POINT DE VUE D’EXPERT

Comment sélectionner aujourd’hui le meilleurembryon à transférer ?

How can we nowadays select the best embryo totransfer?L. Alter a,*, F. Boitrelle a, C. Sifer b

a Service d’histologie embryologie, biologie de la reproduction, cytogénétique et génétique médicale, CHI Poissy/Saint-Germain-en-Laye, 10, rue du Champ-Gaillard, 78303 Poissy cedex, Franceb Service de biologie de la reproduction, CHU Jean-Verdier, AP–HP, avenue du 14-Juillet, 93143 Bondy, France

Reçu le 19 janvier 2014 ; accepté le 29 avril 2014Disponible sur Internet le 18 juin 2014

Résumé

Le transfert sélectif d’un seul embryon (eSET) permet d’éliminer presque totalement les grossesses doubles sans pourautant compromettre les taux de naissance mais cette pratique impose de savoir sélectionner le meilleur embryon pour letransfert. La morphologie embryonnaire est un paramètre capital et reste aujourd’hui le critère le plus pertinent dans lechoix de l’embryon à transférer. L’introduction de l’imagerie time-lapse, qui permet un suivi continu du développementembryonnaire, fournit de nouveaux critères prédictifs du potentiel d’implantation de l’embryon mais l’apport réel de cesystème, notamment le rapport bénéfice/coût, n’est à ce jour pas clairement démontré. Dans ce contexte de meilleuresélection embryonnaire, la culture prolongée (CP) jusqu’au stade blastocyste est une pratique incontournable, mais ilsemble judicieux de la réserver à une population de bon pronostic. Par ailleurs, aucun bénéfice n’est apporté par la pratiquedu « Preimplantation Genetic Screening » (PGS), analyse du fond chromosomique des embryons par hybridation in situfluorescente (FISH) à j3. Un « nouveau » PGS est aujourd’hui pratiqué et consiste en une analyse globale du génome austade blastocyste sur cellules trophoblastiques. Si cette pratique semble améliorer les taux d’implantation, son applicationen routine ne sera justifiée que si les études randomisées actuellement en cours valident son intérêt clinique. Enfin, il estprobable qu’à l’avenir l’évaluation de la qualité embryonnaire intégrera des critères métaboliques fournis par les techniquesdites « omics ». Ces nouvelles approches pourraient permettre de disposer de biomarqueurs fiables prédictifs de la qualitéembryonnaire voire de grossesses.� 2014 Publié par Elsevier Masson SAS.

Abstract

Multiple pregnancies stand as the most common adverse outcome of assisted reproduction technologies (ART) and thedangers associated with those pregnancies have been reduced by doing elective single embryo transfers (e-SET). Manystudies have shown that e-SET is compatible with a continuously high pregnancy rate per embryo transfer. Yet, it stillbecomes necessary to improve the selection process in order to define the quality of individual embryos – so that the oneswe choose for transfer are more likely to implant. First, analysis of embryo morphology has greatly helped in thisidentification and remains the most relevant criterion for choosing the embryo. The introduction of time-lapse imagingprovides new criteria predictive of implantation potential, but the real contribution of this system – including the benefit/cost ratio – seems to be not yet properly established. In this context, extended culture until blastocyst stage is an essential

Gynécologie Obstétrique & Fertilité 42 (2014) 515–525

* Auteur correspondant.Adresse e-mail : alter.laura@hotmail.fr (L. Alter).

http://dx.doi.org/10.1016/j.gyobfe.2014.05.006

1297-9589/� 2014 Publie par Elsevier Masson SAS.

practice but it appears wise to keep it for a population showing a good prognosis. Then, the failure of aneuploid embryos toimplant properly led to achieve preimplantation genetic screening (PGS) in order to increase pregnancy and delivery ratesafter ART. However, PGS by fluorescence in situ hybridization (FISH) at day 3 is a useless process – and may even beharmful. Another solution involves using comparative genomic hybridisation (CGH) and moving to blastocyst biopsy.Finally, it is envisaged that morphology will also be significantly aided by non-invasive analysis of biomarkers in the culturemedia that give a better reflection of whole-embryo physiology and function.� 2014 Published by Elsevier Masson SAS.

Mots clés : Fécondation in vitro ; Morphologie embryonnaire ; ESET ; Cinétique ; Time-lapse ; Diagnostic pré-implantatoire ; Omics

Keywords: In vitro fertilization; Embryo morphology; eSET; Kinetic; Time-lapse; Preimplantation genetic diagnosis; Omics

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1. INTRODUCTION

Les grossesses multiples issues de l’assistance médicale à laprocréation (AMP) constituent un sujet de préoccupationmondiale en termes de santé publique. De nombreuses étudesmontrent que par rapport aux grossesses uniques, lesgrossesses multiples ont un risque nettement supérieur demorbidité et de mortalité maternelle et il est clairement établique les risques de toutes les complications périnatalesaugmentent avec le nombre de fœtus : prématurité, hypo-trophie fœtale, séquelles neurologiques, morbidité et mortalitépérinatales. Ainsi, limiter le nombre de grossesses multiplesapparaît important et de nombreuses publications sur letransfert sélectif d’un seul embryon ont vu le jour ces dernièresannées. En Europe, le taux de grossesses multiples aprèstransfert d’embryons a régulièrement diminué depuis l’an 2000,passant de 26,9 % à 20,2 % en 2009 [1]. En France, les grossessesgémellaires représentaient 23,3 % des accouchements après FIVou ICSI entre 2000 et 2004 (données FIVNAT 2006) contre18,6 % en 2011 (données ABM 2012). Il existe de grandesdifférences entre les pays européens en ce qui concerne lesgrossesses multiples mais l’on observe une tendance homogèneà transférer un moindre nombre d’embryons.

Dès 1993 en Suède, il y eu une volonté de réduire le nombred’embryons transférés de trois à deux. Il en a résulté unediminution du nombre de grossesses triples, tout en conservantun taux de grossesse et d’accouchement peu différent(National Board of Health and Welfare, 2004). Si aujourd’huiles grossesses triples ont fortement diminué, les grossessesgémellaires issues de l’AMP sont toujours préoccupantes. Faceà cette problématique, le transfert sélectif d’un seul embryon(eSET, pour elective single embryo transfer) est le moyen le plussimple d’éviter les grossesses gémellaires. L’utilisation de cettestratégie est variable selon les pays et les premiers à adoptercette politique de transfert furent les pays nordiques, avec entête la Suède, qui entre 2003 et 2005 a pratiqué 69,4 % d’eSET.À l’inverse, les États-Unis n’ont effectuées que 2,8 % d’eSETdurant cette même période [2]. Pourtant, les données publiéesmontrent qu’une application judicieuse de l’eSET limitelargement les grossesses doubles sans pour autant compro-mettre les taux de naissance. Néanmoins, cette pratiqueimpose de transférer un embryon d’excellente qualité et à fortpotentiel implantatoire et il devient donc indispensable desavoir sélectionner le meilleur embryon à replacer afin de ne

faire perdre aucune chance de grossesse au couple en désird’enfant. Le but de cet article est de faire le point sur lesdifférents critères actuellement utilisés dans l’évaluation de laqualité embryonnaire et de déterminer comment sélectionnerle meilleur embryon pour le transfert.

