Post on 03-Mar-2019
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen-Gesamtfakultät
der
Ruprechts - Karls - Universität
Heidelberg
erstellt am
Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg
(DKFZ)
vorgelegt von
Diplom-Biochemiker Erik Dülsner
aus: Berlin
Tag der mündlichen Prüfung: 22. November 2007
Thema
Cyclooxygenase-(COX-)2 abhängige Signaltransduktion
in der Harnblase
K5.COX-2 transgener Mäuse
Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Werner Buselmaier
PD Dr. med. Michael A. Kern
Fürchte dich nicht vor dem langsamen Vorwärtsgehen,
fürchte dich nur vor dem Stehen bleiben.
chin. Weisheit
Für
„Meine Familie“
Zusammenfassung
I
Das Urothelkarzinom ist die 4. häufigste Karzinomerkrankung bei Männern und die 6.
häufigste bei Frauen. In allen Stadien des Urothelkarzinoms konnte gezeigt werden, dass es
zu einer erhöhten Expression der induzierbaren Cyclooxygenase Isoform, COX-2, mit
erhöhten Prostaglandinspiegeln kommt. COX-2 wird in den meisten Geweben nicht
exprimiert, jedoch in Prozessen der Wundheilung und Entzündung oder in Karzinomen
induziert. Um die Rolle der COX-2 im Urothelkarzinom zu untersuchen, wurde ein
transgenes Mausmodell verwendet, bei dem die COX-2 cDNA unter dem Keratin
5-Promotor steht, so dass es zu einer konstitutiven Expression von COX-2 im basalen
Epithel (u. a. Harnblasenschleimhaut) kommt, welches auf RNA- und Proteinebene sowie
mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden konnte. Die spontane Entwicklung des
entzündlichen, hyperplastischen/dysplastischen Phänotyps im Transgen konnte durch
Hemmung der COX-2 Aktivität mittels COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib reduziert
wurde. Die spontane Entwicklung des Urothelkarzinoms im Transgen erfolgte scheinbar
entlang dem humanen Urothelkarzinom, aufgrund erhöhter Her-2 Level und Ras
Aktivierung. Der COX-2 bedingte Phänotyp im Transgen wurde über die EP-Rezeptor
Isoformen EP2 und EP4 vermittelt, da deren Expression erhöht war und die beiden
EP-Rezeptor Isoformen von Entzündungszellen und von Karzinomzellen exprimiert
wurden.
Mittels etablierter 2D-DIGE-Technologie konnte im Transgen die differentielle Expression
verschiedener Proteinen, wie z. B. Prx-2 oder GST (Phase-II Detoxifizierungs- und anti-
oxidativer Stress Antwortenzyme), detektiert werden, welches einen erhöhten oxidativen
Stress implizierte. Durch einen in vitro Ansatz konnte gezeigt werden, dass der erhöhte
oxidative Stress im Transgen COX-2 und PGE2 abhängig war. Die Regulation der
Transkription der Phase-II und anti-oxidativer Stressgene wird durch den
Transkriptionsfaktor Nrf-2 vermittelt, dessen Expression im Transgen erhöht war und seine
Zellkerntranslokation COX-2 abhängig erfolgte.
Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass eine aberrante COX-2 Überexpression den
erhöhten oxidativen Stress fördert und die daraus resultierenden Dysregulationen COX-2
bedingter downstream Targets zum hyperplastischen Phänotyp und zur Entwicklung des
Urothelkarzinom führen und daher COX-2 eine wichtige Zielstruktur bei der Behandlung
des Urothelkarzinoms darstellt.
Summary
II
Urinary bladder cancer is a common cancer disease worldwide which ranks on place 4 in
men and place 6 in women of all cancer diseases. According to the TNM-system it was
shown that the inducible isoform of Cyclooxygenases, COX-2, is over-expressed in all
stages of urinary bladder cancer. Under physiological conditions COX-2 is normally not
expressed in most tissues, but is rapidly induced by mitogens, pro-inflammatory cytokines
or growth factors. To investigate the role of COX-2-dependent signaling during the
development of urinary bladder cancer, a transgenic mouse model was used where the
COX-2 cDNA is under control of the bovine Keratin 5-promotor. In marked contrast to the
normal situation, COX-2 is constitutively over-expressed in the basal epithelium of the
urinary bladder which was shown on mRNA- and protein level as well as by
immunfluorescence. Moreover, the spontaneous development of an inflammatory
hyperplastic/dysplastic phenotype accompanied by increased prostaglandin levels in
transgenic were reduced by the COX-2-selective inhibitor Celecoxib. Furthermore, the
spontaneous development of the transitional cell carcinoma (TCC) in transgenic may
occurred along the human TCC pathway via elevated Her-2 level and increased Ras
activation. The COX-2-dependent phenotype in transgenic showed increased prostaglandin
EP2 and EP4 receptor levels which were expressed in tumor cell areas and by
inflammatory cells.
By means of the established 2D-DIGE-Technology the differentially expression of various
enzymes in transgenic was shown, e.g. Prx-2 and GST (phase-II detoxifying and anti-
oxidative stress response enzymes), suggesting an increased oxidative stress. Using in vitro
analysis it was shown that oxidative stress occurred in a COX-2- and PGE2-dependent
manner. The coordinated transcription of phase-II detoxifying and anti-oxidative stress
response genes are regulated by the transcription factor Nrf-2. Its expression was increased
in transgenic and the nucleus translocation occurred COX-2-dependent.
Taken together, the aberrant COX-2 over-expression increased additionally the oxidative
stress and results in a differentially expression of COX-2-dependent downstream targets
which trigger the hyperplastic phenotype and consequently results in the development of
TCC. Therefore, COX-2 is a tremendously important therapeutic target of urinary bladder
cancer.
Abkürzungen
III
Abkürzungen
% Prozent
~ etwa, rund
” Zoll
°C Grad Celsius
µ(X) My
2D-DIGE 2-Dimensionale Differenz-In-Gele-Elektrophorese
A Ampere
AA Arachidonsäure
AC Adenylat-Cyclase
AKT Proteinkinase B
APS Ammoniumpersulfat
ARE Antioxidant responsive element
BCG Bacillus Calmette Guérin
bp Basenpaar
bzw. beziehungsweise
cAMP Cyclic adenosine monophosphate
cDNA kopierte Desoxyribonukleinsäure
CIS Carcinoma in situ
COX Cyclooxygenase
COXib selektive COX-2 Inhibitoren
CREB cAMP response element binding protein
CT Computertomographie
CX Celecoxib
CYP Cytochrom
d. h. dass heißt
DAB Diaminobenzidin
DAG Diacylglycerin
DAPI 4´,6-Diamidino-2-phenylindol
DMEM Dulbeco´s modified eagle´s medium
DNA Desoxyribonukleinsäure
ECL Enhanced chemiluminescence
Abkürzungen
IV
ECM Extra Cellulare Matrix
EET Epoxyeicosatrienoic acid
EGF(R) Epidermal growth factor (receptor)
EPA Eicosapentaensäure
ER Endoplasmatisches Retikulum
Erk Extracellular-signal regulated kinase
ESI (Q-ToF) Elektrospray Ionisation (Time-of-Flight)
ETS E-twenty six-sepcific
FAK Focal Adhesion Kinase
FAP Familial adenomatous polyposis
FDA US Food and Drug Administration
FGFR Fibroblast growth factor receptor
FIH-1 Factor inhibiting HIF-1
g Gramm
GDP Guanosine diphosphate
GM-CSF Granulocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor
GPCR G protein-coupled receptor (G-Protein-gekoppelter
7-Transmembranrezeptor)
GSH Glutathion
GTP Guanosine triphosphate
HE Hämatoxylin/Eosin
Her-2 Human epidermal growth receptor 2, erbB2 (Her-2/neu)
HIF-1 Hypoxia inducible factor 1alpha
HO-1 Hemoxygenase-1
HPETE Hydroperoxyeicosatetraenoic acid
HPLC High performance liquid chromatography
HRE Hypoxia responsive element
HRP Horseradish Peroxidase
IB Immunoblot
IEF Isoelektrische Fokussierung
IF Immunfluoreszenz
IHC Immunhistochemie
kDa kiloDalton
Abkürzungen
V
l Liter
LOH Loss of heterozygosity
LSB Laemmli Sample Buffer
m Masse
M Molar
m(X) milli
MALDI-ToF Matrix-assisted laser desorption/ionization Time-of-Flight
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MEK Extracellular signal-regulated kinase kinase
min Minute
mm Millimeter
MMP Matrix-Metalloproteinase
Mo Monat
mRNA messenger (Boten-) Ribonukleinsäure
MS Massenspektroskopie
MSA Multiple Systematrophie
NF-IL6 Nuclear factor interleukin-6
NFB Nuclear factor kappa b
NL Non-Linear
nm Nanometer
Nrf-2 Nuclear factor, erythroid derived 2, like 2
NSAR Nicht-Steriodale Anti-Rheumatika (NSAID, Non-steroidal anti-
inflammatory drug)
p.A. per Analysis
PBS Phosphate buffered saline
PG Prostaglandin
PI3K Phosphatidylinositol 3-Kinase
PKA Proteinkinase A
PLA2 Phospholipase A2
PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor
Prx Peroxiredoxin
PSD Post source decay
PTEN Phosphatase and tensin homolog
Abkürzungen
VI
PTFE Polytetrafluorethylen
PVDF Polyvinylidenfluorid
Ras Rat sarcoma
RasGEF Ras Guanine nucleotide exchange factor
Rb Retinoblastom
RKI Robert-Koch Institut
RNA Ribonukleinsäure
ROS reaktive Sauerstoffspezie (reactive oxygen species)
rpm Rounds per minute
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Traskriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion
SCC Squamous cell carcinoma
SD Standard derivation
SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
SEM Standard error of mean
TCC Transitional cell carcinoma
Tcf T-cell factor
TCH Transitional cell hyperplasia
TM Temperatur
TPA Tetradecanoyl-Phorbolacetat
TUR Transurethrale Resektion
U Unit
u. a. unter anderem
u. U. unter Umständen
v/v Volume per volume
VEGF Vascular endothelial growth factor
vgl. Vergleich
VHL Von Hippel-Lindau factor
w/v Weight per volume
Wo Woche
z Ladung
z. T. zum Teil
z. B. zum Beispiel
Inhaltsverzeichnis
VII
Inhaltsverzeichnis
Kapitel 1 Einleitung ............................................................................................................. 1
1.1. Proliferation, Apoptose, Krebs, Tumor und Metastasierung .................................. 2
1.2. Harnblase (Vesica urinaria) .................................................................................... 8
1.3. Urothelkarzinom ................................................................................................... 13
1.4. Arachidonsäurestoffwechsel ................................................................................. 19
1.4.1. Prostaglandinendoperoxid-Synthase (COX) ................................................. 24
1.4.2. Prostaglandine und ihre pro- und anti-inflammatorischen Effekte ............... 31
1.5. Cyclooxygenase-2 im Zusammenhang mit dem Urothelkarzinom ...................... 35
Kapitel 2 Zielsetzung ......................................................................................................... 40
Kapitel 3 Material und Methoden .................................................................................... 41
3.1. Material ................................................................................................................. 41
3.1.1. Geräte und Chemikalien ................................................................................ 41
3.1.2. Antikörper ...................................................................................................... 52
3.1.3. Primer ............................................................................................................ 55
3.2. Methoden .............................................................................................................. 57
3.2.1. Mauslinien ..................................................................................................... 57
3.2.2. Entnahme der Harnblase aus Mäusen ............................................................ 58
3.2.3. Proteinisolierung aus der Harnblase .............................................................. 58
3.2.4. Proteinbiochemische Nachweisverfahren...................................................... 63
3.2.5. Immunologische Analysen ............................................................................ 81
3.2.6. Molekularbiologische Analysen .................................................................... 88
3.2.7. Lipidanalytik .................................................................................................. 92
3.2.8. In vitro Analysen ........................................................................................... 95
3.2.9. Statistik .......................................................................................................... 96
Kapitel 4 Ergebnisse .......................................................................................................... 97
4.1. Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Mausmodell ............................................. 97
4.2. COX-2 Proteinexpression und Prostaglandinprofile in der Harnblase
transgener Mäuse ............................................................................................................. 99
4.2.1. Expression und immunhistochemische Lokalisation von
COX-Isoenzymen…. ................................................................................................... 99
4.2.2. Erhöhte Prostaglandinspiegel in der Harnblase transgener Mäuse ............. 102
4.3. Eine Proliferationsstörung bedingt Hyperplasie und spontane
Tumorentstehung…. ...................................................................................................... 105
Inhaltsverzeichnis
VIII
4.4. Die spontane Tumorentwicklung in Harnblase transgener Mäuse erfolgt
entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell ........................................... 108
4.4.1. Erhöhte Her-2 Level in der Harnblase transgener Mäuse ........................... 109
4.4.2. Ras ist in der Harnblase transgener Mäuse aktiviert ................................... 112
4.5. Zusammenhang zwischen COX-2 Überexpression und einem entzündlichen
Phänotyp ........................................................................................................................ 114
4.6. Analyse des Prostaglandin E2 Syntheseweges .................................................... 117
4.6.1. Expression der Prostaglandin E Synthase (PGES-)Isoformen .................... 117
4.6.2. Expression und Lokalisation der Prostaglandin E Rezeptor
(EP-)Isoformen…. ..................................................................................................... 120
4.6.3. K5.COX-2 transgene Mäuse zeigen ein vergleichendes Expressionsprofil
wie humane Urothelkarzinomzelllinien..................................................................... 138
4.7. Gewebliche Proteomanalyse mittels 2-Dimensionaler
Differenz-In-Gel-Elektrophorese-(2D-DIGE-)Technologie ......................................... 143
4.7.1. Etablierung der 2D-DIGE-Technologie ...................................................... 143
4.7.2. COX-2 Überexpression erhöht den oxidativen Stress ................................. 152
4.7.3. Oxidativer Stress verursacht eine erhöhte Expression von Nrf-2 in der
Harnblase transgener Mäuse ...................................................................................... 159
Kapitel 5 Diskussion ........................................................................................................ 192
Kapitel 6 Referenzen ....................................................................................................... 206
Kapitel 1 Einleitung
1
Kapitel 1 Einleitung
Das Urothelkarzinom ist eine zunehmende Tumorerkrankung weltweit (1;2). Als
Hauptrisikofaktoren werden chronische Entzündungen, Bilharziose und das Rauchen
angesehen (3-5). Die dadurch verursachten molekularen Veränderungen wie Mutationen
im p53-Gen, führen zum Beispiel (z. B.) zum invasiven Urothelkarzinom, während der
veränderte funktionelle Status eines Proteins durch Phosphorylierungen (wie im
Retinoblastom, Rb) das Urothelkarzinom begünstigt (6). Auch Dysregulationen in der
Proteinexpression, die unterschiedliche Signalwege aktivieren können und somit
Proliferation begünstigen, wie eine Aktivierung von erbB2 (Her-2/neu, Human epidermal
growth receptor 2), das mit einer schlechten Prognose beim Brustkarzinom im
Zusammenhang steht, tragen zur Entstehung des Urothelkarzinoms bei (7;8). Klinische
Studien zeigten in diesem Zusammenhang, dass die Cyclooxygenase-(COX-)2 Expression
in allen Stadien des Blasentumors erhöht ist (9;10). Darüber hinaus gibt es Hinweise
darauf, dass ein Zusammenhang zwischen COX-2 Expression und der Tumorinvasion
sowie dem klinischen Verlauf bei Patienten besteht (6;11;12). Eine COX-2 Überexpression
wird auch in anderen Tumoren, wie in der Haut oder Brust, im Pankreas oder Colon
beobachtet (13-15). COX-2 ist die durch inflammatorische Zytokine oder
Tumorpromotoren induzierbare Isoform der Cyclooxygenasen im
Prostaglandinstoffwechsel, die den geschwindigkeits-bestimmenden Schritt (committed
step) der Prostaglandinsynthese katalysieren. Prostaglandine wirken über
G-Protein-gekoppelte 7-Transmembranrezeptoren und können eine Reihe von
Signalwegen induzieren, die in der Proliferation, Differenzierung oder Apoptose einer
Zelle münden (16;17). Die Hemmung der COX-2 Aktivität durch spezifische Inhibitoren
(z. B. Celecoxib, CX) zeigten eine deutliche Reduktion in der Tumorlast (18-20). Daher ist
die Analyse des Proteoms der hyperplastisch/dysplastischen Blase von höchster
Bedeutung, um ein COX-2 abhängiges Proteinprofil zu ermitteln, damit gezielt neue
Wirkstoffe gegen das Urothelkarzinom entwickelt werden können.
Kapitel 1 Einleitung
2
1.1. Proliferation, Apoptose, Krebs, Tumor und Metastasierung
Im Organismus wird die Zellzahl im Wesentlichen durch die zwei Vorgänge,
Zellproliferation und Apoptose, kontrolliert.
Die Zellproliferation umfasst die Teilung von Zellen. Dabei wird das genetische Material
der Mutterzelle auf die Tochterzellen (zwei Tochterzellen bei der mitotischen Zellteilung
und vier Tochterzellen bei der meiotischen) übertragen. Die proliferierenden Zellen teilen
sich solange, bis sie Kontakt zu den Nachbarzellen ausgebildet haben. Dann stellen sie
durch Kontaktinhibition ihre Zellteilung ein (21). Ausnahmen bestehen, wenn der Verlust
von Zellen einen Ersatz durch Neubildung notwendig macht, z.B. Zellen in der Umgebung
einer Verletzung oder im Darmepithel (22).
Bei der Apoptose handelt es sich um ein genetisch determiniertes, aktives Sterbeprogramm
der Zelle. Beide Prozesse liegen unter physiologischen Bedingungen in einem streng
kontrollierten Gleichgewicht vor. Eine Verschiebung zugunsten der Apoptose führt zu
einer Hypotrophie, wie sie bei einigen neurologischen Erkrankungen (z. B. Multiple
Systematrophie, MSA) beobachtet wird. Eine Verschiebung zugunsten der Proliferation
führt zur Hypertrophie, die mit der Entstehung von Tumoren sowie
Autoimmunerkrankungen einhergehen kann. In Abbildung 1 ist die Regulation der
Zellzahl schematisch dargestellt.
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Regulation der Zellzahl durch Proliferation, Differenzierung und
Apoptose. In einem neoplastischen Gewebe erfolgt eine Verschiebung der Homöostase zu Ungunsten von
Differenzierung und Apoptose in Richtung Proliferation bzw. einer Blockade der Apoptose. Dies hat einen Anstieg
der Zellzahl zur Folge (23).
einheitliche
Zellpopulation
+
+
-
-
Differenzierung von
Vorläuferzellen
Differenzierung von
reifen Zellen
Proliferation Apoptose
Kapitel 1 Einleitung
3
Unter dem Begriff „Neoplasie“ wird allgemein die abnorme Vergrößerung eines Gewebes
verstanden, welches durch autonome, progressive und überschießende Proliferation
körpereigener Zellen gekennzeichnet ist. Der Begriff „Krebs“ wird im Zusammenhang
maligner Tumore verwendet, die sich von den benignen dahingehend unterscheiden, dass
sie ein infiltratives und destruktives Wachstum sowie die Fähigkeit zur Metastasenbildung
besitzen. Der Begriff „Krebs“ stammt aus dem Lateinischen cancer für Geschwülste, „die
sich im Gewebe festbeißen“ (24).
Tumore, die von den Epithelien ausgehen sind Karzinome und diejenigen mesenchymalen
Ursprungs sind Sarkome.
In der Regel sind Tumore (Karzinome) klonalen Ursprungs und bilden sich aus einer
einzigen „Normal“zelle, wobei der Übergang vom „normalen“ Epithel zum CIS
(Carcinoma in situ) als „Transformation“ bezeichnet wird und durch eine zunehmende
Entdifferenzierung gekennzeichnet ist, z. B. gestörte Position der Zellen zueinander, einer
veränderten Zellform und einem fortschreitenden Verlust der Gewebestrukturen. Durch ein
initiales Ereignis in einer gesunden Zelle erhält diese dann einen Wachstumsvorteil
gegenüber ihren Nachbarzellen, so dass sie infolge dessen zu einem Klon identischer
Zellen expandiert (25). Eine Folge weiterer Ereignisse (Promotion) führt zu weiteren
Wachstumsvorteilen, bis schließlich ein Karzinom wächst, welches sich weitgehend den
Kontrollmechanismen des Wirts entzogen hat (25;26). Das Karzinom invadiert ins fremde
Gewebe und siedelt schließlich Metastasen ab (maligne Progression). Dieser Schritt der
Invasion stellt ein wesentliches Definitionskriterium von Karzinomen dar. Es erfolgt ein
Durchdringen der Basalmembran, woraufhin anschließend die Karzinomzellen in das
subepitheliale Bindegewebe eindringen. Sie invadieren dabei auch in Lymphspalten und
Blutgefäße und können aktiv Bestandteile des Bindegewebes abbauen (Destruktion).
Die Invasion der Karzinomzellen in Blut- und Lymphgefäße stellt den initialen Schritt zur
Metastasierung dar, wobei Mechanismen zum Schutz gegen Apoptose aktiv sein müssen,
um in den Gefäßen zu überleben. Nach der Invasion der Karzinomzellen in das Gewebe,
wie es in Abbildung 2 skizziert ist, werden Angiogenese und desmoplastische
Stromareaktion eingeleitet. Unter Verlust der Zell-Zell-Adhäsion sind einige
Karzinomzellen in invasiv wachsenden Karzinomen in der Lage sich aus dem Zellverband
abzulösen und Fernmetastasen zu bilden. Fernmetastasen bilden sich in etwa 90 % aller
Karzinome in denjenigen Kapillarbetten, in die die Karzinomzelle entsprechend der
anatomischen Lokalisation des Karzinoms zuerst gelangt. Dies kann zum Beispiel über
Kapitel 1 Einleitung
4
eine Embolisierung der Endstrombahn oder durch Adhärenz der Karzinomzelle an das
Endothel erfolgen (23).
Dieser Langzeitprozess der Karzinomentwicklung wird durch das Mehrstufenmodell der
Maushautkarzinogense am besten charakterisiert. Dabei zerlegt es operational und
mechanistisch die gut charakterisierten Teilschritte der Initiation, Promotion und malignen
Progression und bietet eine Grundlage zur Identifizierung karzinomrelevanter Gene sowie
der Funktionsanalyse von definierten genetischen Veränderungen bei der
Karzinomentwicklung (27-30).
Abbildung 2 Eigenschaften eines invasiv wachsenden Karzinoms. Karzinomzellen durchdringen die
Basalmembran und brechen in Blut- und/oder Lymphgefäße ein und bilden so Fernmetastasen (23).
Wie bereits erwähnt, invadieren die Karzinomzellen nach Durchdringen des Endothels das
subendotheliale bindegewebige Stroma, anschließend das Parenchym des betreffenden
Organs und bilden dort solide Metastasen. Dies ist am Beispiel der hämatogenen
Lungenmetastasierung in Abbildung 3 gezeigt. Auch im späten Stadium des
Blasenkarzinoms können in der Lunge Fernmetastasen auftreten.
Einbruch in Lymphgefäße
Destruktion der Basalmembran
Invasion, Verlust des Zell - Zell - Kontakts Entzündungsreaktion ( Leukozyten) Einbruch in Blutgefäße
Angiogenese
Kapitel 1 Einleitung
5
Abbildung 3 Schritte der hämatogenen Metastasierung am Beispiel der Lunge. Zirkulierende Karziomzellen, die
Apoptosemechanismen unterlaufen, adhärieren am Lungenendothel und invadieren ins Stroma, wo sie solide
Lungenmetastasen ausbilden. In diesen Prozess sind aktivierte MMPs (Matrix-Metallo-Proteinasen)
involviert (23).
Lungenmetastase
Extravasion
Adhärenz an das
Lungenendothel und/oder Embolisierung von
Kapillaren
Zirkulierende Karzinomzellen mit anti - Apoptose - Mechanismen und
aktivierten MMPs
Kapitel 1 Einleitung
6
Die soliden Karzinome bestehen aus den eigentlichen Karzinomzellen und den
akzessorischen Zellen, zu denen die Endothelzellen, die Fibroblasten und ggf.
Immunzellen (Leukozyten, Lymphozyten) gehören. Letztere sind immer Ausdruck von
Entzündungsreaktionen, die bei der Tumorentstehung beobachtet werden können (13).
Hingegen wird die Phagozytose nekrotischer Gewebsbestandteile den Makrophagen
zugeschrieben.
Unter physiologischen Bedingungen verhindert das Apoptoseprogramm „heimatloser“
Zellen (Anoikis) die Ansiedlung ins fremde Gewebe. Metastasierende Zellen unterlaufen
jedoch diese physiologische Kontrolle, da sie nicht mehr auf den Kontakt zur ECM (Extra
Cellulare Matrix) angewiesen sind und somit unter pathophysiologischen Bedingungen
überleben können. Möglicherweise ist die FAK (Focal Adhesion Kinase) für das
Überleben der adhärenten Zellen verantwortlich, denn eine konstitutive FAK Aktivierung
in Endothelzellen führt zum Ausbleiben des Apoptoseprogramms nach dem Verlust ihrer
Adhärenz zur ECM (31), so dass die Produktion von mutiertem, konstitutiv aktivem Ras
(Rat sarcoma) über die PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase) das eigentliche Integrin
vermittelte Signal zur Hemmung der Apoptose ersetzten könnte, wie es Abbildung 4
schematisch darstellt.
Alternativ zu diesem Signalweg, wäre eine verstärkte FAK Expression, wie sie im
Kolorektal- und Mammakarzinom beobachtet wird (32).
Andererseits führt ein konstitutiv aktiviertes Ras zur Aktivierung von Erk-1/-2
(Extracellular-signal regulated kinase), welches einerseits die cytoplasmatische PLA2
(Phospholipase A2) aktiviert, die ihrerseits Arachidonsäure, dem unmittelbaren Substrat
der Cyclooxygenasen, freisetzt und andererseits die Genexpression durch Phosporylierung
von Transkriptionsfaktoren der ETS-Familie (E-twenty six-sepcific) fördert, zu der die
MMP (Matrix-Metalloproteinase), GM-CSF (Granulocyte/Macrophage-Colony
Stimulating Factor) und auch die COX-2 (Cyclooxygenase-2) gehören. Diese induzierten
Gene sind alle an Vorgängen der Tumorinvasion und Tumorstromabildung sowie der
Wachstumskontrolle beteiligt.
Kapitel 1 Einleitung
7
Abbildung 4 Hemmung der Apoptose durch Aktivierung der PI3K durch ECM gebundene Integrine. Mutiertes,
konstitutiv aktives Ras kann über die PI3K das eigentliche Integrin vermittelte Signal zur Hemmung der
Apoptose ersetzten (23). RasGEF (Ras Guanine nucleotide exchange factor), GTP (Guanosine triphosphate), GDP
(Guanosine diphosphate), AKT (Proteinkinase B).
Kapitel 1 Einleitung
8
1.2. Harnblase (Vesica urinaria)
Die Harnblase (Vesica urinaria) ist ein sackförmiges Hohlorgan und befindet sich im
Becken unter dem Bauchfell, direkt hinter der Schambeinfuge (Symphyse) (33).
Die Funktion besteht in der Ansammlung des aus den Nieren kommenden Harns sowie
dessen Ausscheidung über die Harnleiter (Urethra). Dabei bilden die Nieren und die
Ureteren den oberen Abschnitt des Urogenitaltraktes, die Blase und die Harnröhre den
unteren. Über die Urinausscheidung erfolgt die Regulation des Wasser- und Salzhaushaltes
des Körpers. Die Leerung der Harnblase erfolgt im Wesentlichen über den Schließmuskel
der Harnröhre. Ein Harndrang wird bereits bei ungefähr 300 ml ausgelöst, wobei die
Harnblase eines ausgewachsenen Menschen bis zu einem Liter Flüssigkeit aufnehmen
kann. Bei einer längeren Behinderung des Abflusses kommt es zu einem zeitabhängigen
Anstieg der Cyclooxygenase-2 Expression verbunden mit erhöhtem Prostaglandin
PGE-2-Level (34). Damit löst bereits mechanischer Stress der Harnblase eine Expression
von COX-2 aus.
Im gefüllten Zustand weißt die Harnblase eine kugelförmige Form auf, während im leeren
die Harnblase einen schlaffen Sack gleicht. Die Harnblase lässt sich in vier Abschnitte
einteilen:
Harnblasenspitze oder Harnblasenscheitel (Apex vesicae – Verbindung zum
Nabel über das Nabelband),
Harnblasenkörper (Corpus vesicae – Großteil der Harnblasenwand),
Harnblasengrund (Fundus vesicae – Boden der Harnblase),
Harnblasenhals (Übergang zur Harnblase).
Die für die Entleerung der Blase wichtige verflochtene glatte Muskulatur (Musculus
detrusor) umgibt die Harnblase als mittlere Wandschicht. Die äußere Wandschicht ist von
Nerven-, Blut- und Lymphgefäßen durchzogen. Die innere Wandschicht besteht aus
Schleimhaut mit Übergangsepithel (Epithelium transitionale), die sich den ständigen
Volumenveränderungen anpassen kann.
Innerhalb des Blasendreiecks (Trigonum vesicae, befindet sich zwischen den
Harnleiterschlitzen und dem Abgang der Harnröhre) ist die Schleimhaut im Vergleich zu
Kapitel 1 Einleitung
9
den übrigen aufgefalteten Bereichen glatt. Abbildung 5 zeigt einen Überblick der
männlichen und weiblichen Harnblase (35).
Mikroskopisch betrachtet kann die Harnblase aufgrund des weitgehend übereinstimmenden
anatomischen Aufbaus als dreischichtiger, erweiterter Harnleiter betrachtet werden (36).
Der dreischichtige Wandaufbau setzt sich zusammen aus:
Tunica mucosa,
o Übergangsepithel,
o Submucosa,
Tunica muscularis,
Tunica adventitia,
der in Abbildung 6 dargestellt ist.
Abbildung 5 Aufbau der männlichen (A) und weiblichen (B) Harnblase. Am unteren Scheitel befinden sich bei der
männlichen Harnblase die Samenbläschen und die Prostata (35).
HarnblaseHarnleiter
Samenleiter
Samenbläschen
ProstataMuskelschicht
Harnblase
linker und rechter
Harnleiter
A B
Kapitel 1 Einleitung
10
Abbildung 6 Ureterwand (Harnleiterwand). Die Harnblase zeigt den dreischichtigen Aufbau einer
Harnleiterwand (van Gieson, Vergrößerung x 100) (37).
Wie bereits erwähnt ist die Harnblase innen mit dem Epithelium transitionale ausgekleidet,
das je nach Harnblasenfüllstand zwei bis 14 Zelllagen aufweist (s. Abbildung 7). Es
beginnt am Rand der Nierenkelche und endet im proximalen Teil der Urethra. Das
Epithelium transitionale dient dem darunter liegendem Gewebe als Barriere gegen den
hypertonen Harn. Dieser Schutz wird durch eine ausgeprägte Glykokalix sowie sehr
wirksamen Tight-junctions gewährleistet. Die Tight-junctions verhindern unter anderem
den Wasseraustritt vom umliegenden Gewebe in den Harn.
Abbildung 7 Querschnitt einer kontrahierten Harnblase einer Maus. Die Schleimhaut legt sich in starke Falten
zusammen (Hämatoxylin/Eosin-(HE-)Färbung, Vergrößerung x 16).
Übergangsepithel
Submucosa
Tunica muscularis
Lumen
Deckschicht des
Urothels
Mucosa (Urothel)
Submucosa
Blutgefäß
Tunica muscularis
Kapitel 1 Einleitung
11
Die Basalmembran ist asymmetrisch, denn die äußere Lamelle ist mit 8 nm dicker als die
innere mit 2-3 nm. Hervorstechend ist in diesen Membranen der hohe Anteil an
Zerebrosiden als Träger polarer Gruppen sowie integrale Membranproteine, die in
diskusförmigen Vesikeln gespeichert sind (37). Die Vesikel werden bei einer Dehnung in
das lumenwärtige Plasmalemm eingebaut. In der darunter liegenden Zellschicht wechseln
sich Aktin- und Intermediärfilamente ab. Hieran schließt sich die Submucosa an, die aus
einem lockeren, elastischen Bindegewebe besteht. Die Submucosa ist scherenförmig
angeordnet und bildet eine bewegliche Verschiebeschicht. In Querschnitten zeigt sich,
aufgrund der unterstützenden Faltenbildung der Harnblasenwand, ein sternförmiges Lumen
(Abbildung 8).
Nur das Trigonum vesicae bildet eine Ausnahme. Hier ist die Muskelschicht mit der
Schleimhaut fest verwachsen und daher faltenfrei.
Abbildung 8 Übersichtsaufnahme eines Querschnitts der Harnblase. (Schwein, HE-Färbung, Vergrößerung
x 10) (36).
Besonders bei Tieren treten Lymphfollikel in der Submucosa auf. Die an die Submucosa
anschließende Tunica muscularis besteht aus kräftigen Lagen glatter Muskulatur, die
vorwiegend spiralig angeordnet und netzförmig verflochten sind. Des Weiteren ist das
Gewebe durch viele Kollagene aufgelockert. Die Muskulatur gliedert sich in drei
Längsorientierungen. In Abbildung 9 ist gezeigt, dass einer mittleren, zirkulären
Mucosa
Submucosa
Tunica muscularis
Kapitel 1 Einleitung
12
Muskellage zu beiden Seiten dünnere, längsorientierte Muskelschichten anliegen, die
ebenfalls schraubenförmig angeordnet sind, so dass die Muskulatur teils quer, schräg und
längs in Querschnitten zu sehen ist (s. Vergleich Abbildung 6). Dieser dreidimensionale,
spiralig angeordnete Faserverlauf sorgt für eine kontinuierliche, gleichmäßige Kontraktion
der Harnblasenwand. Lediglich im Bereich des Blasenhalses und des -scheitels lagern sich
die Fasern zu engen Schleifen zusammen und lassen die Muskulatur glatt erscheinen.
Abbildung 9 Spiralig angeordnete glatte Muskulatur der Harnblasenwand (Ziege, Goldner-Färbung,
Vergrößerung x 250) (36).
Die von der Harnblasenwand ableitenden Harnwege werden von der Tunica adventitia
umgeben. Gleichzeitig verbindet sie damit die Harnwege mit dem umliegenden Gewebe.
Dem Verschluss der Harnblase dient der Kreismuskel Musculus sphincter vesicae.
Die Motorik der Harnblase sowie der Gefäßwände werden durch sympathische und
parasympathische Nervenfasern gesteuert. Diese Innervation geht von einem vegetativen
Plexus (verzweigte Nervenfasern) aus. Die Ganglienzellen liegen vorwiegend zwischen
den Muskelfaserschichten (intramurale Ganglien). Zahlreiche sensible Nerven kommen
noch zusätzlich subepithelial und intraepithelial vor.
Nur während der fetalen Entwicklungsphase, aber nicht unter physiologischen
Bedingungen ist eine erhöhte Expression von COX-2 in der Vorläuferharnblase
nachweisbar. Dessen Reaktionsprodukte aktivieren Signalkaskaden für Differenzierung,
Kapitel 1 Einleitung
13
Proliferation und Angiogenese (34;38). Mechanischer Stress verursacht eine erhöhte
COX-2 Expression in der glatten Muskulatur. Zudem können auch Zigarettenrauch und
chronische Entzündungsprozesse hervorgerufen durch Bakterien, Viren, und Trematoden
(Saugwürmer - Bilharziose oder Schistosomiasis genannt) eine COX-2 Expression in der
Harnblase induzieren und damit das Risiko am Urothelkarzinom zu erkranken erhöhen
(4;39-41).
1.3. Urothelkarzinom
Karzinome der Harnblase liegen bei Männern auf Platz vier und bei Frauen auf Platz sechs
aller Karzinomerkrankungen, während es als Todesursache beim Mann auf Position sechs
und bei Frauen auf Position acht rangiert (2;42). Nach Angaben des Robert-Koch Institut
(RKI) in Berlin erkranken ~ 16000-25000 Menschen jährlich neu in Deutschland (33;43).
Das Urothelkarzinom tritt im höheren Lebensalter auch zunehmend bei Frauen auf. Zu den
Risikofaktoren gehört an erster Stelle der gesteigerte Zigarettenkonsum (44;45), des
Weiteren eine vermehrte Strahlenbelastung (46), sowie die erhöhte Exposition von
Arylaminderivaten (z.B. Anilin) (3). Diese karzinogenen Substanzen werden in der Niere
aus dem Blut gefiltert und gelangen mit dem Urin in die Harnblase, wo sie bis zur
Ausscheidung verweilen und bis dahin das Gewebe schädigen können. Aber nicht nur
kanzerogene Substanzen stehen im Zusammenhang mit der Entstehung von
Urothelkarzinomen, sondern auch chronische Entzündungen (Zystitis), die mit dem
Plattenepithelkarzinom assoziiert sein können, und mechanischer Stress, bei denen es zu
vermehrten COX-2 Expressionen u. a. in der Tunica muscularis mit erhöhten
Prostaglandinspiegeln kommt (34), oder über Jahre anhaltenden tropische
Infektionskrankheiten (Bilharziose) (4). Die beginnende Blasenkarzinogenese wird
begleitet durch Zystitis (Entzündung der Harnblasenschleimhaut) und eine meist
schmerzfreie Hämaturie (Blut im Harn), die sich zu einer Makrohämaturie und eine meist
unilaterale Harnstauung entwickeln kann (spätes Stadium, abhängig von der
Tumorlokalisation). In der weiteren Karzinogenese kommt es zur Pollakisuri (Drang zu
häufigem Wasserlassen ohne vermehrte Ausscheidung) sowie zur Dysurie (schmerzhafter
Harndrang mit Erschwernis des Wasserlassens) (47). Neben wesentlichen diagnostischen
Kapitel 1 Einleitung
14
Verfahren sollte ergänzend eine Ultraschalluntersuchung und CT-Untersuchung sowie eine
Lungenröntgenaufnahme und Knochenszintigraphie erfolgen, um Fernmetastasen
ausschließen zu können bzw. entsprechende Therapiemaßnahmen einzuleiten.
Wie aus Abbildung 10 hervorgeht handelt es sich beim Blasenkarzinom in 90 % der
erkrankten Betroffenen um das Urothelkarzinom (TCC, Transitional Cell Carcinoma).
Daneben finden sich Plattenepithelkarzinome (SCC, Squamous Cell Carcinoma),
Adenokarzinome, kleinzellige und undifferenzierte Karzinome.
Abbildung 10 Einteilung des Urothelkarzinoms. Der häufigste Gewebetyp beim Blasentumor ist das
Urothelkarzinom (90 %). Seltener kommen Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinom oder Sarkome vor.
Im Gegensatz zur FAP (Familial adenomatous polyposis) ließ sich beim Urothelkarzinom
bislang noch keine familiäre Disposition feststellen. Beim Urothelkarzinom liegt der
Ursprung des Primärtumors im Übergangsepithel. Von dort erfolgt eine Invasion primär in
die Blase (Blasenkarzinom) oder in das Nierenbecken (Urothelkarzinome des
Nierenbeckens) sowie Harnröhre und Harnleiter (47). Die Ursache für die Entstehung des
Blasenkarzinoms liegt auf molekularer Ebene. Eine somatische Inaktivierung des zweiten
Allels führt zum Verlust des heterozygoten Charakters (LOH = loss of heterozygosity),
90 % Urothelkarzinom (TCC) 3-5 % Plattenepithelkarzinome (SCC) 0,2-2 % Adenokarzinome < 1 % Sarkomas, Metastasen primärer
Karzinome
Kapitel 1 Einleitung
15
dass den onkogenen Effekt potenziert und eine nicht regulierte Zellteilung zur Folge hat.
Die beim Blasenkarzinom beteiligten Chromosomen sind 11p und 13q (48). Das beteiligte
Chromosom 13q ist unter anderem auch bei der Karzinogenese des Lungen- und
Brustkarzinoms, beim Retinoblastom, Osteosarkom und hepatozellulären Karzinom
involviert (49-54).
Das zu 90 % auftretende Urothelkarzinom (TCC) wird klinisch zwischen dem papillären
Urothelkarzinom und dem invasiven Urothelkarzinom unterschieden (s. Abbildung 11).
Beim selten auftretenden invasiven Urothelkarzinom (20 %) entwickelt sich das normale
Epithel als Folge einer Mutation im Tumorsuppressorgen p53 bzw. Proteinprodukt oder
verminderten Retinoblastomaktivität in eine Dysplasie bzw. Carcinoma in situ. Die Hälfte
der Betroffenen stirbt innerhalb von zwei Jahren aufgrund von Fernmetastasen (55). Das
sehr häufig auftretende papilläre Urothelkarzinom zeigt bei sehr frühzeitiger Diagnose eine
hohe 5-Jahres-Überlebensrate (11;56). Als Folge einer molekularen Aberration von H-Ras
(harvey-Ras), FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3) und/oder Her-2 kommt es zu
einer Hyperplasie des Übergangszellepithels, welches sich zu einem gut differenzierten,
nicht-invasiven Urothelkarzinom entwickelt. Einige derzeitige Behandlungsmethoden
stellen die radikale Zystektomie (Harnblasenentfernung), BCG (Bacillus Calmette Guérin,
bezeichnet ein abgeschwächtes, nicht mehr krankheitserregendes Rindertuberkelbakterium,
welches das natürliche Abwehrsystem des Körpers gegen den Blasenkrebs direkt in der
Blase anregt und aktiviert) oder TUR (Transurethrale Resektion) dar, wobei in 70 % der
Fälle nach TUR das Karzinom wiederkehrt und in eine Dysplasie übergeht. Da die
Dysplasie durch weitere Aberrationen in ein invasives Karzinom übergehen kann und
schließlich metastasiert, sinkt dramatisch die 5-Jahres-Überlebensrate der Betroffenen bei
Diagnose des Stadiums (1;6;12;55;57-62).
Kapitel 1 Einleitung
16
Abbildung 11 Das zu 90 % auftretende Urothelkarzinom (TCC) wird klinisch zwischen dem papillären
Urothelkarzinom und dem invasiven Urothelkarzinom unterschieden (Erklärung siehe Text; Abbildungen zum
Teil übernommen aus (59)).
normales
Urothelium
invasives TCC
gut differenziertes, nicht-
invasives, papilläres TCC
hochgradige Dysplasie
nach TUR (70 %)
Papilläres Urothelkarzinom
(80 %)
Invasives Urothelkarzinom
(20 %)
Dysplasie/CIS
p53mut
RB ↓
Hyperplasie
H-rasmut
FGFR3mut
(HER-2 ↑ )
50 %Metastasierung
15 %
p53mut
RB ↓
Kapitel 1 Einleitung
17
Das maligne Wachstum der Blasenkarzinome ist sehr unterschiedlich, so dass eine
Klassifizierung für weitere Behandlungsmaßnahmen von entscheidender Voraussetzung
ist. Das wichtigste Kriterium dabei ist, wie weit sich der Tumor ausgebreitet hat. Dabei
lässt sich die Tumorausbreitung in verschiedene Stadien einteilen. Maßgebend für diese
Einteilung sind drei Gesichtspunkte TNM:
T kennzeichnet die Größe eines Tumors,
N kennzeichnet die Zahl und Lokalisation der befallenen Lymphknoten,
M kennzeichnet das Auftreten und die Lokalisation von Metastasen.
Es handelt sich hierbei um die sogenannte TNM-Klassifikation (Tabelle 1), die
prognostische Aussagen erlaubt und auch häufig die weitere Therapie bestimmt.
Ein wiederkehrendes Ereignis im Vergleich mit anderen Karzinomen ist, dass es auch beim
Blasenkarzinom in den unterschiedlichen Tumorgraden und -stadien zu einer erhöhten
Expression von Cyclooxygenase-2 mit einem gleichzeitigen Anstieg an Prostaglandinen
kommt (63-66).
Kapitel 1 Einleitung
18
Tabelle 1 Klassifikation des Tumors nach der TNM-Nomenklatur (33).
T Primärtumor
Tx Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0 kein Anhalt für Primärtumor
Ta nicht invasives papilläres Karzinom
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor infiltriert subepitheliales Bindegewebe
T2 Tumor infiltriert Muskulatur
T3 Tumor infiltriert Fettgewebe
T4
Tumor infiltriert benachbarte Organe (z.B. Prostata, Enddarm, Uterus,
Vagina)
N benachbarte (regionäre) Lymphknoten
Nx benachbarte Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0 keine benachbarten Lymphknotenmetastasen
N1
Metastase in einzelnem (solitärem) Lymphknoten, 2 cm oder weniger in
größter Ausdehnung
N2
Metastase in einzelnem (solitärem) Lymphknoten, mehr als 2 cm, aber
weniger als 5 cm in größter Ausdehnung oder in mehreren (multiplen)
Lymphknoten, jedoch keine mehr als 5 cm
N3 Metastasen in Lymphknoten, mehr als 5 cm in größter Ausdehnung
M Fernmetastasen
Mx keine Beurteilung von Fernmetastasen
M0 keine Fernmetastasen
M1 Fernmetastasen
Kapitel 1 Einleitung
19
1.4. Arachidonsäurestoffwechsel
In den 30-iger Jahren wurde eine Gruppe von Hormonen im menschlichen Sperma von Ulf
von Euler und M. W. Goldblatt entdeckt, die eine uteruskontrahierende und
blutdrucksenkende Wirkung besitzen. Aufgrund der Annahme ihrer Herkunft aus der
Prostatadrüse wurden sie als Prostaglandine (PG) bezeichnet. Mitte der 40-iger Jahre
wurde herausgefunden, dass diese Prostaglandine in der Samenblase synthetisiert werden.
Die ersten Strukturaufklärungen dieser Stoffklasse erfolgte 1958-1964 durch Bergström
(67). Chemisch betrachtet handelt es sich bei den Prostaglandinen um Derivate der
Prostansäure, so dass sie auch unter dem Begriff Prostanoide bekannt sind. Somit handelt
es sich bei PGA um ,-ungesättigte Ketone, bei PGE um -Hydroxyketone und PGF um
1,3-Diole. Charakteristisches Merkmal der Prostaglandine ist der Cyclopentanring. Bei der
Bezeichnung geben die Indizes die Anzahl der Doppelbindungen im Molekül wieder. Die
Stellung der Hydroxygruppe am C9-Atom im Cyclopentanring wird durch den Index
bzw. beschrieben. Befindet sich die Hydroxygruppe auf derselben Seite wie der Ring, so
handelt es sich um das -Derivat, während es sich bei gegenüberliegender Anordnung um
das -Derivat handelt.
Bis auf die roten Blutkörperchen produzieren alle Säugerzellen Prostaglandine, sowie die
mit ihnen verwandten Verbindungen Leukotriene, Prostacyclin und Thromboxane. Nur die
Blutplättchen bilden ausschließlich die Thromboxane. In ihrer Gesamtheit werden sie als
Eicosanoide bezeichnet, da es sich um C20-Verbindungen handelt (eicos: griechisch,
zwanzig) (68). Eicosanoide besitzen hormonähnliche Wirkungen, da viele ihrer Wirkungen
intrazellulär über cAMP (Cyclic adenosine monophosphate) übertragen werden. Jedoch
sind Eicosanoide chemisch und biologisch instabiler als Hormone, so dass es sich um
lokale Mediatoren handelt.
Die wichtigste Vorstufe der Prostaglandine bildet die Arachidonsäure
(5,8,11,14-Eicosatetraensäure). Es handelt sich um eine ω-6-Fettsäure. Deren Freisetzung
erfolgt in erster Linie durch die katalytische Aktivität der Phospholipase A2, kann aber
auch über die Phospholipase C und anschließender Diacylglycerin-Kinase- bzw.
Diacylglycerin-Lipase-Aktivität erfolgen. Nur Prostaglandine mit dem Index 2 (sogenannte
Typ-2 PG) werden aus der Arachidonsäure synthetisiert, während sich die Typ-1 PG von
der 8,11,14-Eicosatriensäure und die Typ-3 PG von der 5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure
(EPA) ableiten. Beim Menschen kommen überwiegend Typ-2 Prostaglandine vor.
Kapitel 1 Einleitung
20
Die freigesetzte Arachidonsäure kann in drei Stoffwechselwegen münden (Abbildung 12),
dem sogenannten cyclischen Weg (Cyclooxygenase-Weg), der zur Synthese der
Prostanoide führt, der lineare Weg (Lipoxygenase-Weg), der die Synthese der HPETE
(Hydroperoxyeicosatetraenoic acids) und Leukotriene beinhaltet, sowie die Umsetzung
von Arachidonsäure durch Cytochrom P450-Enzyme zu EETs (Epoxyeicosatrienoic acids)
(17;69).
Der cyclische Weg beginnt mit der Umsetzung der Arachidonsäure zu Prostaglandin H2
(PGH2) durch die Prostaglandinendoperoxid-Synthase (EC 1.14.99.1 PGH, PGHS, COX)
(70). Dieses Enzym besitzt zwei katalytische Aktivitäten. Die Cyclooxygenase-Aktivität
katalysiert die Addition von zwei Molekülen Sauerstoff an die Arachidonsäure. Dabei
entsteht das instabile Zwischenprodukt PGG2, welches sofort durch die Hydroperoxidase-
Aktivität in einer glutathionabhängigen Reaktion in PGH2 überführt wird, in dem die
Hydroperoxidgruppe am C15 in eine Hydroxygruppe reduziert wird (Abbildung 13) (71).
Dieser erste Reaktionsschritt stellt den „committed step“ der Prostaglandinbiosynthese dar
(72), der durch die beiden Isoenzyme Cyclooxygenase-(COX-)1 und -2 gleichermaßen
katalysiert werden kann.
Das PGH2 stellt die Vorstufe sowohl für weitere Prostaglandine als auch für Prostacyclin
und Thromboxan dar (s. Abbildung 14). Diese Umsetzungsreaktionen werden durch
gewebsabhängige Synthasen katalysiert. Die biologisch aktiven Prostanoide können
intracin, autocrin, endocrin oder paracrin wirken und eine Reihe von Signalwegen
aktivieren.
Kapitel 1 Einleitung
21
Abbildung 12 Umsetzung von Arachidonsäure. Durch die katalytische Aktivität der PLA2 (Phospholipase A2)
wird Arachidonsäure aus der Membran freigesetzt und kann in drei Stoffwechselwegen münden, dem
Lipoxygenase-Weg, dem Cyclooxygenase-Weg oder dem Cytochrom P450-Weg.
Prostaglandine
Thromboxan
Prostacyclin
Leukotriene
Hydroxyeicosa-
tetraensäuren
Epoxyeicosa-
triensäuren
P450 Lipoxygenasen
Cyclooxygenasen
Arachidonsäure
Kapitel 1 Einleitung
22
Abbildung 13
Synthese von
PGH2 aus
Arachidonsäure
(AA) durch die
Prostaglandin-
endoperoxid-
Synthase (COX-1
und COX-2);
COX-1/-2 besitzen
eine Cyclo-
oxygenase- sowie
Hydroperoxidase-
Aktivität und sind
als Homodimere
katalytisch aktiv;
PGH2 ist die
Vorstufe weiterer
Prostaglandine,
sowie Prostacyclin
und Thromboxan;
PGG2 – instabiles
Zwischenprodukt;
GSH – Glutathion
(reduziert), GSSG
– Glutathion
(oxidiert) (68).
