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【5】5 新技術説明会プレゼン資料2016(産総研 小松) · Bioorg Med Chem., 23,...
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核酸の新規安定化技術の開発と、遺伝子
分析ならびに医薬品への応用
産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門小松康雄
1
2本鎖1本鎖
通常の2本鎖は外的因子、配列の影響を受ける。安定な形成には一定以上鎖長、修飾核酸等が必要になる
2本鎖形成は多様な技術で関わる
• 遺伝子の検出、制御
• 配列解析
• 機能性核酸
• 核酸医薬
• 導電性
etc
2本鎖核酸と特徴
2
2本鎖核酸のクロスリンク(CL)
• 2本鎖の安定化が可能
• DNAの損傷、抗がん剤
• 配列選択的に機能を抑制
Crit Rev Biochem Mol Biol. 2010, 45, 23–49. Nature Reviews Cancer 11, 467-480.
構造的な歪みが生じる
反応の特異性と簡便性
2本鎖の安定化と課題
3
紹介する技術
1. 2本鎖核酸の新規なクロスリンク(CL)技術とその性質
2. 応用例CL2本鎖を利用したプローブ開発
4
新規な2本鎖CL反応
J. Am. Chem. Soc., 131 (37), 13208–13209 (2009).Chem. Commun. (Camb) 48, 2143-2145 (2012). 特許5196448
脱塩基部位
O
O
O
OHOH
O
O
OH
反応
塩基対
クロスリンク(CL)
脱塩基部位のペアー
• 簡便な連結法
• 位置選択的に複数導入可能
クロスリンク(CL)2本鎖
5’
3’5’
3’
5
新規なCL2本鎖の性質
CL2本鎖
高温でもへリックス構造を維持可能
剛直構造
温度(℃)
0.E+00
2.E+05
4.E+05
6.E+05
8.E+05
65 70 75 80 85
分子楕円率(θ)
3’ GCCUCGUCGUCG 5’
5’ CGGAGCAGCAGC 3’
3’ GCCUCGXCGUCG 5’
5’ CGGAGCXGCAGC 3’
mDS mCL
-6.E+05
-2.E+05
2.E+05
6.E+05
1.E+06
220 240 260 280 300 320
25℃80℃
2’-O-methyl RNAの2本鎖
へリックス構造を維持へリックス構造破壊
通常の2本鎖
Chem. Lett., 41, 62-64 (2012) .Langmuir, 28, 17211-17216 (2012) .
e-
通常のDNA
電極
曲がる↓
直接電子移動
Mediator (med)
e-
throughbase pairs
CL-DNA
S S
HO O OP
O
O-
e-
6
これまでのCL-DNAの活用例
H2O2H2O
FcOH+ FcOH
グルコース GDL
O2
酵素B
酵素A
電極e-
マイクロ電極
電流計測
抗がん剤の薬剤耐性を上げる物質のスクリーニング系構築に本CL構造が利用された
(通常のCLよりも修復酵素に認識されにくいことが利用)(国外)
Bioorg Med Chem., 23, 6912 (2015)
微小電極上への酵素の配置
解離しない、安定、鎖長可変、簡便
スクリーニング
7
CL
CL2本鎖-1本鎖
プローブ
CL2本鎖を新規なプローブに利用
標的核酸
1. 隣接ハイブリへの影響
2. microRNA(miRNA)に対する影響
標的核酸との結合配列の近傍に導入したプローブを作製
従来の核酸プローブ例
8
0
0.05
0.1
0.15
0.2
20 40 60 80
dDS-Itarget (-)
dSS-I
44.7
Tm (℃) (ΔTm) 結合の安定性の指標
43.3 (0)
43.7 (0.4)
I
CL2本鎖による隣接ハイブリの安定化
0
0.05
0.1
0.15
0.2
20 40 60 80
CLプローブ
target (-)dCL-I 54.9 (11.6)
プローブ:DNA標的:RNA(22 mer)
標的RNA
Tm上昇
融解曲線
温度(℃)
ΔA260
ΔA260
温度(℃)
変化無し
dhp-I 43.9 (-0.8)
56.2 (12.9)dCLhp-I 上昇
59.2 (15.9)
プローブ
9
CL-I
CL2-I
CL
• 隣接するハイブリを安定化
• DNA, RNA, 修飾核酸いずれの場合においても安定化効果を有する
• CLx1で15℃、CLx2で20℃程度Tm値は上昇
• 核酸分解酵素に耐性(生体内持続性が高い)
新技術の効果
hp-I
強固なヘリックス構造
安定化効果
10
1. 2本鎖核酸の新規なクロスリンク(CL)技術とそのCL2本鎖の性質
2. 応用例CL2本鎖を利用したプローブ開発
紹介技術
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•転写•Processing•核外輸送•トリミング
AAA…An 3’UTRcap
翻訳阻害
AAA…An 3’UTRcap
切断・分解
5’UTRcap
翻訳活性化
mRNA
DNA
RNA-induced silencing complex (RISC)
細胞
1本鎖型
2本鎖型
Anti-miRNA oligo (AMO)
miRNAの相補鎖
B社
A社
