INAUGURAL - DISSERTATION · urinary bladder which was shown on mRNA- and protein level as well as...

INAUGURAL - DISSERTATION

zur

Erlangung der Doktorwürde

der

Naturwissenschaftlich-Mathematischen-Gesamtfakultät

der

Ruprechts - Karls - Universität

Heidelberg

erstellt am

Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg

(DKFZ)

vorgelegt von

Diplom-Biochemiker Erik Dülsner

aus: Berlin

Tag der mündlichen Prüfung: 22. November 2007

Thema

Cyclooxygenase-(COX-)2 abhängige Signaltransduktion

in der Harnblase

K5.COX-2 transgener Mäuse

Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Werner Buselmaier

PD Dr. med. Michael A. Kern

Fürchte dich nicht vor dem langsamen Vorwärtsgehen,

fürchte dich nur vor dem Stehen bleiben.

chin. Weisheit

Für

„Meine Familie“

Zusammenfassung

I

Das Urothelkarzinom ist die 4. häufigste Karzinomerkrankung bei Männern und die 6.

häufigste bei Frauen. In allen Stadien des Urothelkarzinoms konnte gezeigt werden, dass es

zu einer erhöhten Expression der induzierbaren Cyclooxygenase Isoform, COX-2, mit

erhöhten Prostaglandinspiegeln kommt. COX-2 wird in den meisten Geweben nicht

exprimiert, jedoch in Prozessen der Wundheilung und Entzündung oder in Karzinomen

induziert. Um die Rolle der COX-2 im Urothelkarzinom zu untersuchen, wurde ein

transgenes Mausmodell verwendet, bei dem die COX-2 cDNA unter dem Keratin

5-Promotor steht, so dass es zu einer konstitutiven Expression von COX-2 im basalen

Epithel (u. a. Harnblasenschleimhaut) kommt, welches auf RNA- und Proteinebene sowie

mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden konnte. Die spontane Entwicklung des

entzündlichen, hyperplastischen/dysplastischen Phänotyps im Transgen konnte durch

Hemmung der COX-2 Aktivität mittels COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib reduziert

wurde. Die spontane Entwicklung des Urothelkarzinoms im Transgen erfolgte scheinbar

entlang dem humanen Urothelkarzinom, aufgrund erhöhter Her-2 Level und Ras

Aktivierung. Der COX-2 bedingte Phänotyp im Transgen wurde über die EP-Rezeptor

Isoformen EP2 und EP4 vermittelt, da deren Expression erhöht war und die beiden

EP-Rezeptor Isoformen von Entzündungszellen und von Karzinomzellen exprimiert

wurden.

Mittels etablierter 2D-DIGE-Technologie konnte im Transgen die differentielle Expression

verschiedener Proteinen, wie z. B. Prx-2 oder GST (Phase-II Detoxifizierungs- und anti-

oxidativer Stress Antwortenzyme), detektiert werden, welches einen erhöhten oxidativen

Stress implizierte. Durch einen in vitro Ansatz konnte gezeigt werden, dass der erhöhte

oxidative Stress im Transgen COX-2 und PGE2 abhängig war. Die Regulation der

Transkription der Phase-II und anti-oxidativer Stressgene wird durch den

Transkriptionsfaktor Nrf-2 vermittelt, dessen Expression im Transgen erhöht war und seine

Zellkerntranslokation COX-2 abhängig erfolgte.

Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass eine aberrante COX-2 Überexpression den

erhöhten oxidativen Stress fördert und die daraus resultierenden Dysregulationen COX-2

bedingter downstream Targets zum hyperplastischen Phänotyp und zur Entwicklung des

Urothelkarzinom führen und daher COX-2 eine wichtige Zielstruktur bei der Behandlung

des Urothelkarzinoms darstellt.

Summary

II

Urinary bladder cancer is a common cancer disease worldwide which ranks on place 4 in

men and place 6 in women of all cancer diseases. According to the TNM-system it was

shown that the inducible isoform of Cyclooxygenases, COX-2, is over-expressed in all

stages of urinary bladder cancer. Under physiological conditions COX-2 is normally not

expressed in most tissues, but is rapidly induced by mitogens, pro-inflammatory cytokines

or growth factors. To investigate the role of COX-2-dependent signaling during the

development of urinary bladder cancer, a transgenic mouse model was used where the

COX-2 cDNA is under control of the bovine Keratin 5-promotor. In marked contrast to the

normal situation, COX-2 is constitutively over-expressed in the basal epithelium of the

urinary bladder which was shown on mRNA- and protein level as well as by

immunfluorescence. Moreover, the spontaneous development of an inflammatory

hyperplastic/dysplastic phenotype accompanied by increased prostaglandin levels in

transgenic were reduced by the COX-2-selective inhibitor Celecoxib. Furthermore, the

spontaneous development of the transitional cell carcinoma (TCC) in transgenic may

occurred along the human TCC pathway via elevated Her-2 level and increased Ras

activation. The COX-2-dependent phenotype in transgenic showed increased prostaglandin

EP2 and EP4 receptor levels which were expressed in tumor cell areas and by

inflammatory cells.

By means of the established 2D-DIGE-Technology the differentially expression of various

enzymes in transgenic was shown, e.g. Prx-2 and GST (phase-II detoxifying and anti-

oxidative stress response enzymes), suggesting an increased oxidative stress. Using in vitro

analysis it was shown that oxidative stress occurred in a COX-2- and PGE2-dependent

manner. The coordinated transcription of phase-II detoxifying and anti-oxidative stress

response genes are regulated by the transcription factor Nrf-2. Its expression was increased

in transgenic and the nucleus translocation occurred COX-2-dependent.

Taken together, the aberrant COX-2 over-expression increased additionally the oxidative

stress and results in a differentially expression of COX-2-dependent downstream targets

which trigger the hyperplastic phenotype and consequently results in the development of

TCC. Therefore, COX-2 is a tremendously important therapeutic target of urinary bladder

cancer.

Abkürzungen

III

Abkürzungen

% Prozent

~ etwa, rund

” Zoll

°C Grad Celsius

µ(X) My

2D-DIGE 2-Dimensionale Differenz-In-Gele-Elektrophorese

A Ampere

AA Arachidonsäure

AC Adenylat-Cyclase

AKT Proteinkinase B

APS Ammoniumpersulfat

ARE Antioxidant responsive element

BCG Bacillus Calmette Guérin

bp Basenpaar

bzw. beziehungsweise

cAMP Cyclic adenosine monophosphate

cDNA kopierte Desoxyribonukleinsäure

CIS Carcinoma in situ

COX Cyclooxygenase

COXib selektive COX-2 Inhibitoren

CREB cAMP response element binding protein

CT Computertomographie

CX Celecoxib

CYP Cytochrom

d. h. dass heißt

DAB Diaminobenzidin

DAG Diacylglycerin

DAPI 4´,6-Diamidino-2-phenylindol

DMEM Dulbeco´s modified eagle´s medium

DNA Desoxyribonukleinsäure

ECL Enhanced chemiluminescence

Abkürzungen

IV

ECM Extra Cellulare Matrix

EET Epoxyeicosatrienoic acid

EGF(R) Epidermal growth factor (receptor)

EPA Eicosapentaensäure

ER Endoplasmatisches Retikulum

Erk Extracellular-signal regulated kinase

ESI (Q-ToF) Elektrospray Ionisation (Time-of-Flight)

ETS E-twenty six-sepcific

FAK Focal Adhesion Kinase

FAP Familial adenomatous polyposis

FDA US Food and Drug Administration

FGFR Fibroblast growth factor receptor

FIH-1 Factor inhibiting HIF-1

g Gramm

GDP Guanosine diphosphate

GM-CSF Granulocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor

GPCR G protein-coupled receptor (G-Protein-gekoppelter

7-Transmembranrezeptor)

GSH Glutathion

GTP Guanosine triphosphate

HE Hämatoxylin/Eosin

Her-2 Human epidermal growth receptor 2, erbB2 (Her-2/neu)

HIF-1 Hypoxia inducible factor 1alpha

HO-1 Hemoxygenase-1

HPETE Hydroperoxyeicosatetraenoic acid

HPLC High performance liquid chromatography

HRE Hypoxia responsive element

HRP Horseradish Peroxidase

IB Immunoblot

IEF Isoelektrische Fokussierung

IF Immunfluoreszenz

IHC Immunhistochemie

kDa kiloDalton

Abkürzungen

V

l Liter

LOH Loss of heterozygosity

LSB Laemmli Sample Buffer

m Masse

M Molar

m(X) milli

MALDI-ToF Matrix-assisted laser desorption/ionization Time-of-Flight

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MEK Extracellular signal-regulated kinase kinase

min Minute

mm Millimeter

MMP Matrix-Metalloproteinase

Mo Monat

mRNA messenger (Boten-) Ribonukleinsäure

MS Massenspektroskopie

MSA Multiple Systematrophie

NF-IL6 Nuclear factor interleukin-6

NFB Nuclear factor kappa b

NL Non-Linear

nm Nanometer

Nrf-2 Nuclear factor, erythroid derived 2, like 2

NSAR Nicht-Steriodale Anti-Rheumatika (NSAID, Non-steroidal anti-

inflammatory drug)

p.A. per Analysis

PBS Phosphate buffered saline

PG Prostaglandin

PI3K Phosphatidylinositol 3-Kinase

PKA Proteinkinase A

PLA2 Phospholipase A2

PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor

Prx Peroxiredoxin

PSD Post source decay

PTEN Phosphatase and tensin homolog

Abkürzungen

VI

PTFE Polytetrafluorethylen

PVDF Polyvinylidenfluorid

Ras Rat sarcoma

RasGEF Ras Guanine nucleotide exchange factor

Rb Retinoblastom

RKI Robert-Koch Institut

RNA Ribonukleinsäure

ROS reaktive Sauerstoffspezie (reactive oxygen species)

rpm Rounds per minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Traskriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion

SCC Squamous cell carcinoma

SD Standard derivation

SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

SEM Standard error of mean

TCC Transitional cell carcinoma

Tcf T-cell factor

TCH Transitional cell hyperplasia

TM Temperatur

TPA Tetradecanoyl-Phorbolacetat

TUR Transurethrale Resektion

U Unit

u. a. unter anderem

u. U. unter Umständen

v/v Volume per volume

VEGF Vascular endothelial growth factor

vgl. Vergleich

VHL Von Hippel-Lindau factor

w/v Weight per volume

Wo Woche

z Ladung

z. T. zum Teil

z. B. zum Beispiel

Inhaltsverzeichnis

VII

Inhaltsverzeichnis

Kapitel 1 Einleitung ............................................................................................................. 1

1.1. Proliferation, Apoptose, Krebs, Tumor und Metastasierung .................................. 2

1.2. Harnblase (Vesica urinaria) .................................................................................... 8

1.3. Urothelkarzinom ................................................................................................... 13

1.4. Arachidonsäurestoffwechsel ................................................................................. 19

1.4.1. Prostaglandinendoperoxid-Synthase (COX) ................................................. 24

1.4.2. Prostaglandine und ihre pro- und anti-inflammatorischen Effekte ............... 31

1.5. Cyclooxygenase-2 im Zusammenhang mit dem Urothelkarzinom ...................... 35

Kapitel 2 Zielsetzung ......................................................................................................... 40

Kapitel 3 Material und Methoden .................................................................................... 41

3.1. Material ................................................................................................................. 41

3.1.1. Geräte und Chemikalien ................................................................................ 41

3.1.2. Antikörper ...................................................................................................... 52

3.1.3. Primer ............................................................................................................ 55

3.2. Methoden .............................................................................................................. 57

3.2.1. Mauslinien ..................................................................................................... 57

3.2.2. Entnahme der Harnblase aus Mäusen ............................................................ 58

3.2.3. Proteinisolierung aus der Harnblase .............................................................. 58

3.2.4. Proteinbiochemische Nachweisverfahren...................................................... 63

3.2.5. Immunologische Analysen ............................................................................ 81

3.2.6. Molekularbiologische Analysen .................................................................... 88

3.2.7. Lipidanalytik .................................................................................................. 92

3.2.8. In vitro Analysen ........................................................................................... 95

3.2.9. Statistik .......................................................................................................... 96

Kapitel 4 Ergebnisse .......................................................................................................... 97

4.1. Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Mausmodell ............................................. 97

4.2. COX-2 Proteinexpression und Prostaglandinprofile in der Harnblase

transgener Mäuse ............................................................................................................. 99

4.2.1. Expression und immunhistochemische Lokalisation von

COX-Isoenzymen…. ................................................................................................... 99

4.2.2. Erhöhte Prostaglandinspiegel in der Harnblase transgener Mäuse ............. 102

4.3. Eine Proliferationsstörung bedingt Hyperplasie und spontane

Tumorentstehung…. ...................................................................................................... 105

Inhaltsverzeichnis

VIII

4.4. Die spontane Tumorentwicklung in Harnblase transgener Mäuse erfolgt

entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell ........................................... 108

4.4.1. Erhöhte Her-2 Level in der Harnblase transgener Mäuse ........................... 109

4.4.2. Ras ist in der Harnblase transgener Mäuse aktiviert ................................... 112

4.5. Zusammenhang zwischen COX-2 Überexpression und einem entzündlichen

Phänotyp ........................................................................................................................ 114

4.6. Analyse des Prostaglandin E2 Syntheseweges .................................................... 117

4.6.1. Expression der Prostaglandin E Synthase (PGES-)Isoformen .................... 117

4.6.2. Expression und Lokalisation der Prostaglandin E Rezeptor

(EP-)Isoformen…. ..................................................................................................... 120

4.6.3. K5.COX-2 transgene Mäuse zeigen ein vergleichendes Expressionsprofil

wie humane Urothelkarzinomzelllinien..................................................................... 138

4.7. Gewebliche Proteomanalyse mittels 2-Dimensionaler

Differenz-In-Gel-Elektrophorese-(2D-DIGE-)Technologie ......................................... 143

4.7.1. Etablierung der 2D-DIGE-Technologie ...................................................... 143

4.7.2. COX-2 Überexpression erhöht den oxidativen Stress ................................. 152

4.7.3. Oxidativer Stress verursacht eine erhöhte Expression von Nrf-2 in der

Harnblase transgener Mäuse ...................................................................................... 159

Kapitel 5 Diskussion ........................................................................................................ 192

Kapitel 6 Referenzen ....................................................................................................... 206

Kapitel 1 Einleitung

1


Das Urothelkarzinom ist eine zunehmende Tumorerkrankung weltweit (1;2). Als

Hauptrisikofaktoren werden chronische Entzündungen, Bilharziose und das Rauchen

angesehen (3-5). Die dadurch verursachten molekularen Veränderungen wie Mutationen

im p53-Gen, führen zum Beispiel (z. B.) zum invasiven Urothelkarzinom, während der

veränderte funktionelle Status eines Proteins durch Phosphorylierungen (wie im

Retinoblastom, Rb) das Urothelkarzinom begünstigt (6). Auch Dysregulationen in der

Proteinexpression, die unterschiedliche Signalwege aktivieren können und somit

Proliferation begünstigen, wie eine Aktivierung von erbB2 (Her-2/neu, Human epidermal

growth receptor 2), das mit einer schlechten Prognose beim Brustkarzinom im

Zusammenhang steht, tragen zur Entstehung des Urothelkarzinoms bei (7;8). Klinische

Studien zeigten in diesem Zusammenhang, dass die Cyclooxygenase-(COX-)2 Expression

in allen Stadien des Blasentumors erhöht ist (9;10). Darüber hinaus gibt es Hinweise

darauf, dass ein Zusammenhang zwischen COX-2 Expression und der Tumorinvasion

sowie dem klinischen Verlauf bei Patienten besteht (6;11;12). Eine COX-2 Überexpression

wird auch in anderen Tumoren, wie in der Haut oder Brust, im Pankreas oder Colon

beobachtet (13-15). COX-2 ist die durch inflammatorische Zytokine oder

Tumorpromotoren induzierbare Isoform der Cyclooxygenasen im

Prostaglandinstoffwechsel, die den geschwindigkeits-bestimmenden Schritt (committed

step) der Prostaglandinsynthese katalysieren. Prostaglandine wirken über

G-Protein-gekoppelte 7-Transmembranrezeptoren und können eine Reihe von

Signalwegen induzieren, die in der Proliferation, Differenzierung oder Apoptose einer

Zelle münden (16;17). Die Hemmung der COX-2 Aktivität durch spezifische Inhibitoren

(z. B. Celecoxib, CX) zeigten eine deutliche Reduktion in der Tumorlast (18-20). Daher ist

die Analyse des Proteoms der hyperplastisch/dysplastischen Blase von höchster

Bedeutung, um ein COX-2 abhängiges Proteinprofil zu ermitteln, damit gezielt neue

Wirkstoffe gegen das Urothelkarzinom entwickelt werden können.


2

1.1. Proliferation, Apoptose, Krebs, Tumor und Metastasierung

Im Organismus wird die Zellzahl im Wesentlichen durch die zwei Vorgänge,

Zellproliferation und Apoptose, kontrolliert.

Die Zellproliferation umfasst die Teilung von Zellen. Dabei wird das genetische Material

der Mutterzelle auf die Tochterzellen (zwei Tochterzellen bei der mitotischen Zellteilung

und vier Tochterzellen bei der meiotischen) übertragen. Die proliferierenden Zellen teilen

sich solange, bis sie Kontakt zu den Nachbarzellen ausgebildet haben. Dann stellen sie

durch Kontaktinhibition ihre Zellteilung ein (21). Ausnahmen bestehen, wenn der Verlust

von Zellen einen Ersatz durch Neubildung notwendig macht, z.B. Zellen in der Umgebung

einer Verletzung oder im Darmepithel (22).

Bei der Apoptose handelt es sich um ein genetisch determiniertes, aktives Sterbeprogramm

der Zelle. Beide Prozesse liegen unter physiologischen Bedingungen in einem streng

kontrollierten Gleichgewicht vor. Eine Verschiebung zugunsten der Apoptose führt zu

einer Hypotrophie, wie sie bei einigen neurologischen Erkrankungen (z. B. Multiple

Systematrophie, MSA) beobachtet wird. Eine Verschiebung zugunsten der Proliferation

führt zur Hypertrophie, die mit der Entstehung von Tumoren sowie

Autoimmunerkrankungen einhergehen kann. In Abbildung 1 ist die Regulation der

Zellzahl schematisch dargestellt.

Abbildung 1 Schematische Darstellung der Regulation der Zellzahl durch Proliferation, Differenzierung und

Apoptose. In einem neoplastischen Gewebe erfolgt eine Verschiebung der Homöostase zu Ungunsten von

Differenzierung und Apoptose in Richtung Proliferation bzw. einer Blockade der Apoptose. Dies hat einen Anstieg

der Zellzahl zur Folge (23).

einheitliche

Zellpopulation

+

+

-

-

Differenzierung von

Vorläuferzellen

Differenzierung von

reifen Zellen

Proliferation Apoptose


3

Unter dem Begriff „Neoplasie“ wird allgemein die abnorme Vergrößerung eines Gewebes

verstanden, welches durch autonome, progressive und überschießende Proliferation

körpereigener Zellen gekennzeichnet ist. Der Begriff „Krebs“ wird im Zusammenhang

maligner Tumore verwendet, die sich von den benignen dahingehend unterscheiden, dass

sie ein infiltratives und destruktives Wachstum sowie die Fähigkeit zur Metastasenbildung

besitzen. Der Begriff „Krebs“ stammt aus dem Lateinischen cancer für Geschwülste, „die

sich im Gewebe festbeißen“ (24).

Tumore, die von den Epithelien ausgehen sind Karzinome und diejenigen mesenchymalen

Ursprungs sind Sarkome.

In der Regel sind Tumore (Karzinome) klonalen Ursprungs und bilden sich aus einer

einzigen „Normal“zelle, wobei der Übergang vom „normalen“ Epithel zum CIS

(Carcinoma in situ) als „Transformation“ bezeichnet wird und durch eine zunehmende

Entdifferenzierung gekennzeichnet ist, z. B. gestörte Position der Zellen zueinander, einer

veränderten Zellform und einem fortschreitenden Verlust der Gewebestrukturen. Durch ein

initiales Ereignis in einer gesunden Zelle erhält diese dann einen Wachstumsvorteil

gegenüber ihren Nachbarzellen, so dass sie infolge dessen zu einem Klon identischer

Zellen expandiert (25). Eine Folge weiterer Ereignisse (Promotion) führt zu weiteren

Wachstumsvorteilen, bis schließlich ein Karzinom wächst, welches sich weitgehend den

Kontrollmechanismen des Wirts entzogen hat (25;26). Das Karzinom invadiert ins fremde

Gewebe und siedelt schließlich Metastasen ab (maligne Progression). Dieser Schritt der

Invasion stellt ein wesentliches Definitionskriterium von Karzinomen dar. Es erfolgt ein

Durchdringen der Basalmembran, woraufhin anschließend die Karzinomzellen in das

subepitheliale Bindegewebe eindringen. Sie invadieren dabei auch in Lymphspalten und

Blutgefäße und können aktiv Bestandteile des Bindegewebes abbauen (Destruktion).

Die Invasion der Karzinomzellen in Blut- und Lymphgefäße stellt den initialen Schritt zur

Metastasierung dar, wobei Mechanismen zum Schutz gegen Apoptose aktiv sein müssen,

um in den Gefäßen zu überleben. Nach der Invasion der Karzinomzellen in das Gewebe,

wie es in Abbildung 2 skizziert ist, werden Angiogenese und desmoplastische

Stromareaktion eingeleitet. Unter Verlust der Zell-Zell-Adhäsion sind einige

Karzinomzellen in invasiv wachsenden Karzinomen in der Lage sich aus dem Zellverband

abzulösen und Fernmetastasen zu bilden. Fernmetastasen bilden sich in etwa 90 % aller

Karzinome in denjenigen Kapillarbetten, in die die Karzinomzelle entsprechend der

anatomischen Lokalisation des Karzinoms zuerst gelangt. Dies kann zum Beispiel über


4

eine Embolisierung der Endstrombahn oder durch Adhärenz der Karzinomzelle an das

Endothel erfolgen (23).

Dieser Langzeitprozess der Karzinomentwicklung wird durch das Mehrstufenmodell der

Maushautkarzinogense am besten charakterisiert. Dabei zerlegt es operational und

mechanistisch die gut charakterisierten Teilschritte der Initiation, Promotion und malignen

Progression und bietet eine Grundlage zur Identifizierung karzinomrelevanter Gene sowie

der Funktionsanalyse von definierten genetischen Veränderungen bei der

Karzinomentwicklung (27-30).

Abbildung 2 Eigenschaften eines invasiv wachsenden Karzinoms. Karzinomzellen durchdringen die

Basalmembran und brechen in Blut- und/oder Lymphgefäße ein und bilden so Fernmetastasen (23).

Wie bereits erwähnt, invadieren die Karzinomzellen nach Durchdringen des Endothels das

subendotheliale bindegewebige Stroma, anschließend das Parenchym des betreffenden

Organs und bilden dort solide Metastasen. Dies ist am Beispiel der hämatogenen

Lungenmetastasierung in Abbildung 3 gezeigt. Auch im späten Stadium des

Blasenkarzinoms können in der Lunge Fernmetastasen auftreten.

Einbruch in Lymphgefäße

Destruktion der Basalmembran

Invasion, Verlust des Zell - Zell - Kontakts Entzündungsreaktion ( Leukozyten) Einbruch in Blutgefäße

Angiogenese


5

Abbildung 3 Schritte der hämatogenen Metastasierung am Beispiel der Lunge. Zirkulierende Karziomzellen, die

Apoptosemechanismen unterlaufen, adhärieren am Lungenendothel und invadieren ins Stroma, wo sie solide

Lungenmetastasen ausbilden. In diesen Prozess sind aktivierte MMPs (Matrix-Metallo-Proteinasen)

involviert (23).

Lungenmetastase

Extravasion

Adhärenz an das

Lungenendothel und/oder Embolisierung von

Kapillaren

Zirkulierende Karzinomzellen mit anti - Apoptose - Mechanismen und

aktivierten MMPs


6

Die soliden Karzinome bestehen aus den eigentlichen Karzinomzellen und den

akzessorischen Zellen, zu denen die Endothelzellen, die Fibroblasten und ggf.

Immunzellen (Leukozyten, Lymphozyten) gehören. Letztere sind immer Ausdruck von

Entzündungsreaktionen, die bei der Tumorentstehung beobachtet werden können (13).

Hingegen wird die Phagozytose nekrotischer Gewebsbestandteile den Makrophagen

zugeschrieben.

Unter physiologischen Bedingungen verhindert das Apoptoseprogramm „heimatloser“

Zellen (Anoikis) die Ansiedlung ins fremde Gewebe. Metastasierende Zellen unterlaufen

jedoch diese physiologische Kontrolle, da sie nicht mehr auf den Kontakt zur ECM (Extra

Cellulare Matrix) angewiesen sind und somit unter pathophysiologischen Bedingungen

überleben können. Möglicherweise ist die FAK (Focal Adhesion Kinase) für das

Überleben der adhärenten Zellen verantwortlich, denn eine konstitutive FAK Aktivierung

in Endothelzellen führt zum Ausbleiben des Apoptoseprogramms nach dem Verlust ihrer

Adhärenz zur ECM (31), so dass die Produktion von mutiertem, konstitutiv aktivem Ras

(Rat sarcoma) über die PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase) das eigentliche Integrin

vermittelte Signal zur Hemmung der Apoptose ersetzten könnte, wie es Abbildung 4

schematisch darstellt.

Alternativ zu diesem Signalweg, wäre eine verstärkte FAK Expression, wie sie im

Kolorektal- und Mammakarzinom beobachtet wird (32).

Andererseits führt ein konstitutiv aktiviertes Ras zur Aktivierung von Erk-1/-2

(Extracellular-signal regulated kinase), welches einerseits die cytoplasmatische PLA2

(Phospholipase A2) aktiviert, die ihrerseits Arachidonsäure, dem unmittelbaren Substrat

der Cyclooxygenasen, freisetzt und andererseits die Genexpression durch Phosporylierung

von Transkriptionsfaktoren der ETS-Familie (E-twenty six-sepcific) fördert, zu der die

MMP (Matrix-Metalloproteinase), GM-CSF (Granulocyte/Macrophage-Colony

Stimulating Factor) und auch die COX-2 (Cyclooxygenase-2) gehören. Diese induzierten

Gene sind alle an Vorgängen der Tumorinvasion und Tumorstromabildung sowie der

Wachstumskontrolle beteiligt.


7

Abbildung 4 Hemmung der Apoptose durch Aktivierung der PI3K durch ECM gebundene Integrine. Mutiertes,

konstitutiv aktives Ras kann über die PI3K das eigentliche Integrin vermittelte Signal zur Hemmung der

Apoptose ersetzten (23). RasGEF (Ras Guanine nucleotide exchange factor), GTP (Guanosine triphosphate), GDP

(Guanosine diphosphate), AKT (Proteinkinase B).


8

1.2. Harnblase (Vesica urinaria)

Die Harnblase (Vesica urinaria) ist ein sackförmiges Hohlorgan und befindet sich im

Becken unter dem Bauchfell, direkt hinter der Schambeinfuge (Symphyse) (33).

Die Funktion besteht in der Ansammlung des aus den Nieren kommenden Harns sowie

dessen Ausscheidung über die Harnleiter (Urethra). Dabei bilden die Nieren und die

Ureteren den oberen Abschnitt des Urogenitaltraktes, die Blase und die Harnröhre den

unteren. Über die Urinausscheidung erfolgt die Regulation des Wasser- und Salzhaushaltes

des Körpers. Die Leerung der Harnblase erfolgt im Wesentlichen über den Schließmuskel

der Harnröhre. Ein Harndrang wird bereits bei ungefähr 300 ml ausgelöst, wobei die

Harnblase eines ausgewachsenen Menschen bis zu einem Liter Flüssigkeit aufnehmen

kann. Bei einer längeren Behinderung des Abflusses kommt es zu einem zeitabhängigen

Anstieg der Cyclooxygenase-2 Expression verbunden mit erhöhtem Prostaglandin

PGE-2-Level (34). Damit löst bereits mechanischer Stress der Harnblase eine Expression

von COX-2 aus.

Im gefüllten Zustand weißt die Harnblase eine kugelförmige Form auf, während im leeren

die Harnblase einen schlaffen Sack gleicht. Die Harnblase lässt sich in vier Abschnitte

einteilen:

Harnblasenspitze oder Harnblasenscheitel (Apex vesicae – Verbindung zum

Nabel über das Nabelband),

Harnblasenkörper (Corpus vesicae – Großteil der Harnblasenwand),

Harnblasengrund (Fundus vesicae – Boden der Harnblase),

Harnblasenhals (Übergang zur Harnblase).

Die für die Entleerung der Blase wichtige verflochtene glatte Muskulatur (Musculus

detrusor) umgibt die Harnblase als mittlere Wandschicht. Die äußere Wandschicht ist von

Nerven-, Blut- und Lymphgefäßen durchzogen. Die innere Wandschicht besteht aus

Schleimhaut mit Übergangsepithel (Epithelium transitionale), die sich den ständigen

Volumenveränderungen anpassen kann.

Innerhalb des Blasendreiecks (Trigonum vesicae, befindet sich zwischen den

Harnleiterschlitzen und dem Abgang der Harnröhre) ist die Schleimhaut im Vergleich zu


9

den übrigen aufgefalteten Bereichen glatt. Abbildung 5 zeigt einen Überblick der

männlichen und weiblichen Harnblase (35).

Mikroskopisch betrachtet kann die Harnblase aufgrund des weitgehend übereinstimmenden

anatomischen Aufbaus als dreischichtiger, erweiterter Harnleiter betrachtet werden (36).

Der dreischichtige Wandaufbau setzt sich zusammen aus:

Tunica mucosa,

o Übergangsepithel,

o Submucosa,

Tunica muscularis,

Tunica adventitia,

der in Abbildung 6 dargestellt ist.

Abbildung 5 Aufbau der männlichen (A) und weiblichen (B) Harnblase. Am unteren Scheitel befinden sich bei der

männlichen Harnblase die Samenbläschen und die Prostata (35).

HarnblaseHarnleiter

Samenleiter

Samenbläschen

ProstataMuskelschicht

Harnblase

linker und rechter

Harnleiter

A B


10

Abbildung 6 Ureterwand (Harnleiterwand). Die Harnblase zeigt den dreischichtigen Aufbau einer

Harnleiterwand (van Gieson, Vergrößerung x 100) (37).

Wie bereits erwähnt ist die Harnblase innen mit dem Epithelium transitionale ausgekleidet,

das je nach Harnblasenfüllstand zwei bis 14 Zelllagen aufweist (s. Abbildung 7). Es

beginnt am Rand der Nierenkelche und endet im proximalen Teil der Urethra. Das

Epithelium transitionale dient dem darunter liegendem Gewebe als Barriere gegen den

hypertonen Harn. Dieser Schutz wird durch eine ausgeprägte Glykokalix sowie sehr

wirksamen Tight-junctions gewährleistet. Die Tight-junctions verhindern unter anderem

den Wasseraustritt vom umliegenden Gewebe in den Harn.

Abbildung 7 Querschnitt einer kontrahierten Harnblase einer Maus. Die Schleimhaut legt sich in starke Falten

zusammen (Hämatoxylin/Eosin-(HE-)Färbung, Vergrößerung x 16).

Übergangsepithel

Submucosa

Tunica muscularis

Lumen

Deckschicht des

Urothels

Mucosa (Urothel)

Submucosa

Blutgefäß

Tunica muscularis


11

Die Basalmembran ist asymmetrisch, denn die äußere Lamelle ist mit 8 nm dicker als die

innere mit 2-3 nm. Hervorstechend ist in diesen Membranen der hohe Anteil an

Zerebrosiden als Träger polarer Gruppen sowie integrale Membranproteine, die in

diskusförmigen Vesikeln gespeichert sind (37). Die Vesikel werden bei einer Dehnung in

das lumenwärtige Plasmalemm eingebaut. In der darunter liegenden Zellschicht wechseln

sich Aktin- und Intermediärfilamente ab. Hieran schließt sich die Submucosa an, die aus

einem lockeren, elastischen Bindegewebe besteht. Die Submucosa ist scherenförmig

angeordnet und bildet eine bewegliche Verschiebeschicht. In Querschnitten zeigt sich,

aufgrund der unterstützenden Faltenbildung der Harnblasenwand, ein sternförmiges Lumen

(Abbildung 8).

Nur das Trigonum vesicae bildet eine Ausnahme. Hier ist die Muskelschicht mit der

Schleimhaut fest verwachsen und daher faltenfrei.

Abbildung 8 Übersichtsaufnahme eines Querschnitts der Harnblase. (Schwein, HE-Färbung, Vergrößerung

x 10) (36).

Besonders bei Tieren treten Lymphfollikel in der Submucosa auf. Die an die Submucosa

anschließende Tunica muscularis besteht aus kräftigen Lagen glatter Muskulatur, die

vorwiegend spiralig angeordnet und netzförmig verflochten sind. Des Weiteren ist das

Gewebe durch viele Kollagene aufgelockert. Die Muskulatur gliedert sich in drei

Längsorientierungen. In Abbildung 9 ist gezeigt, dass einer mittleren, zirkulären

Mucosa

Submucosa

Tunica muscularis


12

Muskellage zu beiden Seiten dünnere, längsorientierte Muskelschichten anliegen, die

ebenfalls schraubenförmig angeordnet sind, so dass die Muskulatur teils quer, schräg und

längs in Querschnitten zu sehen ist (s. Vergleich Abbildung 6). Dieser dreidimensionale,

spiralig angeordnete Faserverlauf sorgt für eine kontinuierliche, gleichmäßige Kontraktion

der Harnblasenwand. Lediglich im Bereich des Blasenhalses und des -scheitels lagern sich

die Fasern zu engen Schleifen zusammen und lassen die Muskulatur glatt erscheinen.

Abbildung 9 Spiralig angeordnete glatte Muskulatur der Harnblasenwand (Ziege, Goldner-Färbung,

Vergrößerung x 250) (36).

Die von der Harnblasenwand ableitenden Harnwege werden von der Tunica adventitia

umgeben. Gleichzeitig verbindet sie damit die Harnwege mit dem umliegenden Gewebe.

Dem Verschluss der Harnblase dient der Kreismuskel Musculus sphincter vesicae.

Die Motorik der Harnblase sowie der Gefäßwände werden durch sympathische und

parasympathische Nervenfasern gesteuert. Diese Innervation geht von einem vegetativen

Plexus (verzweigte Nervenfasern) aus. Die Ganglienzellen liegen vorwiegend zwischen

den Muskelfaserschichten (intramurale Ganglien). Zahlreiche sensible Nerven kommen

noch zusätzlich subepithelial und intraepithelial vor.

Nur während der fetalen Entwicklungsphase, aber nicht unter physiologischen

Bedingungen ist eine erhöhte Expression von COX-2 in der Vorläuferharnblase

nachweisbar. Dessen Reaktionsprodukte aktivieren Signalkaskaden für Differenzierung,


13

Proliferation und Angiogenese (34;38). Mechanischer Stress verursacht eine erhöhte

COX-2 Expression in der glatten Muskulatur. Zudem können auch Zigarettenrauch und

chronische Entzündungsprozesse hervorgerufen durch Bakterien, Viren, und Trematoden

(Saugwürmer - Bilharziose oder Schistosomiasis genannt) eine COX-2 Expression in der

Harnblase induzieren und damit das Risiko am Urothelkarzinom zu erkranken erhöhen

(4;39-41).

1.3. Urothelkarzinom

Karzinome der Harnblase liegen bei Männern auf Platz vier und bei Frauen auf Platz sechs

aller Karzinomerkrankungen, während es als Todesursache beim Mann auf Position sechs

und bei Frauen auf Position acht rangiert (2;42). Nach Angaben des Robert-Koch Institut

(RKI) in Berlin erkranken ~ 16000-25000 Menschen jährlich neu in Deutschland (33;43).

Das Urothelkarzinom tritt im höheren Lebensalter auch zunehmend bei Frauen auf. Zu den

Risikofaktoren gehört an erster Stelle der gesteigerte Zigarettenkonsum (44;45), des

Weiteren eine vermehrte Strahlenbelastung (46), sowie die erhöhte Exposition von

Arylaminderivaten (z.B. Anilin) (3). Diese karzinogenen Substanzen werden in der Niere

aus dem Blut gefiltert und gelangen mit dem Urin in die Harnblase, wo sie bis zur

Ausscheidung verweilen und bis dahin das Gewebe schädigen können. Aber nicht nur

kanzerogene Substanzen stehen im Zusammenhang mit der Entstehung von

Urothelkarzinomen, sondern auch chronische Entzündungen (Zystitis), die mit dem

Plattenepithelkarzinom assoziiert sein können, und mechanischer Stress, bei denen es zu

vermehrten COX-2 Expressionen u. a. in der Tunica muscularis mit erhöhten

Prostaglandinspiegeln kommt (34), oder über Jahre anhaltenden tropische

Infektionskrankheiten (Bilharziose) (4). Die beginnende Blasenkarzinogenese wird

begleitet durch Zystitis (Entzündung der Harnblasenschleimhaut) und eine meist

schmerzfreie Hämaturie (Blut im Harn), die sich zu einer Makrohämaturie und eine meist

unilaterale Harnstauung entwickeln kann (spätes Stadium, abhängig von der

Tumorlokalisation). In der weiteren Karzinogenese kommt es zur Pollakisuri (Drang zu

häufigem Wasserlassen ohne vermehrte Ausscheidung) sowie zur Dysurie (schmerzhafter

Harndrang mit Erschwernis des Wasserlassens) (47). Neben wesentlichen diagnostischen


14

Verfahren sollte ergänzend eine Ultraschalluntersuchung und CT-Untersuchung sowie eine

Lungenröntgenaufnahme und Knochenszintigraphie erfolgen, um Fernmetastasen

ausschließen zu können bzw. entsprechende Therapiemaßnahmen einzuleiten.

