3 CULTURE 4 RÉCUPÉRATION DU PRODUIT 1 INOCULUM = …

MICROBIOLOGIE 2BioAc Module 5- Chap3

K. Gabin®, ETSL Page | 1

Fig. 1 : Schéma général d’une fermentation industrielle à partir de microorganismes.

PRÉCULTURE

(souvent, plusieurs

étapes)

BIORÉACTEUR

(parfois plusieurs

étapes dans

plusieurs cuves)

Formulation du milieu (avec

valorisation de rejets industriels)

STÉRILISATION DU MILIEU

1

MOÛT

(suspension microbienne +

produit d’intérêt)

Produit

d’intérêt

Autres

effluents

EXTRACTION -

PURIFICATION

2 – MILIEU

SOUCHE à revivifier

(cryoconservation ou

lyophilisation)

2

2 3

Cellules (biomasse)

Surnageant

SÉPARATION DES CELLULES

1 – INOCULUM

3 – CULTURE &

PRODUCTION

4 – RÉCUPÉRATION DU PRODUIT

= SÉPARATION & PURIFICATION

1

2 Contrôles pureté et qualité

de la souche

Contrôles stérilité et qualité

des milieux

TRAITEMENT UTILISATION,

COMMERCIALISATION

TRAITEMENT,

UTILISATION

1

3 Contrôles pureté et

richesse de l’inoculum



Fig. 2 : Exemple de valorisation de substrats (rejets industriels, sous-produits d’industrie AA…) pour les

fermentations industrielles.

MATIÈRE

PREMIÈRE ORIGINE REMARQUES EXEMPLES D’UTILISATION

Mélasse de betterave ou de canne à sucre

Production de sucre

30-50% saccharose clivable en glucose et fructose par une invertase (S. cerevisiae)

Nécessité d’aérer (pour éviter la formation d’éthanol)

- Levures-aliments (biomasse)

- Production d’éthanol

- Production d’acétone et butanol

- Production de glutamate

- Production de vitamines

cf. Chap. 5-4

Trempe de maïs Industrie agricole

2-3% glucose

11-13% lactose

- Production d’ATB (si apports d’autres substrats essentiels)

Marc Production d’alcool Composition variable - Varié

Amidon et dextrines

(ou boues riches en amidon)

Industrie agricole (maïs, pomme de

terre…)

Composition variable

- Production d’éthanol

- Production de citrate (A. niger)

- Production de glutamate

- Procédé SYMBA (Suède) pour les levures pour fourrage (alimentation animale) : Endomycopsis fibuliger transforme l’amidon en glucose, qui est utilisé par Candida utilis pour sa croissance (biomasse)

Eaux usés

Industrie papetière

2-4% hexoses et pentoses

Bois et cellulose subissent une thermolyse en présence de HCl surnageant très acide riche en pentoses = « lessives » sulfitiques.

- Digestion du bois hexoses métabolisés par S. cerevisiae + pentoses utilisés par C. utilis

- Procédé PEKILO (Finlande) : levures de fourrage (Paecilomyces variotii)

Extraits sulfités ou Lessives sulfitiques

Foin, bagasse, fumier, sciure Rejets divers

Composition variable : cellulose en majorité

Procédé WATERLOO (Canada) : levures de fourrage (Chaetominium cellulolyticum)

Lactosérum (petit lait) Laiterie

4-5% lactose

pH très acide

- Bonne culture de Kluyveromyces fragilis (« levure lactique ») ou d’autres levures-aliments

- Production de lactate (Lactobacillus bulgaricus)

- Production de xanthane (polysacc.) par Xanthomonas campestris génétiquement modifié (avec 2 gènes de E. coli)

Hydrocarbures Pétrochimie

Alcanes aliphatiques

Aérer, agiter et refroidir (réactions exothermiques)

- Procédé TOPRINA (GB) : Candida lipolytica

- Production de citrate (rare)

- Production de tensio-actifs

Méthane (gaz naturel)

Fumier de

décomposition organique

Donne du méthanol utilisable par les méthylotrophes

- PRUTEEN (alimentation animale) : Methylophilus methylotrophus (bactérie)



Fig. 3 : Obtention de « corn steep liquor » (trempe de maïs ou liqueur de maïs) au cours de la transformation du maïs

en amidon.