2. CRITÈRES MORPHOLOGIQUES

La morphologie embryonnaire observée au microscopetient une place de choix dans l’évaluation de la viabilité del’embryon. Elle est actuellement le principal critère utilisé pourla sélection de l’embryon à transférer et une bonne maîtrise dece paramètre est obligatoire pour développer avec succès unprogramme d’eSET.

2.1. Observations statiques

Des classifications embryonnaires existent pour chaquestade de développement, du lendemain de la ponctionfolliculaire jusqu’au stade blastocyste, cinq jours (j) après laponction.

2.1.1. Le zygoteScott et Smith [3] publient en 1998 une classification

comparative des tailles et positions des pronuclei en intégrant :le nombre, la taille et l’alignement des précurseurs nucléolaires.Elle distingue dans un premier temps cinq grades puis cetteclassification a été revue en fonction de l’aptitude des embryonsà atteindre le stade de blastocyste sous la dénomination de « Z-score » [4]. Z1 et Z2 sont considérés comme les Z-scoresdonnant les meilleures chances de développement et d’implan-tation embryonnaires. Bien que des études confirment ladifférence d’implantation en fonction du profil zygotique, lafinesse des paramètres observés fait de cette classification unoutil relativement difficile à manier et son intérêt restecontroversé.

2.1.2. L’embryonLa première division mitotique survient généralement à la fin

de la première journée de culture et dès le stade deux cellules,de nombreuses anomalies sont visibles lors de l’observation aumicroscope. Elles concernent en particulier la régularité des

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blastomères, la présence de fragments ainsi que le degré denucléation des blastomères.

Différentes classifications sont utilisées en France. Cellefaisant l’objet d’un consensus des BLEFCO présente l’avantaged’une codification simple et repose sur le nombre de cellules del’embryon, l’aspect typique des blastomères et le pourcentagede fragments.

Au laboratoire, la classification utilisée tient compte de cestrois mêmes critères, mais la codification est différente. Lepourcentage du volume embryonnaire occupé par lesfragments est désigné par une lettre : A, B, C ou D, lesembryons de type A ne présentant pas de fragments. Lenombre de blastomères est chiffré et au total, le typeembryonnaire est désigné par un chiffre et une lettre. Lesembryons de type A et B, à condition d’avoir un nombre decellules conforme au stade de développement, sont ceux ayantle meilleur potentiel implantatoire.

Certains auteurs ont proposé des adaptations de laclassification BLEFCO en attribuant des points à chaqueembryon en fonction de critères prédéfinis (scoring). Une étudeportant sur une série de 987 transferts d’un seul embryon [5] aévalué la valeur prédictive relative de chacun des paramètressuivants : absence de blastomères irréguliers, absence defragmentation (ou fragmentation représentant moins de 20 %du volume embryonnaire) et stade 4 cellules. Cette évaluation apermis de définir un score embryonnaire à 4 pointssignificativement corrélé au taux de grossesse (embryons descore 1 : taux d’implantation = 4 % vs score 4 = 16 %).

Par la suite, d’autres auteurs ont montré l’intérêt decombiner ces différents critères. En 2007, Holte et al. [6] ontanalysé de manière prospective 2266 cycles de FIV/ICSI, suivisd’un transfert de deux embryons. Cinq critères ont été évaluéspour guider le choix des embryons à transférer : le nombre deblastomères, le degré de fragmentation, les différences de taille

Fig. 1. Paramètres morphologiques de sélection embryonnaire, d’après Holte et

entre les blastomères, la symétrie du clivage et la mono-nucléarité des blastomères (Fig. 1). Les résultats montrent queces cinq paramètres sont fortement corrélés au potentield’implantation de l’embryon mais seuls le nombre deblastomères, leur mononucléarité et leur taille sont desvariables indépendantes. Il a donc été possible d’établir unscore fiable de notation des embryons (score IMC pourIntegrated Morphology Cleavage), validé statistiquement etprédictif de l’implantation embryonnaire. Ce modèle denotation comprenant le stade de clivage, l’homogénéité detaille des blastomères et leur mononucléarité permet doncd’optimiser la sélection des embryons à transférer.

2.1.3. Le blastocysteDès le 5e jour survient la mise en place du blastocœle, cavité

dont l’apparition est excentrée, définissant le blastocyste jeune.Le blastocœle grossit jusqu’à aplatissement des cellules enpériphérie qui prennent le nom de trophectoderme et lescellules internes s’organisent pour former le bouton embryon-naire ou masse cellulaire interne (MCI).

À ce stade, la classification de Gardner et Schoolcraft [7] aété proposée. Elle repose sur l’évolution du blastocyste etdéfinit six stades en fonction de l’apparition du blastocœle et del’augmentation de volume qu’il impose à l’embryon (B1 à B6). Àpartir du stade B3, cette classification est complétée parl’analyse du bouton embryonnaire (type A à C), A représentantun bouton embryonnaire formé de nombreuses cellules biencompactées. Cette classification tient également compte del’aspect du trophectoderme, aussi caractérisé par trois gradesA, B et C (Fig. 2).

Le transfert tardif au stade blastocyste est désormais unepratique nécessaire et les nombreuses publications sur le sujetmontrent qu’il permet une meilleure sélection de l’embryon

al. [6].

Fig. 2. Classification des blastocystes.

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ainsi qu’une meilleure synchronisation de l’embryon et del’endomètre.

En 2011, Goto et al. publient [8] une analyse rétrospectivevisant à estimer le taux de grossesse après FIV ou ICSI, enfonction de la morphologie du blastocyste et de l’âge de lapatiente. Dans ce but, ils analysent 1488 cycles de transfertunique d’un blastocyste congelé. Les blastocystes sont évaluésavant et après décongélation en utilisant la classification deGardner et trois groupes sont constitués en fonction de l’âgedes patientes. Les taux de grossesse clinique (CPR), degrossesse viable (VPR) et d’accouchement (DR) sont mesurésdans chacun des groupes. Deux critères sont donc pris encompte ici : la qualité du blastocyste et l’âge de la patiente. Lesrésultats montrent tout d’abord que la qualité du blastocystedécroît à mesure que l’âge maternel avance ( p < 0,001) et pourun blastocyste de même qualité, les CPR, VPR et DR diminuent

avec l’âge. D’autre part, quel que soit l’âge de la patiente, onobserve des taux de grossesse et d’accouchement significati-vement plus faibles pour les transferts de blastocystes demauvaise qualité. Il existe donc une corrélation significativeentre la qualité du blastocyste et l’issue des tentatives de FIV/ICSI, en plus de l’influence de l’âge maternel.

La classification de Gardner a une valeur prédictive dupotentiel de l’embryon à s’implanter et à donner une grossesseévolutive et constitue un critère majeur pour le choix del’embryon à transférer. De plus, l’aspect du trophectodermeapparaît comme étant un critère morphologique particulière-ment important. L’étude d’Ahlstrom en 2011 analyse les issuesde 1117 transferts frais d’un blastocyste à j5 en fonction dechacun des trois paramètres de la classification de Gardner(degrés d’expansion, masse cellulaire interne et aspect dutrophectoderme). Les résultats montrent que la qualité du

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trophectoderme est le seul critère indépendant significative-ment corrélé aux taux de grossesses et constitue le paramètremorphologique le plus prédictif de naissances.