2 GSH
GSSG
Cyclooxygenase-Aktivität
Hydroperoxidase-Aktivität
AA
PGG2
PGH2
Kapitel 1 Einleitung
23
Abbildung 14 PGH2 dient als Vorstufe weiterer Prostaglandine sowie Prostacyclin und Thromboxan. Die
Umsetzung erfolgt durch gewebsspezifische Prostaglandin Synthasen in ihre biologisch aktiven Formen. Durch
nicht- bzw. enzymatische Hydrolyse erfolgt die Inaktivierung der Prostanoide; PG = Prostaglandin,
Tx = Thromboxan. (67;68;73;74)
O
O COOH
OH
OH
O
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
O
OH
COOH
OH
OH
O
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
O
O
COOH
OH
O
O
COOH
OH
OH
OH
OH
O
COOH
O
PGE2
PGF2
PGD2
PGH2
PGI2 (instabil)
6-oxo PGF1
TxA2 (instabil)
TxB2
nicht-enzymatischeHydrolyse
nicht-enzymatischeHydrolyse
Thromboxan-SynthaseProstacyclin-Synthase
1. Prostaglandin-15-Dehydrogenase2. Prostaglandin-13-Reduktase
inaktiv
Synthasen
Kapitel 1 Einleitung
24
1.4.1. Prostaglandinendoperoxid-Synthase (COX)
Prostaglandinendoperoxid-Synthase (Cyclooxygenasen, COX) katalysieren die
Oxygenierung von C20-Fettsäuren durch zwei Moleküle Sauerstoff. Der Name „cyclo“
bezieht sich auf den Fünfring im Reaktionsprodukt Prostaglandin H2, der durch die
Verknüpfung der C-Atome 8 und 12 entsteht (s. Abbildung 13).
Drei Isoformen der Cyclooxygenasen sind unter dem Namen COX-1, COX-2 und COX-3
bekannt. Die beiden Membran-gebundenen Hämglycoproteine COX-1 und COX-2 zeigen
eine 60 %-ige Sequenzhomologie auf, wie aus Abbildung 15 hervorgeht, und katalysieren
in einer Zwei-Stufen-Reaktion die Umsetzung von Arachidonsäure zu PGH2 mit ähnlicher
Kinetik, obwohl sie unterschiedliche Lipid-Reservoire nutzen. COX-1 synthetisiert
Prostaglandine nur am endoplasmatischen Retikulum (ER), während die PG-Synthese von
COX-2 sowohl am ER als auch an der nukleären Hülle (neclear envelope) erfolgt (75).
Während COX-1 ein stabiles Protein ist, wird COX-2 schnell durch Ubiquitinierung im
26S Proteasom abgebaut. Für die Degradierung essentiell ist die Insertion einer
19-Aminosäurekassette mit zusätzlicher Glykolysierungsstelle in der Nähe vom
C-Terminus (Abbildung 15). Für den proteosomalen Abbau wird COX-2 vom ER ins
Cytosol transportiert (76).
COX-1 und COX-2 sind als Homodimere mit Kopf-Schwanz-Polarisierung katalytisch
aktiv. Von der COX-3 ist noch sehr wenig bekannt (77).
1.4.1.1. Cyclooxygenase-1
Vor 30 Jahren wurde COX-1 isoliert und 12 Jahre später kloniert (78). Das Gen der
Isoform (Ptges1) befindet sich auf dem Chromosom 9 (s. Tabelle 2) (79;80). Der
Promotorbereich weißt mehrere Startpunkte für die Transkription ohne das Vorhandensein
einer TATA-Box auf (81). COX-1 besitzt ein Molekulargewicht von 70 kDa und wird
konstitutiv in allen Geweben exprimiert. Seine katalytische Aktivität bleibt unter
physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen weitgehend konstant (17). Durch
COX-1 synthetisierte Prostaglandine sind in vielen physiologischen Prozessen
eingebunden, wie z. B. bei der Regulation des Blutflusses (82), der Aggregation von
Blutplättchen (83) sowie dem Schutz der Magenschleimhaut vor Selbstverdauung (84).
Kapitel 1 Einleitung
25
Die Cyclooxygenase-(Cox-) und Hydroperoxidase-Aktivität sind in räumlicher Nähe
voneinander getrennt. Die Cox-aktive Seite ergibt einen langen hydrophoben Kanal mit
Tyrosin 385 und Serin 530 am Scheitel. Nicht-Steroidale Anti-Rheumatika (NSARs), wie
z. B. Ibuprofen und Aspirin blockieren die Cox-Aktivität von COX-1 durch Ausbildung
von Wasserstoffbrückenbindungen am Arginin 120, woraufhin der Zugang von
Arachidonsäure in das katalytische Zentrum verhindert wird, wie in Abbildung 15
schematisch dargestellt. Aspririn acetyliert zusätzlich irreversibel Serine 530. Die
Hydroperoxidase-Aktivität bleibt davon unberührt.
1.4.1.2. Cyclooxygenase-2
Erst 1991 wurde eine weitere Form der Cyclooxygenasen, aufgrund der anti-
inflammatorischen Wirkung der NSARs, entdeckt, COX-2 (77;81;85-87). Das Ptges2 Gen
ist auf Chromosom 1 lokalisiert (s. Tabelle 2). Die Unterschiede zwischen COX-1 und
COX-2 sind zum einen, dass das Intron 1 von COX-1 im COX-2 Gen fehlt und zum
anderen sind die Introns im COX-2 Gen wesentlich kürzer. Das längste Exon im COX-2
Gen bildet der 3´-untranslatierte Bereich (3´-UTR). Die 5´-flankierende Promotorregion
von COX-2 weißt zahlreiche Konsensus cis-Elemente auf, die eine komplexe Regulation
der Transkription unabhängig voneinander oder synergistisch ermöglichen. Zu diesen
gehören eine TATA-Box, ein NF-IL6 (nuclear factor interleukin-6) sowie ein Cre Motiv,
eine E-Box, des Weiteren zwei NFB (nuclear factor kappa b), zwei AP2 und drei Sp1
Bindungsstellen (81). Die COX-2 Gene besitzen ähnliche Sequenzstrukturen bei Maus,
Ratte, Kuh und Pferd. COX ist ein entfernt verwandtes Mitglied der Peroxidasefamilie und
die Genduplikation erfolgte vor der Verzweigung zwischen den Vögeln und Säugetieren.
Anders als COX-1 wird COX-2 in den meisten Geweben nicht exprimiert, sondern wird
durch pro-inflammatorische Zytokine (z. B. bakterielle Lipopolysaccharide LPS),
Hormone (Östrogen), Mitogene und Tumorpromotoren (TPA, Tetradecanoyl-
Phorbolacetat), Wachstumsfaktoren, Onkogene oder durch mechanischen Stress induziert
(34;88;89). Des Weiteren üben die COX-2 abgeleiteten Prostanoide sowohl physiologische
Funktionen, z. B. bei der Ovulation und Eiimplementation, als auch pathophysiologische
Funktionen, z. B. beim Fieber, bei Entzündungsprozessen und insbesondere bei der
Karzinomentstehung bzw. beim -wachstum, aus (90). Aufgrund der raschen Aktivierung
Kapitel 1 Einleitung
26
bei Entzündungsprozessen wird COX-2 auch als „inflammatorisches Notfallenzym“
bezeichnet. Im Gegensatz zur COX-1 kann die COX-2 Transkription durch
Glucocorticoide und anti-inflammatorische Zytokine gehemmt werden (80).
Aufgrund der hohen Sequenzhomologie zu COX-1 kann die katalytische Aktivität von
COX-2 ebenfalls durch NSARs blockiert werden. Untersuchungen zeigten, dass die anti-
inflammatorischen, analgetischen und antipyretischen Effekte der NSARs durch
Inhibierung der COX-2 zustande kommen, während die antithrombotischen und
bekannten, nachteiligen Effekte auf die Inhibierung der COX-1 zurückzuführen sind. Die
Hemmung der katalytischen Aktivität durch NSARs führt zum Verlust der Synthese von
PGH2 beider Enzyme. Da die Hydroperoxidase-Aktivität nicht inhibiert wird erfolgt nach
Gabe von Aspirin die Umsetzung von Arachidonsäure zu 12-R oder
15-R-Hydroxyeicosatetraensäure (12-/15-R-HETE) durch COX-2, während COX-1
vollständig inaktiviert ist (86;91;92). Jedoch ist der Kanal zum katalytischen Zentrum von
COX-2 wesentlich größer (ca. 17 %), da an Position 523 die Aminosäure Isoleucin durch
das kleinere Valin ausgetauscht ist (s. Abbildung 15). Dies bildet einen sterischen
Freiraum, der es ermöglicht, spezifische COX-2 Inhibitoren (COXibs, z. B. Celecoxib,
Rofecoxib) zu entwickeln und damit die Nebenwirkungen der NSARs zu reduzieren.
Dieser unterschiedliche Wirkmechanismus ist in Abbildung 17 dargestellt.
Abbildung 15 Schematische Darstellung der humanen COX-1 und COX-2 Enzyme; N-terminales Signalpeptid
(dunkelgrün), Transmembrandomäne (hellgrün), 18-Aminosäure Insertionskassette am C-terminus (rot),
N-Glykolysierungsstellen (schwarze Dreiecke), Aspirinacetylierungsstelle am Serin (schwarzer Pfeil), aktives
Zentrum bestehend aus: axiales (His-295) und distales (His-374) Histidin zur Hämbindung, katalytisch aktiver
Tyrosinrest (Tyr-371) (75).
Katalytische Zentrum
hCOX-1
hCOX-2
Ile
523
Ser
530 599
N-terminus
1
Arg
106 277 292
His
295
Tyr
371
His
374
N-terminus
1
Arg
106 277 292
His
295
Tyr
371
His
374
Ser
516
Val
523 604
Kapitel 1 Einleitung
27
Abbildung 16 Kristallstruktur der Kette A der Cyclooxygenase-2 mit gebundenem Prostaglandin H2 (93).
Der selektive COX-2 Inhibitor Celecoxib (CX, Celebrex®) wurde von der FDA (US Food
and Drug Administration) für die Behandlung von rheumatischer Arthritis, Osteoarthritis
sowie zur Behandlung der FAP freigegeben (94). Die Verträglichkeit wird in der CLASS-
Studie (Celecoxib Long-term Arthritis Safety Study) untersucht (95;96). Celecoxib kann
durch Cytochrom P450 2C9 und 3A4 oxidiert werden und interagiert mit Inhibitoren von
diesen Enzymen.
Die Peroxidase-Aktivität der Cyclooxygenasen beinhaltet auch unter physiologischen
Bedingungen die Bildung sauerstoffaktiver Spezien (ROS). Bei einer Dysregulation der
Enzyme, sei es durch Inhibierung durch NSARs oder durch COX-2 Überexpression im
Karzinom, verstärkt sich die Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezien in der Zelle und
schädigen diese durch Erhöhung des oxidativen Stresses bzw. begünstigen eine Entartung
der Zelle, wenn die Detoxifizierung versagt (9;97-99).
Kapitel 1 Einleitung
28
Abbildung 17 Schematische Darstellung der Strukturunterschiede zwischen den Substratbindungstaschen von
COX-1 und COX-2, das die Nutzung eines selektiven Inhibitors ermöglicht. Ein unspezifischer Inhibitor hat
Zugang zu aktiven Zentrum beider Isoenzyme (A). Die sterische Behinderung in der Substratbindungstasche von
COX-1 verhindert den Zugang eines spezifischen COX-2 Inhibitors (COXib) (100).
Aktives
Zentrum
Aktives
Zentrum
Aktives
Zentrum
Aktives
Zentrum
Unspezifischer Inhibitor (NSAID)
Spezifischer Inhibitor (COXib)
A
B
Kapitel 1 Einleitung
29
1.4.1.3. Cyclooxygenase-3
Chandrasekharan et al. zeigte vor einiger Zeit die Existenz einer weiteren Cyclooxygenase,
COX-3, die spezifisch durch Acetaminophen inhibiert werden kann und somit die
unbekannten antipyretischen und analgetischen Wirkmechanismen erklärt werden könnten
(101). Es handelt sich um eine Splicevariante der COX-1, die das Intron-1 in der mRNA
behält und damit eine Insertion von 30-34 Aminosäuren aufweist. Eine weitere
Splicevariante stellt die PCOX-1a dar, die zusätzlich zur Insertion des Intron 1 eine
Deletion der Exons 5-8 in der mRNA aufweist. Die COX-3 und PCOX-1 Transkriptionen
erfolgen bei Kaninchen und Menschen im Cortex cerebrale. Die Existenz der katalytisch,
aktiven Isoformen wurde durch Dinchuk et al. in Frage gestellt (77;101;102).
In Tabelle 2 sind die Eigenschaften der Cyclooxygenasen zusammengefasst.
Kapitel 1 Einleitung
30
Tabelle 2 Eigenschaften der humanen Cyclooxygenasen COX-1, COX-2 und COX-3 (77;81;86;103-105)
COX-1 COX-2 COX-3
Expression konstitutiv,
lokalisiert zu Thrombo-
zyten, Endothelzellen,
Magen, Niere, glatter
Muskulatur
konstitutiv in Gehirn, Niere,
Megakaryozyten, neu
gebildete Thrombozyten;
induzierbar („inflammation
response gene“), Gehirn,
Follikels, Monozyten und
Synoviozyten während der
Entzündung vor der
Ovulation, Makrophagen,
maligne Zellen
Cortex
cerebrale
Lokalisation Chromosom 9 Chromosom 1
Gengröße 22 kb mit 11 Exons 8 kb mit 10 Exons
mRNA-
Transkript
2,7 kb
4,5 kb mit multiplen Shaw-
Kamen Sequenzen
5,2 kb
5´-Region keine TATA Box, GC-reich,
SP1
NFB, NF-IL6, CRE,
E-Box, TATA-Box
3´-UTR 0,7 kb 2 kb
Molekulare
Eigenschaften
576 Aminosäuren
68-72 kDa
604 Aminosäuren
68-72/74 kDa (abhängig von
Glycolysierungen)
Kompartiment ER, nukleäre Hülle ER, nukleäre Hülle
Funktion Schutz der
Magenschleimhaut, Blut-
plättchenaggregation, renaler
Blutfluß, vaskuläre
Homeostase
renale Entwicklung,
Reninsekretion,
Knochenmetabolismus,
Wundheilung, Entzündung,
Schmerz, Fieber,
Tumorpromotion
zentraler
Schmerz
und
Fieber
Kapitel 1 Einleitung
31
1.4.2. Prostaglandine und ihre pro- und anti-inflammatorischen Effekte
Prostaglandine (PG) sind Lipidderivate der Arachidonsäure. Cyclooxygenasen katalysieren
die Oxygenierung in einer Zwei-Stufen-Reaktion der Arachidonsäure zum PGH2, welches
als Substrat gewebsspezifischer Prostaglandin Synthasen dient (106). Diese setzen PGH2
in prinzipiell fünf biologisch aktive Prostaglandine, PGE2, PGF2, PGD2, PGI2
(Prostacyclin) und TXA2 (Thromboxan) um. Die gebildete PG-Menge einer Zelle ist
abhängig von der Expression der individuellen PG-Synthasen (TXAS, PGDS, PGES,
PGF-S und PGI-S), die entsprechend ihrer Reaktionsprodukte bezeichnet werden. Von der
glutathionabhängigen PGE-Synthase werden die drei Isoformen cytoplasmatische
(c)PGES, membran-assoziierte (m)PGES-1 sowie mPGES-2 unterschieden (107-109).
Ähnlich wie COX-2 ist auch die mPGES-1 Expression induzierbar, denn mPGES-1 wird
sowohl mit COX-2 als auch mit COX-1 koexprimiert (110;111). Während cPGES mit
COX-1 assoziiert ist, bleibt die Kopplung der mPGES-2 bislang noch unklar (112).
Die ubiquitär vorkommenden Prostaglandine üben zahlreiche physiologische Effekte z. B.
im kardiovaskulären, gastrointestinalen, urogenitalen, respiratorischen, endokrinen,
immunologischen sowie zentralen Nervensystem (ZNS) aus. Darüber hinaus sind PGs in
zahlreichen Krankheiten involviert, wie Entzündungen, kardiovaskulären Erkrankungen,
Bluthochdruck und vor allem Krebs. Prostaglandine können autokrin, parakrin, endokrin
oder intrakrin ihre Wirkung ausüben. Wie wichtig die physiologische Funktion der PG ist,
zeigt die klinische Anwendung der unspezifischen Cyclooxygenase-Inhibitoren NSARs bei
der Behandlung verschiedener Beschwerden. Durch NSARs werden die COX Isoenzyme
gleichermaßen inhibiert, so dass deren längere Einnahme zu Nebenwirkungen wie
gastrointestinale Blutungen führen (113).
Die physiologischen Effekte der biologisch aktiven Prostaglandine erfolgen über
G-Protein-gekoppelte Prostanoidrezeptoren, eine Familie von Rhodopsin ähnlichen
7-Transmembranrezeptoren (GPCRs). Die Prostanoidrezeptoren, die eine 20-30 %-ige
Sequenzhomologie untereinander aufweisen, bestehen aus acht Mitgliedern (TP, DP,
EP1-4, IP und FP), die entsprechend ihrer Prostanoidliganden klassifiziert werden
(s. Abbildung 18) (114;115). Hirai et al. beschreibt die Existenz eines neunten Mitglieds,
den CRTH2 Rezeptor, der auf Th2-Zellen exprimiert wird und PGD2 bindet. Jedoch weist
dieser mehr Ähnlichkeit zu Chemorezeptoren auf als zu den Prostanoidrezeptoren
(116;117). Die Kopplung der Prostanoidrezeptoren zu heterotrimeren G-Protein
Kapitel 1 Einleitung
32
vermittelten Signalwegen und den damit verbundenen Prostanoid vermittelten, involvierten
Signalkaskaden sind sehr komplex, wie es
Tabelle 3 zusammenfassend zeigt.
Abbildung 18 Prostaglandin H2 bildet die Vorstufe der biologisch aktiven Prostanoide, die über spezifische
G-Protein-gekoppelte 7-Transmembranrezeptoren autokrin, parakrin, endokrin oder intrakrin z. B. über PPAR
(Peroxisomal proliferativ activated receptor ) wirken können.
O
O COOH
OH
O
COOH
OH
O
O
OH
COOH
OHOH
O
COOH
OHOH
O
OH
COOH
OH
OH
COOH
OH
PGH2
TxA2 (instabil) PGE2 PGI2 (instabil)PGF2a
TXAS PGDS cPGESmPGES-1/-2
PGISPGFS
PGD2
DPTP EP1-4 IP FP
biologisch aktive Prostaglandine
spezifische G-Protein-gekoppelte 7-Transmembranrezeptoren
Prostaglandin Synthasen
PPAR
15-d-PGJ2
Kapitel 1 Einleitung
33
Tabelle 3 Signaltransduktion von Prostanoidrezeptoren.
PG-
Klasse
Typ Isoform Subtyp G-Protein 2nd
Messenger
TxA2 TP TP TP Gq, GS, Gh,
G12
↑ IP3/DAG/Ca2+
, ↑ cAMP
TP Gi, G12 ↓ cAMP
PGD2 DP DP GS ↑ cAMP, Ca2+
CRTH2 Gi ↓ cAMP, ↑ Ca2+
, PLC, PI3K,
MAPK
PGE2 EP EP1 Unbekannt ↑ Ca2+
, IP3
EP2 GS ↑ cAMP, -catenin,
EGFR Transaktivierung
EP3 EP3A Gi ↓ cAMP
EP3B GS ↑ cAMP
EP3C GS ↑ cAMP
EP3D Gq, GS, Gi ↑ IP3/DAG, ↑ cAMP, ↓ cAMP
EP4 Gs ↑ cAMP, PI3K, Erk-1/-2
PGI2 IP Gq, GS, Gi ↑ IP3/DAG, ↑ cAMP, ↓ cAMP
PGF2 FP Gq ↑ IP3/DAG, Rho, -catenin, EGFR
Transaktivierung
Zusammenfassung representativer Signalwege der jeweiligen Rezeptoren aus unterschiedlichen Organismen
(TP-Isoformen vom Menschen, EP-Isoformen vom Rind, übrigen von der Maus). ↑ erhöht; ↓ erniedrigt; IP3
Inositoltrisphosphat; DAG Diacylglycerin; PLC Phospholipas e C; EGFR epidermal growth factor receptor;
MAPK Mitogen-activated protein kinase (74;84;90).
So ist es nicht verwunderlich, dass aufgrund der strukturellen Gemeinsamkeiten,
Prostaglandine mehr als einen Prostaglandinrezeptor aktivieren können (90).
Pharmakologische und gentische Funktionsanalysen der PG-Rezeptoren zeigen ein immer
komplexeres Bild, in welchem die Prostaglandine sowohl Entzündungen unterstützen als
Kapitel 1 Einleitung
34
auch unterdrücken. Dies zeigt die vielfältigen Funktionen der Prostaglandine, von denen
einige in der Tabelle 4 zusammengefasst dargestellt sind.
Tabelle 4 Pathophysiologische und physiologische Effekte der Prostaglandine.
PG-
Klasse
patho- & physiologische Effekte
TXA2 ↑ Thrombozytenaggregation, Vasokonstriktion, Bronchokonstriktion, T-Zell
Proliferation, lokale cytotoxische T-Zell Funktion, Eliminierung von selbst-
reaktiven T-Zellen, Cytokinproduktion bei mononukleären Milzzellen
↓ dendritische Zell-T-Zell Interaktionen
PGD2 ↑ Bronchokonstriktion, Allergien, Anaphylaxie, Aktivierung von Eosinophilen,
Atemwegsentzündungen, Stimulation von Th2 Zellen
↓ dendritische Zellmigration, Langerhans-Zellenmigration bei kutan,
hypersensitiven Reaktionen, Eosinophile Apoptose
PGE2 ↑ Muskelkontraktion, Darmkontraktion, Thermoregulation (Fieber),
Hydrogencarbonatsekretion, entzündliche Hyperalgesie, LPS-stimulierte,
oxidative Schädigung, IgG-Klassen-Switch bei B-Zellen, antigen-stimulierte
Mastzellendegranulation, Th1-vermittelte Entzündung
↓ Lipolyse, T-Zell Proliferation, dendritischen Zellfunktion in Karzinom-
assoziierten Immundefekten, Cytokinproduktion von Makrophagen
PGI2 ↑ Cytoprotektion, Vasodilatation, Hauttemperatur, mikrovaskuläre Permeabilität,
IL-10 Produktion von T-Zellen
↓ Thrombozytenaggregation
PGF2 ↑ Muskelkontraktion, Uteruskontraktion, Reproduktion, entzündliche
Schmerzausstrahlung
↓ Lymphozyten-Endothelzell-Interaktionen
↑ verstärkt bzw. aktiviert; ↓ erniedrigt bzw. inhibiert; (74;90;113;118-120)
Kapitel 1 Einleitung
35
1.5. Cyclooxygenase-2 im Zusammenhang mit dem Urothelkarzinom
COX-2 ist in einer Vielzahl von prämalignen und malignen humanen Karzinomen, wie
z.B. beim Ösophagus-, Pankreas-, Brust-, Haut- und Blasenkarzinom überexprimiert
(13;15;82;121-123). Während in Tieren das Urothelkarzinom nur sehr selten auftritt,
handelt es sich beim Menschen um eine immer häufiger auftretende Erkrankung (124).
Diesbezüglich zeigen Studien, dass COX-2 in allen Tumorstadien und -graden nach der
TNM-Klassifizierung mit sehr unterschiedlicher Stärke überexprimiert wird, was eine
starke Heterogenität des Urothelkarzinoms implementiert (125-127). Jedoch korreliert die
COX-2 Expression nicht mit dem Tumorstadium bzw. Grad, jedoch signifikant zu den
histologischen Subtypen. Li et al. konnte jedoch eine signifikante Korrelation zwischen
COX-2 Überexpression und Invasionstiefe des Tumors ausmachen (11;85). Shirahama et
al. zeigte, dass COX-2 zu 100 % in allen untersuchten Plattenepithelkarzinomen (SCC)
überexprimiert wird, während Wülfing et al. und Mohammed et al. zeigen konnten, dass
im Urothelkarzinom (TCC) nur 83 % und im CIS 75 % positiv für eine COX-2 Expression
waren (9;10;126). Darüberhinaus geben Überlebensanalysen keinen Zusammenhang
zwischen einer COX-2 Überexpression und der Gesamtüberlebensrate bzw.
beschwerdefreien Rate von Betroffenen (128). Jedoch konnte in diesem Zusammenhang
gezeigt werden, dass bei Personen, die Chemotherapie erhielten, eine starke COX-2
Expression signifikant mit einer schlechten Prognose korreliert (10). Die absolute
Signifikanz einer COX-2 Expression im Urothelkarzinom ist demnach nicht gegeben.
Shariat et al. und andere Studien beschreiben, dass COX-2 in den meisten Patienten mit
CIS und T1 Blasentumoren überexprimiert wird, so dass die COX-2 Hochregulation als ein
frühes Ereignis in der Karzinogenese angesehen werden kann (56). Einnahmen von
COX-Inhibitoren führen zu einer signifikant reduzierten Häufigkeit des Auftretens von
Blasenkarzinomen (18;129;130). Demzufolge wird davon ausgegangen, dass eine erhöhte
COX-2 Aktivität die Karzinogenese fördern kann (83). Unterstütz wird diese Aussage
durch die Experimente von Tiano et al., die bei COX Knock-out Mäusen eine 75 %-ige
Reduktion an Hautkarzinomen nach TPA-Behandlung feststellten (131).
Die Hauptfunktion der COX-2 ist die Umsetzung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen,
wobei das PGE2 das dominante und aktive Endprodukt darstellt (132). Prostaglandin E2 ist
in vielen physiologischen Prozessen wie z. B. der Zellproliferation, Angiogenese,
Immunantwort und Apoptose involviert (74;84;90;118). Diese Funktion impliziert dem
Kapitel 1 Einleitung
36
PGE2 ein malignes Potential (133;134). Prostaglandin E2 kann seine biologische Wirkung
über die vier G-Protein-gekoppelten Rezeptoren EP1-4 ausüben, die ihrerseits mit
malignem Potenzial und der Entwicklung von Karzinomzellen assoziiert werden (135-
138). Im Zusammenhang bei der malignen Progression des Urothelkarzinoms stehen
besonders die EP2 und EP4 Rezeptor, für die eine erhöhte Expression nachgewiesen
werden konnte, da sie aufgrund ihrer Kopplung zu GS-Proteinen und der damit
verbundenen Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels, zahlreiche Signalkaskaden
(MAPK, Wnt, Ras, PI3K) induzieren können, die ihrerseits wiederum in Vorgängen der
Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Apoptose involviert sind (16;17;132;133;139).
Abbildung 19 zeigt eine schematische Darstellung der komplexen Signalwege, die EP2
und EP4 Rezeptor induzieren können.
In vielfältigen Prozessen wie Proliferation, Angiogenese und Differenzierung sind Ras
Proteine beteiligt, die über stimulierte EP-Rezeptoren aktiviert werden können (17). Die
Familie der monomeren Ras-G-Proteine besteht aus H-Ras (Harvey-Ras), K-Ras
(Kirsten-Ras) und N-Ras (Neuroblastom-Ras) und können in Karzinomen aktiviert z. B.
durch EGF (Epidermale Wachstumsfaktoren) bzw. mutiert aktiviert durch
Punktmutationen vorliegen (140). Neben diesen drei Vertretern der Ras Familie gibt es
noch M-Ras, R-Ras, Rap1/2 und Ral (141). Ras Proteine können verschiedene
Proteinkinasen, z. B. Erk-1 und -2, MAPK (z. B. p38, c-Jun) sowie PI3K aktivieren. Unter
deren Kontrolle stehen Transkriptionsfaktoren, so dass eine zielgerichtete Transkription
stattfinden kann bzw. Gene abgeschaltet werden können. Beim humanen Urothelkarzinom
liegt vorrangig im Codon 12 des H-Ras Gens eine Punktmutation vor, bei dem das Glycin
durch ein Valin ausgetauscht wurde (22). Die Konsequenz ist ein ständig aktives Ras. Aber
nicht nur der Ras-Status bestimmt die Entwicklung und Progression eines Blasentumors,
sondern molekulare Veränderungen auf Genebene wie z. B. Mutationen im p53 Gen auf
dem chromosomalen Lokus 17p13, ausgelöst z. B. durch reaktive Sauerstoffspezien
(ROS), oder Veränderungen im Proteinexpressionslevel von p21 oder der funktionale
Status eines Proteins im Hinblick auf seinen Phosphorylierungszustand, wie im Falle des
Retinoblastom (6). Diese molekularen Veränderungen haben eine voraussagende und
prognostische Größe im Zusammenhang mit dem klinischen Verlauf betroffener Patienten
gezeigt (6;12;58).
Reaktive Sauerstoffspezies werden durch alle aeroben Organismen gebildet und dienen
unter physiologischen Konzentrationen der normalen Zellfunktion, unter exzessiven
Kapitel 1 Einleitung
37
Konzentrationen begünstigen sie den sogenannten oxidativen Stress (142). Bei jeder
Sauerstoffabhängigen Reaktion entstehen als Nebenprodukte ROS, wie auch bei der
Cyclooxygenase-Reaktion. Rudolf Virchow erkannte seinerzeit die dramatische Infiltration
inflammatorischer Zellen ins neoplastische Gewebe und stellte damit die Grundlage für
einen Zusammenhang zwischen Krebs und Entzündung her (97). Zum jetzigen Zeitpunkt
ist unumstritten, ob ROS, als Zustand des oxidativen Stresses, nicht nur das Altern
begünstigen, sondern durch ihre zellschädigenden Wirkungen eine Zellentartung
begünstigen. Um eine Entartung der Zelle zu vermeiden erfolgt unter derartigen
Bedingungen die Expression von einer Batterie von Genen, die für den zellulären
Schutzmechanismus essentiell sind (143). Dieser Prozess erfolgt über das „antioxidant
responsive element“ (ARE), welches die Gene einschließt, die für Enzyme der Phase-II
Detoxifizierung und anti-oxidativer Stress Antwort kodieren. Derartige Enzyme sind z. B.
Gluthations S-Transferase, Hemoxygenase, NADPH Quinone Oxidoreduktase oder
Peroxiredoxine (zur Familie der Thioredoxine gehörend) (143;144). Ein wichtiger
Transkriptionsfaktor, der an ARE bindet, ist Nuclear factor, erythroid derived 2, like 2
(Nrf-2). Nrf-2 ist ein Mitglied der Leuzin-Zipper Transkriptionsfaktorfamilie und spielt
eine wichtige Rolle bei der Cytoprotektion während Entzündungsprozessen sowie
elektrophilen sowie oxidativen Stresssituationen und kann die Transkription von Genen
initiieren, die sowohl für die Enzyme der Phase-II Detoxifizierung kodieren als auch für
Enzyme des anti-oxidativen Stress (97;143-146), welches in Abbildung 20 schematisch
dargestellt ist. COX-2 wird als inflammatorisches Notfallenzym bezeichnet, aufgrund
seiner raschen Aktivierung und der Beteiligung von COX-2 abgeleiteten Prostaglandinen
bei Entzündungsprozessen. Insbesondere bei aktivierten Makrophagen im
Entzündungsprozess konnten hohe Nrf-2 Level detektiert werden (147). Itoh et al. zeigten,
dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nrf-2 durch
15-deoxy-Δ12,14
-Prostaglandin J2 (15-deoxy-PGJ2) vermittelt werden kann und dem
15-deoxy-PGJ2 daher eine cytoprotektive Wirkung impliziert wird (143). Auch andere
Derivate des PGD2, die sogenannten Cyclopentenone begünstigen den „physiologischen“
intrazellulären Stress, gekennzeichnet durch ROS-Bildung, Lipidperoxidation und
Redoxveränderungen und unterstreichen die biologischen Effekte hinsichtlich ihrer
anti-proliferativen und anti-tumorgenen Wirkung (148;149). Jedoch bei exzessiver
ROS-Bildung scheint die cytoprotektive Wirkung verloren zu gehen und sich der Effekt
umzudrehen (150). Derartige Effekt konnten auch bei Hypoxie beobachtet werden (151).
Kapitel 1 Einleitung
38
Diese Daten unterstreichen auch beim Harnblasentumor eine Beteiligung der COX-2
während der Karzinogenese und bestärken die Analyse des Proteoms, um ein COX-2
abhängiges Proteinprofil während der Karzinomentstehung zu erstellen, so dass eine
zielgerichtetere Wirkstoffsynthese für die Tumortherapie erfolgen kann, damit sich der
klinische Verlauf betroffener Patienten verbessert.
Abbildung 19 Prostaglandin EP2 und EP4 Rezeptoren abhängige Signalwege fördern Proliferation, Überleben,
Angiogenese und Migration nach PGE2-Aktivierung. EP2 und EP4 Rezeptoren aktivieren AC (Adenylat-Cyclase)
durch Bindung des Gs Proteins (stimulatory guanine nucleotide binding protein). Dies führt zur Bildung von
cAMP, welches PKA (Proteinkinase A) aktiviert. Alternativ kann cAMP durch Bindung an den
Transkriptionsfaktor CREB (cAMP response element binding protein) die Transkription von CRE-regulierten
Genen initiieren, wie z.B. dem COX-Gen, das einen Anstieg der Expression von COX-2 und folglich einen
erhöhten PGE2-Level, zur Folge hat. Parallel kann die aktivierte PKA durch Stabilisierung von -catenin (Wnt-
Signalweg) die Transkription Tcf-(T-cell factor-)regulierter Gene aktivieren. EP4 Rezeptor besitzt zusätzlich
PI3K abhängige Akt-Kinase-Effekte, die einerseits zur Stabilisierung von -catenin führt, durch Aktivierung von
PPAR die Apoptose hemmt und andererseits die MAPK Erk-1/-2 aktiviert. Eine Aktivierung der Erk-1/-2 kann
alternativ durch EGFR (z. B. Her-2) via Ras Aktivierung erfolgen und ändert den Expressionszustand von PGES
(PGE2-Synthase). Des Weiteren fördert die EGFR Stimulation die Migration von Zellen über FAK Aktivierung.
Die Her-2 Stimulation induziert zudem die COX-2 Expression über den Ras/MAPK/AP1-Signalweg. Umgekehrt
kann COX-2 die Her-2 Expression über sein Hauptprodukt PGE2, entweder direkt bzw. über EP4
Rezeptor-Her-2-Transaktivierung oder über cAMP/CREB, stimulieren. Der erhöhte PGE2-Spiegel fördert eine
feedback-forward Stimulation (7;16;17;84;152;153). Pfeile: schwarz – aktiviert, rot – inhibiert, orange –
transaktiviert.
Kapitel 1 Einleitung
39
Abbildung 20 Molekularer Mechanismus von Nrf-2-Keap1 bei oxidativen und elektrophilen Stress. Unter
physiologischen Bedingungen liegt Nrf-2 gebunden an Keap1 im Cytoplasma vor und wird durch Ubiquitinierung
im Proteasom abgebaut (A). Bei einem Anstieg von Elektrophilen (oxidative Stresssituationen) verändern diese
durch Bindung an Keap1 dessen Struktur, so dass Nrf-2 nicht mehr binden kann. Die Akkumulation fördert die
Translokation von Nrf-2 in den Zellkern. Nach Heterodimerisierung mit weiteren Transkriptionsfaktoren erfolgt
die Transkription von Genen für die Phase-II Detoxifizierung und/oder anti-oxidativer Stress Antwort (B) (154-
160).
Kapitel 2 Zielsetzung
40
Kapitel 2 Zielsetzung
In dieser Arbeit sollen die Folgen einer Keratin 5-Promotor gesteuerten COX-2
Überexpression in den basalen Epithelschichten der Harnblase in einem homozygoten,
transgenen NMRI-Mausmodell gegenüber NMRI-Wildtyptieren untersucht werden. Für
die in vivo Analysen dienen die generierten homozygoten, transgenen Mauslinien, bei
denen die COX-2 cDNA unter der Kontrolle des bovinen Keratin 5-Promotors steht (161).
Dabei sollen auf histologischer Ebene COX-2 und Prostaglandin bedingte Veränderungen
im Blasenepithel charakterisiert werden, während auf molekularer Ebene neben den
Prostaglandinprofilen auch die Expressionsmuster der Prostaglandin E Synthasen (PGES)
und Prostaglandin E-(EP-)Rezeptoren, als wesentliche Komponenten Prostaglandin
abhängiger Signaltransduktion, analysiert werden sollen. Zum Vergleich soll eine Analyse
der PGES und EP-Rezeptoren der COX-2 positiven humanen, epithelialen
Blasentumorzelllinien RT112 und 5637 erfolgen.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist die Darstellung COX-2 abhängiger Proteinprofile. Dazu
soll die hochauflösende 2-Dimensionale Gelelektrophorse, die auf einer isoelektrischen
Fokussierung in immobilisierten pH-Gradientenstreifen (IEF) mit anschließender
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) basiert, etabliert werden. Um COX-2
abhängige, differentiell exprimierte Kandidatenproteine zu analysieren und zu
quantifizieren soll zusätzlich zur 2D-Gelektrophorese die 2-Dimensionale-Differenz-In-
Gel-Elektrophorese (2D-DIGE)-Technologie und deren Auswertung etabliert werden.
Kandidatenproteine sollen nach deren Identifikation durch MALDI-ToF- bzw.
Q-ToF-Analysen validiert werden.
Kapitel 3 Material und Methoden
41
Kapitel 3 Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Geräte und Chemikalien
Für die vorliegende Arbeit wurden die nachfolgend, alphabetisch aufgelisteten Geräte und
Chemikalien verwendet. Alle Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, in per
analysis Qualität verwendet.
Geräte und Materialien Firma
Axioskop 2 Zeiss, Göttingen (Deutschland)
Brutschrank Infors, Bottingen (Schweiz)
Dewar-Gefäße KGW Isotherm, Karlsruhe
(Deutschland)
Elektrophoresekammer Horizontal BioRad GmbH, München
(Deutschland)
Elektrophoresekammer Mini CTI GmbH, Idstein
(Deutschland)
Elektrophoresekammer Twin (Maxi) Renner, Darmstadt
(Deutschland)
Elektrophorese Power Supply PHERO-STAB 500 Biotec Fischer GmbH,
Reiskirchen (Deutschland)
ELISA-Reader Elx 800 Bio-Tek Instruments, Winooski,
VT ( USA)
Entwicklermaschine Optimax Typ TR M&S Laborgeräte, Wiesloch
(Deutschland)
Eppendorfzentrifuge (Biofuge 13) Heraeus Instruments, Hanau
(Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
42
Ettan DALTsix Electrophoresis Unit GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Ettan IPGphore GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Falcon-Tubes 15 ml, 50 ml Techno Plastic Products (TPP),
Trasadingen (Schweiz)
Feinwaage BL6100 Sartorius, Göttingen
(Deutschland)
Feinwaage BP61 Sartorius, Göttingen
(Deutschland)
Feinwaage 2004 MP Sartorius, Göttingen
(Deutschland)
Hecht Assistant Gläser (88 x 14 x 15 mm) Neolab, Heidelberg
(Deutschland)
IPG-Quellkammer LKB 2117 mit GE Healthcare,
Multiphore II Electrophoresis Unit und Reswelling Tray Freiburg (Deutschland)
IPG Multi Temp III Cooling GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Kippschüttler, Mini Rocking Platform Biometra, Göttingen
(Deutschland)
Kippschüttler, Profile Rocker Stovall Life Sciences Inc., NC
(USA)
Kryotom Leica CM 3050 Leica, Bensheim (Deutschland)
Kühltisch Julabo Julabo, Seelbach (Schweiz)
Kühlzentrifuge Avanti J-25 Beckman, Palo Alto, CA (USA)
Kühlzentrifuge GPKR Beckman, Palo Alto, CA,
(USA)
Magnetrührer MR2002 Heidolph, Kehlheim
(Deutschland)
Mikro-Dismembrator S II B.Braun BiotechInstruments,
Melsungen (Deutschland)
Mikro-Dismembrator S II Chromstahlkugel (10 mm) B.Braun BiotechInstruments,
Melsungen (Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
43
Mikro-Dismembrator S II PTFE-Behälter (3 ml) B.Braun BiotechInstruments,
Melsungen (Deutschland)
Mikrowelle Bosch GmbH, Karlsruhe
(Deutschland)
Nano Drop Kisker-Biotech, Steinfurt
(Deutschland)
Objektträger superfrost Neolab, Heidelberg
(Deutschland)
Papierschneider Dahle North America,
Peterborough, NH, (USA)
PapPen Novocastra Novo Pen, New
Castle (UK)
PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml Biozym Diagnostik
GmbH, Oldendorf
(Deutschland)
PCR-Reaktionsgefäße 0,5 ml Eppendorf, Hamburg
(Deutschland)
PCR Peltier Thermo Cycler PTC200 Biozym Diagnostik
GmbH, Oldendorf
(Deutschland)
PCR Pipettenfilterspitzen 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl Starlab GmbH, Ahrensburg
(Deutschland)
pH-Meter pH330 Fischer BioBlock
Scientific, Illirch Cedex
(Frankreich)
Pipetboy Integra Bioscience, Fernwald
(Deutschland)
Pipetten 10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl Gilson, WI (USA)
Pipettenspitzen 10 µl, 200 µl, 1000 µl Eppendorf, Hamburg
(Deutschland)
Quarzküvetten (0,2 ml, 10 mm Schichtdicke) Hellma, Freiburg (Deutschland)
Reaktionsgefäße 0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Eppendorf, Hamburg
(Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
44
Röntgenfilmkassetten Dr. Goods Suprema, Heidelberg
(Deutschland)
Spectrophotometer Ultrospec II GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Speedvac Vakuumzentrifuge Bachofer, Reutlingen
(Deutschland)
SPU-Adsorbex Probeneinheit Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Sterilbank Heraeus Instruments, Hanau
(Deutschland)
Stickstofftank Messer Griesheim, Krefeld
(Deutschland)
Thermoblock Typ 2099 Bachofer Laboratoriumsgeräte,
Reutlingen (Deutschland)
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg
(Deutschland)
Tischzentrifuge Hermle Z233M M&S Laborgeräte, Wiesloch
(Deutschland)
Typhoon Scanner 9410 GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Überköpfschüttler Heidolph, Kehlheim
(Deutschland)
UV-Stratalinker 1800 Stratagene, La Jolla, CA (USA)
UV-Transilluminator Alpha Innotech
Corporation, CA (USA)
Victor 1420 Multilabel counter Perkin Elmer, MA, (USA)
Vortexer DSG 302 Heidolph, Kehlheim
(Deutschland)
Wasserbad Kottermann, Haenigsen
(Deutschland)
Western Blot Kammer SD1 CTI GmbH, Idstein
(Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
45
Zellkulturflaschen (75 cm², 150 cm²) TPP Renner, Dannstadt
(Deutschland)
Zellkulturschalen (60 mm, 100 mm) TPP Renner, Dannstadt
(Deutschland)
Chemikalien Firma
15-Deoxy-12,14-Prostaglandin J2 Enzyme Kit Assay Designs, Ann Arbor
(USA)
2D-CleanUp Kit GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
2D-Quant-Protein-Assay GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
1-kb-DNA Standard (Puc-DNA-Marker) MBI Fermentas (USA)
6-keto-Prostaglandin F1 Enzyme Immunoassay Kit Alexxis Biochemicals, Lausen
(Schweiz)
6x Ladepuffer (Loading Dye Solution) MBI Fermentas (USA)
2-Mercaptoethanol (98%) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
96-Wellplatten, steril Falcon Neolab, Heidelberg
(Deutschland)
2-Macroglobulin Roche, Mannheim
(Deutschland)
-Amino-n-Capronsäure (99%) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Aceton Lichrosolve Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Aceton p.A. Fluka, Buchs (Schweiz)
Aceton technisch DKFZ-Lager (Deutschland)
Acetonitril Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
46
Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Ammoniumbicarbonat Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
AmplexRed Kit Invitrogen, Karlsruhe
(Deutschland)
Antibiotika (Penecellin/Streptomycin 100x) Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
Aprotenin (lyophilisiert) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
APS (Ammoniumpersulfat) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Aqua bidest Millipore, Eschborn
(Deutschland)
Aqua pure (HPLC-grade) Fluka, Buchs (Schweiz)
Borsäure Fluka, Buchs (Schweiz)
Bradford-Reagenz BioRad, München
(Deutschland)
Bromphenolblau, PlusOne GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Calciumchlorid Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Celecoxib (1500 ppm in Nagerpellets) Pfizer, New York (USA)
Chaps (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1- Sigma-Aldrich,
propanesulfonate Taufkirchen (Deutschland)
Coomassie brillant blue R Gerbu Biotechnik, Gaiberg
(Deutschland)
Cover Fluid GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Cy2, Cy3, Cy5 (Minimal-labeling) GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
DAKO Fluorescent Mounting Medium DAKO, Hamburg
(Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
47
Deckgläschen Neolab, Heidelberg
(Deutschland)
DeStreak-Lösung GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Diethyldithiocarbamat (Natriumsalz) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Dinatriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt
(Deutschland)
DMEM mit 4,5g Glucose Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
DMF (N,N-Dimethylformamid, wasserfrei (99.8%)) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
dNTP-Set (Desoxynukleosid Triphosphat), PCR-Grade Roche, Mannheim
(Deutschland)
DTT (Dithiothreitol) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
DTT (Dithiothreitol), PlusOne GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
ECL (Western Blotting Detection Reagents) GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
EDTA (Etyhlendiamintetraacetat, Titriplex) Serva Feinbiochemica
GmbH & Co., Heidelberg
(Deutschland)
Einbettschälchen Cryomold Standard Vogel, Gießen (Deutschland)
ELISA-BSA (Bovine serum albumin) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Eosinrot G Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Essigsäure, reinst Fluka, Buchs (Schweiz)
Ethanol, technisch (1% Petrolether) DKFZ-Lager (Deutschland)
Ethanol p.A. Fluka, Buchs (Schweiz)
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
48
Ethylacetat (Lichrosolve) Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Eukitt (Vitro-Clud) O. Kindler GmbH, Freiburg
(Deutschland)
Formaldehyd (37%) AppliChem, Darmstadt
(Deutschland)
Fötales Kälberserum (FCS) Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
Glucose Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Glutamin (100x) Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
Glycerin, PlusOne GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Glycin Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Hämatoxylin (saures Hämalaun nach Mayer) Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Harnstoff (Urea, PlusOne) GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
HCCA (-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
IAA (Iodoacetamide, kristallin) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Immobiline DryStrip Cover Fluid, PlusOne GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Immobiline DryStrip pH 3-10, pH 3-5,6NL, GE Healthcare,
pH 5,3-6,5, pH 6,2-7,5, pH 7-11NL Freiburg (Deutschland)
IPGphor Strip Holder (Reinigungslösung) GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
IPG-Puffer, pH 3-10, pH 3,5-5,0, pH 5,5-6,7, GE Healthcare,
pH 6-11, pH 7-11 NL Freiburg (Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
49
Kaliumchlorid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Leupeptin (lyophilisiert) Roche, Mannheim
(Deutschland)
L-Lysin (98% TLC) GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Magnesiumsulfat Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Methanol p.A. Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Methanol, technisch DKFZ-Lager (Deutschland)
Milchpulver, entfettet Fluka, Buchs (Schweiz)
Multiwell-Objektträger ICN Biomedicals, Meckenheim
(Deutschland)
Natriumcarbonat p.A. Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Natriumchlorid Roth, Karlsruhe (Deutschland)
Natriumfluorid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Natriumformiat Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Natriumphosphat Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Natriumpyruvat Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
Natriumorthovanadat Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Natriumthiosulfat Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
50
n-Hexane p.A. Riedel-de Haén, Seelze
(Deutschland)
nicht-essentielle Aminosäuren (100x) Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
Paraformaldehyd, reinst Merck, Darmstadt
(Deutschland)
PBS (Dulbecco Phosphat buffered saline) Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
PCR Direct (tail) Lysis Reagent Viagen Biotech Inc., LA, CA
(USA)
PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Ponceau S, reinst Serva, Heidelberg
(Deutschland)
Prostaglandin E2 Enzyme Immunoassay Kit Alexxis Biochemicals, Lausen
(Schweiz)
Prostaglandin F2 Enzyme Immunoassay Kit Alexxis Biochemicals, Lausen
(Schweiz)
Protein-Detection Kit (DC Quick Lowry) BioRad, München
(Deutschland)
Protein-G Sepharose 4 Fast flow beads GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
PVDF-Membran, Immobilon P Millipore Corporation, Bredford
(USA)
Ras activation Assay Upstate, New York (USA)
Red Taq Polymerase Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Röntgenfilme Fuji Super RX medical Fuji Photoshop GmbH,
Düsseldorf (Deutschland)
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1 Acrylamid:Bisacrylamid) Roth, Karlsruhe (Deutschland)
RPMI 1640 (12-167) Cambrex BioScience Verviers
(Belgien)
Kapitel 3 Material und Methoden
51
RT-PCR-Core Kit Roche, Mannheim
(Deutschland)
Salzsäure Merck, Darmstadt
(Deutschland)
SDS (Sodium dodecylsulfat), PlusOne GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
SDS-b Pulver (Sodium dodecylsulfat) Gerbu, Gaiberg (Deutschland)
SDS-6H-Marker für High molecular weights Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
SDS-7L-Marker für Low molecular weigths Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Sigma Fast DAB (Diaminobenzidin) Tabletten Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Silbernitrat, kristallin Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Silica-C18-Glas-Filtersätze 6 ml (500 mg) Separtis, Grenzach-Wyhlen
(Deutschland)
TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) p.A. Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
TFA (Trifluoressigsäure) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Tissue Tek Vogel, Gießen (Deutschland)
Tris p.A. Roth, Karlsruhe (Deutschland)
Tris, PlusOne GE Healthcare, Freiburg
(Deutschland)
Trypsin Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
Trypsin (sequencing grade) Promega, Mannheim
(Deutschland)
Tween-20 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
Vitamine (100x) Biochrom AG, Berlin
(Deutschland)
Kapitel 3 Material und Methoden
52
Wasserstoffperoxid 30% Merck, Darmstadt
(Deutschland)
Western Light Protein-Detection Kit Tropix, Bedford, MA (USA)
Whatman-3MM-Blotting-Papier Sartorius, Göttingen
(Deutschland)
Xylol Isomergemisch Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(Deutschland)
3.1.2. Antikörper
Tabelle 5 Verwendete Primäre Antikörper
Antikörper Firma Verdünnung
Goat anti-β-Aktin
(SC-1616)
Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:5000 - 1:10000 (IB)
Rabbit anti-Akt (9272) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)
Rabbit anti-p-Akt (9271) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)
Goat anti-COX-1 (SC-1754) Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:200 (IF)
Rabbit anti-mouse COX-1
(Hase 50)
DKFZ, Heidelberg 1:2000 (IB)
Goat anti-COX-2 (SC-1745) Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:1600 (IF)
1:2000 (IB)
Rabbit anti-mouse COX-2
(Hase 82)
DKFZ, Heidelberg 1:2000 (IB)
Rabbit anti-CD31 Becton Dickinson Co.; BD
Heidelberg
1:200 (IF)
Rat anti-CD4/L3T4 Becton Dickinson Co.; BD
Heidelberg
1:200 (IF, IHC)
Rat anti-CD45R/B220 BD Bioscience Pharmingen,
Heidelberg
1:200 (IF, IHC)
Kapitel 3 Material und Methoden
53
Rabbit anti-EP1 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:1000 (IB)
1:50 (IF, IHC)
Rabbit anti-EP2 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:1000 (IB)
Rabbit anti-EP2 Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:50 (IF)
Rabbit anti-EP3 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:1000 (IB)
1:100 (IF, IHC)
Rabbit anti-EP4 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:500 (IB)
1:50 (IF, IHC)
Rabbit anti-Erk-1/2 (p44/42
9102)
Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)
Rabbit anti-p-Erk-1/2
(9101)
Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)
Rat anti-F4/80 BD Bioscience Pharmingen,
Heidelberg
1:50 (IF)
Goat anti-FIH-1 Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:500 (IB)
Rabbit anti-Glutathione
S-transferase
Alexxis Biochemicals, Lausen,
Schweiz
1:2000 (IB)
Rabbit
anti-Hemoxygenase-1
Alexxis Biochemicals, Lausen,
Schweiz
1:2000 (IB)
Rabbit anti-Her-2/Neu
(SC-284)
Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:1000 (IB)
Rabbit anti-HIF-1 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:500 (IB)
Rabbit anti-Ki67 Novocastra Laboratories,
Newcastle, UK
1:250 (IF)
Rabbit anti-MK5-PRB-
160P
Hiss Diagnostics, Freiburg 1:4000 (IF)
Rabbit anti-Nrf-2 (SC-722) Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:500 (IB)
1:50 (IHC)
Rabbit anti-Peroxiredoxin-1 LabFrontier, Seoul, Korea 1:15000 (IB)
Kapitel 3 Material und Methoden
54
Rabbit anti-Peroxiredoxin-2 LabFrontier, Seoul, Korea 1:15000 (IB)
Rabbit anti-Peroxiredoxin-3 LabFrontier, Seoul, Korea 1:15000 (IB)
Rabbit anti-Peroxiredoxin-4 LabFrontier, Seoul, Korea 1:15000 (IB)
Rabbit anti-Peroxiredoxin-5 LabFrontier, Seoul, Korea 1:15000 (IB)
Rabbit anti-Peroxiredoxin-6 LabFrontier, Seoul, Korea 1:15000 (IB)
Rabbit anti-PTEN (138G6) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)
Rabbit anti-cPGES Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:2000 (IB)
Rabbit anti-mPGES-1 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:2000 (IB)
Rabbit anti-mPGES-2 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:2000 (IB)
Rabbit anti-PI3 (p85 4257) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)
Rabbit anti-p-PI3 (p85/p55
4228)
Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)
Mouse anti-Ras
(clone Ras10)
Upstate, New York, USA 1:20000 (IB)
Rabbit anti-VHL (2738) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)
Tabelle 6 Verwendete Sekundäre Antikörper
Antikörper Firma Verdünnung
Donkey anti-goat-IgG
AlexaFluor488
MoBiTec, Göttingen 1:400 (IF)
Donkey anti-goat-IgG-Cy3 Jackson/Dianova, Heidelberg 1:500 (IF)
Rabbit anti-goat-IgG-HRP
(SC-2020)
Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:2000 (IB)
1:400 (IHC)
Donkey anti-goat IgG AP
(SC-2022) (kein Tropix bei
COX-1/-2 Nachweis)
Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:5000 (IB)
Goat anti-mouse IgG HRP
(SC-2005) (beim Ras
activation assay)
Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg
1:2000 (IB)
Donkey anti-rabbit-IgG-
Cy3
Jackson/Dianova, Heidelberg 1:500 (IF)
Kapitel 3 Material und Methoden
55
Goat anti-rabbit-IgG-HRP
(H+L)
Jackson/Dianova, Hamburg 1:10000 (IB)
1:400 (IHC)
Goat anti-rabbit conjugated
Alkaline Phosphatase
Tropix, Bedford, MA,
USA
1:5000 (IB)
Goat anti-rat-IgG
AlexaFluor488
MoBiTec, Göttingen 1:400 (IF)
Hoechst 33258 Sigma, Taufkirchen 1:3000 (IF)
anti-mouse IgG HRP Jackson/Dianova, Heidelberg 1:400 (IHC)
3.1.3. Primer
Die aufgelisteten Oligonukleotide wurden von Thermo Fisher Scientific (GmbH) in Ulm
(Deutschland) bezogen, lagen in einem HPLC gereinigten Synthesemaßstab von 0,02 µmol
vor und wurden in Aqua pur aufgenommen.