•

• Sous-produit de la fabrication de l’amidon et

du gluten de maïs.

• Obtenu par trempage des grains pdt 50h en

présence SO2 et lactobacilles (Lactobacillus

delbruckii)

• Riche en N, sucres…

Fig. 4 : Revivification des souches.

Fig. 5 : Exemple des précultures réalisées pour l’utilisation des levains lactiques en industrie laitière.

Laboratoire Atelier

Culture à revivifier

(liquide, desséchée)

Préculture en plusieurs étapesCuve à levain

Cuve de maturation

50mL

20h 500mL

20h100L

5000L

5L- 20h

culture mère

Culture (lyophilisée HD,

concentrée congelée)

Préparation et utilisation des levains lactiques en industrie laitière

t0 t20H t40H t60H t80H

C1 C2 C3

C4 C5

Cx = contrôles (résultats en 48h)

RCx = résultats du contrôle

RC1 RC2

C1 C2 C3

RC3

C4 C5



Fig. 6 : Contrôles avant la production

Fig. 7 : Exemples de fermenteurs de type FMS.

Schéma d’un fermenteur de type Koji



Fig. 8 : Principaux produits alimentaires issus de la FMS en Asie.

Fig. 9 : Exemples production d’enzymes par FMS.

Fig. 10 : exemples d’applications de la FMS pour des microorganismes de type bactériens et des mycètes.



Fig. 11 : Exemple de système à cellules immobilisées : réacteur à lit fixe. Les

cellules sont fixées sur des billes de verre entassées dans une colonne. Le milieu

(substrat) est injecté ici à la base de cette dernière.

Fig. 12 : Exemple de système à cellules immobilisées : Fabrication du vinaigre

avec Acetobacter (bacille Gram -).

Fig. 13 : Levures emprisonnées dans des billes d’alginate et prise en mousse du vin mousseux.

Les levures emprisonnées dans les billes

d’alginate sont nourries grâce à la

diffusion du sucre et des éléments

nutritifs à l’intérieur des billes. L’alcool

et le CO2 s’en échappent.

L’emprisonnement des cellules permet

cette prise en mousse sans troubler le

vin, et cela permet d’amener les levures

dans le col de la bouteille en quelques

minutes contre plusieurs jours

traditionnellement.



Fig. 13 : Utilisation de levures immobilisées en billes d’alginate de sodium et la fabrication de vins mousseux. La prise en mousse du champagne et des vins mousseux est

traditionnellement une opération assez longue, qui intervient après une 1ère fermentation alcoolique et malo-lactique (voir schéma traditionnel ci-dessous). Le vin est

embouteillé et on rajoute du sucre et des levures pour réaliser une 2ème fermentation alcoolique au cours de laquelle le Co2 s’accumule et se dissous dans le vin. Pendant

cette étape, le vin se trouble (dvpt levures) et il est nécessaire de le clarifier (élimination dépôts de levures) en effectuant le remuage puis le dégorgement. L’utilisation de

levures emprisonnées dans des billes d’alginate permet d’accélérer ces 2 derniers processus !

MICROBIOLOGIE TS2 B CHAPITRE 5-3


Fig. 14 : Les différents procédés de fermentation en milieu liquide (FML).

è_iuyhFig. 14bis : Les différents procédés de fermentation en

milieu liquide (FML).

V X0 Xf

S0 Sf

P0 Pf

Inoculum + milieu et on laisse se dérouler la culture dans un fermenteur parfaitement mélangé. Tous les composés se trouvent dans le milieu de culture au départ, on n’intervient plus sur la composition du milieu

Le volume V reste constant

La biomasse X augmente selon la courbe de croissance microbienne classique

Le substrat S est consommé et le produit P apparaît.

