4. Kromatografi

8/10/2019 4. Kromatografi

1/50

KROM TOGR FI


2/50

Literatur

Shriner, et.al, 2004, The SystematicIdentification of Organic Compounds,

edisi 8th,John Willeys & sons,

Singapore Sarker, S.D., et.al., 2006, Natural

Product Isolation, Humana Press,

New Jersey Gritter, R.J, et.al, 1991, Pengantar

Kromatografi, Penerbit ITB, Bandung


3/50

Pengertian

Stahl:

Kromatografi adalah metode fisiko-kimiauntuk memisahkan komponen

berdasarkan waktu tambat setiapkomponen diantara fase diam (FD) dan

fase gerak (FG)

Komponen A merambat lebih cepatdaripada komponen B karena waktu

tambat A lebih kecil dibandingkan waktutambat komponen B


4/50

Pengertian

Martin :

Kromatografi adalah metode fisikokimiauntuk memisahkan komponen

berdasarkan perbedaan pergerakansetiap komponen di antara fase diam

dan fase gerak

Komponen A merambat lebih cepat darikomponen B karena komponen A bergerak

lebih cepat daripada B


5/50

Pengertian

Kromatografi adalah pemisahan

komponen dalam larutan melaluidistribusi komponen secara selektif

di antara fase gerak (FG) dan fase

diam (FD).


6/50

Pemakaian kromatografi

Tujuan Kualitatif

Mendeteksi keberadaan senyawa dlm

sampel Menggambarkan kerumitan suatu

campuran

Dapat digunakan u/menetapakn pola

sidik jari suatu campuran

Co/ KKt, KLT, KG, KCKT


7/50

Tujuan Kuantitatif

Menunjukkan banyaknya masing2

komponen

Digunakan u/menetapkan kadar cuplikan Co/ KG dan KCKT

Tujuan Preparatif Digunakan untuk memperoleh komponen

dalam jumlah memadai (mgg) dalam

keadaan murni


8/50

Pengelompokkan

A. Berdasarkan FG

a) Kromatografi Cair

KLT KK

KKt

KCKT

b) Kromatografi Gas

GLC - GSC

B. Berdasarkan FD

a) Kromatografi Cair-

cair

KKt

b) Kromatografi Cair-

Padat

KLT KK

KCKT


9/50

Pengelompokkan..

C. Berdasarkan

Mekanisme

a) Krom. Partisi- KKt

b) Krom. Adsorpsi

- KLT - KGC

- KK - KCKT

D. Berdasarkan

Wadah FD

a) Krom. Cair Planar- KKt

- KLT

b) Krom. Cair Kolom

- KGC

- KK - KCKT


10/50

1. Kromatografi lapis tipis

2. Kromatografi kertas


11/50

1. Kromatografi lapis tipis


12/50

Mekanisme

Terjadi adsorpsisolut padaadsorben/FD

Terjadi kompetisi antara FG dan solut

untuk teradsorpsi pada adsorben/FD

Solut terdesorpsidari FD

Solut terelusi oleh FG/sistem cairan

pengembang (eluen)


13/50

Jenis lapis tipis

Plat penyangga

Kaca

Alumunium

Plastik

Adsorben

Silika gel

Alumina

Kiselguhr

Selulosa


14/50

Silika GEL (Si OH)

Bersifat Polar

Silika Gel G

Mengandungsenyawa pengikat

(Gypsum = CaSO4

5-15%)

Silika Gel S

Mengandung

pengikat (starch)

Silika Gel GF 254 Mengandung

pengikat (gypsum)

dan indikator

fluoresensi

anorganik yang dpt

berfluoresensi pada

254 nm


15/50

Silika gel H/silika

gel N

Tanpa senyawa

pengikat

Silika gel F 254 Mengandung

indikator fluoresensi

Silika gel PF254+365

Digunakan pada

pemisahan

preparatif danmengandung

indikator fluoresensi


16/50

Alumina

Bersifat kurang polar dibandingkansilika gel

Bisa bersifat basa, netral dan asam

Jenis: alumina G, F, H


17/50

Kiselguhr

Mgd SIO2> 89%,

Al2CO3, Fe2O3,

TiO2, CaO, MgO,Na2O, dll

Memiliki aktivitas

yang rendah

Selulosa

Mekanisme = KKt

Serat < KKt

Bercak < KKt

Waktu elusiAdsorben lain < selulosa< KKt

Tidak dapatmenggunakan

penampak bercak

H2SO4


18/50

Jenis adsorben / FD

Plat pra-lapis (Merck)