2.2. Observations dynamiques

La sélection des embryons à replacer est donc essentiel-lement basée sur des critères morphologiques. Cependant,ceux-ci ne peuvent être dissociés de la notion d’évolutiondynamique au cours des 2 à 5 jours de culture et la cinétique dudéveloppement embryonnaire constitue un élément importantà considérer pour la sélection des embryons.

2.2.1. Clivage précoceLa survenue précoce de la première division embryonnaire,

environ 26 heures après la fécondation, peut aider à l’évaluationde la qualité embryonnaire [9]. Ce critère à l’avantage d’êtrefacile à établir car l’observation de deux cellules suffit à affirmerla présence d’un clivage précoce et depuis plusieurs années, denombreuses équipes l’utilisent.

D’après les données publiées, la présence d’un clivageprécoce est corrélée avec un meilleur potentiel de développe-ment embryonnaire. Ce critère peut même être utilisé de façonplus fine en distinguant les clivages rapides à deux cellulesrégulières de ceux présentant deux cellules irrégulières et/oudes fragmentations. Dans une étude publiée en 2007 [10],Terriou et al. analysent ces différents types de clivage précoce à26 heures après FIV ou ICSI sur 371 embryons afin d’évaluer lavaleur prédictive du clivage précoce à deux cellules régulières(EEC) sur les taux de grossesse, en plus du score embryonnaireau deuxième jour (j2). Les résultats montrent que parmi lesembryons de morphologie satisfaisante à 48 heures, ceux issusde divisions précoces harmonieuses ont un meilleur tauxd’implantation que ceux issus de divisions précoces irréguliè-res. Ce critère dynamique apporterait donc de la prédictivitésupplémentaire à la morphologie embryonnaire classique etcombiner ces données permet d’affiner le choix de l’embryon àtransférer. D’autres études ont par la suite validé l’intérêt de ceparamètre. En 2009, Fu et al. [11] évaluent pour 9544 embryonsla présence ou non d’un clivage précoce entre 25 et 29 heures.Là encore, il retrouve de manière significative d’avantage degrossesses par transfert pour les embryons clivés précoce-ment.

Néanmoins, certaines publications viennent contredire cesrésultats quant à la pertinence de ce paramètre. L’étude deSundström et Saldeen [12] en 2008 regroupe 275 transfertsfrais d’un seul embryon et compare deux groupes selon laprésence ou non d’un clivage précoce à 25–28 heures. Lesrésultats montrent que les taux d’implantation et de naissancesont similaires dans les deux groupes et que lorsqu’un embryonde bonne qualité est transféré, le clivage précoce ne semble pasavoir d’intérêt supplémentaire pour prédire son potentielimplantatoire. Ce résultat est confirmé en 2011 par l’étudeprospective observationnelle de Sifer et al. [13] qui identifie lescritères prédictifs de grossesse clinique après transfert d’unembryon. L’eSET est proposé aux patientes de moins de 37 ans,ayant au moins deux embryons de bonne qualité dont un « top

embryon », et pour lesquelles il s’agit d’un premier oudeuxième cycle de FIV/ICSI. Les résultats montrent que lasurvenue d’une grossesse clinique après eSET est associée demanière significative à l’âge maternel et au nombre d’embryonsde bonne qualité obtenus à j2 ou j3. Par contre, pour cesembryons de bonne qualité, les taux d’implantation sontsemblables quel que soit leur score zygotique, leur degrés defragmentation et la survenue ou non d’un clivage précoce.

Il apparaît donc que les critères utilisés pour définir lesembryons de bonne qualité, à savoir la présence de 6 à 9 cellulesà j3, moins de 20 % de fragmentation et l’absence de blastomèremultinucléé, sont ceux à retenir pour l’eSET, associés à l’âgematernel et au rang de tentative.

Néanmoins, Lamazou et al. publient en 2010 [14] une étudevisant à appliquer les critères d’eSET proposés dans lalittérature à la population du centre afin d’évaluer lepourcentage de leur population éligible à l’eSET selon cescritères. Les résultats montrent que ces critères d’inclusion neconcernent qu’une minorité de la population étudiée (2,4 % à10,8 %) et ne modifieront donc que peu les taux de grossessesgéméllaires. Il convient donc d’essayer d’élargir les critèresd’éligibilité à l’eSET, notamment l’âge maternel, fixé à 37 ans ici.En effet, l’étude de Veleva et al. [15] qui analysent les résultatsd’eSET chez des patientes de 36 à 39 ans montre des taux degrossesse semblables à ceux retrouvés dans les études portantsur des femmes plus jeunes. Il serait donc envisageabled’étendre la pratique de l’eSET jusqu’à un âge maternel limite de39 ans.

2.2.2. Jour du transfertSi l’intérêt du clivage précoce est discrédité par les résultats

de l’étude de Sifer et al. [13], le jour du transfert embryonnaireapparaît lui comme étant un paramètre important à prendre encompte. En effet, les résultats de cette même étude montrentune diminution significative du taux de grossesses cliniqueslorsque l’eSET est effectué à j2 par rapport à j3, probablementliée à une meilleure sélection embryonnaire. Il semblerait doncpréférable, dans une population à bon pronostic éligible àl’eSET, d’effectuer le transfert à j3 plutôt qu’à j2.

Ce résultat est en accord avec une méta-analyseprécédemment publiée sur ce sujet [16] même si aucunedifférence significative en termes de taux de grossesse évolutiveet de taux d’accouchement entre les transferts embryonnairesfrais à j2 ou j3 n’est observée.

Par ailleurs, lorsque l’embryon est replacé à j3, la qualitéembryonnaire est généralement appréciée de manière quoti-dienne jusqu’au moment du transfert. Mais existe-t-il réelle-ment un intérêt à évaluer ces critères toutes les 24 heures ?

La publication de Racowsky et al. [17] en 2009 vise à établirun modèle prédictif pour la sélection de l’embryon à j3 etmontre qu’une évaluation à j1 seulement est insuffisante pourprédire le développement embryonnaire, le pouvoir discrimi-nant étant le moins bon. A contrario, il n’est pas retrouvé dedifférence significative entre une évaluation à j2 seul, j3 seul ouquotidienne jusqu’à j3. Sachant que cette pratique impose desortir les embryons des conditions optimales de gaz et detempérature de l’incubateur, l’analyse de la morphologie

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embryonnaire uniquement avant le transfert à j3 pourrait êtrepréférable dans la mesure où elle fournit la même valeurprédictive.