On ne retire rien jusqu’à la fin, on n’ajoute que du neutralisant et de l’antimousse

dV

V0, S0, X’0

F

S

X = 0

P = 0

X

S

P

La fermentation commence dans un faible volume de milieu de culture V0 (pied de cuve). Donc pour une même taille d’inoculum qu’en batch, comme le volume est plus faible, la concentration initiale X’0 sera plus élevée. La fermentation va donc démarrer plus vite. Chaque phase de démarrage correspond à une fermentation discontinue

Lorsque la culture est en phase exponentielle de croissance, le milieu stérile est introduit dans la cuve. Le débit est réglé de sorte que, par exemple, [X] ou [S] soit constant dans la cuve. Apport continuel de milieu neuf possible de maintenir la croissance à son niveau optimal tout au long du processus

Quand la cuve est remplie (quand V ≈ 90% du volume utile), on arrête l’alimentation en milieu. La culture évolue alors conformément à la courbe de croissance discontinue (phase de ralentissement puis stationnaire)

V X = cte

S = cte

P = cte

F

S

X = 0

P = 0

F

X ≠ 0

P ≠ 0

S ≠ 0

Initiation par une phase de croissance discontinue

Ouverture des pompes

Lorsque le système est à l’équilibre, tous les paramètres sont constants

D = taux de dilution = taux auquel est ajouté le milieu par unité de temps = F/V en t–1

Le débit F, dont dépend D, détermine µ et X (densité bactérienne) selon les relations qui relient µ à S et µ à X

PROCÉDÉ BATCH

PROCÉDÉ FED-BATCH

PROCÉDÉ CONTINU

Pied de

cuve



Fig. 15 : Comparatifs différents procédés de FML.

Flexibilité Simplicité de conception

Contrôle dynamique

Sécurité aux injections

Économie à grande échelle

AVANTAGES INCONVÉNIENTS

BA

TC

H

+ + + + + + + + + + +

- Augmentation rapide de la biomasse - Faible taux de contamination - Faible consommation de milieu de culture - Réparation et stérilisation des installations possibles entre chaque campagne de production

- Beaucoup de manutentions : nettoyage, stérilisations entre chaque production - Arrêt du fermenteur entre chaque campagne (le temps d’immobilisation est de l’ordre de 20%) = production saccadée - Production courte de métabolites primaires

FE

D-B

AT

CH

+ + + + + + + + + + + + + +

- Apport des substrats contrôlé en fonction des besoins contrôle de µ et de X - Gain de temps et donc de productivité - Possibilité de travailler à µmax - Possibilité de modifier la composition du milieu de culture durant l’opération (ex : [S] peut être augmentée) intéressant si on veut favoriser la croissance puis dans un 2e temps stimuler la production de métabolite - Possibilité d’augmenter [S] à des valeurs qui seraient inhibitrices si on devait les appliquer en batch en début de croissance

- Mêmes inconvénients que pour le batch mais temps d’immobilisation moins important car les campagnes sont plus longues - Risque de contamination un peu plus grand que pour le batch

CU

LT

UR

E

CO

NT

IN

UE

+ + + + + + + + +

- Pas d’arrêt du fermenteur, pas de cuve vidée, nettoyée et stérilisée - Culture maintenue en phase de croissance obtention d’une biomasse très importante - Possibilité d’extraction en continu des produits avec recyclage des cellules

- Grande consommation de milieu nécessité d’utiliser des substrats bon marché - Problèmes de contamination, formation de biofilms et apparition de mutants - Faible possibilité d’intervention en cas de panne ou de contamination



Fig. 16 : Autre procédé de FML : multi-étage. La culture est effectuée dans plusieurs fermenteurs en cascade. Le

milieu frais est envoyé dans le premier fermenteur, puis les effluents successifs sont envoyés dans les fermenteurs

suivants. En général le premier étage est utilisé pour optimiser les conditions de croissance et le deuxième pour

optimiser les conditions de production du métabolite.

Exemple : traitements successifs sur des déchets ou des eaux usées.

Fig. 17 : Exemples de boucles de régulation d’une FML

PARAMÈTRE APPAREILLAGE SONDE EFFECTEURS – ACTIONS À FAIRE

AGITATION

- Rotation rapide d’un mobile d’agitation muni de pales. Contre-pales pour éviter l’effet vortex. - Agitation par air (colonne à bulles)

compte-tours mécanique, capteur

électronique (tachymètre)

Moteur de vitesse réglable : 300 à 1500 tours / minutes en laboratoire (moins dans l’industrie).

TEMPÉRATURE

Thermostatisation de l’enceinte par circulation d’eau thermostatée, dans la double paroi, ou dans un circuit constituant un échangeur thermique.