Tabelle 7 Eingesetzte Oligonukleotide
Gen/Laborcode Sequenz TM /
Zyklen
Größe
(bp)
COX-2 (m) 181f 5´-CCTAGATAACAGAGCCGCTTTC-3´ 56°C/ 332
COX-2 (m) 611 5´-TTTCACCATAGAATCCAGTCCG-3´ 30
COX-2 (h) f 5´-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATT-3´ 52°C/ 305
COX-2 (h) r 5´-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3´ 30
COX-2 (m) f 5´-ACTCACTCAGTTTGTTGAGTCATTC-3´ 54°C/ 600
COX-2 (m) r 5´-TTGATTAGTACTGTAGGGTTAATG-3´ 40
COX-1 (h) f 5´-TGCCCAGCTCCTGGCCCGCCGCTT-3´ 64°C/ 303
COX-1 (h) r 5´-GTGCATCAACACAGGCGCCTCTTC-3´ 30
COX-1 (m) f 5´-TGCATGTGGCTGTGGATGTCATCAA-3´ 63°C/ 449
COX-1 (m) r 5´-CACTAAGACAGACCCGTCATCTCCA-3´ 40
-Aktin (h) f 5´-GTTGCGTTACACCCTTTGTTGACA-3´ 58°C/ 336
-Aktin (h) r 5´-CTGTGTGGACTTGGGAGAGGACTG-3´ 30
Kapitel 3 Material und Methoden
56
-Aktin (m) f 5´-AAACTGGAACGGTGAAGGC-3´ 54°C/ 450
-Aktin (m) r 5´-GCTGCCTCAACACCTCAAC-3´ 35
EP1 (h) f 5´-CTTCGGCCTCCACCTTCT-3´ 56°C/ 497
EP1 (h) r 5´-TTTCGCAGAATGGCTTTTTATT-3´ 45
EP1 (m) f 5´-TAGTGTGCAATACGCTCAGCG-3´ 64°C/ 553
EP1 (m) r 5´-GAGGTGACTGAAACCACTGTG-3´ 40
EP2 (h) f 5´-AGGCTACAGATGTGCTGACAAG-3´ 51°C/ 404
EP2 (h) r 5´-AGGCTACAGATGTGCTGACAAG-3´ 30-45
EP2 (m) f 5´-TATGGCAAAGACCCAAGGG-3´ 58°C/ 348
EP2 (m) r 5´-GACTGCATACCTTCAGCTGTAC-3´ 40
EP3 (h) f 5´-TTCTTCGAAAGTTTTGCCAGAT-3´ 51°C/ 309
EP3 (h) r 5´-CAATCAACACATGGAAAGTGCT-3´ 45
EP3 (m) f 5´-GGCACGTGGTGCTTCATC-3´ 54°C/ 416
EP3 (m) r 5´-GGGATCCAAGATCTGGTTC-3´ 40
EP4 (h) f 5´-ATCTTACTCATTGCCACC-3´ 54°C/ 212
EP4 (h) r 5´-TCTATTGCTTTACTGAGCAC-3´ 30
EP4 (m) f 5´-CTGAACAGCCCGGTGACCATTCC-3´ 63°C/ 363
EP4 (m) r 5´-GCCGGCCAGCCGCTTGTCCAC-3´ 40
HIF-1 (m) f 5'-ATTTGTGAACCCATTCCTCATC-3' 51°C/ 503
HIF-1 (m) r 5'-GCTTATCAAAAAGGCAGCTTGT-3' 45
PPAR (m) f 5'-AGATTCTCCTGTTGACCCAGAG-3' 51°C/ 499
PPAR (m) r 5'-TAAGCTTCAATCGGATGGTTCT-3' 30
mPGES-1 (m) f 5´-CCGAGATGCCTTCCCCGGGC-3´ 65°C/ 580
mPGES-1 (m) r 5´-CCAGGACCCCAGGACCAGACCC-3´ 40
Nrf-2 (m) f 5´-TGGACGGGACTATTGAAGGCTG-3´ 58°C/ 735
Nrf-2 (m) r 5´-GCCGCCTTTTCAGTAGATGGAGG-3´ 30
(h) human; (m) mouse; f forward; r reverse; TM eingesetzte Annealingtemperatur
Kapitel 3 Material und Methoden
57
3.2. Methoden
3.2.1. Mauslinien
Heterozygote und homozygote Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Linien (tr) 667+/-
und
675+/+
, hergestellt nach G.Neufang et al. (161), und NMRI-Wildtyp-Mäuse (wt)
(Füllinsdorf, Schweiz) wurden am Deutschen Krebsforschungszentrum (Heidelberg) unter
kontrollierten Tag- und Nachtzyklen gehalten und mit Altromin Standardpellets gefüttert.
Die Wasserversorgung erfolgte ad libitum.
Das K5.COX-2 Konstrukt der trangenen Tiere besteht aus dem Rinder Keratin 5-Promotor,
der Maus COX-2 cDNA und einer poly-Adeninsequenz, welches in Abbildung 21
dargestellt ist. In der Abbildung wurden im Konstrukt die Endonuklease-Schnittstellen
mitberücksichtigt.
Abbildung 21 Schematische Darstellung des K5.COX-2 DNA-Konstrukts (161)
Da die COX-2 cDNA unter der Kontrolle des Keratin 5-Promotors steht, erfolgt die
Expression von COX-2 in den basalen Epithelschichten.
Um die Effekte des selektiven COX-2 Inhibitors Celebrex® Pfizer zu untersuchen, wurden
transgene Tiere in einer durchgeführten Diät 5010 mit 1500 ppm Celebrex® vom Tag 1 bis
zum Tag 360 nach der Geburt gefüttert.
Alle tierexperimentellen Untersuchungen wurden durch das Regierungspräsidium
Karlsruhe genehmigt und liefen unter der Aktennummer 20/02.
5,12 kb 1,92 kb 1,75 kb
K5-Promotor COX-2 Splice + pA
KpnI KpnISal I Sal I
Eco RI Eco RI
Kapitel 3 Material und Methoden
58
3.2.2. Entnahme der Harnblase aus Mäusen
Für die Entnahme der Harnblase und weiterer Organe wurden die Mäuse durch cervicale
Dislokation getötet und die Harnblase nach Öffnen der Bauchdecke entnommen.
Für molekularbiologische Untersuchungen erfolgte das sofortige Einfrieren im flüssigen
Stickstoff in 1,5 ml Eppendorftubes (Safe-Lock) und der weiteren Lagerung bei -80°C. Für
immunhistochemisch relevante Fragestellungen wurde die Harnblase in Tissue Tek
eingebettet und in Isobutan im flüssigen Stickstoff eingefroren. Die weitere Lagerung
erfolgte bei -80°C.
3.2.3. Proteinisolierung aus der Harnblase
Für die Proteinisolierung aus der Harnblase wurden die bei -80°C gelagerten
Gewebeproben zunächst im flüssigen Stickstoff gekühlt. Die anschließende
Homogenisierung des Blasengewebes erfolgte mit Hilfe des Mikro-Dismembrators S für
eine Minute bei 2500 rpm in Stickstoff gekühlten 3 ml PTFE-Schüttelbehältern und unter
zu Hilfenahme einer ebenfalls gekühlten Chromstahlkugel (7,85 g/ml, 10 mm im
Durchmesser). Das Homogenat sowie die Chromstahlkugel wurden in 1,0-1,2 ml Puffer in
15 ml Corex-Röhrchen aufgenommen. Die für die jeweiligen Reaktionsansätze
verschiedenen Puffer wurden kurz vor Versuchsbeginn mit den Protease-Inhibitoren
PMSF, Aprotenin, Leupeptin und 2-Makroglobulin versetzt.
Nach dem vollständigen Ablösen des Homogenates von der Chromstahlkugel wurde diese
entfernt und das Lysat mittels 1 ml Spritzen mit 21G 11/2
“ Kanülen auf Eis homogenisiert
(außer den Proteinhomogenaten für die 2D-Gelelektrophorese) und die
Desoxyribonukleinsäure (DNS) dabei geschert. Dieser Vorgang wurde während der
gesamten Proteinaufarbeitung insgesamt 25-mal durchgeführt.
Abhängig vom weiteren Reaktionsverlauf erfolgte eine unterschiedliche Weiterbehandlung
der Proteinhomogenate.
Kapitel 3 Material und Methoden
59
3.2.3.1. Aufarbeitung für die 2D-Gelelektrophorese
Die im Lysepuffer aufgenommenen Blasengewebehomogenate inkubierten mindestens drei
Stunde bei 25°C und wurden dabei mehrmals mit 21G Kanülen mittels 1 ml Spritzen
homogenisiert. Daraufhin wurden die Zelltrümmer und nicht gelösten Bestandteile durch
Zentrifugation für zehn Minuten bei 2500 x g und 20°C in der Avanti-Kühlzentrifuge
(J-25) abgetrennt. Der klare Überstand wurde ohne die darüberliegende Lipidschicht
entnommen und 200 µl mit dem 2D-CleanUp Kit aufgereinigt. Dazu wurden die Proben
mit dem dreifachen Volumen an Präzipitat versetzt, gevortext und für 15 Minuten bei 4°C
inkubiert. Anschließend erfolgte der Zusatz des dreifachen Volumens an Co-Präzipitat,
erneutes vortexen und eine Zentrifugation für zehn Minuten bei 8000 x g und 4°C. Nach
dem Verwerfen des Überstandes wurden die Proben erneut für zwei Minuten bei 8000 x g
und 4°C zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet im doppelten Volumen
mit Co-Präzipitat versetzt, ohne dabei das Pellet zu zerstören und erneut für fünf Minuten
zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde das Pellet mit Aqua bidest bedeckt
und mit dem zehnfachen Volumen an Waschlösung, die mindestens eine Stunde vor
Benutzung bei -20°C inkubierte, aufgenommen und so lange gevortext bis das Pellet von
der Reaktionsgefäßwand abgelöst war. Daraufhin wurden die Proben für 30 Minuten bei
-20°C inkubiert und alle zehn Minuten für 30 Sekunden gevortext. Nach dem
Zentrifugieren für zehn Minuten bei 8000 x g und 4°C, wurde der Überstand abgenommen,
das Pellet maximal fünf Minuten luftgetrocknet und in Lysepuffer resuspendiert. Danach
wurde die Proteinkonzentration mit dem 2D-Quant Protein-Assay (3.2.4.1.3) bestimmt und
die Proteinkonzentration der Proteinlysate auf 1 µg/µl mittels Lysepuffer eingestellt und
für weitere Versuche aliqotiert.
Die Lagerung der Proteinlysate erfolgte bei -70°C bzw. die Weiterbehandlung, wie unter
3.2.4.2.2 bzw. 3.2.4.3.1 beschrieben.
Lysepuffer
Harnstoff 9 M
Chaps 65 mM
Tris/HCl 30 mM
EDTA 1 mM
Kapitel 3 Material und Methoden
60
PMSF 1 mM
Aprotinin 10 µg/ml
Leupeptin 10 µg/ml
α2-Makroglobulin 0,2 mg/ml
pH 8,5
2D-CleanUp Kit
3.2.3.2. Aufarbeitung für die Immunpräzipitation und Immunoblot
Für die Immunpräzipitation bzw. dem Immunoblot wurde das Blasengewebehomogenat
zur Isolierung der Cyclooxygenasen in COX-Puffer, zur Isolierung der EP-Rezeptoren in
EP-Rezeptoren-Puffer und zur Isolierung übriger Proteine in HP-Puffer aufgenommen. Die
Homogenate inkubierten für 20 Minuten auf Eis und wurden währenddessen wie unter
3.2.3 beschrieben homogenisiert. Anschließend wurden die Zelltrümmer und nicht
gelösten Bestandteile durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 4000 rpm und 4°C in der
Avanti-Kühlzentrifuge (J-25) abgetrennt. Der klare Überstand wurde ohne die
darüberliegende Lipidschicht entnommen und die Proteinkonzentration mit dem
Quick-Lowry-Protein-Assay bestimmt und mit dem jeweiligen Puffer auf 1 mg/ml
eingestellt. Anschließend erfolgte die Immunpräzipitation bzw. der Immunoblot wie unter
3.2.5.1 bzw. 3.2.5.2 beschrieben.
COX-Puffer
Tris/HCl 50 mM
EDTA 2 mM
Tween-20 1 % (v/v)
PMSF 1 mM
Aprotenin 10 µg/ml
Leupeptin 10 µg/ml
α2-Makroglobulin 0,2 mg/ml
pH 7,5
Kapitel 3 Material und Methoden
61
EP-Rezeptoren-Puffer
Natriumchlorid 150 mM
Tris/HCl 50 mM
Diethyldithiocarbamat 200 mM
EDTA 2 mM
Tween-20 1 % (v/v)
PMSF 1 mM
Aprotenin 10 µg/ml
Leupeptin 10 µg/ml
α2-Makroglobulin 0,2 mg/ml
pH 8,0
HP-Puffer
Tris/HCl 50 mM
Diethyldithiocarbamat 200 mM
EDTA 2 mM
Tween-20 1 % (v/v)
PMSF 1 mM
Aprotenin 10 µg/ml
Leupeptin 10 µg/ml
α2-Makroglobulin 0,2 mg/ml
pH 7,5
3.2.3.3. Aufarbeitung für den Ras-GTPase Assay
Das pulverisierte Harnblasengewebe wurde nach Aufnahme in MLB-Puffer und
anschließender Homogenisierung in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt und die
Zelltrümmer und nicht gelösten Bestandteile durch Zentrifugation für fünf Minuten bei
13000 rpm und 4°C in der Eppendorfzentrifuge (Biofuge 13) abgetrennt. Der klare
Überstand wurde entnommen und die Proteinkonzentration mit dem Quick Lowry Protein-
Assay bestimmt. Danach erfolgte das Einstellen der Proteinkonzentration auf
Kapitel 3 Material und Methoden
62
2 mg/ml bzw. 4 mg/ml mittels MLB-Puffer auf ein Endvolumen von 500 µl (Pull-down,
PD, s. 3.2.6.1). Das restliche Volumen (RV) wurde einer Ethanolfällung unterzogen.
MLB-Puffer (Magnesium-Lysis-Wasch-Puffer)
5x MLB 1x
Natriumfluorid 25 mM
Natriumorthovanadat 1 mM
Aprotenin 10 µg/ml
Leupeptin 10 µg/ml
add HPLC-Wasser (10 % Glycerol (v/v))
3.2.3.4. Ethanolfällung
Die Proteinansätze wurden mit dem 2-fachen Volumen an -20°C kaltem Ethanol versetzt,
gevortext und über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für
30 Minuten bei 13000 rpm und 4°C in der Eppendorfzentrifuge bzw. für 30 Minuten bei
10000 x g und 4°C in der Avanti-Kühlzentrifuge (J-25). Der klare Überstand wurde
dekantiert, das Pellet kurz luftgetrocknet und in 1x LSB (Laemmli Sample Buffer) in einer
Konzentration von 2 mg/ml auf Eis resuspendiert.
In Vorbereitung für die Disk-Elektrophorese wurden die Ansätze fünf Minuten bei 100°C
denaturiert, auf Eis Schock gekühlt und anschließend fünf Minuten bei 13000 rpm in der
Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Die weitere Lagerung erfolgte bei -20°C.
1x LSB
Glycin 1,3 M
SDS 0,1 M
PMSF 2 mM
2-Mercaptoethanol 5 % (v/v)
Bromphenolblau 0,015 mM
Upper-Tris 1x (s. Seite 64 ff.)
Kapitel 3 Material und Methoden
63
3.2.4. Proteinbiochemische Nachweisverfahren
3.2.4.1. Proteinbestimmung
3.2.4.1.1. Bradford-Assay
Für die Proteinbestimmung wurde eine BSA-Standard Verdünnungsreihe in den
Konzentrationen von 0,125 mg/ml bis 8 mg/ml erstellt. Anschließend wurden 10 µl
Standard bzw. der zu untersuchenden Proben mit 990 µl BioRad Arbeitslösung (1:5
BioRad Bradford Reagenz:Wasser) versetzt, gevortext und 15 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte mit 200 µl Probenmaterial in
96-Wellplatten am ELISA-Reader Elx800 bei 600 nm. Die nachweisbare Proteinmenge
liegt bei 5-30 µg.
3.2.4.1.2. DC Quick Lowry
Für den DC Quick Lowry Assay wurde eine BSA-Standard Verdünnungsreihe mit einer
Konzentration von 0,125 mg/ml bis 8,0 mg/ml erstellt.
Entsprechend den Herstellerangaben (BioRad) wurden 37,5 µl einer frisch hergestellten
Lösung A´ (1:50 aus Lösung S:A) mit 7,5 µl Probe bzw. Standard versetzt und sofort
gevortext. Nach Zugabe von 300 µl Lösung B wurden die Proben gevortext und
15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte mit 200 µl
Probenmaterial in 96-Wellplatten am ELISA-Reader Elx800 bei 750 nm. Die
nachweisbare Proteinmenge liegt bei 20-200 µg.
3.2.4.1.3. 2D-Quant Protein-Assay
Für die Proteinbestimmung wurde eine Standard Verdünnungsreihe mit den BSA-Mengen
zwischen 0-50 µg nach Herstellerangaben erstellt. Die zu untersuchenden
Proteinhomogenate bzw. -lysate wurden unverdünnt, 1:2 und 1:4 mit Lysepuffer verdünnt
und 20 µl sowie 40 µl jeweils in Doppelbestimmung eingesetzt.
Diese Reaktionsansätze wurden mit 500 µl Präzipitat versetzt, gevortext und 2-3 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte ein Zusatz von 500 µl Co-Präzipitat,
erneutes vortexen und eine Zentrifugation bei 13000 rpm für fünf Minuten bei
Kapitel 3 Material und Methoden
64
Raumtemperatur (Biofuge 13). Der Überstand wurde dekantiert und die Ansätze erneut für
fünf Minuten bei 13000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Der erhaltene Überstand
wurde abgenommen und das Pellet in 500 µl einer 1:5 in aqua bidest verdünnten
Kupferlösung resuspendiert. Nach dem Zusatz von 1 ml Color Reagent wurden die Proben
gevortext und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte am
Spectrophotometer Ultrospec II in Quarzküvetten bei einer Wellenlänge von 480 nm. Die
nachweisbare Proteinmenge liegt bei 0,5 µg.
3.2.4.2. Gelelektrophoretische Auftrennungen
3.2.4.2.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Für die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinlysaten wurden 7,5 %-ige,
12 %-ige bzw. 15 %-ige Trenngele mit 4 %-igem Sammelgel hergestellt (Tabelle 8).
Die verwendeten Glasplatten wurden durch definierte 1,5 mm starke Spacer getrennt. Die
Abdichtung erfolgte mittels 1 %-iger Agarose. Nach dem Erstarren der Agarose wurde das
Trenngel gegossen und mit Ethanol überschichtet. Nach dem Auspolymerisieren wurde das
Sammelgel gegossen. Die Nachpolymerisation betrug mindestens zwei Stunden.
Das hergestellte Gel wurde daraufhin in die Gelelektrophorese-Kammer überführt und mit
400 ml SDS-Laufpuffer beschichtet. Anschließend wurden 50 µg - 140 µg Gesamtprotein
(2 mg/ml) der vorbereiteten Proben, 20 µl des Markers (6H-SDS bzw. Low Molecular
Weight Marker, s. Tabelle 9 und Tabelle 10) und ggf. 0,5 µg - 5,0 µg einer Positivkontrolle
auf das Gel aufgetragen.
Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte bei konstanten 9-11 mA über Nacht und
bei Raumtemperatur.
Kapitel 3 Material und Methoden
65
Tabelle 8 Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels
Trenngele 7,5 / 12,0 / 15,0 % Sammelgel 4,0 %
4x Lower Tris 10,0 / 10,0 / 10,0 ml -
4x Upper Tris - 5 ml
Bis-/Acrylamid 10,0 / 16,0 / 20,0 ml 2,7 ml
TEMED 40 µl 40 µl
10 % APS 450 µl 60 µl
Aqua bidest 19,6 / 13,5 / 9,5 ml 12,4 ml
Tabelle 9 Molekulargewichte des SDS-6H-Standard-Markers nach Sigma
Tabelle 10 Molekulargewichte des Low-Molecular-Weight-Markers nach Sigma
Protein Molekulargewicht [Da]
Myosin (Rabbit muscle) 205.000
β-Galactosidase (E.coli) 116.000
Phosphorylase b (Rabbit muscle) 97.400
Albumin (Bovine) 66.000
Albumin (Egg) 45.000
Carboanhydrase (Bovine erythrocytes) 29.000
Protein Molekulargewicht [Da]
Albumin, Bovine 66.000
Albumin, Egg 45.000
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-
Dehydrogenase
36.000
Carbonic anhydrase, Bovine 29.000
Trypsinogen, Bovine pancreas 24.000
Trypsin Inhibitor, Soybean 20.000
Kapitel 3 Material und Methoden
66
4x Lower Tris
Tris/HCl 1,5 M
SDS 0,4 % (w/v)
pH 8,8
4x Upper Tris
Tris/HCl 0,5 M
SDS 0,4 % (w/v)
pH 6,8
1x SDS-Laufpuffer
Tris 25 mM
Glycin 192 mM
SDS 1 % (w/v)
3.2.4.2.2. Zwei-dimensionale Gelelektrophorese
Bei der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese werden Proteine in zwei Dimensionen
aufgetrennt. Die Auftrennung der ersten Dimension erfolgt mittels der isoelektrischen
Fokussierung (IEF), bei der ein natives Protein oder Peptid im elektrischen Feld durch
einen pH-Gradienten wandert, bis es an den pH-Wert gelangt, an dem seine Nettoladung
und damit seine Wanderungsgeschwindigkeit Null ist. Dies ist sein isoelektrischer Punkt
(Abbildung 22).
In der zweiten Dimension werden die denativen Proteine nach ihrem Molekulargewicht
getrennt.
Kapitel 3 Material und Methoden
67
Abbildung 22 Prinzip der isoelektrischen Fokussierung (nach GE Healthcare)
Quellen der IPG-Streifen
Für die Auftrennung der Proteine in der ersten Dimension wurden getrocknete 180 mm
lange IPG-Streifen mit verschiedenen pH-Gradienten (pH 3-5,6NL, pH 5,3-6,5, pH 6,2-
7,5, pH 7-11NL und pH 3-10) eingesetzt, die entsprechend den Herstellerangaben
30 Minuten vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmt und mit 150 µg Proteinmenge
beladen wurden. Die Proteinlysate wurden nach 3.2.3.1 erhalten und in einem Verhältnis
von 1:1 mit 2x Rehydratationspuffer versetzt bzw. im weiteren Verlauf durch
DeStreak-Lösung ersetzt. Das maximale Quellvolumen für die gewählten IPG-Streifen
beträgt 340 µl, wobei das eingesetzte Quellvolumen abhängig vom durchgeführten
Versuch zwischen 300-340 µl betrug.
Das Probenvolumen wurde in die Quellkammer (Reswelling-Tray) vorgelegt und die zu
benetzende IPG-Seite, nach dem Abziehen der Schutzfolie, nach unten in die
Proteinlösung inkubiert. Der IPG-Streifen wurde anschließend mit 2 ml Cover Fluid
bedeckt und mittels Multi Temp III Cooling bei 20°C für mindestens 12 Stunden über
Nacht gequollen.
pH
3
pH
10
+ - - -
- - +
-
+
+
+ - + -
+ +
+ + + Time0
+ - - -
- - -
+
+
+ + -
+ + + +
+ + +
+ - -
- -
+ + - + Time1
- + Time2
Kapitel 3 Material und Methoden
68
2x Rehydratationspuffer
Harnstoff 9 M
Chaps 33 mM
Bromphenolblau 0,06 mM
DTT 36 mM
IPG-Puffer 1,0 % (v/v)
DeStreak-Lösung
DTT 36 mM
IPG-Puffer 1,0 % (v/v)
Isoelektrische Fokussierung
Die gequollenen IPG-Streifen wurden mit aqua bidest befeuchtete 3 MM Whatmann-
Filterpapier dreimal vorsichtig abgetupft, um Cover Fluid Rückstände sowie eventuelle
Harnstoffkristalle zu entfernen. Anschließend wurden die IPG-Streifen in Teflonschiffe
bzw. Keramiklaufwanne mit der Gelseite nach oben überführt. An den jeweiligen
Gelstreifenenden wurden 5x5 mm große, mit aqua bidest angefeuchtete Filterstreifen
aufgelegt und mit den Elektroden fixiert. Danach wurden die Teflonschiffe entsprechend
der Anoden-Kathoden-Polarisation in die Ettan IPGphore I überführt und die IPG-Streifen
mit 4-5 ml Cover Fluid benetzt.
Das Laufprogramm für die isoelektrische Fokussierung ist in der nachfolgenden Tabelle
zusammengefasst.
Tabelle 11 Laufprogramm der isoelektrischen Fokussierung nach GE Healthcare in der ersten Dimension für 180
mm lange IPG-Streifen
Step 1 1 h 150 V Step and hold
Step 2 3 h 300 V Step and hold
Step 3 6 h 1000 V Gradient
Step 4 3 h 6000 V Gradient
Step 5 3 h 6000 V Step and hold
Kapitel 3 Material und Methoden
69
Eine Lagerung der IPG-Streifen nach der isoelektrischen Fokussierung erfolgte im
Äquilibrierungspuffer-frozen bei -20°C.
Äquilibrierung der IPG-Streifen und zweite Dimension
Die Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht in der zweiten Dimension
erfolgte in 210x180x1 mm großen 12,5 %-igen SDS-Gelen (s. Tabelle 12) in
Low-Fluorescence Gelplatten.
Mit Hilfe des Ettan Daltsix-Gel-Casters wurden sechs Gele gleichzeitig gegossen. Dazu
wurden die Gelplatten mit Aceton (Lichrosolve) gereinigt und entsprechend den
Herstellerangaben die Gießkammer mit den Gelen zusammengesetzt, die Gele gegossen
und mit 80-100 ml Ethanol (p.A.) überschichtet. Nach ein bis zwei Stunden Polymerisation
wurde das Ethanol abgegossen, die Gele mit Aqua bidest überschichtet und über Nacht bei
4°C gelagert, so dass eine vollständige Nachpolymerisation gewährleistet wurde.
Tabelle 12 Zusammensetzung der 12,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgele in der zweiten Dimension
450,25 ml Gesamtvolumen für sechs Gele á 12,5 %
Substanz Volumen [ml]
Rotiphorese Gel 30 188
1,5 M Tris*HCl-Puffer, pH 8,8 113
Aqua bidest 140
10% SDS 4,5
10% APS (frisch zubereitet) 4,5
TEMED 0,25
Vor der Überführung der IPG-Streifen in die zweite Dimension, mussten die Proteine
zunächst denaturiert werden. Dazu wurden die IPG-Streifen jeweils 15 Minuten in
Dithiothreitol-(DTT-)Äquilibrierungspuffer sowie in Iodoacetamid-(IAA-)Aquilibrie-
rungspuffer unter schwenken (100 rpm) inkubiert. Anschließend wurden die IPG-Streifen
Kapitel 3 Material und Methoden
70
für ca. fünf Sekunden in 1x SDS-Laufpuffer gespült und auf die 12,5 %-igen SDS-Gele
überführt. Für die Auftrennung wurden 0,7 µl 6H-SDS-Standard-Marker (Tabelle 9) auf
5x5 mm Whatmann-Filter aufgetragen und neben der aziden IPG-Streifenseite platziert.
Die IPG- und Filterstreifen wurden mit 0,7 % warmer Agarose (40-50°C) überschichtet.
Nach dem Erstarren der Agarose wurden die Gele in die Ettan DALTsix Elelctrophoresis
Unit überführt und mit 1x SDS-Laufpuffer überschichtet. Die obere Laufkammer wurde
mit 2x SDS-Laufpuffer befüllt. Die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine
erfolgte über Nacht mit 0,67 Watt pro Gel.
Äquilibrierungspuffer
Harnstoff 6 M
Tris/HCl 50 mM
Glycerin 3,26 M
SDS 69,35 mM
Bromphenolblau 0,03 mM
DTT-Äquilibrierungspuffer
zusätzlich
DTT 65 mM
IAA-Äquilibrierungspuffer
zusätzlich
IAA 135 mM
Äquilibrierungspuffer-frozen
Tris/HCl 50 mM
Glycerin 3,26 M
SDS 69,35 mM
Kapitel 3 Material und Methoden
71
1x SDS-Laufpuffer
Tris 25 mM
Glycin 192 mM
SDS 3,47 mM
Agaroselösung
Agarose 0,5 % (w/v)
Bromphenolblau 0,002 % (w/v)
3.2.4.3. Proteinmarkierung
3.2.4.3.1. 2D-DIGE Proteinlabeling
Um Unterschiede im Expressionsmuster der Proteine in transgener K5.COX-2 (tr) im
Vergleich zur Wildtyp (wt) Harnblase zu identifizieren und zu quantifizieren wurde die
traditionelle 2-Dimensionale Gelelektrophorese mit der Differenz-In-Gel-Elektrophorese
kombiniert. Die Grundlage bildet die Veresterung von Proteinen mit unterschiedlichen
Fluoreszenzfarbstoffen (CyDye Flourochrome). Diese Flourochrome werden speziell für
die 2-Dimensionale Differenz-In-Gel-Elektrophorese-(2D-DIGE-)Technologie entwickelt.
Dabei reagieren die NHS-Estergruppen der Cydyes mit den -Aminogruppen der freien
Lysine der Proteine. Darin liegt die Limitierung der Methode, da nur 3-5% aller Proteine
damit für die Labeling-Reaktion zur Verfügung stehen. Für die 2D-DIGE-Methode stehen
drei CyDyes zur Verfügung - CyTM
2, CyTM
3 und CyTM
5, die sich in ihren Eigenschaften,
wie es in der folgenden Tabelle zusammenfassend dargestellt ist, unterscheiden.
Tabelle 13 Eigenschaften der Fluorochrome Cy2, Cy3 und Cy5
Fluorochrom Farbe Absorption
[nm]
Extinktion
[nm]
Molekulargewicht
M [g/mol]
Cy2 Grün 491 509 434
Cy3 Rot 553 569 466
Cy5 Blau 645 664 464
Kapitel 3 Material und Methoden
72
In dieser Arbeit wurde der Minimal-labeling Ansatz verwendet. Dies stellte sicher, dass
nur ein CyDye Fluorochrome mit einem Protein verestert werden konnte und nicht
falsch-positive Werte aufgrund mehrfacher Kopplungsreaktionen erhalten werden. Die
Detektion der markierten Proteine erfolgt mittels eines Colour-Fluoreszenzscanners
(Typhoon 9400).
Wie es in Abbildung 23 schematisch dargestellt ist, wurden nach der Extraktion der
Proteine aus der Harnblase 50 µg wt-Probe (1 mg/ml) mit dem Fluorochrom Cy3 markiert,
50 µg tr-Probe mit Cy5 und 25 µg wt- plus 25 µg tr-Probe mit Cy2. Der Cy2-markierte
Ansatz dient dabei als interner Standard. Für die kovalente Verknüpfung wurden 1 µl
(400 pmol) CyDye zum jeweiligen Reaktionsansatz gegeben und für 30 Minuten auf Eis
im Dunkeln inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden durch Zusatz von 1 µl 10 mM Lysin
gestoppt und für weitere zehn Minuten im Dunkeln auf Eis gelagert.
Nach der Markierungsreaktion wurden alle drei Ansätze vereinigt, so dass sich 150 µg
Gesamtproteinmenge ergab, mit DeStreak-Lösung versetzt und die Proteine nach dem
Prinzip der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese separiert. Somit erfolgte die Auftrennung
unter exakt den gleichen Bedingungen und minimierte damit Gel-zu-Gel Variationen
(162;163).
Mittels Typhoon Scanner 9400 wurde das Gel entsprechend den Wellenlängen der
Fluorochrome eingescannt und die Kanäle gebündelt. Mit Musteralgorithmen der DeCyder
Software (GE Healthcare) wurden über den internen Standard differentiell exprimierte
Proteine identifiziert und quantifiziert. Darüber hinaus erlaubt die Software Gel-zu-Gel
Spotmatches und statistische Berechnungen.
Nach Identifizierung der differentiell exprimierten Proteine erfolgte die weitere
Behandlung wie unter 3.2.4.2.2 und 3.2.4.5 beschrieben.
Kapitel 3 Material und Methoden
73
Abbildung 23 Schematische Darstellung des 2D-DIGE Arbeitsflusses mit einem Drei-Farbsystem (Erklärung im
Text)
Proteinextraktion
Harnblasengewebewt tr
wttr
Zentrifugation
2D-CleanUp
wt + tr
Cy2
wt
Cy3
tr
Cy5
2D-Gelelektrophorese der vereinigten Ansätze
Scannen und Datenquantifizierung
wt tr
Identifizierung
MALDI-ToF-MS
ESI-MS/MS
Kapitel 3 Material und Methoden
74
CyDye-Fluoreszenzfarbstoffe in Dimethylformamid [DMF]
Cy-Farbstoff 400 pmol/µl
Lysin-Stopplösung
L-Lysin 10 mM
3.2.4.4. Proteinfärbung
3.2.4.4.1. Coomassie-Färbung
Für die Coomassie-Färbung wurden die Gele nach der elektrophoretischen Trennung für
eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln in der Färbelösung inkubiert.
Anschließend erfolgte durch mehrmaliges Wechseln der Entfärberlösung das Entfärben der
Gele.
Färbelösung
Methanol 40 % (v/v)
Essigsäure 10 % (v/v)
Coomassie brillant blue R 0,6 % (w/v)
Entfärbelösung
Methanol 40 % (v/v)
Essigsäure 10 % (v/v)
3.2.4.4.2. SDS-Gel Silberfärbung
Für die Silberfärbung wurden die Gele nach der elektrophoretischen Trennung über Nacht
in Fixierlösung unter schütteln bei 25 rpm inkubiert. Anschließend wurden die Gele
dreimal 20 Minuten unter schütteln in Waschpuffer gewaschen, eine Minute in
Natriumthiosulfatlösung inkubiert und 20 Minuten imprägniert. Danach wurden die Gele
zweimal 20 Sekunden mit aqua bidest gewaschen und 1-2 Minuten entwickelt. Die
Kapitel 3 Material und Methoden
75
Farbentwicklung wurde durch eine mindestens zehn minütige Inkubation in Fixierlösung
gestoppt.
Anschließend wurden die Gele in Aqua bidest rehydriert, in Folien eingeschweißt und
mittels HP-Scanner visualisiert und mittels AdobePhotoshop ausgewertet.
Fixierlösung
Ethanol (techn.) 50 % (v/v)
Essigsäure 12 % (v/v)
Waschpuffer
Ethanol (techn.) 30 % (v/v)
Natriumthiosulfatlösung
Natriumthiosulfat 0,8 mM
Imprägnierer
Silbernitrat 11,8 mM
Formaldehyd 6,7 mM
Entwickler
Natriumcarbonat 566 mM
Formaldehyd 6,7 mM
Natriumthiosulfat 0,02 mM
3.2.4.5. Analytische Auswertung der CyDye markierten Proteine
3.2.4.5.1. Quantifizierung der 2D-Gele
In Kooperation mit Herrn Dr. K. T. Junghanns und Dr. J. Thiermann (GE Healthcare,
Freiburg) wurden die CyDye markierten und aufgetrennten Proteine mittels DyCyder-
Software 6.5 quantitativ ausgewertet. Dazu wurden die in Low-Fluorescence-Gelplatten
befindlichen Gele mittels Typhoon Scanner 9400 entsprechend der korrespondierenden
Wellenlängen der CyDye-Fluorochrome eingescannt. Die Anregung erfolgte dabei mit drei
Kapitel 3 Material und Methoden
76
unterschiedlichen Lasern, um die Cy2-, Cy3- und Cy5-markierten Proteinmuster getrennt
voneinander zu detektieren. Anschließend wurden die drei gescannten Zustände
übereinander gelegt und die Cy3- und Cy5-markierten Proben über den internen
Cy2-Standard normiert und der Harnblase transgener Mäuse differenziell exprimierten
Proteinspots analysiert, quantifiziert und markiert, um sie aus dem Gel schneiden zu
können. Mittels der Software wurde die Gesamtzahl der Proteinspots ermittelt.
3.2.4.5.2. Tryptischer Verdau differentiell exprimierter Proteine
Kandidatenproteine wurden unter einem Luftschutzkäfig ausgeschnitten und in 0,2 ml
PCR-Tubes überführt. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
Für die Massenspektrometrie-(MS-)Analyse mussten die ausgeschnittenen, silbergefärbten
Proteinspots aufgereinigt werden. Dazu wurden die Gelstücke mit 140 µl Wasser bei 42°C
und 600 rpm für acht Minuten im Thermomixer inkubiert und anschließend mit 140 µl
Waschlösung unter den gleichen Bedingungen gewaschen. Die Reduktion der Proteine
erfolgte durch Zugabe von 100 µl DTT für eine Stunde bei 56°C im Thermomixer
(600 rpm). Anschließend wurden die Gelstücke mit 140 µl Pufferlösung bei 42°C für acht
Minuten im Thermomixer gewaschen und die Proteine durch Zugabe von 100 µl
Iodoacetamid für 30 Minuten bei 25°C im Thermomixer alkyliert. Danach wurden die
Gelstücke jeweils dreimal abwechselnd mit 140 µl Pufferlösung und Ethanol (p.A.) für
acht Minuten bei 37°C im Thermomixer gewaschen. Durch Zugabe von 100 µl Acetonitril
für eine Minute bei 25°C im Thermomixer erfolgte der restliche Wasserentzug aus den
Gelstücken. Anschließend wurden die Gelstücke für mindestens 15 Minuten bei
Raumtemperatur getrocknet.
Die getrockneten Gelstücke wurden mit 10-20 µl Trypsin versetzt und 15 Minuten bei
37°C im Thermomixer (600 rpm) inkubiert. Waren die Gelstücke nicht vollständig benetzt,
wurde entsprechend Pufferlösung zugesetzt und erneut unter den gleichen Bedingungen
inkubiert und anschließend wieder überprüft. Daraufhin wurden die Proben über Nacht bei
37°C verdaut.
Kapitel 3 Material und Methoden
77
Waschlösung
Pufferlösung 50 % (v/v)
Ethanol 50 % (v/v)
Pufferlösung
Ammoniumbicarbonat 40 mM
DTT
DTT 10 mM
in Pufferlösung
IAA
IAA 55 mM
in Pufferlösung
Trypsin
Trypsin 20 µg in 40 µl 1mM Salzsäure lösen
Ansatz 1:50 mit Pufferlösung
verdünnen
3.2.4.5.3. Ankertarget-Präparation
Für die Messung wurden 1 µl Probe auf das Target aufgetragen, 1 µl Matrix dazu
pipettiert. Nach Lufttrocknung erfolgte ein Ankertarget-Waschschritt, indem 1 µl
0,1 %-ige TA-Lösung auf die Probe pipettiert und sofort wieder abgesaugt wurde. Durch
diese Prozedur wurden die Proben entsalzt. Die Umkristallisation erfolgte anschließend
durch Zusatz von 0,5 µl Umkristallisationslösung.
TFA-Lösung
TFA 0,1 %
Kapitel 3 Material und Methoden
78
TA-Lösung
0,1 % TFA/Aceton 2:1 (v/v)
Matrix
Spatelspitze HCCA in 400 µl TA-Lösung lösen, anschließend
abzentrifugieren und 1:10 mit Ethanol/Aceton (2:1) verdünnen
Umkristallisationslösung
Ethanol/Aceton/0,1 % TFA 6:3:1 (v/v)
3.2.4.5.4. MALDI-ToF-MS
In Kooperation mit Frau Dr. M. Schnölzer (DKFZ, Heidelberg) wurden differenziell
exprimierte Proteine aus den 2D-Gelen mittels Matrix-assisted Laser-Desorption Ionization
Time of Flight-Flugrohr Massenspektrometrie (MALDI-ToF-MS) identifiziert.
Ein Massenspektrometer besteht aus drei Teilen: die Ionenquelle, die gasförmige Protein-
Ionen erzeugt, dem Analysator, der die gasförmigen Bestandteile auftrennt und dem
Detektor, der die Protein-Ionen nachweist.
Für die Analyse der Proteine wurde die MALDI-ToF-MS genutzt. Dabei werden Proteine
oder Peptide in eine kristalline Matrix integriert, die zuvor auf einen Probenträger
aufgetragen wurde. Durch einen kurzen Beschuss mit einem Laserstrahl werden die
Proteine oder Peptide explosionsartig aus der Matrix als Ionen-Gas freigesetzt und
anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt, im Vakuum der Flugröhre nach dem
Quotienten aus Masse und Ladung (m/z) aufgetrennt und am Detektor gemessen. Die bis
zum Erreichen des Detektors benötigte Flugzeit (Time Of Flight) ist dabei proportional zur
Wurzel aus dem Verhältnis von Masse und Ladung (m/z). Einige Proteinionen zerfallen
während des Flugs im Analysator in Bruchstücke (PSD, Post source decay), die sich mit
gleicher Geschwindigkeit weiterbewegen wie das Mutterion, so dass im Mutterion-Gipfel
neben dem Mutterion als Hauptkomponente auch Bruchstücke vorliegen. Die
PSD-Analysen erfolgten im Kationenreflektormodus mit verzögerter Extraktion. Dabei
wurde das zu untersuchende Ion mit einer Genauigkeit von ± 40 Da ausgeblendet und die
Spannung des Reflektors schrittweise in 14 Stufen erniedrigt. Jedes Spektrum in den
einzelnen Segmenten wurde aus 200 individuellen Laserschüssen gemittelt. Anschließend
Kapitel 3 Material und Methoden
79
wurden alle Segmente mit der FAST Software (Bruker-Daltonik GmbH, Bremen) zu einem
Ionenfragmentspektrum gemittelt. Die Kalibrierung der Fragmentsprektren erfolgte mit
den Fragmentmassen des Adenocorticotropinhormons 18-39 (ACTH 18-39).
Alle MALDI-Massenspektren wurden auf einem Reflex II Time-of-Flight Instrument
(Bruker-Daltonics GmbH, Bremen) aufgenommen. Das Instrument war mit einer
SCOUT-26 Probenquelle und einem 337 nm Stickstofflaser ausgerüstet.
Massenspektren, die die Massen der tryptischen Peptide aufzeigten, wurden im
Positiv-Ionen-Reflektor-Modus mit verzögerter Extraktion (positiv ion reflector mode with
delayed extraction) aufgenommen. Die Spannung der Ionenbeschleunigung der
MALDI-Analyse betrug 26,5 kV, die des Reflektors 30,0 kV und die der Extraktionsplatte
20,6 kV. Die interne Kalibrierung erfolgte mit Hilfe der Zweipunktgeraden der beiden
Autolyseprodukte des Trypsins bei m/z 842,5 und m/z 2211,1.
Mit diesem übersetzten Peptidmassen-Fingerabdruck (peptide mass fingerprint) erfolgte
die Suche in Protein- und Genomdatenbanken, um Proteine zu finden, die eine
übereinstimmende Peptidmassenverteilung aufweisen.
3.2.4.5.5. Datenbanken
Die Eingabe für die Datenbanksuche erfolgte mit einfach geladenen, monoisotopischen
Peptidmassen. Bei der Suche in der NCBInr Datenbank dienten der ProFound Algorithmus
(http://129.85.19.192/prowl-cgi/ProFound.exe) und das Mascot Suchprogramm
(http://www.matrixscience.com) als Grundlage.
Um die Suche zu spezifizieren wurden isoelektrische Datenpunkte von 0-14 zugelassen,
oxidierte Methionine als mögliche Modifikationen sowie eine nicht erfolgte tryptische
Spaltung erlaubt und eine Abweichung der monoisotopischen Peptidmassen von
± 100 ppm bzw. ± 0,1 Da toleriert.
Dahingegen wurde der MS-Tag Algorithmus für die vergleichende Suche der
Fragmentmassen aus den PSD-Experimenten verwendet. Dieser Algorithmus war
Bestandteil der Prospector Protein Software. Als Suchkriterien wurden die möglichen
Massenabweichungen des Elternmoleküls von ± 0,1 Da und die der Ionenfragmente von
± 0,8 Da toleriert.
Kapitel 3 Material und Methoden
80
3.2.4.5.6. Extraktion für LCQ
Der Überstand der tryptisch verdauten Proben wurde abgenommen und in neue
PCR-Tubes überführt. Das Gelstück wurde mit 10-100 µl Acetonitril/Trifluoressigsäure-
Gemisch extrahiert, anschließend fünf Minuten im Ultraschallbad inkubiert, kurz
zentrifugiert und der Überstand mit dem tryptisch verdauten Überstand vereinigt. Diese
Extraktion wurde mit 0,1 %-iger Trifluoressigsäure und anschließend erneut mit
Acetonitril durchgeführt. Die vereinigten Überstände wurden in der Speedvac eingeengt.
Die Peptide wurden in 5-11 µl 0,1 %-iger Trifluoressigsäure resuspendiert, fünf Minuten
im Ultraschallbad inkubiert, erneut zentrifugiert und der Überstand in geeignete LCQ-
Behälter überführt.
Acetonitril/Triluoressigsäure-Gemisch
Acetonitril 50 % /v/v)
Trifluoressigsäure 0,1 % 50 % (v/v)
Trifluoressigsäure
Trifluoressigsäure 0,1 % (v/v)
3.2.4.5.7. ESI-MS/MS
Für die Identifizierung der tryptischen und extrahierten Peptide wurde eine nanoESI-QTof,
gekoppelt mit einer nano-CapLC, verwendet (Waters). Über die Steuerungssoftware Mass
Lynx 4.0 (Waters) erfolgte die Überwachung des Trennvorgangs und die Aufzeichnung der
MS/MS-Spektren. Zunächst wurden 5 µl Probenvolumen injiziert und über die Vorsäule
Symmetry 300 C18 (5 µm, Nano Ease, Waters) der nano-CapLC zugeführt. Die Trennung
und damit die Anreicherung der Peptide erfolgte über die nachgeschaltete Trennsäule
Reprosil-Pur C18 AQ (3 µm, 150 mm x 75 µm ID, Dr. Maisch GmbH Ammerbuch-
Entringen) bei einem konstanten Fluss von 200 nl/min. Der lineare Stufengradient von
94,9 % Wasser/0,1 % Ameisensäure/5 % Acetonitril auf 94,9 % Acetonitril/5 %
Wasser/0,1 % Ameisensäure betrug für die Elution der Peptide eine Stunde. Die Spannung
am ESI-Gerät wurde auf 2400 V eingestellt. Die Kalibrierung des Gerätes erfolgte vor
Versuchsbeginn über einen internen Standard.
Kapitel 3 Material und Methoden
81
Zunächst wurden Precursor Ionen in einem automatischen (data dependent analysis, DDA)
Experiment durch den Quadrupol herausgefiltert. Anschließend erfolgte von diesen
Precursor Ionen die Erzeugung der MS/MS-Spektren durch weitere
Fragmentierungsreaktionen.
Die Rohdaten der ESI-MS/MS Spektren wurden mit Protein Lynx Global Server
2.2 Software (Waters) prozessiert. Bei der Suche in der NCBInr Datenbank dienten
ebenfalls die Mascot Suchprogrammparameter als Grundlage. Zusätzlich wurde in der
Suche mögliche Desamidierungen mit eingeschlossen.
3.2.5. Immunologische Analysen
3.2.5.1. Immunpräzipitation
Für die Immunpräzipitation wurden 5 µl Rabbit anti-mouse COX-2 (Hase 82) Antikörper
mit 1 mg Proteinmenge gelöst in 1 ml COX-Puffer versetzt. Nach dem Zusatz von 60 µl
Protein-G Sepharose 4 Fast flow beads wurden die Proben im Überkopfschüttler bei 4°C
über Nacht inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für fünf Minuten bei
4000 rpm und 4°C in der Beckman-Zentrifuge (GPKR). Der Überstand wurde entnommen
und für eine weitere Immunpräzipitation mit 5 µl Rabbit anti-mouse COX-1 (Hase 50)
Antikörper für eine Stunde bei 4°C im Überkopfschüttler inkubiert. Daraufhin schloss sich
eine weitere Zentrifugation mit Entnahme des Überstandes an. Die Protein-G Sepharose
Immunpräzipitatpellets wurden danach mit 1 ml IP-Waschpuffer gewaschen und erneut für
fünf Minuten bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde insgesamt
5-mal durchgeführt. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Proben fünf Minute in der
Eppendorfzentrifuge (Biofuge 13) bei 13000 rpm und 4°C erneut zentrifugiert und der
Überstand anschließend abgenommen. Daraufhin erfolgte eine Resuspension der Beads in
60 µl 2x Laemmli Sample Buffer (LSB). In Vorbereitung für die Disk-Elektrophorese
wurden die Proben fünf Minuten bei 100°C im Thermoblock denaturiert, auf Eis Schock
gekühlt, fünf Minuten bei 13000 rpm in der Eppendorfzentrifuge zentrifugiert und 60 µl
des Überstandes auf ein 7,5%-iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen bzw. bei -20°C
gelagert.
