสมสารละลาย 1 และ 2 ใหเขากน แลวเกบในขวดสชา 24 ชวโมง ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส กอนใชงาน


1. เจอจางสารตวอยางดวยนากลน

2. ผสม Nelson’s Reagent A 12.5 มลลลตร กบ Nelson’s Reagent B 0.5 มลลลตร

3. ผสม Nelson’s Reagent A+B 100 ไมโครลตร กบ สารละลายตวอยาง 100 ไมโครลตร และใหความรอนในนาเดอดเปนเวลา 20 นาท 4. เมอครบ 20 นาท ทาใหสารผสมเยนตวลง

5. เตม Arsenomolybdate Reagent 1 มลลตร และเขยาเปนครงคราวนาน 5 นาท เพอละลายตะกอนสแดงของ CuSO4 และใหปฏกรยาเกดขนอยางสมบรณ โดยปฏกรยาเสรจสนเมอเกด CO2

6. เมอปฏกรยาเสรจสนเตมนากลน 7 มลลลตร ผสมใหเขากน และวดการความเขมของสดวยเครอง Spectrophotometer ทความยาวคลน 500 นาโนเมตร

4.3 การหาปรมาณ reducing sugar ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ glucose จะไดสมการ y = 0.0037x


x คอความเขมขนของ reducing sugar (ug/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณ reducing sugar ไดดงน reducing sugar (mg/ml) = x dilution factor

สำนกหอ


64

ภาพท 23 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสโดยการวเคราะหดวยวธ Somogyi – Nelson

5. การวเคราะหนาตาลรดวซดวยวธ Glucose Oxidase -Peroxidase

5.1 การเตรยมสารเคม การเตรยม GOD (200 มลลลตร)

- 102 มลลโมลาร KH2PO4·H2O (MW=136.09) ชง 2.776 กรม

- 0.79 มลลโมลาร 4-aminoantipurine (MW=203.2) ชง 0.0321 กรม

- นาสารทงสองมาละลายในนากลน 100 ml ปรบพเอช เทากบ 7.0 ดวย NaOH

- เตม 21 กโลยนต ตอลตร GOD (17,300 หนวนตอกรม) ชง 0.2428 กรม

- เตม 1.5 กโลยนต ตอลตร POD (286.0 หนวนตอกรม) ชง 0.00104 กรม

- เตม 1.54 มลลโมลาร NaN3 ชง 0.02 กรม

- ปรบปรมาตรเปน 200 มลลลตร ดวยนากลน

การเตรยม Phenol Solution

- 560 มลลโมลาร Phenol ชง 211 มลลกรม

y = 0.0037x

R² = 0.998

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0 50 100 150 200 250

OD

500

nm

glucose (μg/ml)

สำนกหอ


65

- ละลายในนากลน 4 มลลลตร


ผสม GOD 200 มลลลตร กบ Phenol Solution 4 มลลลตร จากนาสาร ผสม GOD และ Phenol

200 ไมโครมลลลตร กบ สารละลายตวอยาง 20 ไมโครมลลลตร และบมในทมดเปนเวลา 40 นาท วดการความเขมของสดวยเครอง Spectrophotometer ทความยาวคลน 546 นาโนเมตร

5.3 การหาปรมาณ glucose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ glucose จะไดสมการ y = 1.411x


x คอความเขมขนของ glucose (mg/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณ glucose ไดดงน glucose (mg/ml) = x dilution factor

ภาพท 24 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสโดยการวเคราะหดวยวธ Glucose Oxidase -Peroxidase

6. การวเคราะหนาหนกโมเลกลโดยเทคนค gel filtration chromatography

y = 1.411x

R² = 0.999

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

OD.

546

nm

glucose (mg/ml)

สำนกหอ


66

การหานาหนกโมเลกลของเอนไซมดวยเครอง Fast Protein liquid chromatrography

(AKTA) โดยผาน Gel filtration ทภายในคอลมน XK 13 ซงบรรจ sephacryl S-200 ทาสมดลดวย

potassium phosphate buffer อตราการไหล 0.1 มลลลตรตอมลลลตร โดยผสมโปรตนมาตรฐานททราบนาหนกโมเลกลประกอบดวย Lysozyme; MW 14600 Trypsin; MW 23800 Lipase; MW

45000 BSA; 66000 และ Amyloglucosidase; MW 97000 ใหมความเขมขนเทากบ 10 มลลกรมตอมลลลตร เขยนกราฟมาตรฐานระหวางนาหนกโมเลกลกบปรมาตรทโปรตนมาตรฐานถกชะออกจากคอลมน ตารางท 10 แสดงความสมพนธระหวางนาหนกโมเลกลของโปรตนกบปรมาตรทถกชะออกจากคอลมน

Protein MW Elute (ml)

Lysozyme 14600 62.427

Trypsin 23800 53.757

Lipase 45000 45.893

BSA 66000 38.936

Amyloglucosidase 97000 29.459

7. การวเคราะหนาหนกโมเลกลโดยเทคนค SDS-PAGE

7.1 เตรยม stacking gel ความเขมขน acrylamide 4 เปอรเซนต ใน 0.6 M Tris-HCl

pH 6.8 - Distilled water 7.5 มลลลตร

- 0.6 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 มลลลตร

-10% SDS 0.1 มลลลตร

- 30% Acrylamide stock 1.35 มลลลตร

- 10% Ammonium persulphate 0.05 มลลลตร

- TEMED 14 ไมโครลตร

7.2 เตรยม resolving gel ความเขมขน acrylamide เทากบ 12 เปอรเซนต ใน 1.875 M

Tris-HCl pH 8.8 - Distilled water 5.7 มลลลตร


- 10% SDS 0.2 มลลลตร

สำนกหอ


67

- 30% Acrylamide stock 10 มลลลตร

- 10% Ammonium persulphate 0.1 มลลลตร

- TEMED 14 ไมโครลตร

7.3 เตรยม sample buffer


- SDS 0.05 กรม

- Sucrose 0.5 กรม

- ß-Mercaptoethanol 0.025 มลลลตร

- Bromophenol blue, 0.5% stock solution 0.5 มลลลตร

ปรบปรมาตรของ smple buffer ใหไดปรมาตรรวมเทากบ 5 มลลลตร

7.4 เตรยม protein staining

- Coomassie brilliant blue R-250 1.0 กรม

- Methanol 50 มลลลตร

- Acetic acid 10 มลลลตร

- Distilled water 39 มลลลตร

วธการทดลอง

1. เตรยม stacking gel โดยใช acrylamide ความเขมขนเทากบ 4% โดยนาหนกตอปรมาตร และ resolving gel โดยใช acrylamide ความเขมขนเทากบ 12% โดยนาหนกตอปรมาตร