Thermomètre ou sonde de

température

Contrôle de la température. Ajustement de la température de l’eau circulante : électrovanne d’eau froide ou résistance thermique.

DÉBIT DES GAZ Injections de gaz par des systèmes semblables à ceux de l’oxygénation

Rotamètre, débitmètre

Contrôle du débit d’entrée, sortie non colmatée…

AÉRATION –

OXYGÉNATION

(O2 DISSOUT)

Apport : injection d’air stérile (filtré), juste sous les pales fragmentation améliorant la disponibilité de l’O2 (meilleure dissolution). Sortie évacuation des gaz et de la surpression.

Sonde O2 (électrode

polarographique)

Régulation par la vitesse d’agitation à débit d’air constant : commande du potentiomètre du moteur. Quand vitesse maximale atteinte : contrôle du débit d’air (pression d’air) par contrôle de l’ouverture de l’électrovanne d’arrivée. Éventuellement débit d’air enrichi en O2. Vérification de la sortie non colmatée.

SUBSTRATS ET

PRODUITS

Biocapteurs, dosages

spécifiques

Ajustement de la composition du milieu au départ (apport de substrats) ou au cours du processus (culture continue). Extraction des produits.

PH Ajustement du pH initial. Sonde pH (électrode

potentiométrique)

Solutions compensatrices acides ou basiques. Leur ajout est manuel ou sous la dépendance d’un effecteur (pompe péristaltique).

FORMATION DE

MOUSSES

Sonde résistive antimousse

Empêcher leur formation, détruire celles formées : solution d’antimousse. OU jets de vapeur, contre-pression.

BIOMASSE Spectrophotomètre,

opacimètre… Ajustement de l’inoculum au départ. Contrôle entrées/sorties (si continue).



Fig. 18 : Exemples de schémas de fermenteurs avec leurs boucles de régulation

(a) Et (b) sont des fermenteurs à double enveloppe ;

celle-ci permet de chauffer et de refroidir la culture,

selon les besoins. En général au cours de la

production de biomasse la température augmente en

raison du métabolisme cellulaire. La double

enveloppe peut également permettre la stérilisation

du milieu en place.

(c) est un fermenteur à serpentin (moins répendu).

Fig. 19 : Notion de boucle de régulation.

(a)

(c)

(b)



Fig. 20 : exemple de l’utilisation de cosmides comme vecteur de clonage.

Stérilisation in situ et en batch

Stérilisation en continu indirecte : Échangeur chaleur à

spirale

Stérilisation en continu directe par injection de vapeur.

Fig. 21 : Tableau comparatif des différents systèmes de stérilisation pour milieux de culture de fermenteurs.



Fig. 22 : Bilan, exemple de la mise en œuvre d'une fermentation.

Fig. 23 : Notion de « scale up »

Une fermentation industrielle doit pouvoir être faite à grande

échelle pour des raisons économiques !

L’Étude du passage échelle labo à industrielle est nommée

« scale up », elle est toujours progressive (tes échelles)

Intègre les étapes de fermentation, extraction et purification de la biomasse d’intérêt. Transfert complexe → impossible de conserver l’ensemble des paramètres identiques ou proportionnels au changement d’échelle.



Fig. 24 : évaluation des paramètres de la croissance dans un fermenteur.

Fig. 25 : La croissance des microorganismes (rappels).



Fig. 26 : Paramètres décrivant la croissance des microorganismes (rappels).

PARAMÈTRES DÉFINITION – SIGNIFICATION UNITÉ DÉTERMINATION

µ = QX

Vitesse / taux spécifique

de croissance

Variation de l’accroissement de la biomasse en

fonction du temps

µ =

Dérivée à la courbe en tous points (pente de la tangente)

µmax = µexpo = QXexpo

Vitesse / taux spécifique

de croissance maximum

Vitesse / taux spécifique de croissance en phase

exponentielle

Pendant la phase exponentielle de croissance

µexpo

Pente de la droite représentant la phase exponentielle linéaire

G

Tps de doublement (tD)

Temps de génération

minimum

Temps nécessaire à une bactérie pour se diviser

= temps nécessaire au doublement de la

population

= temps qui sépare 2 divisions successives

Pendant la phase exponentielle de croissance

G =

n Nombre de divisions Xt = X0 x 2n

Donc n =

R ou Taux de

croissance horaire Nombre de génération par unité de temps r =



Fig. 27 : Paramètres décrivant le rendement des fermenteurs.