Toujours dans le but d’améliorer la sélection embryonnaireen vue d’eSET, le transfert embryonnaire au stade blastocysteest une pratique de plus en plus utilisée. La culture prolongée(CP) jusqu’à j5 présente de nombreux avantages, notammentd’un point de vue cytogénétique puisque les embryons les plusdéséquilibrés chromosomiquement n’atteindront pas le stadede blastocyste [18]. De plus, les nombreuses données publiéesrévèlent des taux d’implantation nettement supérieurs aprèstransfert au stade blastocyste. L’étude de Papanikolaou et al.[19] parue en 2008 rassemble les résultats de six étudesrandomisées, soit 1654 patientes séparées en deux groupesselon que le transfert s’effectue au stade j2/j3 ou au stadeblastocyste. Les résultats montrent que le taux de naissance parpatiente est significativement plus élevé lorsque le transfert sefait au stade de blastocyste ( p = 0,005) mais la CP expose aurisque de ne pas obtenir de blastocystes à transférer et les tauxd’annulation retrouvés sont aussi significativement plusimportants.

La CP jusqu’au stade blastocyste aboutit donc à unediminution du nombre d’embryons transférables ou congela-bles, mais les taux d’implantation sont nettement améliorésaprès transfert à j5 par rapport à j2/j3 lorsqu’un même nombred’embryons est transféré.

Les données publiées par Guerif et al. [20] en 2009 confir-ment ces résultats pour les transferts frais de blastocystes.Dans une étude prospective portant sur 478 couples pourlesquels un seul embryon est transféré soit à j2 (n = 243), soitau stade blastocyste (n = 235), le taux d’accouchement estmesuré, incluant les transferts frais et congelés dans les deuxgroupes. Ces résultats montrent un taux d’accouchement parcycle significativement plus élevé après transfert frais d’unblastocyste par rapport au transfert d’un embryon clivé à j2.Cependant, le transfert d’un embryon clivé décongelé conduit àde meilleurs résultats que le transfert d’un blastocystedécongelé, du fait de taux de survie plus faibles aprèscongélation/décongélation pour les blastocystes (77 % à j2 vs65 % à j5). Au total, le taux de naissance cumulée par couple,incluant les transferts frais et congelés, est similaire dans lesdeux groupes (34,2 % à j2 vs 37,9 % à j5). Néanmoins,l’amélioration des techniques de cryoconservation des blasto-cystes pourrait modifier ces résultats et l’apport certain de lavitrification est attendu ici. En effet, les résultats montrent quela vitrification permet d’obtenir, à tous les stades embryonnai-res, de meilleurs taux de survie et en particulier de meilleurstaux de survie intacte [21].

La CP est donc aujourd’hui une pratique incontournablemais son bénéfice clinique n’est pas, à ce jour, clairementdémontré dans la littérature et la pratiquer de façonsystématique ne semble pas être justifiée. En effet, l’analysede l’étude de Blake et al. [22], qui regroupe les données de18 essais randomisés, montre que le taux de naissance partransfert embryonnaire frais est significativement supérieuraprès CP uniquement lorsque la randomisation était faite à j2/j3, lorsque de nombreux embryons de bonne qualité étaient

disponibles aux stades précoces. En revanche, aucun bénéficesignificatif n’était attribué à la CP lorsqu’elle était décidée enamont, au début de la stimulation ovarienne, voir à j0 ou j1 de latentative de FIV/ICSI. Le transfert tardif au stade blastocystesemble donc avoir un réel intérêt lorsque réservé à unepopulation de bon pronostic, également éligible à l’eSET.

La CP permet donc dans ces conditions de mieuxsélectionner l’embryon à transférer et depuis quelques années,une meilleure prédiction précoce du développement dublastocyste est envisagée grâce aux données fournies par letime-lapse.

2.2.3. Time-lapsePour pallier les limites de l’observation intermittente, Payne

et al. ont développé le time-lapse, système permettant de suivrede façon continue le développement précoce embryonnaire. Lapublication de Mio et Maeda [23] en 2008, illustre bien l’intérêtde cet équipement. Des étuves équipées de caméras intégréespermettent de maintenir les embryons dans des conditions deculture optimales stables et d’acquérir des images digitalesrapprochées sans sortir les embryons de l’étuve et les donnéesne montrent aucun effet délétère de cet outil sur lamorphologie embryonnaire ni sur les taux de grossesseclinique.

Plusieurs systèmes time-lapse sont disponibles actuellementet de nombreuses publications sur le sujet ont vu le jour cesdernières années, soulignant toutes l’importance des événe-ments précoces du développement embryonnaire. Notam-ment, les résultats publiés par Wong et al. [24] en2010 suggèrent que les étapes qui précèdent l’activation dugénome embryonnaire permettent de prédire le développe-ment jusqu’au stade blastocyste. Les observations faitesrévèlent que les embryons qui atteignent le stade blastocystesuivent une cinétique de développement stricte et prévisiblelors des premières divisions. Trois paramètres dynamiquessemblent prédire le développement ultérieur de l’embryonjusqu’à j5 : la durée de la première cytokinèse, le temps entre lapremière et la deuxième mitose et l’apparition synchrone destroisième et quatrième blastomères (Fig. 3). La pertinence deces critères et l’importance du « timing » des évènementsprécoces ont été confirmés dans plusieurs études récentes et leconcept de « morphocinétique » est apparu, qui combine lamorphologie et la cinétique de développement embryonnaire[25]. Les données de la littérature montrent l’existence demarqueurs morphocinétiques prédictifs du développementembryonnaire, susceptibles d’être utilisés afin d’affiner le choixde l’embryon à transférer mais l’intérêt clinique de cesparamètres reste à confirmer et des études prospectives sonten cours. En effet, si l’observation en continu du développe-ment embryonnaire permet d’envisager une améliorationglobale des aspects embryologiques de l’AMP, le rapportbénéfice/coût du time-lapse n’est encore, à ce jour, pasclairement démontré. Aucune étude ne permet notammentd’affirmer que les bénéfices apportés par ce système sont dusaux critères cinétiques fournis ou simplement au maintien desembryons dans des conditions de gaz et de températureoptimales.

Fig. 3. Timing des premières divisions embryonnaires, d’après Wong et al.

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La sélection du meilleur embryon à transférer en vue d’eSETrepose donc en grande partie sur l’analyse de la morphologieembryonnaire et la mise en place de classifications appropriées.Des critères dynamiques sont venus s’ajouter à l’évaluation dupotentiel implantatoire de l’embryon et depuis quelquesannées, l’introduction de nouvelles approches non morpho-logiques tend également à optimiser ce choix.

3. CRITÈRES NON MORPHOLOGIQUES

L’avènement de la génomique, technique invasive d’explora-tion du génome embryonnaire et plus récemment de lamétabolomique, de la transcriptomique et de la protéomique,techniques non invasives d’étude du sécrétome de l’embryon,apporte de nouveaux facteurs prédictifs de la qualitéembryonnaire.

3.1. Approches invasives

3.1.1. « Preimplantation Genetic Diagnosis »(PGD)

En France, la pratique du diagnostic pré-implantatoire (DPI)est autorisée depuis 1999 pour les couples ayant une forteprobabilité de donner naissance à un enfant atteint d’unemaladie génétique grave reconnue comme incurable aumoment du diagnostic. Le DPI permet de déterminer le statutgénétique ou chromosomique d’un embryon obtenu parfécondation in vitro (avec ICSI) avant son transfert dansl’utérus en prélevant un ou deux blastomères à j3. Lesblastomères sont ensuite analysés soit par biologie moléculairepour les maladies monogéniques, soit par des techniquesd’hybridation in situ fluorescente (FISH) pour les indicationschromosomiques ou pour certaines maladies dont la trans-mission est liée au sexe.