Serbuk silika gel

Plat dibuat dgn alat Stahl-Desaga

Dilakukan pada suhu kamar

Plat diaktifkan pada suhu 110oC,

selama 1 jam


19/50

Sistem Elusi / FG

Pelarut tunggal

Campuran pelarut

Hanya digunakan

untuk 1x

pengembangan /

elusi

Tjd perubahan

komposisi

Tgt kepolaransenyawa


20/50

Penampak Bercak

A. Pereaksi Semprot

Universal :

H2SO4 dgn konsentrasi 5-10% dalam

metanol

Uap I2

Ce2SO4

Spesifik

Dragendorff : u/alkaloid

AlCl3 : u/flavonoid

FeCl3 : u/ fenol


21/50

Penampak bercak

B. Lampu UV

Plat dg indikator fluoresensi

Solut dg ikatan rangkap

terkonjugasi menghslkan:

Backgroundberfluoresensi

Bercak gelap

Solut tanpa ikatan

rangkap terkonjugasimenghslkan :

Background

berfluoresensi

Warna bercak bbd dari

background

Plat tanpa indikatorfluoresensi

Beberapa solut

dapat

berfluoresensi

pada 254 & 366 nm


22/50

Arah Pengembangan/Elusi pada KLT

Menaik

Radial / Sirkular


23/50

Jenis Pengembangan/Elusi

Pengembangan

Tunggal

Sistem

pengembang: sama

ataupun berbeda

Pengembangan

Berganda

U/memperbaiki

pemisahan

Nilai Rf terlalu

rendah

Setelah plat dielusi

1x, dikeluarkan dari

bejana, keringkan,

elusi u/ke 2x

Sistem pengembang

: samaKepolaran pengembang meningkat


24/50

Jenis Pengembangan/Elusi

Pengembangan dua dimensi Sistem pengembang ke-1 bbd dari yang

ke-2

Arah pengembangan ke-2 berbeda 90odari arah pengembangan ke-1

Untuk menguji kemurnian isolat

1

2


25/50

WARNING !!

Untuk mengidentifikasi senyawajangan membandingkan harga Rf

hasil penelitian dengan Rf pada

literatur


26/50

Faktor yg Mempengaruhi Nilai Rf

Kejenuhan chamber

Adsorben

Suhu

Kelembaban Plat berupa pra-lapis

atau tidak

Ketebalan lapisan

Metode

u/mengaktivasi plat

Jarak bercak dari sisiplat

Jmlh plat dlm

chamber

Pengukuran bercak

Sistem pengembang

Kemurnian pelarut

pd sistempengembang

Konsentrasi sampel

(jmlh besar : tailing)


27/50

Penggunaan KLT

Analisis

Kualitatif

Pemantauan

komponen Kuantitatif

menentukan

jumlah /kadar

komponen

Preparatif

Mendapatkan

isolat murni


28/50

KLT-Preparatif

Menggunakan platpra-lapis untukpreparatif atau platyang dibuat dgn alat

Stahl-Desaga Ketebalan optimum :

11,5 mm

Sampel ditotolkan

sebesar 1-5 mmdalam bentuk pita

Hasil pemisahan:bbtk pita


29/50

KLT-Preparatif

Penampak bercak

Lampu UV

Pereaksi semprot

Pita yg mgdsenyawa kmdn

dikerok

Ekstraksi denganpelarut

Di bagian

pinggir plat Didapatkan isolat


30/50

2. Kromatografi Kertas


31/50

Mekanisme:

Partisisolut di antara FD dan FG

Fase Diam:

Berupa lapisan cairan tipis padapenyangga

Penyangga:selulosa (kertas whatman)


32/50

Fase gerak

B A W (4 : 1 : 5)

Air

Forestal

(HCl : asam asetat : air = 3:10:30)