Wie aus Abbildung 10 hervorgeht handelt es sich beim Blasenkarzinom in 90 % der

erkrankten Betroffenen um das Urothelkarzinom (TCC, Transitional Cell Carcinoma).

Daneben finden sich Plattenepithelkarzinome (SCC, Squamous Cell Carcinoma),

Adenokarzinome, kleinzellige und undifferenzierte Karzinome.

Abbildung 10 Einteilung des Urothelkarzinoms. Der häufigste Gewebetyp beim Blasentumor ist das

Urothelkarzinom (90 %). Seltener kommen Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinom oder Sarkome vor.

Im Gegensatz zur FAP (Familial adenomatous polyposis) ließ sich beim Urothelkarzinom

bislang noch keine familiäre Disposition feststellen. Beim Urothelkarzinom liegt der

Ursprung des Primärtumors im Übergangsepithel. Von dort erfolgt eine Invasion primär in

die Blase (Blasenkarzinom) oder in das Nierenbecken (Urothelkarzinome des

Nierenbeckens) sowie Harnröhre und Harnleiter (47). Die Ursache für die Entstehung des

Blasenkarzinoms liegt auf molekularer Ebene. Eine somatische Inaktivierung des zweiten

Allels führt zum Verlust des heterozygoten Charakters (LOH = loss of heterozygosity),

90 % Urothelkarzinom (TCC) 3-5 % Plattenepithelkarzinome (SCC) 0,2-2 % Adenokarzinome < 1 % Sarkomas, Metastasen primärer

Karzinome


15

dass den onkogenen Effekt potenziert und eine nicht regulierte Zellteilung zur Folge hat.

Die beim Blasenkarzinom beteiligten Chromosomen sind 11p und 13q (48). Das beteiligte

Chromosom 13q ist unter anderem auch bei der Karzinogenese des Lungen- und

Brustkarzinoms, beim Retinoblastom, Osteosarkom und hepatozellulären Karzinom

involviert (49-54).

Das zu 90 % auftretende Urothelkarzinom (TCC) wird klinisch zwischen dem papillären

Urothelkarzinom und dem invasiven Urothelkarzinom unterschieden (s. Abbildung 11).

Beim selten auftretenden invasiven Urothelkarzinom (20 %) entwickelt sich das normale

Epithel als Folge einer Mutation im Tumorsuppressorgen p53 bzw. Proteinprodukt oder

verminderten Retinoblastomaktivität in eine Dysplasie bzw. Carcinoma in situ. Die Hälfte

der Betroffenen stirbt innerhalb von zwei Jahren aufgrund von Fernmetastasen (55). Das

sehr häufig auftretende papilläre Urothelkarzinom zeigt bei sehr frühzeitiger Diagnose eine

hohe 5-Jahres-Überlebensrate (11;56). Als Folge einer molekularen Aberration von H-Ras

(harvey-Ras), FGFR3 (Fibroblast growth factor receptor 3) und/oder Her-2 kommt es zu

einer Hyperplasie des Übergangszellepithels, welches sich zu einem gut differenzierten,

nicht-invasiven Urothelkarzinom entwickelt. Einige derzeitige Behandlungsmethoden

stellen die radikale Zystektomie (Harnblasenentfernung), BCG (Bacillus Calmette Guérin,

bezeichnet ein abgeschwächtes, nicht mehr krankheitserregendes Rindertuberkelbakterium,

welches das natürliche Abwehrsystem des Körpers gegen den Blasenkrebs direkt in der

Blase anregt und aktiviert) oder TUR (Transurethrale Resektion) dar, wobei in 70 % der

Fälle nach TUR das Karzinom wiederkehrt und in eine Dysplasie übergeht. Da die

Dysplasie durch weitere Aberrationen in ein invasives Karzinom übergehen kann und

schließlich metastasiert, sinkt dramatisch die 5-Jahres-Überlebensrate der Betroffenen bei

Diagnose des Stadiums (1;6;12;55;57-62).


16

Abbildung 11 Das zu 90 % auftretende Urothelkarzinom (TCC) wird klinisch zwischen dem papillären

Urothelkarzinom und dem invasiven Urothelkarzinom unterschieden (Erklärung siehe Text; Abbildungen zum

Teil übernommen aus (59)).

normales

Urothelium

invasives TCC

gut differenziertes, nicht-

invasives, papilläres TCC

hochgradige Dysplasie

nach TUR (70 %)

Papilläres Urothelkarzinom

(80 %)

Invasives Urothelkarzinom

(20 %)

Dysplasie/CIS

p53mut

RB ↓

Hyperplasie

H-rasmut

FGFR3mut

(HER-2 ↑ )

50 %Metastasierung

15 %

p53mut

RB ↓


17

Das maligne Wachstum der Blasenkarzinome ist sehr unterschiedlich, so dass eine

Klassifizierung für weitere Behandlungsmaßnahmen von entscheidender Voraussetzung

ist. Das wichtigste Kriterium dabei ist, wie weit sich der Tumor ausgebreitet hat. Dabei

lässt sich die Tumorausbreitung in verschiedene Stadien einteilen. Maßgebend für diese

Einteilung sind drei Gesichtspunkte TNM:

T kennzeichnet die Größe eines Tumors,

N kennzeichnet die Zahl und Lokalisation der befallenen Lymphknoten,

M kennzeichnet das Auftreten und die Lokalisation von Metastasen.

Es handelt sich hierbei um die sogenannte TNM-Klassifikation (Tabelle 1), die

prognostische Aussagen erlaubt und auch häufig die weitere Therapie bestimmt.

Ein wiederkehrendes Ereignis im Vergleich mit anderen Karzinomen ist, dass es auch beim

Blasenkarzinom in den unterschiedlichen Tumorgraden und -stadien zu einer erhöhten

Expression von Cyclooxygenase-2 mit einem gleichzeitigen Anstieg an Prostaglandinen

kommt (63-66).


18

Tabelle 1 Klassifikation des Tumors nach der TNM-Nomenklatur (33).

T Primärtumor

Tx Primärtumor kann nicht beurteilt werden

T0 kein Anhalt für Primärtumor

Ta nicht invasives papilläres Karzinom

Tis Carcinoma in situ

T1 Tumor infiltriert subepitheliales Bindegewebe

T2 Tumor infiltriert Muskulatur

T3 Tumor infiltriert Fettgewebe

T4

Tumor infiltriert benachbarte Organe (z.B. Prostata, Enddarm, Uterus,

Vagina)

N benachbarte (regionäre) Lymphknoten

Nx benachbarte Lymphknoten können nicht beurteilt werden

N0 keine benachbarten Lymphknotenmetastasen

N1

Metastase in einzelnem (solitärem) Lymphknoten, 2 cm oder weniger in

größter Ausdehnung

N2

Metastase in einzelnem (solitärem) Lymphknoten, mehr als 2 cm, aber

weniger als 5 cm in größter Ausdehnung oder in mehreren (multiplen)

Lymphknoten, jedoch keine mehr als 5 cm

N3 Metastasen in Lymphknoten, mehr als 5 cm in größter Ausdehnung

M Fernmetastasen

Mx keine Beurteilung von Fernmetastasen

M0 keine Fernmetastasen

M1 Fernmetastasen


19

1.4. Arachidonsäurestoffwechsel

In den 30-iger Jahren wurde eine Gruppe von Hormonen im menschlichen Sperma von Ulf

von Euler und M. W. Goldblatt entdeckt, die eine uteruskontrahierende und

blutdrucksenkende Wirkung besitzen. Aufgrund der Annahme ihrer Herkunft aus der

Prostatadrüse wurden sie als Prostaglandine (PG) bezeichnet. Mitte der 40-iger Jahre

wurde herausgefunden, dass diese Prostaglandine in der Samenblase synthetisiert werden.

Die ersten Strukturaufklärungen dieser Stoffklasse erfolgte 1958-1964 durch Bergström

(67). Chemisch betrachtet handelt es sich bei den Prostaglandinen um Derivate der

Prostansäure, so dass sie auch unter dem Begriff Prostanoide bekannt sind. Somit handelt

es sich bei PGA um ,-ungesättigte Ketone, bei PGE um -Hydroxyketone und PGF um

1,3-Diole. Charakteristisches Merkmal der Prostaglandine ist der Cyclopentanring. Bei der

Bezeichnung geben die Indizes die Anzahl der Doppelbindungen im Molekül wieder. Die

Stellung der Hydroxygruppe am C9-Atom im Cyclopentanring wird durch den Index

bzw. beschrieben. Befindet sich die Hydroxygruppe auf derselben Seite wie der Ring, so

handelt es sich um das -Derivat, während es sich bei gegenüberliegender Anordnung um

das -Derivat handelt.

Bis auf die roten Blutkörperchen produzieren alle Säugerzellen Prostaglandine, sowie die

mit ihnen verwandten Verbindungen Leukotriene, Prostacyclin und Thromboxane. Nur die

Blutplättchen bilden ausschließlich die Thromboxane. In ihrer Gesamtheit werden sie als

Eicosanoide bezeichnet, da es sich um C20-Verbindungen handelt (eicos: griechisch,

zwanzig) (68). Eicosanoide besitzen hormonähnliche Wirkungen, da viele ihrer Wirkungen

intrazellulär über cAMP (Cyclic adenosine monophosphate) übertragen werden. Jedoch

sind Eicosanoide chemisch und biologisch instabiler als Hormone, so dass es sich um

lokale Mediatoren handelt.

Die wichtigste Vorstufe der Prostaglandine bildet die Arachidonsäure

(5,8,11,14-Eicosatetraensäure). Es handelt sich um eine ω-6-Fettsäure. Deren Freisetzung

erfolgt in erster Linie durch die katalytische Aktivität der Phospholipase A2, kann aber

auch über die Phospholipase C und anschließender Diacylglycerin-Kinase- bzw.

Diacylglycerin-Lipase-Aktivität erfolgen. Nur Prostaglandine mit dem Index 2 (sogenannte

Typ-2 PG) werden aus der Arachidonsäure synthetisiert, während sich die Typ-1 PG von

der 8,11,14-Eicosatriensäure und die Typ-3 PG von der 5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure

(EPA) ableiten. Beim Menschen kommen überwiegend Typ-2 Prostaglandine vor.


20

Die freigesetzte Arachidonsäure kann in drei Stoffwechselwegen münden (Abbildung 12),

dem sogenannten cyclischen Weg (Cyclooxygenase-Weg), der zur Synthese der

Prostanoide führt, der lineare Weg (Lipoxygenase-Weg), der die Synthese der HPETE

(Hydroperoxyeicosatetraenoic acids) und Leukotriene beinhaltet, sowie die Umsetzung

von Arachidonsäure durch Cytochrom P450-Enzyme zu EETs (Epoxyeicosatrienoic acids)

(17;69).

Der cyclische Weg beginnt mit der Umsetzung der Arachidonsäure zu Prostaglandin H2

(PGH2) durch die Prostaglandinendoperoxid-Synthase (EC 1.14.99.1 PGH, PGHS, COX)

(70). Dieses Enzym besitzt zwei katalytische Aktivitäten. Die Cyclooxygenase-Aktivität

katalysiert die Addition von zwei Molekülen Sauerstoff an die Arachidonsäure. Dabei

entsteht das instabile Zwischenprodukt PGG2, welches sofort durch die Hydroperoxidase-

Aktivität in einer glutathionabhängigen Reaktion in PGH2 überführt wird, in dem die

Hydroperoxidgruppe am C15 in eine Hydroxygruppe reduziert wird (Abbildung 13) (71).

Dieser erste Reaktionsschritt stellt den „committed step“ der Prostaglandinbiosynthese dar

(72), der durch die beiden Isoenzyme Cyclooxygenase-(COX-)1 und -2 gleichermaßen

katalysiert werden kann.

Das PGH2 stellt die Vorstufe sowohl für weitere Prostaglandine als auch für Prostacyclin

und Thromboxan dar (s. Abbildung 14). Diese Umsetzungsreaktionen werden durch

gewebsabhängige Synthasen katalysiert. Die biologisch aktiven Prostanoide können

intracin, autocrin, endocrin oder paracrin wirken und eine Reihe von Signalwegen

aktivieren.


21

Abbildung 12 Umsetzung von Arachidonsäure. Durch die katalytische Aktivität der PLA2 (Phospholipase A2)

wird Arachidonsäure aus der Membran freigesetzt und kann in drei Stoffwechselwegen münden, dem

Lipoxygenase-Weg, dem Cyclooxygenase-Weg oder dem Cytochrom P450-Weg.

Prostaglandine

Thromboxan

Prostacyclin

Leukotriene

Hydroxyeicosa-

tetraensäuren

Epoxyeicosa-

triensäuren

P450 Lipoxygenasen

Cyclooxygenasen

Arachidonsäure


22

Abbildung 13

Synthese von

PGH2 aus

Arachidonsäure

(AA) durch die

Prostaglandin-

endoperoxid-

Synthase (COX-1

und COX-2);

COX-1/-2 besitzen

eine Cyclo-

oxygenase- sowie

Hydroperoxidase-

Aktivität und sind

als Homodimere

katalytisch aktiv;

PGH2 ist die

Vorstufe weiterer

Prostaglandine,

sowie Prostacyclin

und Thromboxan;

PGG2 – instabiles

Zwischenprodukt;

GSH – Glutathion

(reduziert), GSSG

– Glutathion

(oxidiert) (68).

2 GSH

GSSG

Cyclooxygenase-Aktivität

Hydroperoxidase-Aktivität

AA

PGG2

PGH2


23

Abbildung 14 PGH2 dient als Vorstufe weiterer Prostaglandine sowie Prostacyclin und Thromboxan. Die

Umsetzung erfolgt durch gewebsspezifische Prostaglandin Synthasen in ihre biologisch aktiven Formen. Durch

nicht- bzw. enzymatische Hydrolyse erfolgt die Inaktivierung der Prostanoide; PG = Prostaglandin,

Tx = Thromboxan. (67;68;73;74)

O

O COOH

OH

OH

O

COOH

OH

OH

OH

COOH

OH

O

OH

COOH

OH

OH

O

OH

COOH

OH

OH

OH

COOH

O

O

COOH

OH

O

O

COOH

OH

OH

OH

OH

O

COOH

O

PGE2

PGF2

PGD2

PGH2

PGI2 (instabil)

6-oxo PGF1

TxA2 (instabil)

TxB2

nicht-enzymatischeHydrolyse

nicht-enzymatischeHydrolyse

Thromboxan-SynthaseProstacyclin-Synthase

1. Prostaglandin-15-Dehydrogenase2. Prostaglandin-13-Reduktase

inaktiv

Synthasen


24

1.4.1. Prostaglandinendoperoxid-Synthase (COX)

Prostaglandinendoperoxid-Synthase (Cyclooxygenasen, COX) katalysieren die

Oxygenierung von C20-Fettsäuren durch zwei Moleküle Sauerstoff. Der Name „cyclo“

bezieht sich auf den Fünfring im Reaktionsprodukt Prostaglandin H2, der durch die

Verknüpfung der C-Atome 8 und 12 entsteht (s. Abbildung 13).

Drei Isoformen der Cyclooxygenasen sind unter dem Namen COX-1, COX-2 und COX-3

bekannt. Die beiden Membran-gebundenen Hämglycoproteine COX-1 und COX-2 zeigen

eine 60 %-ige Sequenzhomologie auf, wie aus Abbildung 15 hervorgeht, und katalysieren

in einer Zwei-Stufen-Reaktion die Umsetzung von Arachidonsäure zu PGH2 mit ähnlicher

Kinetik, obwohl sie unterschiedliche Lipid-Reservoire nutzen. COX-1 synthetisiert

Prostaglandine nur am endoplasmatischen Retikulum (ER), während die PG-Synthese von

COX-2 sowohl am ER als auch an der nukleären Hülle (neclear envelope) erfolgt (75).

Während COX-1 ein stabiles Protein ist, wird COX-2 schnell durch Ubiquitinierung im

26S Proteasom abgebaut. Für die Degradierung essentiell ist die Insertion einer

19-Aminosäurekassette mit zusätzlicher Glykolysierungsstelle in der Nähe vom

C-Terminus (Abbildung 15). Für den proteosomalen Abbau wird COX-2 vom ER ins

Cytosol transportiert (76).

COX-1 und COX-2 sind als Homodimere mit Kopf-Schwanz-Polarisierung katalytisch

aktiv. Von der COX-3 ist noch sehr wenig bekannt (77).

1.4.1.1. Cyclooxygenase-1

Vor 30 Jahren wurde COX-1 isoliert und 12 Jahre später kloniert (78). Das Gen der

Isoform (Ptges1) befindet sich auf dem Chromosom 9 (s. Tabelle 2) (79;80). Der

Promotorbereich weißt mehrere Startpunkte für die Transkription ohne das Vorhandensein

einer TATA-Box auf (81). COX-1 besitzt ein Molekulargewicht von 70 kDa und wird

konstitutiv in allen Geweben exprimiert. Seine katalytische Aktivität bleibt unter

physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen weitgehend konstant (17). Durch

COX-1 synthetisierte Prostaglandine sind in vielen physiologischen Prozessen

eingebunden, wie z. B. bei der Regulation des Blutflusses (82), der Aggregation von

Blutplättchen (83) sowie dem Schutz der Magenschleimhaut vor Selbstverdauung (84).


25

Die Cyclooxygenase-(Cox-) und Hydroperoxidase-Aktivität sind in räumlicher Nähe

voneinander getrennt. Die Cox-aktive Seite ergibt einen langen hydrophoben Kanal mit

Tyrosin 385 und Serin 530 am Scheitel. Nicht-Steroidale Anti-Rheumatika (NSARs), wie

z. B. Ibuprofen und Aspirin blockieren die Cox-Aktivität von COX-1 durch Ausbildung

von Wasserstoffbrückenbindungen am Arginin 120, woraufhin der Zugang von

Arachidonsäure in das katalytische Zentrum verhindert wird, wie in Abbildung 15

schematisch dargestellt. Aspririn acetyliert zusätzlich irreversibel Serine 530. Die

Hydroperoxidase-Aktivität bleibt davon unberührt.


Erst 1991 wurde eine weitere Form der Cyclooxygenasen, aufgrund der anti-

inflammatorischen Wirkung der NSARs, entdeckt, COX-2 (77;81;85-87). Das Ptges2 Gen

ist auf Chromosom 1 lokalisiert (s. Tabelle 2). Die Unterschiede zwischen COX-1 und

COX-2 sind zum einen, dass das Intron 1 von COX-1 im COX-2 Gen fehlt und zum

anderen sind die Introns im COX-2 Gen wesentlich kürzer. Das längste Exon im COX-2

Gen bildet der 3´-untranslatierte Bereich (3´-UTR). Die 5´-flankierende Promotorregion

von COX-2 weißt zahlreiche Konsensus cis-Elemente auf, die eine komplexe Regulation

der Transkription unabhängig voneinander oder synergistisch ermöglichen. Zu diesen

gehören eine TATA-Box, ein NF-IL6 (nuclear factor interleukin-6) sowie ein Cre Motiv,

eine E-Box, des Weiteren zwei NFB (nuclear factor kappa b), zwei AP2 und drei Sp1

Bindungsstellen (81). Die COX-2 Gene besitzen ähnliche Sequenzstrukturen bei Maus,

Ratte, Kuh und Pferd. COX ist ein entfernt verwandtes Mitglied der Peroxidasefamilie und

die Genduplikation erfolgte vor der Verzweigung zwischen den Vögeln und Säugetieren.

Anders als COX-1 wird COX-2 in den meisten Geweben nicht exprimiert, sondern wird

durch pro-inflammatorische Zytokine (z. B. bakterielle Lipopolysaccharide LPS),

Hormone (Östrogen), Mitogene und Tumorpromotoren (TPA, Tetradecanoyl-

Phorbolacetat), Wachstumsfaktoren, Onkogene oder durch mechanischen Stress induziert

(34;88;89). Des Weiteren üben die COX-2 abgeleiteten Prostanoide sowohl physiologische

Funktionen, z. B. bei der Ovulation und Eiimplementation, als auch pathophysiologische

Funktionen, z. B. beim Fieber, bei Entzündungsprozessen und insbesondere bei der

Karzinomentstehung bzw. beim -wachstum, aus (90). Aufgrund der raschen Aktivierung


26

bei Entzündungsprozessen wird COX-2 auch als „inflammatorisches Notfallenzym“

bezeichnet. Im Gegensatz zur COX-1 kann die COX-2 Transkription durch

Glucocorticoide und anti-inflammatorische Zytokine gehemmt werden (80).

Aufgrund der hohen Sequenzhomologie zu COX-1 kann die katalytische Aktivität von

COX-2 ebenfalls durch NSARs blockiert werden. Untersuchungen zeigten, dass die anti-

inflammatorischen, analgetischen und antipyretischen Effekte der NSARs durch

Inhibierung der COX-2 zustande kommen, während die antithrombotischen und

bekannten, nachteiligen Effekte auf die Inhibierung der COX-1 zurückzuführen sind. Die

Hemmung der katalytischen Aktivität durch NSARs führt zum Verlust der Synthese von

PGH2 beider Enzyme. Da die Hydroperoxidase-Aktivität nicht inhibiert wird erfolgt nach

Gabe von Aspirin die Umsetzung von Arachidonsäure zu 12-R oder

15-R-Hydroxyeicosatetraensäure (12-/15-R-HETE) durch COX-2, während COX-1

vollständig inaktiviert ist (86;91;92). Jedoch ist der Kanal zum katalytischen Zentrum von

COX-2 wesentlich größer (ca. 17 %), da an Position 523 die Aminosäure Isoleucin durch

das kleinere Valin ausgetauscht ist (s. Abbildung 15). Dies bildet einen sterischen

Freiraum, der es ermöglicht, spezifische COX-2 Inhibitoren (COXibs, z. B. Celecoxib,

Rofecoxib) zu entwickeln und damit die Nebenwirkungen der NSARs zu reduzieren.

Dieser unterschiedliche Wirkmechanismus ist in Abbildung 17 dargestellt.

Abbildung 15 Schematische Darstellung der humanen COX-1 und COX-2 Enzyme; N-terminales Signalpeptid

(dunkelgrün), Transmembrandomäne (hellgrün), 18-Aminosäure Insertionskassette am C-terminus (rot),

N-Glykolysierungsstellen (schwarze Dreiecke), Aspirinacetylierungsstelle am Serin (schwarzer Pfeil), aktives

Zentrum bestehend aus: axiales (His-295) und distales (His-374) Histidin zur Hämbindung, katalytisch aktiver

Tyrosinrest (Tyr-371) (75).

Katalytische Zentrum

hCOX-1

hCOX-2

Ile

523

Ser

530 599

N-terminus

1

Arg

106 277 292

His

295

Tyr

371

His

374

N-terminus

1

Arg

106 277 292

His

295

Tyr

371

His

374

Ser

516

Val

523 604


27

Abbildung 16 Kristallstruktur der Kette A der Cyclooxygenase-2 mit gebundenem Prostaglandin H2 (93).

Der selektive COX-2 Inhibitor Celecoxib (CX, Celebrex®) wurde von der FDA (US Food

and Drug Administration) für die Behandlung von rheumatischer Arthritis, Osteoarthritis

sowie zur Behandlung der FAP freigegeben (94). Die Verträglichkeit wird in der CLASS-

Studie (Celecoxib Long-term Arthritis Safety Study) untersucht (95;96). Celecoxib kann

durch Cytochrom P450 2C9 und 3A4 oxidiert werden und interagiert mit Inhibitoren von

diesen Enzymen.

Die Peroxidase-Aktivität der Cyclooxygenasen beinhaltet auch unter physiologischen

Bedingungen die Bildung sauerstoffaktiver Spezien (ROS). Bei einer Dysregulation der

Enzyme, sei es durch Inhibierung durch NSARs oder durch COX-2 Überexpression im

Karzinom, verstärkt sich die Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezien in der Zelle und

schädigen diese durch Erhöhung des oxidativen Stresses bzw. begünstigen eine Entartung

der Zelle, wenn die Detoxifizierung versagt (9;97-99).


28

Abbildung 17 Schematische Darstellung der Strukturunterschiede zwischen den Substratbindungstaschen von

COX-1 und COX-2, das die Nutzung eines selektiven Inhibitors ermöglicht. Ein unspezifischer Inhibitor hat

Zugang zu aktiven Zentrum beider Isoenzyme (A). Die sterische Behinderung in der Substratbindungstasche von

COX-1 verhindert den Zugang eines spezifischen COX-2 Inhibitors (COXib) (100).

Aktives

Zentrum

Aktives

Zentrum

Aktives

Zentrum

Aktives

Zentrum

Unspezifischer Inhibitor (NSAID)

Spezifischer Inhibitor (COXib)

A

B


29


Chandrasekharan et al. zeigte vor einiger Zeit die Existenz einer weiteren Cyclooxygenase,

COX-3, die spezifisch durch Acetaminophen inhibiert werden kann und somit die

unbekannten antipyretischen und analgetischen Wirkmechanismen erklärt werden könnten

(101). Es handelt sich um eine Splicevariante der COX-1, die das Intron-1 in der mRNA

behält und damit eine Insertion von 30-34 Aminosäuren aufweist. Eine weitere

Splicevariante stellt die PCOX-1a dar, die zusätzlich zur Insertion des Intron 1 eine

Deletion der Exons 5-8 in der mRNA aufweist. Die COX-3 und PCOX-1 Transkriptionen

erfolgen bei Kaninchen und Menschen im Cortex cerebrale. Die Existenz der katalytisch,

aktiven Isoformen wurde durch Dinchuk et al. in Frage gestellt (77;101;102).

In Tabelle 2 sind die Eigenschaften der Cyclooxygenasen zusammengefasst.


30

Tabelle 2 Eigenschaften der humanen Cyclooxygenasen COX-1, COX-2 und COX-3 (77;81;86;103-105)

COX-1 COX-2 COX-3

Expression konstitutiv,

lokalisiert zu Thrombo-

zyten, Endothelzellen,

Magen, Niere, glatter

Muskulatur

konstitutiv in Gehirn, Niere,

Megakaryozyten, neu

gebildete Thrombozyten;

induzierbar („inflammation

response gene“), Gehirn,

Follikels, Monozyten und

Synoviozyten während der

Entzündung vor der

Ovulation, Makrophagen,

maligne Zellen

Cortex

cerebrale

Lokalisation Chromosom 9 Chromosom 1

Gengröße 22 kb mit 11 Exons 8 kb mit 10 Exons

mRNA-

Transkript

2,7 kb

4,5 kb mit multiplen Shaw-

Kamen Sequenzen

5,2 kb

5´-Region keine TATA Box, GC-reich,

SP1

NFB, NF-IL6, CRE,

E-Box, TATA-Box

3´-UTR 0,7 kb 2 kb

Molekulare

Eigenschaften

576 Aminosäuren

68-72 kDa

604 Aminosäuren

68-72/74 kDa (abhängig von

Glycolysierungen)

Kompartiment ER, nukleäre Hülle ER, nukleäre Hülle

Funktion Schutz der

Magenschleimhaut, Blut-

plättchenaggregation, renaler

Blutfluß, vaskuläre

Homeostase

renale Entwicklung,

Reninsekretion,

Knochenmetabolismus,

Wundheilung, Entzündung,

Schmerz, Fieber,

Tumorpromotion

zentraler

Schmerz

und

Fieber


31

1.4.2. Prostaglandine und ihre pro- und anti-inflammatorischen Effekte

Prostaglandine (PG) sind Lipidderivate der Arachidonsäure. Cyclooxygenasen katalysieren

die Oxygenierung in einer Zwei-Stufen-Reaktion der Arachidonsäure zum PGH2, welches

als Substrat gewebsspezifischer Prostaglandin Synthasen dient (106). Diese setzen PGH2

in prinzipiell fünf biologisch aktive Prostaglandine, PGE2, PGF2, PGD2, PGI2

(Prostacyclin) und TXA2 (Thromboxan) um. Die gebildete PG-Menge einer Zelle ist

abhängig von der Expression der individuellen PG-Synthasen (TXAS, PGDS, PGES,

PGF-S und PGI-S), die entsprechend ihrer Reaktionsprodukte bezeichnet werden. Von der

glutathionabhängigen PGE-Synthase werden die drei Isoformen cytoplasmatische

(c)PGES, membran-assoziierte (m)PGES-1 sowie mPGES-2 unterschieden (107-109).

Ähnlich wie COX-2 ist auch die mPGES-1 Expression induzierbar, denn mPGES-1 wird

sowohl mit COX-2 als auch mit COX-1 koexprimiert (110;111). Während cPGES mit

COX-1 assoziiert ist, bleibt die Kopplung der mPGES-2 bislang noch unklar (112).

Die ubiquitär vorkommenden Prostaglandine üben zahlreiche physiologische Effekte z. B.

im kardiovaskulären, gastrointestinalen, urogenitalen, respiratorischen, endokrinen,

immunologischen sowie zentralen Nervensystem (ZNS) aus. Darüber hinaus sind PGs in

zahlreichen Krankheiten involviert, wie Entzündungen, kardiovaskulären Erkrankungen,

Bluthochdruck und vor allem Krebs. Prostaglandine können autokrin, parakrin, endokrin

oder intrakrin ihre Wirkung ausüben. Wie wichtig die physiologische Funktion der PG ist,

zeigt die klinische Anwendung der unspezifischen Cyclooxygenase-Inhibitoren NSARs bei

der Behandlung verschiedener Beschwerden. Durch NSARs werden die COX Isoenzyme

gleichermaßen inhibiert, so dass deren längere Einnahme zu Nebenwirkungen wie

gastrointestinale Blutungen führen (113).

Die physiologischen Effekte der biologisch aktiven Prostaglandine erfolgen über

G-Protein-gekoppelte Prostanoidrezeptoren, eine Familie von Rhodopsin ähnlichen

7-Transmembranrezeptoren (GPCRs). Die Prostanoidrezeptoren, die eine 20-30 %-ige

Sequenzhomologie untereinander aufweisen, bestehen aus acht Mitgliedern (TP, DP,

EP1-4, IP und FP), die entsprechend ihrer Prostanoidliganden klassifiziert werden

(s. Abbildung 18) (114;115). Hirai et al. beschreibt die Existenz eines neunten Mitglieds,

den CRTH2 Rezeptor, der auf Th2-Zellen exprimiert wird und PGD2 bindet. Jedoch weist

dieser mehr Ähnlichkeit zu Chemorezeptoren auf als zu den Prostanoidrezeptoren

(116;117). Die Kopplung der Prostanoidrezeptoren zu heterotrimeren G-Protein


32

vermittelten Signalwegen und den damit verbundenen Prostanoid vermittelten, involvierten

Signalkaskaden sind sehr komplex, wie es

Tabelle 3 zusammenfassend zeigt.

Abbildung 18 Prostaglandin H2 bildet die Vorstufe der biologisch aktiven Prostanoide, die über spezifische

G-Protein-gekoppelte 7-Transmembranrezeptoren autokrin, parakrin, endokrin oder intrakrin z. B. über PPAR

(Peroxisomal proliferativ activated receptor ) wirken können.

O

O COOH

OH

O

COOH

OH

O

O

OH

COOH

OHOH

O

COOH

OHOH

O

OH

COOH

OH

OH

COOH

OH

PGH2

TxA2 (instabil) PGE2 PGI2 (instabil)PGF2a

TXAS PGDS cPGESmPGES-1/-2

PGISPGFS

PGD2

DPTP EP1-4 IP FP

biologisch aktive Prostaglandine

spezifische G-Protein-gekoppelte 7-Transmembranrezeptoren

Prostaglandin Synthasen

PPAR

15-d-PGJ2


33

Tabelle 3 Signaltransduktion von Prostanoidrezeptoren.

PG-

Klasse

Typ Isoform Subtyp G-Protein 2nd

Messenger

TxA2 TP TP TP Gq, GS, Gh,

G12

↑ IP3/DAG/Ca2+

, ↑ cAMP

TP Gi, G12 ↓ cAMP

PGD2 DP DP GS ↑ cAMP, Ca2+

CRTH2 Gi ↓ cAMP, ↑ Ca2+

, PLC, PI3K,

MAPK

PGE2 EP EP1 Unbekannt ↑ Ca2+

, IP3

EP2 GS ↑ cAMP, -catenin,

EGFR Transaktivierung

EP3 EP3A Gi ↓ cAMP

EP3B GS ↑ cAMP

EP3C GS ↑ cAMP

EP3D Gq, GS, Gi ↑ IP3/DAG, ↑ cAMP, ↓ cAMP

EP4 Gs ↑ cAMP, PI3K, Erk-1/-2

PGI2 IP Gq, GS, Gi ↑ IP3/DAG, ↑ cAMP, ↓ cAMP

PGF2 FP Gq ↑ IP3/DAG, Rho, -catenin, EGFR

Transaktivierung

Zusammenfassung representativer Signalwege der jeweiligen Rezeptoren aus unterschiedlichen Organismen

(TP-Isoformen vom Menschen, EP-Isoformen vom Rind, übrigen von der Maus). ↑ erhöht; ↓ erniedrigt; IP3

Inositoltrisphosphat; DAG Diacylglycerin; PLC Phospholipas e C; EGFR epidermal growth factor receptor;

MAPK Mitogen-activated protein kinase (74;84;90).

So ist es nicht verwunderlich, dass aufgrund der strukturellen Gemeinsamkeiten,

Prostaglandine mehr als einen Prostaglandinrezeptor aktivieren können (90).

Pharmakologische und gentische Funktionsanalysen der PG-Rezeptoren zeigen ein immer

komplexeres Bild, in welchem die Prostaglandine sowohl Entzündungen unterstützen als


34

auch unterdrücken. Dies zeigt die vielfältigen Funktionen der Prostaglandine, von denen

einige in der Tabelle 4 zusammengefasst dargestellt sind.

Tabelle 4 Pathophysiologische und physiologische Effekte der Prostaglandine.

PG-

Klasse

patho- & physiologische Effekte

TXA2 ↑ Thrombozytenaggregation, Vasokonstriktion, Bronchokonstriktion, T-Zell

Proliferation, lokale cytotoxische T-Zell Funktion, Eliminierung von selbst-

reaktiven T-Zellen, Cytokinproduktion bei mononukleären Milzzellen

↓ dendritische Zell-T-Zell Interaktionen

PGD2 ↑ Bronchokonstriktion, Allergien, Anaphylaxie, Aktivierung von Eosinophilen,

Atemwegsentzündungen, Stimulation von Th2 Zellen

↓ dendritische Zellmigration, Langerhans-Zellenmigration bei kutan,

hypersensitiven Reaktionen, Eosinophile Apoptose

PGE2 ↑ Muskelkontraktion, Darmkontraktion, Thermoregulation (Fieber),

Hydrogencarbonatsekretion, entzündliche Hyperalgesie, LPS-stimulierte,

oxidative Schädigung, IgG-Klassen-Switch bei B-Zellen, antigen-stimulierte

Mastzellendegranulation, Th1-vermittelte Entzündung

↓ Lipolyse, T-Zell Proliferation, dendritischen Zellfunktion in Karzinom-

assoziierten Immundefekten, Cytokinproduktion von Makrophagen

PGI2 ↑ Cytoprotektion, Vasodilatation, Hauttemperatur, mikrovaskuläre Permeabilität,

IL-10 Produktion von T-Zellen

↓ Thrombozytenaggregation

PGF2 ↑ Muskelkontraktion, Uteruskontraktion, Reproduktion, entzündliche

Schmerzausstrahlung

↓ Lymphozyten-Endothelzell-Interaktionen

↑ verstärkt bzw. aktiviert; ↓ erniedrigt bzw. inhibiert; (74;90;113;118-120)


35

1.5. Cyclooxygenase-2 im Zusammenhang mit dem Urothelkarzinom

COX-2 ist in einer Vielzahl von prämalignen und malignen humanen Karzinomen, wie

z.B. beim Ösophagus-, Pankreas-, Brust-, Haut- und Blasenkarzinom überexprimiert

(13;15;82;121-123). Während in Tieren das Urothelkarzinom nur sehr selten auftritt,

handelt es sich beim Menschen um eine immer häufiger auftretende Erkrankung (124).

Diesbezüglich zeigen Studien, dass COX-2 in allen Tumorstadien und -graden nach der

TNM-Klassifizierung mit sehr unterschiedlicher Stärke überexprimiert wird, was eine

starke Heterogenität des Urothelkarzinoms implementiert (125-127). Jedoch korreliert die

COX-2 Expression nicht mit dem Tumorstadium bzw. Grad, jedoch signifikant zu den

histologischen Subtypen. Li et al. konnte jedoch eine signifikante Korrelation zwischen

COX-2 Überexpression und Invasionstiefe des Tumors ausmachen (11;85). Shirahama et

al. zeigte, dass COX-2 zu 100 % in allen untersuchten Plattenepithelkarzinomen (SCC)

überexprimiert wird, während Wülfing et al. und Mohammed et al. zeigen konnten, dass

im Urothelkarzinom (TCC) nur 83 % und im CIS 75 % positiv für eine COX-2 Expression

waren (9;10;126). Darüberhinaus geben Überlebensanalysen keinen Zusammenhang

zwischen einer COX-2 Überexpression und der Gesamtüberlebensrate bzw.

beschwerdefreien Rate von Betroffenen (128). Jedoch konnte in diesem Zusammenhang

gezeigt werden, dass bei Personen, die Chemotherapie erhielten, eine starke COX-2

Expression signifikant mit einer schlechten Prognose korreliert (10). Die absolute

Signifikanz einer COX-2 Expression im Urothelkarzinom ist demnach nicht gegeben.