Le diagnostic moléculaire repose sur le principe de la PCR( polymerase chain reaction) et l’analyse se faisant sur celluleunique (blastomère), le DPI moléculaire se heurte à unproblème majeur : la faible quantité d’ADN génomiquedisponible. En effet, le contenu en ADN d’un blastomère estminime (5–10 pg), alors qu’un diagnostic génétique « classique »est fondé sur l’amplification d’une quantité d’ADN de l’ordre de50 à 500 pg (10 000 à 100 000 cellules). Un important nombrede cycles d’amplification est donc requis pour effectuer lediagnostic, ce qui intensifie les problèmes qui affectentcouramment tous les tests PCR. Le risque de contaminationpar de l’ADN étranger ou parental entraîne ainsi un risqueaccru de diagnostic erroné. De plus, le phénomène d’allèle drop

out (ADO), qui peut être défini comme un échec d’amplificationn’affectant qu’un seul des allèles parentaux présents dans unecellule isolée, peut aussi donner lieu à un résultat inexact, bienque diminué de manière drastique par l’utilisation de nouveauxprotocoles. Ces contraintes imposent donc un réglageminutieux des conditions de PCR et l’analyse moléculaire peuts’avérer très exigeante sur le plan technique.

Le diagnostic cytogénétique (hors diagnostic de sexe)concerne les patients porteurs d’une anomalie chromosomiquede structure, particulièrement à risque de produire desgamètes comptant un nombre incorrect de chromosomes. Ilfait appel à la technique de FISH sur des cellules interphasiques,qui permet de détecter grâce à l’hybridation de sondesadéquates les segments chromosomiques impliqués dans leséventuels déséquilibres méiotiques survenus lors de laségrégation des chromosomes impliqués dans le remaniement.Le service de cytogénétique de l’hôpital Necker Enfants Maladesa développé des sondes de grande taille (1 à 2 Mb) pour chaqueextrémité télomérique, afin de réduire le taux d’hybridationinefficace (pour mémoire la taille des sondes commerciales estde 0,2 à 0,4 Mb). L’utilisation de ces sondes a permis de réduire letaux de non-réponse lors d’un DPI de 20 à 2 % et la FISHconstitue aujourd’hui une technique fiable et résolutive pour lediagnostic des déséquilibres chromosomiques.

Cependant, le DPI chromosomique se heurte à une difficultémajeure, inhérente à la physiologie des premières divisionsembryonnaires : l’instabilité chromosomique générant lemosaïcisme, phénomène selon lequel les cellules d’un embryonn’ont pas toutes le même contenu chromosomique. En effet, lesdonnées récentes de la littérature révèlent que jusqu’à 90 % desembryons humains sont mosaïques à j3 [26,27] l’analyse d’un oudeux blastomères n’étant alors pas représentative du statutglobal de l’embryon. Par conséquent, de nombreux payseffectuent désormais la biopsie à j5 et l’analyse porte alors surdes cellules du trophectoderme (Fig. 4). Cette techniqueprésente l’avantage de fournir plus de matériel pour lediagnostic (5 à 10 cellules), limitant ainsi le risque d’erreurdû au mosaïcisme, tout en laissant la masse cellulaire interne, àl’origine de l’embryon, intacte [28]. De nombreux résultats ontété publiés ces dernières années en faveur de cette pratique etdes études randomisées sont en cours pour confirmer l’intérêtclinique du DPI au stade blastocyste.

Cette remise en question récente des pratiques dans lecadre DPI fait suite aux questions soulevées par la pratiquedepuis une quinzaine d’années du « Preimplantation GeneticScreening » (PGS), analyse du fond chromosomique desembryons.

Fig. 4. Biopsie des cellules du trophectoderme à j5, d’après Kokkali et al.

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3.1.2. « Preimplantation Genetic Screening »(PGS)

Le PGS est pratiqué dans de nombreux pays pour les couplesà risque d’obtenir des embryons porteurs d’anomalieschromosomiques de nombre (aneuploïdies) dans les indicationssuivantes : âge maternel avancé, antécédents de faussescouches à répétition et échecs répétés d’implantation. Cettepratique part du constat que l’aneuploïdie est extrêmementcourante chez les embryons en division et mène à l’arrêt du

Fig. 5. Métabolisme du glucose et taux de grossesse, d’après Gardner et al. A. Cofœtal). B. Consommation de glucose par l’embryon

développement, à l’échec d’implantation ou à l’avortementspontané. Il a donc été avancé qu’en ayant recours au dépistagedes aneuploïdies en pré-implantatoire et en ne transférant queles embryons normaux sur le plan chromosomique, les issuesde FIV s’en trouveraient améliorées. La pratique du PGS s’estlargement répandue durant les années 2000 et comme pour leDPI, les embryons en division étaient biopsiés et l’analyse desblastomères était faite par technique de FISH mais dans le cadredu PGS, 6 à 15 chromosomes par embryon étaient examinés

nsommation de glucose par l’embryon à j4 et issue de FIV (rythme cardiaque à j5 et issue de FIV (rythme cardiaque fœtal).

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(les chromosomes 13, 16, 18, 21, 22, X et Y le plus souvent).Cependant, des études récentes sont venues remettre en causel’intérêt clinique de cette pratique.

Depuis 1997, un rapport de l’ESHRE analyse les donnéesconcernant le PGD de l’ensemble des centres participant auconsortium Européen. Harper et al. [29] présentent dans leurpapier un aperçu des dix premières années, en réunissant lesdonnées publiées entre 1997 et 2007 et pour la première foisdepuis 1997, le nombre de cycles de PGS réalisés est en baissedans le dernier rapport de l’ESHRE publié. Cette tendance peuts’expliquer par le fait que plusieurs centres ont réduit oustoppé leur pratique du PGS, suite à la publication ces dernièresannées de plusieurs essais randomisés qui peinent à démontrerle bénéfice apporté par cette technique. En 2007, Mastenbroeket al. [30] ont signalé les résultats d’un essai randomisé à doubleinsu, multicentrique et de grande envergure, qui démontrentqu’une FISH visant neuf chromosomes (1, 13, 16, 17,18, 21, X etY) sur un blastomère biopsié à j3 ne constitue pas un moyenefficace d’améliorer les taux de grossesse pour les femmesâgées de 35 à 41 ans.