2. วางแผนกระจกทบรรจเจลทแขงตวแลวลงใน chamber เท electrophoresis buffer

(ประกอบดวย Tris 3.0 กรม, glycine 14.4 กรม และ SDS 0.5 กรม) ใหทวมขอบกระจกดานบน เบาๆ เพอไมใหเกดฟอง

3. เตรยมตวอยางโปรตนโดยละลาย crude peptide ปรมาณ 0.05-1 มลลกรมตอมลลลตร ใน Sample buffer

4. ปเปตสารละลายโปรตนเปปไทดทความเขมขน 0.05, 0.1, 0.5 และ 1.0 มลลกรมโปรตนตอ

มลลลตร ปรมาตร 20 ไมโครลตร บรรจลงหลม และเตมโปรตนมาตรฐานปรมาตร 20 ไมโครลตร กอนปดฝา chamber ตอขวไฟฟาเขากบเครองจายไฟกระแสตรง 30 mA ความตางศกยไฟฟาท 200

Volt เปนเวลาประมาณ 40 นาท จนกระทงแถบนาเงนของ bromophenol blue เคลอนทลงมาจนเกอบถงปลายลางของแผนเจลจงปดเครองจายไฟ

5. นาแผนเจลออกจากกระจกดวยความระมดระวง จากนนทาการยอมแผนเจลดวยสารละลาย

สำนกหอ


68

staining (ตารางท 4) เปนเวลาประมาณ 2-3 ชวโมง 6. แชแผนเจลในสารละลาย destaining (ตารางท 5) ทงไว 6 ชวโมง เปลยน destaining ใหม

จนเหนแถบสนาเงนของโปรตนบนแผนเจล วเคราะหขนาดโมเลกลโดยเทยบกบโปรตนมาตรฐาน

(perfect protein ladder นาหนกโมลเลกล 5-200 kDa)

8. การวเคราะหนาตาลชนดตางๆโดยใชเทคนค HPLC

การวเคราะหนาตาลชนดตางๆ ดวยเครอง High Performance Liquid Chromatography (HPLC) โดยใช Rezek RNM carbohydrate Column ขนาด 7.8x300 มลลเมตร (Phenomenex) ชะดวย deionized distill water ทอตราการไหล (flow rate) เทากบ 0.4 มลลลตรตอนาท อณหภมทใชในการแยกคอ 45 องศาเซลเซยส และตรวจวดสารทออกจากคอลมนดวย Refractive index detector

8.1 สารมาตรฐานนาตาลซโครสม retention time ประมาณ 13.90 นาท

ภาพท 25 โครมาโตแกรมสารมาตรฐานนาตาลซโครสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC

การหาปรมาณนาตาลซโครสในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของซโครสจะไดสมการ y = 397486x

โดย y คอพนทท retention time ประมาณ 13.90 นาท x คอความเขมขนของ ซโครส (mg/ml)

สำนกหอ


69

y = 397486x

R² = 0.9997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 2 4 6 8 10 12

Area

sucrose (mg/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณซโครสไดดงน ซโครส (mg/ml) = x dilution factor

ภาพท 26 กราฟมาตรฐานของนาตาลซโครสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC

8.2 สารมาตรฐาน 1-kestose ม retention time ประมาณ 11.86 นาท

ภาพท 27 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน 1-kestose จากการวเคราะหดวยวธ HPLC

การหาปรมาณ1-kestose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ1-kestose จะไดสมการ y = 382688x

โดย y คอพนทท retention time ประมาณ 11.86 นาท x คอความเขมขนของ1-kestose (mg/ml)

สำนกหอ


70

สามารถคานวณหาปรมาณ1-kestose ไดดงน 1-kestose (mg/ml) = x dilution factor

ภาพท 28 กราฟมาตรฐานของ 1-kestose จากการวเคราะหดวยวธ HPLC

y = 382688x

R² = 0.9972

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 2 4 6 8 10 12

Area

1-kestose (mg/ml)

สำนกหอ


71

8.3 สารมาตรฐาน nystose ม retention time ประมาณ 10.68 นาท

ภาพท 29 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน nystose จากการวเคราะหดวยวธ HPLC

การหาปรมาณ nystose ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ nystose จะไดสมการ y = 339016x

โดย y คอพนทท retention time ประมาณ 10.68 นาท x คอความเขมขนของ nystose (mg/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณ nystose ไดดงน nystose (mg/ml) = x dilution factor

ภาพท 30 กราฟมาตรฐานของ nystose จากการวเคราะหดวยวธ HPLC

8.4 สารมาตรฐานนาตาลฟรกโตสม retention time ประมาณ 19.88 นาท

y = 339016x

R² = 0.9962

0

1000000

2000000

3000000

4000000

0 2 4 6 8 10 12

Area

nystose (mg/ml)

สำนกหอ


72

ภาพท 31 โครมาโตแกรมสารมาตรฐานนาตาลฟรกโตสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC

การหาปรมาณนาตาลฟรกโตสในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของนาตาลฟรกโตสจะไดสมการ y = 420192x

โดย y คอพนทท retention time ประมาณ 19.88 นาท x คอความเขมขนของนาตาลฟรกโตส (mg/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณนาตาลฟรกโตสไดดงน นาตาลฟรกโตส (mg/ml) = x dilution factor

สำนกหอ


73

ภาพท 32 กราฟมาตรฐานของฟรกโตสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC

8.5 สารมาตรฐานนาตาลกลโคสม retention time ประมาณ 17.59 นาท

ภาพท 33 โครมาโตแกรมสารมาตรฐานนาตาลกลโคสจากการวเคราะหดวยวธ HPLC

การหาปรมาณนาตาลกลโคสในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคสจะไดสมการ y = 396379x

โดย y คอพนทท retention time ประมาณ 17.59 นาท x คอความเขมขนของนาตาลกลโคส (mg/ml)