Shariat et al. und andere Studien beschreiben, dass COX-2 in den meisten Patienten mit

CIS und T1 Blasentumoren überexprimiert wird, so dass die COX-2 Hochregulation als ein

frühes Ereignis in der Karzinogenese angesehen werden kann (56). Einnahmen von

COX-Inhibitoren führen zu einer signifikant reduzierten Häufigkeit des Auftretens von

Blasenkarzinomen (18;129;130). Demzufolge wird davon ausgegangen, dass eine erhöhte

COX-2 Aktivität die Karzinogenese fördern kann (83). Unterstütz wird diese Aussage

durch die Experimente von Tiano et al., die bei COX Knock-out Mäusen eine 75 %-ige

Reduktion an Hautkarzinomen nach TPA-Behandlung feststellten (131).

Die Hauptfunktion der COX-2 ist die Umsetzung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen,

wobei das PGE2 das dominante und aktive Endprodukt darstellt (132). Prostaglandin E2 ist

in vielen physiologischen Prozessen wie z. B. der Zellproliferation, Angiogenese,

Immunantwort und Apoptose involviert (74;84;90;118). Diese Funktion impliziert dem


36

PGE2 ein malignes Potential (133;134). Prostaglandin E2 kann seine biologische Wirkung

über die vier G-Protein-gekoppelten Rezeptoren EP1-4 ausüben, die ihrerseits mit

malignem Potenzial und der Entwicklung von Karzinomzellen assoziiert werden (135-

138). Im Zusammenhang bei der malignen Progression des Urothelkarzinoms stehen

besonders die EP2 und EP4 Rezeptor, für die eine erhöhte Expression nachgewiesen

werden konnte, da sie aufgrund ihrer Kopplung zu GS-Proteinen und der damit

verbundenen Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels, zahlreiche Signalkaskaden

(MAPK, Wnt, Ras, PI3K) induzieren können, die ihrerseits wiederum in Vorgängen der

Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Apoptose involviert sind (16;17;132;133;139).

Abbildung 19 zeigt eine schematische Darstellung der komplexen Signalwege, die EP2

und EP4 Rezeptor induzieren können.

In vielfältigen Prozessen wie Proliferation, Angiogenese und Differenzierung sind Ras

Proteine beteiligt, die über stimulierte EP-Rezeptoren aktiviert werden können (17). Die

Familie der monomeren Ras-G-Proteine besteht aus H-Ras (Harvey-Ras), K-Ras

(Kirsten-Ras) und N-Ras (Neuroblastom-Ras) und können in Karzinomen aktiviert z. B.

durch EGF (Epidermale Wachstumsfaktoren) bzw. mutiert aktiviert durch

Punktmutationen vorliegen (140). Neben diesen drei Vertretern der Ras Familie gibt es

noch M-Ras, R-Ras, Rap1/2 und Ral (141). Ras Proteine können verschiedene

Proteinkinasen, z. B. Erk-1 und -2, MAPK (z. B. p38, c-Jun) sowie PI3K aktivieren. Unter

deren Kontrolle stehen Transkriptionsfaktoren, so dass eine zielgerichtete Transkription

stattfinden kann bzw. Gene abgeschaltet werden können. Beim humanen Urothelkarzinom

liegt vorrangig im Codon 12 des H-Ras Gens eine Punktmutation vor, bei dem das Glycin

durch ein Valin ausgetauscht wurde (22). Die Konsequenz ist ein ständig aktives Ras. Aber

nicht nur der Ras-Status bestimmt die Entwicklung und Progression eines Blasentumors,

sondern molekulare Veränderungen auf Genebene wie z. B. Mutationen im p53 Gen auf

dem chromosomalen Lokus 17p13, ausgelöst z. B. durch reaktive Sauerstoffspezien

(ROS), oder Veränderungen im Proteinexpressionslevel von p21 oder der funktionale

Status eines Proteins im Hinblick auf seinen Phosphorylierungszustand, wie im Falle des

Retinoblastom (6). Diese molekularen Veränderungen haben eine voraussagende und

prognostische Größe im Zusammenhang mit dem klinischen Verlauf betroffener Patienten

gezeigt (6;12;58).

Reaktive Sauerstoffspezies werden durch alle aeroben Organismen gebildet und dienen

unter physiologischen Konzentrationen der normalen Zellfunktion, unter exzessiven


37

Konzentrationen begünstigen sie den sogenannten oxidativen Stress (142). Bei jeder

Sauerstoffabhängigen Reaktion entstehen als Nebenprodukte ROS, wie auch bei der

Cyclooxygenase-Reaktion. Rudolf Virchow erkannte seinerzeit die dramatische Infiltration

inflammatorischer Zellen ins neoplastische Gewebe und stellte damit die Grundlage für

einen Zusammenhang zwischen Krebs und Entzündung her (97). Zum jetzigen Zeitpunkt

ist unumstritten, ob ROS, als Zustand des oxidativen Stresses, nicht nur das Altern

begünstigen, sondern durch ihre zellschädigenden Wirkungen eine Zellentartung

begünstigen. Um eine Entartung der Zelle zu vermeiden erfolgt unter derartigen

Bedingungen die Expression von einer Batterie von Genen, die für den zellulären

Schutzmechanismus essentiell sind (143). Dieser Prozess erfolgt über das „antioxidant

responsive element“ (ARE), welches die Gene einschließt, die für Enzyme der Phase-II

Detoxifizierung und anti-oxidativer Stress Antwort kodieren. Derartige Enzyme sind z. B.

Gluthations S-Transferase, Hemoxygenase, NADPH Quinone Oxidoreduktase oder

Peroxiredoxine (zur Familie der Thioredoxine gehörend) (143;144). Ein wichtiger

Transkriptionsfaktor, der an ARE bindet, ist Nuclear factor, erythroid derived 2, like 2

(Nrf-2). Nrf-2 ist ein Mitglied der Leuzin-Zipper Transkriptionsfaktorfamilie und spielt

eine wichtige Rolle bei der Cytoprotektion während Entzündungsprozessen sowie

elektrophilen sowie oxidativen Stresssituationen und kann die Transkription von Genen

initiieren, die sowohl für die Enzyme der Phase-II Detoxifizierung kodieren als auch für

Enzyme des anti-oxidativen Stress (97;143-146), welches in Abbildung 20 schematisch

dargestellt ist. COX-2 wird als inflammatorisches Notfallenzym bezeichnet, aufgrund

seiner raschen Aktivierung und der Beteiligung von COX-2 abgeleiteten Prostaglandinen

bei Entzündungsprozessen. Insbesondere bei aktivierten Makrophagen im

Entzündungsprozess konnten hohe Nrf-2 Level detektiert werden (147). Itoh et al. zeigten,

dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nrf-2 durch

15-deoxy-Δ12,14

-Prostaglandin J2 (15-deoxy-PGJ2) vermittelt werden kann und dem

15-deoxy-PGJ2 daher eine cytoprotektive Wirkung impliziert wird (143). Auch andere

Derivate des PGD2, die sogenannten Cyclopentenone begünstigen den „physiologischen“

intrazellulären Stress, gekennzeichnet durch ROS-Bildung, Lipidperoxidation und

Redoxveränderungen und unterstreichen die biologischen Effekte hinsichtlich ihrer

anti-proliferativen und anti-tumorgenen Wirkung (148;149). Jedoch bei exzessiver

ROS-Bildung scheint die cytoprotektive Wirkung verloren zu gehen und sich der Effekt

umzudrehen (150). Derartige Effekt konnten auch bei Hypoxie beobachtet werden (151).


38

Diese Daten unterstreichen auch beim Harnblasentumor eine Beteiligung der COX-2

während der Karzinogenese und bestärken die Analyse des Proteoms, um ein COX-2

abhängiges Proteinprofil während der Karzinomentstehung zu erstellen, so dass eine

zielgerichtetere Wirkstoffsynthese für die Tumortherapie erfolgen kann, damit sich der

klinische Verlauf betroffener Patienten verbessert.

Abbildung 19 Prostaglandin EP2 und EP4 Rezeptoren abhängige Signalwege fördern Proliferation, Überleben,

Angiogenese und Migration nach PGE2-Aktivierung. EP2 und EP4 Rezeptoren aktivieren AC (Adenylat-Cyclase)

durch Bindung des Gs Proteins (stimulatory guanine nucleotide binding protein). Dies führt zur Bildung von

cAMP, welches PKA (Proteinkinase A) aktiviert. Alternativ kann cAMP durch Bindung an den

Transkriptionsfaktor CREB (cAMP response element binding protein) die Transkription von CRE-regulierten

Genen initiieren, wie z.B. dem COX-Gen, das einen Anstieg der Expression von COX-2 und folglich einen

erhöhten PGE2-Level, zur Folge hat. Parallel kann die aktivierte PKA durch Stabilisierung von -catenin (Wnt-

Signalweg) die Transkription Tcf-(T-cell factor-)regulierter Gene aktivieren. EP4 Rezeptor besitzt zusätzlich

PI3K abhängige Akt-Kinase-Effekte, die einerseits zur Stabilisierung von -catenin führt, durch Aktivierung von

PPAR die Apoptose hemmt und andererseits die MAPK Erk-1/-2 aktiviert. Eine Aktivierung der Erk-1/-2 kann

alternativ durch EGFR (z. B. Her-2) via Ras Aktivierung erfolgen und ändert den Expressionszustand von PGES

(PGE2-Synthase). Des Weiteren fördert die EGFR Stimulation die Migration von Zellen über FAK Aktivierung.

Die Her-2 Stimulation induziert zudem die COX-2 Expression über den Ras/MAPK/AP1-Signalweg. Umgekehrt

kann COX-2 die Her-2 Expression über sein Hauptprodukt PGE2, entweder direkt bzw. über EP4

Rezeptor-Her-2-Transaktivierung oder über cAMP/CREB, stimulieren. Der erhöhte PGE2-Spiegel fördert eine

feedback-forward Stimulation (7;16;17;84;152;153). Pfeile: schwarz – aktiviert, rot – inhibiert, orange –

transaktiviert.


39

Abbildung 20 Molekularer Mechanismus von Nrf-2-Keap1 bei oxidativen und elektrophilen Stress. Unter

physiologischen Bedingungen liegt Nrf-2 gebunden an Keap1 im Cytoplasma vor und wird durch Ubiquitinierung

im Proteasom abgebaut (A). Bei einem Anstieg von Elektrophilen (oxidative Stresssituationen) verändern diese

durch Bindung an Keap1 dessen Struktur, so dass Nrf-2 nicht mehr binden kann. Die Akkumulation fördert die

Translokation von Nrf-2 in den Zellkern. Nach Heterodimerisierung mit weiteren Transkriptionsfaktoren erfolgt

die Transkription von Genen für die Phase-II Detoxifizierung und/oder anti-oxidativer Stress Antwort (B) (154-

160).

Kapitel 2 Zielsetzung

40

Kapitel 2 Zielsetzung

In dieser Arbeit sollen die Folgen einer Keratin 5-Promotor gesteuerten COX-2

Überexpression in den basalen Epithelschichten der Harnblase in einem homozygoten,

transgenen NMRI-Mausmodell gegenüber NMRI-Wildtyptieren untersucht werden. Für

die in vivo Analysen dienen die generierten homozygoten, transgenen Mauslinien, bei

denen die COX-2 cDNA unter der Kontrolle des bovinen Keratin 5-Promotors steht (161).

Dabei sollen auf histologischer Ebene COX-2 und Prostaglandin bedingte Veränderungen

im Blasenepithel charakterisiert werden, während auf molekularer Ebene neben den

Prostaglandinprofilen auch die Expressionsmuster der Prostaglandin E Synthasen (PGES)

und Prostaglandin E-(EP-)Rezeptoren, als wesentliche Komponenten Prostaglandin

abhängiger Signaltransduktion, analysiert werden sollen. Zum Vergleich soll eine Analyse

der PGES und EP-Rezeptoren der COX-2 positiven humanen, epithelialen

Blasentumorzelllinien RT112 und 5637 erfolgen.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit ist die Darstellung COX-2 abhängiger Proteinprofile. Dazu

soll die hochauflösende 2-Dimensionale Gelelektrophorse, die auf einer isoelektrischen

Fokussierung in immobilisierten pH-Gradientenstreifen (IEF) mit anschließender

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) basiert, etabliert werden. Um COX-2

abhängige, differentiell exprimierte Kandidatenproteine zu analysieren und zu

quantifizieren soll zusätzlich zur 2D-Gelektrophorese die 2-Dimensionale-Differenz-In-

Gel-Elektrophorese (2D-DIGE)-Technologie und deren Auswertung etabliert werden.

Kandidatenproteine sollen nach deren Identifikation durch MALDI-ToF- bzw.

Q-ToF-Analysen validiert werden.

Kapitel 3 Material und Methoden

41


3.1. Material

3.1.1. Geräte und Chemikalien

Für die vorliegende Arbeit wurden die nachfolgend, alphabetisch aufgelisteten Geräte und

Chemikalien verwendet. Alle Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, in per

analysis Qualität verwendet.

Geräte und Materialien Firma

Axioskop 2 Zeiss, Göttingen (Deutschland)

Brutschrank Infors, Bottingen (Schweiz)

Dewar-Gefäße KGW Isotherm, Karlsruhe

(Deutschland)

Elektrophoresekammer Horizontal BioRad GmbH, München

(Deutschland)

Elektrophoresekammer Mini CTI GmbH, Idstein

(Deutschland)

Elektrophoresekammer Twin (Maxi) Renner, Darmstadt

(Deutschland)

Elektrophorese Power Supply PHERO-STAB 500 Biotec Fischer GmbH,

Reiskirchen (Deutschland)

ELISA-Reader Elx 800 Bio-Tek Instruments, Winooski,

VT ( USA)

Entwicklermaschine Optimax Typ TR M&S Laborgeräte, Wiesloch

(Deutschland)

Eppendorfzentrifuge (Biofuge 13) Heraeus Instruments, Hanau

(Deutschland)


42

Ettan DALTsix Electrophoresis Unit GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Ettan IPGphore GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Falcon-Tubes 15 ml, 50 ml Techno Plastic Products (TPP),

Trasadingen (Schweiz)

Feinwaage BL6100 Sartorius, Göttingen

(Deutschland)

Feinwaage BP61 Sartorius, Göttingen

(Deutschland)

Feinwaage 2004 MP Sartorius, Göttingen

(Deutschland)

Hecht Assistant Gläser (88 x 14 x 15 mm) Neolab, Heidelberg

(Deutschland)

IPG-Quellkammer LKB 2117 mit GE Healthcare,

Multiphore II Electrophoresis Unit und Reswelling Tray Freiburg (Deutschland)

IPG Multi Temp III Cooling GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Kippschüttler, Mini Rocking Platform Biometra, Göttingen

(Deutschland)

Kippschüttler, Profile Rocker Stovall Life Sciences Inc., NC

(USA)

Kryotom Leica CM 3050 Leica, Bensheim (Deutschland)

Kühltisch Julabo Julabo, Seelbach (Schweiz)

Kühlzentrifuge Avanti J-25 Beckman, Palo Alto, CA (USA)

Kühlzentrifuge GPKR Beckman, Palo Alto, CA,

(USA)

Magnetrührer MR2002 Heidolph, Kehlheim

(Deutschland)

Mikro-Dismembrator S II B.Braun BiotechInstruments,

Melsungen (Deutschland)

Mikro-Dismembrator S II Chromstahlkugel (10 mm) B.Braun BiotechInstruments,



43

Mikro-Dismembrator S II PTFE-Behälter (3 ml) B.Braun BiotechInstruments,


Mikrowelle Bosch GmbH, Karlsruhe

(Deutschland)

Nano Drop Kisker-Biotech, Steinfurt

(Deutschland)

Objektträger superfrost Neolab, Heidelberg

(Deutschland)

Papierschneider Dahle North America,

Peterborough, NH, (USA)

PapPen Novocastra Novo Pen, New

Castle (UK)

PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml Biozym Diagnostik

GmbH, Oldendorf

(Deutschland)

PCR-Reaktionsgefäße 0,5 ml Eppendorf, Hamburg

(Deutschland)

PCR Peltier Thermo Cycler PTC200 Biozym Diagnostik

GmbH, Oldendorf

(Deutschland)

PCR Pipettenfilterspitzen 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl Starlab GmbH, Ahrensburg

(Deutschland)

pH-Meter pH330 Fischer BioBlock

Scientific, Illirch Cedex

(Frankreich)

Pipetboy Integra Bioscience, Fernwald

(Deutschland)

Pipetten 10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl Gilson, WI (USA)

Pipettenspitzen 10 µl, 200 µl, 1000 µl Eppendorf, Hamburg

(Deutschland)

Quarzküvetten (0,2 ml, 10 mm Schichtdicke) Hellma, Freiburg (Deutschland)

Reaktionsgefäße 0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Eppendorf, Hamburg

(Deutschland)


44

Röntgenfilmkassetten Dr. Goods Suprema, Heidelberg

(Deutschland)

Spectrophotometer Ultrospec II GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Speedvac Vakuumzentrifuge Bachofer, Reutlingen

(Deutschland)

SPU-Adsorbex Probeneinheit Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Sterilbank Heraeus Instruments, Hanau

(Deutschland)

Stickstofftank Messer Griesheim, Krefeld

(Deutschland)

Thermoblock Typ 2099 Bachofer Laboratoriumsgeräte,

Reutlingen (Deutschland)

Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

(Deutschland)

Tischzentrifuge Hermle Z233M M&S Laborgeräte, Wiesloch

(Deutschland)

Typhoon Scanner 9410 GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Überköpfschüttler Heidolph, Kehlheim

(Deutschland)

UV-Stratalinker 1800 Stratagene, La Jolla, CA (USA)

UV-Transilluminator Alpha Innotech

Corporation, CA (USA)

Victor 1420 Multilabel counter Perkin Elmer, MA, (USA)

Vortexer DSG 302 Heidolph, Kehlheim

(Deutschland)

Wasserbad Kottermann, Haenigsen

(Deutschland)

Western Blot Kammer SD1 CTI GmbH, Idstein

(Deutschland)


45

Zellkulturflaschen (75 cm², 150 cm²) TPP Renner, Dannstadt

(Deutschland)

Zellkulturschalen (60 mm, 100 mm) TPP Renner, Dannstadt

(Deutschland)

Chemikalien Firma

15-Deoxy-12,14-Prostaglandin J2 Enzyme Kit Assay Designs, Ann Arbor

(USA)

2D-CleanUp Kit GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

2D-Quant-Protein-Assay GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

1-kb-DNA Standard (Puc-DNA-Marker) MBI Fermentas (USA)

6-keto-Prostaglandin F1 Enzyme Immunoassay Kit Alexxis Biochemicals, Lausen

(Schweiz)

6x Ladepuffer (Loading Dye Solution) MBI Fermentas (USA)

2-Mercaptoethanol (98%) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

96-Wellplatten, steril Falcon Neolab, Heidelberg

(Deutschland)

2-Macroglobulin Roche, Mannheim

(Deutschland)

-Amino-n-Capronsäure (99%) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Aceton Lichrosolve Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Aceton p.A. Fluka, Buchs (Schweiz)

Aceton technisch DKFZ-Lager (Deutschland)

Acetonitril Merck, Darmstadt

(Deutschland)


46

Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Ammoniumbicarbonat Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

AmplexRed Kit Invitrogen, Karlsruhe

(Deutschland)

Antibiotika (Penecellin/Streptomycin 100x) Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)

Aprotenin (lyophilisiert) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

APS (Ammoniumpersulfat) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Aqua bidest Millipore, Eschborn

(Deutschland)

Aqua pure (HPLC-grade) Fluka, Buchs (Schweiz)

Borsäure Fluka, Buchs (Schweiz)

Bradford-Reagenz BioRad, München

(Deutschland)

Bromphenolblau, PlusOne GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Calciumchlorid Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Celecoxib (1500 ppm in Nagerpellets) Pfizer, New York (USA)

Chaps (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1- Sigma-Aldrich,

propanesulfonate Taufkirchen (Deutschland)

Coomassie brillant blue R Gerbu Biotechnik, Gaiberg

(Deutschland)

Cover Fluid GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Cy2, Cy3, Cy5 (Minimal-labeling) GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

DAKO Fluorescent Mounting Medium DAKO, Hamburg

(Deutschland)


47

Deckgläschen Neolab, Heidelberg

(Deutschland)

DeStreak-Lösung GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Diethyldithiocarbamat (Natriumsalz) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Dinatriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt

(Deutschland)

DMEM mit 4,5g Glucose Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)

DMF (N,N-Dimethylformamid, wasserfrei (99.8%)) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

dNTP-Set (Desoxynukleosid Triphosphat), PCR-Grade Roche, Mannheim

(Deutschland)

DTT (Dithiothreitol) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

DTT (Dithiothreitol), PlusOne GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

ECL (Western Blotting Detection Reagents) GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

EDTA (Etyhlendiamintetraacetat, Titriplex) Serva Feinbiochemica

GmbH & Co., Heidelberg

(Deutschland)

Einbettschälchen Cryomold Standard Vogel, Gießen (Deutschland)

ELISA-BSA (Bovine serum albumin) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Eosinrot G Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Essigsäure, reinst Fluka, Buchs (Schweiz)

Ethanol, technisch (1% Petrolether) DKFZ-Lager (Deutschland)

Ethanol p.A. Fluka, Buchs (Schweiz)

Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)


48

Ethylacetat (Lichrosolve) Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Eukitt (Vitro-Clud) O. Kindler GmbH, Freiburg

(Deutschland)

Formaldehyd (37%) AppliChem, Darmstadt

(Deutschland)

Fötales Kälberserum (FCS) Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)

Glucose Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Glutamin (100x) Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)

Glycerin, PlusOne GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Glycin Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Hämatoxylin (saures Hämalaun nach Mayer) Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Harnstoff (Urea, PlusOne) GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

HCCA (-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

IAA (Iodoacetamide, kristallin) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Immobiline DryStrip Cover Fluid, PlusOne GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Immobiline DryStrip pH 3-10, pH 3-5,6NL, GE Healthcare,

pH 5,3-6,5, pH 6,2-7,5, pH 7-11NL Freiburg (Deutschland)

IPGphor Strip Holder (Reinigungslösung) GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

IPG-Puffer, pH 3-10, pH 3,5-5,0, pH 5,5-6,7, GE Healthcare,

pH 6-11, pH 7-11 NL Freiburg (Deutschland)


49

Kaliumchlorid Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Leupeptin (lyophilisiert) Roche, Mannheim

(Deutschland)

L-Lysin (98% TLC) GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Magnesiumsulfat Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Methanol p.A. Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Methanol, technisch DKFZ-Lager (Deutschland)

Milchpulver, entfettet Fluka, Buchs (Schweiz)

Multiwell-Objektträger ICN Biomedicals, Meckenheim

(Deutschland)

Natriumcarbonat p.A. Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Natriumchlorid Roth, Karlsruhe (Deutschland)

Natriumfluorid Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Natriumformiat Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Natriumphosphat Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Natriumpyruvat Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)

Natriumorthovanadat Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Natriumthiosulfat Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)


50

n-Hexane p.A. Riedel-de Haén, Seelze

(Deutschland)

nicht-essentielle Aminosäuren (100x) Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)

Paraformaldehyd, reinst Merck, Darmstadt

(Deutschland)

PBS (Dulbecco Phosphat buffered saline) Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)

PCR Direct (tail) Lysis Reagent Viagen Biotech Inc., LA, CA

(USA)

PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Ponceau S, reinst Serva, Heidelberg

(Deutschland)

Prostaglandin E2 Enzyme Immunoassay Kit Alexxis Biochemicals, Lausen

(Schweiz)

Prostaglandin F2 Enzyme Immunoassay Kit Alexxis Biochemicals, Lausen

(Schweiz)

Protein-Detection Kit (DC Quick Lowry) BioRad, München

(Deutschland)

Protein-G Sepharose 4 Fast flow beads GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

PVDF-Membran, Immobilon P Millipore Corporation, Bredford

(USA)

Ras activation Assay Upstate, New York (USA)

Red Taq Polymerase Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Röntgenfilme Fuji Super RX medical Fuji Photoshop GmbH,

Düsseldorf (Deutschland)

Rotiphorese Gel 30 (37.5:1 Acrylamid:Bisacrylamid) Roth, Karlsruhe (Deutschland)

RPMI 1640 (12-167) Cambrex BioScience Verviers

(Belgien)


51

RT-PCR-Core Kit Roche, Mannheim

(Deutschland)

Salzsäure Merck, Darmstadt

(Deutschland)

SDS (Sodium dodecylsulfat), PlusOne GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

SDS-b Pulver (Sodium dodecylsulfat) Gerbu, Gaiberg (Deutschland)

SDS-6H-Marker für High molecular weights Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

SDS-7L-Marker für Low molecular weigths Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Sigma Fast DAB (Diaminobenzidin) Tabletten Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Silbernitrat, kristallin Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Silica-C18-Glas-Filtersätze 6 ml (500 mg) Separtis, Grenzach-Wyhlen

(Deutschland)

TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) p.A. Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

TFA (Trifluoressigsäure) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Tissue Tek Vogel, Gießen (Deutschland)

Tris p.A. Roth, Karlsruhe (Deutschland)

Tris, PlusOne GE Healthcare, Freiburg

(Deutschland)

Trypsin Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)

Trypsin (sequencing grade) Promega, Mannheim

(Deutschland)

Tween-20 Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

Vitamine (100x) Biochrom AG, Berlin

(Deutschland)


52

Wasserstoffperoxid 30% Merck, Darmstadt

(Deutschland)

Western Light Protein-Detection Kit Tropix, Bedford, MA (USA)

Whatman-3MM-Blotting-Papier Sartorius, Göttingen

(Deutschland)

Xylol Isomergemisch Sigma-Aldrich, Taufkirchen

(Deutschland)

3.1.2. Antikörper

Tabelle 5 Verwendete Primäre Antikörper

Antikörper Firma Verdünnung

Goat anti-β-Aktin

(SC-1616)

Santa Cruz Biotechnology,

Heidelberg

1:5000 - 1:10000 (IB)

Rabbit anti-Akt (9272) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)

Rabbit anti-p-Akt (9271) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)

Goat anti-COX-1 (SC-1754) Santa Cruz Biotechnology,

Heidelberg

1:200 (IF)

Rabbit anti-mouse COX-1

(Hase 50)

DKFZ, Heidelberg 1:2000 (IB)

Goat anti-COX-2 (SC-1745) Santa Cruz Biotechnology,

Heidelberg

1:1600 (IF)

1:2000 (IB)

Rabbit anti-mouse COX-2

(Hase 82)

DKFZ, Heidelberg 1:2000 (IB)

Rabbit anti-CD31 Becton Dickinson Co.; BD

Heidelberg

1:200 (IF)

Rat anti-CD4/L3T4 Becton Dickinson Co.; BD

Heidelberg

1:200 (IF, IHC)

Rat anti-CD45R/B220 BD Bioscience Pharmingen,

Heidelberg

1:200 (IF, IHC)


53

Rabbit anti-EP1 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:1000 (IB)

1:50 (IF, IHC)


Rabbit anti-EP2 Santa Cruz Biotechnology,

Heidelberg

1:50 (IF)


1:100 (IF, IHC)


1:50 (IF, IHC)

Rabbit anti-Erk-1/2 (p44/42

9102)

Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)

Rabbit anti-p-Erk-1/2

(9101)


Rat anti-F4/80 BD Bioscience Pharmingen,

Heidelberg

1:50 (IF)

Goat anti-FIH-1 Santa Cruz Biotechnology,

Heidelberg

1:500 (IB)

Rabbit anti-Glutathione

S-transferase

Alexxis Biochemicals, Lausen,

Schweiz

1:2000 (IB)

Rabbit

anti-Hemoxygenase-1

Alexxis Biochemicals, Lausen,

Schweiz

1:2000 (IB)

Rabbit anti-Her-2/Neu

(SC-284)


Heidelberg

1:1000 (IB)

Rabbit anti-HIF-1 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:500 (IB)

Rabbit anti-Ki67 Novocastra Laboratories,

Newcastle, UK

1:250 (IF)

Rabbit anti-MK5-PRB-

160P

Hiss Diagnostics, Freiburg 1:4000 (IF)

Rabbit anti-Nrf-2 (SC-722) Santa Cruz Biotechnology,

Heidelberg

1:500 (IB)

1:50 (IHC)

Rabbit anti-Peroxiredoxin-1 LabFrontier, Seoul, Korea 1:15000 (IB)


54






Rabbit anti-PTEN (138G6) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)

Rabbit anti-cPGES Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:2000 (IB)

Rabbit anti-mPGES-1 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:2000 (IB)

Rabbit anti-mPGES-2 Axxora, Ann Arbor, MI, USA 1:2000 (IB)

Rabbit anti-PI3 (p85 4257) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)

Rabbit anti-p-PI3 (p85/p55

4228)


Mouse anti-Ras

(clone Ras10)

Upstate, New York, USA 1:20000 (IB)

Rabbit anti-VHL (2738) Cell Signaling, MA, USA 1:1000 (IB)

Tabelle 6 Verwendete Sekundäre Antikörper

Antikörper Firma Verdünnung

Donkey anti-goat-IgG

AlexaFluor488

MoBiTec, Göttingen 1:400 (IF)

Donkey anti-goat-IgG-Cy3 Jackson/Dianova, Heidelberg 1:500 (IF)

Rabbit anti-goat-IgG-HRP

(SC-2020)


Heidelberg

1:2000 (IB)

1:400 (IHC)

Donkey anti-goat IgG AP

(SC-2022) (kein Tropix bei

COX-1/-2 Nachweis)


Heidelberg

1:5000 (IB)

Goat anti-mouse IgG HRP

(SC-2005) (beim Ras

activation assay)


Heidelberg

1:2000 (IB)

Donkey anti-rabbit-IgG-

Cy3

Jackson/Dianova, Heidelberg 1:500 (IF)


55

Goat anti-rabbit-IgG-HRP

(H+L)

Jackson/Dianova, Hamburg 1:10000 (IB)

1:400 (IHC)

Goat anti-rabbit conjugated

Alkaline Phosphatase

Tropix, Bedford, MA,

USA

1:5000 (IB)

Goat anti-rat-IgG

AlexaFluor488

MoBiTec, Göttingen 1:400 (IF)

Hoechst 33258 Sigma, Taufkirchen 1:3000 (IF)

anti-mouse IgG HRP Jackson/Dianova, Heidelberg 1:400 (IHC)

3.1.3. Primer

Die aufgelisteten Oligonukleotide wurden von Thermo Fisher Scientific (GmbH) in Ulm

(Deutschland) bezogen, lagen in einem HPLC gereinigten Synthesemaßstab von 0,02 µmol

vor und wurden in Aqua pur aufgenommen.

Tabelle 7 Eingesetzte Oligonukleotide

Gen/Laborcode Sequenz TM /

Zyklen

Größe

(bp)

COX-2 (m) 181f 5´-CCTAGATAACAGAGCCGCTTTC-3´ 56°C/ 332

COX-2 (m) 611 5´-TTTCACCATAGAATCCAGTCCG-3´ 30

COX-2 (h) f 5´-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATT-3´ 52°C/ 305

COX-2 (h) r 5´-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3´ 30

COX-2 (m) f 5´-ACTCACTCAGTTTGTTGAGTCATTC-3´ 54°C/ 600

COX-2 (m) r 5´-TTGATTAGTACTGTAGGGTTAATG-3´ 40

COX-1 (h) f 5´-TGCCCAGCTCCTGGCCCGCCGCTT-3´ 64°C/ 303

COX-1 (h) r 5´-GTGCATCAACACAGGCGCCTCTTC-3´ 30

COX-1 (m) f 5´-TGCATGTGGCTGTGGATGTCATCAA-3´ 63°C/ 449

COX-1 (m) r 5´-CACTAAGACAGACCCGTCATCTCCA-3´ 40

-Aktin (h) f 5´-GTTGCGTTACACCCTTTGTTGACA-3´ 58°C/ 336

-Aktin (h) r 5´-CTGTGTGGACTTGGGAGAGGACTG-3´ 30


56

-Aktin (m) f 5´-AAACTGGAACGGTGAAGGC-3´ 54°C/ 450

-Aktin (m) r 5´-GCTGCCTCAACACCTCAAC-3´ 35

EP1 (h) f 5´-CTTCGGCCTCCACCTTCT-3´ 56°C/ 497

EP1 (h) r 5´-TTTCGCAGAATGGCTTTTTATT-3´ 45

EP1 (m) f 5´-TAGTGTGCAATACGCTCAGCG-3´ 64°C/ 553

EP1 (m) r 5´-GAGGTGACTGAAACCACTGTG-3´ 40

EP2 (h) f 5´-AGGCTACAGATGTGCTGACAAG-3´ 51°C/ 404

EP2 (h) r 5´-AGGCTACAGATGTGCTGACAAG-3´ 30-45

EP2 (m) f 5´-TATGGCAAAGACCCAAGGG-3´ 58°C/ 348

EP2 (m) r 5´-GACTGCATACCTTCAGCTGTAC-3´ 40

EP3 (h) f 5´-TTCTTCGAAAGTTTTGCCAGAT-3´ 51°C/ 309

EP3 (h) r 5´-CAATCAACACATGGAAAGTGCT-3´ 45

EP3 (m) f 5´-GGCACGTGGTGCTTCATC-3´ 54°C/ 416

EP3 (m) r 5´-GGGATCCAAGATCTGGTTC-3´ 40

EP4 (h) f 5´-ATCTTACTCATTGCCACC-3´ 54°C/ 212

EP4 (h) r 5´-TCTATTGCTTTACTGAGCAC-3´ 30

EP4 (m) f 5´-CTGAACAGCCCGGTGACCATTCC-3´ 63°C/ 363

EP4 (m) r 5´-GCCGGCCAGCCGCTTGTCCAC-3´ 40

HIF-1 (m) f 5'-ATTTGTGAACCCATTCCTCATC-3' 51°C/ 503

HIF-1 (m) r 5'-GCTTATCAAAAAGGCAGCTTGT-3' 45

PPAR (m) f 5'-AGATTCTCCTGTTGACCCAGAG-3' 51°C/ 499

PPAR (m) r 5'-TAAGCTTCAATCGGATGGTTCT-3' 30

mPGES-1 (m) f 5´-CCGAGATGCCTTCCCCGGGC-3´ 65°C/ 580

mPGES-1 (m) r 5´-CCAGGACCCCAGGACCAGACCC-3´ 40

Nrf-2 (m) f 5´-TGGACGGGACTATTGAAGGCTG-3´ 58°C/ 735

Nrf-2 (m) r 5´-GCCGCCTTTTCAGTAGATGGAGG-3´ 30

(h) human; (m) mouse; f forward; r reverse; TM eingesetzte Annealingtemperatur


57

3.2. Methoden

3.2.1. Mauslinien

Heterozygote und homozygote Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Linien (tr) 667+/-

und

675+/+

, hergestellt nach G.Neufang et al. (161), und NMRI-Wildtyp-Mäuse (wt)

(Füllinsdorf, Schweiz) wurden am Deutschen Krebsforschungszentrum (Heidelberg) unter

kontrollierten Tag- und Nachtzyklen gehalten und mit Altromin Standardpellets gefüttert.

Die Wasserversorgung erfolgte ad libitum.

Das K5.COX-2 Konstrukt der trangenen Tiere besteht aus dem Rinder Keratin 5-Promotor,

der Maus COX-2 cDNA und einer poly-Adeninsequenz, welches in Abbildung 21

dargestellt ist. In der Abbildung wurden im Konstrukt die Endonuklease-Schnittstellen

mitberücksichtigt.

Abbildung 21 Schematische Darstellung des K5.COX-2 DNA-Konstrukts (161)

Da die COX-2 cDNA unter der Kontrolle des Keratin 5-Promotors steht, erfolgt die

Expression von COX-2 in den basalen Epithelschichten.

Um die Effekte des selektiven COX-2 Inhibitors Celebrex® Pfizer zu untersuchen, wurden

transgene Tiere in einer durchgeführten Diät 5010 mit 1500 ppm Celebrex® vom Tag 1 bis

zum Tag 360 nach der Geburt gefüttert.

Alle tierexperimentellen Untersuchungen wurden durch das Regierungspräsidium

Karlsruhe genehmigt und liefen unter der Aktennummer 20/02.

5,12 kb 1,92 kb 1,75 kb

K5-Promotor COX-2 Splice + pA

KpnI KpnISal I Sal I

Eco RI Eco RI


58

3.2.2. Entnahme der Harnblase aus Mäusen

Für die Entnahme der Harnblase und weiterer Organe wurden die Mäuse durch cervicale

Dislokation getötet und die Harnblase nach Öffnen der Bauchdecke entnommen.

Für molekularbiologische Untersuchungen erfolgte das sofortige Einfrieren im flüssigen

Stickstoff in 1,5 ml Eppendorftubes (Safe-Lock) und der weiteren Lagerung bei -80°C. Für

immunhistochemisch relevante Fragestellungen wurde die Harnblase in Tissue Tek

eingebettet und in Isobutan im flüssigen Stickstoff eingefroren. Die weitere Lagerung

erfolgte bei -80°C.

3.2.3. Proteinisolierung aus der Harnblase

Für die Proteinisolierung aus der Harnblase wurden die bei -80°C gelagerten

Gewebeproben zunächst im flüssigen Stickstoff gekühlt. Die anschließende

Homogenisierung des Blasengewebes erfolgte mit Hilfe des Mikro-Dismembrators S für

eine Minute bei 2500 rpm in Stickstoff gekühlten 3 ml PTFE-Schüttelbehältern und unter

zu Hilfenahme einer ebenfalls gekühlten Chromstahlkugel (7,85 g/ml, 10 mm im

Durchmesser). Das Homogenat sowie die Chromstahlkugel wurden in 1,0-1,2 ml Puffer in

15 ml Corex-Röhrchen aufgenommen. Die für die jeweiligen Reaktionsansätze

verschiedenen Puffer wurden kurz vor Versuchsbeginn mit den Protease-Inhibitoren

PMSF, Aprotenin, Leupeptin und 2-Makroglobulin versetzt.