Kapitel 3 Material und Methoden
82
IP-Waschpuffer
Tris/HCl 50 mM
EDTA 200 mM
Aprotenin 10 µg/ml
Leupeptin 10 µg/ml
pH 7.5
2x LSB (Laemmli Sample Buffer)
Glycin 2,6 M
SDS 0,2 M
PMSF 2 mM
2-Mercaptoethanol 10 % (v/v)
Bromphenolblau 0,03 mM
Upper-Tris 1x
3.2.5.2. Immunoblot (Western Blotting, Ponceau S Färbung und
Immunodetektion)
Für das Western Blotting wurde der „semidry“ Elektrotransfer verwendet. Entsprechend
der SDS-Gelgröße (16x12 cm) wurden 15 3 MM Whatmanfilter und eine PVDF-
(Polyvinyldifluorid-)Membran vorbereitet und in unterschiedlichen Puffern inkubiert. In
Transferrichtung wurden 6x 3 MM Whatmanfilter in Kathoden-Puffer, das SDS-Gel in
Kathoden-Puffer (Inkubation für fünf Minuten), PVDF-Membran in Anoden-Puffer II
(zuvor in Ethanol inkubiert), 3x 3 MM Whatmanfilter in Anoden-Puffer II und 6x 3 MM
Whatmanfilter in Anoden-Puffer I inkubiert und nach dem „Sandwich-Modell“
zusammengebaut. Zusätzlich wurde die Apparatur, ähnlich wie beim Kapillartransfer, mit
1 kg Gewicht beschwert, um einen gleichmäßigeren Tranfser zu erzielen.
Der Transfer erfolgte mit 0,8 mA pro cm2 Gel für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Anschließend wurde die Membran für circa zehn Sekunden in PBS gewaschen und bis zu
drei Minuten mit Ponceau S gefärbt, um die Markerbanden zu markieren und den Transfer
zu überprüfen. Nach der Entfärbung in Aqua bidest wurde wie nachfolgend beschrieben
die Immundetektion durchgeführt.
Kapitel 3 Material und Methoden
83
Anoden-Puffer I
Tris/HCl 0,3 M
Methanol 20 % (v/v)
pH 10,4
Anoden-Puffer II
Tris/HCl 25 mM
Methanol 20 % (v/v)
pH 10,4
Kathoden-Puffer
Tris/HCl 25 mM
-Amino-n-Capronsäure 40 mM
Methanol 20 % (v/v)
pH 9,4
Ponceau S
Ponceau S 0,5 % (w/v)
Essigsaure 0,1 % (v/v)
PBS (Phosphate buffered saline)
Natriumchlorid 137 mM
Kaliumchlorid 2,7 mM
Dinatriumhydrogenphosphat10,14 mM
Kaliumdihydrogenphosphat 1,8 mM
Immunodetektion mittels Tropix
Die entfärbte Membran wurde für eine Stunde unter Schütteln und bei Raumtemperatur in
30 ml I-Block Puffer inkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem
Primärantikörper über Nacht bei 4°C unter Schütteln. Danach wurde 6-mal fünf Minuten in
30 ml I-Block Puffer bei Raumtemperatur gewaschen. Der Sekundärantikörper konjugiert
mit Alkalischer Phosphatase (Tropix) inkubierte eine Stunde bei Raumtemperatur.
Kapitel 3 Material und Methoden
84
Daraufhin wurde die Membran erneut 6-mal fünf Minuten bei Raumtemperatur mit
I-Block Puffer gewaschen. Die darauf folgende Detektion des Antigens via
Chemiluminescence erfolgte mit dem Western Light Protein-Detection Kit von Tropix.
Entsprechend der Herstellerangaben wurde die Membran zweimal fünf Minuten in 20 ml
Assay-Puffer inkubiert. Anschließend erfolgte eine fünf minütige Inkubation in 4 ml
Nitroblock:CSPD-Substrat 1:20. Die Membran wurde in eine Entwicklungskassette
überführt und Fuji-Röntgenfilme mit unterschiedlichen Expositionszeiten entwickelt.
I-Block-Puffer (in PBS)
I-Block 0,2 % (w/v)
Tween-20 0,1 % (v/v)
Antikörper-Lösung
I-Block-Puffer 50 % (v/v)
Wasch-Puffer 50 % (v/v)
Immundetektion mittels ECL (GE Healthcare)
Die entfärbte Membran wurde für eine Stunde in Blocklösung bei Raumtemperatur
geschüttelt. Die Primärantikörperinkubation erfolgte bei 4°C über Nacht in Blocklösung
unter schütteln (150 rpm). Anschließend wurde die Membran 6-mal fünf Minuten in
Wasch-Puffer gewaschen und mit dem Sekundärantikörper für eine Stunde bei
Raumtemperatur in Blocklösung inkubiert. Nach erneuter Durchführung der Waschschritte
erfolgte die ECL-Entwicklung. Dazu wurden die Reagenzien A und B im Verhältnis 1:1
gemischt und eine Minute mit der Membran unter schwenken inkubiert. Die Membran
wurde leicht luftgetrocknet, in eine Entwicklungskassette überführt und Fuji-Röntgenfilme
mit unterschiedlichen Expositionszeiten entwickelt.
Blocklösung (in PBS)
Magermilchpulver 5 % (w/v)
Tween-20 0,1 % (v/v)
Kapitel 3 Material und Methoden
85
Wasch-Puffer (PBS-T)
Tween-20 0,1 % (v/v)
3.2.5.3. Herstellung von Kryogewebeschnitten
Die bei -70°C in Tissue Tek gelagerten Harnblasen wurden am Kryotom auf -28°C
erwärmt und in 5 µm dünne Präparate geschnitten. Die Dünnschnitte wurden sofort auf
beschichtete Objektträger (superfrost) fixiert und zwei Stunden bei Raumtemperatur
getrocknet und in Objektträgerkästen bei -70°C gelagert.
3.2.5.4. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Die bei -70°C gelagerten Kryoschnitte wurden für mindestens zwei Stunden bei
Raumtemperatur aufgetaut. Daraufhin wurden die Dünnschnitte fünf Minuten in
Paraformaldehydlösung fixiert und anschließend zehn Minuten in PBS gewaschen. Nach
zwei bis drei Minuten Inkubation in Hämatoxylin wurde die Färbung durch Wässern für
eine Minute unter fließendem Leitungswasser gestoppt und die Präparate für 20 Sekunden
in HCl-Ethanol inkubiert. Nach erneutem Wässern für zehn Minuten wurden die
Gewebeschnitte eine Minute in Eosin gefärbt und anschließend die Färbung durch
Inkubation für eine Minute unter fließendem Leitungswasser gestoppt. Danach erfolgte die
Entwässerung der Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe, d. h. je 2-mal zwei
Minuten in 70 %, 80 %, 90 %, 96 % und 100 % Ethanol. Nach 2-maliger Inkubation für je
fünf Minuten in Xylol wurden die Gewebeschnitte in Eukitt eingebettet, unter dem
Mikroskop ausgewertet und bei Raumtemperatur für weitere Untersuchungen gelagert.
Paraformaldehydlösung
Paraformaldehyd 1 % (v/v)
Kapitel 3 Material und Methoden
86
HCl-Ethanol
Salzsäure (25 %) 25 % (v/v)
Ethanol 70 % (v/v)
3.2.5.5. Immunfluoreszenz
Für die indirekten Doppel-/Immunfluoreszenzen wurden 5 µm Kryoschnitte verwendet. Zu
Beginn wurde das bei -70°C gelagerte Gewebe für zwei Stunden bei Raumtemperatur
aufgetaut und anschließend durch Inkubation in Aceton für 15 Sekunden fixiert, um das
Gewebe zu permeabilisieren und zu dehydratisieren, ohne dessen Struktur dabei zu
zerstören. Während der folgenden Lufttrocknung für fünf bis zehn Minuten wurde das
Gewebe mit einem PapPen umrandet und anschließend 2-mal für fünf Minuten in PBS
inkubiert. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren erfolgte eine Inkubation mit
50-100 µl pro Gewebeschnitt mit Blocklösung für eine Stunde bei Raumtemperatur in
einer Feuchtigkeitskammer. Anschließend wurden 50 µl des Primärantikörpers in
Blocklösung über Nacht bei 4°C in der Feuchtigkeitskammer inkubiert.
Nach 3-maligen waschen für je zehn Minuten in PBS wurden 50 µl des
Sekundärantikörpers in Blocklösung für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln in
der Feuchtigkeitskammer inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze erneut 3-mal für je
zehn Minuten in PBS gewaschen, in Mounting Medium luftblasenfrei mit Deckgläschen
abgedeckt und unter dem Carl Zeiss Fluoreszenzmikroskop mittels den entsprechenden
Fluoreszenzfiltern ausgewertet und für weitere Untersuchungen bei 4°C im Dunkeln
gelagert (Tabelle 14).
Tabelle 14 Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe
Fluorochrom Farbe Extinktion [nm] Emission [nm]
DAPI Blau 358 461
Cy3 Rot 550 570
AlexaFluor488 Grün 495 519
Kapitel 3 Material und Methoden
87
Blocklösung
ELISA-BSA 1 % (w/v)
3.2.5.6. Immunhistochemie
Im Unterschied zur Fluoreszenz erfolgte die Fixierung in Aceton für zehn Minuten und der
Sekundärantikörper ist nicht mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, sondern mit einer
Peroxidase, so dass nach Substratzugabe eine Farbreaktion erfolgt.
Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper in Blocklösung und dem 3-maligen
Waschen in PBS wurden die Gewebeschnitte nicht wie bei der Immunfluoreszenz in
Mounting Medium eingebettet, sondern mit 50 µl pro Gewebeschnitt mit DAB/H2O2 als
Substrat im Dunkeln inkubiert. Das DAB-Substrat (Diaminobenzidin) wird durch die
Peroxidase-Aktivität in einen braunen Farbstoff umgewandelt. Beim Erreichen der
gewünschten Färbeintensität, wurden die Objektträger für zehn Minuten gewässert,
anschließend eine Minute in Hämalaun gegengefärbt und die Färbung durch Wässern für
eine Minute unter fließendem Leitungswasser gestoppt. Anschließend wurden die
Präparate für 20 Sekunden in HCl-Ethanol inkubiert und erneut für 10 Minuten gewässert.
Danach wurden die Gewebeschnitte entwässert, indem sie jeweils zwei Minuten in 70 %,
80 %, 90 %, 96 % und 100 % Ethanol und 2-mal fünf Minuten in Xylol inkubierten.
Anschließend erfolgte das luftblasenfreie Einbetten in Eukitt und die Lagerung bei
Raumtemperatur.
Blocklösung
ELISA-BSA 1 % (w/v)
Tween-20 0,1 % (v/v) bei Nrf-2
DAB-Substrat
1 Tablette Wasserstoffperoxid
1 Tablette DAB
in 1 ml Wasser
Kapitel 3 Material und Methoden
88
HCl-Alkohol
Salzsäure (25 %) 25 % (v/v)
Ethanol 70 % (v/v)
3.2.6. Molekularbiologische Analysen
3.2.6.1. Ras-GTPase Assay
Entsprechend den Angaben nach Upstate wurden die unter 3.2.3.3 erhaltenen Proben für
eine Positivkontrolle (Ansatz mit 100 µM -S-GTP versetzt), für eine Negativkontrolle
(Ansatz mit 100 µM GDP versetzt) und als Pull-down (PD)-Ansätze (Probe ohne Zusatz)
eingesetzt.
Nach dem Zusatz der Positivkontrolle bzw. Negativkontrolle inkubierten die Ansätze für
30 min bei 30°C. Danach wurde die Ladereaktion in den Kontrollen durch den Zusatz von
32 µl 1 M Magnesiumchlorid gestoppt. Anschließend wurden 20 µg Raf-1-RBD-Agarose
zu den Reaktionsansätzen gegeben, die eine Stunde bei 4°C im Überkopfschüttler
inkubierten. Danach wurden die Beads durch Zentrifugation für fünf Minuten bei
4000 rpm und 4°C pelletiert, der klare Überstand vorsichtig abgenommen, die Beads mit
500 µl MLB-Puffer gewaschen und erneut zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde
insgesamt dreimal durchgeführt. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Beads in 50 µl
2x LSB resuspendiert, fünf Minuten bei 100°C gekocht, auf Eis Schock gekühlt und fünf
Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Die Lagerung erfolgte bei -20°C bzw. die Proben
wurden gleich auf 15 %-ige SDS-Gele überführt und Immunoblots durchgeführt.
5x MLB-Puffer
1x MLB
2x LSB-Puffer
s.Seite 81 ff.
Kapitel 3 Material und Methoden
89
3.2.6.2. Nucleinsäureanalytik
3.2.6.2.1. DNA-Isolierung für Genotypisierungsanalysen
Die DNA-Isolierung aus Mausschwänzen bzw. -ohren erfolgte mittels PCR Lysis Reagent
von Viagen. Dazu wurden 200 µl Lysis Reagent mit dem jeweiligen Gewebe für 45 min
bei 85°C inkubiert und anschließend 1-2 µl des Reaktionsansatzes für die Polymerase-
Ketten-Reaktion eingesetzt.
3.2.6.2.2. Bestimmung der DNA-/RNA-Konzentration
Die Bestimmung der DNA-/RNA-Konzentrationen erfolgte durch eine Messung der
optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm mittels Nano Drop.
Eine OD von eins bei 260 nm entspricht dabei einer Konzentration an doppelsträngiger
DNA von 50 µg/ml bzw. an einzelsträngiger RNA von 40 µg/ml.
3.2.6.2.3. cDNA-Synthese (Reverse Transkriptase-Polymerase-
Ketten-Reaktion, RT-PCR)
Für die RT-Reaktion wurden 1 µg RNA in 3-6 µl Wasser aufgenommen und denaturiert.
Anschließend erfolgte nach dem Zusatz von 17-34 µl Reaktionsansatz die RT-Reaktion.
Aus diesem Reaktionsansatz wurden direkt 1-3 µl neusynthetisierte cDNA für die
nachfolgende PCR eingesetzt. Daher handelt es sich hierbei um eine Zweistufen-RT-PCR-
Reaktion.
Denaturierung
65°C 5 min
4°C
RT-Reaktion (cDNA-Synthese)
42°C 15 min
99°C 5 min
4°C
Kapitel 3 Material und Methoden
90
Tabelle 15 Reaktionsansatz für die RT-Reaktion mit 20 µl Reaktionsvolumen
Komponente Volumen [µl]
25 mM Magnesiumchlorid 4
10x Puffer 2
50 µM oligo(dT)-Primer 1
je 10 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP je 2
RNase Inhibitor (20 U/µl) 1
MuLV Reverse Transkriptase (50 U/µl) 1
3.2.6.2.4. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die eingesetzten Primer wurden chemisch synthetisiert und sind in Tabelle 7
zusammengefasst.
Der Reaktionsansatz (Tabelle 16) wurde zunächst für fünf Minuten auf 95°C erhitzt, um
DNA-Einzelstränge zu erhalten. Anschließend erfolgte eine Abkühlung des
Reaktionsansatzes für anderthalb Minuten, um die Hybridisierung der Primer an die
DNA-Einzelstränge zu ermöglichen. Von diesen ausgehend wurden nun in beiden
Richtungen komplementäre DNA-Stränge bei 72°C für zweieinhalb Minuten neu
synthetisiert. Anschließend wurde der Reaktionsansatz auf 94°C für anderthalb Minuten
erhitzt, um erneut Einzelstränge zu erhalten. Wiederholtes Abkühlen führte zum
Hybridisieren der Primer an die DNA-Einzelstränge. Dieser Zyklusschritt der dreistufigen
PCR wurde 30-40-mal durchgeführt. Mit jedem neuen Zyklus kam es zu einem
exponentiellen Anstieg der neu-synthetisierten DNA.
Nach dem letzten Zyklus wurden für zehn Minuten 72°C gehalten, um unvollständige
DNA-Fragmente zu vervollständigen. Anschließend wurden die Proben auf 4°C gekühlt
und bis zum Auftrag auf ein Agarosegel bei dieser Temperatur gelagert (s.
Abbildung 24).
Kapitel 3 Material und Methoden
91
Tabelle 16 Reaktionsansatz für die PCR
Komponente Volumen [µl]
(c)DNA-Template 1 - 2
Primer forward (400 pmol) 1,25
Primer reverse (400 pmol) 1,25
dNTPs (je 10 mM) 0,4
10x Red Taq Puffer 2,5
Red Taq Polymerase 1,25
HPLC Wasser 17,25
Abbildung 24 Schematische Darstellung des Temperatur-Zeit-Profils einer dreistufigen PCR; D = Denaturierung;
S = Synthese; A = Annealing der Primer; RT = Raumtemperatur
3.2.6.2.5. Agarosegel
Zur Überprüfung der PCR-Reaktion unter 3.2.6.2.4 wurden 10 µl des
PCR-Reaktionsansatzes sowie 5 µl 1 kbp- bzw. 100 bp-DNA-Marker auf ein 1 %-iges
Agarosegel aufgetragen. Der Lauf erfolgte 45-90 min bei 120 V.
RT
S
A
EndeAbschlusssyntheseSchleife
30-40 mal Zyklus 1
Zeit
Temperatur
D
Kapitel 3 Material und Methoden
92
Agarosegel (in TBE)
Agarose 1,0 % (w/v)
TBE-Puffer
Tris/HCl 0,1 M
Börsäure 89 mM
EDTA 1 mM
pH 8.5
3.2.7. Lipidanalytik
3.2.7.1. Isolierung von Prostaglandinen (Powell)
Um Prostaglandine (PG) aus Medium oder Blutplasma zu gewinnen, wurde 1 ml
Probenmaterial mit 2 µl 1 N HCl auf pH 3,5 eingestellt. Nach dem Zusatz von 4 ml
Ethylacetat wurden die Proben 30 Sekunden gevortext, fünf Minuten bei 4000 rpm in der
Beckman-Zentrifuge zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abgenommen und die untere
Phase erneut mit 2 ml Ethylacetat extrahiert. Nach dem Vereinigen der Überstände wurde
das Ethylacetat mittels der Speedvac Vakuumzentrifuge verdampft, das Lipidpellet in 1 ml
Ethanol resuspendiert und die Proben auf Eis überführt.
Für eine Lipidextraktion aus dem Blasengewebe wurde dieses zunächst für eine Minute bei
2500 rpm mittels Mikrodismembrator unter Stickstoffkühlung pulverisiert. Anschließend
wurde das pulverisierte Gewebe in 1 ml Ethanol aufgenommen und 30 Sekunden gevortext
und auf Eis gehalten. Nach dem Zentrifugieren für zehn Minuten bei 4000 rpm und 4°C in
der Beckman-Zentrifuge wurde der Überstand in 4°C gekühlte Hecht Assistent Gläser
überführt. Das Pellet wurde in 1 ml 8 M Harnstoff gelöst und einer Proteinbestimmung
nach Bradford unterzogen.
Die erhaltenen Überstände wurden mit einer Natriumformiatlösung auf eine 15 %-ige
Ethanollösung eingestellt und bis zur Reversed-Phase Chromatographie auf Eis gelagert.
Kapitel 3 Material und Methoden
93
Natriumformiatlösung
Natriumformiat 0,1 M
pH 3,1
3.2.7.2. Anreicherung der Eicosanoide mittels Reversed-Phase
Chromatographie
Für die Anreicherung wurden 6 ml Silica-C18-Glasfiltersäulen mit 500 mg
Octadecyl-C18-Matrix verwendet. Über die SPU-Adsorbex-Säuleneinheit wurde ein
Unterdruck von bis zu 12 mbar während der Wasch- und Äquilibrierungsschritte erzeugt.
Zu Beginn wurden die Säulen mit 5 ml Ethylacetat (Lichrosolve), anschließend mit
Ethanol und Aqua bidest für den Probenauftrag vorbereitet.
Der Probenauftrag auf die Säulen erfolgte bei einem Druck von 2,5 mbar. Anschließend
erfolgte jeweils mit 5 ml 15%-igen Ethanol, Aqua bidest, 30 Sekunden Luftatmosphäre
und 5 ml n-Hexan eine Interferenzelution bei 12 mbar. Die Elution der Eicosanoide
erfolgte in 4 ml Ethylacetat bei Überdruck. Die Proben wurden anschließend bei -20°C
gelagert bzw. für den Enzym-Immunosorb-Assay weiter aufgearbeitet, in dem das
Ethylacetat in der Speedvac Vakuumzentrifuge verdampft und das Lipidgemisch in 500 µl
EIA-Puffer resuspendiert wurde. Die Proben wurden sofort für den Enzym-Immunosorb-
Assay eingesetzt oder bei -20°C gelagert.
3.2.7.3. Enzym-Immunosorb-Assay (EIA)
Mit Hilfe der Enzym-Immunosorb-Assays wurden die Mengen an 15-deoxy-Δ12,14
-PGJ2,
PGF2α, 6-keto-PGF1 bzw. PGE2 der zu untersuchenden Proben ermittelt.
Entsprechend der Angaben des Herstellers Cayman erfolgte für die PGF2α-, 6-keto-PGF1-
bzw. PGE2-Assays die Aufnahme des PG-Tracers, der PG-Standard Verdünnungsreihe
sowie des PG-Antikörpers in EIA-Puffer. Das Ellmann-Reagenz wurde kurz vor dem
Gebrauch in Aqua pure gelöst und im Dunkeln aufbewahrt.
Kapitel 3 Material und Methoden
94
Für die Bestimmung der Prostaglandinmenge wurden die Proben aus der Lipidextraktion
nach Powell herangezogen (s. 3.2.7.1), die in EIA-Puffer aufgenommen waren und bei
-20°C lagerten.
Nach dem Auftauen wurde eine geeignete Verdünnungsreihe der Proben in EIA-Puffer bei
4°C erstellt. 50 µl Probenansätze bzw. des Standards wurden daraufhin in Vertiefungen
von 96-Well-Immunosorbplatten (Cayman) überführt und jeweils mit 50 µl Tracer sowie
PG-Antiserum versetzt und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert. Danach wurden die
Reaktionsansätze fünfmal mit jeweils 200 µl pro Vertiefung mit Cayman-Waschpuffer
gewaschen und anschließend mit 200 µl pro Vertiefung Ellmanns-Reagenz versetzt und im
Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Intensitätszunahme des im Reaktionsansatz entstandenen gelben Farbstoffs wurde
photometrisch bei 405 nm am ELISA-Reader Elx800 über einen Zeitraum von sechs
Stunden verfolgt. Messungen erfolgten dabei nach 15, 30, 60, 120, 180, 240 und
360 Minuten.
Die Bestimmung der 15-deoxy-Δ12,14
-PGJ2-Menge nach dem Protokoll von Assay-Design
weicht von der Durchführung nach Cayman ab. Nach der Vorschrift von Assay-Design
wurden 100 µl Probenmaterial bzw. Standard in Vertiefungen von 96-Well-
Immunosorbplatten überführt, mit je 50 µl Tracer und 15d-PGJ2-Konjugat versetzt und
anschließend zwei Stunden bei 500 rpm und Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden
die Reaktionsansätze 3-mal mit 400 µl pro Vertiefung mit Waschpuffer gewaschen und
trocken geklopft. Nach dem Zusatz von 200 µl Farbreagenz inkubierten die
Reaktionsansätze für drei Stunden im Dunkeln bei 37°C. Die Farbreaktion wurde durch
den Zusatz von 50 µl Stopplösung gestoppt und die Proben sofort bei 405 nm am ELISA-
Reader Elx800 vermessen.
Über die sigmoidal verlaufende Standardeichkurve wurde die Prostaglandinmenge bezogen
auf die Gesamtproteinmenge der jeweiligen Probe bzw. auf 1 ml Volumen ermittelt. Die
Standardeichkurve unterliegt einer logistischen Wachstumsverteilung mit dem Formelsatz:
Nur die Datensätze im linearen Anstieg wurden für die Bestimmung der PG-Menge
herangezogen.
y = A1 - A2
1 + (x/x0)p
+ A2
Kapitel 3 Material und Methoden
95
3.2.8. In vitro Analysen
3.2.8.1. Kulturbedingungen
Die eingesetzten Zelllinien RT112 und 5637 wurden bei 37°C und 5 % Kohlenstoffdioxid-
Sättigung kultiviert.
Beim Passagieren wurden die Zellen mit 5 ml PBS gewaschen, mit 1 ml Trypsin
beschichtet, 10 min bei 37°C inkubiert und anschließend in 10 ml frisches Medium
resuspendiert, in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt und 106 Zellen in neue
T150-Kulturflaschen überführt.
3.2.8.2. AmplexRed Assay
Der AmplexRed Assay basiert auf dem fluorometrischen Nachweis von
Wasserstoffperoxid in lebenden Zellen. Dabei wird in Anwesenheit der Horseradish
Peroxidase (HRP) in einer stöchiometrischen Reaktion Wasserstoffperoxid mit
AmplexRed im Verhältnis 1:1 zu Resorufin (Absorption 571 nm, Extinktion 585 nm)
umgesetzt. Die Empfindlichkeit des Assays liegt bei 50 nM Wasserstoffperoxid.
Für den Assay wurden 750.000 Zellen in 60 mm Kulturschalen für 24 Stunden kultiviert
und anschließend für weitere 24 Stunden mit dem COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib
sowie in Kombination mit steigenden Konzentrationen an PGE2 inkubiert.
Entsprechend der Herstellerangaben erfolgte eine Vorbehandlung einer 96-Wellplatte, in
dem in jedes Well 100 µl bzw. 50 µl beim Standard Reaktionsmix vorgelegt und die Platte
für zehn Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Durch Zusatz von 20 µl Zellsuspension
(30.000 Zellen in Krebs-Ringer-Phosphat-Glucose-Lösung, KRPG) zum Reaktionsansatz
bzw. 50 µl Wasserstoffperoxid-Standard (Konzentration von 0,25 mM bis 8 mM) wurde
der AmplexRed Assay gestartet, die Platte erneut bei 37°C inkubiert und die Reaktion über
einen Zeitlauf von 24 Stunden photometrisch bei 560 nm am Fluoreszenzmessgerät Viktor
verfolgt. Die Auswertung erfolgte für 120 Minuten.
Kapitel 3 Material und Methoden
96
KRPG-Lösung
Natriumchlorid 0,145 M
Natriumphosphat 5,6 mM
Kaliumchlorid 4,86 mM
Calciumchlorid 0,54 mM
Magnesiumsulfat 1,22 mM
Glucose 5,5 mM
pH 7,35
AmplexRed-Kit
3.2.8.3. Kulturbedingung für immunhistologische Analysen
Für immunhistochemische Untersuchungen wurden 750.000 Zellen auf
Multiwell-Objektträger für 48 Stunden kultiviert und anschließend für weitere 24 Stunden
mit dem selektiven COX-2 Inhibitor Celecoxib sowie in Kombination mit steigenden
Konzentrationen an PGE2 inkubiert. Nach dem Waschen in PBS wurden die Objektträger
für 10 min in Aceton fixiert und wie unter 3.2.5.6 weiterbehandelt.
3.2.9. Statistik
Statistische Analysen zur Bestimmung der Signifikanzen wurden für alle Experimente mit
SigmaPlot und DyCyder 6.5 durchgeführt und der unpaired Student´s t-Test gewählt. Die
Bestimmungen der Signifikanzen erfolgten gegen die Kontrollwerte. Der p-Value ist eine
Wahrscheinlichkeit mit einem Wertebereich von 0 bis 1. In dieser Arbeit wurden alle
Datenätze, deren p-Value < 0,05 waren, als statistisch signifikant, innerhalb des
Konfidenzbereichs von 95 %, betrachtet.
Kapitel 4 Ergebnisse
97
Kapitel 4 Ergebnisse
4.1. Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Mausmodell
Um die Rolle der COX-2 in der Harnblase studieren zu können, wurde die in der
Arbeitsgruppe generierte K5.COX-2 transgene Mauslinie verwendet. Dabei steht die
COX-2 full-length cDNA unter der Kontrolle des bovinen Keratin 5-Promotors (K5), so
dass es zu einer konstitutiven Überexpression des COX-2 Proteins in den basalen
Epithelschichten (Mucosa) der Harnblase kommt, da Keratin 5 ein Bestandteil der
Intermediärfilamente basaler, proliferationsaktiver Keratinozyten ist (Abbildung 25A, B).
In dieser Arbeit erfolgte fast ausschließlich die Analyse an weiblichen homozygoten
Tieren der K5.COX-2 transgenen Mauslinie 675+/+
. Die homozygoten Tiere zeichneten
sich im Vergleich zu NMRI-Wildtyptieren durch ein struppig und fettig erscheinendes
Haarkleid aus, das ab dem dritten Monat nach der Geburt in eine starke Alopezie überging
(Abbildung 25C). Ferner kam es zu einem verstärkt, ausgeprägten Krallenwachstum an
Hinter- und Vorderfüßen der homozygoten Tiere. Die K5.COX-2 transgenen Mäuse
wirkten im Vergleich zu ihren gleichaltrigen NMRI-Kontrolltieren zierlicher und
zeichneten sich zudem durch ein geringeres Fettgewebe aus. Dieser bei homozygoten
transgenen Mäusen beobachtete Phänotyp war in heterozygoten transgenen Tieren
geringfügig schwächer ausgeprägt (161).
Kapitel 4 Ergebnisse
98
Abbildung 25 Die Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Maus. In dem transgenen Mausmodell steht die COX-2
full-length cDNA (A) unter der Kontrolle des Keratin 5-Promotors, so dass es zu einer Überexpression des
Proteins in der basalen Epithelschicht (*) der Harnblase transgener Tiere (tr) kommt (B). K5.COX-2 transgene
Tiere zeichnen sich im Vergleich zu Wildtyp NMRI-Kontrolltieren (wt) durch ein fettiges, strähniges und dünnes
Haarkleid aus sowie extrem langen Krallen (C).
wt
tr
wt
COX-2 splice + pABoviner K5 Promoter
Mucosa Submucosa
Deckschicht
Lumen des Urothels
A
B C
*
*
tr
**
*** * **
*
***
*
**
*
*
**
**
**
**
**
**
**
**
**
**
*
*
*
*
***
*
**
** * *** ****
**
**
**
***********
Kapitel 4 Ergebnisse
99
4.2. COX-2 Proteinexpression und Prostaglandinprofile in der Harnblase transgener Mäuse
4.2.1. Expression und immunhistochemische Lokalisation von
COX-Isoenzymen
Die COX-2 cDNA steht unter der Kontrolle des K5-Promotors, so dass es zu einer
konstitutiven Überexpression von COX-2 in der Harnblase kommt. Mittels RT-PCR
erfolgte die Analyse der COX-2 Expression in sieben und 12 Wochen alter Harnblase von
transgenen und Wildtyptieren. Wie aus Abbildung 26A hervorgeht, zeigte eine semi-
quantitative Auswertung der IDV (intensive density value) der RT-PCR Analyse über
-Aktin eine signifikante Erhöhung der COX-2 RNA-Menge sowohl in sieben als auch in
12 Wochen alter Harnblase transgener Mäuse verglichen mit Wildtyptieren (> 1,5;
p-Value < 0,005), während die COX-1 RNA-Menge unverändert war. Um die COX-2
Expression auf Proteinebene zu überprüfen, erfolgte eine Immunpräzipitation der
COX-Isoenzyme von sechs Monate alten transgenen Tieren. Mittels anschließendem
Immunoblot konnte nur in der Harnblase von transgenen Mäusen eine COX-2 Expression
nachgewiesen werden (Abbildung 26B). Die Expression des COX-1 Isoenzyms war in
beiden Genotypen konstitutiv und vergleichbar stark.
Keratin 5 ist ein Bestandteil der Intermediärfilamente basaler, proliferationsaktiver
Keranozyten, so dass es durch den K5-Promotor zu einer gerichteten COX-2 Expression in
diesem Kompartiment kommen sollte. Mittels indirekter Immunfluoreszenz-Analyse
erfolgte die Lokalisation von COX-2 in sechs Monate alter nicht-hyperplastischer und
hyperplastischer Harnblasenschleimhaut transgener sowie Wildtyptiere. Keratin 5 wurde
im basalen Harnblasenepithel von Wildtyptieren sowie in nicht-hyperplastischer und
hyperplastischer Schleimhaut transgener Mäuse detektiert (Abbildung 27A, B). Im
hyperplastischen Epithel erstreckte sich die K5 Expression in den suprabasalen und
luminalen Bereich (Abbildung 27C). Eine Expression von COX-2 konnte nur im
transgenen basalen und luminalen Blasenepithel detektiert werden (Abbildung 27D-F).
Wie Abbildung 27 zeigt, konnte eine eindeutige Co-Lokalisation von Keratin 5 und
COX-2 vom basalen zum luminalen Epithel in der Harnblase transgener Mäuse detektiert
werden.
Kapitel 4 Ergebnisse
100
Abbildung 26 Expression von COX-Isoenzymen in K5.COX-2 transgener und Wildtypharnblase.
A) RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von COX-1 und COX-2 in 7-12 Wochen (Wo) alter Wildtyp- (wt)
und K5.COX-2 transgener (tr) Harnblaser. Semi-quantitative Analyse über β-Aktin als interne Kontrolle zeigte in
der Harnblase von 7 und 12 Wochen alten transgenen Mäusen eine signifikante Erhöhung der COX-2 RNA-
Menge (> 1,5; p-Value < 0,005), während die COX-1 RNA-Menge unverändert war. n = 3 Tiere pro Gruppe.
DNA-Größenstandards: M1= GeneRuler 1 kb DNA Leiter, M2 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. Student´s t-Test.
B) Immunoblot-Analyse der COX-Isoformen 1 und 2 in der Harnblase von 6 Monate alten Wildtyp- und
homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen mittels Immunopräzipitation. Nur in der Harnblase von transgenen
Mäusen konnte die Expression von COX-2 nachgewiesen werden, während die COX-1 Expression unverändert
war. 7,5 %-iges SDS-Polyacrylamidgel. n = 3 Tiere pro Gruppe, kDa = Molekulargewicht des Referenzproteins in
Kilodalton, * Kreuzreaktion des Antikörpers mit IgG.
COX-1
66
wt tr
COX-2
66
kDa
*
*
A
- COX-2
- COX-1
- -Aktin
600 -
500 -
500 -
M1 M2 wt tr wt tr
7 Wo
(-)bp
12 Wo
7 Wo 12 Wo
0
25
50
75
100
125
150
175
IDV
CO
X-1
/-2 /
ID
V
-Ak
tin
[% w
t]
Kontrolle (wt)
COX-1
COX-2
B
Kapitel 4 Ergebnisse
101
Abbildung 27 Immunolokalisation von Keratin 5 und COX-2 im basalen Epithel der Harnblase. In Kryoschnitten
der Harnblase von 6 Monate alter weiblicher Wildtyp- (A, D, G) und K5.COX-2 transgener, nicht-
hyperplastischer (B, E, H) sowie hyperplastischer (C, F, I) Harnblasenschleimhaut erfolgte die Analyse der
Lokalisation von Keratin 5 (A-C) und die COX-2 Expression (D-F) durch indirekte Doppelimmunfluoreszenz.
Keratin 5 (K5) ist als rotes Cy3- und COX-2 als grünes AlexaFluor488-Fluoreszenzsignal zu erkennen. In den
übereinandergelagerten K5-COX-2-Bildern (G-H), in denen die Zellkerne zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff
blau angefärbt wurden, ist eine eindeutige Kolokalisation von beiden Antigenen im basalen und suprabasalen
Eptihel in der Harnblase von den homozygoten transgenen Mäusen gezeigt (H, I). Vergrößerung: x 40, x 63 (C, F,
I).
Zusätzlich wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz die COX-1 Lokalisation in der
Harnblase sechs Monate alter Mäuse analysiert. Wie aus Abbildung 28 ersichtlich ist,
erfolgte die COX-1 Expression in der Tunica muscularis und in den Blutgefäßen der
Harnblase transgener (Abbildung 28A, B) und Wildtyptiere (Abbildung 28C, D).
wt
basal
luminal
A
D
G
B
E
H
C
F
I
suprabasal
tr
nicht hyperplastisch hyperplastisch
Keratin 5
COX-2
Keratin-5, COX-2, Hoechst
Kapitel 4 Ergebnisse
102
Abbildung 28 Immunolokalisation von COX-1 in der Tunica muscularis und in Blutgefäßen der Harnblase. In
Kryoschnitte der Harnblase von 6 Monate alten weiblichen Wildtyp- (C, D) und K5.COX-2 transgenen (A, B)
Mäusen wurden die COX-1 Expression durch indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen. Die Zellkerne wurden
zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt. Die Expression von COX-1 erfolgte in der Tunica muscularis
sowie in den Blutgefäßen der Harnblase von transgenen und Wildtyptieren. Vergrößerung: x 40.
4.2.2. Erhöhte Prostaglandinspiegel in der Harnblase transgener Mäuse
Um zu überprüfen, ob die erhöhte COX-2 Expression in transgenen Mäusen zu
veränderten Prostaglandinkonzentrationen führte, erfolgte mittels spezifischen Enzym-
Immunosorb-Assays die Analyse der Eicosanoide PGE2, PGF2, 15-deoxy-Δ12,14
-PGJ2,
einem dehydratisierten Metaboliten des PGD2, und 6-keto-PGF1, einem stabilen
Metaboliten des PGI2, im Plasma sowie in der Harnblase sieben Wochen alter weiblicher
Mäuse. Um geschlechtsabhängige Effekte auszuschließen, erfolgte zusätzlich die Analyse
der Eicosanoide PGE2, PGF2 und 6-keto-PGF1 in männlicher Harnblase gleichaltriger
Mäuse. Zu diesem Zeitpunkt hatten die transgenen Mäuse den Phänotyp noch nicht voll
ausgebildet, dennoch waren sowohl in weiblicher (w) als auch in männlicher (m)
tr
wt
Lamina muscularis Blutgefäße
A
C
B
D
Kapitel 4 Ergebnisse
103
Harnblase transgener Mäuse der PGE2-Spiegel 1,8 bzw. 2-fach und der PGF2-Spiegel
signifikant (p-Value < 0,02) 1,7 bzw. 2,3-fach erhöht (Abbildung 29). Im Plasma
weiblicher transgener Mäuse waren hingegen sowohl der PGE2- als auch der
PGF2-Spiegel signifikant (p-Value < 0,001) 4,2 bzw. 2,5-fach erhöht. Nahezu unverändert
waren der 6-keto-PGF1-Spiegel in der Harnblase sowie 15-deoxy-Δ12,14
-PGJ2-Spiegel im
Plasma transgener Mäuse.
Abbildung 29 Prostaglandinbestimmung in der Harnblase sowie im Plasma von 7 Wochen weiblichen (w) und
männlichen (m) homozygoten COX-2 transgenen und Wildtyptieren. Sowohl in weiblicher (w) als auch in
männlicher (m) Harnblase transgener Mäuse war der PGE2-Spiegel leicht (> 1,8) und der PGF2-Spiegel (> 1,7)
signifikant erhöht, während im Plasma transgener Mäuse sowohl der PGF2 als auch der PGE2-Spiegel (> 2,5)
signifikant erhöht waren. Unverändert hingegen waren der 6-keto-PGF1- sowie PGJ2-Spiegel. Die Mittelwerte
ergeben sich aus n = 5 Werte ± SD. Student´s t-Test; * Harnbase: p-Value < 0,02; Plasma: p-Value < 0,001.
wt tr0
40
80
120
160
200
240
Plasma
*
m
PGE2
PGF2
6-keto-PGF1
PGJ2
Harnblase
wt tr0
4
8
400
450
500
**
[pg
PG/m
gP
rote
in]
w
wt tr0
40
80
120
160
200
240
*
[pg
PG/m
gP
rote
in]
w
Kapitel 4 Ergebnisse
104
Da weibliche und männliche Harnblasen transgener Mäuse die gleichen Tendenzen
hinsichtlich ihrer erhöhten COX-2 Expression (ohne Abbildung) als auch ihrer
Prostaglandinprofile zeigten, konnte von geschlechtsunabhängigen Effekten ausgegangen
werden und die weiteren Analysen erfolgte nur noch mit weiblichen Mäusen.
Nach Ausbildung des transgenen Phänotyps wurden die Prostaglandinkonzentrationen von
PGE2 und PGF2 in sechs Monate alten Mäusen erneut bestimmt. Um dabei zu überprüfen,
ob ein direkter Zusammenhang zu den bereits beobachteten erhöhten Prostaglandinprofilen
und der transgenbedingten COX-2 Überexpression besteht, wurden transgene Mäuse ab
dem ersten Tag ihrer Geburt mit dem COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib®
(CX) in einer
Konzentration von 1500 ppm gefüttert und deren Prostaglandinkonzentrationen ebenfalls
bestimmt. Diese behandelten Mäuse zeigten keine Ausbildung des unter 4.1 beschriebenen
Phänotyps.
Wie Abbildung 30 zeigt, waren in Harnblase transgener Mäuse der PGE2- und PGF2-
Spiegel signifikant 1,8 (p-Value 0,02) bzw. 2-fach (p-Value 0,025) erhöht. Die CX-
Behandlung in den transgenen Mäusen zeigte eine signifikante Reduktion der erhöhten
Prostaglandinspiegel auf Wildtypniveau (PGE2: p-Value 0,025 und PGF2: p-Value 0,005).
Dies zeigt, dass die erhöhten Prostaglandinlevel auf die transgenbedingte COX-2
Überexpression zurückzuführen waren.
Kapitel 4 Ergebnisse
105
wt tr tr + CX0
10
20
30
40
50
60
70
80
+
+
*
[pg
PG/m
gP
rote
in]
PGE2
PGF2*
Abbildung 30 Prostaglandinbestimmung in der Harnblase von 6 Monate alten COX-2 transgenen und
Wildtyptieren nach Celecoxibbehandlung. In Harnblase transgener Mäuse waren der PGE2- sowie PGF2-Spiegel
signifikant erhöht, während diese in Celecoxib behandelten transgenen Mäusen signifikant auf Wildtypniveau
reduziert waren. Die Mittelwerte ergeben sich aus n = 3-4 Werte ± SEM. Student´s t-Test; * p-Value 0,02 (bezogen
auf wt); + p-Value < 0,025 (bezogen auf tr).
4.3. Eine Proliferationsstörung bedingt Hyperplasie und spontane
Tumorentstehung
Die Bestimmung der Prostaglandinkonzentrationen zeigte eine signifikante Erhöhung an
PGE2 in Harnblase transgener Mäuse. Da PGE2 in vielen physiologischen Prozessen wie
z. B. Angiogenese, Immunantwort, Apoptose und Zellproliferation involviert ist
(74;84;90;118), erfolgte die histologische Analyse HE-gefärbter Kryoschnitte von sechs
und 12 Monate alten Mäusen. Die histologische Untersuchung zeigte, wie in Abbildung 31
dargestellt, eine spontane Entwicklung einer Hyperplasie (TCH, transitional cell
hyperplasia) in Harnblase transgener Mäuse. Auffällig war die Mehrlagigkeit des Epithels
im Transgen (Abbildung 31B) verglichen zu den zwei bis vier Zelllagen im Wildtyp
(Abbildung 31A). Die Celecoxibbehandlung in transgenen Mäusen reduzierte die
Entwicklung der Hyperplasie (Abbildung 31C). R. Klein konnte in diesem Zusammenhang
Kapitel 4 Ergebnisse
106
eine Vergrößerung und Zunahme der Blutgefäße in der Harnblase K5.COX-2 transgener
Mäuse detektieren (13).
Die graphische Auswertung der histologischen Analyse in Abbildung 31D spiegelt die
Häufigkeit des Auftretens an Hyperplasien in den unbehandelten und behandelten Gruppen
Abbildung 31 Effekt einer Celecoxibbehandlung von 6 bzw. 12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen
Mäusen auf die Hyperplasie. HE-gefärbte Kryoschnitte der Harnblase von 12 Monate alten Wildtyptieren (A),
homozygoten K5.COX-2 trangenen Mäusen (B) sowie trangenen Tieren, die ab dem ersten Tag ihrer Geburt mit
einer Celecoxibdiät (1500 ppm) gefüttert wurden (C). Zu erkennen ist dabei die Verminderung der Hyperplasie in
Celecoxib behandelten transgenen Mäusen (C) auf Wildtypniveau (A) verglichen mit unbehandelten Transgenen
(B). Durch eine histologische Analyse (D) wurde der prozentuale Anteil der Hyperplasien in 6 und 12 Monate
alten Celecoxib behandelten und unbehandelten transgenen Mäusen ermittelt und gegenübergestellt. Zu erkennen
waren dabei die signifikanten Unterschiede nach dem Student´s t-Test mit p < 0,02-0,001 zwischen Wildtyp und
unbehandeltem Transgen sowie zwischen unbehandeltem und behandeltem Transgen bei 6 bzw. 12 Monaten.
(* bezogen auf wt; + bezogen auf tr); wt: n = 3 (6 Mo), n = 10 (12 Mo); tr: n = 12 (6 Mo), n = 10 (12 Mo); tr + CX:
n = 12 (6 Mo), n = 16 (12 Mo); Mo = Monate; Vergrößerung: x 40 (A-C).
wieder. Dabei manifestierte sich in 60-70 % der untersuchten unbehandelten transgenen
Mäuse eine Hyperplasie und in 7-10 % in CX behandelten Tieren. Dies deutete auf eine
A B
C
wt tr tr + CX0
15
30
45
60
75
90
*
++
Hä
ufig
ke
it d
er
Hyp
erp
lasie
n [%
]
6 Mo
12 Mo
*
D
Kapitel 4 Ergebnisse
107
Proliferationsstörung hin, so dass mittels indirekter Immunfluoreszenz das in
teilungsaktiven Zellen exprimierte Protein Ki67 in Kryoschnitten sechs Monate alter
Mäuse nachgewiesen wurde (Abbildung 32). In Wildtyptieren zeigten vereinzelte basale
Epithelzellen eine Ki67 positive Expression (Abbildung 32A), während in transgenen
Mäusen die Anzahl an Ki67 positiven Zellen stark erhöht war (Abbildung 32B). Die
CX-Behandlung in transgenen Mäusen führte zu einer deutlichen Reduktion der Ki67-
positiven Zellen auf Wildtypniveau (Abbildung 32C).
Neben der auftretenden Hyperplasie und der begleitenden Proliferationsstörung in der
Harnblase transgener Mäuse konnte die vereinzelt, spontan auftretende Entwicklung eines
Urothelkarzinoms beobachtet werden. Die spontane Entwicklung des Karzinoms erfolgte
ab circa dem zehnten Monat und war nicht nur auf homozygote transgene Mäuse begrenzt.
R. Klein et. al konnte bereits in diesem Zusammenhang zeigen, dass in 8 % der
untersuchten heterozygoten und 10 % der homozygoten transgenen Mäuse ein
Urothelkarzinom ausbildete (13). Abbildung 33 zeigt die HE-Färbung der Harnblase eines
Paraformaldehydschnittes einer zehn Monate alten heterozygoten transgenen Maus mit
einem Urothelkarzinom, bei dem der Tumor in die Submucosa und Tunica muscularis
invadierte. Zu erkennen ist der Verlust der regulären Zellstrukturen sowie das mehrlagige,
hyperplastische und dysplastische Epithel im Transgen verglichen zum Wildtyptier
(Abbildung 33A, B). K5.COX-2 transgene hyperplastische Blasen waren fast doppelt bis
viermal so groß wie Wildtypblasen gleichen Alters.
Abbildung 32 Nachweis von Ki67 in der Harnblase von 6 Monate alten homozygoten Celecoxib unbehandelten
und behandelten K5.COX-2 transgenen und Wildtyptieren. Mittels indirekter Immunfluoreszenz wurde in
Gefrierschnitten im Vergleich zu Wildtyptieren (A) eine erhöhte Anzahl des Ki67-Proteins in Zellen des Epithels
und in der Submucosa in der Harnblase transgener Mäuse (B) detektiert. Die Anzahl Ki67-positiver Zellen war in
Celecoxib behandelten Mäusen wieder reduziert (C). Vergrößerung: x 16.
A B C
Kapitel 4 Ergebnisse
108
Abbildung 33 Urothelkarzinom (TCC) in der Harnblase von heterozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In
Paraformaldhyd fixierte, HE-gefärbter Kryoschnitte von 10 Monate alter heterozygoter K5.COX-2 transgener
Maus (B-D) zeigte die spontane Entwicklung vom Urothelkarzinom (TCC) (B), bei dem der Tumor in die
Submucosa (C) und in die Tunica muscularis (D) invadierte. Verglichen zur Harnblase einer 12 Monate alten
Wildtypmaus (A) war die Harnblase transgener Mäuse (B) stark vergrößert. Vergrößerung: x 2,5 (A,B), x 40 (C,
D).
4.4. Die spontane Tumorentwicklung in Harnblase transgener Mäuse
erfolgt entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell
In der Harnblase heterozygoter und homozygoter transgener Mäuse wurde die selten
auftretende spontane Entwicklung eines Urothelkarzinoms beobachtet. Wie aus Abbildung
11 ersichtlich ist, sind zwei mögliche Modelle an Signalwegen im Menschen bekannt, die
zur Entwicklung des metastasierenden Urothelkarzinoms führen können. Um zu
überprüfen, ob die spontane Entwicklung des Urothelkarzinoms im transgenen
Mausmodell entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell oder dem invasiven
Urothelkarzinommodell erfolgte, wurden mittels Immunoblot die Expressionprofile von
Tunica muscularis
Submucosa
B
C
D
A
Kapitel 4 Ergebnisse
109
Her-2 und H-Ras entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell analysiert,
deren Expression im Urothelkarzinom erhöht sind (164-167).
4.4.1. Erhöhte Her-2 Level in der Harnblase transgener Mäuse
Im humanen Urothelkarzinom ist der Her-2 Level erhöht und mit Metastasierung sowie
schlechter Prognose assoziiert (164;165). Mittels Immunoblot erfolgte die kinetische
Analyse der Her-2 Expression in sieben bis 12 Wochen sowie sechs bis 12 Monate alter
Harnblase transgener sowie Wildtyptiere. Wie in Abbildung 34 ersichtlich ist, war die
Her-2 Expression in sechs und 12 Monate alten transgenen Mäusen erhöht, während in
sieben bis 12 Wochen alten Tieren keine veränderten Her-2 Level detektiert werden
konnten. Die semi-quantitative Auswertung ergab eine 2,8-fache Erhöhung
(p-Value 0,421) in sechs Monate und eine signifikante 3,2-fache Erhöhung (p-Value 0,003)
in 12 Monate alten transgenen Mäusen. Um zu überprüfen, ob der erhöhte Her-2 Level
COX-2 abhängig ist, wurden 12 Monate alte nicht-hyperplastische und hyperplastische
Harnblasen sowie die Harnblasen CX behandelter trangener Mäuse mittels Immunoblot auf
ihre Her-2 Expression untersucht. In Abbildung 35 ist zu erkennen, dass der erhöhte Her-2
Level auf die hyperplastischen Harnblasen transgener Mäuse begrenzt war (Abbildung
35A). Die semi-quantitative Analyse ergab eine eindeutige signifikante 4,8-fache
Erhöhung (p-Value 0,003) in den hyperplastischen Harnblasen transgener Mäuse und
bekräftigte damit zugleich die unabhängige kinetische Her-2 Analyse (Abbildung 35B).