สามารถคานวณหาปรมาณนาตาลกลโคสไดดงน

y = 420192x

R² = 0.9979

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 2 4 6 8 10 12

Area

fructose (mg/ml) สำนกหอ


74

นาตาลกลโคส (mg/ml) = x dilution factor

ภาพท 34 กราฟมาตรฐานของนาตาลกลโคส จากการวเคราะหดวยวธ HPLC

8.6 สารมาตรฐาน inulin from chicory ม retention time ประมาณ 8.63 นาท

ภาพท 35 โครมาโตแกรมสารมาตรฐาน inulin from chicory จากการวเคราะหดวยวธ HPLC

การหาปรมาณ inulin from chicory ในสารตวอยาง

จากกราฟมาตรฐานของ inulin from chicory จะไดสมการ y = 294115x

โดย y คอพนทท retention time ประมาณ 8.63 นาท x คอความเขมขนของ inulin from chicory (mg/ml)

y = 396379x

R² = 0.9891

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 2 4 6 8 10 12

Area

glucose (mg/ml)

สำนกหอ


75

สามารถคานวณหาปรมาณ inulin from chicory ไดดงน inulin from chicory (mg/ml) = x dilution factor

ภาพท 36 กราฟมาตรฐานของ inulin from chicory จากการวเคราะหดวยวธ HPLC

9. การคานวนคากจกรรมของเอนไซม FTase

9.1 การคานวนโดยวธ Somogyi-Nelson และ glucoseoxidase - peroxidase (GOD/POD)

กาหนดให 1 หนวย (Unit, U) ของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส คอ ปรมาณเอนไซมททาใหเกด 1 ไมโครโมล ของฟรกโตสทถกถายโอน จากซโคส ภายในเวลา 1 นาท ภายใตสภาวะททาการวเคราะห โดยสามารถหาคา ฟรกโตสทถกถายโอน (F’) ไดจาก

F = R – G

F’ = G –F = 2G – R

หมายเหต หาปรมาณนาตาลรดวซ (R) โดยวธ Somogyi-Nelson และวเคราะหหานาตาลกลโคส (G)

โดยวธ glucoseoxidase - peroxidase (GOD/POD)

Activity (U/ml) =

9.2 การคานวนโดยการวเคราะหดวย HPLC

y = 294115x

R² = 0.9882

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

0 2 4 6 8 10 12

Area

inulin from chicory (mg/ml)

สำนกหอ


76

กาหนดให 1 หนวย (Unit, U) ของเอนไซมฟรกโตซลทรานสเฟอเรส คอ ปรมาณเอนไซมททาใหเกด 1 ไมโครโมล 1-kestose จากซโคส ภายในเวลา 1 นาท ภายใตสภาวะททาการวเคราะห

Activity (U/ml) =

10. การคานวณหาคาพารามเตอรของการทาบรสทธเอนไซม 8.1 Specific activity (U/mg protein) =

8.2 Total activity (U) =

8.3 Total protein (mg) =

8.4 Purification fold =

8.5 % Recovery =

11. การคานวณหาปรมาณเชอ Bifidobacterium sp. จากกราฟมาตรฐานของเชอ Bifidobacterium sp. จะไดสมการ y = 0.7393x


x คอปรมาณของเชอ Bifidobacterium sp. (CFU X 108)

สามารถคานวณหาปรมาณเชอ Bifidobacterium spไดดงน

Bifidobacterium sp. (CFU X 108) = x dilution factor

สำนกหอ


77

ภาพท 37 กราฟมาตรฐานของเชอ Bifidobacterium sp

y = 0.7393x

R² = 0.9815

0

1

2

3

4

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

OD.

600

nm

CFU X108 สำนกหอ


ภาคผนวก ค

สำนกหอ


79

ภาคผนวก ค

ขอมลผลการทดลอง

1. การสะสม FOS ของแกนตะวนระยะตางๆ

ตารางท 11 ปรมาณนาตาลในแกนตะวนอายชวงอายตางๆ

อาย (วน)

ตว

อยาง

total sugar

(mg/g fw.)

reducing

sugar

(mg/g fw.)

non-reducing

sugar

(mg/g fw.)

คาเฉลย

(AVE.)

(mg/g fw.)

คาเบยงเบน

มาตรฐาน

(±SD)

ใบ 2.788 2.183 0.605 0.435 0.177

2.626 2.178 0.449

30 2.687 2.435 0.252

ตน 16.023 4.407 11.615 12.231 0.534

16.970 4.459 12.510

17.045 4.477 12.569

ใบ 6.926 2.881 4.046 4.263 0.189

7.381 3.031 4.350

7.273 2.881 4.392

60 ตน 11.050 1.425 9.625 9.934 0.347

11.311 1.443 9.868

11.808 1.499 10.309

ราก 19.104 0.993 18.111 17.181 1.076

17.055 1.053 16.002

18.445 1.015 17.430

สำนกหอ


80


อาย (วน)

ตว

อยาง

total sugar

(mg/g fw.)

reducing

sugar

(mg/g fw.)

non-reducing

sugar

(mg/g fw.)

คาเฉลย

(mg/g fw.)



ใบ 6.291 2.236 4.056 3.916 0.159

6.379 2.429 3.950

6.043 2.300 3.743

90 ตน 84.818 2.384 82.434 85.037 2.942

86.824 2.375 84.448

90.633 2.405 88.229

ราก 35.152 1.516 33.635 31.955 1.932

31.380 1.536 29.845

33.939 1.554 32.386

ใบ 11.745 5.537 6.208 6.101 0.143

12.094 5.937 6.157

11.590 5.652 5.938

ตน 43.741 1.575 42.166 39.982 2.769

42.644 1.732 40.912

38.567 1.699 36.868

105 ราก 42.721 1.470 41.251 41.851 1.791

45.336 1.470 43.866

41.889 1.453 40.437

หว 116.526 1.638 114.888 113.025 5.058

118.400 1.514 116.887

108.716 1.417 107.299

สำนกหอ


81


อาย (วน)

ตว

อยาง

total sugar

(mg/g fw.)

reducing sugar

(mg/g fw.)

non-reducing sugar

(mg/g fw.)

คาเฉลย

(AVE.)

(mg/g fw.)