Nach dem vollständigen Ablösen des Homogenates von der Chromstahlkugel wurde diese

entfernt und das Lysat mittels 1 ml Spritzen mit 21G 11/2

“ Kanülen auf Eis homogenisiert

(außer den Proteinhomogenaten für die 2D-Gelelektrophorese) und die

Desoxyribonukleinsäure (DNS) dabei geschert. Dieser Vorgang wurde während der

gesamten Proteinaufarbeitung insgesamt 25-mal durchgeführt.

Abhängig vom weiteren Reaktionsverlauf erfolgte eine unterschiedliche Weiterbehandlung

der Proteinhomogenate.


59

3.2.3.1. Aufarbeitung für die 2D-Gelelektrophorese

Die im Lysepuffer aufgenommenen Blasengewebehomogenate inkubierten mindestens drei

Stunde bei 25°C und wurden dabei mehrmals mit 21G Kanülen mittels 1 ml Spritzen

homogenisiert. Daraufhin wurden die Zelltrümmer und nicht gelösten Bestandteile durch

Zentrifugation für zehn Minuten bei 2500 x g und 20°C in der Avanti-Kühlzentrifuge

(J-25) abgetrennt. Der klare Überstand wurde ohne die darüberliegende Lipidschicht

entnommen und 200 µl mit dem 2D-CleanUp Kit aufgereinigt. Dazu wurden die Proben

mit dem dreifachen Volumen an Präzipitat versetzt, gevortext und für 15 Minuten bei 4°C

inkubiert. Anschließend erfolgte der Zusatz des dreifachen Volumens an Co-Präzipitat,

erneutes vortexen und eine Zentrifugation für zehn Minuten bei 8000 x g und 4°C. Nach

dem Verwerfen des Überstandes wurden die Proben erneut für zwei Minuten bei 8000 x g

und 4°C zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Pellet im doppelten Volumen

mit Co-Präzipitat versetzt, ohne dabei das Pellet zu zerstören und erneut für fünf Minuten

zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde das Pellet mit Aqua bidest bedeckt

und mit dem zehnfachen Volumen an Waschlösung, die mindestens eine Stunde vor

Benutzung bei -20°C inkubierte, aufgenommen und so lange gevortext bis das Pellet von

der Reaktionsgefäßwand abgelöst war. Daraufhin wurden die Proben für 30 Minuten bei

-20°C inkubiert und alle zehn Minuten für 30 Sekunden gevortext. Nach dem

Zentrifugieren für zehn Minuten bei 8000 x g und 4°C, wurde der Überstand abgenommen,

das Pellet maximal fünf Minuten luftgetrocknet und in Lysepuffer resuspendiert. Danach

wurde die Proteinkonzentration mit dem 2D-Quant Protein-Assay (3.2.4.1.3) bestimmt und

die Proteinkonzentration der Proteinlysate auf 1 µg/µl mittels Lysepuffer eingestellt und

für weitere Versuche aliqotiert.

Die Lagerung der Proteinlysate erfolgte bei -70°C bzw. die Weiterbehandlung, wie unter

3.2.4.2.2 bzw. 3.2.4.3.1 beschrieben.

Lysepuffer

Harnstoff 9 M

Chaps 65 mM

Tris/HCl 30 mM

EDTA 1 mM


60

PMSF 1 mM

Aprotinin 10 µg/ml

Leupeptin 10 µg/ml

α2-Makroglobulin 0,2 mg/ml

pH 8,5

2D-CleanUp Kit

3.2.3.2. Aufarbeitung für die Immunpräzipitation und Immunoblot

Für die Immunpräzipitation bzw. dem Immunoblot wurde das Blasengewebehomogenat

zur Isolierung der Cyclooxygenasen in COX-Puffer, zur Isolierung der EP-Rezeptoren in

EP-Rezeptoren-Puffer und zur Isolierung übriger Proteine in HP-Puffer aufgenommen. Die

Homogenate inkubierten für 20 Minuten auf Eis und wurden währenddessen wie unter

3.2.3 beschrieben homogenisiert. Anschließend wurden die Zelltrümmer und nicht

gelösten Bestandteile durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 4000 rpm und 4°C in der

Avanti-Kühlzentrifuge (J-25) abgetrennt. Der klare Überstand wurde ohne die

darüberliegende Lipidschicht entnommen und die Proteinkonzentration mit dem

Quick-Lowry-Protein-Assay bestimmt und mit dem jeweiligen Puffer auf 1 mg/ml

eingestellt. Anschließend erfolgte die Immunpräzipitation bzw. der Immunoblot wie unter

3.2.5.1 bzw. 3.2.5.2 beschrieben.

COX-Puffer

Tris/HCl 50 mM

EDTA 2 mM

Tween-20 1 % (v/v)

PMSF 1 mM

Aprotenin 10 µg/ml

Leupeptin 10 µg/ml


pH 7,5


61

EP-Rezeptoren-Puffer

Natriumchlorid 150 mM

Tris/HCl 50 mM

Diethyldithiocarbamat 200 mM

EDTA 2 mM

Tween-20 1 % (v/v)

PMSF 1 mM

Aprotenin 10 µg/ml

Leupeptin 10 µg/ml


pH 8,0

HP-Puffer

Tris/HCl 50 mM

Diethyldithiocarbamat 200 mM

EDTA 2 mM

Tween-20 1 % (v/v)

PMSF 1 mM

Aprotenin 10 µg/ml

Leupeptin 10 µg/ml


pH 7,5

3.2.3.3. Aufarbeitung für den Ras-GTPase Assay

Das pulverisierte Harnblasengewebe wurde nach Aufnahme in MLB-Puffer und

anschließender Homogenisierung in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt und die

Zelltrümmer und nicht gelösten Bestandteile durch Zentrifugation für fünf Minuten bei

13000 rpm und 4°C in der Eppendorfzentrifuge (Biofuge 13) abgetrennt. Der klare

Überstand wurde entnommen und die Proteinkonzentration mit dem Quick Lowry Protein-

Assay bestimmt. Danach erfolgte das Einstellen der Proteinkonzentration auf


62

2 mg/ml bzw. 4 mg/ml mittels MLB-Puffer auf ein Endvolumen von 500 µl (Pull-down,

PD, s. 3.2.6.1). Das restliche Volumen (RV) wurde einer Ethanolfällung unterzogen.

MLB-Puffer (Magnesium-Lysis-Wasch-Puffer)

5x MLB 1x

Natriumfluorid 25 mM

Natriumorthovanadat 1 mM

Aprotenin 10 µg/ml

Leupeptin 10 µg/ml

add HPLC-Wasser (10 % Glycerol (v/v))

3.2.3.4. Ethanolfällung

Die Proteinansätze wurden mit dem 2-fachen Volumen an -20°C kaltem Ethanol versetzt,

gevortext und über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für

30 Minuten bei 13000 rpm und 4°C in der Eppendorfzentrifuge bzw. für 30 Minuten bei

10000 x g und 4°C in der Avanti-Kühlzentrifuge (J-25). Der klare Überstand wurde

dekantiert, das Pellet kurz luftgetrocknet und in 1x LSB (Laemmli Sample Buffer) in einer

Konzentration von 2 mg/ml auf Eis resuspendiert.

In Vorbereitung für die Disk-Elektrophorese wurden die Ansätze fünf Minuten bei 100°C

denaturiert, auf Eis Schock gekühlt und anschließend fünf Minuten bei 13000 rpm in der

Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Die weitere Lagerung erfolgte bei -20°C.

1x LSB

Glycin 1,3 M

SDS 0,1 M

PMSF 2 mM

2-Mercaptoethanol 5 % (v/v)

Bromphenolblau 0,015 mM

Upper-Tris 1x (s. Seite 64 ff.)


63

3.2.4. Proteinbiochemische Nachweisverfahren

3.2.4.1. Proteinbestimmung

3.2.4.1.1. Bradford-Assay

Für die Proteinbestimmung wurde eine BSA-Standard Verdünnungsreihe in den

Konzentrationen von 0,125 mg/ml bis 8 mg/ml erstellt. Anschließend wurden 10 µl

Standard bzw. der zu untersuchenden Proben mit 990 µl BioRad Arbeitslösung (1:5

BioRad Bradford Reagenz:Wasser) versetzt, gevortext und 15 Minuten bei

Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte mit 200 µl Probenmaterial in

96-Wellplatten am ELISA-Reader Elx800 bei 600 nm. Die nachweisbare Proteinmenge

liegt bei 5-30 µg.

3.2.4.1.2. DC Quick Lowry

Für den DC Quick Lowry Assay wurde eine BSA-Standard Verdünnungsreihe mit einer

Konzentration von 0,125 mg/ml bis 8,0 mg/ml erstellt.

Entsprechend den Herstellerangaben (BioRad) wurden 37,5 µl einer frisch hergestellten

Lösung A´ (1:50 aus Lösung S:A) mit 7,5 µl Probe bzw. Standard versetzt und sofort

gevortext. Nach Zugabe von 300 µl Lösung B wurden die Proben gevortext und

15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte mit 200 µl

Probenmaterial in 96-Wellplatten am ELISA-Reader Elx800 bei 750 nm. Die

nachweisbare Proteinmenge liegt bei 20-200 µg.

3.2.4.1.3. 2D-Quant Protein-Assay

Für die Proteinbestimmung wurde eine Standard Verdünnungsreihe mit den BSA-Mengen

zwischen 0-50 µg nach Herstellerangaben erstellt. Die zu untersuchenden

Proteinhomogenate bzw. -lysate wurden unverdünnt, 1:2 und 1:4 mit Lysepuffer verdünnt

und 20 µl sowie 40 µl jeweils in Doppelbestimmung eingesetzt.

Diese Reaktionsansätze wurden mit 500 µl Präzipitat versetzt, gevortext und 2-3 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte ein Zusatz von 500 µl Co-Präzipitat,

erneutes vortexen und eine Zentrifugation bei 13000 rpm für fünf Minuten bei


64

Raumtemperatur (Biofuge 13). Der Überstand wurde dekantiert und die Ansätze erneut für

fünf Minuten bei 13000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Der erhaltene Überstand

wurde abgenommen und das Pellet in 500 µl einer 1:5 in aqua bidest verdünnten

Kupferlösung resuspendiert. Nach dem Zusatz von 1 ml Color Reagent wurden die Proben

gevortext und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte am

Spectrophotometer Ultrospec II in Quarzküvetten bei einer Wellenlänge von 480 nm. Die

nachweisbare Proteinmenge liegt bei 0,5 µg.

3.2.4.2. Gelelektrophoretische Auftrennungen

3.2.4.2.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Für die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinlysaten wurden 7,5 %-ige,

12 %-ige bzw. 15 %-ige Trenngele mit 4 %-igem Sammelgel hergestellt (Tabelle 8).

Die verwendeten Glasplatten wurden durch definierte 1,5 mm starke Spacer getrennt. Die

Abdichtung erfolgte mittels 1 %-iger Agarose. Nach dem Erstarren der Agarose wurde das

Trenngel gegossen und mit Ethanol überschichtet. Nach dem Auspolymerisieren wurde das

Sammelgel gegossen. Die Nachpolymerisation betrug mindestens zwei Stunden.

Das hergestellte Gel wurde daraufhin in die Gelelektrophorese-Kammer überführt und mit

400 ml SDS-Laufpuffer beschichtet. Anschließend wurden 50 µg - 140 µg Gesamtprotein

(2 mg/ml) der vorbereiteten Proben, 20 µl des Markers (6H-SDS bzw. Low Molecular

Weight Marker, s. Tabelle 9 und Tabelle 10) und ggf. 0,5 µg - 5,0 µg einer Positivkontrolle

auf das Gel aufgetragen.

Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte bei konstanten 9-11 mA über Nacht und

bei Raumtemperatur.


65

Tabelle 8 Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels

Trenngele 7,5 / 12,0 / 15,0 % Sammelgel 4,0 %

4x Lower Tris 10,0 / 10,0 / 10,0 ml -

4x Upper Tris - 5 ml

Bis-/Acrylamid 10,0 / 16,0 / 20,0 ml 2,7 ml

TEMED 40 µl 40 µl

10 % APS 450 µl 60 µl

Aqua bidest 19,6 / 13,5 / 9,5 ml 12,4 ml

Tabelle 9 Molekulargewichte des SDS-6H-Standard-Markers nach Sigma

Tabelle 10 Molekulargewichte des Low-Molecular-Weight-Markers nach Sigma

Protein Molekulargewicht [Da]

Myosin (Rabbit muscle) 205.000

β-Galactosidase (E.coli) 116.000

Phosphorylase b (Rabbit muscle) 97.400

Albumin (Bovine) 66.000

Albumin (Egg) 45.000

Carboanhydrase (Bovine erythrocytes) 29.000

Protein Molekulargewicht [Da]

Albumin, Bovine 66.000

Albumin, Egg 45.000

Glycerinaldehyd-3-Phosphat-

Dehydrogenase

36.000

Carbonic anhydrase, Bovine 29.000

Trypsinogen, Bovine pancreas 24.000

Trypsin Inhibitor, Soybean 20.000


66

4x Lower Tris

Tris/HCl 1,5 M

SDS 0,4 % (w/v)

pH 8,8

4x Upper Tris

Tris/HCl 0,5 M

SDS 0,4 % (w/v)

pH 6,8

1x SDS-Laufpuffer

Tris 25 mM

Glycin 192 mM

SDS 1 % (w/v)

3.2.4.2.2. Zwei-dimensionale Gelelektrophorese

Bei der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese werden Proteine in zwei Dimensionen

aufgetrennt. Die Auftrennung der ersten Dimension erfolgt mittels der isoelektrischen

Fokussierung (IEF), bei der ein natives Protein oder Peptid im elektrischen Feld durch

einen pH-Gradienten wandert, bis es an den pH-Wert gelangt, an dem seine Nettoladung

und damit seine Wanderungsgeschwindigkeit Null ist. Dies ist sein isoelektrischer Punkt

(Abbildung 22).

In der zweiten Dimension werden die denativen Proteine nach ihrem Molekulargewicht

getrennt.


67

Abbildung 22 Prinzip der isoelektrischen Fokussierung (nach GE Healthcare)

Quellen der IPG-Streifen

Für die Auftrennung der Proteine in der ersten Dimension wurden getrocknete 180 mm

lange IPG-Streifen mit verschiedenen pH-Gradienten (pH 3-5,6NL, pH 5,3-6,5, pH 6,2-

7,5, pH 7-11NL und pH 3-10) eingesetzt, die entsprechend den Herstellerangaben

30 Minuten vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmt und mit 150 µg Proteinmenge

beladen wurden. Die Proteinlysate wurden nach 3.2.3.1 erhalten und in einem Verhältnis

von 1:1 mit 2x Rehydratationspuffer versetzt bzw. im weiteren Verlauf durch

DeStreak-Lösung ersetzt. Das maximale Quellvolumen für die gewählten IPG-Streifen

beträgt 340 µl, wobei das eingesetzte Quellvolumen abhängig vom durchgeführten

Versuch zwischen 300-340 µl betrug.

Das Probenvolumen wurde in die Quellkammer (Reswelling-Tray) vorgelegt und die zu

benetzende IPG-Seite, nach dem Abziehen der Schutzfolie, nach unten in die

Proteinlösung inkubiert. Der IPG-Streifen wurde anschließend mit 2 ml Cover Fluid

bedeckt und mittels Multi Temp III Cooling bei 20°C für mindestens 12 Stunden über

Nacht gequollen.

pH

3

pH

10

+ - - -

- - +

-

+

+

+ - + -

+ +

+ + + Time0

+ - - -

- - -

+

+

+ + -

+ + + +

+ + +

+ - -

- -

+ + - + Time1

- + Time2


68

2x Rehydratationspuffer

Harnstoff 9 M

Chaps 33 mM


DTT 36 mM

IPG-Puffer 1,0 % (v/v)

DeStreak-Lösung

DTT 36 mM

IPG-Puffer 1,0 % (v/v)

Isoelektrische Fokussierung

Die gequollenen IPG-Streifen wurden mit aqua bidest befeuchtete 3 MM Whatmann-

Filterpapier dreimal vorsichtig abgetupft, um Cover Fluid Rückstände sowie eventuelle

Harnstoffkristalle zu entfernen. Anschließend wurden die IPG-Streifen in Teflonschiffe

bzw. Keramiklaufwanne mit der Gelseite nach oben überführt. An den jeweiligen

Gelstreifenenden wurden 5x5 mm große, mit aqua bidest angefeuchtete Filterstreifen

aufgelegt und mit den Elektroden fixiert. Danach wurden die Teflonschiffe entsprechend

der Anoden-Kathoden-Polarisation in die Ettan IPGphore I überführt und die IPG-Streifen

mit 4-5 ml Cover Fluid benetzt.

Das Laufprogramm für die isoelektrische Fokussierung ist in der nachfolgenden Tabelle

zusammengefasst.

Tabelle 11 Laufprogramm der isoelektrischen Fokussierung nach GE Healthcare in der ersten Dimension für 180

mm lange IPG-Streifen

Step 1 1 h 150 V Step and hold


Step 3 6 h 1000 V Gradient

Step 4 3 h 6000 V Gradient



69

Eine Lagerung der IPG-Streifen nach der isoelektrischen Fokussierung erfolgte im

Äquilibrierungspuffer-frozen bei -20°C.

Äquilibrierung der IPG-Streifen und zweite Dimension

Die Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht in der zweiten Dimension

erfolgte in 210x180x1 mm großen 12,5 %-igen SDS-Gelen (s. Tabelle 12) in

Low-Fluorescence Gelplatten.

Mit Hilfe des Ettan Daltsix-Gel-Casters wurden sechs Gele gleichzeitig gegossen. Dazu

wurden die Gelplatten mit Aceton (Lichrosolve) gereinigt und entsprechend den

Herstellerangaben die Gießkammer mit den Gelen zusammengesetzt, die Gele gegossen

und mit 80-100 ml Ethanol (p.A.) überschichtet. Nach ein bis zwei Stunden Polymerisation

wurde das Ethanol abgegossen, die Gele mit Aqua bidest überschichtet und über Nacht bei

4°C gelagert, so dass eine vollständige Nachpolymerisation gewährleistet wurde.

Tabelle 12 Zusammensetzung der 12,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgele in der zweiten Dimension

450,25 ml Gesamtvolumen für sechs Gele á 12,5 %

Substanz Volumen [ml]

Rotiphorese Gel 30 188

1,5 M Tris*HCl-Puffer, pH 8,8 113

Aqua bidest 140

10% SDS 4,5

10% APS (frisch zubereitet) 4,5

TEMED 0,25

Vor der Überführung der IPG-Streifen in die zweite Dimension, mussten die Proteine

zunächst denaturiert werden. Dazu wurden die IPG-Streifen jeweils 15 Minuten in

Dithiothreitol-(DTT-)Äquilibrierungspuffer sowie in Iodoacetamid-(IAA-)Aquilibrie-

rungspuffer unter schwenken (100 rpm) inkubiert. Anschließend wurden die IPG-Streifen


70

für ca. fünf Sekunden in 1x SDS-Laufpuffer gespült und auf die 12,5 %-igen SDS-Gele

überführt. Für die Auftrennung wurden 0,7 µl 6H-SDS-Standard-Marker (Tabelle 9) auf

5x5 mm Whatmann-Filter aufgetragen und neben der aziden IPG-Streifenseite platziert.

Die IPG- und Filterstreifen wurden mit 0,7 % warmer Agarose (40-50°C) überschichtet.

Nach dem Erstarren der Agarose wurden die Gele in die Ettan DALTsix Elelctrophoresis

Unit überführt und mit 1x SDS-Laufpuffer überschichtet. Die obere Laufkammer wurde

mit 2x SDS-Laufpuffer befüllt. Die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine

erfolgte über Nacht mit 0,67 Watt pro Gel.

Äquilibrierungspuffer

Harnstoff 6 M

Tris/HCl 50 mM

Glycerin 3,26 M

SDS 69,35 mM


DTT-Äquilibrierungspuffer

zusätzlich

DTT 65 mM

IAA-Äquilibrierungspuffer

zusätzlich

IAA 135 mM

Äquilibrierungspuffer-frozen

Tris/HCl 50 mM

Glycerin 3,26 M

SDS 69,35 mM


71

1x SDS-Laufpuffer

Tris 25 mM

Glycin 192 mM

SDS 3,47 mM

Agaroselösung

Agarose 0,5 % (w/v)

Bromphenolblau 0,002 % (w/v)

3.2.4.3. Proteinmarkierung

3.2.4.3.1. 2D-DIGE Proteinlabeling

Um Unterschiede im Expressionsmuster der Proteine in transgener K5.COX-2 (tr) im

Vergleich zur Wildtyp (wt) Harnblase zu identifizieren und zu quantifizieren wurde die

traditionelle 2-Dimensionale Gelelektrophorese mit der Differenz-In-Gel-Elektrophorese

kombiniert. Die Grundlage bildet die Veresterung von Proteinen mit unterschiedlichen

Fluoreszenzfarbstoffen (CyDye Flourochrome). Diese Flourochrome werden speziell für

die 2-Dimensionale Differenz-In-Gel-Elektrophorese-(2D-DIGE-)Technologie entwickelt.

Dabei reagieren die NHS-Estergruppen der Cydyes mit den -Aminogruppen der freien

Lysine der Proteine. Darin liegt die Limitierung der Methode, da nur 3-5% aller Proteine

damit für die Labeling-Reaktion zur Verfügung stehen. Für die 2D-DIGE-Methode stehen

drei CyDyes zur Verfügung - CyTM

2, CyTM

3 und CyTM

5, die sich in ihren Eigenschaften,

wie es in der folgenden Tabelle zusammenfassend dargestellt ist, unterscheiden.

Tabelle 13 Eigenschaften der Fluorochrome Cy2, Cy3 und Cy5

Fluorochrom Farbe Absorption

[nm]

Extinktion

[nm]

Molekulargewicht

M [g/mol]

Cy2 Grün 491 509 434

Cy3 Rot 553 569 466

Cy5 Blau 645 664 464


72

In dieser Arbeit wurde der Minimal-labeling Ansatz verwendet. Dies stellte sicher, dass

nur ein CyDye Fluorochrome mit einem Protein verestert werden konnte und nicht

falsch-positive Werte aufgrund mehrfacher Kopplungsreaktionen erhalten werden. Die

Detektion der markierten Proteine erfolgt mittels eines Colour-Fluoreszenzscanners

(Typhoon 9400).

Wie es in Abbildung 23 schematisch dargestellt ist, wurden nach der Extraktion der

Proteine aus der Harnblase 50 µg wt-Probe (1 mg/ml) mit dem Fluorochrom Cy3 markiert,

50 µg tr-Probe mit Cy5 und 25 µg wt- plus 25 µg tr-Probe mit Cy2. Der Cy2-markierte

Ansatz dient dabei als interner Standard. Für die kovalente Verknüpfung wurden 1 µl

(400 pmol) CyDye zum jeweiligen Reaktionsansatz gegeben und für 30 Minuten auf Eis

im Dunkeln inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden durch Zusatz von 1 µl 10 mM Lysin

gestoppt und für weitere zehn Minuten im Dunkeln auf Eis gelagert.

Nach der Markierungsreaktion wurden alle drei Ansätze vereinigt, so dass sich 150 µg

Gesamtproteinmenge ergab, mit DeStreak-Lösung versetzt und die Proteine nach dem

Prinzip der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese separiert. Somit erfolgte die Auftrennung

unter exakt den gleichen Bedingungen und minimierte damit Gel-zu-Gel Variationen

(162;163).

Mittels Typhoon Scanner 9400 wurde das Gel entsprechend den Wellenlängen der

Fluorochrome eingescannt und die Kanäle gebündelt. Mit Musteralgorithmen der DeCyder

Software (GE Healthcare) wurden über den internen Standard differentiell exprimierte

Proteine identifiziert und quantifiziert. Darüber hinaus erlaubt die Software Gel-zu-Gel

Spotmatches und statistische Berechnungen.

Nach Identifizierung der differentiell exprimierten Proteine erfolgte die weitere

Behandlung wie unter 3.2.4.2.2 und 3.2.4.5 beschrieben.


73

Abbildung 23 Schematische Darstellung des 2D-DIGE Arbeitsflusses mit einem Drei-Farbsystem (Erklärung im

Text)

Proteinextraktion

Harnblasengewebewt tr

wttr

Zentrifugation

2D-CleanUp

wt + tr

Cy2

wt

Cy3

tr

Cy5

2D-Gelelektrophorese der vereinigten Ansätze

Scannen und Datenquantifizierung

wt tr

Identifizierung

MALDI-ToF-MS

ESI-MS/MS


74

CyDye-Fluoreszenzfarbstoffe in Dimethylformamid [DMF]

Cy-Farbstoff 400 pmol/µl

Lysin-Stopplösung

L-Lysin 10 mM

3.2.4.4. Proteinfärbung

3.2.4.4.1. Coomassie-Färbung

Für die Coomassie-Färbung wurden die Gele nach der elektrophoretischen Trennung für

eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln in der Färbelösung inkubiert.

Anschließend erfolgte durch mehrmaliges Wechseln der Entfärberlösung das Entfärben der

Gele.

Färbelösung

Methanol 40 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v)

Coomassie brillant blue R 0,6 % (w/v)

Entfärbelösung

Methanol 40 % (v/v)


3.2.4.4.2. SDS-Gel Silberfärbung

Für die Silberfärbung wurden die Gele nach der elektrophoretischen Trennung über Nacht

in Fixierlösung unter schütteln bei 25 rpm inkubiert. Anschließend wurden die Gele

dreimal 20 Minuten unter schütteln in Waschpuffer gewaschen, eine Minute in

Natriumthiosulfatlösung inkubiert und 20 Minuten imprägniert. Danach wurden die Gele

zweimal 20 Sekunden mit aqua bidest gewaschen und 1-2 Minuten entwickelt. Die


75

Farbentwicklung wurde durch eine mindestens zehn minütige Inkubation in Fixierlösung

gestoppt.

Anschließend wurden die Gele in Aqua bidest rehydriert, in Folien eingeschweißt und

mittels HP-Scanner visualisiert und mittels AdobePhotoshop ausgewertet.

Fixierlösung

Ethanol (techn.) 50 % (v/v)


Waschpuffer

Ethanol (techn.) 30 % (v/v)

Natriumthiosulfatlösung

Natriumthiosulfat 0,8 mM

Imprägnierer

Silbernitrat 11,8 mM

Formaldehyd 6,7 mM

Entwickler

Natriumcarbonat 566 mM

Formaldehyd 6,7 mM

Natriumthiosulfat 0,02 mM

3.2.4.5. Analytische Auswertung der CyDye markierten Proteine

3.2.4.5.1. Quantifizierung der 2D-Gele

In Kooperation mit Herrn Dr. K. T. Junghanns und Dr. J. Thiermann (GE Healthcare,

Freiburg) wurden die CyDye markierten und aufgetrennten Proteine mittels DyCyder-

Software 6.5 quantitativ ausgewertet. Dazu wurden die in Low-Fluorescence-Gelplatten

befindlichen Gele mittels Typhoon Scanner 9400 entsprechend der korrespondierenden

Wellenlängen der CyDye-Fluorochrome eingescannt. Die Anregung erfolgte dabei mit drei


76

unterschiedlichen Lasern, um die Cy2-, Cy3- und Cy5-markierten Proteinmuster getrennt

voneinander zu detektieren. Anschließend wurden die drei gescannten Zustände

übereinander gelegt und die Cy3- und Cy5-markierten Proben über den internen

Cy2-Standard normiert und der Harnblase transgener Mäuse differenziell exprimierten

Proteinspots analysiert, quantifiziert und markiert, um sie aus dem Gel schneiden zu

können. Mittels der Software wurde die Gesamtzahl der Proteinspots ermittelt.

3.2.4.5.2. Tryptischer Verdau differentiell exprimierter Proteine

Kandidatenproteine wurden unter einem Luftschutzkäfig ausgeschnitten und in 0,2 ml

PCR-Tubes überführt. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.

Für die Massenspektrometrie-(MS-)Analyse mussten die ausgeschnittenen, silbergefärbten

Proteinspots aufgereinigt werden. Dazu wurden die Gelstücke mit 140 µl Wasser bei 42°C

und 600 rpm für acht Minuten im Thermomixer inkubiert und anschließend mit 140 µl

Waschlösung unter den gleichen Bedingungen gewaschen. Die Reduktion der Proteine

erfolgte durch Zugabe von 100 µl DTT für eine Stunde bei 56°C im Thermomixer

(600 rpm). Anschließend wurden die Gelstücke mit 140 µl Pufferlösung bei 42°C für acht

Minuten im Thermomixer gewaschen und die Proteine durch Zugabe von 100 µl

Iodoacetamid für 30 Minuten bei 25°C im Thermomixer alkyliert. Danach wurden die

Gelstücke jeweils dreimal abwechselnd mit 140 µl Pufferlösung und Ethanol (p.A.) für

acht Minuten bei 37°C im Thermomixer gewaschen. Durch Zugabe von 100 µl Acetonitril

für eine Minute bei 25°C im Thermomixer erfolgte der restliche Wasserentzug aus den

Gelstücken. Anschließend wurden die Gelstücke für mindestens 15 Minuten bei

Raumtemperatur getrocknet.

Die getrockneten Gelstücke wurden mit 10-20 µl Trypsin versetzt und 15 Minuten bei

37°C im Thermomixer (600 rpm) inkubiert. Waren die Gelstücke nicht vollständig benetzt,

wurde entsprechend Pufferlösung zugesetzt und erneut unter den gleichen Bedingungen

inkubiert und anschließend wieder überprüft. Daraufhin wurden die Proben über Nacht bei

37°C verdaut.


77

Waschlösung

Pufferlösung 50 % (v/v)

Ethanol 50 % (v/v)

Pufferlösung

Ammoniumbicarbonat 40 mM

DTT

DTT 10 mM

in Pufferlösung

IAA

IAA 55 mM

in Pufferlösung

Trypsin

Trypsin 20 µg in 40 µl 1mM Salzsäure lösen

Ansatz 1:50 mit Pufferlösung

verdünnen

3.2.4.5.3. Ankertarget-Präparation

Für die Messung wurden 1 µl Probe auf das Target aufgetragen, 1 µl Matrix dazu

pipettiert. Nach Lufttrocknung erfolgte ein Ankertarget-Waschschritt, indem 1 µl

0,1 %-ige TA-Lösung auf die Probe pipettiert und sofort wieder abgesaugt wurde. Durch

diese Prozedur wurden die Proben entsalzt. Die Umkristallisation erfolgte anschließend

durch Zusatz von 0,5 µl Umkristallisationslösung.

TFA-Lösung

TFA 0,1 %


78

TA-Lösung

0,1 % TFA/Aceton 2:1 (v/v)

Matrix

Spatelspitze HCCA in 400 µl TA-Lösung lösen, anschließend

abzentrifugieren und 1:10 mit Ethanol/Aceton (2:1) verdünnen

Umkristallisationslösung

Ethanol/Aceton/0,1 % TFA 6:3:1 (v/v)

3.2.4.5.4. MALDI-ToF-MS

In Kooperation mit Frau Dr. M. Schnölzer (DKFZ, Heidelberg) wurden differenziell

exprimierte Proteine aus den 2D-Gelen mittels Matrix-assisted Laser-Desorption Ionization

Time of Flight-Flugrohr Massenspektrometrie (MALDI-ToF-MS) identifiziert.

Ein Massenspektrometer besteht aus drei Teilen: die Ionenquelle, die gasförmige Protein-

Ionen erzeugt, dem Analysator, der die gasförmigen Bestandteile auftrennt und dem

Detektor, der die Protein-Ionen nachweist.

Für die Analyse der Proteine wurde die MALDI-ToF-MS genutzt. Dabei werden Proteine

oder Peptide in eine kristalline Matrix integriert, die zuvor auf einen Probenträger

aufgetragen wurde. Durch einen kurzen Beschuss mit einem Laserstrahl werden die

Proteine oder Peptide explosionsartig aus der Matrix als Ionen-Gas freigesetzt und

anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt, im Vakuum der Flugröhre nach dem

Quotienten aus Masse und Ladung (m/z) aufgetrennt und am Detektor gemessen. Die bis

zum Erreichen des Detektors benötigte Flugzeit (Time Of Flight) ist dabei proportional zur

Wurzel aus dem Verhältnis von Masse und Ladung (m/z). Einige Proteinionen zerfallen

während des Flugs im Analysator in Bruchstücke (PSD, Post source decay), die sich mit

gleicher Geschwindigkeit weiterbewegen wie das Mutterion, so dass im Mutterion-Gipfel

neben dem Mutterion als Hauptkomponente auch Bruchstücke vorliegen. Die

PSD-Analysen erfolgten im Kationenreflektormodus mit verzögerter Extraktion. Dabei

wurde das zu untersuchende Ion mit einer Genauigkeit von ± 40 Da ausgeblendet und die

Spannung des Reflektors schrittweise in 14 Stufen erniedrigt. Jedes Spektrum in den

einzelnen Segmenten wurde aus 200 individuellen Laserschüssen gemittelt. Anschließend


79

wurden alle Segmente mit der FAST Software (Bruker-Daltonik GmbH, Bremen) zu einem

Ionenfragmentspektrum gemittelt. Die Kalibrierung der Fragmentsprektren erfolgte mit

den Fragmentmassen des Adenocorticotropinhormons 18-39 (ACTH 18-39).

Alle MALDI-Massenspektren wurden auf einem Reflex II Time-of-Flight Instrument

(Bruker-Daltonics GmbH, Bremen) aufgenommen. Das Instrument war mit einer

SCOUT-26 Probenquelle und einem 337 nm Stickstofflaser ausgerüstet.

Massenspektren, die die Massen der tryptischen Peptide aufzeigten, wurden im

Positiv-Ionen-Reflektor-Modus mit verzögerter Extraktion (positiv ion reflector mode with

delayed extraction) aufgenommen. Die Spannung der Ionenbeschleunigung der

MALDI-Analyse betrug 26,5 kV, die des Reflektors 30,0 kV und die der Extraktionsplatte

20,6 kV. Die interne Kalibrierung erfolgte mit Hilfe der Zweipunktgeraden der beiden

Autolyseprodukte des Trypsins bei m/z 842,5 und m/z 2211,1.

Mit diesem übersetzten Peptidmassen-Fingerabdruck (peptide mass fingerprint) erfolgte

die Suche in Protein- und Genomdatenbanken, um Proteine zu finden, die eine

übereinstimmende Peptidmassenverteilung aufweisen.

3.2.4.5.5. Datenbanken

Die Eingabe für die Datenbanksuche erfolgte mit einfach geladenen, monoisotopischen

Peptidmassen. Bei der Suche in der NCBInr Datenbank dienten der ProFound Algorithmus

(http://129.85.19.192/prowl-cgi/ProFound.exe) und das Mascot Suchprogramm

(http://www.matrixscience.com) als Grundlage.

Um die Suche zu spezifizieren wurden isoelektrische Datenpunkte von 0-14 zugelassen,

oxidierte Methionine als mögliche Modifikationen sowie eine nicht erfolgte tryptische

Spaltung erlaubt und eine Abweichung der monoisotopischen Peptidmassen von

± 100 ppm bzw. ± 0,1 Da toleriert.

Dahingegen wurde der MS-Tag Algorithmus für die vergleichende Suche der

Fragmentmassen aus den PSD-Experimenten verwendet. Dieser Algorithmus war

Bestandteil der Prospector Protein Software. Als Suchkriterien wurden die möglichen

Massenabweichungen des Elternmoleküls von ± 0,1 Da und die der Ionenfragmente von

± 0,8 Da toleriert.


80

3.2.4.5.6. Extraktion für LCQ

Der Überstand der tryptisch verdauten Proben wurde abgenommen und in neue

PCR-Tubes überführt. Das Gelstück wurde mit 10-100 µl Acetonitril/Trifluoressigsäure-

Gemisch extrahiert, anschließend fünf Minuten im Ultraschallbad inkubiert, kurz

zentrifugiert und der Überstand mit dem tryptisch verdauten Überstand vereinigt. Diese

Extraktion wurde mit 0,1 %-iger Trifluoressigsäure und anschließend erneut mit

Acetonitril durchgeführt. Die vereinigten Überstände wurden in der Speedvac eingeengt.

Die Peptide wurden in 5-11 µl 0,1 %-iger Trifluoressigsäure resuspendiert, fünf Minuten

im Ultraschallbad inkubiert, erneut zentrifugiert und der Überstand in geeignete LCQ-

Behälter überführt.