PARAMÈTRES DÉFINITION – SIGNIFICATION UNITÉ DÉTERMINATION

YX/S

Rendement de croissance par rapport

au substrat

Quantité de biomasse (en g) produite par quantité de substrat dégradé (en g)

Traduit la conversion du substrat en biomasse à l'instant t (qui peut être la fin du procédé)

YX/S =

Xt et St = quantité en biomasse et substrat à l'instant t (en gramme) X0 et S0 = quantité à l'instant t = 0 (en gramme)

YP/S

Rendement de

conversion du substrat

en produit

Quantité de produit formé (en g) par quantité de

substrat consommé (en g)

Traduit la conversion du substrat en produit à

l’instant t (qui peut être la fin du procédé)

YP/S =

Pt et St = quantité en produit et substrat à l’instant t (en gramme) P0 et S0 = quantité à l’instant t = 0(en gramme)

PVH

Productivité volumique

horaire

Quantité de produit ou de biomasse formée par

unité de volume et par unité de temps

PVH =

Pt et P0 = concentration en produit au temps t et t0

PVHT

Productivité horaire

totale (finale ou globale)

Productivité volumique horaire obtenue en fin de

fermentation (tenir compte du temps de

fermentation mais aussi des temps morts)

Sur la courbe P = f(t), on détermine les coordonnées du point final (Pf, tf) avec tf = temps d’arrêt de la fermentation

PVHT =

PVHM

Productivité horaire

maximale

Productivité horaire que l’on obtiendrait si on

arrêtait la fermentation au temps tA

Plus grande pente dP/dt

Sur la courbe P = f(t), on détermine les coordonnées du point A (Pm,

tA) sachant que (0-A) est la droite de plus forte pente, tangente à la

courbe au point A et passant par l’origine 0

PVHM =

REMARQUE : les productivités peuvent aussi s’exprimer en quantité par unité de temps PH, PHT, PHM (sans faire intervenir le volume)



Fig. 28 : Lexique de microbiologie industrielle.

TERMES DÉFINITIONS

Antimousse moyen mécanique ou produit ajouté à la culture pour limiter la production de mousse qui risque de faire déborder le fermenteur et de contaminer l’environnement antifoam

Batch culture en milieu non renouvelé, on dit aussi culture discontinue = fournée (français)

Biocapteur capteur équipé d’enzymes ou de cellules immobilisées, utilisé en analyse de laboratoire ou lors du suivi d’une culture en bioréacteur

Bioréacteur (réacteur biologique)

enceinte hermétique stérilisable pourvue d’issues avec l’extérieur, permettant la mise en œuvre d’enzymes (réacteur enzymatique), de microorganismes (fermenteur) libres ou immobilisés, de cellules eucaryotes supérieures animales ou végétales (cytoculteur) bioreactor

Bouchon plasma petit bouchon de caoutchouc stérilisable permettant de placer à travers lui des aiguilles, tubulures, par perforation en conditions aseptiques.

Capteur ensemble constitué de l’électrode et d’une carrosserie protectrice sensor

Chémostat système de culture continue dans lequel la concentration en un substrat limitant est maintenue constante par l’ajustement d’un débit d’alimentation

Ciel partie supérieure du volume du fermenteur constituée de l’atmosphère située au-dessus du milieu

Cisaillement

contraintes s’exerçant sur les enveloppes cellulaires et risquant de déchirer celles-ci. shear forces Les protozoaires, micro-algues, cellules animales et végétales sont généralement très sensibles au cisaillement et nécessitent des agitations douces.

