《中国癌症杂志》2010年第20卷第3期

CHINA ONCOLOGY 2010 Vol.20 No.3 580

磷酸钙/磷脂-MPEG组装复合纳米粒促进耐药细胞MCF-7/MIT的药物摄取

研究

陈晓炎 1　梁晓飞 1　孙颖 1　王可伟 2　朱英杰 2　段友容 1

1. 上海交通大学肿瘤研究所，上海 200032 ；2. 中国科学院上海硅酸盐研究所，上海 200050

　　［摘要］　背景与目的：乳腺癌耐药是导致临床上化疗失败的一个重要原因，逆转乳腺癌耐药已经成为急

待解决的问题。纳米递送系统作为药物载体有很多优点，将其作为抗癌药物载体是逆转肿瘤耐药的有效策略之

一。本文研究一种新型的纳米递送系统：磷酸钙/磷脂-MPEG组装复合纳米粒对BCRP高表达的乳腺癌盐酸米托蒽

醌耐药细胞MCF-7/MIT药物摄取的影响，从而探讨该纳米递送系统对MCF-7/MIT细胞耐药性的逆转作用。方法：

设计并制备了磷酸钙/磷脂组装复合纳米粒，考察了载盐酸米托蒽醌纳米粒的包封率和体外药物释放规律，定

量比较了MCF-7和MCF-7/MIT细胞对载药纳米粒和游离药物的摄取，并采用激光共聚焦显微镜观察方法比较细

胞摄取载药纳米粒和游离药物后药物在细胞内分布情况。结果：磷酸钙/磷脂组装复合纳米粒呈均匀的多孔球

形，粒径小于100 nm，包载药物盐酸米托蒽醌的包封率为（89.45±0.05）%，药物释放呈初期突释和后期缓释

两相。载药纳米粒与游离药物作用于细胞1 h后，在MCF-7细胞内的药物摄取量前者是后者的1.89倍，在MCF-7/

MIT细胞内的药物摄取量前者是后者的2.33倍，载药纳米粒可以携带药物进入细胞核，而游离药物未见明显的

核内分布。结论：磷酸钙/磷脂-MPEG组装复合纳米粒可以促进乳腺癌细胞MCF-7和其对应的BCRP高表达的盐酸

米托蒽醌耐药细胞MCF-7/MIT对抗癌药物盐酸米托蒽醌的摄取，并能携带药物进入细胞核，是一种有潜力的逆

转肿瘤耐药纳米药物载体。

　　［关键词］　盐酸米托蒽醌；　纳米粒；　乳腺癌；　耐药；　摄取

　　中图分类号：R7XXX　　文献标识码：A　　文章编号：1007-3639(2010)03-XXXX-0X

Cellular uptake study of CAP/GPC-MPEG nanoparticle in breast cancer cells CHEN Xiao-yan,LIANG Xiao-fei,SUN Ying,WANG Ke-wei,ZHU Ying-jie,DUAN You-rong (Cancer Institute

of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200032, China)

Correspondence to：DUAN You-rong　E-mail：yrduan@sci.shmu.edu.cn

　　［Abstract］ Background and purpose：Overcoming drug resistance of breast cancer is a pressing problem for it is the main obstacle of clinical chemotherapy. Nano-delivery system, which has many advantages as drug carrier, can be used to overcome tumor drug resistance effectively by loading anticancer drugs. In this paper, a novel nano-delivery system called calcium phosphate and glycerophosphocholine-mPEG (CAP/GPC-MPEG) composite nanoparticle was studied in its influence to cellular drug uptake of BCRP-overexpressing mitoxantrone (MIT)-resistant breast cancer cell MCF-7/MIT, and the effect of the nanoparticles delivery system on overcoming drug resistance to the MCF-7/MIT cells was explored. Methods：The calcium phosphate and GPC-mPEG composite nanoparticles were designed and prepared, the entrapment efficiency and in vitro drug release of mitoxantrone-loaded nanoparticles were investigated, cellular uptake of drug-loaded nanoparticles and free drug were compared quantitatively, subcellular distribution of drug-loaded nanoparticles and free drug were compared using confocal laser scanning microscopy. Results：The calcium phosphate and GPC-mPEG composite nanoparticles were nanoporous spheric particles with diameters of 50-100 nm. The entrapment efficiency of MIT-loaded nanoparticles was (89.45±0.05)%, and drug-loaded nanoparticles showed an initial burst drug release followed by a sustained release profile. The concentration of mitoxantrone was 1.89