Acetonitril/Triluoressigsäure-Gemisch

Acetonitril 50 % /v/v)

Trifluoressigsäure 0,1 % 50 % (v/v)

Trifluoressigsäure

Trifluoressigsäure 0,1 % (v/v)

3.2.4.5.7. ESI-MS/MS

Für die Identifizierung der tryptischen und extrahierten Peptide wurde eine nanoESI-QTof,

gekoppelt mit einer nano-CapLC, verwendet (Waters). Über die Steuerungssoftware Mass

Lynx 4.0 (Waters) erfolgte die Überwachung des Trennvorgangs und die Aufzeichnung der

MS/MS-Spektren. Zunächst wurden 5 µl Probenvolumen injiziert und über die Vorsäule

Symmetry 300 C18 (5 µm, Nano Ease, Waters) der nano-CapLC zugeführt. Die Trennung

und damit die Anreicherung der Peptide erfolgte über die nachgeschaltete Trennsäule

Reprosil-Pur C18 AQ (3 µm, 150 mm x 75 µm ID, Dr. Maisch GmbH Ammerbuch-

Entringen) bei einem konstanten Fluss von 200 nl/min. Der lineare Stufengradient von

94,9 % Wasser/0,1 % Ameisensäure/5 % Acetonitril auf 94,9 % Acetonitril/5 %

Wasser/0,1 % Ameisensäure betrug für die Elution der Peptide eine Stunde. Die Spannung

am ESI-Gerät wurde auf 2400 V eingestellt. Die Kalibrierung des Gerätes erfolgte vor

Versuchsbeginn über einen internen Standard.


81

Zunächst wurden Precursor Ionen in einem automatischen (data dependent analysis, DDA)

Experiment durch den Quadrupol herausgefiltert. Anschließend erfolgte von diesen

Precursor Ionen die Erzeugung der MS/MS-Spektren durch weitere

Fragmentierungsreaktionen.

Die Rohdaten der ESI-MS/MS Spektren wurden mit Protein Lynx Global Server

2.2 Software (Waters) prozessiert. Bei der Suche in der NCBInr Datenbank dienten

ebenfalls die Mascot Suchprogrammparameter als Grundlage. Zusätzlich wurde in der

Suche mögliche Desamidierungen mit eingeschlossen.

3.2.5. Immunologische Analysen

3.2.5.1. Immunpräzipitation

Für die Immunpräzipitation wurden 5 µl Rabbit anti-mouse COX-2 (Hase 82) Antikörper

mit 1 mg Proteinmenge gelöst in 1 ml COX-Puffer versetzt. Nach dem Zusatz von 60 µl

Protein-G Sepharose 4 Fast flow beads wurden die Proben im Überkopfschüttler bei 4°C

über Nacht inkubiert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für fünf Minuten bei

4000 rpm und 4°C in der Beckman-Zentrifuge (GPKR). Der Überstand wurde entnommen

und für eine weitere Immunpräzipitation mit 5 µl Rabbit anti-mouse COX-1 (Hase 50)

Antikörper für eine Stunde bei 4°C im Überkopfschüttler inkubiert. Daraufhin schloss sich

eine weitere Zentrifugation mit Entnahme des Überstandes an. Die Protein-G Sepharose

Immunpräzipitatpellets wurden danach mit 1 ml IP-Waschpuffer gewaschen und erneut für

fünf Minuten bei 4000 rpm und 4°C zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde insgesamt

5-mal durchgeführt. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Proben fünf Minute in der

Eppendorfzentrifuge (Biofuge 13) bei 13000 rpm und 4°C erneut zentrifugiert und der

Überstand anschließend abgenommen. Daraufhin erfolgte eine Resuspension der Beads in

60 µl 2x Laemmli Sample Buffer (LSB). In Vorbereitung für die Disk-Elektrophorese

wurden die Proben fünf Minuten bei 100°C im Thermoblock denaturiert, auf Eis Schock

gekühlt, fünf Minuten bei 13000 rpm in der Eppendorfzentrifuge zentrifugiert und 60 µl

des Überstandes auf ein 7,5%-iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen bzw. bei -20°C

gelagert.


82

IP-Waschpuffer

Tris/HCl 50 mM

EDTA 200 mM

Aprotenin 10 µg/ml

Leupeptin 10 µg/ml

pH 7.5

2x LSB (Laemmli Sample Buffer)

Glycin 2,6 M

SDS 0,2 M

PMSF 2 mM

2-Mercaptoethanol 10 % (v/v)


Upper-Tris 1x

3.2.5.2. Immunoblot (Western Blotting, Ponceau S Färbung und

Immunodetektion)

Für das Western Blotting wurde der „semidry“ Elektrotransfer verwendet. Entsprechend

der SDS-Gelgröße (16x12 cm) wurden 15 3 MM Whatmanfilter und eine PVDF-

(Polyvinyldifluorid-)Membran vorbereitet und in unterschiedlichen Puffern inkubiert. In

Transferrichtung wurden 6x 3 MM Whatmanfilter in Kathoden-Puffer, das SDS-Gel in

Kathoden-Puffer (Inkubation für fünf Minuten), PVDF-Membran in Anoden-Puffer II

(zuvor in Ethanol inkubiert), 3x 3 MM Whatmanfilter in Anoden-Puffer II und 6x 3 MM

Whatmanfilter in Anoden-Puffer I inkubiert und nach dem „Sandwich-Modell“

zusammengebaut. Zusätzlich wurde die Apparatur, ähnlich wie beim Kapillartransfer, mit

1 kg Gewicht beschwert, um einen gleichmäßigeren Tranfser zu erzielen.

Der Transfer erfolgte mit 0,8 mA pro cm2 Gel für zwei Stunden bei Raumtemperatur.

Anschließend wurde die Membran für circa zehn Sekunden in PBS gewaschen und bis zu

drei Minuten mit Ponceau S gefärbt, um die Markerbanden zu markieren und den Transfer

zu überprüfen. Nach der Entfärbung in Aqua bidest wurde wie nachfolgend beschrieben

die Immundetektion durchgeführt.


83

Anoden-Puffer I

Tris/HCl 0,3 M

Methanol 20 % (v/v)

pH 10,4

Anoden-Puffer II

Tris/HCl 25 mM

Methanol 20 % (v/v)

pH 10,4

Kathoden-Puffer

Tris/HCl 25 mM

-Amino-n-Capronsäure 40 mM

Methanol 20 % (v/v)

pH 9,4

Ponceau S

Ponceau S 0,5 % (w/v)

Essigsaure 0,1 % (v/v)

PBS (Phosphate buffered saline)

Natriumchlorid 137 mM

Kaliumchlorid 2,7 mM

Dinatriumhydrogenphosphat10,14 mM

Kaliumdihydrogenphosphat 1,8 mM

Immunodetektion mittels Tropix

Die entfärbte Membran wurde für eine Stunde unter Schütteln und bei Raumtemperatur in

30 ml I-Block Puffer inkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem

Primärantikörper über Nacht bei 4°C unter Schütteln. Danach wurde 6-mal fünf Minuten in

30 ml I-Block Puffer bei Raumtemperatur gewaschen. Der Sekundärantikörper konjugiert

mit Alkalischer Phosphatase (Tropix) inkubierte eine Stunde bei Raumtemperatur.


84

Daraufhin wurde die Membran erneut 6-mal fünf Minuten bei Raumtemperatur mit

I-Block Puffer gewaschen. Die darauf folgende Detektion des Antigens via

Chemiluminescence erfolgte mit dem Western Light Protein-Detection Kit von Tropix.

Entsprechend der Herstellerangaben wurde die Membran zweimal fünf Minuten in 20 ml

Assay-Puffer inkubiert. Anschließend erfolgte eine fünf minütige Inkubation in 4 ml

Nitroblock:CSPD-Substrat 1:20. Die Membran wurde in eine Entwicklungskassette

überführt und Fuji-Röntgenfilme mit unterschiedlichen Expositionszeiten entwickelt.

I-Block-Puffer (in PBS)

I-Block 0,2 % (w/v)

Tween-20 0,1 % (v/v)

Antikörper-Lösung

I-Block-Puffer 50 % (v/v)

Wasch-Puffer 50 % (v/v)

Immundetektion mittels ECL (GE Healthcare)

Die entfärbte Membran wurde für eine Stunde in Blocklösung bei Raumtemperatur

geschüttelt. Die Primärantikörperinkubation erfolgte bei 4°C über Nacht in Blocklösung

unter schütteln (150 rpm). Anschließend wurde die Membran 6-mal fünf Minuten in

Wasch-Puffer gewaschen und mit dem Sekundärantikörper für eine Stunde bei

Raumtemperatur in Blocklösung inkubiert. Nach erneuter Durchführung der Waschschritte

erfolgte die ECL-Entwicklung. Dazu wurden die Reagenzien A und B im Verhältnis 1:1

gemischt und eine Minute mit der Membran unter schwenken inkubiert. Die Membran

wurde leicht luftgetrocknet, in eine Entwicklungskassette überführt und Fuji-Röntgenfilme

mit unterschiedlichen Expositionszeiten entwickelt.

Blocklösung (in PBS)

Magermilchpulver 5 % (w/v)

Tween-20 0,1 % (v/v)


85

Wasch-Puffer (PBS-T)

Tween-20 0,1 % (v/v)

3.2.5.3. Herstellung von Kryogewebeschnitten

Die bei -70°C in Tissue Tek gelagerten Harnblasen wurden am Kryotom auf -28°C

erwärmt und in 5 µm dünne Präparate geschnitten. Die Dünnschnitte wurden sofort auf

beschichtete Objektträger (superfrost) fixiert und zwei Stunden bei Raumtemperatur

getrocknet und in Objektträgerkästen bei -70°C gelagert.

3.2.5.4. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

Die bei -70°C gelagerten Kryoschnitte wurden für mindestens zwei Stunden bei

Raumtemperatur aufgetaut. Daraufhin wurden die Dünnschnitte fünf Minuten in

Paraformaldehydlösung fixiert und anschließend zehn Minuten in PBS gewaschen. Nach

zwei bis drei Minuten Inkubation in Hämatoxylin wurde die Färbung durch Wässern für

eine Minute unter fließendem Leitungswasser gestoppt und die Präparate für 20 Sekunden

in HCl-Ethanol inkubiert. Nach erneutem Wässern für zehn Minuten wurden die

Gewebeschnitte eine Minute in Eosin gefärbt und anschließend die Färbung durch

Inkubation für eine Minute unter fließendem Leitungswasser gestoppt. Danach erfolgte die

Entwässerung der Präparate in einer aufsteigenden Alkoholreihe, d. h. je 2-mal zwei

Minuten in 70 %, 80 %, 90 %, 96 % und 100 % Ethanol. Nach 2-maliger Inkubation für je

fünf Minuten in Xylol wurden die Gewebeschnitte in Eukitt eingebettet, unter dem

Mikroskop ausgewertet und bei Raumtemperatur für weitere Untersuchungen gelagert.

Paraformaldehydlösung

Paraformaldehyd 1 % (v/v)


86

HCl-Ethanol

Salzsäure (25 %) 25 % (v/v)

Ethanol 70 % (v/v)

3.2.5.5. Immunfluoreszenz

Für die indirekten Doppel-/Immunfluoreszenzen wurden 5 µm Kryoschnitte verwendet. Zu

Beginn wurde das bei -70°C gelagerte Gewebe für zwei Stunden bei Raumtemperatur

aufgetaut und anschließend durch Inkubation in Aceton für 15 Sekunden fixiert, um das

Gewebe zu permeabilisieren und zu dehydratisieren, ohne dessen Struktur dabei zu

zerstören. Während der folgenden Lufttrocknung für fünf bis zehn Minuten wurde das

Gewebe mit einem PapPen umrandet und anschließend 2-mal für fünf Minuten in PBS

inkubiert. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren erfolgte eine Inkubation mit

50-100 µl pro Gewebeschnitt mit Blocklösung für eine Stunde bei Raumtemperatur in

einer Feuchtigkeitskammer. Anschließend wurden 50 µl des Primärantikörpers in

Blocklösung über Nacht bei 4°C in der Feuchtigkeitskammer inkubiert.

Nach 3-maligen waschen für je zehn Minuten in PBS wurden 50 µl des

Sekundärantikörpers in Blocklösung für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln in

der Feuchtigkeitskammer inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze erneut 3-mal für je

zehn Minuten in PBS gewaschen, in Mounting Medium luftblasenfrei mit Deckgläschen

abgedeckt und unter dem Carl Zeiss Fluoreszenzmikroskop mittels den entsprechenden

Fluoreszenzfiltern ausgewertet und für weitere Untersuchungen bei 4°C im Dunkeln

gelagert (Tabelle 14).

Tabelle 14 Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe

Fluorochrom Farbe Extinktion [nm] Emission [nm]

DAPI Blau 358 461

Cy3 Rot 550 570

AlexaFluor488 Grün 495 519


87

Blocklösung

ELISA-BSA 1 % (w/v)

3.2.5.6. Immunhistochemie

Im Unterschied zur Fluoreszenz erfolgte die Fixierung in Aceton für zehn Minuten und der

Sekundärantikörper ist nicht mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, sondern mit einer

Peroxidase, so dass nach Substratzugabe eine Farbreaktion erfolgt.

Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper in Blocklösung und dem 3-maligen

Waschen in PBS wurden die Gewebeschnitte nicht wie bei der Immunfluoreszenz in

Mounting Medium eingebettet, sondern mit 50 µl pro Gewebeschnitt mit DAB/H2O2 als

Substrat im Dunkeln inkubiert. Das DAB-Substrat (Diaminobenzidin) wird durch die

Peroxidase-Aktivität in einen braunen Farbstoff umgewandelt. Beim Erreichen der

gewünschten Färbeintensität, wurden die Objektträger für zehn Minuten gewässert,

anschließend eine Minute in Hämalaun gegengefärbt und die Färbung durch Wässern für

eine Minute unter fließendem Leitungswasser gestoppt. Anschließend wurden die

Präparate für 20 Sekunden in HCl-Ethanol inkubiert und erneut für 10 Minuten gewässert.

Danach wurden die Gewebeschnitte entwässert, indem sie jeweils zwei Minuten in 70 %,

80 %, 90 %, 96 % und 100 % Ethanol und 2-mal fünf Minuten in Xylol inkubierten.

Anschließend erfolgte das luftblasenfreie Einbetten in Eukitt und die Lagerung bei

Raumtemperatur.

Blocklösung

ELISA-BSA 1 % (w/v)

Tween-20 0,1 % (v/v) bei Nrf-2

DAB-Substrat

1 Tablette Wasserstoffperoxid

1 Tablette DAB

in 1 ml Wasser


88

HCl-Alkohol

Salzsäure (25 %) 25 % (v/v)

Ethanol 70 % (v/v)

3.2.6. Molekularbiologische Analysen

3.2.6.1. Ras-GTPase Assay

Entsprechend den Angaben nach Upstate wurden die unter 3.2.3.3 erhaltenen Proben für

eine Positivkontrolle (Ansatz mit 100 µM -S-GTP versetzt), für eine Negativkontrolle

(Ansatz mit 100 µM GDP versetzt) und als Pull-down (PD)-Ansätze (Probe ohne Zusatz)

eingesetzt.

Nach dem Zusatz der Positivkontrolle bzw. Negativkontrolle inkubierten die Ansätze für

30 min bei 30°C. Danach wurde die Ladereaktion in den Kontrollen durch den Zusatz von

32 µl 1 M Magnesiumchlorid gestoppt. Anschließend wurden 20 µg Raf-1-RBD-Agarose

zu den Reaktionsansätzen gegeben, die eine Stunde bei 4°C im Überkopfschüttler

inkubierten. Danach wurden die Beads durch Zentrifugation für fünf Minuten bei

4000 rpm und 4°C pelletiert, der klare Überstand vorsichtig abgenommen, die Beads mit

500 µl MLB-Puffer gewaschen und erneut zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde

insgesamt dreimal durchgeführt. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Beads in 50 µl

2x LSB resuspendiert, fünf Minuten bei 100°C gekocht, auf Eis Schock gekühlt und fünf

Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Die Lagerung erfolgte bei -20°C bzw. die Proben

wurden gleich auf 15 %-ige SDS-Gele überführt und Immunoblots durchgeführt.

5x MLB-Puffer

1x MLB

2x LSB-Puffer

s.Seite 81 ff.


89

3.2.6.2. Nucleinsäureanalytik

3.2.6.2.1. DNA-Isolierung für Genotypisierungsanalysen

Die DNA-Isolierung aus Mausschwänzen bzw. -ohren erfolgte mittels PCR Lysis Reagent

von Viagen. Dazu wurden 200 µl Lysis Reagent mit dem jeweiligen Gewebe für 45 min

bei 85°C inkubiert und anschließend 1-2 µl des Reaktionsansatzes für die Polymerase-

Ketten-Reaktion eingesetzt.

3.2.6.2.2. Bestimmung der DNA-/RNA-Konzentration

Die Bestimmung der DNA-/RNA-Konzentrationen erfolgte durch eine Messung der

optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm mittels Nano Drop.

Eine OD von eins bei 260 nm entspricht dabei einer Konzentration an doppelsträngiger

DNA von 50 µg/ml bzw. an einzelsträngiger RNA von 40 µg/ml.

3.2.6.2.3. cDNA-Synthese (Reverse Transkriptase-Polymerase-

Ketten-Reaktion, RT-PCR)

Für die RT-Reaktion wurden 1 µg RNA in 3-6 µl Wasser aufgenommen und denaturiert.

Anschließend erfolgte nach dem Zusatz von 17-34 µl Reaktionsansatz die RT-Reaktion.

Aus diesem Reaktionsansatz wurden direkt 1-3 µl neusynthetisierte cDNA für die

nachfolgende PCR eingesetzt. Daher handelt es sich hierbei um eine Zweistufen-RT-PCR-

Reaktion.

Denaturierung

65°C 5 min

4°C

RT-Reaktion (cDNA-Synthese)

42°C 15 min

99°C 5 min

4°C


90

Tabelle 15 Reaktionsansatz für die RT-Reaktion mit 20 µl Reaktionsvolumen

Komponente Volumen [µl]

25 mM Magnesiumchlorid 4

10x Puffer 2

50 µM oligo(dT)-Primer 1

je 10 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP je 2

RNase Inhibitor (20 U/µl) 1

MuLV Reverse Transkriptase (50 U/µl) 1

3.2.6.2.4. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die eingesetzten Primer wurden chemisch synthetisiert und sind in Tabelle 7

zusammengefasst.

Der Reaktionsansatz (Tabelle 16) wurde zunächst für fünf Minuten auf 95°C erhitzt, um

DNA-Einzelstränge zu erhalten. Anschließend erfolgte eine Abkühlung des

Reaktionsansatzes für anderthalb Minuten, um die Hybridisierung der Primer an die

DNA-Einzelstränge zu ermöglichen. Von diesen ausgehend wurden nun in beiden

Richtungen komplementäre DNA-Stränge bei 72°C für zweieinhalb Minuten neu

synthetisiert. Anschließend wurde der Reaktionsansatz auf 94°C für anderthalb Minuten

erhitzt, um erneut Einzelstränge zu erhalten. Wiederholtes Abkühlen führte zum

Hybridisieren der Primer an die DNA-Einzelstränge. Dieser Zyklusschritt der dreistufigen

PCR wurde 30-40-mal durchgeführt. Mit jedem neuen Zyklus kam es zu einem

exponentiellen Anstieg der neu-synthetisierten DNA.

Nach dem letzten Zyklus wurden für zehn Minuten 72°C gehalten, um unvollständige

DNA-Fragmente zu vervollständigen. Anschließend wurden die Proben auf 4°C gekühlt

und bis zum Auftrag auf ein Agarosegel bei dieser Temperatur gelagert (s.

Abbildung 24).


91

Tabelle 16 Reaktionsansatz für die PCR

Komponente Volumen [µl]

(c)DNA-Template 1 - 2

Primer forward (400 pmol) 1,25

Primer reverse (400 pmol) 1,25

dNTPs (je 10 mM) 0,4

10x Red Taq Puffer 2,5

Red Taq Polymerase 1,25

HPLC Wasser 17,25

Abbildung 24 Schematische Darstellung des Temperatur-Zeit-Profils einer dreistufigen PCR; D = Denaturierung;

S = Synthese; A = Annealing der Primer; RT = Raumtemperatur

3.2.6.2.5. Agarosegel

Zur Überprüfung der PCR-Reaktion unter 3.2.6.2.4 wurden 10 µl des

PCR-Reaktionsansatzes sowie 5 µl 1 kbp- bzw. 100 bp-DNA-Marker auf ein 1 %-iges

Agarosegel aufgetragen. Der Lauf erfolgte 45-90 min bei 120 V.

RT

S

A

EndeAbschlusssyntheseSchleife

30-40 mal Zyklus 1

Zeit

Temperatur

D


92

Agarosegel (in TBE)

Agarose 1,0 % (w/v)

TBE-Puffer

Tris/HCl 0,1 M

Börsäure 89 mM

EDTA 1 mM

pH 8.5

3.2.7. Lipidanalytik

3.2.7.1. Isolierung von Prostaglandinen (Powell)

Um Prostaglandine (PG) aus Medium oder Blutplasma zu gewinnen, wurde 1 ml

Probenmaterial mit 2 µl 1 N HCl auf pH 3,5 eingestellt. Nach dem Zusatz von 4 ml

Ethylacetat wurden die Proben 30 Sekunden gevortext, fünf Minuten bei 4000 rpm in der

Beckman-Zentrifuge zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abgenommen und die untere

Phase erneut mit 2 ml Ethylacetat extrahiert. Nach dem Vereinigen der Überstände wurde

das Ethylacetat mittels der Speedvac Vakuumzentrifuge verdampft, das Lipidpellet in 1 ml

Ethanol resuspendiert und die Proben auf Eis überführt.

Für eine Lipidextraktion aus dem Blasengewebe wurde dieses zunächst für eine Minute bei

2500 rpm mittels Mikrodismembrator unter Stickstoffkühlung pulverisiert. Anschließend

wurde das pulverisierte Gewebe in 1 ml Ethanol aufgenommen und 30 Sekunden gevortext

und auf Eis gehalten. Nach dem Zentrifugieren für zehn Minuten bei 4000 rpm und 4°C in

der Beckman-Zentrifuge wurde der Überstand in 4°C gekühlte Hecht Assistent Gläser

überführt. Das Pellet wurde in 1 ml 8 M Harnstoff gelöst und einer Proteinbestimmung

nach Bradford unterzogen.

Die erhaltenen Überstände wurden mit einer Natriumformiatlösung auf eine 15 %-ige

Ethanollösung eingestellt und bis zur Reversed-Phase Chromatographie auf Eis gelagert.


93

Natriumformiatlösung

Natriumformiat 0,1 M

pH 3,1

3.2.7.2. Anreicherung der Eicosanoide mittels Reversed-Phase

Chromatographie

Für die Anreicherung wurden 6 ml Silica-C18-Glasfiltersäulen mit 500 mg

Octadecyl-C18-Matrix verwendet. Über die SPU-Adsorbex-Säuleneinheit wurde ein

Unterdruck von bis zu 12 mbar während der Wasch- und Äquilibrierungsschritte erzeugt.

Zu Beginn wurden die Säulen mit 5 ml Ethylacetat (Lichrosolve), anschließend mit

Ethanol und Aqua bidest für den Probenauftrag vorbereitet.

Der Probenauftrag auf die Säulen erfolgte bei einem Druck von 2,5 mbar. Anschließend

erfolgte jeweils mit 5 ml 15%-igen Ethanol, Aqua bidest, 30 Sekunden Luftatmosphäre

und 5 ml n-Hexan eine Interferenzelution bei 12 mbar. Die Elution der Eicosanoide

erfolgte in 4 ml Ethylacetat bei Überdruck. Die Proben wurden anschließend bei -20°C

gelagert bzw. für den Enzym-Immunosorb-Assay weiter aufgearbeitet, in dem das

Ethylacetat in der Speedvac Vakuumzentrifuge verdampft und das Lipidgemisch in 500 µl

EIA-Puffer resuspendiert wurde. Die Proben wurden sofort für den Enzym-Immunosorb-

Assay eingesetzt oder bei -20°C gelagert.

3.2.7.3. Enzym-Immunosorb-Assay (EIA)

Mit Hilfe der Enzym-Immunosorb-Assays wurden die Mengen an 15-deoxy-Δ12,14

-PGJ2,

PGF2α, 6-keto-PGF1 bzw. PGE2 der zu untersuchenden Proben ermittelt.

Entsprechend der Angaben des Herstellers Cayman erfolgte für die PGF2α-, 6-keto-PGF1-

bzw. PGE2-Assays die Aufnahme des PG-Tracers, der PG-Standard Verdünnungsreihe

sowie des PG-Antikörpers in EIA-Puffer. Das Ellmann-Reagenz wurde kurz vor dem

Gebrauch in Aqua pure gelöst und im Dunkeln aufbewahrt.


94

Für die Bestimmung der Prostaglandinmenge wurden die Proben aus der Lipidextraktion

nach Powell herangezogen (s. 3.2.7.1), die in EIA-Puffer aufgenommen waren und bei

-20°C lagerten.

Nach dem Auftauen wurde eine geeignete Verdünnungsreihe der Proben in EIA-Puffer bei

4°C erstellt. 50 µl Probenansätze bzw. des Standards wurden daraufhin in Vertiefungen

von 96-Well-Immunosorbplatten (Cayman) überführt und jeweils mit 50 µl Tracer sowie

PG-Antiserum versetzt und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert. Danach wurden die

Reaktionsansätze fünfmal mit jeweils 200 µl pro Vertiefung mit Cayman-Waschpuffer

gewaschen und anschließend mit 200 µl pro Vertiefung Ellmanns-Reagenz versetzt und im

Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Intensitätszunahme des im Reaktionsansatz entstandenen gelben Farbstoffs wurde

photometrisch bei 405 nm am ELISA-Reader Elx800 über einen Zeitraum von sechs

Stunden verfolgt. Messungen erfolgten dabei nach 15, 30, 60, 120, 180, 240 und

360 Minuten.

Die Bestimmung der 15-deoxy-Δ12,14

-PGJ2-Menge nach dem Protokoll von Assay-Design

weicht von der Durchführung nach Cayman ab. Nach der Vorschrift von Assay-Design

wurden 100 µl Probenmaterial bzw. Standard in Vertiefungen von 96-Well-

Immunosorbplatten überführt, mit je 50 µl Tracer und 15d-PGJ2-Konjugat versetzt und

anschließend zwei Stunden bei 500 rpm und Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden

die Reaktionsansätze 3-mal mit 400 µl pro Vertiefung mit Waschpuffer gewaschen und

trocken geklopft. Nach dem Zusatz von 200 µl Farbreagenz inkubierten die

Reaktionsansätze für drei Stunden im Dunkeln bei 37°C. Die Farbreaktion wurde durch

den Zusatz von 50 µl Stopplösung gestoppt und die Proben sofort bei 405 nm am ELISA-

Reader Elx800 vermessen.

Über die sigmoidal verlaufende Standardeichkurve wurde die Prostaglandinmenge bezogen

auf die Gesamtproteinmenge der jeweiligen Probe bzw. auf 1 ml Volumen ermittelt. Die

Standardeichkurve unterliegt einer logistischen Wachstumsverteilung mit dem Formelsatz:

Nur die Datensätze im linearen Anstieg wurden für die Bestimmung der PG-Menge

herangezogen.

y = A1 - A2

1 + (x/x0)p

+ A2


95

3.2.8. In vitro Analysen

3.2.8.1. Kulturbedingungen

Die eingesetzten Zelllinien RT112 und 5637 wurden bei 37°C und 5 % Kohlenstoffdioxid-

Sättigung kultiviert.

Beim Passagieren wurden die Zellen mit 5 ml PBS gewaschen, mit 1 ml Trypsin

beschichtet, 10 min bei 37°C inkubiert und anschließend in 10 ml frisches Medium

resuspendiert, in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt und 106 Zellen in neue

T150-Kulturflaschen überführt.

3.2.8.2. AmplexRed Assay

Der AmplexRed Assay basiert auf dem fluorometrischen Nachweis von

Wasserstoffperoxid in lebenden Zellen. Dabei wird in Anwesenheit der Horseradish

Peroxidase (HRP) in einer stöchiometrischen Reaktion Wasserstoffperoxid mit

AmplexRed im Verhältnis 1:1 zu Resorufin (Absorption 571 nm, Extinktion 585 nm)

umgesetzt. Die Empfindlichkeit des Assays liegt bei 50 nM Wasserstoffperoxid.

Für den Assay wurden 750.000 Zellen in 60 mm Kulturschalen für 24 Stunden kultiviert

und anschließend für weitere 24 Stunden mit dem COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib

sowie in Kombination mit steigenden Konzentrationen an PGE2 inkubiert.

Entsprechend der Herstellerangaben erfolgte eine Vorbehandlung einer 96-Wellplatte, in

dem in jedes Well 100 µl bzw. 50 µl beim Standard Reaktionsmix vorgelegt und die Platte

für zehn Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Durch Zusatz von 20 µl Zellsuspension

(30.000 Zellen in Krebs-Ringer-Phosphat-Glucose-Lösung, KRPG) zum Reaktionsansatz

bzw. 50 µl Wasserstoffperoxid-Standard (Konzentration von 0,25 mM bis 8 mM) wurde

der AmplexRed Assay gestartet, die Platte erneut bei 37°C inkubiert und die Reaktion über

einen Zeitlauf von 24 Stunden photometrisch bei 560 nm am Fluoreszenzmessgerät Viktor

verfolgt. Die Auswertung erfolgte für 120 Minuten.


96

KRPG-Lösung

Natriumchlorid 0,145 M

Natriumphosphat 5,6 mM

Kaliumchlorid 4,86 mM

Calciumchlorid 0,54 mM

Magnesiumsulfat 1,22 mM

Glucose 5,5 mM

pH 7,35

AmplexRed-Kit

3.2.8.3. Kulturbedingung für immunhistologische Analysen

Für immunhistochemische Untersuchungen wurden 750.000 Zellen auf

Multiwell-Objektträger für 48 Stunden kultiviert und anschließend für weitere 24 Stunden

mit dem selektiven COX-2 Inhibitor Celecoxib sowie in Kombination mit steigenden

Konzentrationen an PGE2 inkubiert. Nach dem Waschen in PBS wurden die Objektträger

für 10 min in Aceton fixiert und wie unter 3.2.5.6 weiterbehandelt.

3.2.9. Statistik

Statistische Analysen zur Bestimmung der Signifikanzen wurden für alle Experimente mit

SigmaPlot und DyCyder 6.5 durchgeführt und der unpaired Student´s t-Test gewählt. Die

Bestimmungen der Signifikanzen erfolgten gegen die Kontrollwerte. Der p-Value ist eine

Wahrscheinlichkeit mit einem Wertebereich von 0 bis 1. In dieser Arbeit wurden alle

Datenätze, deren p-Value < 0,05 waren, als statistisch signifikant, innerhalb des

Konfidenzbereichs von 95 %, betrachtet.

Kapitel 4 Ergebnisse

97


4.1. Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Mausmodell

Um die Rolle der COX-2 in der Harnblase studieren zu können, wurde die in der

Arbeitsgruppe generierte K5.COX-2 transgene Mauslinie verwendet. Dabei steht die

COX-2 full-length cDNA unter der Kontrolle des bovinen Keratin 5-Promotors (K5), so

dass es zu einer konstitutiven Überexpression des COX-2 Proteins in den basalen

Epithelschichten (Mucosa) der Harnblase kommt, da Keratin 5 ein Bestandteil der

Intermediärfilamente basaler, proliferationsaktiver Keratinozyten ist (Abbildung 25A, B).

In dieser Arbeit erfolgte fast ausschließlich die Analyse an weiblichen homozygoten

Tieren der K5.COX-2 transgenen Mauslinie 675+/+

. Die homozygoten Tiere zeichneten

sich im Vergleich zu NMRI-Wildtyptieren durch ein struppig und fettig erscheinendes

Haarkleid aus, das ab dem dritten Monat nach der Geburt in eine starke Alopezie überging

(Abbildung 25C). Ferner kam es zu einem verstärkt, ausgeprägten Krallenwachstum an

Hinter- und Vorderfüßen der homozygoten Tiere. Die K5.COX-2 transgenen Mäuse

wirkten im Vergleich zu ihren gleichaltrigen NMRI-Kontrolltieren zierlicher und

zeichneten sich zudem durch ein geringeres Fettgewebe aus. Dieser bei homozygoten

transgenen Mäusen beobachtete Phänotyp war in heterozygoten transgenen Tieren

geringfügig schwächer ausgeprägt (161).


98

Abbildung 25 Die Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Maus. In dem transgenen Mausmodell steht die COX-2

full-length cDNA (A) unter der Kontrolle des Keratin 5-Promotors, so dass es zu einer Überexpression des

Proteins in der basalen Epithelschicht (*) der Harnblase transgener Tiere (tr) kommt (B). K5.COX-2 transgene

Tiere zeichnen sich im Vergleich zu Wildtyp NMRI-Kontrolltieren (wt) durch ein fettiges, strähniges und dünnes

Haarkleid aus sowie extrem langen Krallen (C).

wt

tr

wt

COX-2 splice + pABoviner K5 Promoter

Mucosa Submucosa

Deckschicht

Lumen des Urothels

A

B C

*

*

tr

**

*** * **

*

***

*

**

*

*

**

**

**

**

**

**

**

**

**

**

*

*

*

*

***

*

**

** * *** ****

**

**

**

***********


99

4.2. COX-2 Proteinexpression und Prostaglandinprofile in der Harnblase transgener Mäuse

4.2.1. Expression und immunhistochemische Lokalisation von

COX-Isoenzymen

Die COX-2 cDNA steht unter der Kontrolle des K5-Promotors, so dass es zu einer

konstitutiven Überexpression von COX-2 in der Harnblase kommt. Mittels RT-PCR

erfolgte die Analyse der COX-2 Expression in sieben und 12 Wochen alter Harnblase von

transgenen und Wildtyptieren. Wie aus Abbildung 26A hervorgeht, zeigte eine semi-

quantitative Auswertung der IDV (intensive density value) der RT-PCR Analyse über

-Aktin eine signifikante Erhöhung der COX-2 RNA-Menge sowohl in sieben als auch in

12 Wochen alter Harnblase transgener Mäuse verglichen mit Wildtyptieren (> 1,5;

p-Value < 0,005), während die COX-1 RNA-Menge unverändert war. Um die COX-2

Expression auf Proteinebene zu überprüfen, erfolgte eine Immunpräzipitation der

COX-Isoenzyme von sechs Monate alten transgenen Tieren. Mittels anschließendem

Immunoblot konnte nur in der Harnblase von transgenen Mäusen eine COX-2 Expression

nachgewiesen werden (Abbildung 26B). Die Expression des COX-1 Isoenzyms war in

beiden Genotypen konstitutiv und vergleichbar stark.

Keratin 5 ist ein Bestandteil der Intermediärfilamente basaler, proliferationsaktiver

Keranozyten, so dass es durch den K5-Promotor zu einer gerichteten COX-2 Expression in

diesem Kompartiment kommen sollte. Mittels indirekter Immunfluoreszenz-Analyse

erfolgte die Lokalisation von COX-2 in sechs Monate alter nicht-hyperplastischer und

hyperplastischer Harnblasenschleimhaut transgener sowie Wildtyptiere. Keratin 5 wurde

im basalen Harnblasenepithel von Wildtyptieren sowie in nicht-hyperplastischer und

hyperplastischer Schleimhaut transgener Mäuse detektiert (Abbildung 27A, B). Im

hyperplastischen Epithel erstreckte sich die K5 Expression in den suprabasalen und

luminalen Bereich (Abbildung 27C). Eine Expression von COX-2 konnte nur im

transgenen basalen und luminalen Blasenepithel detektiert werden (Abbildung 27D-F).

Wie Abbildung 27 zeigt, konnte eine eindeutige Co-Lokalisation von Keratin 5 und

COX-2 vom basalen zum luminalen Epithel in der Harnblase transgener Mäuse detektiert

werden.


100

Abbildung 26 Expression von COX-Isoenzymen in K5.COX-2 transgener und Wildtypharnblase.

A) RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von COX-1 und COX-2 in 7-12 Wochen (Wo) alter Wildtyp- (wt)

und K5.COX-2 transgener (tr) Harnblaser. Semi-quantitative Analyse über β-Aktin als interne Kontrolle zeigte in

der Harnblase von 7 und 12 Wochen alten transgenen Mäusen eine signifikante Erhöhung der COX-2 RNA-

Menge (> 1,5; p-Value < 0,005), während die COX-1 RNA-Menge unverändert war. n = 3 Tiere pro Gruppe.

DNA-Größenstandards: M1= GeneRuler 1 kb DNA Leiter, M2 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. Student´s t-Test.

B) Immunoblot-Analyse der COX-Isoformen 1 und 2 in der Harnblase von 6 Monate alten Wildtyp- und

homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen mittels Immunopräzipitation. Nur in der Harnblase von transgenen

Mäusen konnte die Expression von COX-2 nachgewiesen werden, während die COX-1 Expression unverändert

war. 7,5 %-iges SDS-Polyacrylamidgel. n = 3 Tiere pro Gruppe, kDa = Molekulargewicht des Referenzproteins in

Kilodalton, * Kreuzreaktion des Antikörpers mit IgG.

COX-1

66

wt tr

COX-2

66

kDa

*

*

A

- COX-2

- COX-1

- -Aktin

600 -

500 -

500 -

M1 M2 wt tr wt tr

7 Wo

(-)bp

12 Wo

7 Wo 12 Wo

0

25

50

75

100

125

150

175

IDV

CO

X-1

/-2 /

ID

V

-Ak

tin

[% w

t]

Kontrolle (wt)

COX-1

COX-2

B


101

Abbildung 27 Immunolokalisation von Keratin 5 und COX-2 im basalen Epithel der Harnblase. In Kryoschnitten

der Harnblase von 6 Monate alter weiblicher Wildtyp- (A, D, G) und K5.COX-2 transgener, nicht-

hyperplastischer (B, E, H) sowie hyperplastischer (C, F, I) Harnblasenschleimhaut erfolgte die Analyse der

Lokalisation von Keratin 5 (A-C) und die COX-2 Expression (D-F) durch indirekte Doppelimmunfluoreszenz.