Ces résultats sont renforcés par l’étude de Staesssen et al.[31] en 2008 qui n’observent pas d’augmentation des taux denaissance après PGS pour les femmes de moins de 36 ans et parHardarson et al. [32] pour les femmes de plus de 38 ans. Demême, en 2010 les études de Debrock et al. [33] et de Milánet al. [34] confirment l’absence de bénéfices apportée par lePGS en termes de grossesses cliniques et de naissances. Autotal, plus de onze essais randomisés ont été publiés et il estdésormais admis que la pratique du PGS par FISH à j3 estinefficace voire délétère. Depuis, plusieurs hypothèses ont étéavancées pour expliquer ces résultats. Tout d’abord, l’impactde la technique d’aspiration en elle-même sur le développementultérieur de l’embryon a toujours été très discuté. Deux étudesrécentes ont montré que la biopsie de deux blastomères austade huit cellules influait négativement sur l’aptitude del’embryon à évoluer jusqu’au stade blastocyste. Il en résulte unediminution du nombre d’embryons disponibles pour letransfert [35] et une diminution du taux de naissances lorsquecomparé au groupe contrôle [36].

De plus, l’analyse d’une ou deux cellules n’est pas forcémentreprésentative du reste de l’embryon du fait de l’importance dumosaïcisme à j3. Les données de la littérature montrent que ledéveloppement embryonnaire précoce se démarque parl’importance des anomalies chromosomiques retrouvées àce stade et ce d’autant que le nombre de chromosomesanalysés est important. En effet, des équipes ayant appliquéesdes méthodes d’étude globale du génome pour l’analyse d’unblastomère à j3 révèlent que 60 % à 90 % des embryons sontmosaïques à ce stade [26,27]. Si des taux importants demosaïcisme persistent au stade de blastocyste, ce phénomènediminue entre j3 et j5, soit par arrêt de développement desembryons les plus déséquilibrés, soit par « auto-correction »des anomalies chromosomiques. Dans son étude, Barbash-Hazan et al. [37] ré analysent par FISH à j5 des embryonsdiagnostiqués aneuploïdes à j3 et retrouve ces phénomènes decorrection (self-correction), puisque près de 10 % des embryonsaneuploïdes à j3 étaient parfaitement euploïdies à j5. De fait,

l’analyse d’un ou deux blastomères à j3 dans le cadre du PGSpeut donc conduire à exclure, à tort, un embryon potentiel-lement viable. De plus, l’analyse d’un blastomère par FISH neporte que sur un nombre restreint de chromosomes (15 auplus), ne permettant donc qu’un dépistage partiel desaneuploïdies.

Le PGS, lorsque pratiqué par FISH à j3, n’est donc pasreprésentatif du statut chromosomique global de l’embryon ets’expose à un risque important d’erreur diagnostique. Parconséquent, il est aujourd’hui nécessaire d’évaluer d’une part,l’avantage de nouvelles techniques permettant une analyseglobale du génome, comme la CGH Array et, d’autre part,l’intérêt d’effectuer le dépistage au stade blastocyste surcellules trophoblastiques. De nombreux pays utilisent déjàcette pratique en routine depuis plusieurs années et rapportentune amélioration des taux d’implantation, mais la pratique de ce« nouveau » PGS par CGH Array à j5 ne sera réellementjustifiée que si les études randomisées actuellement en coursvalident son intérêt clinique [38].

3.2. Approches non invasives

De nombreux travaux actuels s’orientent plutôt vers uneapproche fonctionnelle pour prédire la viabilité embryonnaire.Il s’agit ici d’étudier le métabolisme de l’embryon (métabolo-mique), les ARN messagers transcrits à partir de son ADN(transcriptomique) et les protéines qui en sont issues(protéomique). Ces nouvelles techniques se regroupent sousle terme générique « omics » et contrairement à la génomique,elles sont non invasives puisqu’elles étudient les surnageants deculture des embryons. De plus, du fait d’une amélioration trèsnette de leur sensibilité, ces techniques présentent l’avantagede pouvoir être réalisées sur les quantités infimes de produitsécrétées par un seul embryon. Ces analyses reposent sur destechniques de spectrométrie, de chromatographie, de réso-nance magnétique nucléaire, de microarrays et sur l’utilisation delogiciels bioinformatiques.

3.2.1. ProtéomiqueLa protéomique s’appuie sur le fait que les protéines

sécrétées par un embryon attestent d’un profil d’expression decertains gènes et donc conditionnent une activité fonctionnellepouvant influencer le devenir de cet embryon. Il existe desapproches spécifiques qui étudient des « protéines candidates »et des approches plus globales qui visent à définir des profilsprotéiques de sécrétome associés à la capacité de développe-ment ou d’implantation de l’embryon.

Dans plusieurs études, Katze-Jaffe et al. [39] analysent parspectrométrie de masse le profil d’expression protéique dusécrétome aux différents stades du développement précoceembryonnaire. Les résultats montrent l’expression de protéinesdifférentes au cours du développement de l’embryon et desprofils de sécrétion ont pu être associés à la capacité d’atteindrele stade de blastocyste. En particulier, l’ubiquitine s’est révéléeêtre un marqueur corrélé au développement embryonnaire.D’autre part, les embryons qui dégénèrent montrent uneexpression significativement accrue de plusieurs biomarqueurs

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qui pourraient être impliqués dans des mécanismes d’inhibitionde la croissance et d’apoptose. De plus, ces travaux suggèrentqu’il existe une « signature protéique » du sécrétome permettantde déterminer l’état de ploïdie d’un embryon.

L’impact de ces profils ou des biomarqueurs identifiés resteà évaluer de manière prospective sur un plus grand nombred’échantillons mais si les recherches en cour confirment cesrésultats, cette approche constituerait un outil puissant pour lasélection des embryons, en permettant d’évaluer à la fois lepotentiel de développement et la constitution chromosomiquede l’embryon sans être invasif.

3.2.2. MétabolomiqueLa métabolomique consiste en l’analyse du métabolisme

embryonnaire et plusieurs études ont déjà montré unecorrélation entre le statut métabolique de l’embryon et saviabilité. Il existe des approches précises qui s’intéressent aumétabolisme énergétique ou à la consommation d’oxygène etdes approches spectrales plus globales.

Des travaux sur le métabolisme des acides aminés suggèrentque le « turn-over » de certains acides aminés des embryons estcorrélé à l’obtention d’une grossesse après transfert. En outre,Botros et al. [40] désignent le pyruvate comme un marqueurpotentiel de la viabilité embryonnaire. Ce résultat confirme lesdonnées de Gardner et al. [41] en 2001 qui avaient égalementmontré une consommation en pyruvate, mesurée au quatrièmejour, significativement plus importante pour les embryonsatteignant le stade de blastocyste. D’autre part, ces mêmestravaux se rejoignent quant au métabolisme du glucose. Lesrésultats montrent qu’une hausse significative de la métabolisa-tion du glucose à j4 reflète le potentiel de développement del’embryon. De surcroît, l’étude de Gardner et al. [42] en2011 conclut que la consommation de glucose par l’embryonserait prédictive de l’issue de la FIV (Fig. 5) voire même du sexede l’embryon.

Ses résultats mettent donc en évidence des différencesmétaboliques entre les embryons en fonction de leur capacité àdonner des naissances et l’étude de ces métabolismespermettrait une meilleure sélection de l’embryon à transférer.