基金项目：上海市科委纳米科技研究项目（项目编号：0852nm05800）；国家自然科学基金（No.50673058）。通讯作者：段友容　E-mail:yrduan@sci.shmu.edu.cn

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　　化学治疗在临床肿瘤治疗中占有很重要地位，但是肿瘤细胞对化疗药物表现出来的耐药性常常是导致化疗失败的重要原因，因而成为临床肿瘤化疗中一个急需解决的问题［1］。乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，是女性常见的恶性肿瘤之一。盐酸米托蒽醌（mitoxantrone，MIT）是一种广谱抗肿瘤药，临床上对乳腺癌有较好疗效，但是其心脏毒性较大，而且乳腺癌耐药问题显著，限制了盐酸米托蒽醌的临床应用［2］。纳米递送系统包载抗肿瘤药物，能够利用肿瘤通透性增强与滞留（enhanced permeability and retention，EPR）效应，使抗肿瘤药物被动靶向肿瘤部位，实现靶向给药，减少全身用药的不良反应［3］。近年来，纳米递送系统在逆转肿瘤耐药方面的研究越来越多，肿瘤耐药的细胞机制主要是膜蛋白介导的药物外排，而包封于纳米递送系统中的抗癌药物，能够逃避耐药相关蛋白的识别、结合及外排，从而增加细胞内药物蓄积，在一定程度上起到逆转肿瘤耐药的作用［4］。本文设计并制备了一种新型的纳米载体：磷酸钙/磷脂-mPEG组装复合纳米粒，考察了其载药特性，并研究了该纳米载体对乳腺癌细胞MCF-7和其对应的盐酸米托蒽醌耐药细胞MCF-7/MIT摄取药物的影响，探索其在逆转乳腺癌耐药方面的作用。

1　材料和方法

1.1　材料　乳腺癌MCF-7细胞和盐酸米托蒽醌耐药细胞株MCF-7/MIT由上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室惠赠。DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素购自Gibco公司；甘油磷脂酰胆碱（glycerophosphocholine，GPC）购自北京美亚斯磷脂技术有限公司；盐酸米托蒽醌原药（含量＞99%）购自重庆凯林制药有限公司；聚乙二醇单甲醚（mPEG）、四甲基

times in MCF-7/MIT cells and 2.33 times in MCF-7/MIT cells treated with MIT-loaded nanoparticles for 1 h compared to that treated with free mitoxantrone for 1 h. The red fluorescence of mitoxantrone appeared in the cytoplasm and the nucleus of MCF-7 and MCF-7/MIT cells treated with MIT-loaded nanoparticles while it almost can not be observed in both cells treated with free mitoxantrone. Conclusion：Calcium phosphate and GPC-mPEG composite nanoparticle can promote the cellular uptake and the entering of mitoxantrone to the nucleus in MCF-7 and its corresponding BCRP-overexpressing MIT-resistant MCF-7/MIT breast cancer cell lines. The nanoparticle is a potential nano-carrier to overcome tumor drug resistance. 　［Key words］　mitoxantrone; nanoparticle; breast cancer; drug resistance; uptake

偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、多聚甲醛、DAPI及BCA蛋白定量试剂盒购自Sigma公司；透析袋购自上海绿鸟科技发展有限公司，截留相对分子量7 000；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；飞鸽牌离心机购自上海安亭科学仪器厂；透射电子显微镜（JEM-2100F）购自日本电子公司；Zeta电位分析仪购自英国马尔文仪器公司；激光共聚焦成像系统（FV1000）购自日本Olympus公司。1.2　MPEG-甘油磷脂酰胆碱 (磷脂-mPEG)的合成　10 g mPEG（MW=2 000）置于干燥烧瓶中，溶于100 mL无水氯仿中，加丁二酸酐3 g，再加入干燥吡啶1.5 mL，60 ℃回流48 h，旋蒸去除溶剂，固体溶于50 mL饱和碳酸氢钠溶液，滴加浓HCL至pH为5～6，氯仿萃取3次，水洗1次，取有机相，加无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩至15～20 mL，加冰乙醚沉淀，过滤出产物，真空干燥得到白色粉末。将磷脂溶于PBS中，加入一定量的上述白色粉末和EDC，通氮气密封，室温反应1 d。过滤，旋蒸至少量液体存留，二氯甲烷萃取，取水相，置真空干燥箱干燥得磷脂-mPEG。1.3　磷酸钙/磷脂-mPEG组装复合纳米粒的制备和表征1.3.1　空白纳米粒的制备和表征　将0.6 mL磷脂-mPEG水溶液（80 mg/mL）和2 mL CaCl2溶液（0.5 mol/L）一起加入到50 mL去离子水中，室温下磁力搅拌至形成透明溶液，用氨水将该溶液的pH值调至10，然后加入2 mL（NH4）

2HPO4溶液（0.3 mol/L），反应液pH值用氨水保持在10。磁力搅拌反应5 min，然后将反应液离心收集，所得白色沉淀用去离子水和乙醇各洗涤3次，最后在室温下真空烘干。在JEOL JEM-2100F场发射透射电子显微镜（TEM）上观察样品的形貌和粒径分布。

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1.3.2　载药纳米粒的制备以及包封率和电位测定　称取纳米粒粉末3 mg，溶于0.6 mL PBS中，加0.5 mg/mL米托蒽醌的PBS溶液0.4 mL，漩涡1 min混匀，低频超声10 min，静置2 h使纳米粒充分吸附药物,再次超声2 min使纳米粒分散均匀，然后3 500×g离心30 min，取上清液，测定610 nm处紫外吸光值，根据米托蒽醌紫外吸收标准曲线计算盐酸米托蒽醌含量并计算包封率，包封率=（盐酸米托蒽醌总量－液体中未包封的盐酸米托蒽醌量）/盐酸米托蒽醌总量。沉淀加PBS吹打分散均匀，即为载米托蒽醌纳米粒，取载药纳米粒测定表面电位。1.4　载药纳米粒的体外药物释放　取透析袋（MW=7000）置于蒸馏水中，煮沸5 min,然后用60 ℃蒸馏水冲洗10 min,并置于4 ℃蒸馏水中浸泡过夜备用。将载药纳米粒样品2 mL装入透析袋中,两端扎好后装在有15 mL pH 7.4的PBS的离心管中，置于摇床中37.8 ℃，75 r/min摇动，分别在1、2、4、6、12、24、48、96、144、192及240 h取1 mL的液体检测610 nm处紫外吸光值，并补充等量新鲜PBS。按照紫外吸光值计算释放出的药物含量并绘制药物累积释放曲线。每个条件设置3个重复样。 1.5　细胞培养　乳腺癌细胞MCF-7培养，采用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基,常规培养于37℃，CO2体积分数为5%的饱和湿度的细胞培养箱中，其对应的盐酸米托蒽醌耐药细胞MCF-7/MIT除上述条件外，加1.0 ug/mL的盐酸米托蒽醌维持其耐药性，实验前脱药培养一周。取对数期细胞铺板进行实验。 1.6　细胞药物摄取定量研究　MCF-7细胞和MCF-7/MIT细胞铺24孔板，每孔8×104个细胞, 0.5 mL培液，在37 ℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，分别换成含有游离盐酸米托蒽醌或盐酸米托蒽醌载药纳米粒的培液0.5 mL（盐酸米托蒽醌浓度为20 μg/mL），继续培养1 h，弃去培液，加PBS洗2次，然后加细胞裂解液裂解细胞，收集裂解液分为两部分，一部分检测610 nm处紫外吸光值并计算盐酸米托蒽醌含量，一部分用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量，最后计算细胞内药物含量并用蛋白含量进行标定。每个条件设置3个复孔。1.7　激光共聚焦显微镜观察细胞内药物分布