Keratin 5 (K5) ist als rotes Cy3- und COX-2 als grünes AlexaFluor488-Fluoreszenzsignal zu erkennen. In den

übereinandergelagerten K5-COX-2-Bildern (G-H), in denen die Zellkerne zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff

blau angefärbt wurden, ist eine eindeutige Kolokalisation von beiden Antigenen im basalen und suprabasalen

Eptihel in der Harnblase von den homozygoten transgenen Mäusen gezeigt (H, I). Vergrößerung: x 40, x 63 (C, F,

I).

Zusätzlich wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz die COX-1 Lokalisation in der

Harnblase sechs Monate alter Mäuse analysiert. Wie aus Abbildung 28 ersichtlich ist,

erfolgte die COX-1 Expression in der Tunica muscularis und in den Blutgefäßen der

Harnblase transgener (Abbildung 28A, B) und Wildtyptiere (Abbildung 28C, D).

wt

basal

luminal

A

D

G

B

E

H

C

F

I

suprabasal

tr

nicht hyperplastisch hyperplastisch

Keratin 5

COX-2

Keratin-5, COX-2, Hoechst


102

Abbildung 28 Immunolokalisation von COX-1 in der Tunica muscularis und in Blutgefäßen der Harnblase. In

Kryoschnitte der Harnblase von 6 Monate alten weiblichen Wildtyp- (C, D) und K5.COX-2 transgenen (A, B)

Mäusen wurden die COX-1 Expression durch indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen. Die Zellkerne wurden

zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt. Die Expression von COX-1 erfolgte in der Tunica muscularis

sowie in den Blutgefäßen der Harnblase von transgenen und Wildtyptieren. Vergrößerung: x 40.

4.2.2. Erhöhte Prostaglandinspiegel in der Harnblase transgener Mäuse

Um zu überprüfen, ob die erhöhte COX-2 Expression in transgenen Mäusen zu

veränderten Prostaglandinkonzentrationen führte, erfolgte mittels spezifischen Enzym-

Immunosorb-Assays die Analyse der Eicosanoide PGE2, PGF2, 15-deoxy-Δ12,14

-PGJ2,

einem dehydratisierten Metaboliten des PGD2, und 6-keto-PGF1, einem stabilen

Metaboliten des PGI2, im Plasma sowie in der Harnblase sieben Wochen alter weiblicher

Mäuse. Um geschlechtsabhängige Effekte auszuschließen, erfolgte zusätzlich die Analyse

der Eicosanoide PGE2, PGF2 und 6-keto-PGF1 in männlicher Harnblase gleichaltriger

Mäuse. Zu diesem Zeitpunkt hatten die transgenen Mäuse den Phänotyp noch nicht voll

ausgebildet, dennoch waren sowohl in weiblicher (w) als auch in männlicher (m)

tr

wt

Lamina muscularis Blutgefäße

A

C

B

D


103

Harnblase transgener Mäuse der PGE2-Spiegel 1,8 bzw. 2-fach und der PGF2-Spiegel

signifikant (p-Value < 0,02) 1,7 bzw. 2,3-fach erhöht (Abbildung 29). Im Plasma

weiblicher transgener Mäuse waren hingegen sowohl der PGE2- als auch der

PGF2-Spiegel signifikant (p-Value < 0,001) 4,2 bzw. 2,5-fach erhöht. Nahezu unverändert

waren der 6-keto-PGF1-Spiegel in der Harnblase sowie 15-deoxy-Δ12,14

-PGJ2-Spiegel im

Plasma transgener Mäuse.

Abbildung 29 Prostaglandinbestimmung in der Harnblase sowie im Plasma von 7 Wochen weiblichen (w) und

männlichen (m) homozygoten COX-2 transgenen und Wildtyptieren. Sowohl in weiblicher (w) als auch in

männlicher (m) Harnblase transgener Mäuse war der PGE2-Spiegel leicht (> 1,8) und der PGF2-Spiegel (> 1,7)

signifikant erhöht, während im Plasma transgener Mäuse sowohl der PGF2 als auch der PGE2-Spiegel (> 2,5)

signifikant erhöht waren. Unverändert hingegen waren der 6-keto-PGF1- sowie PGJ2-Spiegel. Die Mittelwerte

ergeben sich aus n = 5 Werte ± SD. Student´s t-Test; * Harnbase: p-Value < 0,02; Plasma: p-Value < 0,001.

wt tr0

40

80

120

160

200

240

Plasma

*

m

PGE2

PGF2

6-keto-PGF1

PGJ2

Harnblase

wt tr0

4

8

400

450

500

**

[pg

PG/m

gP

rote

in]

w

wt tr0

40

80

120

160

200

240

*

[pg

PG/m

gP

rote

in]

w


104

Da weibliche und männliche Harnblasen transgener Mäuse die gleichen Tendenzen

hinsichtlich ihrer erhöhten COX-2 Expression (ohne Abbildung) als auch ihrer

Prostaglandinprofile zeigten, konnte von geschlechtsunabhängigen Effekten ausgegangen

werden und die weiteren Analysen erfolgte nur noch mit weiblichen Mäusen.

Nach Ausbildung des transgenen Phänotyps wurden die Prostaglandinkonzentrationen von

PGE2 und PGF2 in sechs Monate alten Mäusen erneut bestimmt. Um dabei zu überprüfen,

ob ein direkter Zusammenhang zu den bereits beobachteten erhöhten Prostaglandinprofilen

und der transgenbedingten COX-2 Überexpression besteht, wurden transgene Mäuse ab

dem ersten Tag ihrer Geburt mit dem COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib®

(CX) in einer

Konzentration von 1500 ppm gefüttert und deren Prostaglandinkonzentrationen ebenfalls

bestimmt. Diese behandelten Mäuse zeigten keine Ausbildung des unter 4.1 beschriebenen

Phänotyps.

Wie Abbildung 30 zeigt, waren in Harnblase transgener Mäuse der PGE2- und PGF2-

Spiegel signifikant 1,8 (p-Value 0,02) bzw. 2-fach (p-Value 0,025) erhöht. Die CX-

Behandlung in den transgenen Mäusen zeigte eine signifikante Reduktion der erhöhten

Prostaglandinspiegel auf Wildtypniveau (PGE2: p-Value 0,025 und PGF2: p-Value 0,005).

Dies zeigt, dass die erhöhten Prostaglandinlevel auf die transgenbedingte COX-2

Überexpression zurückzuführen waren.


105

wt tr tr + CX0

10

20

30

40

50

60

70

80

+

+

*

[pg

PG/m

gP

rote

in]

PGE2

PGF2*

Abbildung 30 Prostaglandinbestimmung in der Harnblase von 6 Monate alten COX-2 transgenen und

Wildtyptieren nach Celecoxibbehandlung. In Harnblase transgener Mäuse waren der PGE2- sowie PGF2-Spiegel

signifikant erhöht, während diese in Celecoxib behandelten transgenen Mäusen signifikant auf Wildtypniveau

reduziert waren. Die Mittelwerte ergeben sich aus n = 3-4 Werte ± SEM. Student´s t-Test; * p-Value 0,02 (bezogen

auf wt); + p-Value < 0,025 (bezogen auf tr).

4.3. Eine Proliferationsstörung bedingt Hyperplasie und spontane

Tumorentstehung

Die Bestimmung der Prostaglandinkonzentrationen zeigte eine signifikante Erhöhung an

PGE2 in Harnblase transgener Mäuse. Da PGE2 in vielen physiologischen Prozessen wie

z. B. Angiogenese, Immunantwort, Apoptose und Zellproliferation involviert ist

(74;84;90;118), erfolgte die histologische Analyse HE-gefärbter Kryoschnitte von sechs

und 12 Monate alten Mäusen. Die histologische Untersuchung zeigte, wie in Abbildung 31

dargestellt, eine spontane Entwicklung einer Hyperplasie (TCH, transitional cell

hyperplasia) in Harnblase transgener Mäuse. Auffällig war die Mehrlagigkeit des Epithels

im Transgen (Abbildung 31B) verglichen zu den zwei bis vier Zelllagen im Wildtyp

(Abbildung 31A). Die Celecoxibbehandlung in transgenen Mäusen reduzierte die

Entwicklung der Hyperplasie (Abbildung 31C). R. Klein konnte in diesem Zusammenhang


106

eine Vergrößerung und Zunahme der Blutgefäße in der Harnblase K5.COX-2 transgener

Mäuse detektieren (13).

Die graphische Auswertung der histologischen Analyse in Abbildung 31D spiegelt die

Häufigkeit des Auftretens an Hyperplasien in den unbehandelten und behandelten Gruppen

Abbildung 31 Effekt einer Celecoxibbehandlung von 6 bzw. 12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen

Mäusen auf die Hyperplasie. HE-gefärbte Kryoschnitte der Harnblase von 12 Monate alten Wildtyptieren (A),

homozygoten K5.COX-2 trangenen Mäusen (B) sowie trangenen Tieren, die ab dem ersten Tag ihrer Geburt mit

einer Celecoxibdiät (1500 ppm) gefüttert wurden (C). Zu erkennen ist dabei die Verminderung der Hyperplasie in

Celecoxib behandelten transgenen Mäusen (C) auf Wildtypniveau (A) verglichen mit unbehandelten Transgenen

(B). Durch eine histologische Analyse (D) wurde der prozentuale Anteil der Hyperplasien in 6 und 12 Monate

alten Celecoxib behandelten und unbehandelten transgenen Mäusen ermittelt und gegenübergestellt. Zu erkennen

waren dabei die signifikanten Unterschiede nach dem Student´s t-Test mit p < 0,02-0,001 zwischen Wildtyp und

unbehandeltem Transgen sowie zwischen unbehandeltem und behandeltem Transgen bei 6 bzw. 12 Monaten.

(* bezogen auf wt; + bezogen auf tr); wt: n = 3 (6 Mo), n = 10 (12 Mo); tr: n = 12 (6 Mo), n = 10 (12 Mo); tr + CX:

n = 12 (6 Mo), n = 16 (12 Mo); Mo = Monate; Vergrößerung: x 40 (A-C).

wieder. Dabei manifestierte sich in 60-70 % der untersuchten unbehandelten transgenen

Mäuse eine Hyperplasie und in 7-10 % in CX behandelten Tieren. Dies deutete auf eine

A B

C

wt tr tr + CX0

15

30

45

60

75

90

*

++

Hä

ufig

ke

it d

er

Hyp

erp

lasie

n [%

]

6 Mo

12 Mo

*

D


107

Proliferationsstörung hin, so dass mittels indirekter Immunfluoreszenz das in

teilungsaktiven Zellen exprimierte Protein Ki67 in Kryoschnitten sechs Monate alter

Mäuse nachgewiesen wurde (Abbildung 32). In Wildtyptieren zeigten vereinzelte basale

Epithelzellen eine Ki67 positive Expression (Abbildung 32A), während in transgenen

Mäusen die Anzahl an Ki67 positiven Zellen stark erhöht war (Abbildung 32B). Die

CX-Behandlung in transgenen Mäusen führte zu einer deutlichen Reduktion der Ki67-

positiven Zellen auf Wildtypniveau (Abbildung 32C).

Neben der auftretenden Hyperplasie und der begleitenden Proliferationsstörung in der

Harnblase transgener Mäuse konnte die vereinzelt, spontan auftretende Entwicklung eines

Urothelkarzinoms beobachtet werden. Die spontane Entwicklung des Karzinoms erfolgte

ab circa dem zehnten Monat und war nicht nur auf homozygote transgene Mäuse begrenzt.

R. Klein et. al konnte bereits in diesem Zusammenhang zeigen, dass in 8 % der

untersuchten heterozygoten und 10 % der homozygoten transgenen Mäuse ein

Urothelkarzinom ausbildete (13). Abbildung 33 zeigt die HE-Färbung der Harnblase eines

Paraformaldehydschnittes einer zehn Monate alten heterozygoten transgenen Maus mit

einem Urothelkarzinom, bei dem der Tumor in die Submucosa und Tunica muscularis

invadierte. Zu erkennen ist der Verlust der regulären Zellstrukturen sowie das mehrlagige,

hyperplastische und dysplastische Epithel im Transgen verglichen zum Wildtyptier

(Abbildung 33A, B). K5.COX-2 transgene hyperplastische Blasen waren fast doppelt bis

viermal so groß wie Wildtypblasen gleichen Alters.

Abbildung 32 Nachweis von Ki67 in der Harnblase von 6 Monate alten homozygoten Celecoxib unbehandelten

und behandelten K5.COX-2 transgenen und Wildtyptieren. Mittels indirekter Immunfluoreszenz wurde in

Gefrierschnitten im Vergleich zu Wildtyptieren (A) eine erhöhte Anzahl des Ki67-Proteins in Zellen des Epithels

und in der Submucosa in der Harnblase transgener Mäuse (B) detektiert. Die Anzahl Ki67-positiver Zellen war in

Celecoxib behandelten Mäusen wieder reduziert (C). Vergrößerung: x 16.

A B C


108

Abbildung 33 Urothelkarzinom (TCC) in der Harnblase von heterozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In

Paraformaldhyd fixierte, HE-gefärbter Kryoschnitte von 10 Monate alter heterozygoter K5.COX-2 transgener

Maus (B-D) zeigte die spontane Entwicklung vom Urothelkarzinom (TCC) (B), bei dem der Tumor in die

Submucosa (C) und in die Tunica muscularis (D) invadierte. Verglichen zur Harnblase einer 12 Monate alten

Wildtypmaus (A) war die Harnblase transgener Mäuse (B) stark vergrößert. Vergrößerung: x 2,5 (A,B), x 40 (C,

D).

4.4. Die spontane Tumorentwicklung in Harnblase transgener Mäuse

erfolgt entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell

In der Harnblase heterozygoter und homozygoter transgener Mäuse wurde die selten

auftretende spontane Entwicklung eines Urothelkarzinoms beobachtet. Wie aus Abbildung

11 ersichtlich ist, sind zwei mögliche Modelle an Signalwegen im Menschen bekannt, die

zur Entwicklung des metastasierenden Urothelkarzinoms führen können. Um zu

überprüfen, ob die spontane Entwicklung des Urothelkarzinoms im transgenen

Mausmodell entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell oder dem invasiven

Urothelkarzinommodell erfolgte, wurden mittels Immunoblot die Expressionprofile von

Tunica muscularis

Submucosa

B

C

D

A


109

Her-2 und H-Ras entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell analysiert,

deren Expression im Urothelkarzinom erhöht sind (164-167).

4.4.1. Erhöhte Her-2 Level in der Harnblase transgener Mäuse

Im humanen Urothelkarzinom ist der Her-2 Level erhöht und mit Metastasierung sowie

schlechter Prognose assoziiert (164;165). Mittels Immunoblot erfolgte die kinetische

Analyse der Her-2 Expression in sieben bis 12 Wochen sowie sechs bis 12 Monate alter

Harnblase transgener sowie Wildtyptiere. Wie in Abbildung 34 ersichtlich ist, war die

Her-2 Expression in sechs und 12 Monate alten transgenen Mäusen erhöht, während in

sieben bis 12 Wochen alten Tieren keine veränderten Her-2 Level detektiert werden

konnten. Die semi-quantitative Auswertung ergab eine 2,8-fache Erhöhung

(p-Value 0,421) in sechs Monate und eine signifikante 3,2-fache Erhöhung (p-Value 0,003)

in 12 Monate alten transgenen Mäusen. Um zu überprüfen, ob der erhöhte Her-2 Level

COX-2 abhängig ist, wurden 12 Monate alte nicht-hyperplastische und hyperplastische

Harnblasen sowie die Harnblasen CX behandelter trangener Mäuse mittels Immunoblot auf

ihre Her-2 Expression untersucht. In Abbildung 35 ist zu erkennen, dass der erhöhte Her-2

Level auf die hyperplastischen Harnblasen transgener Mäuse begrenzt war (Abbildung

35A). Die semi-quantitative Analyse ergab eine eindeutige signifikante 4,8-fache

Erhöhung (p-Value 0,003) in den hyperplastischen Harnblasen transgener Mäuse und

bekräftigte damit zugleich die unabhängige kinetische Her-2 Analyse (Abbildung 35B).


110

Abbildung 34 Kinetische Analyse der Expression von Her-2 in K5.COX-2 transgener Harnblase. Die Immunoblots

zeigen, dass eine Erhöhung der Her-2 Expression (2,8-fach, p-Value 0,421) in 6 Monate alter Harnblase

transgener Mäuse erfolgte, die bei 12 Monate alten K5.COX-2 Tieren signifikant erhöht war (3,2-fach,

p-Value 0,003). Die Normierung erfolgte über -Aktin. Mittels 7,5 %-igen SDS-Gel wurden 100 µg Gesamtprotein

elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.

Die Behandlung mit dem selektiven COX-2 Inhibitor Celecoxib reduzierte die Expression

von Her-2 um den Faktor 1,8 (p-Value 0,158) in den behandelten Tieren bezogen auf die

unbehandelten transgenen Mäuse (Abbildung 35).

-Aktin45

7 Wo 12 Wo

wt wttr trkDa

Her-2

205

-Aktin45

6 Mo 12 Mo

wt wttr trkDa

Her-2205


111

Abbildung 35 Effekt der Celecoxibbehandlung auf die Her-2 Expression in der Harnblase 12 Monate alter

homozygoter transgener Mäuse.

A) Immunoblot der Her-2 Expression in der Harnblasen von Wildtyptieren und Celecoxib behandelten (CX)

transgenen Mäusen sowie von Transgenen mit nicht-hyperplastischen (n.h.) und hyperplastischen (h.)

Harnblasen. 130 µg Gesamtprotein wurden mittels 7,5 %-igem SDS-Gel separiert.

B) Semi-quantitative Auswertung normiert über -Aktin. Die Expression von Her-2 war signifikant in

hyperplastischen Blasen erhöht und in nicht-hyperplastischen Blasen unverändert. Die CX-Behandlung zeigte

eine Erniedrigung der Her-2 Expression um den Faktor 1,8 verglichen mit unbehandelten hyperplastischen

Blasen. n = 3Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.

Dies zeigt einerseits, dass die Erhöhung der Her-2 Expression möglicherweise durch die

transgenbedingte COX-2 Überexpression beeinflusst wird und andererseits, dass die

Entwicklung des TCC im transgenen Mausmodell dem humanen papillären

Urothelkarzinom entsprechen könnte.

wt:trn.h. wt:trh. trh.:trCX

Her-2

Faktor 0,8 4,8 1,8

p-Value 0,324 0,003 0,158

B

A

-Aktin45

Her-2

205

wt tr (h.)tr (n.h.) tr CXkDa


112

4.4.2. Ras ist in der Harnblase transgener Mäuse aktiviert

Um zu bekräftigen, dass die Entwicklung des TCC in K5.COX-2 transgenen Mäusen

entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell erfolgen könnte, wurde eine Pull-

down-Assay durchgeführt, bei dem die Analyse des Ras-GTP-Status in 12 Monate alten

Tieren mittels Immunoblot erfolgte. Damit falsch-positive Ergebnisse ausgeschlossen

werden konnten, wurden unabhängige Proben in vitro mit -S-GTP, welches als

Positivkontrolle diente und mit GDP, welches als Negativkontrolle diente, beladen. Das

intensivere Signal der GTP-Positivkontrolle in Abbildung 36A verglichen mit der

GDP-Negativkontrolle spiegelte die Funktionalität des Assays wieder. Abbildung 36B

zeigt den Immunoblot von Ras-GTP, totalem Ras und -Aktin als interne Ladekontrolle.

Für die semi-quantitative Auswertung wurden die IDV (intensive density value) von

Ras-GTP auf die des totalen Ras bezogen und anschließend auf -Aktin normiert. Dabei

wurde eine 1,4-fache Ras-GTP Aktivierung (p-Value 0,05) in der Harnblase transgener

Mäuse bezogen auf Wildtyptiere ermittelt.

Dieses Ergebnis bekräftigt damit das vorherige Resultat und unterstreicht damit die

schlussfolgernde Hypothese, dass die Entwicklung des TCC im transgenen Mausmodell

somit entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell erfolgen könnte. Da bei

diesem Assay alle drei Ras-GTP-Isoformen (H-Ras, N-Ras und K-Ras) als gesamtes Ras-

GTP analysiert werden, kann keine explizite Aussage getroffen werden, welche Ras-

Isoform aktiviert war. Da aber im humanen Urothelkarzinom das H-Ras eine dominante

Rolle spielt, wurde davon ausgegangen, dass auch im transgenen Mausmodell eine H-Ras

Aktivierung vorliegen könnte (22;140).


113

Abbildung 36 Erhöhter Ras-GTP Spiegel in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase. Semi-quantitative

Analyse der IDV von Ras-GTP sowie totales Ras jeweils über -Aktin mit anschließender Gegenüberstellung und

normiert auf 100 hat eine 1,4-fache Erhöhung (p-Value 0,05) an aktiviertes Ras in der Harnblase transgener

Mäuse ergeben (B). Als Positiv- (GTP) bzw. Negativkontrolle (GDP) wurden 1 mg unabhängiger Proben mit

-S-GTP bzw. GDP in vitro inkubiert (A). Weitere 1 mg Gesamtproteinlysat wurden als Mock behandelt und

dienten als Pull-down-Ansatz (B). 120µg Gesamtprotein sowie 60µg der GTP, GDP bzw. Pull-down-Ansätze

wurden im 10 %-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. PK = Positivkontrolle.

Student´s t-Test.

wt trPKkDa

totales Ras

25Ras-GTP

25

-Aktin45

kDa

25

A

B

0

25

50

75

100

125

150

Rel

ativ

e D

ensi

tom

etri

e [%

]

(Ras

-GT

P/ß

-Akt

in)/

(tot

ales

Ras

/ß-A

ktin

)

wt tr


114

4.5. Zusammenhang zwischen COX-2 Überexpression und einem

entzündlichen Phänotyp

Histologische Untersuchungen zeigten das Vorhandensein von entzündlichen

Zellverbänden (Zellclustern) in der Harnblase transgener Mäuse. Die Präsenz der

Entzündungscluster erfolgte bereits im Alter von sechs Monaten. In Wildtyptieren wurden

selten und vergleichsweise sehr kleine Entzündungscluster beobachtet. Dabei zeigte sich

eine „Ursache-und-Wirkung“-Beziehung zwischen der transgenbedingten COX-2

Überexpression und deren Aktivität sowie der Entwicklung des hyperplastischen und

entzündlichen Phänotyps. Abbildung 37B zeigt eine repräsentative Darstellung der großen

Entzündungscluster in 12 Monate alter Harnblase transgener Mäuse. Verglichen zu

Wildtyptieren (Abbildung 37A) ist außerdem das stark hyperplastische Blasenepithel

erkennbar. Der COX-2 selektive Inhibitor Celecoxib unterdrückte die Ausbildung des

hyperplastischen Phänotyps in den behandelten transgenen Mäusen, wie es in Abbildung

37C zu sehen. Die histologische Analyse von sechs und 12 Monate alten Mäusen wurde in

einem Boxplot zusammengefasst (Abbildung 37D), in dem die Anzahl der entzündlichen

Zellcluster über die Tiergruppen (Wildtyptiere, Transgene und CX behandelte Transgene)

dargestellt wurde. Sowohl in sechs als auch in 12 Monate alten transgenen Mäusen war die

Anzahl an entzündlichen Zellclustern verglichen mit Wildtyptieren signifikant erhöht

(p-Value < 0,02) und nur in sechs Monate alten CX behandelten Tieren auf Wildtypniveau

wieder reduziert. In 12 Monate alten CX behandelten transgenen Mäusen konnte keine

Abnahme der Anzahl an Entzündungsclustern, jedoch eine Reduktion in ihrer Größe

beobachtet werden. Die Präsenz an Entzündungszellen zeigt ein immer wiederkehrendes

Ereignis im Verlauf der Karzinogenese und während der Tumorbehandlung auf (168;169).

R. Klein hat ebenfalls eine hohe Präsenz an Entzündungsclustern beobachten können, so

dass seine Untersuchungen bestärkt werden konnten. Dessen Charakterisierung hat

ergeben, dass die Entzündungscluster vorwiegend aus B-Zellen, einigen T-Zellen und sehr

wenigen Makrophagen bestanden (13). Um seine Untersuchung auch dahingehend zu

bekräftigen erfolgte eine immunohistochemische Charaktersisierung der

Entzündungscluster in der Harnblase 12 Monate alter Mäuse. Wie aus Abbildung 38

eindeutig hervorgeht, bestanden die Entzündungscluster in der Harnblase transgener Mäuse

vorwiegend aus B-Zellen (Abbildung 38C, D), einigen T-Zellen (Abbildung 38A, B) und

sehr wenigen Makrophagen (Abbildung 38E, F) und sind damit konsistent zu R. Kleins


115

Beobachtungen. Zusätzlich kann jedoch gezeigt werden, dass selbst die in Wildtyptieren

selten beobachteten Entzündungscluster die gleiche Verteilung an den untersuchten

Entzündungszellen zeigten, wie in den transgenen Mäusen (Abbildung 38H, J). Die

Negativkontrollen zeigten keine spezifischen Färbungen (Abbildung 38G, I, K, L).

Abbildung 37 Nachweis von Entzündungsclustern in K5.COX-2 trangener Harnblase. HE-gefärbte Kryoschnitte

der Harnblase von 12 Monate alten Wildtyptieren (A) und homozygoten unbehandelten (B) und CX behandelten

(C) trangenen Mäusen (B). Zu erkennen sind deutliche, große Entzündungsareale in der Harnblase transgener

Mäuse (B), während in CX behandelten Transgenen die Entzündungsareale in ihrer Größe und Anzahl reduziert

waren (C). Durch eine histologische Untersuchung erfolgte die Auszählung der Entzündungsareale in sechs bzw.

12 Monate Celecoxib (CX) unbehandelten sowie behandelten homozygoten transgenen Mäusen (D). In den

unbehandelten sechs bzw. 12 Monate alten transgenen Mäusen war die Anzahl an Entzündungsarealen normiert

auf Wildtyptiere signifikant erhöht. CX-Behandlung reduzierte die Entzündungsareale in sechs Monate alten

transgenen Mäusen auf Wildtypniveau, jedoch nicht bei 12 Monate alten behandelten Tieren. Die Linie in der Box

repräsentiert den Median, das Viereck den Mean und die Boxen sind begrenzt durch den ersten und dritten

Quartile. Die Whiskers repräsentieren den Bereich 5-95 % und dem Koeffizienten x1,5 (inter-quartile range) zu

den am nächsten gelegenen Beobachtungen. p-Value < 0,02 (* bezogen auf wt; + bezogen auf tr); wt: n = 3 (6 Mo),

n = 10 (12 Mo); tr: n = 12 (6 Mo), n = 10 (12 Mo); tr + CX: n = 12 (6 Mo), n = 16 (12 Mo); Mo = Monate;

Vergrößerung: x 16 (A, B, C).

0

5

10

15

20

25

30 +*

tr + CXtr

An

zah

l d

er E

ntz

ün

du

ng

sclu

ster

6 Mo

12 Mo

wt

*

BA

D

C


116

Abbildung 38 Charakterisierung der Entzündungscluster in 12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen

Mäusen und Wildtyptieren. Immunhistochemische Analyse (A-D, G-J) sowie Immunfluoreszenzanalyse (E, F, K,

L) von Aceton-fixierten Kryoschnitten wurden mittels spezifischer Primärantikörper gegen T-Zellen

(anti-CD4/L3T4) (A, B, H), B-Zellen (anti-CD45R/B220) (C, D, I) und Makrophagen (F4/80) (E, F) inkubiert. Die

Detektion erfolgte mit Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper mit DAB/H2O2 als Substrat (A-D, G-J) bzw.

AlexaFluor488-gekoppelten Fluoreszenzsekundärantikörper (E, F, K, L). Die Entzündungsareale in K5.COX-2

transgener Harnblase bestanden aus vereinzelten T-Zellen (A) und einem großen Anteil an B-Zellen (C). In

Wildtyptieren kamen selten Entzündungsareale vor, die neben vereinzelten T-Zellen (H) vorrangig aus B-Zellen

(J) bestanden. Sowohl die Harnblase von Wildtyptieren als auch die transgener Mäuse zeigten das Vorhandensein

von Makrophagen (E, F). Vergrößerung: x 16 (B, D), x 63 (A, C, E-J). Negativkontrollen ohne Inkubation mit

primären Antikörpern zeigten keine spezifischen Signale (G, I, K, L).

Damit kann gezeigt werden, dass Entzündungsreaktionen während der Entwicklung des

hyperplastischen Phänotyps maßgeblich involviert sind.

T-Zellen

tr

B-Zellen

wt

A

C

B

D

E F

G

J

K

Makrophagen

L

H

I


117

4.6. Analyse des Prostaglandin E2 Syntheseweges

4.6.1. Expression der Prostaglandin E Synthase (PGES-)Isoformen

Die Hauptfunktion der COX-2 ist die Umsetzung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen,

wobei das PGE2 das dominante und aktive Endprodukt darstellt (132). PGE2 ist in vielen

patho-/physiologischen Prozessen wie z. B. Angiogenese, Immunantwort, Apoptose und

Zellproliferation involviert (74;84;90;118), so dass diese Funktion dem PGE2 ein malignes

Potential impliziert (133;134). Da die transgenbedingte COX-2 Überexpression eine

signifikante Erhöhung des PGE2-Spiegels ausmachte (s. Abbildung 29, Abbildung 30),

erfolgte die Expressionsanalyse der PGES-Isoformen, um zu überprüfen, ob eine

deregulierte Expression vorliegt. Wie bereits unter 1.4.2 beschrieben, sind drei

PGES-Isoformen bekannt (cPGES, mPGES-1, mPGES-2), von denen die mPGES-1

ähnlich wie die COX-2 induzierbar ist. Daher wurde mittels RT-PCR das Expressionsprofil

auf mRNA-Ebene von mPGES-1 untersucht. Die semi-quantitative Auswertung der

kinetischen RT-PCR-Analyse von mPGES-1 in der Harnblase von sieben bis 12 Wochen

sowie sechs bis 12 Monate alten Wildtyptieren und K5.COX-2 transgenen Mäusen zeigte

nur in 12 Wochen alten transgenen Tieren eine 1,4-fache Erhöhung (p-Value 0,06) der

mPGES-1 mRNA-Menge (Abbildung 39). Jedoch konnte auf Proteinebene mittels

Immunoblot-Analyse keine Erhöhung der Expression von mPGES-1 in 12 Wochen alten

trangenen Mäusen nachgewiesen werden, wie es in Abbildung 40 dargestellt ist. Auch die

Expression der cPGES und mPGES-2 waren in diesem Alter auf Proteinebene unverändert.

Erst in der Harnblase von sechs und 12 Monate alten transgenen Mäusen konnten

veränderte PGES Expressionsprofile mittels Immunoblot detektiert werden. Wie aus

Abbildung 41 ersichtlich ist, war die Expression der cPGES-1 in K5.COX-2 Mäusen

unverändert, während die mPGES-2 in 12 Monate alten transgenen Tieren 1,6-fach

(p-Value 0,086) erhöht war. Die mPGES-1 hingegen war bereits in sechs Monate alten

transgenen Mäusen 1,4-fach (p-Value 0,446) und in 12 Monate alten transgenen Tieren

2,5-fach (p-Value 0,096) erhöht.

Während eine Erhöhung des mPGES-1 Levels auf mRNA-Ebene nur in 12 Wochen alten

transgenen Mäusen detektiert werden konnte, war dies auf Proteinebene erst in sechs bzw.

explizit in 12 Monate alten transgenen Tieren möglich. Dies zeigt zum einen, dass die


118

mRNA-Menge nicht mit der Proteinexpression korrelieren muss und zum anderen, dass die

transgenbedingte COX-2 Überexpression demnach die mPGES-1 Expression beeinflusst.

Abbildung 39 Kinetischer RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von der induzierbaren mPGES-1 in

Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblaser. Semi-quantitative Analyse normiert auf β-Aktin als interne

Kontrolle zeigte, dass die mPGES-1 RNA-Menge nur in der Harnblase von 3 Monate (Mo) alten transgenen

Mäusen erhöht war (1,4, p-Value 0,06) (A, B). n = 3 Tiere pro Gruppe wurden analysiert. DNA-Größenstandards:

M1 = GeneRuler 1 kb DNA Leiter, M2 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. (-) Negativ-PCR; Student´s t-Test.

- mPGES-1600 -

500 -

M1 M2 wt tr wt tr

7 Wo 12 Wo

(-)bp

- -Aktin

- -Aktin

- mPGES-1

M1 M2 wt tr wt tr

6 Mo 12 Mo

600 -

500 -

(-)bp

7 Wo 12 Wo 6 Mo 12 Mo0

25

50

75

100

125

150

IDV

mP

GE

S-1

/ I

DV

-A

kti

n

[% w

t]

wt

tr


119

Abbildung 40 Immunoblot der Prostaglandin E Synthase Isoformen in 3 Monate alten K5.COX-2 transgenen und

Wildtyptieren. Die induzierbare mPGES-1 war in 3 Monate alten transgenen K5.COX-2 Mäusen verglichen mit

Wildtyptieren gleichen Alters nicht erhöht. In ihrer Expression ebenfalls nicht verändert waren die cPGES und

die mPGES-2. Die Normierung erfolgte über -Aktin. Mittels 10 %-igen SDS-Gel wurden 120µg Gesamtprotein

separiert. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.

cPGES

20

20

29

45

mPGES-1

mPGES-2

-Aktin

wtkDa tr


120

Abbildung 41 Immunoblot zum Nachweis der Expression der Prostaglandin E Synthase Isoformen in der

Harnblase von sechs und 12 Monate alten K5.COX-2 transgenen und Wildtyptieren. Die semi-quantitative

Analyse normiert über -Aktin zeigte eine unverändert Expression der cPGES sowohl in der Harnblase von sechs

Monate als auch von 12 Monate alten transgenen Tieren, während die mPGES-2 in 12 Monate alten transgenen

Mäusen um den Faktor 1,6 (p-Value 0,086) erhöht war. Die induzierbare mPGES-1 war in der Harnblase von

sechs Monate alten transgenen Mäusen um den Faktor 1,4 und von 12 Monate alten Transgenen um den Faktor

2,5 nicht signifikant erhöht (p-Value 6 Mo = 0,446; p-Value 12 Mo = 0,096). n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s

t-Test.

4.6.2. Expression und Lokalisation der Prostaglandin E Rezeptor

(EP-)Isoformen

4.6.2.1. Erhöhte Expression von EP2 und EP4 Rezeptor Isoformen in

der Harnblase transgener Mäuse

Prostaglandin E2 kann seine biologische Wirkung über die vier G-Protein-gekoppelten

7-Transmembranrezeptor Isoformen EP1-4 ausüben, die ihrerseits mit malignem Potenzial

6 Mo 12 Mo

wt wttr tr

45 -Aktin

mPGES-2

mPGES-1

cPGES

29

15

25

kDa


121

und der Entwicklung von Krebszellen assoziiert werden (135-138). Da die

transgenbedingte COX-2 Überexpression mit signifikant erhöhten PGE2-Spiegeln und

einer erhöhten Expression der induzierbaren mPGES-1 einherging, erfolgte die

Untersuchung der Prostaglandin Rezeptor Isoformen EP1-4, ob ebenfalls eine deregulierte

Expression vorliegt. Besonders EP2 und EP4 Rezeptor stehen im Zusammenhang bei der

malignen Progression des Urothelkarzinoms (16;17;132;133;139). Die semi-quantitative

Auswertung der kinetischen RT-PCR-Analyse der mRNA der EP-Rezeptor Isofomen in

der Harnblase von sieben bis 12 Wochen sowie sechs bis 12 Monate alten Wildtyptieren

und K5.COX-2 transgenen Mäusen zeigte nur in 12 Wochen alten transgenen Tieren eine

1,5-fache Erhöhung (p-Value 0,123) der EP4 Rezeptor mRNA-Menge (Abbildung 42). Um

das Expressionsprofil auf Proteinebene zu untersuchen, wurde zunächst die Spezifität der

Antikörper gegen die EP-Rezeptor Isoformen überprüft, um falsch-positive Signale

auszuschließen. Dazu wurden die Antikörperlösungen zuvor eine Stunde mit dem 5-fachen

Volumen an Blocking Peptide inkubiert. Aus Abbildung 43, die die Kompetition der

EP-Rezeptoren von 12 Wochen alten transgenen Mäusen zeigt, ist ersichtlich, dass die

Inkubation mit dem Blocking Peptide zum Verlust der spezifischen Signale für die

EP-Rezeptor Isoformen führte. Für den EP1 Rezeptor konnte die spezifische 42 kDa Bande

und eine weitere bei 45 kDa detektiert werden. Die Präsenz von multiplen Banden bei

Immunoblot-Analysen ist ein oft beobachtetes Ereignis bei GPCR (G protein-coupled

receptors), aufgrund der unterschiedlichen Glycolysierungen und der Neigung der

hydrophoben heptahelikalen GPCR SDS-unlösliche Homo- und Heterokomplexe zu bilden

(170-173). Für den EP2, EP3 sowie EP4 Rezeptor konnten in der Maus jeweils nur eine

dominante 53 kDa, 65 kDa bzw. 52 kDa Bande detektiert werden. Beim Menschen können

mitunter für den EP2 bzw. EP3 Rezeptor weitere spezifische Banden detektiert werden, die

ebenfalls auf die oben beschriebenen Glycosylierungen zurückzuführen sind. Jedoch sind

zahlreiche Subtypen einzelner EP-Rezeptor Isoformen bekannt, die zusätzlich zu dem

Banden-laddering beitragen (s.

Tabelle 3).