Colonne à bulles fermenteur dans lequel l'agitation est assurée par de petites bulles d'air comprimé stérile bubble column

Comparateur

élément de régulation d'un paramètre, il assure la comparaison entre le point de consigne et la mesure, puis commande le fonctionnement des effecteurs pour ramener la mesure vers le point de consigne Ex : si pH=4 et le point de consigne est pH=7, le comparateur déclenche la pompe péristaltique assurant l'alimentation en base

Culture (croissance) continue

système de culture assurant l'alimentation de la cuve selon un débit F, et le pompage simultané du contenu du fermenteur selon un même débit F, le volume du fermenteur étant constant continuous-growth culture

Cuve corps du fermenteur : en verre pour les fermenteurs < 20 L (protégé par une enveloppe d'acier si la stérilisation a lieu in situ), et en acier inoxydable au-delà

Double enveloppe

sur les petits fermenteurs de laboratoire, elle permet de chauffer le milieu pour atteindre la température de culture ou de production grâce à une circulation d'eau en provenance d'un bain thermostaté ; sur les fermenteurs pilotes et de production, elle permet la circulation d'un fluide réfrigérant destiné à évacuer la chaleur dégagée

Electrode partie de la sonde assurant la mesure electrode probe

Fed-batch système de culture assurant l'apport régulier ou exponentiel des substrats en fonction des besoins de la souche grâce à une alimentation du milieu de culture = batch alimenté (français)

Fermenteur

réacteur biologique permettant la culture en masse des microorganismes, dont le volume peut atteindre 1000m

3, et dont la géométrie est adaptée aux performances attendues

fermentor



Mesure en ligne

suivi instantané d'un paramètre de la fermentation, réalisé grâce à des capteurs situés dans la cuve, immergés dans le milieu ou à l'extérieur de la cuve on-line measurement Ex : pH, % O2 dissous, masse du fermenteur, vitesse d'agitation

Mesure sur prélèvement (hors-ligne)

détermination de la valeur d'un paramètre d'état nécessitant une analyse de laboratoire off-line measurement Ex : dosages de substrats et produits, concentration de biomasse ...

Métabolite primaire

substance qui apparaît dans le milieu simultanément à la phase de croissance exponentielle primary metabolite Ex : acides, alcools, acides aminés, amylases, béta galactosidase ...

Métabolite secondaire

substance qui apparaît dans le milieu pendant la fin de la phase exponentielle, la phase de ralentissement et la phase stationnaire. secondary metabolite Ex: enzymes, antibiotiques, toxines ...

Pied de cuve volume de milieu présent initialement dans la cuve lors d'un fed-batch : environ 3,5 fois celui de la solution d'alimentation

Pilote fermenteur d'un volume de 50 L à quelques m

3 permettant une étude en "demi-grand" ou "demi-

échelle", afin de permettre le scale-up vers l'unité de production pilot plant

Piquage bouchon métallique évidé au centre, emprisonnant un bouchon plasma et permettant de placer l’aiguille située à l'extrémité d'une tubulure d'alimentation ou d'injecter un produit à la seringue

Platine partie supérieure d'un fermenteur de laboratoire, en acier inoxydable, qui comprend les issues, piquages, tuyauteries et sert éventuellement de support au moteur d'agitation

Point de consigne valeur souhaitée d'un paramètre contrôlé ou régulé set point

Récolte = récupération

ensemble des opérations d'extraction, fractionnement et purification des produits présents dans un moût issu d'un bioréacteur recovery

Scale-down / scale-up = changement d'échelle

ensemble de techniques de calcul qui permettent d'extrapoler les résultats obtenus sur un petit fermenteur de laboratoire à la prévision du fonctionnement d'un fermenteur plus gros (scale-up). La même démarche permet de tenir compte des résultats enregistrés en production pour les essais d'amélioration d'un procédé sur un fermenteur pilote (scale-down).

Serpentin tubulure en acier inoxydable se trouvant à l'intérieur de la cuve, permettant l'évacuation de la chaleur dégagée par la culture grâce à une circulation d'eau glycolée glacée à 2 ou 4°C

Sonde ensemble constitué d'une électrode et de sa carrosserie de protection probe

Transfert du dioxygene

passage des molécules de dioxygène de la phase gazeuse (bulle d'air) à l'état dissous dans le milieu, puis dissous dans le cytoplasme (et les organites chez les eucaryotes)

Turbidostat système de culture continue dans lequel la [biomasse], mesurée par opacimétrie, est maintenue constante par addition d'une solution nutritive ajustée selon les besoins de la souche

Volume utile volume effectivement occupé par le milieu : 70 à 80% du volume total du fermenteur

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