实验九

氨基移换反应及其产物的鉴定

丁鸣

一、实验目的和要求

1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；

2、学习纸层析的原理和操作技术。

二、实验基本原理1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶 )的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适 pH接近 7.4 ，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（ GPT ）和谷草转氨酶（ GOT ）的活性最强。 转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（ glutamic pyruvic transaminase, GPT ）、谷草转氨酶（ glutamic oxalacetic transaminase,GOT ）活性较高。

GPT 催化下的转氨基反应为：

L －谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化 L－谷氨酸氧化脱－ NH2 ，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物 L－谷氨酸。 本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（ GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。

2. 纸层析原理：

滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。

层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。

溶质在滤纸上的移动速率用 Rf 值表示：

原点到溶剂前缘的距离

距离原点到层析斑点中心的值 f

R

原点

溶剂前沿

样品层析斑点X

Y⊙

●

Y

XR f

X——原点到层析斑点中心距离Y——原点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下某种物质的 Rf 值是常数。 Rf 值的大小与样品的性质、结构、溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的 pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外，样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。

用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的 R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（ 0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。

3. 茚三酮的显色原理：

氨基酸 + 茚三酮类 紫红色复合物80℃

三、实验材料与试剂1、实验材料 动物肝脏 (牛蛙肝或猪肝）2、实验试剂⑴ 0.01mol/L磷酸缓冲液（ pH7.4 ）（转氨基反应所需缓冲溶液）；⑵ 0.1mol/Lα －丙氨酸（ pH7.4 ）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）；⑶ 0.1mol/Lα －酮戊二酸（ pH7.4 ）（转氨基反应的底物）；⑷ 0.1mol/L 谷氨酸（ pH7.4 ）（纸层析的标准样品）；⑸ 展层溶剂－酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（ 300： 1）（纸层析用）；⑹ 10 ％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）；⑺ 0.25%碘乙酸（抑制 L－谷氨酸脱氢酶活性）；

⑻ 显色剂（ 0.1% 茚三酮 -乙醇溶液）。

四、实验器材与仪器⑴ 匀浆器或研钵；⑵ 试管及试管架；⑶ 恒温水浴箱（ 37℃、 100℃）；⑷ 铅笔、尺和圆规；⑸ 毛细管（直径 0.5mm) ；⑹ 新华定性滤纸（直径 11cm ）；⑺ 剪刀和镊子；⑻ 电吹风；⑼ 滴管；⑽ 康氏皿；⑾ 喷雾器；⑿ 烘箱（ 80 ℃）。

五、实验操作方法和步骤1 、转氨酶液的制备 取新鲜牛蛙肝或猪肝约 3 g ，先用剪刀充分剪碎约 3 min ，再用研钵将肝脏碾碎 10-15 min （加 2-3 g石英砂 ） ，然后加入 3ml磷酸缓冲液迅速碾磨 5 min ，最后再加 9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤（用漏斗 ） ，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液（粗酶液 ）备用。2、氨基移换反应 取 4 支洁净、干燥的试管，按表 1操作

管号 试剂、操作

1 2 3 4

转氨酶提取液 （ ml ）

1 1 1 1

0.25%碘乙酸 （ ml ）

0.5 0.5 0.5 0.5

预温 滴加 10 ％三氯乙酸溶液 2滴， 100℃×5min

置 37℃恒温水浴保温 5min

0. 1mol/L α －丙氨酸 pH7.4 （ ml ）

1 1 1

0. 1mol/L α －酮戊二酸 pH7.4 （ ml ）

1 1 1

0.01mol/L 磷酸缓冲液 pH7.4 （ ml ）

1 2 2 1

酶促反应 混匀，置 37℃恒温水浴保温 40min （经常摇动，每 3-5 min摇动）

终止酶反应 滴加 10 ％三氯乙酸溶液 2-8 滴，置 100℃恒温水浴保温 5 min

表 1

3、层析

⑴ 准备：取新华定性滤纸（直径 11cm ）一张，找出圆心，用圆规画一直径2 cm 的细圆圈（保持干净），并按图 1 用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径约 0.2cm) 。另取（ W ） 2cm×3-5cm

（ L ）滤纸条，先将下半端剪成须状（ 5-6 齿即可） ，卷成“灯芯”，备用。

⑵ 点样：用毛细管依次点标准 α－丙氨酸 (Ala) 、 谷氨酸 (Glu) 各点 2次，其余 1 － 4号管样液各点 2～ 3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过 0.3cm 。

1

2 3

4

56

1——1号管反应样液（ α－丙氨酸 ）

2——2号管反应样液（ α－丙氨酸 ）

3——3 号管反应样液

4——4号管反应样液（ α－丙氨酸 、谷氨酸）

5——标准样液：α－丙氨酸

6——标准样液：谷氨酸

图 1——层析滤纸示意图5.5cm1cm

用铅笔作出点样位置

用铅笔尖在圆心处截一小孔

⑶ 展层、显色 将下端剪成须状 ,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中 , 平放在盛有展层溶剂的康氏皿中 ,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中 ,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图 2 ）。展层剂沿灯心上升到滤纸 ,再向四周扩散 ,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘 0.5cm( 约需半小时 )，取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒 0.1% 茚三酮－乙醇溶液，用电吹风热风吹干或放入烘箱（ 80 ℃）中显色 3min 。

43

2

图 2 －层析装置示意图

1. 康氏皿 2. 展层溶剂 3. “灯芯” 4. 层析滤纸

1

谷氨酸

丙氨酸

丙氨酸

氨基酸样品的分离图谱

溶剂前沿

原点

6

5

1

2

3

4

氨基酸样品的分离图谱

六、结果分析讨论

七、思考题1. 为什么要设计 4 支反应管？每管所要说明的问题是什么？2. 观察实验现象，并对层析后氨基酸的显色情况进行分析。八、注意事项1 、避免污染滤纸，不要用手接触。2、点样时，毛细管与滤纸轻微接触，不要留下痕迹。3、实验报告附上层析滤纸。

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“自主设计微型研究课题与实践”

值 日

丁鸣