122

Abbildung 42 Kinetischer RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression der EP-Rezeptor Isoformen in Wildtyp- und

K5.COX-2 transgener Harnblaser. Nur in 12 Wochen alten transgenen Mäusen konnte mittels semi-quantitativer

Analyse eine Erhöhung der EP4 Rezeptor RNA-Menge ermittelt werden (1,5, p-Value 0,123). Als interne

Kontrolle diente β-Aktin. n = 3 Tiere pro Gruppe wurden analysiert. DNA-Größenstandards: M1 = GeneRuler

1 kb DNA Leiter, M2 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. (-) Negativ-PCR; Student´s t-Test.

- EP1

- EP2

- EP3

- EP4

- ß-Aktin

500 -

400 -

500 -

500 -

400 -

M1 M2 wt tr wt tr

7 Wo 12 Wo

(-)bp

- ß-Aktin

- EP4

- EP3

- EP2

- EP1

M1 M2 wt tr wt tr

6 Mo 12 Mo

500 -

400 -

500 -

500 -

400 -

(-)bp


123

Abbildung 43 Kompetition der EP-Rezeptoren in der Harnblase 3 Monate alter K5.COX-2 transgener Mäuse. Die

Inkubation mit dem Blocking Peptide zeigte eindeutig den Verlust der spezifischen Signale für die EP-Rezeptoren

in der Harnblase der Maus (EP1 42kDa, EP2 53 kDa, EP3 65kDa, EP4 52 kDa). 120 µg Gesamtprotein wurden

mittels 7,5 %-igen SDS-Gel separiert.

Damit wurde die Spezifität der Antikörper als gesichert angesehen und eine kinetische

Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen mittels Immunoblot von sieben und

12 Wochen sowie sechs und 12 Monate alten transgenen und Wildtyptieren durchgeführt,

die in der Abbildung 44 sowie Abbildung 45 zusammenfassend dargestellt sind. Die

semi-quantitative Auswertung über -Aktin als interne Ladekontrolle ergab keine

veränderten Expressionsprofile der EP-Rezeptor Isoformen EP1 und EP3 in transgenen

Mäusen im untersuchten Zeitraum von sieben Wochen bis 12 Monaten. Jedoch war der

EP4 Rezeptor bereits in 66 % der untersuchten 12 Wochen alten transgenen Mäuse

4,1-fach (p-Value 0,149) erhöht (Abbildung 44). Zu diesem Zeitpunkt konnte auch eine

erhöhte mRNA Expression der EP4 Rezeptor Isoform detektiert werden (vgl. Abbildung

42).

kDa - + peptide

66

66

45

EP4

EP1

EP2

EP3

45


124

Abbildung 44 Kinetische Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen in sieben und 12 Wochen alter

Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblase. Die Expression von EP1, EP2 und EP3 Rezeptoren zeigte keine

Unterschiede zwischen Transgenen und Wildtyptieren unterschiedlichen Alters, während die Expression von EP4

Rezeptor in der Harnblase von 12 Wochen alten transgenen Mäusen um den Faktor 4,1 (p-Value 0,149) erhöht

war. Als interne Kontrolle diente -Aktin. 100 µg Gesamtprotein wurden mittels 7,5 %-igen SDS-Gel

elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.

Während auf mRNA-Ebene keine weitere Erhöhung der EP-Rezeptor Isoformen in sechs

bzw. 12 Monate alten K5.COX-2 transgenen Mäusen detektiert werden konnte, war auf

Proteinebene in sechs Monate alten transgenen Tieren neben einer 1,6-fachen Erhöhung

(p-Value 0,406) des EP4 Rezeptors zusätzlich der EP2 Rezeptor 1,4-fach erhöht

(p-Value 0,194). Die erhöhte Expression der beiden Rezeptor Isoformen manifestierte sich

signifikant in 12 Monate alten transgenen Mäusen. Dabei waren der EP2 Rezeptor 1,6-fach

(p-Value < 0,001) und der EP4 Rezeptor 2,8-fach (p-Value 0,015) erhöht (Abbildung 45).

EP1

EP2

EP3

EP4

-Aktin45

66

66

66

45

7 Wo 12 Wo

wt wttr trkDa


125

Abbildung 45 Kinetische Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen in sechs und 12 Monate alter

Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblase. Die semi-quantitative Analyse normiert über -Aktin ergab keine

veränderte Expression von EP1 und EP3 Rezeptoren in der Harnblase von sechs bzw. 12 Monate alten transgenen

Mäusen verglichen mit Wildtyptieren, während in sechs Monate alter Harnblase transgener Tiere die Expression

von EP2 Rezeptor 1,4-fach (p-Value 0,194) und EP4 Rezeptor 1,6-fach (p-Value 0,406) erhöht waren. In

12 Monate alten K5.COX-2 transgenen Tieren waren die Expression dieser Isoformen signifikant erhöht (EP2

Rezeptor 1,6-fach, p-Value < 0,001, EP4 Rezeptor 2,8-fach, p-Value 0,015). 100 µg Gesamtprotein wurden mittels

7,5 %-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.

Die erhöhte Expression der EP-Rezeptoren EP2 und EP4 implementiert diesen Isoformen

eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Hyperplasie und des Urothelkarzinoms im

K5.COX-2 transgenen Mausmodell.

EP1

EP2

EP3

EP4

-Aktin45

45

66

66

45

6 Mo 12 Mo

wt wttr trkDa


126

4.6.2.2. Expression von EP2 und EP4 Rezeptor in Tumorzellen und

Entzündungszellen

Die Immunoblot-Analyse in 12 Monate alten transgenen Mäusen zeigte eine signifikante

Erhöhung der Expression von EP2 und EP4 Rezeptor, so dass mittels Immunhistochemie

sowie indirekter Immunfluoreszenz die Lokalisation der EP-Rezeptor Isoformen in der

Harnblase erfolgte. Da differentielle Expressionen nur in 12 Monate alten K5.COX-2

Mäusen beobachtet werden konnten, erfolgten die weiteren Analysen nur noch mit Tieren

dieses Alters.

Für die Immunfluoreszenz wurden die EP-Rezeptor Isoformen mit einem spezifischen

primären anti-EP-Rezeptor Antikörper sowie einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper

als rotes Signal und die Blutgefäße mit einem spezifischen primären anti-CD31 Antikörper

sowie einem AlexaFluor488-gekoppelten Sekundärantikörper als grünes Signal sichtbar

gemacht. Zusätzlich wurden die Zellkerne mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt,

welches in den übereinander gelagerten Kanälen sichtbar ist. Für die Immunhistochemie

wurde ein HRP-gekoppelter Sekundärantikörper gegen die EP-Rezeptor Isoformen

verwendet und mittels DAB/H2O2 als Substrat die Lokalisation sichtbar gemacht.

Abbildung 46 zeigt, dass EP1 Rezeptor sowohl von transgenen Mäusen (Abbildung

46A-F) als auch von Wildtyptieren (Abbildung 46G-H) in den Blutgefäßen und

Nervenfaszikel der Harnblase exprimiert wurde. Die Negativkontrollen (Abbildung 46I, J)

zeigten keine spezifischen Signale. Eine Expression des EP2 Rezeptors wurde in

transgenen Mäusen im basalen und luminalen Epithel, vorrangig perinucleär (das

Endomembransystem betreffend), detektiert, wie es in Abbildung 47A, C, E dargestellt ist,

während in Wildtyptieren der EP2 Rezeptor vorwiegend im luminalen Epithel exprimiert

wurde (Abbildung 47G). Zusätzlich konnte eine Expression des EP2 Rezeptors in einigen

Tumorzellen eines TCC in transgenen Mäusen detektiert werden (Abbildung 47B, D, F).

Die Negativkontrolle zeigte keine spezifischen Signale (Abbildung 47H). Auch der

EP3 Rezeptor wurde ähnlich wie der EP1 Rezeptor sowohl in transgenen Mäusen als auch

in Wildtyptieren in den Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase exprimiert, wie

Abbildung 48 zeigt. Jedoch schien der EP3 Rezeptor im Gegensatz zum EP1 Rezeptor

direkt in den Endothelzellen der Blutgefäße exprimiert zu werden. Zusätzlich erfolgte eine

Expression des EP3 Rezeptors in der basalen Epithelschicht sowie in der Tunica

muscularis in K5.COX-2 transgenen Mäusen und NMRI-Wildtyptieren (Abbildung 49).


127

Abbildung 46 Immunolokalisation von EP1 Rezeptor in den Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase 12

Monate alter Mäuse. Immunhistochemische Analyse (G, H, J) sowie Immunfluoreszenzanalyse (A-F, I) in

Kryoschnitten. EP1 Rezeptor ist als rotes Cy3- (A, B) und die Blutgefäße als grünes AlexaFluor488-

Fluoreszenzsignal (C, D) zu erkennen. Die Zellkerne wurden zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt

(E, F). Die Expression von EP1 Rezeptor erfolgte in Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase von

transgenen sowie Wildtyptieren (E-H). Negativkontrollen ohne Inkubation mit primären Antikörpern zeigten

keine spezifischen Signale (I, J). Vergrößerung: x 63.

wt

tr

EP1

CD31

Blutgefäße

EP1, CD31, Hoechst

Nervenfaszikel

A B

D

F

C

E

G H

I

J


128

Abbildung 47 Immunolokalisation von EP2 Rezeptor im Epithel- und Tumorgewebe der Harnblase 12 Monate

alter transgener Mäuse. Immunfluoreszenzanalyse in Kryoschnitten. EP2 Rezeptor ist als rotes Cy3- (A, B) und

die Blutgefäße als grünes AlexaFluor488-Fluoreszenzsignal (C, D) zu erkennen. Die Zellkerne wurden zusätzlich

mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt (E, F). Die Expression von EP2 Rezeptor erfolgte im Epithel der

Harnblase von transgenen sowie Wildtyptieren. Eine erhöhte Expression von EP2 Rezeptor konnte von

Tumorzellen nachgewiesen werden (F). Negativkontrolle ohne Inkubation mit primären Antikörpern zeigte keine

spezifischen Signale (H). Vergrößerung: x 63.

wt

tr

EP2

CD31

Mucosa

EP2, CD31, Hoechst

Karzinom

A B

D

F

C

E

G

H

EP2, CD31, Hoechst


129

Abbildung 48 Immunolokalisation von EP3 Rezeptor in den Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase 12




(E, F). Die Expression von EP3 Rezeptor erfolgte in Blutgefäßen und Nervenfaszikel der Harnblase von

transgenen sowie Wildtyptieren. Negativkontrollen ohne Inkubation mit primären Antikörpern zeigten keine

spezifischen Signale (I, J). Vergrößerung: x 63.

wt

tr

EP3

CD31

Blutgefäße

EP3, CD31, Hoechst

Nervenfaszikel

A B

D

F

C

E

G H

I

J


130

Abbildung 49 Immunolokalisation von EP3 Rezeptor im Epithelgewebe und in der Muskulatur der Harnblase 12




(E, F). Die Expression von EP3 Rezeptor erfolgte im basalen Epithel und in der Muskulatur (Tunica muscularis)

der Harnblase von transgenen sowie Wildtyptieren. Vergrößerung: x 40 (Muskulatur), x 63 (Epithel).

Die immunohistochemische Analyse des EP4 Rezeptors zeigte ein positives Signal im

basalen und luminalen Epithel sowie in Blutgefäßen transgener Mäuse, während in

MuskulaturMucosa

wt

tr

EP3

CD31

EP3, CD31, Hoechst

A B

D

F

C

E

G H


131

Wildtyptieren in diesen Kompartimenten nur ein sehr schwaches Signal detektiert werden

konnte, wie es Abbildung 50-1 zeigt. Wie für den EP2 Rezeptor konnte auch für den

EP4 Rezeptor eine Expression in einem TCC-Areal in transgenen Mäusen nachgewiesen

werden (Abbildung 50-2). Darüberhinaus zeigten einige Zellen im Bereich des Karzinoms,

in der Submucosa und der Tunica muscularis, eine positive EP4 Rezeptor Expression.

Außerdem konnte eine Expression des EP4 Rezeptors in einigen Entzündungszellen eines

Entzündungsclusters in der Harnblase transgener Mäuse nachgewiesen werden, wie es in

Abbildung 50-3 dargestellt ist.

Die Lokalisationsanalyse der EP-Rezeptor Isoformen mittels Immunfluoreszenz und

Immunhistochemie zeigten, dass lediglich der EP2 und EP4 Rezeptor in einem TCC-Areal

in transgenen Mäusen nachgewiesen werden konnten. Diese Ergebnisse bekräftigen die

Annahme, dass EP2 und EP4 Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der

Hyperplasie und des Karzinoms in der Harnblase spielen, wie es Miyata et al. ebenfalls

beschreibt (132). Da zusätzlich der EP4 Rezeptor von einigen Entzündungszellen in

Entzündungsclustern exprimiert wurde, erfolgte die Analyse der Expression der

EP-Rezeptor Isoformen in Entzündungsclustern in der Harnblase 12 Monate alter

transgener Mäuse mittels Doppelimmunfluoreszenz. Die Expressionsanalyse der

EP-Rezeptor Isoformen wurde dabei auf B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen beschränkt.

Die EP-Rezeptor Isoformen wurden mit einem spezifischen primären anti-EP-Rezeptor

Antikörper sowie einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper als rotes Signal und die

Entzündungszellen mit einem spezifischen primären Antikörper (anti-CD4/L3T4 für T-

Zellen, anti-CD45R/B220 für B-Zellen und F4/80 für Makrophagen) sowie einem

AlexaFluor488-gekoppelten Sekundärantikörper als grünes Signal sichtbar gemacht.

Zusätzlich wurden die Zellkerne mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt, welches in den

übereinander gelagerten Kanälen sichtbar ist. In Abbildung 51 ist zu erkennen, dass EP1

Rezeptor weder von T-Zellen noch von B-Zellen oder Makrophagen exprimiert wurde.

Dagegen konnte eine Expression von EP2 Rezeptor sowohl von T-Zellen als auch von

B-Zellen und Makrophagen in der Harnblase transgener Mäuse nachgewiesen werden, wie

es eindeutig in Abbildung 52 dargestellt ist. Wie der EP1 Rezeptor wurde auch der

EP3 Rezeptor von keinen der untersuchten Entzündungszellen exprimiert (Abbildung 53).


132

Abbildung 50 Immunolokalisation von EP4 Rezeptor in der Harnblase 12 Monate alter Mäuse.

Immunhistochemische Analyse von Kryoschnitten.

1) Die Expression von EP4 Rezeptor erfolgte im Epithel und in Blutgefäßen der Harnblase von transgenen

Mäusen (A, B), während bei Wildtyptieren (C, D) nur ein schwaches Signal für EP4 Rezeptor nachweisbar war.

2) Tumorzellen zeigten eine erhöhte EP4 Rezeptor Expression (B). Auch in den umliegenden Tumorarealen,

Submucosa (A) und Tunica muscularis (C) wurde EP4 Rezeptor partial exprimiert.

3) In Entzündungsarealen in der Harnblase transgener K5.COX-2 Tiere erfolgte eine partiale EP4 Rezeptor

Expression. Negativkontrollen ohne Inkubation mit primären Antikörper zeigten keine spezifischen Signale (E,

F).Vergrößerung: x 16 (E, F), x 63.

wt

tr

Mucosa Blutgefäße

A B

C D

E

F

1)

Entzündungscluster

tr

2)

3)

Submucosa

tr

Karzinom Tunica muscularis

A B C


133

Abbildung 51 Doppelimmunfluoreszenz von EP1 Rezeptor und Entzündungszellen in der Harnblase von

12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In den übereinander gelagerten Bildern ist keine

Expression von EP1 Rezeptor von T- und B-Zellen sowie von Makrophagen in der Harnblase von homozygoten

transgenen Mäusen zu erkennen (G-I). Vergrößerung: x 63.

Verglichen mit Abbildung 50-3, die ein positives Signal für die Expression des

EP4 Rezeptors von Entzündungszellen in einem Entzündungscluster zeigt, komplementiert

die Immunfluoreszenz das Ergebnis, dass das positive Signal für den EP4 Rezeptor nicht

von den -Zellen oder B-Zellen, sondern von den Makrophagen kam, die den

EP4 Rezeptor exprimierten (Abbildung 54).

CD45RCD4

EP1 EP1

EP1, CD45R, HoechstEP1, CD4, Hoechst

EP1

F4/80

EP1, F4/80, Hoechst

T-Zellen B-Zellen Makrophagen

A B C

D E F

G H I


134

Abbildung 52 Nachweis von EP2 Rezeptor in Entzündungszellen in der Harnblase von 12 Monate alten

homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In den Kolokalisationen ist eine Expression von EP2 Rezeptor von

T- und B-Zellen sowie Makrophagen in stark entzündeten, homozygoten transgenen Mäusen gezeigt (G-I).

Vergrößerung: x 63.

Dieses Ergebnis impliziert wiederholt dem EP2 als auch EP4 Rezeptor eine wichtige Rolle

in Prozessen der Signaltransduktion, da EP2 Rezeptor sowohl von T-Zellen als auch von

B-Zellen und darüber hinaus beide Isoformen von Makrophagen in der Harnblase

transgener Mäuse exprimiert wurden.

CD45RCD4

EP2 EP2


EP2

F4/80

EP2, F4/80, Hoechst


A B C

D E F

G H I


135

Abbildung 53 Doppelimmunfluoreszenz von EP3 Rezeptor und Entzündungszellen in der Harnblase von

12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In den Kolokalisationen ist keine Expression von

EP3 Rezeptor von T- und B-Zellen sowie von Makrophagen in der Harnblase von homozygoten transgenen

Mäusen zu erkennen (G-I). Vergrößerung: x 63.

Unter physiologischen Bedingungen sind Makrophagen auch in der Harnblase von

Wildtyptieren lokalisiert, jedoch nicht aktiviert. Da sowohl EP2 als auch EP4 Rezeptor von

Makrophagen in der Harnblase transgener Mäuse exprimiert wurden, erfolgte die

Expressionsanalyse der beiden Isoformen in Makrophagen in der Harnblase von

Wildtyptieren mittels Doppelimmunfluoreszenz. Abbildung 55 zeigt, dass sowohl EP2 als

auch EP4 Rezeptor von Makrophagen in der Harnblase von Wildtyptieren exprimiert

wurden (Abbildung 55A, B). Da zusätzlich die Blutgefäße mit spezifischen Antikörpern

grün gefärbt wurden (Abbildung 55C, D), ist zu erkennen, dass die Makrophagen in

Nachbarschaft zu den Blutgefäßen lokalisiert waren (Abbildung 55E, F).

CD45RCD4

EP3 EP3


EP3

F4/80

EP3, F4/80, Hoechst


A B C

D E F

G H I


136

Verglichen mit den Abbildung 51-Abbildung 54 ist außerdem erkennbar, dass in der

Harnblase von Wildtyptieren die Makrophagen in der Tunica muscularis lokalisiert waren,

während die Makrophagen in transgenen Mäusen vorrangig in der Submucosa vorzufinden

waren.

Abbildung 54 Nachweis von EP4 Rezeptor in Entzündungszellen in der Harnblase von 12 Monate alten

homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen. In den übereinander gelagerten Bildern konnte keine Expression

von EP4 Rezeptor von T- und B-Zellen in der Harnblase von homozygoten transgenen Mäusen detektiert werden

(G, H), während Makrophagen eine Expression von EP4 Rezeptor zeigten (I). Vergrößerung: x 63.

CD45RCD4

EP4 EP4


EP4

F4/80

EP4, F4/80, Hoechst


A B C

D E F

G H I


137

Abbildung 55 Nachweis von EP2 und EP4 Rezeptor in Makrophagen in der Harnblase 12 Monate alter

Wildtyptiere. Indirekte Immunfluoreszenz in Gefrierschnitten der Harnblase. EP Rezeptor-Isoformen sind als

rotes Cy3- (A, B) und die Blutgefäße als grünes AlexaFluor488-Fluoreszenzsignal (C, D) zu erkennen. In den

übereinander gelagerten Bildern, in denen die Zellkerne zusätzlich mittels Hoechst-Farbstoff blau angefärbt

wurden, ist erkennbar, dass die Makrophagen in der Harnblase von Wildtyptieren EP2 und EP4 Rezeptoren

exprimierten und in der Tunica muscularis in Nachbarschaft zu den Blutgefäßen lokalisiert waren.

Vergrößerung: x 63.

Zusammenfassend bekräftigen diese Ergebnisse die Aussage, dass der EP2 und

EP4 Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Urothelkarzinoms spielen und

dass das PGE2-Signaling vorrangig über diese beiden Rezeptoren erfolgen könnte.

EP4

CD31

EP4, CD31, Hoechst

Makrophagen

EP2

CD31

EP2, CD31, Hoechst

Makrophagen

A

C

E

B

D

F


138

4.6.3. K5.COX-2 transgene Mäuse zeigen ein vergleichendes

Expressionsprofil wie humane Urothelkarzinomzelllinien

Um zu überprüfen, ob das transgene Mausmodell eine vergleichende Aussage zum

humanen Urothelkarzinom erlaubt, erfolgte die Charakterisierung der TCC-Zelllinien

RT112 und 5637 hinsichtlich ihrer Expressionsprofile der COX-Isoenzyme, PGES und

EP-Rezeptor Isoformen um weitere vergleichende Analysen durchführen zu können.

Bei den RT112 und 5637 TCC-Zelllinien handelt es sich um isolierte, epitheliale Zellen

vom gut-differenzierten Urothelkarzinom (174;175). Beide Zelllinien zeigten annähernd

gleich stark positive Her-2 Expressionslevel (Abbildung 56). Jedoch konnte weder auf

mRNA-Ebene noch auf Proteinebene eine COX-1 Expression mittels RT-PCR bzw.

Immunopräzipitation nachgewiesen werden, während COX-2 sowohl auf mRNA- als auch

auf Proteinebene nachweisbar war. Wie aus Abbildung 57 ersichtlich ist, zeigten die

RT112 Zellen eine stärkere COX-2 Expression als 5637. Zudem war im Immunoblot bei

RT112 Zellen ein Banden-laddering beim COX-2 Nachweis zu erkennen. Diese vier

Banden repräsentieren die vier Glycolysierungszustände des COX-2 Enzyms (68 kDa,

70 kDa, 72 kDa und 74 kDa).

Abbildung 56 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Her-2 in den humanen Urothelkarzinomzelllinien

RT112 und 5637. Repräsentative Darstellung der Her-2 Expression nach Auftrennung von 100 µg Gesamtprotein

mittels 7,5 %-igen SDS-Gel in den humanen TCC Zelllinien. Als Ladekontrolle diente -Aktin. n = 2 unabhängige

Proben pro Gruppe wurden analysiert.

RT112 5637kDa

205Her-2

45 -Aktin


139

Abbildung 57 Nachweis der Expression von COX-Isoenzymen in humanen RT112 und 5637

Urothelkarzinomzelllinien.

A) Mittels RT-PCR-Nachweis konnte keine mRNA für COX-1 in beiden Zelllinien nachgewiesen werden. Positive

Signale wurden für COX-2 erhalten. Als interne Kontrolle diente β-Aktin. n = 2 unabhängige Proben pro Zelllinie

wurden analysiert. PK = Positivkontrolle (humane Pankreaskarzinomzelllinie); DNA-Größenstandards:

M1 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. (-) Negativ-PCR; (--) Negativ-RT-PCR.

B) Immunoblot-Analyse der COX-Isoformen 1 und 2 in den Urothelkarzinomzelllinien mittels

Immunopräzipitation (IP). Eine COX-2 Expression konnte in beiden humanen Urothelkarzinomzelllinien

nachgewiesen werden, wobei in RT112 für COX-2 ein stärkeres Signal als in 5637 detektiert werden konnte. Die

Expression von COX-1 konnte mittels IP nicht nachgewiesen werden. 7,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgel. PK =

Positivkontrolle; * Crossreaktion des Antikörpers mit IgG.

COX-1

66

COX-2

66

kDa

*

*

- COX-1

400 -

M1

400 -- COX-2

400 -- -Aktin

RT112 5637 (--)(-) PKbp

A

B


140

Die Expressionsprofile der Prostaglandin Synthase Isoformen in den TCC-Zelllinien waren

für die cPGES und mPGES-2 in etwa gleich stark. Es erfolgte auch die Expression von

mPGES-1 in beiden Zelllinien, jedoch konnte in RT112 Zellen ein 4-fach so starkes Signal

wie bei 5637 detektiert werden.

Abbildung 58 Expressionsanalyse der PGE-Synthase Isoformen in humanen RT112 und 5637 Zellen. Die drei

PGE-Synthase Isoformen wurden in beiden untersuchten Zelllinien exprimiert. Die induzierbare mPGES-1 war in

RT112 Zellen stärker exprimiert verglichen mit den 5637 Zellen. In ihrer Expression nicht verändert waren die

cPGES und die mPGES-2. 100µg Gesamtprotein wurden mittels 12 %-igen SDS-Gel separiert. n = 2 unabhängige

Proben pro Gruppe wurden analysiert.

Die Analyse der Expressionsprofile der EP-Rezeptor Isoformen erfolgte auf mRNA- und

Proteinebene. Abbildung 59 zeigt, dass auf mRNA-Ebene alle EP-Rezeptor Isoformen in

unterschiedlichen Stärken detektiert werden konnten. Die mRNA Expression von EP3

Rezeptor war in RT112 und 5637 Zellen nahezu gleich, während in RT112 Zellen bezogen

auf 5637 die Expression von EP1 und EP4 Rezeptor erhöht und von EP2 Rezeptor

erniedrigt waren. Auf Proteinebene zeigten sich jedoch andere Expressionsprofile

(Abbildung 60). Nur das Expressionsprofil vom EP1 und EP3 Rezeptor korrelierte mit dem

RT112 5637kDa

25cPGES

15 mPGES-1

35

mPGES-2

-Aktin45


141

mRNA Expressionsprofil, während auf Proteinebene der EP2 Rezeptor in beiden Zelllinien

nahezu gleich exprimiert wurde und der EP4 Rezeptor nur in 5637 detektiert werden

konnte, obwohl auf mRNA-Ebene EP4 Rezeptor auch in RT112 Zellen nachweisbar war.

Dies zeigt einerseits unterschiedliche Kontrollmechanismen sowohl auf mRNA- als auf

Proteinebene und andererseits bekräftigt die positive Expression von EP4 Rezeptor in 5637

Zellen die bereits oben für das transgene Mausmodell aufgestellte Annahme, das diese

EP-Rezeptor Isoform eine wichtige Rolle bei der Karzinomentstehung und deren weiteren

Entwicklung spielt.

Im Unterschied zum transgenen Mausmodell konnte in der Harnblase der Mäuse für den

EP3 Rezeptor nur die 65 kDa Isoform detektiert werden, während in den humanen

TCC-Zelllinien sowohl die 65 kDa als auch die 53 kDa Isoform nachweisbar war

(Abbildung 60).

Abbildung 59 RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression der EP-Rezeptor Isoformen in humanen

Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637. Positive Signale wurden in beiden Urothelkarzinomzelllinien für die

mRNA Expression der EP-Rezeptoren erhalten. Als interne Kontrolle diente β-Aktin. n = 2 unabhängige Proben

pro Zelllinie wurden analysiert. DNA-Größenstandard: M1 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter; (-) Negativ-PCR;

(--) Negativ-RT-PCR.

M1

400 -- -Aktin

RT112 5637 (--)(-)

- EP4200 -

- EP2400 -

- EP1500 -

- EP3300 -


142

Abbildung 60 Immunoblot zum Nachweis der EP-Rezeptor Isoformen in RT112 und 5637 Zellen. Die Isoformen

der EP-Rezeptoren EP1 (42 kDa) und EP2 (53 kDa) wurden in beiden Zelllinien exprimiert, während für den EP3

Rezeptor die 53 kDa sowie 65 kDa Isoform in den humanen Zellen nachgewiesen werden konnte. Für den EP4

Rezeptor (52 kDa) wurde nur in den 5637 Zellen ein positives Signal erhalten. Mittels 7,5 %-igen SDS-Gel wurden

100 µg Gesamtprotein separiert. Als Ladekontrolle diente -Aktin. n = 2 unabhängige Proben pro Gruppe wurden

analysiert.

Die Charakterisierung der humanen Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637 zeigte

insgesamt ein adäquates Expressionsprofil zum transgenen Mausmodell und bekräftigt

somit deren Aussagen.

RT112 5637kDa

45

EP1

EP2

EP3

EP3

EP4

b-Aktin

66

66

45

45


143

4.7. Gewebliche Proteomanalyse mittels 2-Dimensionaler

Differenz-In-Gel-Elektrophorese-(2D-DIGE-)Technologie

Um einen besseren Überblick über die nachgeschalteten Targets (downstream targets) des

COX-2 Signaling zu erhalten wurde ein Hypothese-generierender Ansatz generiert. Dafür

erfolgte zunächst die Etablierung und Verbesserung der 2-Dimensionalen

Gelelektrophorese und anschließend die Etablierung der Differenz-In-Gel-Elektrophorese-

(2D-DIGE)-Technologie, um differentiell exprimierte Kandidatenproteine zu

quantifizieren und mittels MALDI-ToF-MS oder ESI-MS/MS zu identifizieren.

4.7.1. Etablierung der 2D-DIGE-Technologie

Ausgehend vom Gesamtgewebe der Harnblase 12 Monate alter Mäuse erfolgte die

Extraktion der Proteine in Lysispuffer und anschließender Zentrifugation, um ungelöste

Bestandteile zu separieren. Daraufhin wurden 150 µg Gesamtproteinhomogenat mit

Rehydratationspuffer versetzt und über Nacht mit 18 cm langen IPG-Streifen mit einem

pH-Gradienten von pH 3 bis pH 10 inkubiert. Wie unter 3.2.4.2.2 ff. beschrieben, erfolgte

die Separierung der Proteine in der ersten Dimension nach dem isoelektrischen Punkt und

in der zweiten Dimension nach dem Molekulargewicht in 12,5 %-igen SDS-Gelen. Mittels

massenkompatibler Silberfärbung wurden die Proteine im Gel sichtbar gemacht.

Abbildung 61A zeigt eine repräsentative Darstellung eines aufgetrennten

Proteinhomogenats mit anschließender Silberfärbung einer 12 Monate alten Harnblase

einer transgenen Maus. Zu erkennen ist dabei, dass besonders im basischen Bereich

(> pH 8) eine schlechte Fokussierung der Proteine erfolgte. Auch im sauren Bereich

(< pH 4) sowie im höher molekularen Bereich (> 80 kDa) war die Auftrennung und

Fokussierung der Proteine unzureichend. Daher wurde das Gesamtproteinhomogenat nach

Zentrifugation mittels 2D-CleanUp Kit aufgereinigt, um störende Peptide, Lipide oder

Nukleinsäuren zu entfernen. Außerdem wurden 150 µg Gesamtproteinhomogenat nicht mit

Rehydratationspuffer versetzt, sondern mit DeStreak-Lösung, welches die Auftrennung im

basischen Bereich erhöhen soll. Abbildung 61B zeigt eindeutig, dass die Behandlung mit

2D-CleanUp und die anschließende Rehydratation in DeStreak-Lösung die Auftrennung


144

und Fokussierung der Proteine besonders im basischen Bereich, aber auch im sauren und

höher molekularen Bereich erhöhte. Diese Durchführung war die Grundlage für die

Etablierung und Anwendung der Differenz-In-Gel-Elektrophorese-(DIGE)-Technologie.

Für die DIGE-Technologie wurde der Minimal-labeling Ansatz gewählt. In einem

intra-Assay Ansatz wurden die Proteine aus gepoolten Harnblasen von 12 Monate alten

transgenen und Wildtyptieren (je n = 3) als fünf unabhängige technische Replikate mit

2D-CleanUp aufgereinigt und jeweils mit den CyDye-Fluorochromen (Cy2, Cy3, Cy5),

wie unter 3.2.4.3.1 beschrieben, inkubiert. Nach der Labeling-Reaktion wurden die

Probenpaare aus Wildtyp, Transgen und interner Standard (Wildtyp:Transgen, 1:1)

vereinigt, in DeStreak-Lösung und IPG-Streifen rehydriert und anschließend

elektrophoretisch in der ersten und zweiten Dimension aufgetrennt. Nach der

Gelelektrophorese wurden die Gele mittels Typhoon-Scanner 9400 in den entsprechenden

Wellenlängen der CyDye-Fluorochrome eingescannt, woraufhin die Proteinmaps des

jeweiligen Cy2-, Cy3- und Cy5-Kanals erhalten und mit ImageQuant5.2 visualisiert

wurden (Abbildung 62). Über die DyCyder-Software 6.5 erfolgte der Abgleich des

Cy2-Kanals als interner Standard jeweils mit dem Cy3- bzw. Cy5-Kanal, so dass die aus

dem internen Abgleich abgeleiteten Flächenintegrale, differentiell exprimierte Proteine

analysiert und quantifiziert werden konnten. In Abbildung 62 ist exemplarisch dargestellt,

dass ein Protein of interest (POI) in der Harnblase einer transgenen Maus verglichen zum

Wildtyptier in seiner Expression reduziert war. Dieser technische intra-Assay Ansatz

diente der Überprüfung der Reproduzierbarkeit der 2D-DIGE-Technologie. Um jedoch

bereits erste Anhaltspunkte über mögliche differentiell exprimierte Proteine zu erhalten,

wurde ein Pool aus jeweils drei Mäusen pro Gruppe gewählt und anschließend fünfmal

repliziert. Dadurch konnten falsch-positive Werte reduziert werden, wie es bei einem Tier

pro Gruppe und anschließenden fünffachen Replikaten der Fall gewesen wäre, so dass mit

diesem Ansatz auch eine Identifizierung mittels Massenspektroskopie erfolgen konnte. Das

Ergebnis des technischen Ansatzes ist in Tabelle 17 zusammengefasst. Die maximale

Anzahl detektierter Proteinspots betrug 1020 bei gesetzten zu erwartenden 2500 Spots. Das

Gel, dass die meisten als sicher identifizierten Spots aufzeigte bei einem Slope = 1, einer

Fläche > 350 und einer Peakhöhe > 250, wurde als Mastergel spezifiziert, und diente als

Grundlage zur Analyse und des Vergleiches der übrigen Gele. Über die fünf analysierten

Gele wurden 527-1020 Proteinspots von der Software innerhalb der Gele automatisch

gepaart.


145

Abbildung 61 Etablierung der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese. Repräsentative Darstellung eines

Gesamtproteinhomogenats der Harnblase einer 12 Monate alten transgenen Maus.

A) IPG-Streifen wurden über Nacht mit 150 µg Gesamtprotein in Rehydratationspuffer inkubiert. Zu erkennen

ist die geringe Fokussierung der Proteine im basischen Bereich.

B) Gesamtproteinhomogenat wurde mit 2D-CleanUp aufgereinigt und anschließend 150 µg Proteinmenge in

DeStreak-Lösung über Nacht mit IPG-Streifen inkubiert. Dies führte zu einer verbesserten Fokussierung und

Auftrennung der Proteine sowohl im basischen als auch im sauren pH-Bereich sowie im höher molekularen

Bereich.

205 --

116 --97 --

66 --

45 --

29 --

pH 3 10kDa

205 --

116 --97 --

66 --

45 --

29 --

A

B


146

Abbildung 62 Analytische Auswertung der 2-Dimensionalen Differenz-In-Gel-Elektrophorese (2D-DIGE). Die

Abbildungen zeigen eine repräsentative Darstellung des Master-Gels. Nach Markierung der Proteine mit den

CyDye-Fluorochromen sowie anschließender gelelektrophoretischer Auftrennung der Proteine, wurden die Gele

mittels Typhoon Scanner 9400 entsprechend der Fluorochromwellenlängen gescannt, woraufhin die jeweiligen

Proteinmaps erhalten wurden. Nach Abgleich des Cy3- bzw. Cy5-Kanals über den internen Standard (Cy2)

wurden differentiell exprimierte Protein analysiert und quantifiziert. Exemplarisch dargestellt ist die

Herunterregulation der Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 im Transgen verglichen zum Wildtyp.

Quantifizierung mittels DyCyder Software 6.5.

Cy3 Cy2 Cy5

Cy2-Cy3

Abgleich

Cy2-Cy5

Abgleich

Cy2-Cy3-Cy5

Image

205 --116 --97 --

66 --

45 --

29 --

kDa pH 3 10

wt tr


147

Auf Basis der Nullhypothese, die der Software zugrunde liegt, zeigte sich, dass bei einer

Erhöhung der Replikate die Anzahl an automatisch gepaarten Spots abnahm, wie es auch

erwartet werden kann, während aber die Abnahme an differentiell exprimierten Spots bei

Replikaterhöhung über den Verlauf wesentlich geringer war, so dass bei einer weiteren

Erhöhung an Replikaten keine Verbesserung an positiven Werten erzielt werden konnte.

Um jedoch falsch-positive Werte weiter auszuschließen und die Multiplizität indirekt zu

berücksichtigen, wurde der p-Value von 0,05 auf 0,005 erniedrigt, dass die Anzahl der

ermittelten, differentiell exprimierten Proteine noch einmal reduzierte (Tabelle 17) und

damit die Signifikanz erhöhte. Damit konnte insgesamt gezeigt werden, dass drei

Wiederholungen als Minimalanforderung bei technischen Replikaten als geltend angesehen

werden konnten und die eingesetzte 2D-DIGE-Technik eine sehr hohe Reproduzierbarkeit

aufzeigte.