Kapitel 4 Ergebnisse
110
Abbildung 34 Kinetische Analyse der Expression von Her-2 in K5.COX-2 transgener Harnblase. Die Immunoblots
zeigen, dass eine Erhöhung der Her-2 Expression (2,8-fach, p-Value 0,421) in 6 Monate alter Harnblase
transgener Mäuse erfolgte, die bei 12 Monate alten K5.COX-2 Tieren signifikant erhöht war (3,2-fach,
p-Value 0,003). Die Normierung erfolgte über -Aktin. Mittels 7,5 %-igen SDS-Gel wurden 100 µg Gesamtprotein
elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.
Die Behandlung mit dem selektiven COX-2 Inhibitor Celecoxib reduzierte die Expression
von Her-2 um den Faktor 1,8 (p-Value 0,158) in den behandelten Tieren bezogen auf die
unbehandelten transgenen Mäuse (Abbildung 35).
-Aktin45
7 Wo 12 Wo
wt wttr trkDa
Her-2
205
-Aktin45
6 Mo 12 Mo
wt wttr trkDa
Her-2205
Kapitel 4 Ergebnisse
111
Abbildung 35 Effekt der Celecoxibbehandlung auf die Her-2 Expression in der Harnblase 12 Monate alter
homozygoter transgener Mäuse.
A) Immunoblot der Her-2 Expression in der Harnblasen von Wildtyptieren und Celecoxib behandelten (CX)
transgenen Mäusen sowie von Transgenen mit nicht-hyperplastischen (n.h.) und hyperplastischen (h.)
Harnblasen. 130 µg Gesamtprotein wurden mittels 7,5 %-igem SDS-Gel separiert.
B) Semi-quantitative Auswertung normiert über -Aktin. Die Expression von Her-2 war signifikant in
hyperplastischen Blasen erhöht und in nicht-hyperplastischen Blasen unverändert. Die CX-Behandlung zeigte
eine Erniedrigung der Her-2 Expression um den Faktor 1,8 verglichen mit unbehandelten hyperplastischen
Blasen. n = 3Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.
Dies zeigt einerseits, dass die Erhöhung der Her-2 Expression möglicherweise durch die
transgenbedingte COX-2 Überexpression beeinflusst wird und andererseits, dass die
Entwicklung des TCC im transgenen Mausmodell dem humanen papillären
Urothelkarzinom entsprechen könnte.
wt:trn.h. wt:trh. trh.:trCX
Her-2
Faktor 0,8 4,8 1,8
p-Value 0,324 0,003 0,158
B
A
-Aktin45
Her-2
205
wt tr (h.)tr (n.h.) tr CXkDa
Kapitel 4 Ergebnisse
112
4.4.2. Ras ist in der Harnblase transgener Mäuse aktiviert
Um zu bekräftigen, dass die Entwicklung des TCC in K5.COX-2 transgenen Mäusen
entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell erfolgen könnte, wurde eine Pull-
down-Assay durchgeführt, bei dem die Analyse des Ras-GTP-Status in 12 Monate alten
Tieren mittels Immunoblot erfolgte. Damit falsch-positive Ergebnisse ausgeschlossen
werden konnten, wurden unabhängige Proben in vitro mit -S-GTP, welches als
Positivkontrolle diente und mit GDP, welches als Negativkontrolle diente, beladen. Das
intensivere Signal der GTP-Positivkontrolle in Abbildung 36A verglichen mit der
GDP-Negativkontrolle spiegelte die Funktionalität des Assays wieder. Abbildung 36B
zeigt den Immunoblot von Ras-GTP, totalem Ras und -Aktin als interne Ladekontrolle.
Für die semi-quantitative Auswertung wurden die IDV (intensive density value) von
Ras-GTP auf die des totalen Ras bezogen und anschließend auf -Aktin normiert. Dabei
wurde eine 1,4-fache Ras-GTP Aktivierung (p-Value 0,05) in der Harnblase transgener
Mäuse bezogen auf Wildtyptiere ermittelt.
Dieses Ergebnis bekräftigt damit das vorherige Resultat und unterstreicht damit die
schlussfolgernde Hypothese, dass die Entwicklung des TCC im transgenen Mausmodell
somit entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell erfolgen könnte. Da bei
diesem Assay alle drei Ras-GTP-Isoformen (H-Ras, N-Ras und K-Ras) als gesamtes Ras-
GTP analysiert werden, kann keine explizite Aussage getroffen werden, welche Ras-
Isoform aktiviert war. Da aber im humanen Urothelkarzinom das H-Ras eine dominante
Rolle spielt, wurde davon ausgegangen, dass auch im transgenen Mausmodell eine H-Ras
Aktivierung vorliegen könnte (22;140).
Kapitel 4 Ergebnisse
113
Abbildung 36 Erhöhter Ras-GTP Spiegel in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase. Semi-quantitative
Analyse der IDV von Ras-GTP sowie totales Ras jeweils über -Aktin mit anschließender Gegenüberstellung und
normiert auf 100 hat eine 1,4-fache Erhöhung (p-Value 0,05) an aktiviertes Ras in der Harnblase transgener
Mäuse ergeben (B). Als Positiv- (GTP) bzw. Negativkontrolle (GDP) wurden 1 mg unabhängiger Proben mit
-S-GTP bzw. GDP in vitro inkubiert (A). Weitere 1 mg Gesamtproteinlysat wurden als Mock behandelt und
dienten als Pull-down-Ansatz (B). 120µg Gesamtprotein sowie 60µg der GTP, GDP bzw. Pull-down-Ansätze
wurden im 10 %-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. PK = Positivkontrolle.
Student´s t-Test.
wt trPKkDa
totales Ras
25Ras-GTP
25
-Aktin45
kDa
25
A
B
0
25
50
75
100
125
150
Rel
ativ
e D
ensi
tom
etri
e [%
]
(Ras
-GT
P/ß
-Akt
in)/
(tot
ales
Ras
/ß-A
ktin
)
wt tr
Kapitel 4 Ergebnisse
114
4.5. Zusammenhang zwischen COX-2 Überexpression und einem
entzündlichen Phänotyp
Histologische Untersuchungen zeigten das Vorhandensein von entzündlichen
Zellverbänden (Zellclustern) in der Harnblase transgener Mäuse. Die Präsenz der
Entzündungscluster erfolgte bereits im Alter von sechs Monaten. In Wildtyptieren wurden
selten und vergleichsweise sehr kleine Entzündungscluster beobachtet. Dabei zeigte sich
eine „Ursache-und-Wirkung“-Beziehung zwischen der transgenbedingten COX-2
Überexpression und deren Aktivität sowie der Entwicklung des hyperplastischen und
entzündlichen Phänotyps. Abbildung 37B zeigt eine repräsentative Darstellung der großen
Entzündungscluster in 12 Monate alter Harnblase transgener Mäuse. Verglichen zu
Wildtyptieren (Abbildung 37A) ist außerdem das stark hyperplastische Blasenepithel
erkennbar. Der COX-2 selektive Inhibitor Celecoxib unterdrückte die Ausbildung des
hyperplastischen Phänotyps in den behandelten transgenen Mäusen, wie es in Abbildung
37C zu sehen. Die histologische Analyse von sechs und 12 Monate alten Mäusen wurde in
einem Boxplot zusammengefasst (Abbildung 37D), in dem die Anzahl der entzündlichen
Zellcluster über die Tiergruppen (Wildtyptiere, Transgene und CX behandelte Transgene)
dargestellt wurde. Sowohl in sechs als auch in 12 Monate alten transgenen Mäusen war die
Anzahl an entzündlichen Zellclustern verglichen mit Wildtyptieren signifikant erhöht
(p-Value < 0,02) und nur in sechs Monate alten CX behandelten Tieren auf Wildtypniveau
wieder reduziert. In 12 Monate alten CX behandelten transgenen Mäusen konnte keine
Abnahme der Anzahl an Entzündungsclustern, jedoch eine Reduktion in ihrer Größe
beobachtet werden. Die Präsenz an Entzündungszellen zeigt ein immer wiederkehrendes
Ereignis im Verlauf der Karzinogenese und während der Tumorbehandlung auf (168;169).
R. Klein hat ebenfalls eine hohe Präsenz an Entzündungsclustern beobachten können, so
dass seine Untersuchungen bestärkt werden konnten. Dessen Charakterisierung hat
ergeben, dass die Entzündungscluster vorwiegend aus B-Zellen, einigen T-Zellen und sehr
wenigen Makrophagen bestanden (13). Um seine Untersuchung auch dahingehend zu
bekräftigen erfolgte eine immunohistochemische Charaktersisierung der
Entzündungscluster in der Harnblase 12 Monate alter Mäuse. Wie aus Abbildung 38
eindeutig hervorgeht, bestanden die Entzündungscluster in der Harnblase transgener Mäuse
vorwiegend aus B-Zellen (Abbildung 38C, D), einigen T-Zellen (Abbildung 38A, B) und
sehr wenigen Makrophagen (Abbildung 38E, F) und sind damit konsistent zu R. Kleins
Kapitel 4 Ergebnisse
115
Beobachtungen. Zusätzlich kann jedoch gezeigt werden, dass selbst die in Wildtyptieren
selten beobachteten Entzündungscluster die gleiche Verteilung an den untersuchten
Entzündungszellen zeigten, wie in den transgenen Mäusen (Abbildung 38H, J). Die
Negativkontrollen zeigten keine spezifischen Färbungen (Abbildung 38G, I, K, L).
Abbildung 37 Nachweis von Entzündungsclustern in K5.COX-2 trangener Harnblase. HE-gefärbte Kryoschnitte
der Harnblase von 12 Monate alten Wildtyptieren (A) und homozygoten unbehandelten (B) und CX behandelten
(C) trangenen Mäusen (B). Zu erkennen sind deutliche, große Entzündungsareale in der Harnblase transgener
Mäuse (B), während in CX behandelten Transgenen die Entzündungsareale in ihrer Größe und Anzahl reduziert
waren (C). Durch eine histologische Untersuchung erfolgte die Auszählung der Entzündungsareale in sechs bzw.
12 Monate Celecoxib (CX) unbehandelten sowie behandelten homozygoten transgenen Mäusen (D). In den
unbehandelten sechs bzw. 12 Monate alten transgenen Mäusen war die Anzahl an Entzündungsarealen normiert
auf Wildtyptiere signifikant erhöht. CX-Behandlung reduzierte die Entzündungsareale in sechs Monate alten
transgenen Mäusen auf Wildtypniveau, jedoch nicht bei 12 Monate alten behandelten Tieren. Die Linie in der Box
repräsentiert den Median, das Viereck den Mean und die Boxen sind begrenzt durch den ersten und dritten
Quartile. Die Whiskers repräsentieren den Bereich 5-95 % und dem Koeffizienten x1,5 (inter-quartile range) zu
den am nächsten gelegenen Beobachtungen. p-Value < 0,02 (* bezogen auf wt; + bezogen auf tr); wt: n = 3 (6 Mo),
n = 10 (12 Mo); tr: n = 12 (6 Mo), n = 10 (12 Mo); tr + CX: n = 12 (6 Mo), n = 16 (12 Mo); Mo = Monate;
Vergrößerung: x 16 (A, B, C).
0
5
10
15
20
25
30 +*
tr + CXtr
An
zah
l d
er E
ntz
ün
du
ng
sclu
ster
6 Mo
12 Mo
wt
*
BA
D
C
Kapitel 4 Ergebnisse
116
Abbildung 38 Charakterisierung der Entzündungscluster in 12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen
Mäusen und Wildtyptieren. Immunhistochemische Analyse (A-D, G-J) sowie Immunfluoreszenzanalyse (E, F, K,
L) von Aceton-fixierten Kryoschnitten wurden mittels spezifischer Primärantikörper gegen T-Zellen
(anti-CD4/L3T4) (A, B, H), B-Zellen (anti-CD45R/B220) (C, D, I) und Makrophagen (F4/80) (E, F) inkubiert. Die
Detektion erfolgte mit Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper mit DAB/H2O2 als Substrat (A-D, G-J) bzw.
AlexaFluor488-gekoppelten Fluoreszenzsekundärantikörper (E, F, K, L). Die Entzündungsareale in K5.COX-2
transgener Harnblase bestanden aus vereinzelten T-Zellen (A) und einem großen Anteil an B-Zellen (C). In
Wildtyptieren kamen selten Entzündungsareale vor, die neben vereinzelten T-Zellen (H) vorrangig aus B-Zellen
(J) bestanden. Sowohl die Harnblase von Wildtyptieren als auch die transgener Mäuse zeigten das Vorhandensein
von Makrophagen (E, F). Vergrößerung: x 16 (B, D), x 63 (A, C, E-J). Negativkontrollen ohne Inkubation mit
primären Antikörpern zeigten keine spezifischen Signale (G, I, K, L).
Damit kann gezeigt werden, dass Entzündungsreaktionen während der Entwicklung des
hyperplastischen Phänotyps maßgeblich involviert sind.
T-Zellen
tr
B-Zellen
wt
A
C
B
D
E F
G
J
K
Makrophagen
L
H
I
Kapitel 4 Ergebnisse
117
4.6. Analyse des Prostaglandin E2 Syntheseweges
4.6.1. Expression der Prostaglandin E Synthase (PGES-)Isoformen
Die Hauptfunktion der COX-2 ist die Umsetzung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen,
wobei das PGE2 das dominante und aktive Endprodukt darstellt (132). PGE2 ist in vielen
patho-/physiologischen Prozessen wie z. B. Angiogenese, Immunantwort, Apoptose und
Zellproliferation involviert (74;84;90;118), so dass diese Funktion dem PGE2 ein malignes
Potential impliziert (133;134). Da die transgenbedingte COX-2 Überexpression eine
signifikante Erhöhung des PGE2-Spiegels ausmachte (s. Abbildung 29, Abbildung 30),
erfolgte die Expressionsanalyse der PGES-Isoformen, um zu überprüfen, ob eine
deregulierte Expression vorliegt. Wie bereits unter 1.4.2 beschrieben, sind drei
PGES-Isoformen bekannt (cPGES, mPGES-1, mPGES-2), von denen die mPGES-1
ähnlich wie die COX-2 induzierbar ist. Daher wurde mittels RT-PCR das Expressionsprofil
auf mRNA-Ebene von mPGES-1 untersucht. Die semi-quantitative Auswertung der
kinetischen RT-PCR-Analyse von mPGES-1 in der Harnblase von sieben bis 12 Wochen
sowie sechs bis 12 Monate alten Wildtyptieren und K5.COX-2 transgenen Mäusen zeigte
nur in 12 Wochen alten transgenen Tieren eine 1,4-fache Erhöhung (p-Value 0,06) der
mPGES-1 mRNA-Menge (Abbildung 39). Jedoch konnte auf Proteinebene mittels
Immunoblot-Analyse keine Erhöhung der Expression von mPGES-1 in 12 Wochen alten
trangenen Mäusen nachgewiesen werden, wie es in Abbildung 40 dargestellt ist. Auch die
Expression der cPGES und mPGES-2 waren in diesem Alter auf Proteinebene unverändert.
Erst in der Harnblase von sechs und 12 Monate alten transgenen Mäusen konnten
veränderte PGES Expressionsprofile mittels Immunoblot detektiert werden. Wie aus
Abbildung 41 ersichtlich ist, war die Expression der cPGES-1 in K5.COX-2 Mäusen
unverändert, während die mPGES-2 in 12 Monate alten transgenen Tieren 1,6-fach
(p-Value 0,086) erhöht war. Die mPGES-1 hingegen war bereits in sechs Monate alten
transgenen Mäusen 1,4-fach (p-Value 0,446) und in 12 Monate alten transgenen Tieren
2,5-fach (p-Value 0,096) erhöht.
Während eine Erhöhung des mPGES-1 Levels auf mRNA-Ebene nur in 12 Wochen alten
transgenen Mäusen detektiert werden konnte, war dies auf Proteinebene erst in sechs bzw.
explizit in 12 Monate alten transgenen Tieren möglich. Dies zeigt zum einen, dass die
Kapitel 4 Ergebnisse
118
mRNA-Menge nicht mit der Proteinexpression korrelieren muss und zum anderen, dass die
transgenbedingte COX-2 Überexpression demnach die mPGES-1 Expression beeinflusst.
Abbildung 39 Kinetischer RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von der induzierbaren mPGES-1 in
Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblaser. Semi-quantitative Analyse normiert auf β-Aktin als interne
Kontrolle zeigte, dass die mPGES-1 RNA-Menge nur in der Harnblase von 3 Monate (Mo) alten transgenen
Mäusen erhöht war (1,4, p-Value 0,06) (A, B). n = 3 Tiere pro Gruppe wurden analysiert. DNA-Größenstandards:
M1 = GeneRuler 1 kb DNA Leiter, M2 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. (-) Negativ-PCR; Student´s t-Test.
- mPGES-1600 -
500 -
M1 M2 wt tr wt tr
7 Wo 12 Wo
(-)bp
- -Aktin
- -Aktin
- mPGES-1
M1 M2 wt tr wt tr
6 Mo 12 Mo
600 -
500 -
(-)bp
7 Wo 12 Wo 6 Mo 12 Mo0
25
50
75
100
125
150
IDV
mP
GE
S-1
/ I
DV
-A
kti
n
[% w
t]
wt
tr
Kapitel 4 Ergebnisse
119
Abbildung 40 Immunoblot der Prostaglandin E Synthase Isoformen in 3 Monate alten K5.COX-2 transgenen und
Wildtyptieren. Die induzierbare mPGES-1 war in 3 Monate alten transgenen K5.COX-2 Mäusen verglichen mit
Wildtyptieren gleichen Alters nicht erhöht. In ihrer Expression ebenfalls nicht verändert waren die cPGES und
die mPGES-2. Die Normierung erfolgte über -Aktin. Mittels 10 %-igen SDS-Gel wurden 120µg Gesamtprotein
separiert. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.
cPGES
20
20
29
45
mPGES-1
mPGES-2
-Aktin
wtkDa tr
Kapitel 4 Ergebnisse
120
Abbildung 41 Immunoblot zum Nachweis der Expression der Prostaglandin E Synthase Isoformen in der
Harnblase von sechs und 12 Monate alten K5.COX-2 transgenen und Wildtyptieren. Die semi-quantitative
Analyse normiert über -Aktin zeigte eine unverändert Expression der cPGES sowohl in der Harnblase von sechs
Monate als auch von 12 Monate alten transgenen Tieren, während die mPGES-2 in 12 Monate alten transgenen
Mäusen um den Faktor 1,6 (p-Value 0,086) erhöht war. Die induzierbare mPGES-1 war in der Harnblase von
sechs Monate alten transgenen Mäusen um den Faktor 1,4 und von 12 Monate alten Transgenen um den Faktor
2,5 nicht signifikant erhöht (p-Value 6 Mo = 0,446; p-Value 12 Mo = 0,096). n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s
t-Test.
4.6.2. Expression und Lokalisation der Prostaglandin E Rezeptor
(EP-)Isoformen
4.6.2.1. Erhöhte Expression von EP2 und EP4 Rezeptor Isoformen in
der Harnblase transgener Mäuse
Prostaglandin E2 kann seine biologische Wirkung über die vier G-Protein-gekoppelten
7-Transmembranrezeptor Isoformen EP1-4 ausüben, die ihrerseits mit malignem Potenzial
6 Mo 12 Mo
wt wttr tr
45 -Aktin
mPGES-2
mPGES-1
cPGES
29
15
25
kDa
Kapitel 4 Ergebnisse
121
und der Entwicklung von Krebszellen assoziiert werden (135-138). Da die
transgenbedingte COX-2 Überexpression mit signifikant erhöhten PGE2-Spiegeln und
einer erhöhten Expression der induzierbaren mPGES-1 einherging, erfolgte die
Untersuchung der Prostaglandin Rezeptor Isoformen EP1-4, ob ebenfalls eine deregulierte
Expression vorliegt. Besonders EP2 und EP4 Rezeptor stehen im Zusammenhang bei der
malignen Progression des Urothelkarzinoms (16;17;132;133;139). Die semi-quantitative
Auswertung der kinetischen RT-PCR-Analyse der mRNA der EP-Rezeptor Isofomen in
der Harnblase von sieben bis 12 Wochen sowie sechs bis 12 Monate alten Wildtyptieren
und K5.COX-2 transgenen Mäusen zeigte nur in 12 Wochen alten transgenen Tieren eine
1,5-fache Erhöhung (p-Value 0,123) der EP4 Rezeptor mRNA-Menge (Abbildung 42). Um
das Expressionsprofil auf Proteinebene zu untersuchen, wurde zunächst die Spezifität der
Antikörper gegen die EP-Rezeptor Isoformen überprüft, um falsch-positive Signale
auszuschließen. Dazu wurden die Antikörperlösungen zuvor eine Stunde mit dem 5-fachen
Volumen an Blocking Peptide inkubiert. Aus Abbildung 43, die die Kompetition der
EP-Rezeptoren von 12 Wochen alten transgenen Mäusen zeigt, ist ersichtlich, dass die
Inkubation mit dem Blocking Peptide zum Verlust der spezifischen Signale für die
EP-Rezeptor Isoformen führte. Für den EP1 Rezeptor konnte die spezifische 42 kDa Bande
und eine weitere bei 45 kDa detektiert werden. Die Präsenz von multiplen Banden bei
Immunoblot-Analysen ist ein oft beobachtetes Ereignis bei GPCR (G protein-coupled
receptors), aufgrund der unterschiedlichen Glycolysierungen und der Neigung der
hydrophoben heptahelikalen GPCR SDS-unlösliche Homo- und Heterokomplexe zu bilden
(170-173). Für den EP2, EP3 sowie EP4 Rezeptor konnten in der Maus jeweils nur eine
dominante 53 kDa, 65 kDa bzw. 52 kDa Bande detektiert werden. Beim Menschen können
mitunter für den EP2 bzw. EP3 Rezeptor weitere spezifische Banden detektiert werden, die
ebenfalls auf die oben beschriebenen Glycosylierungen zurückzuführen sind. Jedoch sind
zahlreiche Subtypen einzelner EP-Rezeptor Isoformen bekannt, die zusätzlich zu dem
Banden-laddering beitragen (s.
Tabelle 3).
Kapitel 4 Ergebnisse
122
Abbildung 42 Kinetischer RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression der EP-Rezeptor Isoformen in Wildtyp- und
K5.COX-2 transgener Harnblaser. Nur in 12 Wochen alten transgenen Mäusen konnte mittels semi-quantitativer
Analyse eine Erhöhung der EP4 Rezeptor RNA-Menge ermittelt werden (1,5, p-Value 0,123). Als interne
Kontrolle diente β-Aktin. n = 3 Tiere pro Gruppe wurden analysiert. DNA-Größenstandards: M1 = GeneRuler
1 kb DNA Leiter, M2 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. (-) Negativ-PCR; Student´s t-Test.
- EP1
- EP2
- EP3
- EP4
- ß-Aktin
500 -
400 -
500 -
500 -
400 -
M1 M2 wt tr wt tr
7 Wo 12 Wo
(-)bp
- ß-Aktin
- EP4
- EP3
- EP2
- EP1
M1 M2 wt tr wt tr
6 Mo 12 Mo
500 -
400 -
500 -
500 -
400 -
(-)bp
Kapitel 4 Ergebnisse
123
Abbildung 43 Kompetition der EP-Rezeptoren in der Harnblase 3 Monate alter K5.COX-2 transgener Mäuse. Die
Inkubation mit dem Blocking Peptide zeigte eindeutig den Verlust der spezifischen Signale für die EP-Rezeptoren
in der Harnblase der Maus (EP1 42kDa, EP2 53 kDa, EP3 65kDa, EP4 52 kDa). 120 µg Gesamtprotein wurden
mittels 7,5 %-igen SDS-Gel separiert.
Damit wurde die Spezifität der Antikörper als gesichert angesehen und eine kinetische
Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen mittels Immunoblot von sieben und
12 Wochen sowie sechs und 12 Monate alten transgenen und Wildtyptieren durchgeführt,
die in der Abbildung 44 sowie Abbildung 45 zusammenfassend dargestellt sind. Die
semi-quantitative Auswertung über -Aktin als interne Ladekontrolle ergab keine
veränderten Expressionsprofile der EP-Rezeptor Isoformen EP1 und EP3 in transgenen
Mäusen im untersuchten Zeitraum von sieben Wochen bis 12 Monaten. Jedoch war der
EP4 Rezeptor bereits in 66 % der untersuchten 12 Wochen alten transgenen Mäuse
4,1-fach (p-Value 0,149) erhöht (Abbildung 44). Zu diesem Zeitpunkt konnte auch eine
erhöhte mRNA Expression der EP4 Rezeptor Isoform detektiert werden (vgl. Abbildung
42).
kDa - + peptide
66
66
45
EP4
EP1
EP2
EP3
45
Kapitel 4 Ergebnisse
124
Abbildung 44 Kinetische Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen in sieben und 12 Wochen alter
Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblase. Die Expression von EP1, EP2 und EP3 Rezeptoren zeigte keine
Unterschiede zwischen Transgenen und Wildtyptieren unterschiedlichen Alters, während die Expression von EP4
Rezeptor in der Harnblase von 12 Wochen alten transgenen Mäusen um den Faktor 4,1 (p-Value 0,149) erhöht
war. Als interne Kontrolle diente -Aktin. 100 µg Gesamtprotein wurden mittels 7,5 %-igen SDS-Gel
elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.
Während auf mRNA-Ebene keine weitere Erhöhung der EP-Rezeptor Isoformen in sechs
bzw. 12 Monate alten K5.COX-2 transgenen Mäusen detektiert werden konnte, war auf
Proteinebene in sechs Monate alten transgenen Tieren neben einer 1,6-fachen Erhöhung
(p-Value 0,406) des EP4 Rezeptors zusätzlich der EP2 Rezeptor 1,4-fach erhöht
(p-Value 0,194). Die erhöhte Expression der beiden Rezeptor Isoformen manifestierte sich
signifikant in 12 Monate alten transgenen Mäusen. Dabei waren der EP2 Rezeptor 1,6-fach
(p-Value < 0,001) und der EP4 Rezeptor 2,8-fach (p-Value 0,015) erhöht (Abbildung 45).
EP1
EP2
EP3
EP4
-Aktin45
66
66
66
45
7 Wo 12 Wo
wt wttr trkDa
Kapitel 4 Ergebnisse
125
Abbildung 45 Kinetische Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen in sechs und 12 Monate alter
Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblase. Die semi-quantitative Analyse normiert über -Aktin ergab keine
veränderte Expression von EP1 und EP3 Rezeptoren in der Harnblase von sechs bzw. 12 Monate alten transgenen
Mäusen verglichen mit Wildtyptieren, während in sechs Monate alter Harnblase transgener Tiere die Expression
von EP2 Rezeptor 1,4-fach (p-Value 0,194) und EP4 Rezeptor 1,6-fach (p-Value 0,406) erhöht waren. In
12 Monate alten K5.COX-2 transgenen Tieren waren die Expression dieser Isoformen signifikant erhöht (EP2
Rezeptor 1,6-fach, p-Value < 0,001, EP4 Rezeptor 2,8-fach, p-Value 0,015). 100 µg Gesamtprotein wurden mittels
7,5 %-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.
Die erhöhte Expression der EP-Rezeptoren EP2 und EP4 implementiert diesen Isoformen
eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Hyperplasie und des Urothelkarzinoms im
K5.COX-2 transgenen Mausmodell.
EP1
EP2
EP3
EP4
-Aktin45
45
66
66
45
6 Mo 12 Mo
wt wttr trkDa
Kapitel 4 Ergebnisse
126
4.6.2.2. Expression von EP2 und EP4 Rezeptor in Tumorzellen und
Entzündungszellen
Die Immunoblot-Analyse in 12 Monate alten transgenen Mäusen zeigte eine signifikante
Erhöhung der Expression von EP2 und EP4 Rezeptor, so dass mittels Immunhistochemie
sowie indirekter Immunfluoreszenz die Lokalisation der EP-Rezeptor Isoformen in der
Harnblase erfolgte. Da differentielle Expressionen nur in 12 Monate alten K5.COX-2
Mäusen beobachtet werden konnten, erfolgten die weiteren Analysen nur noch mit Tieren
dieses Alters.
Für die Immunfluoreszenz wurden die EP-Rezeptor Isoformen mit einem spezifischen
primären anti-EP-Rezeptor Antikörper sowie einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper
als rotes Signal und die Blutgefäße mit einem spezifischen primären anti-CD31 Antikörper
sowie einem AlexaFluor488-gekoppelten Sekundärantikörper als grünes Signal sichtbar
gemacht. Zusätzlich wurden die Zellkerne mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt,
welches in den übereinander gelagerten Kanälen sichtbar ist. Für die Immunhistochemie
wurde ein HRP-gekoppelter Sekundärantikörper gegen die EP-Rezeptor Isoformen
verwendet und mittels DAB/H2O2 als Substrat die Lokalisation sichtbar gemacht.
Abbildung 46 zeigt, dass EP1 Rezeptor sowohl von transgenen Mäusen (Abbildung
46A-F) als auch von Wildtyptieren (Abbildung 46G-H) in den Blutgefäßen und
Nervenfaszikel der Harnblase exprimiert wurde. Die Negativkontrollen (Abbildung 46I, J)
zeigten keine spezifischen Signale. Eine Expression des EP2 Rezeptors wurde in
transgenen Mäusen im basalen und luminalen Epithel, vorrangig perinucleär (das
Endomembransystem betreffend), detektiert, wie es in Abbildung 47A, C, E dargestellt ist,
während in Wildtyptieren der EP2 Rezeptor vorwiegend im luminalen Epithel exprimiert
wurde (Abbildung 47G). Zusätzlich konnte eine Expression des EP2 Rezeptors in einigen
Tumorzellen eines TCC in transgenen Mäusen detektiert werden (Abbildung 47B, D, F).
Die Negativkontrolle zeigte keine spezifischen Signale (Abbildung 47H). Auch der
EP3 Rezeptor wurde ähnlich wie der EP1 Rezeptor sowohl in transgenen Mäusen als auch
in Wildtyptieren in den Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase exprimiert, wie
Abbildung 48 zeigt. Jedoch schien der EP3 Rezeptor im Gegensatz zum EP1 Rezeptor
direkt in den Endothelzellen der Blutgefäße exprimiert zu werden. Zusätzlich erfolgte eine
Expression des EP3 Rezeptors in der basalen Epithelschicht sowie in der Tunica
muscularis in K5.COX-2 transgenen Mäusen und NMRI-Wildtyptieren (Abbildung 49).
Kapitel 4 Ergebnisse
127
Abbildung 46 Immunolokalisation von EP1 Rezeptor in den Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase 12
Monate alter Mäuse. Immunhistochemische Analyse (G, H, J) sowie Immunfluoreszenzanalyse (A-F, I) in
Kryoschnitten. EP1 Rezeptor ist als rotes Cy3- (A, B) und die Blutgefäße als grünes AlexaFluor488-
Fluoreszenzsignal (C, D) zu erkennen. Die Zellkerne wurden zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt
(E, F). Die Expression von EP1 Rezeptor erfolgte in Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase von
transgenen sowie Wildtyptieren (E-H). Negativkontrollen ohne Inkubation mit primären Antikörpern zeigten
keine spezifischen Signale (I, J). Vergrößerung: x 63.
wt
tr
EP1
CD31
Blutgefäße
EP1, CD31, Hoechst
Nervenfaszikel
A B
D
F
C
E
G H
I
J
Kapitel 4 Ergebnisse
128
Abbildung 47 Immunolokalisation von EP2 Rezeptor im Epithel- und Tumorgewebe der Harnblase 12 Monate
alter transgener Mäuse. Immunfluoreszenzanalyse in Kryoschnitten. EP2 Rezeptor ist als rotes Cy3- (A, B) und
die Blutgefäße als grünes AlexaFluor488-Fluoreszenzsignal (C, D) zu erkennen. Die Zellkerne wurden zusätzlich
mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt (E, F). Die Expression von EP2 Rezeptor erfolgte im Epithel der
Harnblase von transgenen sowie Wildtyptieren. Eine erhöhte Expression von EP2 Rezeptor konnte von
Tumorzellen nachgewiesen werden (F). Negativkontrolle ohne Inkubation mit primären Antikörpern zeigte keine
spezifischen Signale (H). Vergrößerung: x 63.
wt
tr
EP2
CD31
Mucosa
EP2, CD31, Hoechst
Karzinom
A B
D
F
C
E
G
H
EP2, CD31, Hoechst
Kapitel 4 Ergebnisse
129
Abbildung 48 Immunolokalisation von EP3 Rezeptor in den Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase 12
Monate alter Mäuse. Immunhistochemische Analyse (G, H, J) sowie Immunfluoreszenzanalyse (A-F, I) in
Kryoschnitten. EP3 Rezeptor ist als rotes Cy3- (A, B) und die Blutgefäße als grünes AlexaFluor488-
Fluoreszenzsignal (C, D) zu erkennen. Die Zellkerne wurden zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt
(E, F). Die Expression von EP3 Rezeptor erfolgte in Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase von
transgenen sowie Wildtyptieren. Negativkontrollen ohne Inkubation mit primären Antikörpern zeigten keine
spezifischen Signale (I, J). Vergrößerung: x 63.
wt
tr
EP3
CD31
Blutgefäße
EP3, CD31, Hoechst
Nervenfaszikel
A B
D
F
C
E
G H
I
J
Kapitel 4 Ergebnisse
130
Abbildung 49 Immunolokalisation von EP3 Rezeptor im Epithelgewebe und in der Muskulatur der Harnblase 12
Monate alter Mäuse. Immunhistochemische Analyse (G, H, J) sowie Immunfluoreszenzanalyse (A-F, I) in
Kryoschnitten. EP1 Rezeptor ist als rotes Cy3- (A, B) und die Blutgefäße als grünes AlexaFluor488-
Fluoreszenzsignal (C, D) zu erkennen. Die Zellkerne wurden zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt
(E, F). Die Expression von EP3 Rezeptor erfolgte im basalen Epithel und in der Muskulatur (Tunica muscularis)
der Harnblase von transgenen sowie Wildtyptieren. Vergrößerung: x 40 (Muskulatur), x 63 (Epithel).
Die immunohistochemische Analyse des EP4 Rezeptors zeigte ein positives Signal im
basalen und luminalen Epithel sowie in Blutgefäßen transgener Mäuse, während in
MuskulaturMucosa
wt
tr
EP3
CD31
EP3, CD31, Hoechst
A B
D
F
C
E
G H
Kapitel 4 Ergebnisse
131
Wildtyptieren in diesen Kompartimenten nur ein sehr schwaches Signal detektiert werden
konnte, wie es Abbildung 50-1 zeigt. Wie für den EP2 Rezeptor konnte auch für den
EP4 Rezeptor eine Expression in einem TCC-Areal in transgenen Mäusen nachgewiesen
werden (Abbildung 50-2). Darüberhinaus zeigten einige Zellen im Bereich des Karzinoms,
in der Submucosa und der Tunica muscularis, eine positive EP4 Rezeptor Expression.
Außerdem konnte eine Expression des EP4 Rezeptors in einigen Entzündungszellen eines
Entzündungsclusters in der Harnblase transgener Mäuse nachgewiesen werden, wie es in
Abbildung 50-3 dargestellt ist.
Die Lokalisationsanalyse der EP-Rezeptor Isoformen mittels Immunfluoreszenz und
Immunhistochemie zeigten, dass lediglich der EP2 und EP4 Rezeptor in einem TCC-Areal
in transgenen Mäusen nachgewiesen werden konnten. Diese Ergebnisse bekräftigen die
Annahme, dass EP2 und EP4 Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der
Hyperplasie und des Karzinoms in der Harnblase spielen, wie es Miyata et al. ebenfalls
beschreibt (132). Da zusätzlich der EP4 Rezeptor von einigen Entzündungszellen in
Entzündungsclustern exprimiert wurde, erfolgte die Analyse der Expression der
EP-Rezeptor Isoformen in Entzündungsclustern in der Harnblase 12 Monate alter
transgener Mäuse mittels Doppelimmunfluoreszenz. Die Expressionsanalyse der
EP-Rezeptor Isoformen wurde dabei auf B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen beschränkt.
Die EP-Rezeptor Isoformen wurden mit einem spezifischen primären anti-EP-Rezeptor
Antikörper sowie einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper als rotes Signal und die
Entzündungszellen mit einem spezifischen primären Antikörper (anti-CD4/L3T4 für T-
Zellen, anti-CD45R/B220 für B-Zellen und F4/80 für Makrophagen) sowie einem
AlexaFluor488-gekoppelten Sekundärantikörper als grünes Signal sichtbar gemacht.
Zusätzlich wurden die Zellkerne mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt, welches in den
übereinander gelagerten Kanälen sichtbar ist. In Abbildung 51 ist zu erkennen, dass EP1
Rezeptor weder von T-Zellen noch von B-Zellen oder Makrophagen exprimiert wurde.
Dagegen konnte eine Expression von EP2 Rezeptor sowohl von T-Zellen als auch von
B-Zellen und Makrophagen in der Harnblase transgener Mäuse nachgewiesen werden, wie
es eindeutig in Abbildung 52 dargestellt ist. Wie der EP1 Rezeptor wurde auch der
EP3 Rezeptor von keinen der untersuchten Entzündungszellen exprimiert (Abbildung 53).
Kapitel 4 Ergebnisse
132
Abbildung 50 Immunolokalisation von EP4 Rezeptor in der Harnblase 12 Monate alter Mäuse.
Immunhistochemische Analyse von Kryoschnitten.
1) Die Expression von EP4 Rezeptor erfolgte im Epithel und in Blutgefäßen der Harnblase von transgenen
Mäusen (A, B), während bei Wildtyptieren (C, D) nur ein schwaches Signal für EP4 Rezeptor nachweisbar war.
2) Tumorzellen zeigten eine erhöhte EP4 Rezeptor Expression (B). Auch in den umliegenden Tumorarealen,
Submucosa (A) und Tunica muscularis (C) wurde EP4 Rezeptor partial exprimiert.
3) In Entzündungsarealen in der Harnblase transgener K5.COX-2 Tiere erfolgte eine partiale EP4 Rezeptor
Expression. Negativkontrollen ohne Inkubation mit primären Antikörper zeigten keine spezifischen Signale (E,
F).Vergrößerung: x 16 (E, F), x 63.
wt
tr
Mucosa Blutgefäße
A B
C D
E
F
1)
Entzündungscluster
tr
2)
3)
Submucosa
tr
Karzinom Tunica muscularis
A B C
Kapitel 4 Ergebnisse
133
Abbildung 51 Doppelimmunfluoreszenz von EP1 Rezeptor und Entzündungszellen in der Harnblase von
12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In den übereinander gelagerten Bildern ist keine
Expression von EP1 Rezeptor von T- und B-Zellen sowie von Makrophagen in der Harnblase von homozygoten
transgenen Mäusen zu erkennen (G-I). Vergrößerung: x 63.
Verglichen mit Abbildung 50-3, die ein positives Signal für die Expression des
EP4 Rezeptors von Entzündungszellen in einem Entzündungscluster zeigt, komplementiert
die Immunfluoreszenz das Ergebnis, dass das positive Signal für den EP4 Rezeptor nicht
von den -Zellen oder B-Zellen, sondern von den Makrophagen kam, die den
EP4 Rezeptor exprimierten (Abbildung 54).
CD45RCD4
EP1 EP1
EP1, CD45R, HoechstEP1, CD4, Hoechst
EP1
F4/80
EP1, F4/80, Hoechst
T-Zellen B-Zellen Makrophagen
A B C
D E F
G H I
Kapitel 4 Ergebnisse
134
Abbildung 52 Nachweis von EP2 Rezeptor in Entzündungszellen in der Harnblase von 12 Monate alten
homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In den Kolokalisationen ist eine Expression von EP2 Rezeptor von
T- und B-Zellen sowie Makrophagen in stark entzündeten, homozygoten transgenen Mäusen gezeigt (G-I).
Vergrößerung: x 63.
Dieses Ergebnis impliziert wiederholt dem EP2 als auch EP4 Rezeptor eine wichtige Rolle
in Prozessen der Signaltransduktion, da EP2 Rezeptor sowohl von T-Zellen als auch von
B-Zellen und darüber hinaus beide Isoformen von Makrophagen in der Harnblase
transgener Mäuse exprimiert wurden.
CD45RCD4
EP2 EP2
EP2, CD45R, HoechstEP2, CD4, Hoechst
EP2
F4/80
EP2, F4/80, Hoechst
T-Zellen B-Zellen Makrophagen
A B C
D E F
G H I
Kapitel 4 Ergebnisse
135
Abbildung 53 Doppelimmunfluoreszenz von EP3 Rezeptor und Entzündungszellen in der Harnblase von
12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In den Kolokalisationen ist keine Expression von
EP3 Rezeptor von T- und B-Zellen sowie von Makrophagen in der Harnblase von homozygoten transgenen
Mäusen zu erkennen (G-I). Vergrößerung: x 63.
Unter physiologischen Bedingungen sind Makrophagen auch in der Harnblase von
Wildtyptieren lokalisiert, jedoch nicht aktiviert. Da sowohl EP2 als auch EP4 Rezeptor von
Makrophagen in der Harnblase transgener Mäuse exprimiert wurden, erfolgte die
Expressionsanalyse der beiden Isoformen in Makrophagen in der Harnblase von
Wildtyptieren mittels Doppelimmunfluoreszenz. Abbildung 55 zeigt, dass sowohl EP2 als
auch EP4 Rezeptor von Makrophagen in der Harnblase von Wildtyptieren exprimiert
wurden (Abbildung 55A, B). Da zusätzlich die Blutgefäße mit spezifischen Antikörpern
grün gefärbt wurden (Abbildung 55C, D), ist zu erkennen, dass die Makrophagen in
Nachbarschaft zu den Blutgefäßen lokalisiert waren (Abbildung 55E, F).
CD45RCD4
EP3 EP3
EP3, CD45R, HoechstEP3, CD4, Hoechst
EP3
F4/80
EP3, F4/80, Hoechst
T-Zellen B-Zellen Makrophagen
A B C
D E F
G H I
Kapitel 4 Ergebnisse
136
Verglichen mit den Abbildung 51-Abbildung 54 ist außerdem erkennbar, dass in der
Harnblase von Wildtyptieren die Makrophagen in der Tunica muscularis lokalisiert waren,
während die Makrophagen in transgenen Mäusen vorrangig in der Submucosa vorzufinden
waren.
Abbildung 54 Nachweis von EP4 Rezeptor in Entzündungszellen in der Harnblase von 12 Monate alten
homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In den übereinander gelagerten Bildern konnte keine Expression
von EP4 Rezeptor von T- und B-Zellen in der Harnblase von homozygoten transgenen Mäusen detektiert werden
(G, H), während Makrophagen eine Expression von EP4 Rezeptor zeigten (I). Vergrößerung: x 63.
CD45RCD4
EP4 EP4
EP4, CD45R, HoechstEP4, CD4, Hoechst
EP4
F4/80
EP4, F4/80, Hoechst
T-Zellen B-Zellen Makrophagen
A B C
D E F
G H I
Kapitel 4 Ergebnisse
137
Abbildung 55 Nachweis von EP2 und EP4 Rezeptor in Makrophagen in der Harnblase 12 Monate alter
Wildtyptiere. Indirekte Immunfluoreszenz in Gefrierschnitten der Harnblase. EP Rezeptor-Isoformen sind als
rotes Cy3- (A, B) und die Blutgefäße als grünes AlexaFluor488-Fluoreszenzsignal (C, D) zu erkennen. In den
übereinander gelagerten Bildern, in denen die Zellkerne zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt
wurden, ist erkennbar, dass die Makrophagen in der Harnblase von Wildtyptieren EP2 und EP4 Rezeptoren
exprimierten und in der Tunica muscularis in Nachbarschaft zu den Blutgefäßen lokalisiert waren.
Vergrößerung: x 63.
Zusammenfassend bekräftigen diese Ergebnisse die Aussage, dass der EP2 und
EP4 Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Urothelkarzinoms spielen und
dass das PGE2-Signaling vorrangig über diese beiden Rezeptoren erfolgen könnte.
EP4
CD31
EP4, CD31, Hoechst
Makrophagen
EP2
CD31
EP2, CD31, Hoechst
Makrophagen
A
C
E
B
D
F
Kapitel 4 Ergebnisse
138
4.6.3. K5.COX-2 transgene Mäuse zeigen ein vergleichendes
Expressionsprofil wie humane Urothelkarzinomzelllinien
Um zu überprüfen, ob das transgene Mausmodell eine vergleichende Aussage zum
humanen Urothelkarzinom erlaubt, erfolgte die Charakterisierung der TCC-Zelllinien
RT112 und 5637 hinsichtlich ihrer Expressionsprofile der COX-Isoenzyme, PGES und
EP-Rezeptor Isoformen um weitere vergleichende Analysen durchführen zu können.
Bei den RT112 und 5637 TCC-Zelllinien handelt es sich um isolierte, epitheliale Zellen
vom gut-differenzierten Urothelkarzinom (174;175). Beide Zelllinien zeigten annähernd
gleich stark positive Her-2 Expressionslevel (Abbildung 56). Jedoch konnte weder auf
mRNA-Ebene noch auf Proteinebene eine COX-1 Expression mittels RT-PCR bzw.
Immunopräzipitation nachgewiesen werden, während COX-2 sowohl auf mRNA- als auch
auf Proteinebene nachweisbar war. Wie aus Abbildung 57 ersichtlich ist, zeigten die
RT112 Zellen eine stärkere COX-2 Expression als 5637. Zudem war im Immunoblot bei
RT112 Zellen ein Banden-laddering beim COX-2 Nachweis zu erkennen. Diese vier
Banden repräsentieren die vier Glycolysierungszustände des COX-2 Enzyms (68 kDa,
70 kDa, 72 kDa und 74 kDa).
Abbildung 56 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Her-2 in den humanen Urothelkarzinomzelllinien
RT112 und 5637. Repräsentative Darstellung der Her-2 Expression nach Auftrennung von 100 µg Gesamtprotein
mittels 7,5 %-igen SDS-Gel in den humanen TCC Zelllinien. Als Ladekontrolle diente -Aktin. n = 2 unabhängige
Proben pro Gruppe wurden analysiert.
RT112 5637kDa
205Her-2
45 -Aktin
Kapitel 4 Ergebnisse
139
Abbildung 57 Nachweis der Expression von COX-Isoenzymen in humanen RT112 und 5637
Urothelkarzinomzelllinien.
A) Mittels RT-PCR-Nachweis konnte keine mRNA für COX-1 in beiden Zelllinien nachgewiesen werden. Positive
Signale wurden für COX-2 erhalten. Als interne Kontrolle diente β-Aktin. n = 2 unabhängige Proben pro Zelllinie
wurden analysiert. PK = Positivkontrolle (humane Pankreaskarzinomzelllinie); DNA-Größenstandards:
M1 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. (-) Negativ-PCR; (--) Negativ-RT-PCR.
B) Immunoblot-Analyse der COX-Isoformen 1 und 2 in den Urothelkarzinomzelllinien mittels
Immunopräzipitation (IP). Eine COX-2 Expression konnte in beiden humanen Urothelkarzinomzelllinien
nachgewiesen werden, wobei in RT112 für COX-2 ein stärkeres Signal als in 5637 detektiert werden konnte. Die
Expression von COX-1 konnte mittels IP nicht nachgewiesen werden. 7,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgel. PK =
Positivkontrolle; * Crossreaktion des Antikörpers mit IgG.
COX-1
66
COX-2
66
kDa
*
*
- COX-1
400 -
M1
400 -- COX-2
400 -- -Aktin
RT112 5637 (--)(-) PKbp
A
B
Kapitel 4 Ergebnisse
140
Die Expressionsprofile der Prostaglandin Synthase Isoformen in den TCC-Zelllinien waren
für die cPGES und mPGES-2 in etwa gleich stark. Es erfolgte auch die Expression von
mPGES-1 in beiden Zelllinien, jedoch konnte in RT112 Zellen ein 4-fach so starkes Signal
wie bei 5637 detektiert werden.
Abbildung 58 Expressionsanalyse der PGE-Synthase Isoformen in humanen RT112 und 5637 Zellen. Die drei
PGE-Synthase Isoformen wurden in beiden untersuchten Zelllinien exprimiert. Die induzierbare mPGES-1 war in
RT112 Zellen stärker exprimiert verglichen mit den 5637 Zellen. In ihrer Expression nicht verändert waren die
cPGES und die mPGES-2. 100µg Gesamtprotein wurden mittels 12 %-igen SDS-Gel separiert. n = 2 unabhängige
Proben pro Gruppe wurden analysiert.
Die Analyse der Expressionsprofile der EP-Rezeptor Isoformen erfolgte auf mRNA- und
Proteinebene. Abbildung 59 zeigt, dass auf mRNA-Ebene alle EP-Rezeptor Isoformen in
unterschiedlichen Stärken detektiert werden konnten. Die mRNA Expression von EP3
Rezeptor war in RT112 und 5637 Zellen nahezu gleich, während in RT112 Zellen bezogen
auf 5637 die Expression von EP1 und EP4 Rezeptor erhöht und von EP2 Rezeptor
erniedrigt waren. Auf Proteinebene zeigten sich jedoch andere Expressionsprofile
(Abbildung 60). Nur das Expressionsprofil vom EP1 und EP3 Rezeptor korrelierte mit dem
RT112 5637kDa
25cPGES
15 mPGES-1
35
mPGES-2
-Aktin45
Kapitel 4 Ergebnisse
141
mRNA Expressionsprofil, während auf Proteinebene der EP2 Rezeptor in beiden Zelllinien
nahezu gleich exprimiert wurde und der EP4 Rezeptor nur in 5637 detektiert werden
konnte, obwohl auf mRNA-Ebene EP4 Rezeptor auch in RT112 Zellen nachweisbar war.
Dies zeigt einerseits unterschiedliche Kontrollmechanismen sowohl auf mRNA- als auf
Proteinebene und andererseits bekräftigt die positive Expression von EP4 Rezeptor in 5637
Zellen die bereits oben für das transgene Mausmodell aufgestellte Annahme, das diese
EP-Rezeptor Isoform eine wichtige Rolle bei der Karzinomentstehung und deren weiteren
Entwicklung spielt.
Im Unterschied zum transgenen Mausmodell konnte in der Harnblase der Mäuse für den
EP3 Rezeptor nur die 65 kDa Isoform detektiert werden, während in den humanen
TCC-Zelllinien sowohl die 65 kDa als auch die 53 kDa Isoform nachweisbar war
(Abbildung 60).
Abbildung 59 RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression der EP-Rezeptor Isoformen in humanen
Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637. Positive Signale wurden in beiden Urothelkarzinomzelllinien für die
mRNA Expression der EP-Rezeptoren erhalten. Als interne Kontrolle diente β-Aktin. n = 2 unabhängige Proben
pro Zelllinie wurden analysiert. DNA-Größenstandard: M1 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter; (-) Negativ-PCR;
(--) Negativ-RT-PCR.
M1
400 -- -Aktin
RT112 5637 (--)(-)
- EP4200 -
- EP2400 -
- EP1500 -
- EP3300 -
Kapitel 4 Ergebnisse
142
Abbildung 60 Immunoblot zum Nachweis der EP-Rezeptor Isoformen in RT112 und 5637 Zellen. Die Isoformen
der EP-Rezeptoren EP1 (42 kDa) und EP2 (53 kDa) wurden in beiden Zelllinien exprimiert, während für den EP3
Rezeptor die 53 kDa sowie 65 kDa Isoform in den humanen Zellen nachgewiesen werden konnte. Für den EP4
Rezeptor (52 kDa) wurde nur in den 5637 Zellen ein positives Signal erhalten. Mittels 7,5 %-igen SDS-Gel wurden
100 µg Gesamtprotein separiert. Als Ladekontrolle diente -Aktin. n = 2 unabhängige Proben pro Gruppe wurden
analysiert.