　24孔板中预置无菌10 mm2的圆形盖玻片，MCF-7细胞和MCF-7/MIT细胞铺板，每孔8×104个细胞，0.5 mL培液，在37 ℃，CO2体积

分数为5%的细胞培养箱中培养过夜，待细胞爬片后，分别将培液换成含有游离盐酸米托蒽醌或盐酸米托蒽醌载药纳米粒的培液0.5 mL（盐酸米托蒽醌浓度为20 μg/mL），继续培养1 h，弃去培液，用PBS洗3次，每次在摇床上摇动10 min，然后加4%多聚甲醛室温固定20 min，再用PBS洗3次×10 min，每孔加DAPI避光染细胞核10 min，然后再洗3次×10 min，取出盖玻片，加90%甘油固定，反贴在载玻片上，激光共聚焦显微镜观察细胞内盐酸米托蒽醌的含量和分布（盐酸米托蒽醌激发光波长为610～660 nm，发射光波长为685 nm，DAPI 激发光波长为358 nm，发射光波长为461 nm)。1.8　统计处理　实验数据以χ±s表示，组间以t检验比较。应用SPSS11.5软件包进行相关统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　空白纳米粒形态和粒径分布　磷酸钙/磷脂-mPEG组装复合纳米粒在电镜下呈圆形多孔球状，粒径在100 nm以下，大小较均匀（图1）。

图 1　空白纳米粒透射电镜图

Fig. 1 TEM photomicrographs of blank nanoparticles

2.2　载药纳米粒的包封率，电位和体外药物释放曲线　载盐酸米托蒽醌纳米粒的包封率为

陈晓炎，等.　磷酸钙/磷脂-MPEG组装复合纳米粒促进耐药细胞MCF-7/MIT的药物摄取研究

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（89.45±0.05）%，表面电位为（5.65±1.36）mV。体外药物释放曲线如图2所示，纳米粒中药物释放分为初期突释和后期缓释两相，前24 h累积释放药物（76.08±1.47）%，此 后 进 入 缓 释 期 ， 2 4 0 h 末 累 积 释 放 量 达（97.87±1.47）%。

图 2　载药纳米粒体外药物释放曲线

Fig. 2 Drug release profile of drug-loaded nanoparticles

(x±s , n=3)

2.3　细胞内药物浓度　如图3所示，相同药物浓度的游离药物与载药纳米粒作用1 h 后 ， 在 M C F - 7 细 胞 内 ， 药 物 摄 取 量分别为每μg蛋白（29.28±0.45）μg和（55.21±0.95）μg（P＜0.05），后者约为前者的1.89倍；在MCF-7/MIT细胞内，药物摄取量分别为每μg蛋白（37.48±2.50）μg和（87.30±2.97）μg（P＜0.05），后者约为前者的2.33倍。

图 3　细胞对药物摄取定量研究结果

Fig. 3 Drug accumulation in MCF-7 cells and MCF-7/

MIT cells treated with free mitoxantrone and drug-loaded

nanoparticles for 1 h

(x±s , n=3)

2.4　细胞内药物分布　从图4激光共聚焦显微镜观察结果可以看到，在MCF-7细胞内，载药纳米粒组盐酸米托蒽醌的红色荧光比游离药物

组强；在MCF-7/MIT细胞内，两组差别更加明显，游离药物组基本看不到红色荧光，而载药纳米粒组有较强的荧光。载药纳米粒组细胞内红色荧光主要分布于细胞浆，少量分布于细胞核，而游离药物组细胞内红色荧光可以在细胞浆内观察到，细胞核内基本观察不到。