(±SD)

ใบ 7.187 2.591 4.597 4.742 0.126

7.508 2.698 4.810

7.464 2.644 4.820

ตน 45.141 3.483 41.658 40.522 1.111

43.260 3.822 39.439

44.305 3.837 40.468

120 ราก 45.977 4.100 41.877 42.039 0.387

46.674 4.193 42.481

45.977 4.218 41.759

หว 116.427 1.879 114.548 112.885 2.274

115.470 1.658 113.812

111.962 1.668 110.294

ใบ 7.618 3.073 4.545 4.670 0.122

7.831 3.042 4.790

7.778 3.104 4.674

ตน 51.019 3.313 47.707 48.234 1.025

51.184 3.603 47.581

52.994 3.579 49.415

135 ราก 27.052 2.262 24.789 25.195 0.798

28.378 2.262 26.115

26.926 2.244 24.682

หว 88.272 1.000 87.272 90.061 2.784

93.859 1.020 92.839

91.066 0.995 90.070

สำนกหอ


82


อาย (วน)

ตว

อยาง

total sugar

(mg/g fw.)

reducing sugar

(mg/g fw.)

non-reducing sugar

(mg/g fw.)

คาเฉลย

(AVE.)

(mg/g fw.)



(±SD)

ใบ 8.582 2.110 6.471 6.516 0.147

8.743 2.063 6.681

8.614 2.218 6.397

ตน 28.122 5.435 22.687 22.978 1.341

27.479 5.672 21.807

29.568 5.128 24.441

150 ราก 34.685 2.270 32.415 31.654 0.761

33.800 2.147 31.653

33.287 2.394 30.893

หว 61.364 1.425 59.939 59.762 2.053

63.030 1.309 61.721

58.788 1.162 57.626

หว 87.057 3.275 83.782 84.554 0.887

180 88.752 3.230 85.522

87.519 3.162 84.357

สำนกหอ


83

2. การหาคากจกรรมของเอนไซม FTase ของแกนตะวนระยะตางๆ

ตารางท 12 กจกรรมของเอนไซม FTase ของแกนตะวนระยะตางๆ

อาย ตว protein R G F F' activity AVE ±SD

(วน) อยาง (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (U) (U)

ตน 0.633 4.379 3.398 0.981 2.417 0.047 0.061 0.013

0.633 4.299 3.755 0.545 3.210 0.062

60 0.633 4.526 4.165 0.361 3.803 0.073

ราก 0.525 4.379 2.110 2.270 -0.160 -0.003 -0.002 0.001

0.525 4.299 2.097 2.203 -0.106 -0.002

0.525 4.526 2.210 2.316 -0.106 -0.002

ตน 0.657 7.083 4.952 2.131 2.821 0.054 0.059 0.008

0.657 6.766 5.164 1.602 3.563 0.069

0.657 5.883 4.356 1.527 2.830 0.055

90 ราก 0.820 4.341 2.333 2.008 0.325 0.006 -0.003 0.010

0.820 5.291 2.284 3.007 -0.724 -0.014

0.820 5.058 2.511 2.547 -0.037 -0.001

ไหล 1.184 5.668 3.870 1.799 2.071 0.040 0.026 0.013

1.184 6.235 3.671 2.564 1.107 0.021

1.184 6.335 3.586 2.749 0.837 0.016

ตน 0.866 5.457 4.254 1.202 3.052 0.059 0.063 0.012

0.866 5.123 3.936 1.188 2.748 0.053

0.866 5.590 4.768 0.822 3.947 0.076

105 ราก 0.817 3.744 2.111 1.633 0.479 0.009 0.012 0.003

0.817 4.077 2.451 1.626 0.826 0.016

0.817 3.911 2.267 1.643 0.624 0.012

หว 2.285 11.912 8.852 3.060 5.792 0.112 0.103 0.021

2.285 12.362 9.242 3.120 6.121 0.118

2.285 13.229 8.657 4.572 4.085 0.079

สำนกหอ


84




ตน 0.449 2.324 2.265 0.058 2.207 0.043 0.036 0.008

0.449 2.524 2.223 0.301 1.922 0.037

0.449 2.540 1.982 0.559 1.423 0.027

120 ราก 0.492 0.688 0.384 0.304 0.081 0.002 0.005 0.005

0.492 0.655 0.583 0.072 0.511 0.010

0.492 1.005 0.562 0.443 0.118 0.002

หว 1.543 10.278 7.673 2.605 5.067 0.098 0.098 0.008

1.543 10.478 7.999 2.479 5.519 0.106

1.543 10.245 7.460 2.785 4.675 0.090

ตน 0.619 1.921 1.249 0.673 0.576 0.011 0.012 0.001

0.619 1.855 1.234 0.620 0.614 0.012

0.619 2.096 1.404 0.692 0.713 0.014

ราก 0.682 0.640 0.328 0.312 0.016 0.000 0.001 0.001

135 0.682 0.590 0.278 0.312 0.000 0.000

0.682 0.390 0.261 0.129 0.131 0.003

หว 1.481 9.385 6.935 2.450 4.486 0.087 0.086 0.004

1.481 10.185 7.417 2.768 4.649 0.090

1.481 9.585 6.921 2.664 4.257 0.082

สำนกหอ


85




ตน 0.615 1.528 1.311 0.217 1.094 0.021 0.017 0.004

0.615 2.111 1.417 0.694 0.724 0.014

0.615 1.836 1.368 0.469 0.899 0.017

150 ราก 0.767 0.724 0.312 0.413 -0.101 -0.002 -0.002 0.004

0.767 0.844 0.273 0.571 -0.298 -0.006

0.767 0.758 0.424 0.334 0.089 0.002

หว 1.407 8.103 6.339 1.764 4.575 0.088 0.069 0.021

1.407 7.219 5.460 1.759 3.700 0.071

1.407 8.336 5.389 2.947 2.442 0.047

หว 2.365 2.311 1.901 0.409 1.492 0.029 0.033 0.004

180 2.365 2.377 2.163 0.214 1.950 0.038

2.365 2.161 1.923 0.238 1.684 0.032

3. การทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารของแกนตะวน

ตารางท 13 ผลการทาบรสทธเอนไซม FTase จากหวสะสมอาหารแกนตะวน

column volume

(ml)

protein

(mg/ml)