Die Charakterisierung der humanen Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637 zeigte
insgesamt ein adäquates Expressionsprofil zum transgenen Mausmodell und bekräftigt
somit deren Aussagen.
RT112 5637kDa
45
EP1
EP2
EP3
EP3
EP4
b-Aktin
66
66
45
45
Kapitel 4 Ergebnisse
143
4.7. Gewebliche Proteomanalyse mittels 2-Dimensionaler
Differenz-In-Gel-Elektrophorese-(2D-DIGE-)Technologie
Um einen besseren Überblick über die nachgeschalteten Targets (downstream targets) des
COX-2 Signaling zu erhalten wurde ein Hypothese-generierender Ansatz generiert. Dafür
erfolgte zunächst die Etablierung und Verbesserung der 2-Dimensionalen
Gelelektrophorese und anschließend die Etablierung der Differenz-In-Gel-Elektrophorese-
(2D-DIGE)-Technologie, um differentiell exprimierte Kandidatenproteine zu
quantifizieren und mittels MALDI-ToF-MS oder ESI-MS/MS zu identifizieren.
4.7.1. Etablierung der 2D-DIGE-Technologie
Ausgehend vom Gesamtgewebe der Harnblase 12 Monate alter Mäuse erfolgte die
Extraktion der Proteine in Lysispuffer und anschließender Zentrifugation, um ungelöste
Bestandteile zu separieren. Daraufhin wurden 150 µg Gesamtproteinhomogenat mit
Rehydratationspuffer versetzt und über Nacht mit 18 cm langen IPG-Streifen mit einem
pH-Gradienten von pH 3 bis pH 10 inkubiert. Wie unter 3.2.4.2.2 ff. beschrieben, erfolgte
die Separierung der Proteine in der ersten Dimension nach dem isoelektrischen Punkt und
in der zweiten Dimension nach dem Molekulargewicht in 12,5 %-igen SDS-Gelen. Mittels
massenkompatibler Silberfärbung wurden die Proteine im Gel sichtbar gemacht.
Abbildung 61A zeigt eine repräsentative Darstellung eines aufgetrennten
Proteinhomogenats mit anschließender Silberfärbung einer 12 Monate alten Harnblase
einer transgenen Maus. Zu erkennen ist dabei, dass besonders im basischen Bereich
(> pH 8) eine schlechte Fokussierung der Proteine erfolgte. Auch im sauren Bereich
(< pH 4) sowie im höher molekularen Bereich (> 80 kDa) war die Auftrennung und
Fokussierung der Proteine unzureichend. Daher wurde das Gesamtproteinhomogenat nach
Zentrifugation mittels 2D-CleanUp Kit aufgereinigt, um störende Peptide, Lipide oder
Nukleinsäuren zu entfernen. Außerdem wurden 150 µg Gesamtproteinhomogenat nicht mit
Rehydratationspuffer versetzt, sondern mit DeStreak-Lösung, welches die Auftrennung im
basischen Bereich erhöhen soll. Abbildung 61B zeigt eindeutig, dass die Behandlung mit
2D-CleanUp und die anschließende Rehydratation in DeStreak-Lösung die Auftrennung
Kapitel 4 Ergebnisse
144
und Fokussierung der Proteine besonders im basischen Bereich, aber auch im sauren und
höher molekularen Bereich erhöhte. Diese Durchführung war die Grundlage für die
Etablierung und Anwendung der Differenz-In-Gel-Elektrophorese-(DIGE)-Technologie.
Für die DIGE-Technologie wurde der Minimal-labeling Ansatz gewählt. In einem
intra-Assay Ansatz wurden die Proteine aus gepoolten Harnblasen von 12 Monate alten
transgenen und Wildtyptieren (je n = 3) als fünf unabhängige technische Replikate mit
2D-CleanUp aufgereinigt und jeweils mit den CyDye-Fluorochromen (Cy2, Cy3, Cy5),
wie unter 3.2.4.3.1 beschrieben, inkubiert. Nach der Labeling-Reaktion wurden die
Probenpaare aus Wildtyp, Transgen und interner Standard (Wildtyp:Transgen, 1:1)
vereinigt, in DeStreak-Lösung und IPG-Streifen rehydriert und anschließend
elektrophoretisch in der ersten und zweiten Dimension aufgetrennt. Nach der
Gelelektrophorese wurden die Gele mittels Typhoon-Scanner 9400 in den entsprechenden
Wellenlängen der CyDye-Fluorochrome eingescannt, woraufhin die Proteinmaps des
jeweiligen Cy2-, Cy3- und Cy5-Kanals erhalten und mit ImageQuant5.2 visualisiert
wurden (Abbildung 62). Über die DyCyder-Software 6.5 erfolgte der Abgleich des
Cy2-Kanals als interner Standard jeweils mit dem Cy3- bzw. Cy5-Kanal, so dass die aus
dem internen Abgleich abgeleiteten Flächenintegrale, differentiell exprimierte Proteine
analysiert und quantifiziert werden konnten. In Abbildung 62 ist exemplarisch dargestellt,
dass ein Protein of interest (POI) in der Harnblase einer transgenen Maus verglichen zum
Wildtyptier in seiner Expression reduziert war. Dieser technische intra-Assay Ansatz
diente der Überprüfung der Reproduzierbarkeit der 2D-DIGE-Technologie. Um jedoch
bereits erste Anhaltspunkte über mögliche differentiell exprimierte Proteine zu erhalten,
wurde ein Pool aus jeweils drei Mäusen pro Gruppe gewählt und anschließend fünfmal
repliziert. Dadurch konnten falsch-positive Werte reduziert werden, wie es bei einem Tier
pro Gruppe und anschließenden fünffachen Replikaten der Fall gewesen wäre, so dass mit
diesem Ansatz auch eine Identifizierung mittels Massenspektroskopie erfolgen konnte. Das
Ergebnis des technischen Ansatzes ist in Tabelle 17 zusammengefasst. Die maximale
Anzahl detektierter Proteinspots betrug 1020 bei gesetzten zu erwartenden 2500 Spots. Das
Gel, dass die meisten als sicher identifizierten Spots aufzeigte bei einem Slope = 1, einer
Fläche > 350 und einer Peakhöhe > 250, wurde als Mastergel spezifiziert, und diente als
Grundlage zur Analyse und des Vergleiches der übrigen Gele. Über die fünf analysierten
Gele wurden 527-1020 Proteinspots von der Software innerhalb der Gele automatisch
gepaart.
Kapitel 4 Ergebnisse
145
Abbildung 61 Etablierung der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese. Repräsentative Darstellung eines
Gesamtproteinhomogenats der Harnblase einer 12 Monate alten transgenen Maus.
A) IPG-Streifen wurden über Nacht mit 150 µg Gesamtprotein in Rehydratationspuffer inkubiert. Zu erkennen
ist die geringe Fokussierung der Proteine im basischen Bereich.
B) Gesamtproteinhomogenat wurde mit 2D-CleanUp aufgereinigt und anschließend 150 µg Proteinmenge in
DeStreak-Lösung über Nacht mit IPG-Streifen inkubiert. Dies führte zu einer verbesserten Fokussierung und
Auftrennung der Proteine sowohl im basischen als auch im sauren pH-Bereich sowie im höher molekularen
Bereich.
205 --
116 --97 --
66 --
45 --
29 --
pH 3 10kDa
205 --
116 --97 --
66 --
45 --
29 --
A
B
Kapitel 4 Ergebnisse
146
Abbildung 62 Analytische Auswertung der 2-Dimensionalen Differenz-In-Gel-Elektrophorese (2D-DIGE). Die
Abbildungen zeigen eine repräsentative Darstellung des Master-Gels. Nach Markierung der Proteine mit den
CyDye-Fluorochromen sowie anschließender gelelektrophoretischer Auftrennung der Proteine, wurden die Gele
mittels Typhoon Scanner 9400 entsprechend der Fluorochromwellenlängen gescannt, woraufhin die jeweiligen
Proteinmaps erhalten wurden. Nach Abgleich des Cy3- bzw. Cy5-Kanals über den internen Standard (Cy2)
wurden differentiell exprimierte Protein analysiert und quantifiziert. Exemplarisch dargestellt ist die
Herunterregulation der Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 im Transgen verglichen zum Wildtyp.
Quantifizierung mittels DyCyder Software 6.5.
Cy3 Cy2 Cy5
Cy2-Cy3
Abgleich
Cy2-Cy5
Abgleich
Cy2-Cy3-Cy5
Image
205 --116 --97 --
66 --
45 --
29 --
kDa pH 3 10
wt tr
Kapitel 4 Ergebnisse
147
Auf Basis der Nullhypothese, die der Software zugrunde liegt, zeigte sich, dass bei einer
Erhöhung der Replikate die Anzahl an automatisch gepaarten Spots abnahm, wie es auch
erwartet werden kann, während aber die Abnahme an differentiell exprimierten Spots bei
Replikaterhöhung über den Verlauf wesentlich geringer war, so dass bei einer weiteren
Erhöhung an Replikaten keine Verbesserung an positiven Werten erzielt werden konnte.
Um jedoch falsch-positive Werte weiter auszuschließen und die Multiplizität indirekt zu
berücksichtigen, wurde der p-Value von 0,05 auf 0,005 erniedrigt, dass die Anzahl der
ermittelten, differentiell exprimierten Proteine noch einmal reduzierte (Tabelle 17) und
damit die Signifikanz erhöhte. Damit konnte insgesamt gezeigt werden, dass drei
Wiederholungen als Minimalanforderung bei technischen Replikaten als geltend angesehen
werden konnten und die eingesetzte 2D-DIGE-Technik eine sehr hohe Reproduzierbarkeit
aufzeigte.
Tabelle 17 Analytische Auswertung des intra-Assay 2D-DIGE Versuchsansatz auf Grundlage der Nullhypothese
Mastergel 1020
Detektierte Spots 648-1020
Automatisch gepaarte Spots 527-1020
Null-Hypothese
Begrenzt auf
Proteine präsent in x
Gelen
Gepaarte Spots Threshold Differentiell exprimiert
p < 0,05 p < 0,005
5 300 + 1,5 30 27
4 486 + 1,5 35 31
3 657 + 1,5 40 34
2 833 + 1,5 45 35
1 1020 + 1,5 45 35
Kapitel 4 Ergebnisse
148
Da drei Harnblasen als Pool pro Gruppe verwendet wurden, konnte die Auswertung des
technischen Versuchsansatzes für die Analyse der POIs genutzt werden, um die 27
differentiell exprimierten Proteine, die in fünf Replikaten mit p-Value < 0,005 analysiert
und quantifiziert wurden, zu identifizieren und damit erste Anhaltspunkte auf die
downstream Targets des COX-2 Signaling zu erhalten. Dazu wurden die Proteine durch
massenkompatible Silberfärbung sichtbar gemacht, wie es in Abbildung 63 dargestellt ist.
Mittels eines 1:1 Ausdrucks des Mastergels, auf dem die POIs markiert wurden, konnten
die Kandidatenproteine aus dem Silbergel ausgeschnitten und tryptisch verdaut werden.
Von den 27 analysierten Kandidatenproteinen konnten 22 Proteine mittels
MALDI-ToF-MS und zusätzlich durch ESI-MS/MS (nanoESI-Q-ToF) identifiziert bzw.
bestätigt werden, wenn ihr Mascot Score zu gering war (< 45) oder deren Identifizierung
zu wenig spezifische Signale ergab.
Abbildung 63 Analytische Auswertung der 2D-DIGE mit anschließender Silberfärbung des technischen
Versuchsansatzes. Die Abbildung zeigt das Master-Gels des intra-Assay Versuches. Massenkompatible
Silberfärbung der Gele nach der analytischen Auswertung der differentiell exprimierten Proteine. Durch 1:1-
Übertragung wurden die markierten Protein aus dem Mastergel geschnitten, tryptisch verdaut und mittels
MALDI-ToF-MS analysiert und durch Proteindatenbankabgleich identifiziert.
In Tabelle 18 sind die identifizierten Kandidatenproteine zusammengefasst. Dabei ist zu
erkennen, dass die differentiell exprimierten Proteine in verschiedenen Signalwegen
involviert sind, und daher in unterschiedliche Kategorien eingeordnet werden konnten:
-- 205 --
-- 116 ---- 97 --
-- 66 --
-- 45 --
-- 29 --
kDa pH 3 10pH 3 10
Kapitel 4 Ergebnisse
149
Cytoskelett, Detoxifizierung/Antioxidants, Entzündung, Generelle Enzyme, Homeostase,
Metabolismus, Plasma, Proteasom, Signaltransduktion und Transport. Besonders die
erhöhte Expression der Proteine Glutathione S-transferase (GST, die beiden Isoenzyme
omega 1 und mu 1) und Peroxiredoxin-(Prx-)2 der Detoxifizierungs- und
Antioxidantsgruppe in der Harnblase transgener Mäuse explizierten einen vermehrten
oxidativen Stress im K5.COX-2 transgenen Mausmodell, dessen weitere Untersuchung im
Mittelpunkt dieser Arbeit stand.
Tabelle 18 Differentiell exprimierte Proteine in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase verglichen mit Wildtyptieren des intra-Assay Versuchsansatzes.
Spot-Nr. Accession Nr. Kategorie Proteinbeschreibung
Protein-
masse
[Da]
Average p-Value Mascot
score
Sequence
Coverage
[%]
pI Funktion
489* gi|4895037 Cytoskelett Coronin-1 [Mus
musculus] 51627 2,28 0,0015 214 14 6,05
Aktinbindung/Leukozytenbindung/
Phagosombildung/Chemokin-vermittelte
Migration
853 gi|547749 Cytoskelett
Keratin, type I
cytoskeletal 10
(Cytokeratin-10) (CK-
10) (Keratin-10) (K10)
59711 1,75 0,00012 139 29 5,13 Cytoskelettorganisation/Signaltrans-
duktion
934 gi|29789016 Cytoskelett
Myosin, light
polypeptide 1 [Mus
musculus]
20695 1,66 0,0026 364 51 4,98 Cytoskelettorganisation und -biogenese
935* gi|127134 Cytoskelett Myosin light chain 3,
skeletal muscle isoform 16703 1,6 0,00022 143 21 4,62 Cytoskelettorganisation und -biogenese
848 gi|6754090 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase omega 1
[Mus musculus]
27708 1,55 2,70E-05 51 16 6,92 Metabolische Prozesse/Katalyse
Glutathion-abhängiger Reaktionen
901* gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1 [Mus
musculus]
26067 1,58 0,0023 205 21 7,71 Protein turnover/Proteinbindung
934*, 935* gi|2499469 Detoxifizierung/
Antioxidants
Peroxiredoxin-2
(Thioredoxin peroxidase
1) (Thioredoxin-
dependent peroxide
reductase 1)
21936 1,66 0,0026 182 31 5,20 Protein turnover/Antioxidants
557* gi|195156 Entzündung
Immunoglobulin heavy
chain constant region
[Mus musculus
domesticus]
27891 1,74 0,0001 98 8 7,68 Immunreaktion/Endozytose/ Proteolyse
488* gi|15929675 Entzündung Serpina1c protein [Mus
musculus] 45764 2,99 0,0006 228 11 5,31
Akute-Phase Antwort/inhibiert
Serinproteasen
768* gi|71067102 Generelle Enzyme
Aldo-keto reductase
family 1, member B10
[Mus musculus]
36054 3,15 4,10E-05 43 5 6,8 Katalyse NADP-abhängiger Reaktionen
741, 744,
745 gi|7548322 Generelle Enzyme
Aldolase A [Mus
musculus] 39925 1,63 0,00022 104 39 8,55 Glycolyse
790 gi|786001 Generelle Enzyme Aldose reductase [Mus
musculus] 36068 1,58 0,00028 70 26 6,71
Katalyse NADPH- & Aldehydabhängiger
Reaktionen
674, 681,
684 gi|6671762 Generelle Enzyme
Creatine kinase, muscle
[Mus musculus] 43246 1,59 0,0063 162 31 6,58 Energiehomeostase
585, 595 gi|71059715 Generelle Enzyme Eno3 [Mus musculus] 47310 1,74 5,10E-05 70 14 6,29
Glycolyse/Phosphoenolpyruvat Hydratase
& Lyaseaktivität/ Differenzierung und
Entwicklung des Muskels/Myogenese
853*, 869,
871 gi|31982861 Homeostase
Carbonic anhydrase 3
[Mus musculus] 29633 1,77 8,00E-06 157 40 6,89
pH-Homeostase/
Hydrogencarbonatreaktion
627* gi|89573965 Metabolismus
Isocitrate
dehydrogenase 1 [Mus
musculus]
42962 1,61 2,07E-03 541 36 5,98 Katalyse NADP-abhängiger Reaktionen zur
NADPH-Bildung
858* gi|7363449 Plasma
Serum amyloid
P-component [Mus
musculus]
26500 3,52 0,00064 157 14 6,33 anti-Opsonin/unterdrückt Immunantwort
886* gi|61098212 Proteasom
Ubiquitin carboxy-
terminal hydrolase L1
[Mus musculus]
25165 -1,93 2,20E-05 87 17 5,14
Ubiquitin-ligase Aktivität/ Prozessierung
ubiquinierter (Ub) Proteine/Hydrolyse von
Ub
934* gi|84794552 Signaltransduktion
Phosphatidylethanol-
amine binding protein 1
[Mus musculus]
20988 1,66 0,0026 147 39 5,19 postranslationale Modifikation/
Serinproteaseninhibitor
567* gi|6678643 Transport Albumin 1 [Mus
musculus] 70730 2,1 8,00E-66 95 2 5,75
Trägermolekül/Lipid- & Proteinbindung/
negative Apoptoseregulation
336* gi|23956086 Transport/ Plasma Hemopexin [Mus
musculus] 52049 1,85 0,0015 260 14 7,92 Häm-Transport/akute Phase-Reaktant
303*, 312 gi|20330802 Transport Transferrin [Mus
musculus] 78841 1,93 1,70E-06 975 36 6,94 Eisentransport/Zellwachstumsstimulation
Identifizierung der Proteine erfolgte mittels MALDI-ToF-MS Analyse und dem Mascot-Fingerprint-Abgleich. In ihrer Expression waren in der Harnblase transgener Mäuse 21
Proteine erhöht und ein Protein erniedrigt. * Proteine wurden durch ESI-MS/MS Analyse identifiziert bzw. bestätigt.
Kapitel 4 Ergebnisse
152
4.7.2. COX-2 Überexpression erhöht den oxidativen Stress
4.7.2.1. COX-2 abhängige Peroxiredoxin-(Prx-)1 und Prx-2 Expression
in transgenen Mäusen
Die signifikant erhöhte Expression der Detoxifizierungsenzyme GST und Prx-2 im
intra-Assay Ansatz des 2D-DIGE Experiments explizierten einen vermehrten oxidativen
Stress in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse. Um zu untersuchen, ob eine
COX-2 abhängige differenzielle Expression vorliegt bzw. die COX-2 Überexpression
einen Einfluss auf den oxidativen Stress hat, erfolgte eine Immunoblot-Analyse der sechs
Peroxiredoxin-Isoformen der Peroxiredoxinfamilie von nicht-hyperplastischen und
hyperplastischen Harnblasen 12 Monate alten transgenen Mäusen und Wildtyptieren sowie
mit dem COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib (CX) behandelten transgenen Tieren. Wie
aus Abbildung 64 ersichtlich, wurden die Prx-Isoformen Prx-1, -2, -3, -5 und -6 in allen
untersuchten Mäusen exprimiert. Die semi-quantitative Analyse über -Aktin als
Ladekontrolle zeigte keine Unterschiede in der Expression der Prx-Isoformen zwischen
nicht-hyperplastischer transgener Harnblase und der von Wildtyptieren. Jedoch in der
hyperplastischen Harnblase transgener Mäuse erfolgte eine signifikant erhöhte Expression
der Prx-Isoformen Prx-1 (1,6, p-Value 0,007), Prx-2 (1,5, p-Value 0,040), Prx-3 (2,0,
p-Value 0,009) und Prx-6 (1,7, p-Value 0,009). In CX behandelten transgenen Mäusen war
nur die Expression von Prx-1 (1,5, p-Value 0,023) und Prx-2 (1,5, p-Value 0,013)
signifikant wieder auf Wildtypniveau reduziert (Prx-3: 1,3, p-Value 0,379; Prx-6: 1,2,
p-Value 0,429).
Durch die Immunoblot-Analyse konnte zum einen die signifikant erhöhte Expression von
Prx-2 aus dem intra-Assay 2D-DIGE Experiment bestätigt und zum anderen die Annahme
bekräftigt werden, dass in der Harnblase transgener Mäuse ein erhöhter oxidativer Stress
vorlag, der im Hinblick auf die Prx-1 und Prx-2 Expressionslevel, COX-2 abhängig zu sein
schien und daher in einem in vitro Ansatz weiter untersucht wurde.
Kapitel 4 Ergebnisse
153
Abbildung 64 Immunoblot zum Nachweis der differentiellen Expression der Peroxiredoxin-(Prx-)Isoformen in
12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase. Die semi-quantitative Auswertung, normiert über -Aktin,
zeigte keine veränderte Expression der Prx-Isoformen in nicht-hyperplastischen Harnblasen (n.h.), während eine
signifikante Erhöhung der Expression von Prx-1, Prx-2, Prx-3 und Prx-6 in hyperplastischen Harnblasen (h.)
bezogen auf Wildtyptiere ermittelt werden konnte (> 1,5, p-Value < 0,04). In CX behandelten Mäusen war die
Expression von Prx-1 und Prx-2 auf Wildtypniveau reduziert (1,5, p-Value < 0,02). 60 µg Gesamtproteinextrakt
wurden im 15 %-igen SDS-Gel separiert. PK = Positivkontrolle HeLa-Zellextrakt. n = 3 Tiere pro Gruppe.
Student´s t-Test.
45 -Aktin
Prx-6
Prx-5
Prx-4
Prx-3
Prx-2
Prx-1
wt tr (h.)tr (n.h.) tr CXkDa PK
29
29
29
29
29
Kapitel 4 Ergebnisse
154
4.7.2.2. Oxidativer Stress wird durch COX2-PGE2-Signalweg verstärkt
Die gewebliche Proteom-Analyse des intra-Assay 2D-DIGE Experiments und die
Validierung mittels Immunoblot deutete auf einen erhöhten und scheinbaren COX-2
abhängigen oxidativen Stress in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse hin. Um
den oxidativen Stress zu analysieren wurde ein in vitro Ansatz generiert und dafür die
humanen Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637 (TCC-Zelllinien) verwendet, da
deren Charakterisierung mittels RT-PCR und Immunoblot adäquate Expressionsprofile,
bezogen auf Her-2, COX-Isoenzyme, PGES und EP-Rezeptor Isoformen zum transgenen
Mausmodell zeigten (s. 4.6.3). Um zu überprüfen, ob auch in den humanen TCC-Zelllinien
die COX-2 Expression einen Einfluss auf die Prx-Expression hat, wie es im transgenen
Mausmodell gezeigt werden konnte, wurden die humanen Urothelkarzinomzelllinien mit
dem COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib für 24 Stunden behandelt. Abbildung 65 zeigt,
dass alle sechs Prx-Isoformen in beiden Zelllinien nachgewiesen werden konnten. In RT
112 war die Expression von Prx-3 und Prx-5 stärker als in 5637 und von Prx-2 und Prx-4
schwächer. Prx-1 und Prx-6 wurden in beiden Zelllinien in etwa gleich stark exprimiert.
Die semi-quantitative Analyse über -Aktin zeigte jedoch keine Unterschiede in der
Expression der Prx-Isoformen zwischen CX behandelten und unbehandelten Zellen, so
dass davon ausgegangen werden konnte, dass die kurzzeitige
Inhibierung der COX-2 Expression im gut-differenzierten Urothelkarzinom die Regulation
der Expression der Prx-Isoformen unberührt lässt, wenngleich in der hyperplastischen
Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse noch eine Abhängigkeit vorlag (s. Abbildung
64).
Die Charakterisierung der humanen TCC-Zelllinien zeigte insgesamt ein adäquates
Expressionsprofil zum transgenen Mausmodell, so dass mittels eines generierten in vitro
Ansatzes die Analyse des oxidativen Stresses in den TCC-Zelllinien mittels AmplexRed
Assay erfolgte, um zu überprüfen, ob die COX-2 Expression den oxidativen Stress
zusätzlich bedingt. Dazu wurden die Zellen 24 Stunden mit dem selektiven COX-2
Inhibitor Celecoxib (CX), in Kombination mit CX und steigenden Konzentrationen an
PGE2 sowie nur mit PGE2 inkubiert. Der Start der AmplexRed Reaktion wurde durch
Zusatz von 30.000 Zellen/Well eingeleitet und nach zwei Stunden ausgewertet.
Kapitel 4 Ergebnisse
155
Abbildung 65 Darstellung der Expression der Peroxiredoxin (Prx-)Isoformen mittels Immunoblot in RT112 und
5637 Zellen. Zellen wurden 24 Stunden mit 2,5 µM des selektiven COX-2 Inhibitors Celecoxib (CX) behandelt,
anschließend geerntet und 60 µg Gesamtprotein mittels 15 %-igen SDS-Gel separiert. Alle Prx-Isoformen konnten
in beiden Zelllinien gleichermaßen detektiert werden. Die CX-Behandlung zeigte keinen Effekt auf die Expression
der Prx-Isoformen. Als Ladekontrolle diente -Aktin. PK = Positivkontrolle HeLa-Zellextrakt. n = 2 unabhängige
Proben pro Gruppe.
RT112 5637kDa
24 Prx-1
24 Prx-3
24
Prx-4
35
Prx-6
40 -Aktin
PK
- - + + + +- - CX
24 Prx-2
15 Prx-5
Kapitel 4 Ergebnisse
156
In Abbildung 66 ist zu erkennen, dass die Behandlung mit dem COX-2 selektiven Inhibitor
CX (2,5 µM) zu einer signifikanten Reduktion des oxidativen Stresses in RT112
TCC-Zellen (27 %, p-Value < 0,001) und 5637 TCC-Zellen (> 39 %, p-Value < 0,001)
führte. Die zusätzliche Behandlung der Zellen mit 2,5 µM bzw. 5 µM PGE2 konnte diesen
inhibitorischen Effekt wieder signifikant kompensieren (p-Value < 0,001). Dies zeigte
eindeutig, dass der COX-2-PGE2-Signalweg den oxidativen Stress zusätzlich erhöhte und
damit COX-2 und PGE2 abhängig war.
Der alleinige exogene Zusatz von 2,5 µM PGE2 führte zu keiner weiteren Erhöhung des
oxidativen Stresses, während 5 µM PGE2 den oxidativen Stress in beiden Zelllinien
reduzierte. Eine mögliche Erklärung dafür ist, das Prostaglandine in der Lage sind als
Radikalfänger zu wirken, woraufhin ihnen auch eine anti-oxidative Wirkung zu
geschrieben wird (176). Unter Reaktion mit freien Radikalen können dabei die
Prostaglandin-ähnlichen Verbindungen, Isoprostane, entstehen (177;178). Ferner konnte
Mada et al. zeigen, dass hohe Konzentrationen von exogenem PGE2 die Proliferation von
Zellen unterdrücken kann (179). Mögliche Ursache dessen kann die Bildung der
Cyclopentanone aus Prostaglandinen sein, die in hohen Konzentrationen cytotoxisch
wirken (148).
Kapitel 4 Ergebnisse
157
Abbildung 66 Effekt einer Celecoxib-(CX-)Behandlung auf den oxidativen Stress der humanen RT112 und 5637
Zellen. Die CX-Behandlung führte zu einer signifikanten Abnahme (> 25 %, * p-Value < 0,001) des oxidativen
Stresses, während der exogene Zusatz von PGE2 in RT112 Zellen mit einer Konzentration von 5 µM und in 5637
Zellen von 2,5 µM den inhibitorischen Effekt signifikant kompensierte (+ p-Value < 0,001). Der alleinige exogene
Zusatz von 2,5 µM PGE2 zeigte keine zusätzliche Erhöhung des oxidativen Stresses, während 5 µM PGE2 zu einer
Reduktion des oxidativen Stresses in beiden Zelllinien führte. Vermutlich fungierte exogenes PGE2 als
Radikalfängers in der AmplexRed Assay Reaktion. Für den Assay wurden humane Urothelkarzinomzellen
24 Stunden mit 2,5 µM CX bzw. in Kombination 2,5 µM CX mit 2,5 µM bzw. 5 µM PGE2 sowie mit PGE2 ohne
Inhibitor behandelt, anschließend geerntet und in KRPG-Lösung überführt. Der Versuchsbeginn wurde durch
Zusatz von 30.000 Zellen zum Reaktionsansatz eingeleitet, photometrisch bei 560 nm verfolgt und der Zeitpunkt
120 min ausgewertet. 100 % der RT112 Zellen entspricht 0,8411±0,0264 µM H2O2 und der 5637 Zellen
0,6520±0,0741 µM H2O2. Die Linie in der Box repräsentiert den Median und das Viereck den Mean. Die Boxen
sind begrenzt durch den ersten und dritten Quartile. Die Whiskers repräsentieren das Minimum bzw. Maximum
mit dem Koeffizienten x1,5 (inter-quartile range). Der Boxplot ergibt sich aus 2-4 unabhängigen Versuchen mit
jeweils n = 3 Replikaten. Ko = Kontrolle.
Um zu bekräftigen, dass die Reduktion des oxidativen Stresses durch die Hemmung der
COX-2 Aktivität und damit der Reduktion des PGE2-Levels bedingt wurde, erfolgte die
Bestimmung des PGE2-Levels der TCC-Zelllinien CX-Behandlung mittels Enzyme
Immunosorb Assay, welches in Abbildung 67 dargestellt ist. Dabei ist zu sehen, dass nach
Behandlung mit dem spezifischen COX-2 Inhibitor Celecoxib der PGE2-Level in RT112
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Ko 2,5 µM CX 2,5 µM CX & 2,5 µM PGE2 2,5 µM CX & 5,0 µM PGE
2 2,5 µM PGE
2 5,0 µM PGE
2
- + + + - -
PGE2
5637O
xid
ati
ver
Str
ess
[%
Ko
ntr
oll
e]RT112
CX- + + + - -
* + * +
Kapitel 4 Ergebnisse
158
Zellen um 86 % (1658,56 ± 228,85 pg/ml Kontrolle; 231,94 ± 50,06 pg/ml CX behandelt)
und in 5637 Zellen um 65 % (18527,94 ± 1448,41 pg/ml Kontrolle;
6545,63 ± 775,85 pg/ml CX behandelt) reduziert wurde. Dies zeigt eindeutig eine
Hemmung der COX-2 Aktivität und eine Bekräftigung der obigen Ergebnisse. Um
zusätzlich zu klären, ob der oxidative Stress wieder zunimmt, wenn der COX-2 selektive
Inhibitor Celecoxib abgesetzt wird, erfolgte eine kinetische Messung der TCC-Zelllinie
RT112 über 24 Stunden (Abbildung 68). Wie bereits auch unter Abbildung 66 erkennbar,
führte die CX-Behandlung zu einer signifikanten Abnahme des oxidativen Stresses in den
behandelten Zellen. Jedoch zeigen ausgewählte Zeitpunkte deutlich die Zunahme des
oxidativen Stresses nach dem Absetzen des selektiven COX-2 Inhibitors. Nach 23 Stunden
war der oxidative Stresslevel wieder auf Niveau der unbehandelten Zellen. Damit konnte
wiederholt gezeigt werden, dass die COX-2 Aktivität den oxidativen Stress begünstigte
und förderte.
Abbildung 67 Bestimmung von PGE2 in humanen Urothelkarzinomzelllinien nach Celecoxibbehandlung. Nach
Behandlung der Zellen mit dem spezifischen COX-2 Inhibitor Celecoxib (CX) wurde die PGE2-Menge signifikant
(> 65 %, p-Value < 0,001) bezogen auf die Kontrollzellen reduziert. Die Mittelwerte ergeben sich aus n = 5
unabhängigen Messungen ± SD. Student´s t-Test. Ko = Kontrolle.
RT112 5637
0
4000
8000
12000
16000
20000
PG
E2 L
ev
el
nach
CX
-Beh
an
dlu
ng
[p
g/m
l]
Zelllinien
Ko
2,5 µM CX
Kapitel 4 Ergebnisse
159
Abbildung 68 Zunahme des oxidativen Stresses nach Aufhebung der Hemmung der katalytischen Aktivität von
COX-2 durch den Inhibitor Celecoxib. Das Diagramm zeigt eine repräsentative Darstellung der RT112 Zelllinie,
bei der zu sehen ist, dass die CX-Behandlung zu einer signifikanten Abnahme (> 40 %, * p-Value < 0,001) des
oxidativen Stresses führte, wenn die katalytische Aktivität der COX-2 durch den selektiven Inhibitor Celecoxib
inhibiert wurde. Ausgewählte Zeitpunkte verdeutlichen die Zunahme des oxidativen Stresses beim Absetzen des
selektiven Inhibitors CX und dem Wiedererlangen der COX-2 Aktivität. Dargestellt sind zwei unabhängige
Experiment mit jeweils n = 3 Replikaten. Die Balken repräsentieren die Mittelung aus den Versuchen.
Exp: Experiment.
4.7.3. Oxidativer Stress verursacht eine erhöhte Expression von Nrf-2 in
der Harnblase transgener Mäuse
Die bisherigen Ergebnisse der geweblichen Proteomanalyse mittels 2D-DIGE-Technologie
eines intra-Assay Ansatzes und dessen Validierung zeigten eindeutig, dass die COX-2
Überexpression den oxidativen Stress verstärkt und die differentielle Expression
verschiedener Proteine, die vorrangig durch MALDI-ToF-MS Analyse identifiziert werden
konnten, verursachte. Um diese Ergebnisse weiter zu bekräftigen, falsch-positive Werte
durch eine hohe Anzahl technischer Replikate zu minimieren und um einen größeren
Überblick über die downstream Targets des COX-2 Signaling zu erhalten, wurde ein
0
20
40
60
80
100
120
140
23 h
360
min
240
min
180
min
120
min
60 m
in
Exp1
Exp2O
xid
ati
ver
Str
ess
[%
]
Ko
Kapitel 4 Ergebnisse
160
biologischer Ansatz (inter-Assay) mit jeweils fünf unabhängigen Proben der Harnblase
12 Monate alter transgener und Wildtyptiere generiert. Zusätzlich erfolgte die Analyse der
differentiell exprimierten Proteine unabhängig vom p-Value, somit unterschiedlich zum
intra-Assay Ansatz, um zu ermitteln, wie viele Proteine in einem, zwei, drei, vier und fünf
Untersuchungspaaren bei einem Threshold von ± 1,4 differentiell exprimiert waren. Wie
Abbildung 69 zeigt, wurden die Kandidatenproteine im Mastergel markiert, um sie aus
dem silbergefärbten Gel auszuschneiden, tryptisch zu verdauen und für die LCQ
(nanoESI-Q-ToF) zu extrahieren. Die Datenquantifizierung zeigte, dass von den maximal
detektierten 945 Proteinspots 29 in 5/5 Untersuchungspaaren differentiell exprimiert
waren, 12 in 4/5, acht in 3/5, 14 in 2/5 und zwei in 1/5, d. h. in der Summe 65 Proteinspots,
von denen in der Harnblase transgener Mäuse insgesamt 28 in ihrer Expression erhöht und
37 erniedrigt waren. Die Identifizierung der Kandidatenproteine erfolgte ausschließlich mit
ESI-MS/MS-Analyse und anschließendem Mascot Datenbankabgleich (Matrix Science)
und ist in Tabelle 19 zusammengefasst. Die Q-ToF-Technik basiert auf Sequenzanalyse, so
dass die ESI-MS/MS-Analyse wesentlich sensitiver ist als MALDI-ToF-MS, die auf
Peptidmassenanalyse basiert, und daher weit mehr potenzielle Kandidatenproteine
identifiziert werden können. Insgesamt wurden 129 potenzielle Kandidatenproteine
identifiziert (s. Tabelle 19). Ähnlich wie im intra-Assay Ansatz konnten die differentiell
exprimierten Proteine des inter-Assay Ansatzes in unterschiedliche Kategorien hinsichtlich
ihrer Funktionen eingeordnet werden: AAA ATPase Familie, Chaperone, Cytoskelett und
Muskulatur, Tumorsuppressor, Detoxifizierung, Entzündung, Generelle Enzyme,
Proteinbiosynthese, Signaltransduktion und Metabolismus, Transport sowie Zellwachstum.
Für die vereinfachte Übersicht wurden die Kandidatenproteine nach der Kategorie sortiert,
auch, wie aus Tabelle 19 ersichtlich ist, wenn mehrere Kandidatenproteine auf einem Spot
lagen. Zum Beispiel wurden auf Spot 644 die Kandidatenproteine Heat shock protein 70
cognate (Chaperone), Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (Proteinbiosynthese) und
alpha 1 Actin precursor (Cytoskelett) identifiziert. Dabei stellte sich die Frage, welches der
Kandidatenproteine tatsächlich die differentielle Expression bedingte. Als Grundlage
hätten der Mascot Score (> 50) und die Matches herangezogen werden können, d. h. alle
Kandidatenproteine mit einem Mascot Score < 50 und einem Match von eins könnten aus
der Liste potentieller Kandidatenproteine entfernt werden, da ihre eindeutige
Identifizierung nicht sichergestellt werden kann bzw. in einer mehrfachen
Spotidentifizierung würden nur die weiter betrachtet werden, die den höchsten Mascot
Kapitel 4 Ergebnisse
161
Score aufzeigen. Damit ließen sich falsch-positive Ergebnisse minimieren. Jedoch würden
somit auch Einzelspot-Kandidatenproteine, wie z. B. Spot 826, Epidermal growth factor-
receptor-binding protein GRB-3 (Signaltransduktion/Zellwachstum) mit einem Mascot
Score von 41 und einem Match von eins, ebenfalls unberücksichtigt bleiben. Ein weiteres
Kriterium wäre der pI-Vergleich, aber aufgrund posttranslationaler Modifikationen können
Proteine einen pI-Shift erfahren, was tatsächlich im 2D-Gel für die Glutathione
S-transferase beobachtet werden konnte (s. Abbildung 70) und somit nicht mit ihrem
theoretischen pI korrelieren müssen. Der mehrfache Abgleich der MS-Spektren und
Mascot Daten zeigte eine eindeutige Identifizierung und Bestimmung der in Tabelle 19
aufgeführten Kandidatenproteine.
Abbildung 69 Analytische Auswertung der 2D-DIGE mit anschließender Silberfärbung. Die Abbildung zeigt das
Master-Gel des biologischen Assays. Massenkompatible Silberfärbung der Gele nach der analytischen
Auswertung der differentiell exprimierter Proteine. Durch 1:1-Übertragung wurden die markierten Protein aus
dem Gel geschnitten, aufgereinigt, tryptisch verdaut, extrahiert und mittels ESI-MS/MS analysiert und durch
Proteindatenbankabgleich identifiziert. Es wurden 754- 945 Proteinspots detektiert, von denen 65 differentiell
exprimiert waren bei einem Threshold von ± 1,4.
Wiederholt zeigte sich eine differentielle Expression von Proteinen im Transgen, die in
Detoxifizierungsprozessen involviert sind, wie z. B. die Phospholipid hydroperoxide
glutathione peroxidase sowie verschiedene Isoformen der Glutathione S-transferase,
welches die obigen Ergebnisse hinsichtlich des oxidativen Stresses bekräftigten.
-- 205 ---- 116 ---- 97 --
-- 66 --
-- 45 --
-- 29 --
kDa pH 3 10pH 3 10
Tabelle 19 Differentiell exprimierte Proteine in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase des biologischen (inter-Assay) Versuchsansatzes.
Spot-
Nr.