3　讨　　论

　　纳米递送系统作为抗癌药物载体的研究已成为当今药学和肿瘤学的一个研究热点。纳米粒是指尺度在1～100 nm之间的微粒，其作为药物载体可以实现药物靶向递送、控制释放，并能提高药物生物利用度［1］。纳米粒的这些优点使其在逆转肿瘤耐药方面显示出明显的优势，已有多项研究表明纳米粒具有较好的体外体内逆转肿瘤耐药效果，如Zhang等［5］制备的载紫杉醇与多柔比星的纳米粒一定程度上逆转了乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR与卵巢癌耐药细胞株SKOV3-TR30的耐药性；Koziara等［6］制备的纳米粒能够逆转人结肠癌细胞HCT-15对紫杉醇的耐药。 　　磷酸钙纳米粒常被作为基因和药物载体，具有良好的生物相容性和生物可降解性，降解产物钙、磷为人体的正常组分，无不良反应，但是存在形态较难控制，容易聚集沉淀等缺点，限制了其应用［7-8］。本研究将磷酸钙与磷脂-mPEG组装复合对磷酸钙纳米粒进行改进：甘油磷脂酰胆碱是细胞膜的主要组成成分，易于与细胞膜融合，其对磷酸钙进行修饰可以增强纳米粒与肿瘤细胞的亲和力；mPEG修饰磷酸钙纳米粒后其长亲水链端在纳米粒表面形成一定的空间位阻，使纳米粒之间聚集减少，分散性得到改善，粒径更均匀。而且电位测定结果显示该纳米粒表面电位为正，因而易与表面带负电荷细胞膜相互吸引，更容易进入肿瘤细胞［9］。 　　BCRP是1998年美国学者在乳腺癌耐药细胞中发现的一种与多药耐药有关的蛋白，与P糖蛋白（P-glyeoprotein，P-gp），多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-accosiated pro-multidrug resistance-accosiated pro-tein，MRP）一样，都属于ATP结合盒（ATP binding cassette，ABC）膜转运蛋白超家族，具有ATP依赖性药物外排泵的作用，能够利用 ATP提供的能量将进入细胞内的抗癌药“泵”

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出细胞外，使细胞内药物浓度降低，达不到临床所需的治疗浓度，而表现为肿瘤对化疗药物的敏感性下降。BCRP高表达的细胞株对米托蒽醌有较强的耐药性，故有人亦称之为米托蒽醌耐药蛋白。传统的肿瘤耐药逆转剂对于BCRP过表达引起的耐药无显著逆转作用［10-

12］。本研究中磷酸钙/磷脂-mPEG组装复合纳米粒使MCF-7和BCRP高表达的MCF-7/MIT细胞对药物的摄取量增加，且药物进入细胞核的量也增多。由于盐酸米托蒽醌主要是通过与DNA结合来发挥抗癌作用，因此包封于磷酸钙/磷脂-mPEG组装复合纳米粒中的盐酸米托蒽醌不仅能够逃避MCF-7/MIT细胞药物外排泵的识别，

使药物外排减少，细胞内药物浓度增加，同时还能被纳米粒携带进入细胞核而更好地发挥抗癌作用。　　本实验制备了粒径在100 nm以下，分散均匀的圆形多孔磷酸钙/磷脂-mPEG组装复合纳米粒，能够非常方便地包载抗肿瘤药盐酸米托蒽醌，载药纳米粒包封率高，并能实现药物的控制释放。实验结果初步显示出该纳米粒是有潜力的逆转耐药纳米载体，但我们的研究仅仅是针对BCRP高表达的乳腺癌MCF-7耐药细胞株，从细胞摄取的角度进行的初步探讨，该纳米粒在逆转耐药方面的更多作用仍需要进一步深入研究。

图 4　细胞药物摄取激光共聚焦图(红色为盐酸米托蒽醌，蓝色为DAPI染细胞核后的荧光)

Fig. 4 Confocal microscopic images of (a) MCF-7 cells and (b) MCF-7/MIT cells treated with free Mitoxantrone

and drug-loaded nanoparticles. The red fluorescence represents Mitoxantrone and the blue fluorescence from DAPI

corresponds to nucleus.

陈晓炎，等.　磷酸钙/磷脂-MPEG组装复合纳米粒促进耐药细胞MCF-7/MIT的药物摄取研究

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