Asam Asetat 250%


33/50

Penampak bercak

Pereaksi semprot spesifik atau lampuUV

Tidak dapat menggunakan pereaksi

semprot H2SO4

Arah Pengembangan

Pengembangan menaik (ascendingdevlpm)

Pengembangan menurun (descending

devlpm)


34/50


35/50

KLT vs KKt

Pemisahan padaKLT lebih baik dari

KKt

Waktu elusi KLT

KKt


36/50

1. Kromatografi kolom klasik2. Kromatografi cair vakum

3. Kromatografi cair tekanan menengah

4. Kromatografi cair tekanan tinggi


37/50

Hal2 yang penting:

Faktor kapasitasBerhubungandengan kemampuankolom untuk

menahan suatukomponen

Faktor pemisahan

Berhubungan dgn

selektivitas kolomuntuk memisahkansatu komponen dankomponen lainnya

Efisiensi kolomberhubungan dgnjumlah plat teoritisuntuk memisahkan

satu komponen dankomponen lainnya.

Resolusi

berhubungan dgn

kemampuan kolomuntuk memisahkansatu senyawa dansenyawa lainnya


38/50

Contoh Kromatogram HPLC


39/50

1. Kromatografi Kolom Klasik

Proses/mekanisme:

Adsorpsi, desorpsi, elusi (=

KLT), dan gravitasi


40/50

Adsorbent

Silika gel

Alumina

Selulosa Poliamida

Ukuran partikel

KK : 63250 m

KLT : < 63 m

Pemilihan eluen :

Berdasarkan literatur

Data hsl

pemantauan KLT


41/50

Menggunakan data pemantauan

KLT

Pilih eluen untuk KLT (2sistem pengembang:

lebih polar & kurang

polar)

Pilih eluen yg

menghasilkan Rf 0,2

0,3 pada KLT

Pilih eluen yg bersifat

kurang polar untuk

digunakan dalam KK

M t d P i K


42/50

Metode Penyiapan Krom

Kolom Metode kering

Adsorbent

dimasukkan ke

dalam kolom

Baru kmdn eluen

dimasukkan ke

dalam kolom

Metode basah

Masukkan

sebagian eluen ke

dalam kolom Tambahkan

lumpuran adsorben

ke dalam kolom


43/50

Penyiapan Kolom

Ketinggian Kolom

Pemisahan Normal:

10100 x dlm kolom

Pemisahan Sulit :

> 100 x dlm kolom


44/50

Penyiapan Sampel

Sampel dilarutkan dalam eluen

Sampel dilarutkan dalampelarut yang kurang polardibdgkan eluen

Dibuat serbuk

sampel+adsorbent


45/50

Jumlah sampel

Pemisahan Kasar

sampel : adsorben = 1:

10

Pemisahan Normal

sampel : adsorben = 1:

30

Pemisahan Sulit

sampel : adsorben = 1: 100 -

300


46/50

Metode Elusi

Elusi isokratik Menggunakan 1

pelarut

Elusi gradien Menggunakan

bermacam eluen

dgn kepolaran

meningkat

Pengumpulanfraksi

Warna

Volume Waktu

Pemantauan

Komponen

KLT/KKtfraksi yg mgd

senyawa yg sama

digabungkan


47/50

2. Kromatografi Cair Vakum

Proses/mekanisme:

Adsorpsi, desorpsi,

elusi danperbedaan

tekanan

?


48/50

AdsorbentKK : 63250 m

KCV : 4063 m

Eluen

menggunakaneluen dgn

kepolaran yangmeningkat

Contoh komposisi eluen:

N-hexEtOacMeOH

9 : 1 25 mL

8 : 2 25 mL

Dst

1 : 9 25 mL

10 : 0 25 mL9 : 1 25 mL

dst

0 : 10 25 mL

P i Ad b +


49/50

Penyiapan Adsorben +

Sampel Masukkan

adsorben ke dalam

kolom

Ketinggianadsorben 5-6 cm

(setelah divakum)

Sampel dibuat

serbuk bersamadgn adsorben

Pengumpulanfraksi

Setiap fraksi

dikumpulkan

Pemantauan :

KLT/KKt

fraksi yg mgdsenyawa yg sama

digabungkan


50/50

Alhamdulillah

4. Kromatografi

Documents

Transcript of 4. Kromatografi