Total

protein

(mg)

1-kestose

area (x2)

1-kestose

(mgl/ml)

activity

(U/ml)

specific

Activity

(U/mg)

pure

(fold)

total

activity

(U)

yield

(%)

crude 20 1.857 37.138 1324035 276.792 1.905 1.026 1.000 38.105 100.000

Q sep 4 0.455 1.821 1706208 356.686 2.455 5.393 5.257 9.821 25.773

con A 1 0.146 0.146 4516797 944.245 6.500 44.402 43.275 6.500 17.057

สำนกหอ


86

4. การศกษาคณลกษณะสมบตของเอนไซม FTase (Characterization)

ตารางท 14 ผลการศกษาพเอชทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม FTase

R G F F' Activity AVE relative

pH (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (U/ml) (U/ml) activity

3 1.746 0.078 1.668 -1.590 -0.153 -0.147 -27.401

(C) 1.781 0.074 1.707 -1.632 -0.157

1.441 0.050 1.391 -1.341 -0.129

3.5 0.559 0.113 0.446 -0.333 -0.032 -0.020 -3.723

(C) 0.530 0.227 0.303 -0.076 -0.007

0.551 0.170 0.381 -0.211 -0.020

4 0.401 0.400 0.001 0.399 0.039 0.037 6.977

(C) 0.511 0.454 0.057 0.396 0.038

0.591 0.478 0.112 0.366 0.035

4.5 2.381 2.320 0.061 2.260 0.218 0.200 37.384

(C) 2.354 2.306 0.048 2.258 0.218

2.238 1.973 0.265 1.708 0.165

5 4.968 4.529 0.438 4.091 0.395 0.413 77.110

(C) 4.812 4.558 0.254 4.303 0.415

4.753 4.600 0.152 4.448 0.429

5.5 5.279 5.060 0.219 4.842 0.467 0.476 88.858

(C) 5.056 4.961 0.095 4.866 0.469

5.171 5.131 0.040 5.091 0.491

6 5.142 4.782 0.360 4.423 0.427 0.437 81.451

(C) 4.845 4.797 0.048 4.748 0.458

5.081 4.754 0.327 4.427 0.427

5.4 5.564 5.549 0.015 5.535 0.534 0.535 100.000

(P) 5.598 5.585 0.031 5.554 0.536

5.550 5.567 0.001 5.566 0.537

สำนกหอ


87

ตารางท 14 (ตอ) R G F F' Activity AVE relative


6 4.380 4.178 0.202 3.976 0.383 0.398 74.298

(P) 4.326 4.249 0.077 4.172 0.402

4.412 4.320 0.093 4.227 0.408

6.5 1.992 1.627 0.365 1.261 0.122 0.152 28.372

(P) 1.786 1.747 0.039 1.707 0.165

1.922 1.839 0.083 1.757 0.169

7 0.124 0.050 0.074 -0.025 -0.002 -0.002 -0.463

(P) 0.144 0.058 0.086 -0.028 -0.003

0.138 0.057 0.081 -0.024 -0.002

7.5 0.038 0.006 0.031 -0.025 -0.002 -0.003 -0.553

(P) 0.055 0.017 0.038 -0.021 -0.002

0.063 0.009 0.055 -0.046 -0.004

8 0.028 0.021 0.007 0.015 0.001 0.000 0.037

(P) 0.052 0.025 0.027 -0.003 0.000

0.039 0.016 0.022 -0.006 -0.001

7.5 0.061 0.035 0.026 0.009 0.001 0.000 -0.006

(T) 0.015 0.011 0.004 0.008 0.001

0.054 0.018 0.036 -0.017 -0.002

8 0.034 0.004 0.031 -0.027 -0.003 -0.002 -0.325

(T) 0.038 0.005 0.033 -0.028 -0.003

0.009 0.005 0.004 0.001 0.000

8.5 0.029 0.008 0.021 -0.014 -0.001 0.000 -0.061

(T) 0.014 0.013 0.001 0.012 0.001

0.016 0.004 0.012 -0.009 -0.001

8.5 0.069 0.013 0.056 -0.043 -0.004 -0.004 -0.812

(GN) 0.068 0.012 0.056 -0.044 -0.004

0.075 0.013 0.062 -0.048 -0.005

สำนกหอ


88


ตารางท 15 ผลการศกษาพเอชทเสถยรของเอนไซม FTase

time pH R G F F' activity (U) AVE relative

(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (U/ml) (U/ml) activity

4.5 1.950 1.623 0.327 1.296 0.125 0.139 100.000

1.955 1.722 0.233 1.489 0.144

2.004 1.779 0.225 1.554 0.150

5 2.172 1.984 0.188 1.797 0.173 0.191 100.000

0h 2.264 2.211 0.053 2.158 0.208

2.167 2.069 0.097 1.972 0.190

5.5 2.063 2.030 0.032 1.998 0.193 0.196 100.000

2.285 2.201 0.084 2.117 0.204

2.112 2.045 0.067 1.978 0.191

R G F F' Activity AVE relative


9 0.004 0.000 0.004 -0.004 0.000 0.000 -0.067

(GN) 0.005 0.001 0.003 -0.002 0.000

0.005 0.000 0.005 -0.005 -0.001

9.5 0.012 0.001 0.011 -0.010 -0.001 -0.001 -0.102

(GN) 0.011 0.009 0.003 0.006 0.001

0.013 0.000 0.013 -0.013 -0.001

10 0.011 0.000 0.011 -0.011 -0.001 0.000 -0.040

(G) 0.011 0.000 0.011 -0.011 -0.001

0.011 0.013 -0.003 0.016 0.002

สำนกหอ


89


time pH R G F F' activity (U) AVE relative

(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (U/ml) (U/ml) activity

6 2.249 2.166 0.083 2.082 0.201 0.203 100.000

2.201 2.166 0.035 2.131 0.206

2.211 2.152 0.060 2.092 0.202

6.5 2.215 2.166 0.050 2.116 0.204 0.194 100.000

2.269 2.067 0.203 1.864 0.180

0 h 2.161 2.109 0.052 2.057 0.198

7 2.145 1.676 0.468 1.208 0.116 0.148 100.000

2.372 1.761 0.610 1.151 0.111