Les approches plus globales, ou métabolomiques, visent àfournir des profils caractéristiques des embryons à hautpotentiel de développement et d’implantation. Ces techniquesfournissent une image complète du métabolisme embryonnaireet du profil d’expression des gènes et les travaux réalisés dansce domaine ont conduit à calculer un « score de viabilité » del’embryon à partir de son profil métabolomique établi parspectroscopie. L’étude de Seli et al. [43] publiée en2010 compare ce score de viabilité et la morphologieembryonnaire pour prédire les issues de FIV après transfertd’un blastocyste à j5. Au total, 198 embryons et milieux decultures sont analysés et les résultats montrent que l’index deviabilité est plus prédictif de grossesses que les critèresmorphologiques utilisés en routine. La combinaison de cesdeux paramètres pourrait donc permettre de donner plus dechances aux couples ayant recours à l’AMP mais de nouveau, lavalidation de ces approches nécessite une confirmation par desétudes prospectives.

4. CONCLUSION

Les recherches menées au cours des dernières décenniesont fourni de nombreux critères visant à améliorer la sélectionde l’embryon à transférer afin de ne faire perdre aucune chancede grossesse au couple dans le cadre de l’eSET.

La morphologie embryonnaire est un paramètre capitalpour évaluer les chances de succès en fécondation in vitro etreste aujourd’hui le critère le plus pertinent dans le choix del’embryon à transférer. En accordant à la cinétique dedéveloppement embryonnaire autant de crédit que lescritères morphologiques utilisés en routine, le time-lapsepourrait entraîner une modification de nos pratiques en AMP.S’il semble être un outil efficace d’aide à la décision dans lasélection de l’embryon, le rapport bénéfice/coût de cesystème reste à évaluer et des études randomisées sont encours afin de mesurer son apport réel.

Dans ce contexte de meilleure sélection embryonnaire, laculture prolongée jusqu’au stade blastocyste est une pratiqueincontournable et ce d’autant que la vitrification permetdésormais d’obtenir d’excellents taux de survie à ce stade.Néanmoins, la pratiquer de façon systématique ne semble pasjustifié et il est judicieux de réserver la CP à une population debon pronostic, lorsque de nombreux embryons de bonnequalité sont disponibles à j2/j3. Pour affiner la sélection, certainspays ajoutent des techniques invasives en pratiquant le PGS, quilorsque réalisé par FISH à j3, ne présente aucun intérêt clinique.L’apport des techniques récentes permettant une analyseglobale du génome est attendu ici, associées à une biopsiedifférée à j5 qui permet un diagnostic plus juste tant pour le DPIque pour le PGS.

Enfin, l’émergence des nouvelles technologies « omics »pourrait à l’avenir modifier nos pratiques. À l’heure actuelle,l’application de ces techniques reste encore limitée par le coûtélevé des équipements nécessaires et surtout par l’absence devalidation prospective des résultats obtenus. Néanmoins, cestechniques ouvrent la voie au développement de « marqueurs »de compétence accessibles en pratique clinique et une foisvalidées, ces nouvelles approches pourraient améliorer lasélection de l’embryon à transférer et permettre ainsi d’obtenirplus de grossesses après transfert sélectif d’un embryon.

DÉCLARATION D’INTÉRÊTS

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enrelation avec cet article.

RÉFÉRENCES

[1] Ferraretti AP, Goossens V, Kupka M, Bhattacharya S, de Mouzon J, CastillaJA, et al. European IVF-monitoring (EIM), and Consortium, for TheEuropean Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE),‘‘Assisted reproductive technology in Europe, 2009: results generatedfrom European registers by ESHRE’’. Hum Reprod Oxf Engl2013;28(9):2318–31.

[2] Maheshwari A, Griffiths S, Bhattacharya S. ‘‘Global variations in the uptakeof single embryo transfer’’. Hum Reprod Update 2011;17(1):107–20.

L. Alter et al. / Gynécologie Obstétrique & Fertilité 42 (2014) 515–525 525

[3] Scott LA, Smith S. ‘‘The successful use of pronuclear embryo transfers theday following oocyte retrieval’’. Hum Reprod Oxf Engl1998;13(4):1003–13.

[4] Scott L, Alvero R, Leondires M, Miller B. ‘‘The morphology of humanpronuclear embryos is positively related to blastocyst development andimplantation’’. Hum Reprod Oxf Engl 2000;15(11):2394–403.

[5] Giorgetti C, Terriou P, Auquier P, Hans E, Spach JL, Salzmann J, et al.‘‘Embryo score to predict implantation after in-vitro fertilization: basedon 957 single embryo transfers’’. Hum Reprod Oxf Engl 1995;10(9):2427–31.

[6] Holte J, Berglund L, Milton K, Garello C, Gennarelli G, Revelli A, et al.‘‘Construction of an evidence-based integrated morphology cleavageembryo score for implantation potential of embryos scored andtransferred on day 2 after oocyte retrieval’’. Hum Reprod Oxf Engl2007;22(2):548–57.

[7] Gardner DK, Schoolcraft WB. ‘‘Culture and transfer of humanblastocysts’’. Curr Opin Obstet Gynecol 1999;11(3):307–11.

[8] Goto S, Kadowaki T, Tanaka S, Hashimoto H, Kokeguchi S, Shiotani M.‘‘Prediction of pregnancy rate by blastocyst morphological score and age,based on 1,488 single frozen-thawed blastocyst transfer cycles’’. FertilSteril 2011;95(3):948–52.

[9] Shoukir Y, Campana A, Farley T, Sakkas D. ‘‘Early cleavage of in-vitrofertilized human embryos to the 2-cell stage: a novel indicator of embryoquality and viability’’. Hum Reprod Oxf Engl 1997;12(7):1531–6.

[10] Terriou P, Giorgetti C, Hans E, Salzmann J, Charles O, Cignetti L, et al.‘‘Relationship between even early cleavage and day 2 embryo score andassessment of their predictive value for pregnancy’’. Reprod BiomedOnline 2007;14(3):294–9.

[11] Fu J, Wang X-J, Wang Y-W, Sun J, Gemzell-Danielsson K, Sun X-X. ‘‘Theinfluence of early cleavage on embryo developmental potential and IVF/ICSI outcome’’. J Assist Reprod Genet 2009;26(8):437–41.

[12] Sundström P, Saldeen P. ‘‘Cumulative delivery rate in an in vitrofertilization program with a single embryo transfer policy’’. Acta ObstetGynecol Scand 2009;88(6):700–6.

[13] Sifer C, Sermondade N, Poncelet C, Hafhouf E, Porcher R, Cedrin-Durnerin I, et al. ‘‘Biological predictive criteria for clinical pregnancy afterelective single embryo transfer’’. Fertil Steril 2011;95(1):427–30.

[14] Lamazou F, Arbo E, Grynberg M, Bourrier M-C, Fanchin R, Fernandez H,et al. « L’impact des critères du élective single embryo transfer sur les tauxde grossesses gémellaires dans la population française ». J Gynecol ObstetBiol Reprod 2011;40(4):323–8.

[15] Veleva Z, Vilska S, Hydén-Granskog C, Tiitinen A, Tapanainen JS,Martikainen H. ‘‘Elective single embryo transfer in women aged36–39 years’’. Hum Reprod Oxf Engl 2006;21(8):2098–102.