Accession
Nr. Kategorie Proteinbeschreibung
Protein-
masse
[Da]
Auftreten Average Mascot
score Matches
Sequence
Coverage
[%]
PI Funktion
202 gi|400712 AAA ATPase
Familie
Transitional
endoplasmic reticulum
ATPase (TER
ATPase) (15S
Mg(2+)-ATPase p97
subunit) (Valosin-con)
[Mus musculus]
89936 15/15 1,51 90 3 4 5,14 Chaperone-ähnliche Funktion/ Ubiquitinierung
644 gi|309319 Chaperone
Heat shock protein 70
cognate [Mus
musculus]
71021 15/15 2,34 339 10 14 5,37 Zellzyklusregulation/
Proteinfaltung/Proteintransport
202 gi|50510675 Cytosklelett/
Muskulatur
Myh11 protein [Mus
musculus]
(mKIAA0866 protein
[Mus musculus])
228983 15/15 1,51 210 5 2 5,38 ATPase Aktivität,
Muskelkontraktion
274 gi|20070691 Cytosklelett/
Muskulatur
Myh11 protein [Mus
musculus] 227864 6/15 1,55 176 7 4 5,4
ATPase Aktivität,
Muskelkontraktion
743 gi|20070691 Cytosklelett/
Muskulatur
Myh11 protein [Mus
musculus] 227864 6/15 1,42 246 5 2 5,4
ATPase Aktivität,
Muskelkontraktion
472 gi|38605043
Cytoskelett/
glatte
Muskulatur
Myosin regulatory
light chain 2, smooth
muscle isoform
(Myosin RLC)
(Myosin regulatory
light chain) [Mus
musculus]
19898 15/15 -1,41 63 2 22 4,8 Muskelkontraktion
864 gi|38605043 Cytoskelett/ Myosin regulatory 19898 15/15 -1,81 200 6 43 4,8 Muskelkontraktion
glatte
Muskulatur
light chain 2, smooth
muscle isoform
(Myosin RLC)
(Myosin regulatory
light chain) [Mus
musculus]
906 gi|38605043
Cytoskelett/
glatte
Muskulatur
Myosin regulatory
light chain 2, smooth
muscle isoform
(Myosin RLC)
(Myosin regulatory
light chain) [Mus
musculus]
19898 12/15 3,24 203 6 46 4,8 Muskelkontraktion
399 gi|38605043
Cytoskelett/
glatte
Muskulatur
Myosin regulatory
light chain 2, smooth
muscle isoform
(Myosin RLC)
(Myosin regulatory
light chain) [Mus
musculus]
19898 12/15 -1,75 51 2 22 4,8 Muskelkontraktion
944 gi|38605043
Cytoskelett/
glatte
Muskulatur
Myosin regulatory
light chain 2, smooth
muscle isoform
(Myosin RLC)
(Myosin regulatory
light chain) [Mus
musculus]
19898 6/15 -1,91 418 9 51 4,8 Muskelkontraktion
908 gi|7305295
Cytoskelett/
glatte
Muskulatur
Myosin, heavy
polypeptide 11,
smooth muscle [Mus
musculus]
223983 15/15 1,53 59 1 3 5,39 Muskelkontraktion
820 gi|7305295 Cytoskelett/
glatte
Myosin, heavy
polypeptide 11, 223983 12/15 1,4 240 7 3 5,39 Muskelkontraktion
Muskulatur smooth muscle [Mus
musculus]
440 gi|12851268
Cytoskelett/
glatte
Muskulatur
Myosin light chain,
regulatory B-like
[Mus musculus]
19906 12/15 1,46 56 1 10 4,67 Muskelkontraktion
421 gi|50190
Cytoskelett/
glatte
Muskulatur
beta-Tropomyosin
[Mus musculus] 32982 9/15 1,4 40 1 3 4,61 Muskelkontraktion
944 gi|54912
Cytoskelett/
glatte
Muskulatur
Tropomyosin alpha-3
chain (Tropomyosin-
3) (Tropomyosin
gamma) [Mus
musculus]
29231 6/15 -1,91 57 1 7 4,75 Muskelkontraktion
202 gi|4501881 Cytoskelett
alpha 1 Actin
precursor [mus
musculus]
42366 15/15 1,51 112 3 8 5,23 Strukturprotein/Proteinbindung
644 gi|4501881 Cytoskelett alpha 1 actin precursor
[Mus musculus] 42366 15/15 2,34 79 4 12 5,23 Strukturprotein/Proteinbindung
778 gi|4501881 Cytoskelett
alpha 1 Actin
precursor [Mus
musculus]
42366 6/15 1,52 213 5 14 5,23 Strukturprotein/Proteinbindung
202 gi|49868 Cytoskelett put. beta-Actin (aa 27-
375) [Mus musculus] 39446 15/15 1,51 64 1 5 5,78 Strukturprotein/Proteinbindung
867 gi|9790141 Cytoskelett
Actin related protein
2/3 complex, subunit
3 [Mus musculus]
20739 12/15 -1,82 64 2 13 8,78 Strukturprotein/Proteinbindung
743 gi|49864 Cytoskelett alpha-Actin (aa 40-
375) [Mus musculus] 38016 6/15 1,42 195 6 20 5,45 Strukturprotein/Proteinbindung
202 gi|21704156 Cytoskelett Caldesmon 1 [Mus 60531 15/15 1,51 111 5 11 6,97 Muskelkontraktion/
musculus] Proteinbindung
202 gi|17017241 Cytoskelett h-Caldesmon [Mus
musculus] 37232 15/15 1,51 54 1 8 5,26
Muskelkontraktion/
Proteinbindung
470 gi|74195473 Cytoskelett Keratin 8 [Mus
musculus] 54497 15/15 -1,48 979 24 40 5,7 Strukturprotein/Proteinbindung
677 gi|7948997 Cytoskelett PDZ and LIM domain
3 [Mus musculus] 34734 15/15 -1,77 69 6 25 8,09
Aktinbindung/
Signaltransduktion/Muskulatur
682 gi|7948997 Cytoskelett PDZ and LIM domain
3 [Mus musculus] 34734 9/15 -1,74 48 1 5 8,09
Aktinbindung/
Signaltransduktion/Muskulatur
708 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin)
[Mus musculus]
33506 15/15 -2,97 382 8 32 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
709 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin)
[Mus musculus]
33506 15/15 -3,02 404 8 35 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
710 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin)
[Mus musculus]
33506 15/15 -2,03 307 8 31 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
711 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin)
[Mus musculus]
33506 15/15 -1,83 174 7 26 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
868 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin)
[Mus musculus]
33506 15/15 1,45 186 5 22 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
908 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin)
[Mus musculus]
33506 15/15 1,53 159 4 13 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
867 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin)
[Mus musculus]
33506 12/15 -1,82 110 4 11 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
905 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin) [Mus
musculus]
33506 12/15 1,66 172 4 17 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
715 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin)
[Mus musculus]
33506 9/15 -2,36 356 7 26 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
873 gi|584951
Cytoskelett/
Tumor-
suppressor
Calponin-1 (Calponin
H1, smooth muscle)
(Basic calponin) [Mus
musculus]
33506 6/15 2,34 39 1 4 9,05 Muskelkontraktion/Repressor
Zellproliferation
868 gi|5031595 Cytoskelett Arpc4 protein [Mus
musculus] 19768 15/15 1,45 89 2 13 8,53
Proteinmodifikation/Tubulin-
Tyrosin-Ligaseaktivität
875 gi|9790219 Cytoskelett Destrin [Mus
musculus] 18852 15/15 2,19 89 3 23 8,14
Zellbeweglichkeit/Aktinbindun
gZytokinese
879 gi|9790219 Cytoskelett Destrin [Mus
musculus] 18852 15/15 -1,92 475 12 66 8,14
Zellbeweglichkeit/Aktinbindun
gZytokinese
872 gi|9790219 Cytoskelett Destrin [Mus
musculus] 18852 12/15 -2,17 48 1 6 8,14
Zellbeweglichkeit/Aktinbindun
gZytokinese
882 gi|9790219 Cytoskelett Destrin [Mus
musculus] 18852 12/15 -1,53 153 3 23 8,14
Zellbeweglichkeit/Aktinbindun
gZytokinese
945 gi|9790219 Cytoskelett Destrin [Mus
musculus] 18852 6/15 -1,56 454 11 54 8,14
Zellbeweglichkeit/Aktinbindun
gZytokinese
872 gi|6680924 Cytoskelett Cofilin 1, non-muscle
[Mus musculus] 18776 12/15 -2,17 200 5 26 8,22
Zellbeweglichkeit/
Aktindepolymerisierung/
Phagozytenaktivität
908 gi|6755040 Cytoskelett Profilin 1 [Mus
musculus] 15119 15/15 1,53 336 8 71 8,46
Microfilamentregulator/
Signaltransduktion/
Differenzierung
908 gi|6681069 Cytoskelett
Cysteine and glycine-
rich protein 1 [Mus
musculus]
21425 15/15 1,53 256 5 34 8,9 Aktin Cytoskelettorganisation
und -biogenese/Proteinbindung
867 gi|6681069 Cytoskelett
Cysteine and glycine-
rich protein 1 [Mus
musculus]
21425 12/15 -1,82 206 5 38 8,9 Aktin Cytoskelettorganisation
und -biogenese/Proteinbindung
905 gi|6681069 Cytoskelett
Cysteine and glycine-
rich protein 1 [Mus
musculus]
21425 12/15 1,66 134 5 34 8,9 Aktin Cytoskelettorganisation
und -biogenese/Proteinbindung
440 gi|4895037 Cytoskelett Coronin-1 [Mus
musculus] 51627 12/15 1,46 41 2 5 6,05
Aktinbindung/
Leukozytenbindung/
Phagosombildung/Chemokin-
vermittelte Migration
627 gi|33563250 Cytoskelett Desmin [Mus
musculus] 53522 12/15 2,51 913 19 38 5,21
Muskelaufbau und -
organisation
628 gi|33563250 Cytoskelett Desmin [Mus
musculus] 53522 12/15 2,46 653 16 32 5,21
Muskelaufbau und -
organisation
421 gi|6678740 Cytoskelett Lumican [Mus
musculus] 38726 9/15 1,4 109 4 11 5,84 Proteoglycan/Proteinbindung
378 gi|6754084 Detoxifizierung Glutathione S-
transferase, mu 1 26067 15/15 -1,71 67 1 7 7,71
Protein
turnover/Proteinbindung
[Mus musculus]
794 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 -1,41 190 6 28 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
802 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 -1,53 232 9 47 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
805 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 -1,51 291 13 60 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
806 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 -1,6 310 7 32 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
807 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 -1,78 879 19 75 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
826 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 1,54 39 1 7 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
868 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 1,45 42 1 7 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
875 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 2,19 542 14 61 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
883 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 15/15 2,78 145 6 32 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
908 gi|6754084 Detoxifizierung Glutathione S- 26067 15/15 1,53 42 1 7 7,71 Protein
transferase, mu 1
[Mus musculus]
turnover/Proteinbindung
823 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 9/15 1,46 156 5 26 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
904 gi|6754084 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, mu 1
[Mus musculus]
26067 9/15 1,76 358 7 30 7,71 Protein
turnover/Proteinbindung
807 gi|2275019 Detoxifizierung
Glutathione-S-
transferase class M5
[Mus musculus]
25838 15/15 -1,78 154 2 17 6,14 Protein
turnover/Proteinbindung
948 gi|6754082 Detoxifizierung
Glutathione S-
transferase, alpha 4
[Mus musculus]
25559 15/15 -1,41 293 8 35 6,77 Protein
turnover/Proteinbindung
868 gi|2522259 Detoxifizierung
Phospholipid
hydroperoxide
glutathione peroxidase
[Mus musculus]
22660 15/15 1,45 102 2 11 8,65 Peroxidreduktion/Schutz vor
oxidativen Schäden
683 gi|13385466 Entzündung
Leukotriene B4 12-
hydroxydehydrogenas
e [Mus musculus]
35879 15/15 -1,59 236 7 22 8,09 Inaktivierung von Leukotrien
B4
421 gi|6678079 Entzündung
Serine (or cysteine)
proteinase inhibitor,
clade A, member 1a
[Mus musculus]
46145 9/15 1,4 206 6 15 5,44
Akute-Phase Antwort/inhibiert
hämatopoetische
Stammzellmobilität
778 gi|7305247 Entzündung P lysozyme structural
[Mus musculus] 17240 6/15 1,52 45 1 8 9,55
Assoziation mit Monozyten-
Makrophagen-System/
Verstärkung/Immunoaktivität/
Bakteriolytische Funktion
472 gi|74146998 Generelle
Enzyme
ATP synthase, H+
transporting,
mitochondrial F1
complex, alpha
subunit, isoform 1
[Mus musculus]
56033 15/15 -1,41 408 9 20 9,25 Atmungskette/H+ Transport
480 gi|6680748 Generelle
Enzyme
ATP synthase, H+
transporting,
mitochondrial F1
complex, alpha
subunit, isoform 1
[Mus musculus]
59830 12/15 -1,68 454 9 19 9,22 Atmungskette/H+ Transport
473 gi|6680748 Generelle
Enzyme
ATP synthase, H+
transporting,
mitochondrial F1
complex, alpha
subunit, isoform 1
[Mus musculus]
59830 3/15 -2,51 277 8 20 9,22 Atmungskette/H+ Transport
630 gi|6671539 Generelle
Enzyme
Aldolase 1, A isoform
[Mus musculus] 39787 15/15 -1,45 410 9 28 8,31 Metabolismus/Glycolyse
632 gi|6671539 Generelle
Enzyme
Aldolase 1, A isoform
[Mus musculus] 39787 15/15 -1,46 353 11 41 8,31 Metabolismus/Glycolyse
708 gi|6671539 Generelle
Enzyme
Aldolase 1, A isoform
[Mus musculus] 39787 15/15 -2,97 64 2 10 8,31 Metabolismus/Glycolyse
632 gi|2690302 Generelle
Enzyme
Aspartate
aminotransferase
precursor [Mus
musculus]
47781 15/15 -1,46 109 2 6 9,05 Biosynthese/Aspartat-
Glutamat-Reaktion
633 gi|2690302 Generelle
Enzyme
Aspartate
aminotransferase
precursor [Mus
47781 15/15 -1,62 571 14 36 9,05 Biosynthese/Aspartat-
Glutamat-Reaktion
musculus]
633 gi|6754036 Generelle
Enzyme
Glutamate
oxaloacetate
transaminase 2,
mitochondrial [Mus
musculus]
47780 15/15 -1,62 571 14 36 9,13 Biosynthese/Aspartat-
Glutamat-Reaktion
632 gi|6724311 Generelle
Enzyme
Alcohol
dehydrogenase 1
(class I) [Mus
musculus]
40601 15/15 -1,46 76 2 8 8,44 Oxidoreduktaseaktivität
633 gi|6724311 Generelle
Enzyme
Alcohol
dehydrogenase 1
(class I) [Mus
musculus]
40601 15/15 -1,62 223 7 16 8,44 Oxidoreduktaseaktivität
677 gi|31982186 Generelle
Enzyme
Malate dehydrogenase
2, NAD
(mitochondrial) [Mus
musculus]
36045 15/15 -1,77 394 14 55 8,93 Glycolyse/
Oxidoreductaseaktivität
677 gi|6679937 Generelle
Enzyme
similar to
Glyceraldehyde-3-
phosphate
dehydrogenase [Mus
musculus]
36072 15/15 -1,77 296 11 36 8,44 Glycolyse/
Carbohydratdegradierung
683 gi|6679937 Generelle
Enzyme
similar to
Glyceraldehyde-3-
phosphate
dehydrogenase [Mus
musculus]
36072 15/15 -1,59 349 7 25 8,44 Glycolyse/
Carbohydratdegradierung
708 gi|6679937 Generelle
Enzyme
similar to
Glyceraldehyde-3-
phosphate
36072 15/15 -2,97 46 2 10 8,44 Glycolyse/
Carbohydratdegradierung
dehydrogenase [Mus
musculus]
752 gi|6679937 Generelle
Enzyme
similar to
Glyceraldehyde-3-
phosphate
dehydrogenase [Mus
musculus]
36072 15/15 2,83 132 6 27 8,44 Glycolyse/
Carbohydratdegradierung
742 gi|6679937 Generelle
Enzyme
similar to
Glyceraldehyde-3-
phosphate
dehydrogenase [Mus
musculus]
36072 6/15 1,62 176 3 13 8,44 Glycolyse/
Carbohydratdegradierung
794 gi|61888838 Generelle
Enzyme
Hydroxyacyl-
Coenzyme A
dehydrogenase type II
[Mus musculus]
27371 15/15 -1,41 204 5 24 8,89 Metabolismus
875 gi|12857969 Generelle
Enzyme
Acetyl-Coenzyme A
dehydrogenase, long-
chain [Mus musculus]
42271 15/15 2,19 48 1 3 6,22 Lipid-Metabolismus
(Mitochondrium)
515 gi|21758044 Generelle
Enzyme
3-hydroxy-3-
methylglutaryl-
Coenzyme A synthase
2 [Mus musculus]
57334 6/15 -2,93 244 7 13 8,53 Lipid-Metabolismus
(Mitochondrium)
518 gi|21758044 Generelle
Enzyme
3-hydroxy-3-
methylglutaryl-
Coenzyme A synthase
2 [Mus musculus]
57334 6/15 -1,83 271 7 13 8,53 Lipid-Metabolismus
(Mitochondrium)
889 gi|6679439 Generelle
Enzyme
Peptidylprolyl
isomerase A [Mus
musculus]
18131 15/15 -1,5 322 7 41 7,74 Proteinfaltung/Regulation
viraler Genomregulation
399 gi|551295 Generelle
Enzyme
Pyruvate kinase M
[Mus musculus] 58394 12/15 -1,75 307 9 21 7,58 Glycolyse
778 gi|551295 Generelle
Enzyme
Pyruvate kinase M
[Mus musculus] 58394 6/15 1,52 83 2 4 7,58 Glycolyse
440 gi|6996917 Generelle
Enzyme
Glucose-6-phosphate
dehydrogenase X-
linked [Mus
musculus]
59681 12/15 1,46 51 3 6 6,06 Glycolyse/unterstützt
Antioxidants Signalwege
673 gi|6679791 Generelle
Enzyme
Aldo-keto reductase
family 1, member B8
[Mus musculus]
36440 12/15 1,87 78 4 16 5,97 Katalyse NADP-abhängiger
Reaktionen
580 gi|51708092 Generelle
Enzyme
PREDICTED: similar
to Phosphoglycerate
kinase 1 [Mus
musculus]
44921 9/15 -1,4 329 11 32 8,02 ATP-Bildung/Glycolyse
660 gi|129903 Generelle
Enzyme
Phosphoglycerate
kinase 1 [Mus
musculus]
44907 9/15 1,52 44 2 6 7,53 ATP-Bildung/Glycolyse
660 gi|10946574 Generelle
Enzyme
Creatine kinase, brain
[Mus musculus] 42971 9/15 1,52 127 3 9 5,4 Energiehomöostase
518 gi|12963491 Generelle
Enzyme
Enolase 1, alpha non-
neuron [Mus
musculus]
47437 6/15 -1,83 157 3 9 6,37
Glycolyse/Phosphoenolpyruvat
Hydratase & Lyaseaktivität/
Differenzierung und
Entwicklung des Muskels
537 gi|6679651 Generelle
Enzyme
Enolase 3, beta
muscle [Mus
musculus]
47337 6/15 1,72 397 7 20 6,73
Glycolyse/Phosphoenolpyruvat
Hydratase & Lyaseaktivität/
Differenzierung und
Entwicklung des Muskels/
Myogenese
680 gi|12832182 Generelle
Enzyme
Aminolevulinate,
delta- dehydratase
[Mus musculus]
36472 6/15 -2,32 346 7 26 6,32 Häm- & Porphyrinbiosynthese
826 gi|7657031 Nucleotid-
metabolismus
5',3'-Nucleotidase,
cytosolic [Mus
musculus]
23290 15/15 1,54 91 3 20 5,31 Nucleotid-Nucleosid-Reaktion
889 gi|10719673 Proteasom
ubc-like protein
MMS2 [Mus
musculus]
16457 15/15 -1,5 58 1 6 6,34 poly-Ubiquitinierung/
postreplikale-DNA-Reparatur
823 gi|6679497 Proteasom
Proteasome (prosome,
macropain) subunit,
alpha type 2 [Mus
musculus]
26023 9/15 1,46 126 2 10 8,39 Proteindegradierung/möglicher
Regulator des Komplexes
644 gi|8393544 Proteinbio-
synthese
Heterogeneous
nuclear
ribonucleoprotein C
[Mus musculus]
34421 15/15 2,34 122 3 10 4,92 RNA-Splicing
627 gi|8393544 Proteinbio-
synthese
Heterogeneous
nuclear
ribonucleoprotein C
[Mus musculus]
34421 12/15 2,51 44 1 3 4,92 RNA-Splicing
677 gi|6647752 Proteinbio-
synthese
Heterogeneous
nuclear
ribonucleoproteins
A2/B1 (hnRNP A2 /
hnRNP B1) [Mus
musculus]
36028 15/15 -1,77 43 1 3 8,67 RNA-Splicing von cis-acting
A2 response element (A2RE)
683 gi|6647752 Proteinbio-
synthese
Heterogeneous
nuclear
ribonucleoproteins
A2/B1 (hnRNP A2 /
36028 15/15 -1,59 85 3 13 8,67 RNA-Splicing von cis-acting
A2 response element (A2RE)
hnRNP B1) [Mus
musculus]
742 gi|50797 Proteinbio-
synthese
Eukaryotic translation
elongation factor 1
alpha 2 [Mus
musculus]
50360 6/15 1,62 93 2 4 9,16 Translation/Elongation/Anti-
Apoptose
778 gi|94399777 Proteinbio-
synthese
PREDICTED: similar
to cleavage and
polyadenylation
specific factor 1 [Mus
musculus]
149571 6/15 1,52 37 1 0 8,73 mRNA Prozessierung,
Polyadenylierung, Spaltung
875 gi|3294227 Signaltrans-
duktion
Protein-tyrosine-
phosphatase [Mus
musculus]
18367 15/15 2,19 72 2 12 6,12 Dephosphorylierungsreaktione
n
660 gi|4506005 Signaltrans-
duktion
Protein phosphatase 1,
catalytic subunit, beta
isoform [Mus
musculus]
37961 9/15 1,52 41 2 5 5,84
Regulation zellulärer Prozesse
(Zellzyklus, Metabolismus,
Kontraktion)
867 gi|82881544
Signaltrans-
duktion/
Zellwachstum
PREDICTED: similar
to Protein phosphatase
1, regulatory
(inhibitor) subunit
12B isoform b isoform
8 [Mus musculus]
111248 12/15 -1,82 91 2 2 5,58 DNA- & Proteinbindung/
Regulation der Transkription
378 gi|12836576
Signaltrans-
duktion/
Metabilsmus
Mod1 protein [Mus
musculus] 64540 15/15 -1,71 290 6 65 7,16 Pyruvat/PPAR-Signalweg
826 gi|423455
Signaltrans-
duktion/
Zellwachstum
Epidermal growth
factor-receptor-
binding protein GRB-
3 - mouse (fragment)
25997 15/15 1,54 41 1 4 4,97
Aktivierung von
Tyrosinkinase- & RAS-
abhängigen Signalwegen
[Mus musculus]
444 gi|6678313
Signaltrans-
duktion/
Zellwachstum
Transforming growth
factor beta 1 induced
transcript 1 [Mus
musculus]
49793 3/15 1,6 46 1 3 6,93 Multifunktionale Kontrolle von
Wachstum, Differenzierung
826 gi|26345182 Transport Apolipoprotein A-I
[Mus musculus] 30597 15/15 1,54 692 14 50 5,51
Lipid/Regulation ABCA1
Expression in Makrophagen
908 gi|14149635 Transport
Fatty acid binding
protein 4, adipocyte
[Mus musculus]
14755 15/15 1,53 82 2 21 8,53
Lipid/negativer Regulator
Proteinkinasen/
Glucosemetabolismus/
Regulation Cholesterol-
aufnahme in Makrophagen &
Entzündungsaktivität
904 gi|6754450 Transport
Fatty acid binding
protein 5, epidermal
[Mus musculus]
15470 9/15 1,76 106 3 25 6,14
Lipid/Metabolismus/
Glucosemetabolismus/ Lipid-
Scavenger (Antioxidant)/Haut-
Wasser-Permeabilitätsbarriere
660 gi|5915682 Transport
Serum albumin
precursor [Mus
musculus]
70700 9/15 1,52 64 1 2 5,75
Trägermolekül/Lipid- &
Proteinbindung/negative
Apoptoseregulation
904 gi|7305599 Transport Transthyretin [Mus
musculus] 15880 9/15 1,76 72 1 8 5,77 Trägermolekül
472 gi|7304885 Zellwachstum Annexin A11 [Mus
musculus] 54419 15/15 -1,41 146 3 7 7,53 Repressor
682 gi|6996913 Zellwachstum Annexin A2 [Mus
musculus] 38937 9/15 -1,74 637 13 40 7,55
Aktivator, Repressor,
Angiogenese
473 gi|113945 Zellwachstum
Annexin A1 (Annexin
I) (Lipocortin I)
(Calpactin II)
(Chromobindin-9)
38995 3/15 -2,51 71 2 6 6,97 Repressor, Aktivator,
Signaltransduktion
(p35) (Phospholipase
A2 inhib [Mus
musculus]
633 gi|21542195 Zellwachstum
Prolargin precursor
(Proline-arginine-rich
end leucine-rich
repeat protein) [Mus
musculus]
43607 15/15 -1,62 51 2 5 9,59 Skelettentwicklung/
extrazelluläre Matrix
826 gi|21362640 Zellwachstum
Lactoylglutathione
lyase
(Methylglyoxalase)
(Aldoketomutase)
(Glyoxalase I) (Glx I)
(Ketone-aldehyd [Mus
musculus]
20967 15/15 1,54 117 4 23 5,24 Anti-Apoptose
868 gi|6755714 Zellwachstum Transgelin [Mus
musculus] 22618 15/15 1,45 138 3 16 8,85
glatte Muskulatur/
Tumorprogressionsrepressor
Identifizierung der Proteine erfolgte mittels ESI-MS/MS und dem Mascot-Fingerprint-Abgleich*. In ihrer Expression waren in K5.COX-2 transgener Harnblase 28 Proteine
erhöht und 37 Protein erniedrigt. Das Auftreten eines Proteins bezieht sich auf die Untersuchungspaare, d. h. das Auftreten eines Proteins in 15/15 entspricht den 5/5
Untersuchungspaaren, denn pro Gruppe werden die drei Kanäle Cy2, Cy3 und Cy5 zu Grunde gelegt.
*Der Mascot Score ist eine wahrscheinlichkeits-basierende Bestimmung, die aussagt, dass der beobachtete Match zwischen experimentellen Daten und einer Proteinsequenz ein
zufälliges Ereignis ist, das näherungsweise für jedes Protein in der Sequenzdatenbank berechnet wird. Der Mascot Score ergibt sich aus S = -10log(P), wobei P die
Wahrscheinlichkeit ist, dass der beobachtete Match ein randomisiertes Ereignis ist. Die Signifikanz des Resultats ist von der Größe der verwendeten Datenbank abhängig.
Mascotschattierungen in Diagrammen sind grün und deren nicht-signifikanten Treffer unterliegen der p = 0,05 Ausschlussgrenze.
Kapitel 4 Ergebnisse
178
Aus Tabelle 19 ist ersichtlich, dass einige Proteine mehrfach unter verschiedenen
Spotnummern identifiziert werden konnten und zudem in ihrer Expression nicht einheitlich
differentiell exprimiert waren, wie die Glutathione S-transferase mu 1 (GST). Daraus
konnte auf einen pI-Shift geschlossen werden, der tatsächlich im 2D-Gel beobachtet
werden konnte, wie es am Beispiel der GST in Abbildung 70 gezeigt ist. Jede Spotnummer
im Bereich von 26 kDa repräsentierte die GST. Verglichen mit dem theoretischen pI von
7,1, der im Bereich der Spotnummer 805 und 806 lag, zeigte sich eindeutig ein pI-Shift der
GST in den basischen als auch in den sauren Bereich. Während im Bereich des
theoretischen pI die GST der Spotnummer 805 und 806 (jeweils in 5/5
Untersuchungspaaren vertreten) in transgenen Mäusen in ihrer Expression erniedrigt war
(> 1,5), zeigte sich, dass nur im sauren Bereich die GST der Spotnummer 823 (in 3/5) und
826 (in 5/5) in ihrer Expression erhöht war (> 1,4). Um die erhöhte Expression der GST im
Transgen eindeutig zu bestätigen (s. intra-Assay Ansatz Tabelle 18), erfolgte ein
Immunoblot von sechs und 12 Monate alter Harnblase transgener und Wildtyptiere. Wie in
Abbildung 71 erkennbar, ergab die semi-quantitative Analyse der IDV über -Aktin eine
2,4-fach signifikant erhöhte Expression der GST in 12 Monate alter Harnblase transgener
Mäuse (p-Value 0,040). Zusätzlich wurde das Expressionsprofil der Hemoxygenase-1
untersucht, da die Expression oft unter (oxidativen) Stresssituationen erhöht ist (180-183).
Jedoch war die Expression der Hemoxygenase-1 unter diesen oxidativen
Stressbedingungen in der Harnblase transgener Mäuse nicht verändert.
Abbildung 70 Differentielle Expression und pI-Shift der Glutathione S-transferase Isoform mu 1 in der Harnblase
transgener Mäuse. Darstellung des Wildtyp- (wt) und Transgenkanals (tr) des Mastergels nach
Datenquantifizierung differentiell exprimierter Proteine mittels DyCyder-Software 6.5 des inter-Assay Ansatzes
im Bereich von 26 kDa. Jede Spotnummer (außer 778) repräsentierte die Glutathione S-transferase. Verglichen
mit dem theoretischen pI von 7,1, im Bereich der Spotnummer 805 und 806, zeigte sich ein pI-Shift in den
basischen als auch in den sauren Bereich. Nur die GST der Spotnummer 823 und 826 (Kreis) waren im Transgen
in ihrer Expression erhöht (> 1,4).
202 220
252 253 274
378 399
421 440
444
470 472
473 480
515 518 537 580
627 628 630 632
633
643 644 660
673 677
680 682
683
708 709
710
711 715
742 743
752
778 794
802
805
806 807 820 823 826
864 867
868 872
873 875 879
882
883 889
904 905 906 908
944
945
948
202 220
252 253 274
378 399
421 440
444
470 472
473 480
515 518 537 580
627 628 630 632
633
643 644 660
673 677
680 682
683
708 709
710
711 715
742 743
752
778 794
802
805
806 807 820 823 826
864 867
868 872
873 875 879
882
883 889
904 905 906 908
944
945
948
pH 3 10
wt
tr
kDa
26
26
Kapitel 4 Ergebnisse
179
Abbildung 71 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Glutathione S-transferase (GST) und
Hemoxygenase-1 (HO-1) in der Harnblase K5.COX-2 transgener Mäuse. Die semi-quantitative Analyse über
-Aktin zeigte, dass GST in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse um den Faktor 2,4 signifikant
erhöht war (p-Value 0,04). Die Expression von Hemoxygenase-1 war unverändert. Mittels 12 %-igen SDS-Gel
wurden 100 µg Gesamtprotein separiert. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.
Dieses Ergebnis bestätigte die Aussage des intra-Assay Ansatzes und bekräftigte die
Resultate hinsichtlich dem erhöhten oxidativen Stress in der Harnblase transgener Mäuse.
Eine differenziertere Auswertung der Ergebnisse ließ erkennen, dass differentiell
exprimierte Proteine, wie Peroxiredoxin und Glutathione S-transferase, zur Gruppe der
Phase-II Detoxifizierungsenzyme gehören. Die koordinierte, transkriptionale Aktivierung
der Gene, die für die Phase-II Detoxifzierungs- und anti-oxidativer Stress Antwortenzyme
kodieren, obliegt dem Nuclear factor, erythroid derived 2, like 2 (Nrf-2)
Transkriptionsfaktor (97;147;159;184). Die Regulation der Expression dieser
cytoprotektiven Gene wird vorrangig über die ARE´s (antioxidant responsive element)
vermittelt. Ein Literaturvergleich zeigte, dass eine Reihe von Proteinen, deren
transkriptionale Genaktivierung unter der Kontrolle von Nrf-2 stehen, in der Harnblase
transgener Mäuse differentiell exprimiert waren (97-99;143-147;154-157;159;160;185-
192). In Tabelle 20 sind einige in der Literatur beschriebenen Nrf-2 regulierten Gene
zusammengefasst, die den durch das 2D-DIGE Experimente identifizierten Proteine
6 Mo 12 Mo
wt wttr trkDa
29
GST
45 -Aktin
35HO-1
Kapitel 4 Ergebnisse
180
gegenübergestellt wurden. Block I repräsentiert dabei eine exakte Übereinstimmung der
identifizierten Proteine mit den in der Literatur beschriebenen Nrf-2 abhängigen Gene,
während Block II Familienmitglieder gegenüberstellt, von denen vermutet werden kann,
dass die Gene der identifizierten 2D-DIGE Proteine ebenfalls unter der Regulation von
Nrf-2 stehen könnten. Block III repräsentiert Signalwege korrespondierender Protein-Gen-
Kombinationen. Diese Zusammenstellung basiert vorrangig auf einer Annahme, von der
jedoch ausgegangen wurde, dass auch hierbei mögliche Regulationen innerhalb abhängiger
bzw. ergänzender Signalwege durch Nrf-2 vermittelt werden könnten, so dass dieser
Block, entsprechend wie Block II, ebenfalls Anhaltspunkte möglicher abhängiger und
gemeinsamer Regulationen, vermittelt durch Nrf-2, liefern könnte. Die Tabelle 20, wie
auch die Ergebnisse der 2D-DIGE Experimente, implizierte damit eine wichtige Rolle dem
Transkriptionsfaktor Nrf-2 unter den oxidativen Stressbedingungen in der hyperplastischen
Harnblase transgener Tiere, denn die Auflistung zeigt eindeutig, dass die Gene der
Proteine, die in der Harnblase transgener Mäuse differentiell exprimiert waren, wie die
Aldolase 1, Hemopexin, Heat shock protein, Peroxiredoxin und Glutathione S-transferase
unter der Regulation von Nrf-2 stehen. Daher erfolgte in der Harnblase von sechs und
12 Monate alten transgenen Mäusen eine Analyse des Expressionsprofils von Nrf-2 mittels
RT-PCR. Die semi-quantitative Analyse über -Aktin ergab keine Unterschiede im mRNA
Expressionsprofil von Nrf-2 zwischen transgenen Mäusen und Wiltyptieren (Abbildung
72). Da bereits bei den PGES und EP-Rezeptor Isoformen gezeigt werden konnte, dass das
mRNA Expressionsprofil nicht mit dem Protein Expressionsprofil korrelieren muss,
erfolgte eine Immunoblot-Analyse. Wie aus Abbildung 73 eindeutig hervorgeht, ergab die
semi-quantitative Auswertung der IDV über -Aktin bezogen auf Wildtyptiere eine 2-fach
signifikante Erhöhung (p-Value < 0,009) der Expression von Nrf-2 in 12 Monate alter
Harnblase transgener Mäuse. Es konnte die von Pi et al. beschriebene unspezifische Bande
bei 85 kDa (nicht gezeigt) detektiert werden, sowie eine spezifische Bande für Nrf-2 bei
57 kDa, 67 kDa (theoretisch erwartete Masse von Nrf-2) und bei 118 kDa (188;193). Das
im Immunoblot gezeigte und in der Literatur beschriebene Bandenmuster für Nrf-2 kann
z. B. durch posttranslationale Modifikation wie Phosphorylierungen (188;194),
Stabilisierungen durch Ubiquitinierung (186) oder durch Neuanordnungen mit
Aktinfilamenten (185;193) verursacht werden.
Kapitel 4 Ergebnisse
181
Tabelle 20 2D-DIGE identifizierte, Nrf-2 abhängige Proteine
Nrf-2 regulierte Gene 2D-DIGE identifizierte Proteine
I Exakte Übereinstimmung
Glutathione S-transferase, mu 1 Glutathione S-transferase, mu 1
Aldolase 1, A isoform Aldolase 1, A isoform
Serum amyloid P-component Serum amyloid P-component
Hemopexin Hemopexin
Transthyretin Transthyretin
NADPH-dependent Isocitrate dehydrogenase Isocitrate dehydrogenase 1
II Familienmitglieder
Peroxiredoxin-1/Thioredoxin Peroxiredoxin-2 (Thioredoxin peroxidase 1)
Heat shock protein 70 protein 6 Heat shock protein 70 cognate
Proteasome alpha type 1 Proteasome (macropain) subunit, alpha type 2
Ubiquitin-conjugating enzyme E2-32 ubc-like protein MMS2
ubiquitin carboxy-terminal esterase L1/ubiquitin-
specific protease 14 Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1
Carbonic anhydrase 14,111 Carbonic anhydrase 3
Aldo-keto reductase family 1, member A1 Aldo-keto reductase family 1, member B8, B10
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C, A2/B1
Peptidylprolyl isomerase B Peptidylprolyl isomerase A
ATP synthase, H+ transporting, lysosomal (vacuolar
proton pump)
ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1
complex, alpha subunit, isoform 1
Serine proteinase inhibitor 2,4 Serine (or cysteine) proteinase inhibitor 1a
Transforming growth factor beta regulated gene 1 Transforming growth factor beta induced transcript 1
Fatty acid binding protein L-FABP Fatty acid binding protein 4, adipocyte und 5,
epidermal
Apolipoprotein A-IV,V Apolipoprotein A-I
alpha Tropomyosin Tropomyosin alpha-3 chain (Tropomyosin-3)
Myosin, light polypeptide 4 Myosin, light polypeptide 1
Actin gamma put. beta-Actin (aa 27-375) und Alpha-actin (aa 40-
375)
III Signalweg abhängig
eukaryotic initiation factor 2 alpha eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2
Malate oxidoreductase Malate dehydrogenase 2, NAD (mitochondrial)
Pyruvate dehydrogenase Pyruvate kinase M
In Literatur beschriebene Nrf-2 abhängige Gene (Spalte 1) wurden mit den durch 2D-DIGE Experimente
identifizierten Proteine (Spalte 2) abgeglichen und gegenübergestellt (97-99;143-147;154-157;159;160;185-192).
Kapitel 4 Ergebnisse
182
Abbildung 72 RT-PCR zum Nachweis der Expression von Nrf-2 in der Harnblase von sechs und 12 Monate alten
Wildtyptieren und K5.COX-2 transgenen Mäusen. Semi-quantitative Analyse zeigte keine Veränderung der
mRNA-Expressionsprofile in der Harnblase von Transgenen. Als interne Kontrolle diente β-Aktin. n = 3 Tiere pro
Gruppe wurden analysiert. DNA-Größenstandards: M1 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. (-) Negativ-PCR;
(--) Negativ-RT-PCR. Student´s t-Test.
Abbildung 73 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Nrf-2 in der Harnblase von sechs und 12 Monate
alten Wildtyptieren und transgenen Mäusen. Die Normierung über -Aktin zeigte mittels semi-quantitativer
Analyse eine signifikante 2-fache Erhöhung des Nrf-2 Proteins (< p-Value 0,009) in der Harnblase 12 Monate alter
transgener Tiere bei 57 kDa, 67 kDa (* kalkulierte Proteinmasse) und 118 kDa. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s
t-Test.
700 -
500 -
M1 wt tr wt tr
6 Mo 12 Mo
(-) (--)bp
- ß-Aktin
- Nrf-2
6 Mo 12 Mo
wt wttr trkDa
-Aktin45
70Nrf-2*
55 Nrf-2
130
Nrf-2
100
Kapitel 4 Ergebnisse
183
Dieses Ergebnis bestärkte die Aussage der 2D-DIGE Experimente, dass die Regulation
einiger differentiell exprimierter Proteine in der Harnblase transgener Mäuse unter den
oxidativen Stressbedingungen durch Nrf-2 erfolgte.
Um zu überprüfen, ob auch tatsächlich eine erhöhte Translokation von Nrf-2 in den
Zellkern transgener Mäuse erfolgte, wurde an Kryoschnitten 12 Monate alter transgener
und Wildtyptiere eine Immunhistochemie durchgeführt. Wie aus Abbildung 74 hervorgeht,
kam es in Immunzellen und vereinzelten Zellen der Submucosa in der Harnblase
transgener Mäuse, vorrangig cytoplasmatisch und vereinzelt nukleär zu einem positiven
Signal von Nrf-2 (Abbildung 74A), während dieses Signal nur sehr selten in Wildtyptieren
beobachtet werden konnte (Abbildung 74B). Dies suggerierte eine beginnende
Translokation von Nrf-2 in den Zellkern der hyperplastischen Harnblase transgener Mäuse.
Abbildung 74 Nachweis einer beginnenden Translokation von Nrf-2 in den Zellkern in der Harnblase 12 Monate
alter transgener Mäuse. Immunhistochemische Analyse von Kryoschnitten. In Zellen der Submucosa als auch
vereinzelt in Entzündungszellen transgener Mäuse (A) konnte vorrangig ein erhöhtes cytoplasmatisches Signal in
offensichtlich Immunzellen detektiert werden, welches scheinbar eine beginnende Translokation des
Transkriptionsfaktors Nrf-2 in den Zellkern signalisierte, während in Wildtyptieren partial positive Signale der
Translokation detektiert wurden. Negativkontrollen ohne Inkubation mit dem primären Antikörper zeigten keine
spezifischen Signale (C, D). Vergrößerung: x 63
Schlussfolgernd zeigte dies eindeutig, dass eine COX-2 Überexpression zu einem erhöhten
oxidativen Stress führte, der die differentielle Expression von Phase-II Detoxifizierungs-
proteinen verursachte, deren Gene unter Regulation des Transkriptionsfaktors Nrf-2 stehen
und zudem Nrf-2 selbst erhöht exprimiert und in den Zellkern transloziert wurde. Um zu
überprüfen, ob in Übereinstimmung zum AmplexRed Assay, bei dem gezeigt werden
A B DC
Kapitel 4 Ergebnisse
184
konnte, dass der oxidative Stress bei Hemmung der COX-2 Aktivität abnahm und dieser
inhibitorische Effekt durch Zusatz von PGE2 aufgehoben werden konnte, ebenfalls eine
Celecoxibbehandlung Einfluss auf die Nrf-2 Translokation hat, wurden die humanen
TCC-Zelllinien RT112 und 5637 für 24 Stunden mit 2,5 µM selektiven COX-2 Inhibitor
Celecoxib sowie in Kombination mit 2,5 µM bzw. 5 µM PGE2 inkubiert und anschließend
die Translokation mittels Immunhistochemie untersucht. In den unbehandelten
Kontrollzellen der Abbildung 75 (A, B) konnte eine hohe Translokation von Nrf-2 in den
Zellkern beobachtet werden, während in den CX behandelten TCC-Zelllinien (C, D) die
Translokation von Nrf-2 in den Zellkern deutlich abnahm. Ähnlich, wie im AmplexRed
Assay, konnte durch Zusatz von steigenden Konzentrationen von PGE2 der inhibitorische
Effekt der Translokation aufgehoben werden, welches in der Abbildung 75E-H deutlich zu
erkennen ist.
Diese Untersuchung zeigte eindrucksvoll die Beziehung zwischen verminderten oxidativen
Stress durch Hemmung der COX-2 Aktivität und der reduzierten Translokation von Nrf-2
in den Zellkern, als Regulator der Phase-II Gene und bekräftigte damit die Aussage der
oberen Ergebnisse.
Pi et al. konnte zeigen, dass die Translokation und Degradierung von Nrf-2 durch Casein
Kinase 2 (CK2) vermittelte Phosphorylierung erfolgt, während Kang et al. und andere
zeigen konnten, dass die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) die nukleäre Translokation
von Nrf-2 unter oxidativen Stressbedingungen kontrolliert, welches die Neuanordnung von
Aktinmikrofilamenten mit einschließt (185;188;193;195;196). Aus Tabelle 19 des
2D-DIGE Experiments ist ersichtlich, dass auch Aktinfilamente, wie alpha 1 Actin
precursor, beta-Actin, alpha-Actin sowie Actin related protein 2/3 complex, subunit 3 in
K5.COX-2 transgener Harnblase differentiell exprimiert waren. Um das Expressionsprofil
der PI3K zu untersuchen, erfolgte eine Immunoblot-Analyse von 12 Monate alter
Harnblase transgener und Wildtyptiere (Abbildung 76). Die Analyse ergab, dass die nicht
phosphorylierte inaktive PI3K (p85) in der Harnblase transgener Mäuse bezogen auf
Wildtyptiere 1,8-fach (p-Value 0,054) erhöht war und die phosphorylierten aktiven
Untereinheiten p-p85 1,3-fach (p-Value 0,126) und p-p55 2,2-fach (p-Value 0,019), so dass
von einer erhöhten Expression und Aktivierung der katalytischen Aktivität ausgegangen
werden konnte. Die katalytische Aktivität der PI3K wird durch den Tumorsuppressor
PTEN (Phosphatase and tensin homolog) kontrolliert (197). Silencing durch Promotor-
methylierungen oder PTEN Mutationen führen zu einer erhöhten Aktivität von PI3K (198).
Kapitel 4 Ergebnisse
185
Abbildung 75 Effekt einer Celecoxibbehandlung auf die Translokation von Nrf-2 in den Zellkern humaner
Urothelkarzinomzelllinien mittels immunhistochemische Analyse. Zellen, die 24 Stunden mit dem selektiven
COX-2 Inhibitor Celecoxib behandelt wurden, zeigten eine schwächere Translokation des Transkriptionsfaktors
Nrf-2 in den Zellkern (C, D) als die unbehandelten Kontrollzellen (A, B). Die exogene Zugabe steigender
Konzentrationen von PGE2 (E-H) kehrte den inhibitorischen Effekt um und erhöhte wieder die Translokation von
Nrf-2 in den Zellkern. Negativkontrollen ohne Inkubation mit dem primären Antikörper zeigten keine
spezifischen Signale (I, J). Vergrößerung: x 63.
Ko
RT112
2,5 µM CX
2,5 µM PGE2
5637
A B
D
FE
G H2,5 µM CX
5 µM PGE2
I J
2,5 µM CX C
Kapitel 4 Ergebnisse
186
Abbildung 76 Immunoblot-Analyse von totaler und phosphorylierter PI3K in der Harnblase 12 Monate alten
transgenen und Wildtyptieren. Semi-quantitative Analyse normiert über Wildtyptiere ergab in der Harnblase
transgener Mäuse eine Erhöhung an totaler PI3K um den Faktor 1,8 (p-Value 0,054), während die Untereinheiten
der aktiven p-PI3K p-p85 1,3-fach (p-Value 0,126) und p-p55 2,2-fach (0,019) im Transgen erhöht waren. Mittels
7,5 %-igen SDS-Gel wurden 100 µg Gesamtprotein elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe.
Student´s t-Test.
Daher erfolgte mittels Immunoblot die Analyse der Expression von PTEN in der Harnblase
12 Monate alter transgener Mäuse und Wildtyptiere. Die semi-quantitative Analyse über -
Aktin ergab eine leichte signifikante Erhöhung (1,3-fach, p-Value 0,017) der Expression
von PTEN in der Harnblase transgener Mäuse, so dass von einer vorhandenen,
kontrollierten Regulation der katalytischen Aktivität von PI3K vermittelt durch PTEN
ausgegangen werden konnte (Abbildung 77).
Ein wichtiges downstream Target der PI3K ist der Akt/Erk MAP (Protein kinase B/
Extracellular-signal regulated kinase Mitogen activated protein) Kinase Signalweg.
Papaiahgari et al. konnte in diesem Zusammenhang zeigen, dass hyperoxische
Bedingungen eine Nrf-2 transkriptionale Reaktion über den ROS-EGFR-PI3K-Akt/Erk
MAP Kinase Signalweg stimulierte (196). Um zu überprüfen, ob in der Harnblase
transgener Mäuse ebenfalls dieser Signalweg stimuliert war, erfolgte eine Immunoblot-
Analyse des Expressionsprofils vom totalen und phosphorylierten Akt sowie Erk-1/-2 in
sechs und 12 Monate alter Harnblase transgener und Wildtyptiere. Wie aus Abbildung 78
hervorgeht, war nur in 12 Monate alten transgenen Mäuse die Expression von Akt 1,3-fach
wtkDa tr
p-PI3K (p85)70
p-PI3K (p55)55
PI3K (p85)70
Kapitel 4 Ergebnisse
187
signifikant (p-Value 0,024) erhöht, während phosphoryliertes p-Akt keine Veränderung
zeigte.
Abbildung 77 Immunoblot-Analyse der Expression von PTEN in der Harnblase 12 Monate alten transgenen und
Wildtyptieren. Semi-quantitative Analyse zeigte eine geringe signifikante Erhöhung der PTEN Expression in der
Harnblase transgener Mäuse (1,3; p-Value 0,017). Als Ladekontrolle diente -Aktin. 100µg Gesamtprotein
wurden im 7,5 %-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.
Hinsichtlich Erk-1 und Erk-2 zeigte sich ein komplett anderes signifikantes
Expressionsprofil in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse. Während Erk-1 und
Erk-2 in ihrer Expression 1,8-fach (p-Value 0,015) bzw. 1,9-fach (p-Value 0,012) erhöht
waren, konnte eine 4,0 bzw. 4,5-fache Reduktion (p-Value 0,003) von p-Erk-1 bzw.
p-Erk-2 detektiert werden. Dies zeigte eine eindeutige Inhibierung der Aktivierung des
Akt/Erk MAP Kinase Signalweges, so dass die Nrf-2 transkriptionale Reaktion unter den
vorherrschenden oxidativen Stressbedingungen in der Harnblase K5.COX-2 transgener
Mäuse über einen anderen als den PI3K-Akt/Erk MAP Kinase Signalweg erfolgen musste.
Die PI3K ist vielen Signalwegen involviert. So kann zum Beispiel auch eine erhöhte
Aktivität der PI3K zu einer Induktion der Expression von HIF-1 (Hypoxia inducible
factor 1alpha) führen (199). In diesem Zusammenhang konnten Laughner et al. und
Blancher et al. zusätzlich zeigen, dass sowohl eine gesteigerte Aktivität von Her-2 im
Brustkarzinom als auch eine V12
Ras Überexpression zu einer erhöhten Expression von
HIF-1 führte (200;201). Da in der Harnblase transgener Mäuse erhöhte Level von Her-2
und gesteigerte Ras-GTP Level detektiert werden konnten (Abbildung 34, Abbildung 36),
wtkDa tr
-Aktin45
PTEN55
Kapitel 4 Ergebnisse
188
erfolgte mittels RT-PCR die Analyse des mRNA Expressionsprofils von HIF-1 in sechs
und 12 Monate alter Harnblase transgener und Wildtyptiere (Abbildung 79).
Abbildung 78 Immunoblot-Analyse vom totalen und phosphorylierten Akt, Erk-1 und Erk-2 in der Harnblase von
sechs und 12 Monate alten transgenen und Wildtyptieren. Das totale Akt war in sechs und 12 Monate alter
Harnblase transgener Mäuse um den Faktor 1,3 erhöht (6 Mo: p-Value 0,061; 12 Mo: p-Value 0,024), während
das aktive p-Akt keine Erhöhung zeigte. Totales Erk-1 bzw. Erk-2 waren in sechs Monate alten Transgenen
1,6-fach (p-Value 0,121) bzw. 1,5-fach (p-Value 0,095), in 12 Monate alten Transgenen 1,8-fach (p-Value 0,015)
bzw. 1,9-fach (p-Value 0,012) erhöht, während p-Erk-1 bzw. p-Erk-2 in sechs Monate alten Transgenen 1,4-fach
(p-Value 0,202) bzw. 1,3-fach (p-Value 0,229) erhöht und in 12 Monate alten Transgenen 4,0-fach (p-Value 0,003)
bzw. 4,5-fach (p-Value 0,003) erniedrigt waren. 100µg Gesamtprotein wurden mittels 7,5 %-igen SDS-Gel
elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe wurden analysiert. Student´s t-Test.
Die semi-quantitative Analyse über -Aktin ergab eine 1,7-fache Erhöhung
(p-Value 0,071) des mRNA Expressionsprofils in 12 Monate alter Harnblase K5.COX-2
transgener Tiere, welches hypoxische Bedingungen in der Harnblase transgener Mäuse
suggerierte. Um zusätzlich das Expressionsprofil auf Proteinebene zu analysieren, erfolgte
ein Immunoblot von entsprechend gleichaltrigen Mäusen. Aufgrund posttranslationaler
70
p-Akt
55
p-Erk-1
6 Mo 12 Mo
wt wttr trkDa
p-Erk-240
70
Akt
55
Erk-1
Erk-240
Kapitel 4 Ergebnisse
189
Modifikationen kann ein Banden-laddering im Immunoblot zwischen 100-130 kDa des
HIF-1 Proteins detektiert werden. Wie Abbildung 80 zeigt, ergab die semi-quantitative
Auswertung über -Aktin eine 2,7-fach erhöhte Expression (p-Value 0,167) von HIF-1 in
12 Monate alten transgenen Mäuse, das die Annahme einer scheinbar beginnenden
Hypoxie bekräftigte, da die Expression von HIF-1 nur unter hypoxischen Bedingungen
erhöht ist, um die Transkription von Genen zu aktivieren, deren Proteinprodukte die
Sauerstoffverfügbarkeit erhöhen (Erythropoese, Angiogenese) oder die adaptive
intrazelluläre Antwort bei Sauerstoffentfall vermitteln (Glycolyse) (202). Abbildung 80
zeigt jedoch zusätzlich, dass die Expression der HIF-1 regulatorischen Proteine VHL
(Von Hippel-Lindau factor) und FIH-1 (factor inhibiting HIF-1) 1,6-fach (p-Value 0,016)
bzw. 1,4-fach (p-Value 0,011) in 12 Monate alter Harnblase transgener Mäuse signifikant
erhöht waren (203). FIH-1, wie auch VHL sind sauerstoffabhängige, negative Regulatoren
von HIF-1, so dass dies vermuten ließ, dass einer beginnenden Hypoxie, der erhöhten
Expression von HIF-1 entgegengewirkt wurde. Unterstützt wird diese Vermutung
dahingehend, dass die Promotorregion von Enolase 1 und Aldolase A HRE´s (hypoxia
responsive elements) aufweisen (204), deren Expression der Proteinprodukte im
biologischen 2D-DIGE Experiment reduziert war (s. Tabelle 19). Außerdem besitzt die
Promotorregion von Aldolase A ARE´s, so dass die Regulation der Transkription durch
Nrf-2 vermittelt werden kann. Dieses Ergebnis suggerierte den Eindruck, dass sich eine
Verlagerung hyperoxischer Bedingungen, die durch erhöhten oxidativen Stress
gekennzeichnet waren, in eine scheinbar beginnend auszubildende Hypoxie einstellte und
dass Nrf-2 eine wichtige Rolle in diesem Zusammenhang einnimmt.
Kapitel 4 Ergebnisse
190
Abbildung 79 RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von HIF-1 in sechs und 12 Monate alter Wildtyp- und
K5.COX-2 transgener Harnblaser. Semi-quantitative Analyse zeigte in der Harnblase von 12 Mo alten transgenen
Mäusen eine Erhöhung der HIF-1 mRNA Expression (1,7; p-value 0,071). Als interne Kontrolle diente β-Aktin.
n = 3 Tiere pro Gruppe wurden analysiert. DNA-Größenstandards: M1 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter.
(-) Negativ-PCR; (--) Negativ-RT-PCR. Student´s t-Test.
Abbildung 80 Immunoblot-Analyse der Expression von HIF-1, der regulatorischen Proteine VHL und FIH-1 in
der Harnblase transgener und Wildtyptiere. Die semi-quantitative Analyse normiert über -Aktin zeigte nur in
der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse eine Erhöhung der Expression von HIF-1 (Hypoxia inducible
factor 1 2,7; p-Value 0,167), VHL (Von Hippel-Lindau factor 1,6; p-Value 0,014) sowie FIH-1 (factor inhibiting
HIF-1 1,4; p-Value 0,011). 100µg Gesamtprotein wurden im 7,5 %-igen SDS-Gel aufgetrennt. n = 3 Tiere pro
Gruppe. Student´s t-Test.
500 -
M1 wt tr wt tr
6 Mo 12 Mo
(-) (--)bp
- HIF-1
500 -- -Aktin
6 Mo 12 Mo
wt wttr trkDa
40 FIH-1
45 -Aktin
130 HIF-1
100
25 VHL
Kapitel 4 Ergebnisse
191
Insgesamt konnte eindeutig gezeigt werden, dass die aberrante COX-2 Überexpression in
der Harnblase transgener Mäuse entscheidend bei der Entwicklung der
Übergangszellhyperplasie (TCH) und des Urothelkarzinoms (TCC) beiträgt und
möglicherweise über die PGE2 Rezeptor Isoformen EP2 und EP4 vermittelt wurde, da
deren Expression in transgenen Mäusen erhöht war. Zusätzlich förderte die COX-2
Überexpression den oxidativen Stress und führte zu einer differentiellen Expression von
verschiedenen Proteinen, deren Regulation der Transkription zum Teil durch den
Transkriptionsfaktor Nrf-2 reguliert wird. Die Expression von Nrf-2 war in der Harnblase
transgener Mäuse erhöht und außerdem konnte eine vermehrte Translokation in den
Zellkern detektiert werden, die bei COX-2 Inhibierung reduziert war.
Kapitel 5 Diskussion
192
Kapitel 5 Diskussion
Krebs ist nach Herz-Kreislauferkrankungen mit steigender Tendenz die 2. häufigste
Todesursache und tritt im mittleren 65. Lebensjahr auf (42;205). Steigende
durchschnittliche Lebenserwartungen in der Bevölkerung, erhöhte Umweltbelastungen
z. B. durch Feinstaub oder zunehmend ungesunde Lebensweisen, wie z. B. Fast-Food,
Alkoholkonsum und Rauchen, erhöhen das Risiko, an Krebs zu erkranken (5;88;206-208).
Während noch 2002 das Urothelkarzinom die 10. häufigste Erkrankung bei Männern und
11. häufigste bei Frauen war, so stieg das Risiko bis zum Jahre 2006 bereits ab dem
40. Lebensjahr am Urothelkarzinom zu erkranken tendenziell an und liegt der zeitlich bei
Männern auf Position vier und bei Frauen auf Position sechs der häufigsten
Krebserkrankungen (2;42;43). Cote et al. beschrieb, dass die Entwicklung und Progression
vom Urothelkarzinom durch spezifische genetische Läsionen bestimmt werden, die als
chromosomale Loci definierbar sind (6). Diese molekularen Veränderungen, die auf
Genebene (z. B. Mutation im p53 Gen am chromosomalen Locus 17p13) oder auf Ebene
der Proteinexpression (z. B. COX-2) erfolgen oder den funktionalen Status eines Proteins
betreffen können (z. B. Phosphorylierungen von pRB), haben vorhersagbare und
prognostische Werte im Hinblick auf den klinischen Verlauf von Patienten gezeigt
(10;12;58;209). Aber auch die Verbindung zwischen Karzinomentstehung und chronischen
Entzündungen, die z. B. durch Saugwürmer hervorgerufen werden können (4), stehen im
Zusammenhang mit der Entstehung von Karzinomen und gehen bereits auf Virchow im
Jahre 1863 zurück, als er lymphoretikuläre Infiltrate in neoplastischen Geweben
beobachtete (210;211). Schon zu jener Zeit wurde vermutet, dass der Ursprung des
Karzinoms im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen zu finden ist. Die
Entstehung von Karzinomen ist von starken Entzündungsreaktionen begleitet, die auch bei
Wundheilungsprozessen auftreten können, so dass 1986 Dvorak postulierte, dass
Karzinome offene, nicht-heilende Wunden sind (211;212). Bei der Behandlung von
Wundreaktionen, die begleitet wurden von Fieber, Entzündungen und Schmerzen, wurde
schon 1950 sehr schnell als Goldstandard die Wirkung des Aspirins (NSAR) entdeckt.
Dessen Entwicklung ist auf den Chemiker Dr. Felix Hoffmann im Jahre 1897
zurückzuführen (213). Erst nach der erfolgreichen Schmerztherapie von Neil Armstrong
nach seiner Rückkehr vom Mond, wurde von Wissenschaftlern der Wirkmechanismus von
Kapitel 5 Diskussion
193
Aspirin aufgeklärt, bei dem sich zeigte, dass es zur Hemmung der
Prostaglandinbiosynthese kommt. Diese körpereigenen Substanzen üben als Mediatoren
zahlreiche Funktionen im Organismus aus und werden durch die Cyclooxygenase
Isoformen, COX-1 und COX-2 aus Arachidonsäure synthetisiert. Dabei dient
Arachidonsäure den Lipoxygenasen und Cytochromen P450 neben den Cyclooxygenasen
als Substrat (17;69). Neben einigen Lipoxygenasen konnte besonders der induzierbaren
Cyclooxygenase Isoform COX-2 eine wichtige Beteiligung bei der Entstehung von
zahlreichen Karzinomen, z. B. Pankreas, Colon, Brust, Haut oder Harnblase, nachgewiesen
werden (13;15;103;105;121;161;209;214). Um die Rolle der COX-2 und um ein COX-2
abhängiges Signaling während der Entstehung des Urothelkarzinoms zu untersuchen und
zu analysieren, wurde für diese Arbeit ein transgenes Mausmodell verwendet, bei dem die
COX-2 cDNA unter der Kontrolle des Keratin 5-Promotors steht, so dass es zu einer nicht-
physiologisch konstitutiven Expression von COX-2 in basalen Epithelien kommt (161).
Shirahama et al. und Wülfing et al. konnten zeigen, dass COX-2 mit unterschiedlicher
Stärke in den verschiedenen Tumorstadien und -graden exprimiert wird und mit einer
schlechten Prognose in Zusammenhang steht (9-11;64;85). Shariat et al. deutete die
COX-2 Überexpression als ein frühes Ereignis in der urothelialen Karzinogenese (56;215).