2.274 2.257 0.017 2.240 0.216

7.5 1.905 1.850 0.056 1.794 0.002 0.156 100.000

1.916 1.680 0.237 1.443 0.001

1.889 1.751 0.139 1.612 0.002

8 2.075 1.651 0.423 1.228 0.118 0.129 100.000

2.075 1.765 0.310 1.455 0.140

2.199 1.765 0.434 1.330 0.128

4.5 1.916 1.552 0.364 1.188 0.115 0.124 88.783

1.818 1.510 0.308 1.202 0.116

1.876 1.669 0.207 1.462 0.141

5 2.211 1.981 0.230 1.750 0.169 0.158 83.022

2.268 1.991 0.277 1.715 0.165

48 h 2.357 1.906 0.451 1.456 0.140

5.5 2.475 2.038 0.438 1.600 0.154 0.154 78.838

2.467 2.069 0.398 1.672 0.161

2.544 2.038 0.506 1.531 0.148

6 2.413 2.003 0.410 1.593 0.154 0.151 74.421

2.453 2.024 0.429 1.595 0.154

2.522 2.013 0.509 1.505 0.145

สำนกหอ


90


time

pH

R

(mg/ml)

G

(mg/ml)

F

(mg/ml)

F'

(mg/ml)

activity (U)

(U/ml)

AVE

(U/ml)

relative

activity

6.5 2.372 1.960 0.412 1.548 0.149 0.143 73.775

2.178 1.833 0.345 1.488 0.144

2.214 1.816 0.398 1.417 0.137

7 1.435 1.212 0.223 0.989 0.095 0.089 60.125

1.528 1.180 0.348 0.832 0.080

48 h 2.011 1.478 0.533 0.945 0.091

7.5 1.680 1.194 0.486 0.709 0.068 0.073 46.729

1.526 1.173 0.353 0.820 0.079

1.566 1.152 0.415 0.737 0.071

8 1.396 1.099 0.298 0.801 0.077 0.076 58.981

1.360 1.067 0.293 0.774 0.075

1.319 1.056 0.263 0.793 0.076

ตารางท 16 ผลการศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการทางานของเอนไซม FTase

อณหภม (๐C)

R

(mg/ml)

G

(mg/ml)

F

(mg/ml)

F'

(mg/ml)

Activity

(U/ml)

AVE

(U/ml)

relative

activity

0.238 0.229 0.009 0.220 0.021 0.021 7.189

4 0.310 0.251 0.059 0.191 0.018

0.252 0.248 0.004 0.244 0.024

0.612 0.330 0.282 0.049 0.005 0.007 2.518

10 0.592 0.359 0.233 0.125 0.012

0.649 0.352 0.296 0.056 0.005

1.406 1.287 0.119 1.168 0.113 0.086 29.451

20 1.466 1.110 0.356 0.754 0.073

1.429 1.096 0.333 0.762 0.074

สำนกหอ


91


อณหภม (๐C)

R

(mg/ml)

G

(mg/ml)

F

(mg/ml)

F'

(mg/ml)

Activity

(U/ml)

AVE

(U/ml)

relative

activity

1.411 1.282 0.439 0.843 0.081 0.075 25.472

25 1.311 1.225 0.435 0.790 0.076

1.551 1.268 0.579 0.688 0.066

1.721 1.707 0.013 1.694 0.163 0.150 51.283

30 1.661 1.523 0.138 1.385 0.134

1.847 1.721 0.126 1.596 0.154

3.202 3.121 0.080 3.041 0.293 0.293 100.000

35 3.293 3.174 0.119 3.055 0.295

3.293 3.157 0.137 3.020 0.291

3.422 2.727 0.695 2.033 0.196 0.235 80.206

40 3.275 3.039 0.236 2.803 0.270

3.035 2.755 0.280 2.476 0.239

1.225 0.823 0.402 0.180 0.017 0.017 5.916

45 1.203 0.582 0.621 0.202 0.019

1.403 0.780 0.623 0.158 0.015

0.800 0.507 0.293 0.215 0.021 0.013 4.282

50 0.813 0.408 0.405 0.003 0.000

0.800 0.486 0.314 0.172 0.017

0.272 0.206 0.066 0.139 0.013 0.004 1.529

60 0.300 0.135 0.165 -0.029 0.000

0.358 0.168 0.190 -0.022 0.000

0.403 0.014 0.389 -0.375 0.000 0.000 0.000

70 0.193 0.001 0.192 -0.190 0.000

0.328 0.004 0.324 -0.320 0.000

สำนกหอ


92

ตารางท 17 ผลการศกษาอณหภมทเสถยรของเอนไซม FTase

time

tempera

ture (๐C)

R

(mg/ml)

G

(mg/ml)

F

(mg/ml)

F'

(mg/ml)

activity (U)

(U/ml)

AVE

(U/ml)

relative

activity

2.546 2.362 0.184 2.178 0.210 0.230 100.000

0h 2.800 2.687 0.113 2.575 0.248

2.400 2.400 0.000 2.400 0.232

4 2.992 2.702 0.290 2.411 0.233 0.203 88.048

2.459 2.178 0.281 1.897 0.183

2.500 2.249 0.251 1.998 0.193

20 2.641 2.320 0.321 1.999 0.193 0.188 81.429

2.846 2.405 0.441 1.963 0.189

2.854 2.362 0.492 1.870 0.180

25 2.827 2.496 0.331 2.166 0.209 0.226 98.316

2.362 2.355 0.007 2.348 0.226

2.578 2.553 0.025 2.528 0.244

30 2.792 2.221 0.571 1.649 0.159 0.193 83.835

2.895 2.405 0.490 1.914 0.185

48h 2.892 2.666 0.226 2.440 0.235

35 1.932 1.330 0.603 0.727 0.070 0.077 33.570

1.719 1.216 0.503 0.714 0.069

1.830 1.397 0.433 0.964 0.093

40 0.573 0.184 0.389 -0.205 -0.020 -0.025 0.000

0.792 0.198 0.594 -0.396 -0.038

0.581 0.198 0.383 -0.185 -0.018

45 0.508 0.078 0.430 -0.353 -0.034 -0.028 0.000

0.381 0.141 0.240 -0.098 -0.009

0.427 0.000 0.427 -0.427 -0.041

50 0.116 0.053 0.063 -0.010 -0.001 -0.002 0.000

0.121 0.054 0.067 -0.012 -0.001

0.120 0.047 0.073 -0.026 -0.002

สำนกหอ


93


time

tempera

ture (๐C)