[16] Oatway C, Gunby J, Daya S. ‘‘Day three versus day two embryo transferfollowing in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection’’.Cochrane Database Syst Rev 2004;2:CD004378.

[17] Racowsky C, Ohno-Machado L, Kim J, Biggers JD. ‘‘Is there an advantage inscoring early embryos on more than one day?’’ Hum Reprod Oxf Engl2009;24(9):2104–13.

[18] Santos MA, Teklenburg G, Macklon NS, Van Opstal D, Schuring-Blom GH,Krijtenburg P-J, et al. ‘‘The fate of the mosaic embryo: chromosomalconstitution and development of day 4, 5 and 8 human embryos’’. HumReprod Oxf Engl 2010;25(8):1916–26.

[19] Papanikolaou EG, Kolibianakis EM, Tournaye H, Venetis CA, Fatemi H,Tarlatzis B, et al. ‘‘Live birth rates after transfer of equal number ofblastocysts or cleavage-stage embryos in IVF. A systematic review andmeta-analysis’’. Hum Reprod Oxf Engl 2008;23(1):91–9.

[20] Guerif F, Lemseffer M, Bidault R, Gasnier O, Saussereau MH, Cadoret VC,et al. ‘‘Single Day 2 embryo versus blastocyst-stage transfer: a prospectivestudy integrating fresh and frozen embryo transfers’’. Hum Reprod OxfEngl 2009;24(5):1051–8.

[21] AbdelHafez FF, Desai N, Abou-Setta AM, Falcone T, Goldfarb J. ‘‘Slowfreezing, vitrification and ultra-rapid freezing of human embryos: a systematicreview and meta-analysis’’. Reprod Biomed Online 2010;20(2):209–22.

[22] Blake DA, Farquhar CM, Johnson N, Proctor M. ‘‘Cleavage stage versusblastocyst stage embryo transfer in assisted conception’’. CochraneDatabase Syst Rev 2007;4:CD002118.

[23] Mio Y, Maeda K. ‘‘Time-lapse cinematography of dynamic changesoccurring during in vitro development of human embryos’’. Am J ObstetGynecol 2008;199(6):e1–5.

[24] Wong CC, Loewke KE, Bossert NL, Behr B, De Jonge CJ, Baer TM, et al.‘‘Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genomeactivation predicts development to the blastocyst stage’’. Nat Biotechnol2010;28(10):1115–21.

[25] Herrero J, Meseguer M. ‘‘Selection of high potential embryos using time-lapse imaging: the era of morphokinetics’’. Fertil Steril 2013;99(4):1030–4.

[26] Vanneste E, Voet T, Le Caignec C, Ampe M, Konings P, Melotte C, et al.‘‘Chromosome instability is common in human cleavage-stage embryos’’.Nat Med 2009;15(5):577–83.

[27] Mantzouratou A, Delhanty JDA. ‘‘Aneuploidy in the human cleavage stageembryo’’. Cytogenet Genome Res 2011;133(2–4):141–8.

[28] de Boer KA, Catt JW, Jansen RPS, Leigh D, McArthur S. ‘‘Moving toblastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryotransfer at Sydney IVF’’. Fertil Steril 2004;82(2):295–8.

[29] Harper JC, Wilton L, Traeger-Synodinos J, Goossens V, Moutou C,SenGupta SB, et al. ‘‘The ESHRE PGD Consortium: 10 years of datacollection’’. Hum Reprod Update 2012;18(3):234–47.

[30] Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, Sikkema-Raddatz B,Korevaar JC, Verhoeve HR, et al. ‘‘In vitro fertilization withpreimplantation genetic screening’’. N Engl J Med 2007;357(1):9–17.

[31] Staessen C, Verpoest W, Donoso P, Haentjens P, der Elst JV, Liebaers I,et al. ‘‘Preimplantation genetic screening does not improve delivery rate inwomen under the age of 36 following single-embryo transfer’’. HumReprod 2008;23(12):2818–25.

[32] Hardarson T, Hanson C, Lundin K, Hillensjö T, Nilsson L, Stevic J, et al.‘‘Preimplantation genetic screening in women of advanced maternal agecaused a decrease in clinical pregnancy rate: a randomized controlledtrial’’. Hum Reprod Oxf Engl 2008;23(12):2806–12.

[33] Debrock S, Melotte C, Spiessens C, Peeraer K, Vanneste E, Meeuwis L,et al. ‘‘Preimplantation genetic screening for aneuploidy of embryos afterin vitro fertilization in women aged at least 35 years: a prospectiverandomized trial’’. Fertil Steril 2010;93(2):364–73.

[34] Milán M, Cobo AC, Rodrigo L, Mateu E, Mercader A, Buendía P, et al.‘‘Redefining advanced maternal age as an indication for preimplantationgenetic screening’’. Reprod Biomed Online 2010;21(5):649–57.

[35] Goossens V, De Rycke M, De Vos A, Staessen C, Michiels A, Verpoest W,et al. ‘‘Diagnostic efficiency, embryonic development and clinical outcomeafter the biopsy of one or two blastomeres for preimplantation geneticdiagnosis’’. Hum Reprod Oxf Engl 2008;23(3):481–92.

[36] De Vos A, Staessen C, De Rycke M, Verpoest W, Haentjens P, Devroey P,et al. ‘‘Impact of cleavage-stage embryo biopsy in view of PGD on humanblastocyst implantation: a prospective cohort of single embryo transfers’’.Hum Reprod Oxf Engl 2009;24(12):2988–96.

[37] Barbash-Hazan S, Frumkin T, Malcov M, Yaron Y, Cohen T, Azem F, et al.‘‘Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlationwith their developmental potential’’. Fertil Steril 2009;92(3):890–6.

[38] Gleicher N, Barad DH. ‘‘A review of, and commentary on, the ongoingsecond clinical introduction of preimplantation genetic screening (PGS) toroutine IVF practice’’. J Assist Reprod Genet 2012;29(11):1159–66.

[39] Katz-Jaffe MG, McReynolds S, Gardner DK, Schoolcraft WB. ‘‘The role ofproteomics in defining the human embryonic secretome’’. Mol HumReprod 2009;15(5):271–7.

[40] Botros L, Sakkas D, Seli E. ‘‘Metabolomics and its application for non-invasive embryo assessment in IVF’’. Mol Hum Reprod2008;14(12):679–90.

[41] Gardner DK, Lane M, Stevens J, Schoolcraft WB. ‘‘Noninvasiveassessment of human embryo nutrient consumption as a measure ofdevelopmental potential’’. Fertil Steril 2001;76(6):1175–80.

[42] Gardner DK, Wale PL, Collins R, Lane M. ‘‘Glucose consumption of singlepost-compaction human embryos is predictive of embryo sex and livebirth outcome’’. Hum Reprod Oxf Engl 2011;26(8):1981–6.

[43] Seli E, Vergouw CG, Morita H, Botros L, Roos P, Lambalk CB, et al.‘‘Noninvasive metabolomic profiling as an adjunct to morphology fornoninvasive embryo assessment in women undergoing single embryotransfer’’. Fertil Steril 2010;94(2):535–42.