microRNAと阻害核酸• miRNAに結合する核酸は核酸医薬品としても期待されている。
• 2本鎖含有AMOは、1本鎖よりも抑制活性が高い。そこで2本鎖部位のCLを実施し、細胞内における効果を評価した。
Nucl. Acids Res., 40, e58 (2012)
RNA, 13, 723, (2007)
結合
RISC-AMO複合体
miRNAの阻害
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miRNA阻害核酸への導入
3’ GCCUCGUCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGUCGUCG 5’
CGGAGCAGCAGC 3’
12bp5’ CGGAGCAGCAGC
2本鎖型 3’ GCCUCGXCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGXCGUCG 5’
CGGAGCXGCAGC 3’5’ CGGAGCXGCAGC CL型
3’ GCCUCGUCGUCGAUCGAAUAGUCUGACUACAACUGCCUCGUCGUCG 5’1本鎖型5’ UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 3’
miR-21 (miRNA) UCUCGAAGAGCUAUCGAAUAGUCUGACUACAACUUCGAGA
AGCUCUGAA
A
GCUU
ヘアピンループ(HP)型
2’-O-methyl RNAで合成し、細胞内における活性を評価した
3’ GCCUCGXCGUCGAUCGAAUAGUGCCUCGXCGUCG 5’
CGGAGCXGCAGC 3’5’ CGGAGCXGCAGC 短鎖CL型
stable loop
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.20 nM 0.5 nM 1 nM 2 nM 3 nM 4 nM 5 nM 10 nM
X X
82.2℃61.6℃60.1℃ 66.8℃Tm 60.1℃
rela
tive
luc
inte
nsity
A社 B社
細胞内導入48 hr後に評価
mismatch
Dual luciferase assay
Gene Ther. 2011, 18, 1111
CL2本鎖型は最も高い活性を示した
2本鎖型1本鎖型 HP型 CL型 短鎖CL型
CL2本鎖
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❑反応
• 安価な試薬で簡便な反応
新技術の特徴
❑構造
• 連結部位はヘリックス内部に収まる
❑性質
• 剛直かつ低分子の2本鎖核酸を作製可能
• CL試薬に応じて性質が変化(e.g.芳香環→導電性)
• 隣接するハイブリダイゼーションを高度に安定化
• 細胞内においても持続的効果を示す
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称:アミノオキシ基含有の反応性化合物
• 出願番号 :特許5196448• 出願人 :産総研、DNAチップ研究所• 発明者 :小松康雄、小島直、野中 謙
CL試薬関連の特許
• 発明の名称:核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの形成方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ及び相補鎖核酸複合体
• 出願番号 :特願2014-251847/PCT/JP2015/084402• 出願人 :産総研
• 発明者 :小松康雄、平野悠、三重安弘
CLプローブのハイブリに関する特許
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企業への期待
•遺伝子検出にCL構造を有するプローブを
利用することで、高感度化が期待される。
•核酸医薬においては、低濃度化と作用の
持続性が想定される。
•CL試薬ならびにCL核酸は提供可能であ
るため、共同研究さらには事業化を期待
する。
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核酸修飾用リンカーの開発を実施
TCGAポリマー、ポアガラス
5’ 3’
活用例遺伝子解析、診断
DNA チップ研究所、日本ガイシ、東レ等の各製品・Human Pathway analysis、ハイブリ先生(可視化チップ)、3D Gene Yeast Oligochip、SNPs解析カスタムアレイ他
核酸医薬品
製薬企業・核酸医薬(前臨床試験)
ポリエチレングリコール、コレステロール等機能性分子
基礎研究
大学、研究機関
リンカーリンカー
ライセンス
H19年 Sigma-Ald.(US)、H23年 ChemGene(US)
H24年ジーンデザイン社(大阪)
•特許第4336820号(2007年)•US Patent NO.7491857号(2008年), DE1908829 (2014年)
•特許第5808025号(2015年)
産学連携の経歴
お問い合わせ先
国立研究開発法人 産業技術総合研究所
生命工学領域研究戦略部
イノベーションコーディネータ 新間 陽一
TEL 029-862 - 6032
FAX 029-862 - 6048
e-mail [email protected]
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