Tatsächlich verursachte die COX-2 Überexpression im transgenen Mausmodell die
spontane Entwicklung einer Übergangszellhyperplasie und -dysplasie, wie sie auch bei der
Entwicklung humaner Karzinome beobachtet werden kann (59;77;83). Die Hemmung des
hyperplastisch/dysplastischen Phänotyps durch den selektiven COX-2 Inhibitor Celecoxib
war konsistent mit früheren Beobachtungen, die zeigten, dass selbst NSAR das
experimentelle Wachstum des Blasenkarzinoms inhibierten (14;104;216). Jedoch im
Unterschied zu vorangegangen Experimenten der Haut des transgenen Mausmodells,
konnte gezeigt werden, dass die alleinige Überexpression von COX-2 ausreichend war für
eine spontane Entwicklung des Urothelkarzinoms (TCC), wie es auch von R. Klein et al.
gezeigt werden konnte (13;161;209). Weitere immunologische Analysen zeigten, dass die
Entwicklung des TCC scheinbar entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell,
aufgrund der erhöhten Her-2 Level und der Aktivierung von Ras erfolgte. Da es sich um
einen Pull-down-Assay handelte, bei dem die Aktivität aller drei Ras Isoformen
gleichzeitig bestimmt wird, kann keine Aussage getroffen werden, welche Isoform
tatsächlich aktiviert war. Beim humanen Urothelkarzinom liegt vorrangig im Codon 12 des
H-Ras Gens eine Punktmutation vor (22;217), welches zu einer konstitutiven Aktivierung
Kapitel 5 Diskussion
194
von H-Ras führt. Jedoch beschrieb Vageli et al., dass auch K-Ras vielfach im
Blasenkarzinom aktiviert ist und Rodenhuis konnte zeigen, dass auch eine Aktivierung von
K-Ras mit einer erhöhten Expression von COX-2 im Lungenkarzinom assoziiert ist (218-
220). Da demnach sowohl H-Ras als auch K-Ras aktiviert sein können, kann letztlich
davon ausgegangen werden, dass der humane papilläre Urothelkarzinomsignalweg die
Basis für die Entwicklung des TCC im transgenen Mausmodell bildete. Histologische
Analysen zeigten, dass Hyperplasien in sechs Monate alten transgenen Mäusen auftraten,
aber die Entwicklung des TCC erst im Alter von frühestens zehn Monaten erfolgte. Auch
auf molekularer Ebene konnte nicht nur für Her-2 gezeigt werden, dass erst im höheren
Alter (signifikante) Unterschiede in der Expression verschiedener Proteine zu beobachten
waren, welches suggerierte, dass erst weitere wichtige Signalwegketten aus einer
regulierten Kontrolle entzogen sein müssen, damit es zur Entartung und damit zum
Karzinom kommt. Ein wichtiger Mediator ist das PGE2, welches über die drei
PGES-Isoformen synthetisiert wird. Sowohl dem PGE2 als auch der mPGES-1 wird ein
malignes Potenzial impliziert, da sie nicht nur im Urothelkarzinom involviert sind, sondern
auch in anderen wie z. B. in gastrointestinalen Karzinomen (133;134). Shi et al.
schlussfolgerte, dass die Erhöhung des PGE2-Spiegels über den cPLA2-COX-2-mPGES-1
Signalweg erfolgt, der eine wichtige Rolle in der Blasenkarzinogenese spielt (221;222).
Und tatsächlich konnten auch im transgenen Mausmodell erhöhte PGE2-Spiegel gemessen
und im Alter von 12 Monaten eine erhöhte Expression der mPGES-1 nachgewiesen
werden. Die Hemmung der COX-2 Aktivität mittels Celecoxib reduzierte den PGE2-Level
und den hyperplastischen Phänotyp auf Wildtypniveau, so dass die Ergebnisse des
transgenen Mausmodells konsistent zur Literatur sind und R. Kleins Schlussfolgerung, die
COX-2 Überexpression erhöht den PGE2-Level, welches zur spontanen
Karzinomentwicklung führte, bekräftigt. PGE2 kann die vier EP-Rezeptor Isoformen
EP1-EP4 aktivieren, die in zahlreichen (unabhängigen) Signalwegen münden. Bereits im
Alter von sechs Monaten transgener Mäuse konnte eine erhöhte Expression von
EP4 Rezeptor mittels Immunoblot nachgewiesen werden. Miyata et al. konnte auch für
Karzinome des oberen Harntraktes (TCC-UUT) eine erhöhte Expression des
EP4 Rezeptors zeigen und postulierte, dass die Koexpression von COX-2 und
EP4 Rezeptor ein potentieller Marker für Tumorprogression und Überleben von
Betroffenen mit nicht-invasiven TCC-UUT ist (139;222;223). Jedoch konnte sehr schnell
in 12 Monate alten transgenen Mäusen nachgewiesen werden, dass neben EP4 Rezeptor
Kapitel 5 Diskussion
195
auch EP2 Rezeptor in seiner Expression erhöht war, was Miyata et al. auch für TCC-UUT
bestätigen konnte (132). Aber nicht nur für Urogenitalkarzinome konnte damit eindeutig
eine Rolle der EP-Rezeptor Isoformen EP2 und EP4 zugeschrieben werden, sondern bei
Brustkarzinomen als auch bei Cervixkarzinomen (135;224). Fulton et al. beschrieb, dass
der EP1 Rezeptor sowohl in Brustkarzinomen als auch in Hautkarzinomen eine wichtige
Rolle besitzt, während im transgenen Mausmodell nur in der Brust, aber weder in der Haut
noch in der Harnblase eine veränderte Expression von EP1 Rezeptor detektierbar war
(123;209). Viele Beobachtungen hinsichtlich der Rolle der EP-Rezeptoren in Karzinomen
entstammen von Tiermodellen mit Colonkarzinomen. Demnach sind alle EP-Rezeptor
Isoformen involviert, jedoch abhängig vom jeweiligen Karzinommodell (136). So wurde
für EP3 Rezeptor postuliert, dass die Aktivierung von EP3 Signaling im normalen Gewebe
die von EP1, EP2 und EP4 Rezeptor Tumor-fördernde Wirkung aufheben kann (136;225).
Ferner weisen einige Studien dem EP1 Rezeptor eine onkogene Rolle bei der
Polypenbildung in Apc716 Mäusen zu, während andere Gruppen dem EP2 Rezeptor diese
Rolle zu teilen (226;227). Besonders dem EP4 Rezeptor wird durch Kopplung zur PI3K
und zunehmend auch EP2 Rezeptor, aufgrund der Aktivierung von PKA, eine wichtige
Rolle in der Karzinogenese zu geschrieben. Bekräftig wird dies u. a. durch
pharmakologische Untersuchungen, die zeigen konnten, dass die Hemmung von diesen
EP-Rezeptor Isoformen das Wachstum der Zellen unterdrückte (132;136;228-230).
Fulton et al. postulierte, dass Tumorzellen einen oder mehrere EP-Rezeptor Isoformen
exprimieren (136). Und tatsächlich kann in dieser Arbeit diese Aussage bestätigt werden,
da die Expression von EP2 und EP4 Rezeptor von Zellen eines Tumorareals mittels
indirekter Immunfluoreszenz nachgewiesen werden konnte. In Übereinstimmung mit den
Beobachtungen von Ma und Eisenach konnte ebenfalls eine Lokalisation zum Zellkern
einiger EP-Rezeptor Isoformen detektiert werden (231). Darüber hinaus konnte mittels
indirekter Immunfluoreszenz die Expression von EP2 Rezeptor in B- und T-Zellen sowie
von EP2 und EP4 Rezeptor in Makrophagen der Harnblase transgener Mäuse
nachgewiesen werden. Pavlovic et al. konnte die Expression aller EP-Rezeptor Isoformen
in Makrophagen zeigen, gleichwohl nur die selektive Hemmung des EP4 Rezeptors die
COX-2 abhängige, ECM induzierte Proteinaseexpression blockierte (232). Die Ergebnisse
lassen damit die Schlussfolgerung zu, dass besonders EP4 aber auch EP2 Rezeptor eine
wichtige Rolle während der Karzinogenese spielen und dass das PGE2-vermittelte Signal
vorrangig über diese beiden Rezeptor Isoformen erfolgt.
Kapitel 5 Diskussion
196
Sowohl EP2 als auch EP4 Rezeptor sind an GS Proteine gekoppelt und können die
Adenylat-Cyclase aktivieren, was zu erhöhten cAMP-Spiegeln führt und eine Reihe von
Signalwegen anschalten kann. Darüber hinaus kann EP4 Rezeptor die PI3K aktivieren und
weitere cAMP-unabhängige Signalwege induzieren. Zur Analyse des COX-2 abhängigen
Signaling in der Harnblase transgener Mäuse wurde die 2D-DIGE-Technologie etabliert.
Derartige Hypothese-generierenden Ansätze geben einen größeren Überblick über
mögliche Kandidatenproteine aus dem Pool möglicher downstream Targets. Dabei handelt
es sich nicht um exakt vorhersagbare Abhängigkeiten und direkte Interaktionen zwischen
den identifizierten Proteinen und COX-2, sondern vielmehr um mögliche Abhängigkeiten.
Somit muss wie bei Genomic-Ansätzen immer die Möglichkeit eines falsch-positiven
Ergebnisses in Betracht gezogen werden, wenn zu dem eine falsche Gewichtung und
Interpretation der Ergebnisse erfolgt. Auch die alleinige Erhöhung an Replikaten ist kein
Garant dafür, um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren, insbesondere dann, wenn bei
der Interpretation der Ergebnisse die Multiplizität unberücksichtigt bleibt. Für die
Interpretation der MS-Daten dienten einerseits die Anzahl der Matches sowie der Mascot
Score als Grundlage. Je nach verwendeter Datenbank sollte der Mascot Score nicht
< 50-80 sein, um das identifizierte Protein als eindeutig zu bestimmen. Aber wie bereits
schon erwähnt, stellt dies ein Problem dar, bei Proteinen, deren Identifizierung signifikant
war, aber der Mascot Score < 50. Erschwerend für die weitere Bewertung des Ergebnisses
ist, wenn der Match nicht > 1 ist. Für eine strikte Interpretation und Auswertung derartiger
Daten, müssten alle Kandidatenproteine vernachlässigt werden, die nicht die Bedingungen
(Mascot Score > 50, Match > 1) für eine zuverlässige Identifizierung erfüllen. Jedoch
würden dabei mögliche wichtige Kandidatenproteine verloren gehen, so dass sichergestellt
werden muss, ob es sich um ein falsch-positives oder um ein tatsächlich positives Ergebnis
handelt. Ein wichtiger Aspekt dabei ist, ob die Identifizierung des Proteins in irgendeiner
Weise mit abhängigen Signalwegen in Verbindung gebracht werden kann, wie es im Falle
des Grb-3 Adapterproteins ist, welches an Wachstumsrezeptoren bindet. Auch die
mehrfache Identifizierung von Proteinen für einen Spot stellt das Problem der
Interpretation und Gewichtung der Daten dar. Ist es tatsächlich das Protein, welches das
höchste Protein Score und die höchste Anzahl an Matches besitzt, das differentiell
exprimiert ist oder ist es eines der sogenannten gering exprimierten (low abundant)
Proteine? Wenn ein Cytoskelettprotein (Myosin) zusammen mit einem Funktionsprotein
(Prx) auf einem Spot liegt, ist die Wahrscheinlichkeit gegeben, dass das Cytoskelettprotein
Kapitel 5 Diskussion
197
einen höheren Mascot Score hat als das Funktionsprotein und u. U. das Funktionsprotein
gar nicht identifiziert werden kann. Welches ist aber tatsächlich differenziell exprimiert?
Denn es konnte mehrfach gezeigt werden, dass es zu einer Umstrukturierung des
Cytoskeletts während der Karzinogenese kommt. Erschwerend in biologischen Ansätzen
ist außerdem die Regeneration der Proteine. In einem derartigen Ansatz wird nur der
steady-state Level betrachtet, d. h., in genau diesem Zustand kann die differenzielle
Expression eines bereits zuvor identifizierten und durch einen unabhängigen Versuch
validierten Proteins nicht detektierbar sein, obwohl seine differentielle Expression
nachweisbar war und es kommt zur Falle der Multiplizität, die Fehlinterpretation des
Ergebnisses durch extensive Auswertung von Untergruppen bei mehrfachen Endpunkten
und Behandlungen (233). Mittels der 2D-DIGE-Technologie konnten eine Reihe
Kandidatenproteine (POIs) eindeutig identifiziert werden. Auch wenn die Mascot Score
Grenze und der Match unterschritten waren, wurden die POIs mit in die Liste
aufgenommen, da deren Massenspektren signifikant zu den in der Datenbank ermittelten
waren. In den 2D-DIGE Experimenten konnte eindeutig gezeigt werden, dass einige
Proteine, die differentiell exprimiert waren, in die Gruppe der Phase-II
Detoxifizierungsenzyme und/oder anti-oxidativer Stress Antwortenzyme gehören, von
denen GST und Prx mittels Immunoblot validiert wurden. Dieser in der Harnblase
transgener Mäuse suggerierte oxidative Stress konnte durch einen in vitro Ansatz bestätigt
werden, der zeigte, dass der oxidative Stress in der Harnblase transgener Mäuse COX-2
und PGE2 abhängig war. Oxidativer Stress wird als Alterungsprozess, verursacht durch
freie Radikale, verstanden, dem ein Organismus durch Antioxidantien und
Detoxifizierungsreaktionen entgegenwirkt. Aerobe Organismen sind ständig reaktiven
Formen des Sauerstoffs ausgesetzt, die Signalwirkung für zelluläre Prozesse haben und bei
der Verteidigung gegen z. B. Bakterien genutzt werden. Jedoch überschießende Bildung an
ROS, z. B. durch dysregulierte sauerstoffabhängige Reaktionen (z. B. Atmungskette oder
COX-2 Reaktion) führen zur Schädigung von Biomolekülen wie Lipiden, Proteinen und
DNA und haben altersbedingte Erkrankungen wie Diabetes, Arthritis, Morbus Alzheimer
oder Krebs zur Folge (148;234). Kondo et al. konnte zeigen, dass Derivate der
Prostaglandine, die Cyclopentanone, den intrazellulären oxidativen Stress erhöhen (148).
Der Anstieg an Cyclopentanonen unter Hyperoxia führte zur vermehrten
Lipidperoxidation, verringertem GSH Spiegel sowie reduzierter GSH Peroxidase Aktivität,
veränderter mitochondrialer ROS Produktion und schließlich zum Zelltod, woraufhin
Kapitel 5 Diskussion
198
postuliert wurde, dass der intrazelluläre oxidative Stress den beschriebenen anti-
proliferativen und anti-tumorösen Effekten, den Cyclopentanonen zu Grunde liegen könnte
und dass damit eine Verbindung zwischen intrazellulären Stress und Zellentartung,
induziert durch Prostaglandine, vorliegt (148;149;235-238). In der Harnblase transgener
Mäuse konnte mittels 2D-DIGE eine erhöhte Expression von Glutathione S-transferase,
Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase und Peroxiredoxin-2 nachgewiesen
und mittels einem in vitro Ansatz der suggerierte oxidative Stress bestätigt werden. Mittels
Immunoblot-Analyse konnte zusätzlich eine signifikant erhöhte Expression von Prx-1,
Prx-3 und Prx-6 nachgewiesen werden. Diese erhöhte Expression der Phase-II
Detoxifizierungs- und anti-oxidativer Stress Antwortenzyme spiegelte einen Schutz gegen
die erhöhte oxidative Schädigung wieder. Soini et al. konnte in diesem Zusammenhang
zeigen, dass eine positive Prx-2 Expression mit einem niedrigen Tumorgrad assoziiert ist
und eine bessere Prognose betroffener Patienten zeigte (239). Für Prx-6 konnte
nachgewiesen werden, dass eine erhöhte Expression nicht nur zur besseren Wundheilung
beiträgt und anti-apoptische Wirkung nach UV-Behandlung der Haut besitzt, sondern auch
einen Schutz vor Lungenschäden unter Hyperoxia zeigt (240;241). Für die regulatorische
Expression derartiger Schutzenzyme bedarf es eine strikte Kontrolle. Die koordinierte
Regulation der Transkription der Gene, deren Genprodukte an Detoxifizierungs- und/oder
anti-oxidativer Stress Antwortprozessen oder bei der Regulation von
Entzündungsprozessen beteiligt sind, erfolgt durch den Transkriptionsfaktor Nrf-2
(97;191), der in der Harnblase transgener Mäuse in seiner Expression erhöht und in den
Zellkern transloziert war. Durch einen in vitro Ansatz konnte gezeigt werden, dass in
Übereinstimmung zum oxidativen Stress auch die Nrf-2 Zellkerntranslokation COX-2 und
PGE2 abhängig erfolgte. Durch Immunoblot-Analysen mit separierten Proteinfraktionen
könnte diese Aussage weiter gestützt werden. Die Nrf-2 Zellkerntranslokation kann durch
Aktivierung verschiedener Signalwege und Faktoren stimuliert werden
(154;185;190;192;193;195;196). Lim et al. zeigte, dass 15-deoxy-PGJ2, ein potenter
endogener Ligand für PPAR, die Nrf-2 Translokation und folglich die HO-1 Expression
induzierte (242). Jedoch konnte in der Harnblase transgener Mäuse keine veränderte
Expression von PPAR auf mRNA-Ebene detektiert werden (nicht gezeigt) und die HO-1
Expression war im Immunoblot unverändert, so dass davon ausgegangen werden konnte,
dass die Nrf-2 Translokation über eine andere Induktion erfolgen musste. Nach Pi et al. ist
die Phosphorylierung von Nrf-2 durch Casein kinase 2 für die Translokation in den
Kapitel 5 Diskussion
199
Zellkern entscheidend (188), aber auch der Export von Nrf-2 aus dem Zellkern zur
Degradierung wird durch Phosphorylierung bestimmt (188;194). Nakaso et al. und
Kang et al. und andere schreiben jedoch der PI3K eine wichtige Funktion für die Nrf-2
Translokation zu (193;195). Tatsächlich konnte in der Harnblase transgener Mäuse eine
erhöhte Aktivierung der PI3K detektiert werden, so dass wohl die Nrf-2 Translokation
durch Phosphorylierung durch die PI3K vermittelt wurde. Da PI3K auch in Prozessen wie
Zellproliferation, Differenzierung, Zellüberleben und Metabolismus involviert ist, muss die
katalytische Aktivität streng kontrolliert werden, um eine Entartung zu vermeiden. Barthel
und Klotz dokumentierten, dass PI3K durch verschiedene reaktive Sauerstoffverbindungen
aktiviert werden kann und damit als Bindeglied zwischen oxidativen Stress und
Signalwegen in neoplastischen, metabolischen und entarteten Erkrankungen gesehen wird
(243). Des Weiteren beschrieben sie molekulare Mechanismen, in denen die Regulation
der PI3K Signalwege beim oxidativen Stress und wichtige anti-oxidative Reaktionspartner
wie Glutaredoxin-Familie, Thioredoxin-Familie und Serin/Threonin und Tyrosin
Phosphatasen involviert sind, welches Übereinstimmung findet zu den in dieser Arbeit
identifizierten Proteinen mittels 2D-DIGE und den daraus schlussfolgernden Aussagen. Im
Gegensatz zu Papaiahgari et al. beobachteter transkriptionaler Nrf-2 Reaktion über den
ROS-EGFR-PI3K-Akt/Erk MAP Kinase Signalweg und der von Barthel und Klotz
beschriebenen Aktivierung von Akt, ein wichtiges downstream Target der PI3K, unter
oxidativen Stress, konnte in der Harnblase transgener Mäuse keine Aktivierung von Akt,
jedoch eine geringfügig, signifikant erhöhte Expression von Akt, detektiert werden
(196;243). Akt ist ein Onkogen, welches Zellüberleben reguliert und durch PI3K
kontrolliert wird. In diesem konservierten Signalweg konnte gezeigt werden, dass ein
Verlust des Tumorsuppressorproteins PTEN eine Hyperaktivierung von Akt zur Folge
hatte (197;198). Da in der Harnblase transgener Mäuse eine geringe signifikante Erhöhung
der Expression von PTEN mittels Immunoblot detektiert wurde, konnte von einer
regulierten Hemmung der Akt Aktivierung ausgegangen werden. Dies kann auch eine
Ursache für die Hemmung der Aktivierung von Erk-1/-2 in der Harnblase transgener
Mäuse gewesen sein, die mittels Immunoblot-Analyse gezeigt werden konnte. Die
Regulation des Erk Signalweges, welcher in Zellproliferation involviert ist, wird ebenfalls
heftig und kontrovers diskutiert. Xia et al. konnte zeigen, dass eine Überexpression von
EGFR/erbB2 (Her-2), die mit schlechter Prognose von betroffenen Patienten einhergeht, zu
einer Aktivierung von Erk-1/-2 sowie Akt führte (244). In der Harnblase transgener Mäuse
Kapitel 5 Diskussion
200
konnte eine erhöhte Expression von Her-2 nachgewiesen werden. Jedoch schien somit
PTEN die Aktivierung zu unterdrücken. Andererseits konnte Preston et al. zeigen, das
ROS, wie Wasserstoffperoxid, bei der Übertragung von intrazellulären Signalen, wie
Wachstum und Transformation, involviert sind und dass Her-2 eine wichtige Rolle dabei
spielt. Nur in Zellen mit mutiertem Her-2 kam es zu einer Aktivierung von Erk-1/-2,
während beim exprimierten Wildtyp Her-2 die Erk-1/-2 Phosphorylierung durch Katalase,
welches in Detoxifizierungsprozessen beteiligt ist, blockiert wurde. Im Gegensatz dazu
zeigte Fushimi et al., dass die Inhibierung der Erk-1/-2 Aktivierung durch EP4 Rezeptor
vermittelt werden kann, welches über den Raf-1/MEK/Erk Signalweg erfolgt (245). Raf-1
ist wie die PI3K ein downstream Target von Ras, wobei die verschiedenen Ras Isoformen
Raf und PI3K unterschiedlich aktivieren können. Während die effektivere Aktivierung der
PI3K durch H-Ras erfolgt, kann K-Ras Raf-1 besser an die Zellmembran lokalisieren und
aktivieren (246;247). Folglich kann eine Aktivierung der verschiedenen Ras Proteine
unterschiedliche Konsequenzen auf weitere Signalkaskaden haben. Da es sich bei dem
Pull-down Ras-Assay um Raf-1-RBD-Agarose Beads handelte, ist die Schlussfolgerung
nahe liegend, dass die ermittelte Ras Aktivierung vom K-Ras stammte und die beobachtete
Erk-1/-2 Inhibierung durch den EP4/Her-2/Ras/Raf-Signalweg vermittelt wurde. Aber
sowohl Her-2, Ras, PI3K als auch EP4 Rezeptor werden in fortgeschrittenen Karzinomen
mit Tumorpromotion und -progression in Verbindung gebracht (s. 1.3 und 1.5). Zudem
belegen Literaturdaten, dass eine Überexpression mit einer schlechten Prognose korreliert,
durch die Aktivierung von downstream Targets (wie z. B. Erk-1/-2, Akt, VEGF, MMP),
die das Überleben von Karzinomzellen sicherstellen. In Übereinstimmung zu den
Literaturdaten zeigt diese Arbeit jedoch, dass in den Hyperplasien/Dysplasien der
Harnblasen transgener Mäuse genau diese wichtigen Zentralpunkte in Signalwege
involviert sind, die eine andere, scheinbare protektive Wirkung haben. Durch Nrf-2
vermittelte Aktivierung von Überlebensgenen werden wichtige Detoxifizierungsgene
angeschalten und proliferative Signalwege sowie Sauerstoff-zehrende Metabolismen (wie
z. B. Glycolyse, vgl. 2D-DIGE Experiment Tabelle 19) inhibiert, die dann wieder in
Karzinomen aktiviert sind. Somit muss es beim Übergang von der Hyperplasie zum
Karzinom einen Mechanismus geben, der diese Hyperoxie-abhängigen protektiven
Signalwege zu Gunsten der Hypoxie-abhängigen und Proliferation sowie Progression
fördernden Signalkaskaden verschiebt. Ein sehr wichtiger Transkriptionsfaktor, der die
adaptive Antwort unter Hypoxie und der damit verbundenen Aktivierung von abhängigen
Kapitel 5 Diskussion
201
Signalwegen (wie z. B. Glycolyse, Glucosetransporter, Angiogenese, Erythropoese)
vermittelt, um das Überleben von Karzinomzellen sicherstellen, ist Hif-1 (199;202;248).
Eine Überexpression von Hif-1 korreliert mit erhöhter Tumoraggressivität und schlechter
Prognose (199). Besonders die Expression von VEGF wird unter Hypoxia stimuliert (200).
Klein et al. konnte in K5.COX-2 transgener Harnblase einen erhöhten VEGF Level und
vermehrtes Gefäßwachstum detektieren (13), während in dieser Arbeit erstmalig ein
eindeutiger Zusammenhang auf diese späteren Beobachtungen hergestellt werden kann,
denn sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene konnte eine erhöhte Expression von
Hif-1 nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Hif-1
regulatorischen Proteine FIH-1 und VHL, die durch Bindung an Hif-1 dessen
Ubiquitinierung und proteasomale Degradierung initiieren, in ihrer Expression erhöht
waren. Sowohl die Bindung von VHL als auch die von FIH-1 an Hif-1 erfolgt
sauerstoffabhängig, so dass der Verlust der Tumorsuppressoraktivität von VHL und sogar
der von PTEN in einer gesteigerten Expression von Hif-1 resultiert, denn
Untersuchungen zeigten in diesem Zusammenhang, dass eine erhöhte Aktivität von PI3K
ebenfalls eine gesteigerte Expression von Hif-1 fördert (199-201;203). Laughner et al.
konnte zusätzlich zeigen, dass die Aktivierung von Her-2, in Abhängigkeit von der PI3K
Aktivität, die Hif-1 Expression induzieren kann (201). Komplettiert wurde dieser
Signalweg durch Blancher et al., der zeigen konnte, dass dominant aktives V12
Ras die
Expression von Hif-1 und Hif-2 förderte. Erstaunlicherweise wurden die Effekte von
Hif-1 stärker durch einen PI3K Inhibitor geblockt als durch VHL (200). Damit zeigt sich
eindeutig, dass die Her-2/Ras/PI3K-Signalkaskade sowohl protektive als auch progressive
Effekte in Abhängigkeit der vorliegenden Stimuli ausüben kann. Erstaunliche Einsichten
hinsichtlich des Hif-1 downstream Signaling erfolgten durch die Analysen von
Masyugin et al. und Semenza et al., die zeigen konnten, dass die Cytochrome P450 (CYP)
Monooxygenase CYP4B1 Promotorregion zwei Bindestellen für Hif-1 aufweist (248-
250). CYP gehören zur Phase-I Detoxifizierungsenzyme und sind auch an
Entzündungsprozessen sowie an der Biosynthese von Steroiden, Prostaglandinen und
Retinoiden beteiligt. CYP sind Monooxygenasen, die ähnlich wie die acetylierte COX-2,
Arachidonsäure in 12-R-HETE (12-R-hydroxy-5,8,10,14-eicosatetraenoic acid) umsetzen
können (92). Neben diesem potenten Na+/K
+-ATPase Inhibitor können CYP auch
12-R-HETrE (12-R-hydroxy-5,8,14-eicosatrienoic acid) synthetisieren, das
Kapitel 5 Diskussion
202
vasodilatorische, chemotaktische und angio-genetische Eigenschaften besitzt (248). Die
CYP4B1 Promotorregion weißt zusätzlich eine AP1 und SP1 Bindestelle auf (251). Auch
die Hif-1 und die COX-2 Promotorregionen besitzen eine SP1 Bindestelle (252;253).
Unter hypoxischen Bedingungen erfolgt die Aktivierung von SP1, die über EGF Signaling
vermittelt wird (254;255). Benoit et al. postulierte in einem Modell zusätzlich die
Aktivierung von COX-2 über einen Her-2/Ras/AP1 vermittelten Signalweg (7) und in
einer positiven Feedback-Reaktion von PGE2 Her stimulieren, welches in einer
Aktivierung von Hif-1 resultieren kann. Interessanterweise zeigen einige Promotoren,
deren Genregulation durch Nrf-2 vermittelt wird, auch HREs (hypoxia response elements),
wie z. B. die der Hemoxygenase-1 und Aldolase A. Nrf-2 und Hif-1 scheinen somit in
einem komplexen Netzwerk einander gegenseitig zu kontrollieren und gegensätzliche bzw.
gleiche, jedoch zum Vorteil ihrer Signalkaskaden entsprechende Signalwege zu aktivieren.
So z. B. sind die Chaperone Hsp70/Hsp90 Targets von Nrf-2 und bei der Proteinfaltung
involviert. Unter Hypoxia kann die Expression von Hsp70 zur direkten Stabilisierung von
Hif-1 stimuliert werden (256). Auch die Expression anderer Chaperone wird unter
Hypoxie oder direkt durch Hif-1 induziert (257). Das Transporter Chaperone
Hsp70 cognate (Hsc70), welches in K5.COX-2 transgener Harnblase in seiner Expression
erhöht war (s. Tabelle 19), ist der Zellkerntransporter für Ndrg-1, welches zur Gruppe der
stress response genes gehört und für die DNA Reparatur essentiell ist. DNA-Schäden
entstehen auch unter oxidativen Stressbedingungen. Ein Hauptprodukt ist das 8-oxo-
desoxy-Guanin, welches eine Reihe von Missense Mutationen in Karziom bezogenen
Genen verursachen kann (234). Ndrg-1 ist möglicherweise ein direktes Target von Hif-1
da die Expression unter Hypoxia erhöht ist. Folglich kommt es zu erhöhten
Proteinexpressionsleveln von Hsc70 (257). Neben Hsp70 sind auch Erythropoietin und
iNOS direkte Targets von Hif-1(258). Interessanterweise konnte in Nrf-2 defizienten
Mäusen eine erhöhte Expression von iNOS und COX-2 nachgewiesen werden (97).
Ähnliches lässt sich auch für Familienmitglieder der Carbonic anhydrases finden, deren
Transkription durch Nrf-2 oder Hif-1 reguliert werden kann (144;259;260). Neben DNA-
Reparatur spielt auch die mRNA Prozessierung unter derartigen Bedingungen eine
wichtige Rolle. An Prozessierungen der mRNA sind z. B. Heterogeneous nuclear
ribonucleoproteins (hnRNP) beteiligt, deren Regulation der Genexpression durch Nrf-2
vermittelt werden kann (144;186). In hyperplastischer Harnblase transgener Mäuse war die
Kapitel 5 Diskussion
203
Expression von hnRNP A2/B1 reduziert (s. Tabelle 19), während hnRNP A2/B1 im
Lungen- und Brustkarzinom überexprimiert wird. Untersuchungen konnten zeigen, dass
die Sequenz zwei Consensus Sequenzen für Hif-1 in der 5´-Region besitzt und damit
einen direktes Target von Hif-1 darstellt (261). Dies zeigt insgesamt die Komplexheit der
Regulation und Vernetzung von Signalwegen und deren Konsequenzen für die Zelle bei
einer Verschiebung des Regulationsgleichgewichts. Somit bildet diese Arbeit eine wichtige
solide Grundlage, um auf diesem aufzubauen und COX-2 abhängige Signalwege
tiefgründiger zu analysieren und dabei weitere Zusammenhänge und Abhängigkeiten z. B.
in Prozessen der Entzündungsreaktionen, Glycolyse, proteasomalen Abbau, sowie im
MAPK, PI3K und EP-Rezeptor Signaling zu entschlüsseln. Ferner, um die Beziehungen
zwischen Nrf-2 und Hif-1 abhängigen Signalkaskaden und den daraus resultierenden
veränderten Proteinprofilen beim Übergang der Hyperplasie zum Karzinom weiter zu
entschlüsseln. Als proteosomaler Ansatz dient dabei die etablierte hochauflösende 2D-
DIGE-SDS-PAGE-Technologie, um weitere mögliche Kandidatenproteine zu
identifizieren und Anhaltspunkte über abhängig regulierte Signalwege zu erhalten. Um die
Auflösung und Trennung sowie deren Identifizierung von Kandidatenproteinen weiter zu
erhöhen, können speziell ausgewählte pH-Bereiche, z. B. pH 6,2-7,5 anstelle des
gewählten linearen pH-Bereich 3,0-10,0, analysiert werden. Damit lassen sich neue
Ansätze generieren, um weitere wichtige Targets neben COX-2 für die Tumortherapie zu
identifizieren.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eindeutig gezeigt werden, dass die aberrante
COX-2 Expression in der Harnblase von K5.COX-2 transgenen Mäusen zur spontanen
Entwicklung einer Hyperplasie/Dysplasie und schließlich zum Urothelkarzinom führt, die
einhergeht mit erhöhten PG und Her-2 Leveln, sowie einer erhöhten Aktivierung von Ras
und Expression der EP-Rezeptoren EP2 und EP4. Ferner verursacht die COX-2
Überexpression eine Erhöhung des oxidativen Stresses, der zudem COX-2 und PGE2
abhängig war, sowie die differentielle Expression verschiedener Proteine, die in einem
komplexen Netzwerk unter der Regulation von Nrf-2 und Hif-1 stehen, die ebenfalls in
ihrer Expression erhöht waren. Diese Transkriptionsfaktoren sind wichtige Targets der
aktivierten PI3K, die in Abhängigkeit der jeweiligen Situation verschiedene
Signalkaskaden aktivieren kann. Somit kann mittels dieser Arbeit ein Signalweg als
Konsequenz einer COX-2 Überexpression in K5.COX-2 transgener Harnblase
zusammengefasst werden, der eindeutig auf die komplexen Regulationsmechanismen
Kapitel 5 Diskussion
204
hindeutet, bei denen PI3K, Nrf-2 und Hif-1 entscheidende Regulatoren darstellen, um
einerseits die Zelle vor oxidativer Schädigung zu schützen und eine Entartung zu
vermeiden, während andererseits das Überleben und die Progression der Zelle unter
hypoxischen Bedingungen sichergestellt werden soll. Ein Gleichgewicht, welches nicht nur
die Embryonalentwicklung sicherstellt, hat bei einer ungleichen Regulationsverteilung
katastrophale Konsequenzen, die schließlich zum Karzinom führen und deren
Identifizierung maßgebend für weitere Therapieerfolge sein wird.
Kapitel 5 Diskussion
205
Abbildung 81 Konsequenz einer COX-2 Überexpression der Harnblase K5.COX-2 transgener Mäuse. (Erklärung
s. Text).
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5.
Abbildungsverzeichnis
236
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Regulation der Zellzahl durch Proliferation,
Differenzierung und Apoptose .............................................................................................. 2
Abbildung 2 Eigenschaften eines invasiv wachsenden Karzinoms ..................................... 4
Abbildung 3 Schritte der hämatogenen Metastasierung am Beispiel der Lunge ................. 5
Abbildung 4 Hemmung der Apoptose durch Aktivierung der PI3K durch ECM
gebundene Integrine .............................................................................................................. 7
Abbildung 5 Aufbau der männlichen (A) und weiblichen (B) Harnblase ........................... 9
Abbildung 6 Ureterwand (Harnleiterwand) ....................................................................... 10
Abbildung 7 Querschnitt einer kontrahierten Harnblase einer Maus ................................. 10
Abbildung 8 Übersichtsaufnahme eines Querschnitts der Harnblase ................................ 11
Abbildung 9 Spiralig angeordnete glatte Muskulatur der Harnblasenwand ...................... 12
Abbildung 10 Einteilung des Urothelkarzinoms ................................................................ 14
Abbildung 11 Das zu 90 % auftretende Urothelkarzinom (TCC) wird klinisch zwischen
dem papillären Urothelkarzinom und dem invasiven Urothelkarzinom unterschieden ...... 16
Abbildung 12 Umsetzung von Arachidonsäure ................................................................. 21
Abbildung 13 Synthese von PGH2 aus Arachidonsäure (AA) durch die Prostaglandin-
endoperoxid-Synthase (COX-1 und COX-2) ...................................................................... 22
Abbildung 14 PGH2 dient als Vorstufe weiterer Prostaglandine sowie Prostacyclin und
Thromboxan ........................................................................................................................ 23
Abbildung 15 Schematische Darstellung der humanen COX-1 und COX-2 Enzyme ....... 26
Abbildung 16 Kristallstruktur der Kette A der Cyclooxygenase-2 mit gebundenem
Prostaglandin H2 .................................................................................................................. 27
Abbildung 17 Schematische Darstellung der Strukturunterschiede zwischen den
Substratbindungstaschen von COX-1 und COX-2, das die Nutzung eines selektiven
Inhibitors ermöglicht ........................................................................................................... 28
Abbildung 18 Prostaglandin H2 bildet die Vorstufe der biologisch aktiven Prostanoide,
die über spezifische G-Protein-gekoppelte 7-Transmembranrezeptoren autokrin,
parakrin, endokrin oder intrakrin z. B. über PPAR (Peroxisomal proliferativ activated
receptor ) wirken können. .................................................................................................. 32
Abbildung 19 Prostaglandin EP2 und EP4 Rezeptoren abhängige Signalwege fördern
Proliferation, Überleben, Angiogenese und Migration nach PGE2-Aktivierung ................ 38
Abbildung 20 Molekularer Mechanismus von Nrf-2-Keap1 bei oxidativen und
elektrophilen Stress ............................................................................................................. 39
Abbildung 21 Schematische Darstellung des K5.COX-2 DNA-Konstrukts ...................... 57
Abbildung 22 Prinzip der isoelektrischen Fokussierung .................................................... 67
Abbildung 23 Schematische Darstellung des 2D-DIGE Arbeitsflusses mit einem Drei-
Farbsystem ........................................................................................................................... 73
Abbildung 24 Schematische Darstellung des Temperatur-Zeit-Profils einer dreistufigen
PCR ...................................................................................................................................... 91
Abbildung 25 Die Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Maus ........................................ 98
Abbildungsverzeichnis
237
Abbildung 26 Expression von COX-Isoenzymen in K5.COX-2 transgener und
Wildtypharnblase ............................................................................................................... 100
Abbildung 27 Immunolokalisation von Keratin 5 und COX-2 im basalen Epithel der
Harnblase ........................................................................................................................... 101
Abbildung 28 Immunolokalisation von COX-1 in der Tunica muscularis und in
Blutgefäßen der Harnblase ................................................................................................ 102
Abbildung 29 Prostaglandinbestimmung in der Harnblase sowie im Plasma von
7 Wochen weiblichen (w) und männlichen (m) homozygoten COX-2 transgenen und
Wildtyptieren ..................................................................................................................... 103
Abbildung 30 Prostaglandinbestimmung in der Harnblase von 6 Monate alten COX-2
transgenen und Wildtyptieren nach Celecoxibbehandlung ............................................... 105
Abbildung 31 Effekt einer Celecoxibbehandlung von 6 bzw. 12 Monate alten
homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen auf die Hyperplasie .................................. 106
Abbildung 32 Nachweis von Ki67 in der Harnblase von 6 Monate alten homozygoten
Celecoxib unbehandelten und behandelten K5.COX-2 transgenen und Wildtyptieren .... 107
Abbildung 33 Urothelkarzinom (TCC) in der Harnblase von heterozygoten K5.COX-2
transgenen Mäusen ............................................................................................................ 108
Abbildung 34 Kinetische Analyse der Expression von Her-2 in K5.COX-2 transgener
Harnblase ........................................................................................................................... 110
Abbildung 35 Effekt der Celecoxibbehandlung auf die Her-2 Expression in der
Harnblase 12 Monate alter homozygoter transgener Mäuse ............................................. 111
Abbildung 36 Erhöhter Ras-GTP Spiegel in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener
Harnblase ........................................................................................................................... 113
Abbildung 37 Nachweis von Entzündungsclustern in K5.COX-2 trangener Harnblase.. 115
Abbildung 38 Charakterisierung der Entzündungscluster in 12 Monate alten
homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen und Wildtyptieren..................................... 116
Abbildung 39 Kinetischer RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von der
induzierbaren mPGES-1 in Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblaser................... 118
Abbildung 40 Immunoblot der Prostaglandin E Synthase Isoformen in 3 Monate alten
K5.COX-2 transgenen und Wildtyptieren ......................................................................... 119
Abbildung 41 Immunoblot zum Nachweis der Expression der Prostaglandin E
Synthase Isoformen in der Harnblase von sechs und 12 Monate alten K5.COX-2
transgenen und Wildtyptieren ............................................................................................ 120
Abbildung 42 Kinetischer RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression der EP-Rezeptor
Isoformen in Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblaser ......................................... 122
Abbildung 43 Kompetition der EP-Rezeptoren in der Harnblase 3 Monate alter
K5.COX-2 transgener Mäuse ............................................................................................ 123
Abbildung 44 Kinetische Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen in sieben
und 12 Wochen alter Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblase .............................. 124
Abbildung 45 Kinetische Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen in sechs
und 12 Monate alter Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblase ............................... 125
Abbildung 46 Immunolokalisation von EP1 Rezeptor in den Blutgefäßen und
Nervenfaszikel der Harnblase 12 Monate alter Mäuse ...................................................... 127
Abbildungsverzeichnis
238
Abbildung 47 Immunolokalisation von EP2 Rezeptor im Epithel- und Tumorgewebe
der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse ............................................................. 128
Abbildung 48 Immunolokalisation von EP3 Rezeptor in den Blutgefäßen und
Nervenfaszikel der Harnblase 12 Monate alter Mäuse ...................................................... 129
Abbildung 49 Immunolokalisation von EP3 Rezeptor im Epithelgewebe und in der
Muskulatur der Harnblase 12 Monate alter Mäuse ........................................................... 130
Abbildung 50 Immunolokalisation von EP4 Rezeptor in der Harnblase 12 Monate alter
Mäuse ................................................................................................................................ 132
Abbildung 51 Doppelimmunfluoreszenz von EP1 Rezeptor und Entzündungszellen in
der Harnblase von 12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen ......... 133
Abbildung 52 Nachweis von EP2 Rezeptor in Entzündungszellen in der Harnblase von
12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen ........................................ 134
Abbildung 53 Doppelimmunfluoreszenz von EP3 Rezeptor und Entzündungszellen in
der Harnblase von 12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen ......... 135
Abbildung 54 Nachweis von EP4 Rezeptor in Entzündungszellen in der Harnblase von
12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen ........................................ 136
Abbildung 55 Nachweis von EP2 und EP4 Rezeptor in Makrophagen in der Harnblase
12 Monate alter Wildtyptiere. Indirekte Immunfluoreszenz in Gefrierschnitten der
Harnblase ........................................................................................................................... 137
Abbildung 56 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Her-2 in den humanen
Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637 ..................................................................... 138
Abbildung 57 Nachweis der Expression von COX-Isoenzymen in humanen RT112
und 5637 Urothelkarzinomzelllinien ................................................................................. 139
Abbildung 58 Expressionsanalyse der PGE-Synthase Isoformen in humanen RT112
und 5637 Zellen ................................................................................................................. 140
Abbildung 59 RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression der EP-Rezeptor Isoformen
in humanen Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637 ................................................. 141
Abbildung 60 Immunoblot zum Nachweis der EP-Rezeptor Isoformen in RT112 und
5637 Zellen ........................................................................................................................ 142
Abbildung 61 Etablierung der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese. Repräsentative
Darstellung eines Gesamtproteinhomogenats der Harnblase einer 12 Monate alten
transgenen Maus ................................................................................................................ 145
Abbildung 62 Analytische Auswertung der 2-Dimensionalen Differenz-In-Gel-
Elektrophorese (2D-DIGE)................................................................................................ 146
Abbildung 63 Analytische Auswertung der 2D-DIGE mit anschließender Silberfärbung
des technischen Versuchsansatzes ..................................................................................... 148
Abbildung 64 Immunoblot zum Nachweis der differentiellen Expression der
Peroxiredoxin-(Prx-)Isoformen in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase ..... 153
Abbildung 65 Darstellung der Expression der Peroxiredoxin (Prx-)Isoformen mittels
Immunoblot in RT112 und 5637 Zellen ............................................................................ 155
Abbildung 66 Effekt einer Celecoxib-(CX-)Behandlung auf den oxidativen Stress der
humanen RT112 und 5637 Zellen ..................................................................................... 157
Abbildungsverzeichnis
239
Abbildung 67 Bestimmung von PGE2 in humanen Urothelkarzinomzelllinien nach
Celecoxibbehandlung ........................................................................................................ 158
Abbildung 68 Zunahme des oxidativen Stresses nach Aufhebung der Hemmung der
katalytischen Aktivität von COX-2 durch den Inhibitor Celecoxib .................................. 159
Abbildung 69 Analytische Auswertung der 2D-DIGE mit anschließender
Silberfärbung ..................................................................................................................... 161
Abbildung 70 Differentielle Expression und pI-Shift der Glutathione S-transferase
Isoform mu 1 in der Harnblase transgener Mäuse ............................................................. 178
Abbildung 71 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Glutathione
S-transferase (GST) und Hemoxygenase-1 (HO-1) in der Harnblase K5.COX-2
transgener Mäuse ............................................................................................................... 179
Abbildung 72 RT-PCR zum Nachweis der Expression von Nrf-2 in der Harnblase von
sechs und 12 Monate alten Wildtyptieren und K5.COX-2 transgenen Mäusen ................ 182
Abbildung 73 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Nrf-2 in der Harnblase
von sechs und 12 Monate alten Wildtyptieren und transgenen Mäusen ........................... 182
Abbildung 74 Nachweis einer beginnenden Translokation von Nrf-2 in den Zellkern
in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse ......................................................... 183
Abbildung 75 Effekt einer Celecoxibbehandlung auf die Translokation von Nrf-2 in
den Zellkern humaner Urothelkarzinomzelllinien mittels immunhistochemische
Analyse .............................................................................................................................. 185
Abbildung 76 Immunoblot-Analyse von totaler und phosphorylierter PI3K in der
Harnblase 12 Monate alten transgenen und Wildtyptieren. .............................................. 186
Abbildung 77 Immunoblot-Analyse der Expression von PTEN in der Harnblase 12
Monate alten transgenen und Wildtyptieren ...................................................................... 187
Abbildung 78 Immunoblot-Analyse vom totalen und phosphorylierten Akt, Erk-1 und
Erk-2 in der Harnblase von sechs und 12 Monate alten transgenen und Wildtyptieren ... 188
Abbildung 79 RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von HIF-1 in sechs und 12
Monate alter Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblaser.......................................... 190
Abbildung 80 Immunoblot-Analyse der Expression von HIF-1, der regulatorischen
Proteine VHL und FIH-1 in der Harnblase transgener und Wildtyptiere.......................... 190
Abbildung 81 Konsequenz einer COX-2 Überexpression der Harnblase K5.COX-2
transgener Mäuse ............................................................................................................... 205
Tabellenverzeichnis
240
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Klassifikation des Tumors nach der TNM-Nomenklatur ................................... 18
Tabelle 2 Eigenschaften der humanen Cyclooxygenasen COX-1, COX-2 und COX-3 .... 30
Tabelle 3 Signaltransduktion von Prostanoidrezeptoren. ................................................... 33
Tabelle 4 Pathophysiologische und physiologische Effekte der Prostaglandine. ............... 34
Tabelle 5 Verwendete Primäre Antikörper ......................................................................... 52
Tabelle 6 Verwendete Sekundäre Antikörper ..................................................................... 54
Tabelle 7 Eingesetzte Oligonukleotide ............................................................................... 55
Tabelle 8 Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels ................................................. 65
Tabelle 9 Molekulargewichte des SDS-6H-Standard-Markers nach Sigma....................... 65
Tabelle 10 Molekulargewichte des Low-Molecular-Weight-Markers nach Sigma ........... 65
Tabelle 11 Laufprogramm der isoelektrischen Fokussierung nach GE Healthcare in der
ersten Dimension für 180 mm lange IPG-Streifen .............................................................. 68
Tabelle 12 Zusammensetzung der 12,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgele in der zweiten
Dimension ............................................................................................................................ 69
Tabelle 13 Eigenschaften der Fluorochrome Cy2, Cy3 und Cy5 ....................................... 71
Tabelle 14 Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe .......................................................... 86
Tabelle 15 Reaktionsansatz für die RT-Reaktion mit 20 µl Reaktionsvolumen ................ 90
Tabelle 16 Reaktionsansatz für die PCR ............................................................................ 91
Tabelle 17 Analytische Auswertung des intra-Assay 2D-DIGE Versuchsansatz auf
Grundlage der Nullhypothese ............................................................................................ 147
Tabelle 18 Differentiell exprimierte Proteine in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener
Harnblase verglichen mit Wildtyptieren des intra-Assay Versuchsansatzes..................... 150
Tabelle 19 Differentiell exprimierte Proteine in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener
Harnblase des biologischen (inter-Assay) Versuchsansatzes. ........................................... 162
Tabelle 20 2D-DIGE identifizierte, Nrf-2 abhängige Proteine ......................................... 181
Danksagung
241
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich ein paar spezielle Worte an einige Menschen richten, die mich
auf meinem Weg begleitet und auch unterstützt haben sowie viel Kraft spendeten in
weniger erfreulichen Stunden, so dass das Geschriebene nicht losgelöst vom ganzen
betrachte werden darf.
An erster Stelle möchte ich mich natürlich bei meinen Eltern bedanken, die mir seit Jahren
immer in allen Lebenslagen geholfen haben und immer für mich da waren. Ich danke
meinem Bruder, mit dem ich so viele lustige und abenteuerliche Stunden verbringen
konnte und wir uns gegenseitig immer wieder aufgebaut haben. Ich danke speziell meiner
Freundin Kerstin, mit der ich schon so manches Tief überwunden habe, was uns insgesamt
nur stärkte, wie auch die 3-jährige Fernbeziehung für diese Arbeit.
Ich danke Herrn Dr. Fürstenberger für sein Engagement der kontinuierlichen
Unterstützung hinsichtlich meiner Arbeitsverträge, für die informativen, fachlichen wie
auch privaten Gesprächen. Außerdem danke ich Herrn Dr. Fürstenberger und Frau
Dr. Müller-Decker für die Möglichkeit, in ihrer Gruppe meine Arbeit anzufertigen, sowie
für deren Bereitstellung der Arbeitsmaterialien und Geräte.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Buselmaier für sein großes universitäres
Engagement und seiner Unterstützung als „Doktorvater“. Ferner danke ich Herrn Dr. Kern
für seinen Einsatz als Gutachter und seine fachliche Kompetenz sowie Frau Prof. Berger
für ihre Unterstützungen.
Für die technische Unterstützung möchte ich gern Brigitte Steinbauer, Andrea Pohl-Arnold
und Dagmar Kucher danken, ferner meinen Azubis Marcello Schifani und Jasmin Meckler,
die erfrischende Eindrücke hinterlassen haben. Ich wünsche beiden weiterhin viel Erfolg
für ihre berufliche Verwirklichung.
Von meinen Mitarbeitern möchte ich besonders Timo Kehl und Seema Noor sowie Markus
Stauch und Steffi Klappenecker danken für ihre aufmunternden Gespräche, dass sie immer
für einen da waren, wenn man sie brauchte und dass sie die Eingewöhnung in die neue
Heimat erleichterten. Für die tollen Stimmungen in unserem Labor danke ich Ina
Kutschera, Susy Hummel, Sarah Chiblac, Nico Epp, Silvia de Juanes und Mareen Neuman.
Ich wünsche Euch viel Glück bei Eurem weiteren Werdegang!
Danksagung
242
An dieser Stelle möchte ich mich auch für die sehr gute Zusammenarbeit bei
GE Healthcare bedanken. Ohne den Einsatz von Herrn Dr. Goddemaier, Herrn Dr.
Junghans, Herrn Dr. Thiermann sowie Herrn Dr. Wirtz, die mich ständig in einem
Vorhaben der 2D-DIGE-Technologie begleiteten und unterstützten. Mein weiterer Dank
gilt an dieser Stelle Dr. Henning Urlaub. Durch dessen Einsatz wurde das „Summer School
in Proteomic Basics“ Projekt in Brixen/Bressanon ins Leben gerufen. Hierbei war es mir
möglich, tiefe Eindrücke in Proteomics zu erzielen. In diesem Zusammenhang möchte ich
besonders Herrn Dr. Burkhard Scheibe, Herrn Prof. Helmut E. Meyer, Herrn Dr.
Lottspeich und Herrn Dr. Hanno Steen für ihre ausgiebigen Gespräche, offen Antworten
und den vielen Anregungen danken im Bereich der Proteomics danken. Im Bereich der
Massenspektroskopie möchte ich mich besonders bei Dr. Uwe Warnken, Dr. Martina
Schölzer und Dr. Tore Kempf für die tolle Zusammenarbeit bei der Identifizierung der
POIs bedanken. Zusätzlich bedanke ich mich bei Genebio für die Bereitstellung ihrer
Melanie-Software.
Mein größter Dank geht an Herrn Prof. M. Yamamoto für seine kompetenten
Unterstützungen im Bereich des Nrf-2 Signaling und des oxidativen Stresses.
All denjenigen, denen nicht persönlich gedankt werden konnte, danke ich auf diesem Wege
für ihre Unterstützungen und wünsche allen alles Gute für die weitere Zukunft und bis zum
Wiedersehen!