R

(mg/ml)

G

(mg/ml)

F

(mg/ml)

F'

(mg/ml)

activity (U)

(U/ml)

AVE

(U/ml)

relative

activity

60 0.078 0.008 0.070 -0.061 -0.006 -0.006 0.000

0.079 0.009 0.070 -0.061 -0.006

48h 0.092 0.009 0.083 -0.074 -0.007

70 0.078 0.007 0.071 -0.064 -0.006 -0.006 0.000

0.079 0.011 0.068 -0.057 -0.006

0.078 0.011 0.067 -0.055 -0.005

ตารางท 18 ผลการศกษาไออนของโลหะและรเอเจนตตอการทางานของเอนไซม FTase

ion R G F F' Activity AVE relative

(1mM) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (U/ml) (U/ml) activity

none 3.125 2.717 0.407 2.310 0.223 0.251 100.000

3.492 3.142 0.350 2.793 0.269

3.184 2.947 0.237 2.710 0.261

MgCl2 3.493 2.526 0.967 1.559 0.150 0.186 73.943

3.290 2.731 0.559 2.173 0.210

3.347 2.696 0.651 2.045 0.197

SDS 2.804 1.936 0.868 1.068 0.103 0.188 74.842

2.723 2.624 0.100 2.524 0.243

2.496 2.376 0.121 2.255 0.217

CuCl2 2.004 1.625 0.379 1.246 0.120 0.151 60.231

2.291 2.093 0.198 1.895 0.183

2.253 1.909 0.344 1.564 0.151

MnCl2 3.127 2.950 0.177 2.774 0.268 0.262 104.331

3.451 3.248 0.203 3.045 0.294

3.441 2.887 0.554 2.333 0.225

สำนกหอ


94




EDTA 2.942 2.741 0.201 2.539 0.245 0.259 102.951

3.699 3.088 0.611 2.477 0.239

3.347 3.187 0.160 3.027 0.292

B6 3.245 3.144 0.101 3.043 0.293 0.290 115.337

3.148 2.917 0.230 2.687 0.259

3.488 3.385 0.103 3.282 0.317

KI 0.806 0.518 0.288 0.230 0.022 0.030 11.913

0.758 0.532 0.226 0.307 0.030

0.698 0.546 0.152 0.394 0.038

LiCl 3.619 2.765 0.854 1.911 0.184 0.219 87.236

3.576 3.141 0.435 2.706 0.261

3.517 2.858 0.659 2.198 0.212

PMSF 1.812 1.695 0.118 1.577 0.152 0.105 41.609

2.053 1.815 0.238 1.577 0.152

2.004 1.050 0.954 0.097 0.009

NaCl 3.371 2.585 0.787 1.798 0.173 0.221 88.033

3.209 2.996 0.213 2.782 0.268

3.382 2.840 0.542 2.297 0.222

CaCl2 3.333 2.697 0.636 2.062 0.199 0.247 98.168

3.376 2.910 0.466 2.444 0.236

3.209 3.186 0.022 3.164 0.305

KNO3 2.858 2.682 0.177 2.505 0.242 0.256 101.869

3.064 2.923 0.141 2.782 0.268

3.485 3.079 0.407 2.672 0.258

KCl 3.302 2.823 0.479 2.344 0.226 0.228 90.721

3.518 2.794 0.724 2.071 0.200

3.199 2.936 0.263 2.673 0.258

สำนกหอ


95




Mercap 2.863 2.593 0.270 2.324 0.224 0.266 105.836

tonethanol 3.419 3.167 0.252 2.915 0.281

3.030 3.030 0.000 3.030 0.292

Isopropanal 3.107 2.619 0.488 2.132 0.206 0.242 96.300

3.199 2.981 0.218 2.763 0.266

3.248 2.938 0.309 2.629 0.254

ตารางท 19 ผลการศกษาคาจนพลศาสตรของเอนไซม FTase

Sucrose

(M) time (h) 1-kestose (umol/ml)

1-kestose

(umol.ml-1.h-1)

12 7.436 8.090

0.4905

24 13.535 13.511

0.26 36 18.903 18.807

48 24.322 26.777

60 28.626 29.754

72 32.715 32.812

12 8.050 9.014

0.729

24 17.591 15.467

0.46 36 26.975 26.003

48 36.490 34.481

60 44.341 41.520

72 49.651 56.540

สำนกหอ


96


Sucrose

(M) time (h) 1-kestose (umol/ml)

1-kestose

(umol.ml-1.h-1)

12 9.529 8.881

0.7595

24 17.969 18.600

0.66 36 28.278 28.389

48 36.288 37.605

60 45.414 43.680

72 53.061 56.526

12 9.374 9.902

0.853

24 20.343 20.414

36 30.195 29.590

0.86 48 40.592 40.261

60 52.694 50.588

72 61.600 62.326

12 9.117 9.701

0.851

24 18.110 18.704

1.00 36 28.116 28.288

48 42.109 43.079

60 53.590 55.389

สำนกหอ


97

5. การผลต FOS จากเอนไซม FTase

ตารางท 20 FOS จากเอนไซม FTase

Sugar Retention Time 0 h 144 h dilution

Area Height Area Height

buffer 9.114 1786161 40928 - - 2

unknow FOS 9.919 - - 11912476 228772 2

nystose 10.697 - - 4417065 153162 2

1-kestose 11.845 - - 4263463 133292 2

sucrose 13.886 31022242 634527 4761583 139847 2

glucose 17.563 43165 1123 8866789 202624 2

fructose 19.803 - - 971801 18965 2

6. การศกษาคณสมบตความเปนพรไบโอตก

ตารางท 21 คา pH ของอาหาร MRS ทเพาะเลยงเชอ Bifidobacterium sp. ในเวลาตาง ๆ

เวลา (h) pH

Inulin FOS product Sucrose Glucose Fructose

0 6.64 6.42 6.61 6.48 6.55

3 6.49 6.09 6.37 5.50 6.11

6 6.36 5.61 6.12 5.04 5.23

9 6.25 5.25 6.06 4.76 5.05

10 6.25 4.97 5.99 4.29 4.57

11 6.25 4.96 5.89 4.28 4.46

12 6.26 4.94 5.85 4.18 4.42

15 6.25 4.92 5.69 4.01 4.24

18 6.24 4.95 5.53 3.98 4.21

สำนกหอ


98


เวลา (h) pH


21 6.26 4.92 5.41 3.87 4.15

24 6.28 4.89 5.28 3.84 4.02

27 6.20 4.85 5.21 3.79 3.98

30 6.17 4.90 5.12 3.77 4.10

36 6.27 4.95 4.98 3.72 4.07

ตารางท 22 ปรมาณ Bifidobacterium sp. ในอาหารเลยงเชอ MRS ทมแหลงคารบอนชนดตางๆ ในเวลาทเปลยนไป

เวลา (h) ปรมาณเซลล x108 (CFU)


0 0.186 0.256 0.193 0.200 0.223

3 0.389 0.557 0.469 0.552 0.532

6 0.638 0.848 0.870 0.929 0.845

9 0.705 0.958 1.014 1.096 1.078

10 0.889 1.938 1.280 2.996 2.139

11 0.929 1.909 0.698 3.097 2.518

12 0.843 1.934 1.477 3.096 2.624

15 0.814 1.933 1.540 3.194 2.580

18 0.692 1.842 1.640 3.248 2.624

21 0.678 1.823 1.691 3.317 2.657

24 0.888 1.804 1.850 3.465 2.887

27 0.916 1.769 1.857 3.535 3.032

30 1.037 1.739 1.904 3.539 3.037

36 0.936 1.479 2.141 3.606 2.847

สำนกหอ


99

ตารางท 23 นาตาลทงหมดในอาหารเลยงเชอทมแหลงคารบอนชนดตางๆ ในเวลาทเปลยนไป

เวลา (h) ปรมาณนาตาลทงหมด (mg/ml)


0 21.18 24.12 23.08 21.30 24.09

3 21.04 23.27 22.51 20.84 23.38

6 21.01 22.07 21.94 19.60 21.25

9 20.67 21.67 21.23 19.12 19.97

10 20.57 20.64 21.20 15.37 18.84

11 20.47 20.29 21.03 15.07 18.33

12 20.39 18.96 20.84 14.04 17.63

15 20.29 18.62 19.80 13.00 16.52

18 19.80 18.43 19.36 10.30 14.49

21 19.53 18.33 18.70 8.23 12.24

24 19.28 17.95 17.17 7.46 12.04

27 18.27 16.33 16.89 3.45 5.93

30 17.81 15.69 16.49 3.23 5.68

36 17.24 15.17 14.47 3.21 5.33

ตารางท 24 นาตาลรดวซในอาหารเลยงเชอทมแหลงคารบอนชนดตางๆ ในเวลาทเปลยนไป

เวลา (h) ปรมาณนาตาลนาตาลรดวซ (mg/ml)


0 1.55 2.20 0.23 18.12 21.07

3 1.22 2.63 0.25 15.44 13.74

6 1.64 2.38 0.25 14.50 16.27

9 1.54 1.68 0.23 14.60 15.80

10 1.70 1.65 0.32 11.85 11.89

11 2.13 1.74 0.57 9.83 14.48

12 1.76 1.81 0.29 7.50 12.04

สำนกหอ


100


เวลา (h) ปรมาณนาตาลนาตาลรดวซ (mg/ml)


15 1.67 1.92 0.63 11.73 12.29

18 1.76 1.97 0.23 6.55 11.09

21 1.33 0.80 0.17 5.14 8.74

24 1.51 0.64 0.20 3.24 7.30

27 1.26 0.68 0.23 3.41 8.80

30 1.57 0.94 0.22 3.65 6.81

36 1.46 0.61 0.22 2.32 4.46

สำนกหอ


101

คาอธบายสญลกษณและคายอ

% เปอรเซนต U หนวยของเอนไซม ml มลลลตร

L ลตร

mg มลลกรม

M โมลาร mM มลลโมลาร mmole มลลโมล

μmole ไมโครโมล

nm นาโนเมตร

KDa กโลดาลตน

mmolL-1mim-1 มลลโมลตอลตรตอนาท ๐C องศาเซลเซยส

h ชวโมง

min นาท OD. คาการดดกลนแสง

rpm รอบตอนาท G กลโคส

R นาตาลรดวส (reducing sugar)

F ฟรกโตส

F’ ฟรกโตสทถกถายโอน

AVE. คาเฉลย

±SD สวนเบยงเบนมาตรฐาน

FW. นาหนกสด

C citrate phosphate buffer

P potassium phosphate buffer

T Tis-HCL buffer

GN glycine-NaOH buffer

ประวตผวจย

สำนกหอ


102

ชอ-สกล นางสาวศรสดา เคยอาษา Miss Srisuda Keayarsa

เกดวนท 24 มนาคม พ.ศ. 2528

สถานทเกด กรงเทพ ฯ

ทอยปจจบน 1620 หม 6 ซอยนาผง1 ถนน เทพารกษ ตาบล เทพารกษ อาเภอ เมอง จงหวด สมทรปราการ 10270

E-mail [email protected]

ประวตการศกษา

พ.ศ.2545 สาเรจการศกษาระดบมธยมปลายจากโรงเรยนเซนตโยเซฟ บางนา พ.ศ.2550 สาเรจการศกษาปรญญาวทยาศาสตรบณฑต (เทคโนโลยชวภาพ) จาก

คณะวศวกรรมศาสตรและเทคโนโลยอตสาหกรรม มหาวทยาลยศลปากร การนาเสนอผลงานวจย

Oral presentation

พ.ศ.2554 The Activity Analysis of Fructosyltransferase extracted from Jerusalem

Artichoke during tuberization stage (International Food Conference

2011, Surabaya Indonesia)

พ.ศ.2555 Extraction and Analysis of Fructosyltransferase from Various

Tuberization Stages of Jerusalem artichoke (ศลปากรวจยครงท 5)

สำนกหอ


วภาพ 2554 ิทยาลยศิัากลป - Silpakorn University · 2013-08-15 ·...

Documents

Transcript of วภาพ 2554 ิทยาลยศิัากลป - Silpakorn University · 2013-08-15 ·...