Tabelle 17 Analytische Auswertung des intra-Assay 2D-DIGE Versuchsansatz auf Grundlage der Nullhypothese

Mastergel 1020

Detektierte Spots 648-1020

Automatisch gepaarte Spots 527-1020

Null-Hypothese

Begrenzt auf

Proteine präsent in x

Gelen

Gepaarte Spots Threshold Differentiell exprimiert

p < 0,05 p < 0,005

5 300 + 1,5 30 27

4 486 + 1,5 35 31

3 657 + 1,5 40 34

2 833 + 1,5 45 35

1 1020 + 1,5 45 35


148

Da drei Harnblasen als Pool pro Gruppe verwendet wurden, konnte die Auswertung des

technischen Versuchsansatzes für die Analyse der POIs genutzt werden, um die 27

differentiell exprimierten Proteine, die in fünf Replikaten mit p-Value < 0,005 analysiert

und quantifiziert wurden, zu identifizieren und damit erste Anhaltspunkte auf die

downstream Targets des COX-2 Signaling zu erhalten. Dazu wurden die Proteine durch

massenkompatible Silberfärbung sichtbar gemacht, wie es in Abbildung 63 dargestellt ist.

Mittels eines 1:1 Ausdrucks des Mastergels, auf dem die POIs markiert wurden, konnten

die Kandidatenproteine aus dem Silbergel ausgeschnitten und tryptisch verdaut werden.

Von den 27 analysierten Kandidatenproteinen konnten 22 Proteine mittels

MALDI-ToF-MS und zusätzlich durch ESI-MS/MS (nanoESI-Q-ToF) identifiziert bzw.

bestätigt werden, wenn ihr Mascot Score zu gering war (< 45) oder deren Identifizierung

zu wenig spezifische Signale ergab.

Abbildung 63 Analytische Auswertung der 2D-DIGE mit anschließender Silberfärbung des technischen

Versuchsansatzes. Die Abbildung zeigt das Master-Gels des intra-Assay Versuches. Massenkompatible

Silberfärbung der Gele nach der analytischen Auswertung der differentiell exprimierten Proteine. Durch 1:1-

Übertragung wurden die markierten Protein aus dem Mastergel geschnitten, tryptisch verdaut und mittels

MALDI-ToF-MS analysiert und durch Proteindatenbankabgleich identifiziert.

In Tabelle 18 sind die identifizierten Kandidatenproteine zusammengefasst. Dabei ist zu

erkennen, dass die differentiell exprimierten Proteine in verschiedenen Signalwegen

involviert sind, und daher in unterschiedliche Kategorien eingeordnet werden konnten:

-- 205 --

-- 116 ---- 97 --

-- 66 --

-- 45 --

-- 29 --

kDa pH 3 10pH 3 10


149

Cytoskelett, Detoxifizierung/Antioxidants, Entzündung, Generelle Enzyme, Homeostase,

Metabolismus, Plasma, Proteasom, Signaltransduktion und Transport. Besonders die

erhöhte Expression der Proteine Glutathione S-transferase (GST, die beiden Isoenzyme

omega 1 und mu 1) und Peroxiredoxin-(Prx-)2 der Detoxifizierungs- und

Antioxidantsgruppe in der Harnblase transgener Mäuse explizierten einen vermehrten

oxidativen Stress im K5.COX-2 transgenen Mausmodell, dessen weitere Untersuchung im

Mittelpunkt dieser Arbeit stand.

Tabelle 18 Differentiell exprimierte Proteine in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase verglichen mit Wildtyptieren des intra-Assay Versuchsansatzes.

Spot-Nr. Accession Nr. Kategorie Proteinbeschreibung

Protein-

masse

[Da]

Average p-Value Mascot

score

Sequence

Coverage

[%]

pI Funktion

489* gi|4895037 Cytoskelett Coronin-1 [Mus

musculus] 51627 2,28 0,0015 214 14 6,05

Aktinbindung/Leukozytenbindung/

Phagosombildung/Chemokin-vermittelte

Migration

853 gi|547749 Cytoskelett

Keratin, type I

cytoskeletal 10

(Cytokeratin-10) (CK-

10) (Keratin-10) (K10)

59711 1,75 0,00012 139 29 5,13 Cytoskelettorganisation/Signaltrans-

duktion


Myosin, light

polypeptide 1 [Mus

musculus]

20695 1,66 0,0026 364 51 4,98 Cytoskelettorganisation und -biogenese

935* gi|127134 Cytoskelett Myosin light chain 3,

skeletal muscle isoform 16703 1,6 0,00022 143 21 4,62 Cytoskelettorganisation und -biogenese

848 gi|6754090 Detoxifizierung

Glutathione S-

transferase omega 1

[Mus musculus]

27708 1,55 2,70E-05 51 16 6,92 Metabolische Prozesse/Katalyse

Glutathion-abhängiger Reaktionen

901* gi|6754084 Detoxifizierung

Glutathione S-

transferase, mu 1 [Mus

musculus]

26067 1,58 0,0023 205 21 7,71 Protein turnover/Proteinbindung

934*, 935* gi|2499469 Detoxifizierung/

Antioxidants

Peroxiredoxin-2

(Thioredoxin peroxidase

1) (Thioredoxin-

dependent peroxide

reductase 1)

21936 1,66 0,0026 182 31 5,20 Protein turnover/Antioxidants

557* gi|195156 Entzündung

Immunoglobulin heavy

chain constant region

[Mus musculus

domesticus]

27891 1,74 0,0001 98 8 7,68 Immunreaktion/Endozytose/ Proteolyse

488* gi|15929675 Entzündung Serpina1c protein [Mus

musculus] 45764 2,99 0,0006 228 11 5,31

Akute-Phase Antwort/inhibiert

Serinproteasen

768* gi|71067102 Generelle Enzyme

Aldo-keto reductase

family 1, member B10

[Mus musculus]

36054 3,15 4,10E-05 43 5 6,8 Katalyse NADP-abhängiger Reaktionen

741, 744,

745 gi|7548322 Generelle Enzyme

Aldolase A [Mus

musculus] 39925 1,63 0,00022 104 39 8,55 Glycolyse

790 gi|786001 Generelle Enzyme Aldose reductase [Mus

musculus] 36068 1,58 0,00028 70 26 6,71

Katalyse NADPH- & Aldehydabhängiger

Reaktionen

674, 681,

684 gi|6671762 Generelle Enzyme

Creatine kinase, muscle

[Mus musculus] 43246 1,59 0,0063 162 31 6,58 Energiehomeostase

585, 595 gi|71059715 Generelle Enzyme Eno3 [Mus musculus] 47310 1,74 5,10E-05 70 14 6,29

Glycolyse/Phosphoenolpyruvat Hydratase

& Lyaseaktivität/ Differenzierung und

Entwicklung des Muskels/Myogenese

853*, 869,

871 gi|31982861 Homeostase

Carbonic anhydrase 3

[Mus musculus] 29633 1,77 8,00E-06 157 40 6,89

pH-Homeostase/

Hydrogencarbonatreaktion

627* gi|89573965 Metabolismus

Isocitrate

dehydrogenase 1 [Mus

musculus]

42962 1,61 2,07E-03 541 36 5,98 Katalyse NADP-abhängiger Reaktionen zur

NADPH-Bildung

858* gi|7363449 Plasma

Serum amyloid

P-component [Mus

musculus]

26500 3,52 0,00064 157 14 6,33 anti-Opsonin/unterdrückt Immunantwort

886* gi|61098212 Proteasom

Ubiquitin carboxy-

terminal hydrolase L1

[Mus musculus]

25165 -1,93 2,20E-05 87 17 5,14

Ubiquitin-ligase Aktivität/ Prozessierung

ubiquinierter (Ub) Proteine/Hydrolyse von

Ub

934* gi|84794552 Signaltransduktion

Phosphatidylethanol-

amine binding protein 1

[Mus musculus]

20988 1,66 0,0026 147 39 5,19 postranslationale Modifikation/

Serinproteaseninhibitor

567* gi|6678643 Transport Albumin 1 [Mus

musculus] 70730 2,1 8,00E-66 95 2 5,75

Trägermolekül/Lipid- & Proteinbindung/

negative Apoptoseregulation

336* gi|23956086 Transport/ Plasma Hemopexin [Mus

musculus] 52049 1,85 0,0015 260 14 7,92 Häm-Transport/akute Phase-Reaktant

303*, 312 gi|20330802 Transport Transferrin [Mus

musculus] 78841 1,93 1,70E-06 975 36 6,94 Eisentransport/Zellwachstumsstimulation

Identifizierung der Proteine erfolgte mittels MALDI-ToF-MS Analyse und dem Mascot-Fingerprint-Abgleich. In ihrer Expression waren in der Harnblase transgener Mäuse 21

Proteine erhöht und ein Protein erniedrigt. * Proteine wurden durch ESI-MS/MS Analyse identifiziert bzw. bestätigt.


152

4.7.2. COX-2 Überexpression erhöht den oxidativen Stress

4.7.2.1. COX-2 abhängige Peroxiredoxin-(Prx-)1 und Prx-2 Expression

in transgenen Mäusen

Die signifikant erhöhte Expression der Detoxifizierungsenzyme GST und Prx-2 im

intra-Assay Ansatz des 2D-DIGE Experiments explizierten einen vermehrten oxidativen

Stress in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse. Um zu untersuchen, ob eine

COX-2 abhängige differenzielle Expression vorliegt bzw. die COX-2 Überexpression

einen Einfluss auf den oxidativen Stress hat, erfolgte eine Immunoblot-Analyse der sechs

Peroxiredoxin-Isoformen der Peroxiredoxinfamilie von nicht-hyperplastischen und

hyperplastischen Harnblasen 12 Monate alten transgenen Mäusen und Wildtyptieren sowie

mit dem COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib (CX) behandelten transgenen Tieren. Wie

aus Abbildung 64 ersichtlich, wurden die Prx-Isoformen Prx-1, -2, -3, -5 und -6 in allen

untersuchten Mäusen exprimiert. Die semi-quantitative Analyse über -Aktin als

Ladekontrolle zeigte keine Unterschiede in der Expression der Prx-Isoformen zwischen

nicht-hyperplastischer transgener Harnblase und der von Wildtyptieren. Jedoch in der

hyperplastischen Harnblase transgener Mäuse erfolgte eine signifikant erhöhte Expression

der Prx-Isoformen Prx-1 (1,6, p-Value 0,007), Prx-2 (1,5, p-Value 0,040), Prx-3 (2,0,

p-Value 0,009) und Prx-6 (1,7, p-Value 0,009). In CX behandelten transgenen Mäusen war

nur die Expression von Prx-1 (1,5, p-Value 0,023) und Prx-2 (1,5, p-Value 0,013)

signifikant wieder auf Wildtypniveau reduziert (Prx-3: 1,3, p-Value 0,379; Prx-6: 1,2,

p-Value 0,429).

Durch die Immunoblot-Analyse konnte zum einen die signifikant erhöhte Expression von

Prx-2 aus dem intra-Assay 2D-DIGE Experiment bestätigt und zum anderen die Annahme

bekräftigt werden, dass in der Harnblase transgener Mäuse ein erhöhter oxidativer Stress

vorlag, der im Hinblick auf die Prx-1 und Prx-2 Expressionslevel, COX-2 abhängig zu sein

schien und daher in einem in vitro Ansatz weiter untersucht wurde.


153

Abbildung 64 Immunoblot zum Nachweis der differentiellen Expression der Peroxiredoxin-(Prx-)Isoformen in

12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase. Die semi-quantitative Auswertung, normiert über -Aktin,

zeigte keine veränderte Expression der Prx-Isoformen in nicht-hyperplastischen Harnblasen (n.h.), während eine

signifikante Erhöhung der Expression von Prx-1, Prx-2, Prx-3 und Prx-6 in hyperplastischen Harnblasen (h.)

bezogen auf Wildtyptiere ermittelt werden konnte (> 1,5, p-Value < 0,04). In CX behandelten Mäusen war die

Expression von Prx-1 und Prx-2 auf Wildtypniveau reduziert (1,5, p-Value < 0,02). 60 µg Gesamtproteinextrakt

wurden im 15 %-igen SDS-Gel separiert. PK = Positivkontrolle HeLa-Zellextrakt. n = 3 Tiere pro Gruppe.

Student´s t-Test.

45 -Aktin

Prx-6

Prx-5

Prx-4

Prx-3

Prx-2

Prx-1

wt tr (h.)tr (n.h.) tr CXkDa PK

29

29

29

29

29


154

4.7.2.2. Oxidativer Stress wird durch COX2-PGE2-Signalweg verstärkt

Die gewebliche Proteom-Analyse des intra-Assay 2D-DIGE Experiments und die

Validierung mittels Immunoblot deutete auf einen erhöhten und scheinbaren COX-2

abhängigen oxidativen Stress in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse hin. Um

den oxidativen Stress zu analysieren wurde ein in vitro Ansatz generiert und dafür die

humanen Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637 (TCC-Zelllinien) verwendet, da

deren Charakterisierung mittels RT-PCR und Immunoblot adäquate Expressionsprofile,

bezogen auf Her-2, COX-Isoenzyme, PGES und EP-Rezeptor Isoformen zum transgenen

Mausmodell zeigten (s. 4.6.3). Um zu überprüfen, ob auch in den humanen TCC-Zelllinien

die COX-2 Expression einen Einfluss auf die Prx-Expression hat, wie es im transgenen

Mausmodell gezeigt werden konnte, wurden die humanen Urothelkarzinomzelllinien mit

dem COX-2 selektiven Inhibitor Celecoxib für 24 Stunden behandelt. Abbildung 65 zeigt,

dass alle sechs Prx-Isoformen in beiden Zelllinien nachgewiesen werden konnten. In RT

112 war die Expression von Prx-3 und Prx-5 stärker als in 5637 und von Prx-2 und Prx-4

schwächer. Prx-1 und Prx-6 wurden in beiden Zelllinien in etwa gleich stark exprimiert.

Die semi-quantitative Analyse über -Aktin zeigte jedoch keine Unterschiede in der

Expression der Prx-Isoformen zwischen CX behandelten und unbehandelten Zellen, so

dass davon ausgegangen werden konnte, dass die kurzzeitige

Inhibierung der COX-2 Expression im gut-differenzierten Urothelkarzinom die Regulation

der Expression der Prx-Isoformen unberührt lässt, wenngleich in der hyperplastischen

Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse noch eine Abhängigkeit vorlag (s. Abbildung

64).

Die Charakterisierung der humanen TCC-Zelllinien zeigte insgesamt ein adäquates

Expressionsprofil zum transgenen Mausmodell, so dass mittels eines generierten in vitro

Ansatzes die Analyse des oxidativen Stresses in den TCC-Zelllinien mittels AmplexRed

Assay erfolgte, um zu überprüfen, ob die COX-2 Expression den oxidativen Stress

zusätzlich bedingt. Dazu wurden die Zellen 24 Stunden mit dem selektiven COX-2

Inhibitor Celecoxib (CX), in Kombination mit CX und steigenden Konzentrationen an

PGE2 sowie nur mit PGE2 inkubiert. Der Start der AmplexRed Reaktion wurde durch

Zusatz von 30.000 Zellen/Well eingeleitet und nach zwei Stunden ausgewertet.


155

Abbildung 65 Darstellung der Expression der Peroxiredoxin (Prx-)Isoformen mittels Immunoblot in RT112 und

5637 Zellen. Zellen wurden 24 Stunden mit 2,5 µM des selektiven COX-2 Inhibitors Celecoxib (CX) behandelt,

anschließend geerntet und 60 µg Gesamtprotein mittels 15 %-igen SDS-Gel separiert. Alle Prx-Isoformen konnten

in beiden Zelllinien gleichermaßen detektiert werden. Die CX-Behandlung zeigte keinen Effekt auf die Expression

der Prx-Isoformen. Als Ladekontrolle diente -Aktin. PK = Positivkontrolle HeLa-Zellextrakt. n = 2 unabhängige

Proben pro Gruppe.

RT112 5637kDa

24 Prx-1

24 Prx-3

24

Prx-4

35

Prx-6

40 -Aktin

PK

- - + + + +- - CX

24 Prx-2

15 Prx-5


156

In Abbildung 66 ist zu erkennen, dass die Behandlung mit dem COX-2 selektiven Inhibitor

CX (2,5 µM) zu einer signifikanten Reduktion des oxidativen Stresses in RT112

TCC-Zellen (27 %, p-Value < 0,001) und 5637 TCC-Zellen (> 39 %, p-Value < 0,001)

führte. Die zusätzliche Behandlung der Zellen mit 2,5 µM bzw. 5 µM PGE2 konnte diesen

inhibitorischen Effekt wieder signifikant kompensieren (p-Value < 0,001). Dies zeigte

eindeutig, dass der COX-2-PGE2-Signalweg den oxidativen Stress zusätzlich erhöhte und

damit COX-2 und PGE2 abhängig war.

Der alleinige exogene Zusatz von 2,5 µM PGE2 führte zu keiner weiteren Erhöhung des

oxidativen Stresses, während 5 µM PGE2 den oxidativen Stress in beiden Zelllinien

reduzierte. Eine mögliche Erklärung dafür ist, das Prostaglandine in der Lage sind als

Radikalfänger zu wirken, woraufhin ihnen auch eine anti-oxidative Wirkung zu

geschrieben wird (176). Unter Reaktion mit freien Radikalen können dabei die

Prostaglandin-ähnlichen Verbindungen, Isoprostane, entstehen (177;178). Ferner konnte

Mada et al. zeigen, dass hohe Konzentrationen von exogenem PGE2 die Proliferation von

Zellen unterdrücken kann (179). Mögliche Ursache dessen kann die Bildung der

Cyclopentanone aus Prostaglandinen sein, die in hohen Konzentrationen cytotoxisch

wirken (148).


157

Abbildung 66 Effekt einer Celecoxib-(CX-)Behandlung auf den oxidativen Stress der humanen RT112 und 5637

Zellen. Die CX-Behandlung führte zu einer signifikanten Abnahme (> 25 %, * p-Value < 0,001) des oxidativen

Stresses, während der exogene Zusatz von PGE2 in RT112 Zellen mit einer Konzentration von 5 µM und in 5637

Zellen von 2,5 µM den inhibitorischen Effekt signifikant kompensierte (+ p-Value < 0,001). Der alleinige exogene

Zusatz von 2,5 µM PGE2 zeigte keine zusätzliche Erhöhung des oxidativen Stresses, während 5 µM PGE2 zu einer

Reduktion des oxidativen Stresses in beiden Zelllinien führte. Vermutlich fungierte exogenes PGE2 als

Radikalfängers in der AmplexRed Assay Reaktion. Für den Assay wurden humane Urothelkarzinomzellen

24 Stunden mit 2,5 µM CX bzw. in Kombination 2,5 µM CX mit 2,5 µM bzw. 5 µM PGE2 sowie mit PGE2 ohne

Inhibitor behandelt, anschließend geerntet und in KRPG-Lösung überführt. Der Versuchsbeginn wurde durch

Zusatz von 30.000 Zellen zum Reaktionsansatz eingeleitet, photometrisch bei 560 nm verfolgt und der Zeitpunkt

120 min ausgewertet. 100 % der RT112 Zellen entspricht 0,8411±0,0264 µM H2O2 und der 5637 Zellen

0,6520±0,0741 µM H2O2. Die Linie in der Box repräsentiert den Median und das Viereck den Mean. Die Boxen

sind begrenzt durch den ersten und dritten Quartile. Die Whiskers repräsentieren das Minimum bzw. Maximum

mit dem Koeffizienten x1,5 (inter-quartile range). Der Boxplot ergibt sich aus 2-4 unabhängigen Versuchen mit

jeweils n = 3 Replikaten. Ko = Kontrolle.

Um zu bekräftigen, dass die Reduktion des oxidativen Stresses durch die Hemmung der

COX-2 Aktivität und damit der Reduktion des PGE2-Levels bedingt wurde, erfolgte die

Bestimmung des PGE2-Levels der TCC-Zelllinien CX-Behandlung mittels Enzyme

Immunosorb Assay, welches in Abbildung 67 dargestellt ist. Dabei ist zu sehen, dass nach

Behandlung mit dem spezifischen COX-2 Inhibitor Celecoxib der PGE2-Level in RT112

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Ko 2,5 µM CX 2,5 µM CX & 2,5 µM PGE2 2,5 µM CX & 5,0 µM PGE

2 2,5 µM PGE

2 5,0 µM PGE

2

- + + + - -

PGE2

5637O

xid

ati

ver

Str

ess

[%

Ko

ntr

oll

e]RT112

CX- + + + - -

* + * +


158

Zellen um 86 % (1658,56 ± 228,85 pg/ml Kontrolle; 231,94 ± 50,06 pg/ml CX behandelt)

und in 5637 Zellen um 65 % (18527,94 ± 1448,41 pg/ml Kontrolle;

6545,63 ± 775,85 pg/ml CX behandelt) reduziert wurde. Dies zeigt eindeutig eine

Hemmung der COX-2 Aktivität und eine Bekräftigung der obigen Ergebnisse. Um

zusätzlich zu klären, ob der oxidative Stress wieder zunimmt, wenn der COX-2 selektive

Inhibitor Celecoxib abgesetzt wird, erfolgte eine kinetische Messung der TCC-Zelllinie

RT112 über 24 Stunden (Abbildung 68). Wie bereits auch unter Abbildung 66 erkennbar,

führte die CX-Behandlung zu einer signifikanten Abnahme des oxidativen Stresses in den

behandelten Zellen. Jedoch zeigen ausgewählte Zeitpunkte deutlich die Zunahme des

oxidativen Stresses nach dem Absetzen des selektiven COX-2 Inhibitors. Nach 23 Stunden

war der oxidative Stresslevel wieder auf Niveau der unbehandelten Zellen. Damit konnte

wiederholt gezeigt werden, dass die COX-2 Aktivität den oxidativen Stress begünstigte

und förderte.

Abbildung 67 Bestimmung von PGE2 in humanen Urothelkarzinomzelllinien nach Celecoxibbehandlung. Nach

Behandlung der Zellen mit dem spezifischen COX-2 Inhibitor Celecoxib (CX) wurde die PGE2-Menge signifikant

(> 65 %, p-Value < 0,001) bezogen auf die Kontrollzellen reduziert. Die Mittelwerte ergeben sich aus n = 5

unabhängigen Messungen ± SD. Student´s t-Test. Ko = Kontrolle.

RT112 5637

0

4000

8000

12000

16000

20000

PG

E2 L

ev

el

nach

CX

-Beh

an

dlu

ng

[p

g/m

l]

Zelllinien

Ko

2,5 µM CX


159

Abbildung 68 Zunahme des oxidativen Stresses nach Aufhebung der Hemmung der katalytischen Aktivität von

COX-2 durch den Inhibitor Celecoxib. Das Diagramm zeigt eine repräsentative Darstellung der RT112 Zelllinie,

bei der zu sehen ist, dass die CX-Behandlung zu einer signifikanten Abnahme (> 40 %, * p-Value < 0,001) des

oxidativen Stresses führte, wenn die katalytische Aktivität der COX-2 durch den selektiven Inhibitor Celecoxib

inhibiert wurde. Ausgewählte Zeitpunkte verdeutlichen die Zunahme des oxidativen Stresses beim Absetzen des

selektiven Inhibitors CX und dem Wiedererlangen der COX-2 Aktivität. Dargestellt sind zwei unabhängige

Experiment mit jeweils n = 3 Replikaten. Die Balken repräsentieren die Mittelung aus den Versuchen.

Exp: Experiment.

4.7.3. Oxidativer Stress verursacht eine erhöhte Expression von Nrf-2 in

der Harnblase transgener Mäuse

Die bisherigen Ergebnisse der geweblichen Proteomanalyse mittels 2D-DIGE-Technologie

eines intra-Assay Ansatzes und dessen Validierung zeigten eindeutig, dass die COX-2

Überexpression den oxidativen Stress verstärkt und die differentielle Expression

verschiedener Proteine, die vorrangig durch MALDI-ToF-MS Analyse identifiziert werden

konnten, verursachte. Um diese Ergebnisse weiter zu bekräftigen, falsch-positive Werte

durch eine hohe Anzahl technischer Replikate zu minimieren und um einen größeren

Überblick über die downstream Targets des COX-2 Signaling zu erhalten, wurde ein

0

20

40

60

80

100

120

140

23 h

360

min

240

min

180

min

120

min

60 m

in

Exp1

Exp2O

xid

ati

ver

Str

ess

[%

]

Ko


160

biologischer Ansatz (inter-Assay) mit jeweils fünf unabhängigen Proben der Harnblase

12 Monate alter transgener und Wildtyptiere generiert. Zusätzlich erfolgte die Analyse der

differentiell exprimierten Proteine unabhängig vom p-Value, somit unterschiedlich zum

intra-Assay Ansatz, um zu ermitteln, wie viele Proteine in einem, zwei, drei, vier und fünf

Untersuchungspaaren bei einem Threshold von ± 1,4 differentiell exprimiert waren. Wie

Abbildung 69 zeigt, wurden die Kandidatenproteine im Mastergel markiert, um sie aus

dem silbergefärbten Gel auszuschneiden, tryptisch zu verdauen und für die LCQ

(nanoESI-Q-ToF) zu extrahieren. Die Datenquantifizierung zeigte, dass von den maximal

detektierten 945 Proteinspots 29 in 5/5 Untersuchungspaaren differentiell exprimiert

waren, 12 in 4/5, acht in 3/5, 14 in 2/5 und zwei in 1/5, d. h. in der Summe 65 Proteinspots,

von denen in der Harnblase transgener Mäuse insgesamt 28 in ihrer Expression erhöht und

37 erniedrigt waren. Die Identifizierung der Kandidatenproteine erfolgte ausschließlich mit

ESI-MS/MS-Analyse und anschließendem Mascot Datenbankabgleich (Matrix Science)

und ist in Tabelle 19 zusammengefasst. Die Q-ToF-Technik basiert auf Sequenzanalyse, so

dass die ESI-MS/MS-Analyse wesentlich sensitiver ist als MALDI-ToF-MS, die auf

Peptidmassenanalyse basiert, und daher weit mehr potenzielle Kandidatenproteine

identifiziert werden können. Insgesamt wurden 129 potenzielle Kandidatenproteine

identifiziert (s. Tabelle 19). Ähnlich wie im intra-Assay Ansatz konnten die differentiell

exprimierten Proteine des inter-Assay Ansatzes in unterschiedliche Kategorien hinsichtlich

ihrer Funktionen eingeordnet werden: AAA ATPase Familie, Chaperone, Cytoskelett und

Muskulatur, Tumorsuppressor, Detoxifizierung, Entzündung, Generelle Enzyme,

Proteinbiosynthese, Signaltransduktion und Metabolismus, Transport sowie Zellwachstum.

Für die vereinfachte Übersicht wurden die Kandidatenproteine nach der Kategorie sortiert,

auch, wie aus Tabelle 19 ersichtlich ist, wenn mehrere Kandidatenproteine auf einem Spot

lagen. Zum Beispiel wurden auf Spot 644 die Kandidatenproteine Heat shock protein 70

cognate (Chaperone), Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (Proteinbiosynthese) und

alpha 1 Actin precursor (Cytoskelett) identifiziert. Dabei stellte sich die Frage, welches der

Kandidatenproteine tatsächlich die differentielle Expression bedingte. Als Grundlage

hätten der Mascot Score (> 50) und die Matches herangezogen werden können, d. h. alle

Kandidatenproteine mit einem Mascot Score < 50 und einem Match von eins könnten aus

der Liste potentieller Kandidatenproteine entfernt werden, da ihre eindeutige

Identifizierung nicht sichergestellt werden kann bzw. in einer mehrfachen

Spotidentifizierung würden nur die weiter betrachtet werden, die den höchsten Mascot


161

Score aufzeigen. Damit ließen sich falsch-positive Ergebnisse minimieren. Jedoch würden

somit auch Einzelspot-Kandidatenproteine, wie z. B. Spot 826, Epidermal growth factor-

receptor-binding protein GRB-3 (Signaltransduktion/Zellwachstum) mit einem Mascot

Score von 41 und einem Match von eins, ebenfalls unberücksichtigt bleiben. Ein weiteres

Kriterium wäre der pI-Vergleich, aber aufgrund posttranslationaler Modifikationen können

Proteine einen pI-Shift erfahren, was tatsächlich im 2D-Gel für die Glutathione

S-transferase beobachtet werden konnte (s. Abbildung 70) und somit nicht mit ihrem

theoretischen pI korrelieren müssen. Der mehrfache Abgleich der MS-Spektren und

Mascot Daten zeigte eine eindeutige Identifizierung und Bestimmung der in Tabelle 19

aufgeführten Kandidatenproteine.

Abbildung 69 Analytische Auswertung der 2D-DIGE mit anschließender Silberfärbung. Die Abbildung zeigt das

Master-Gel des biologischen Assays. Massenkompatible Silberfärbung der Gele nach der analytischen

Auswertung der differentiell exprimierter Proteine. Durch 1:1-Übertragung wurden die markierten Protein aus

dem Gel geschnitten, aufgereinigt, tryptisch verdaut, extrahiert und mittels ESI-MS/MS analysiert und durch

Proteindatenbankabgleich identifiziert. Es wurden 754- 945 Proteinspots detektiert, von denen 65 differentiell

exprimiert waren bei einem Threshold von ± 1,4.

Wiederholt zeigte sich eine differentielle Expression von Proteinen im Transgen, die in

Detoxifizierungsprozessen involviert sind, wie z. B. die Phospholipid hydroperoxide

glutathione peroxidase sowie verschiedene Isoformen der Glutathione S-transferase,

welches die obigen Ergebnisse hinsichtlich des oxidativen Stresses bekräftigten.

-- 205 ---- 116 ---- 97 --

-- 66 --

-- 45 --

-- 29 --

kDa pH 3 10pH 3 10

Tabelle 19 Differentiell exprimierte Proteine in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase des biologischen (inter-Assay) Versuchsansatzes.

Spot-

Nr.

Accession

Nr. Kategorie Proteinbeschreibung

Protein-

masse

[Da]

Auftreten Average Mascot

score Matches

Sequence

Coverage

[%]

PI Funktion

202 gi|400712 AAA ATPase

Familie

Transitional

endoplasmic reticulum

ATPase (TER

ATPase) (15S

Mg(2+)-ATPase p97

subunit) (Valosin-con)

[Mus musculus]

89936 15/15 1,51 90 3 4 5,14 Chaperone-ähnliche Funktion/ Ubiquitinierung

644 gi|309319 Chaperone

Heat shock protein 70

cognate [Mus

musculus]

71021 15/15 2,34 339 10 14 5,37 Zellzyklusregulation/

Proteinfaltung/Proteintransport

202 gi|50510675 Cytosklelett/

Muskulatur

Myh11 protein [Mus

musculus]

(mKIAA0866 protein

[Mus musculus])

228983 15/15 1,51 210 5 2 5,38 ATPase Aktivität,

Muskelkontraktion


Muskulatur

Myh11 protein [Mus

musculus] 227864 6/15 1,55 176 7 4 5,4

ATPase Aktivität,

Muskelkontraktion


Muskulatur

Myh11 protein [Mus

musculus] 227864 6/15 1,42 246 5 2 5,4

ATPase Aktivität,

Muskelkontraktion

472 gi|38605043

Cytoskelett/

glatte

Muskulatur

Myosin regulatory

light chain 2, smooth

muscle isoform

(Myosin RLC)

(Myosin regulatory

light chain) [Mus

musculus]

19898 15/15 -1,41 63 2 22 4,8 Muskelkontraktion

864 gi|38605043 Cytoskelett/ Myosin regulatory 19898 15/15 -1,81 200 6 43 4,8 Muskelkontraktion

glatte

Muskulatur


muscle isoform

(Myosin RLC)

(Myosin regulatory

light chain) [Mus

musculus]

906 gi|38605043

Cytoskelett/

glatte

Muskulatur

Myosin regulatory


muscle isoform

(Myosin RLC)

(Myosin regulatory

light chain) [Mus

musculus]

19898 12/15 3,24 203 6 46 4,8 Muskelkontraktion

399 gi|38605043

Cytoskelett/

glatte

Muskulatur

Myosin regulatory


muscle isoform

(Myosin RLC)

(Myosin regulatory

light chain) [Mus

musculus]


944 gi|38605043

Cytoskelett/

glatte

Muskulatur

Myosin regulatory


muscle isoform

(Myosin RLC)

(Myosin regulatory

light chain) [Mus

musculus]


908 gi|7305295

Cytoskelett/

glatte

Muskulatur

Myosin, heavy

polypeptide 11,

smooth muscle [Mus

musculus]


820 gi|7305295 Cytoskelett/

glatte

Myosin, heavy

polypeptide 11, 223983 12/15 1,4 240 7 3 5,39 Muskelkontraktion

Muskulatur smooth muscle [Mus

musculus]

440 gi|12851268

Cytoskelett/

glatte

Muskulatur

Myosin light chain,

regulatory B-like

[Mus musculus]


421 gi|50190

Cytoskelett/

glatte

Muskulatur

beta-Tropomyosin

[Mus musculus] 32982 9/15 1,4 40 1 3 4,61 Muskelkontraktion

944 gi|54912

Cytoskelett/

glatte

Muskulatur

Tropomyosin alpha-3

chain (Tropomyosin-

3) (Tropomyosin

gamma) [Mus

musculus]



alpha 1 Actin

precursor [mus

musculus]

42366 15/15 1,51 112 3 8 5,23 Strukturprotein/Proteinbindung

644 gi|4501881 Cytoskelett alpha 1 actin precursor

[Mus musculus] 42366 15/15 2,34 79 4 12 5,23 Strukturprotein/Proteinbindung


alpha 1 Actin

precursor [Mus

musculus]

42366 6/15 1,52 213 5 14 5,23 Strukturprotein/Proteinbindung

202 gi|49868 Cytoskelett put. beta-Actin (aa 27-

375) [Mus musculus] 39446 15/15 1,51 64 1 5 5,78 Strukturprotein/Proteinbindung


Actin related protein

2/3 complex, subunit

3 [Mus musculus]

20739 12/15 -1,82 64 2 13 8,78 Strukturprotein/Proteinbindung

743 gi|49864 Cytoskelett alpha-Actin (aa 40-

375) [Mus musculus] 38016 6/15 1,42 195 6 20 5,45 Strukturprotein/Proteinbindung

202 gi|21704156 Cytoskelett Caldesmon 1 [Mus 60531 15/15 1,51 111 5 11 6,97 Muskelkontraktion/

musculus] Proteinbindung

202 gi|17017241 Cytoskelett h-Caldesmon [Mus

musculus] 37232 15/15 1,51 54 1 8 5,26

Muskelkontraktion/

Proteinbindung

470 gi|74195473 Cytoskelett Keratin 8 [Mus

musculus] 54497 15/15 -1,48 979 24 40 5,7 Strukturprotein/Proteinbindung

677 gi|7948997 Cytoskelett PDZ and LIM domain

3 [Mus musculus] 34734 15/15 -1,77 69 6 25 8,09

Aktinbindung/

Signaltransduktion/Muskulatur

682 gi|7948997 Cytoskelett PDZ and LIM domain

3 [Mus musculus] 34734 9/15 -1,74 48 1 5 8,09

Aktinbindung/

Signaltransduktion/Muskulatur

708 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor

Calponin-1 (Calponin

H1, smooth muscle)

(Basic calponin)

[Mus musculus]

33506 15/15 -2,97 382 8 32 9,05 Muskelkontraktion/Repressor

Zellproliferation

709 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin)

[Mus musculus]


Zellproliferation

710 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin)

[Mus musculus]


Zellproliferation

711 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin)

[Mus musculus]


Zellproliferation

868 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin)

[Mus musculus]

33506 15/15 1,45 186 5 22 9,05 Muskelkontraktion/Repressor

Zellproliferation

908 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin)

[Mus musculus]


Zellproliferation

867 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin)

[Mus musculus]


Zellproliferation

905 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin) [Mus

musculus]


Zellproliferation

715 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin)

[Mus musculus]


Zellproliferation

873 gi|584951

Cytoskelett/

Tumor-

suppressor


H1, smooth muscle)

(Basic calponin) [Mus

musculus]


Zellproliferation

868 gi|5031595 Cytoskelett Arpc4 protein [Mus

musculus] 19768 15/15 1,45 89 2 13 8,53

Proteinmodifikation/Tubulin-

Tyrosin-Ligaseaktivität

875 gi|9790219 Cytoskelett Destrin [Mus

musculus] 18852 15/15 2,19 89 3 23 8,14

Zellbeweglichkeit/Aktinbindun

gZytokinese


musculus] 18852 15/15 -1,92 475 12 66 8,14


gZytokinese


musculus] 18852 12/15 -2,17 48 1 6 8,14


gZytokinese


musculus] 18852 12/15 -1,53 153 3 23 8,14


gZytokinese


musculus] 18852 6/15 -1,56 454 11 54 8,14


gZytokinese

872 gi|6680924 Cytoskelett Cofilin 1, non-muscle

[Mus musculus] 18776 12/15 -2,17 200 5 26 8,22

Zellbeweglichkeit/

Aktindepolymerisierung/

Phagozytenaktivität

908 gi|6755040 Cytoskelett Profilin 1 [Mus

musculus] 15119 15/15 1,53 336 8 71 8,46

Microfilamentregulator/

Signaltransduktion/

Differenzierung


Cysteine and glycine-

rich protein 1 [Mus

musculus]

21425 15/15 1,53 256 5 34 8,9 Aktin Cytoskelettorganisation

und -biogenese/Proteinbindung



rich protein 1 [Mus

musculus]

21425 12/15 -1,82 206 5 38 8,9 Aktin Cytoskelettorganisation




rich protein 1 [Mus

musculus]

21425 12/15 1,66 134 5 34 8,9 Aktin Cytoskelettorganisation


440 gi|4895037 Cytoskelett Coronin-1 [Mus

musculus] 51627 12/15 1,46 41 2 5 6,05

Aktinbindung/

Leukozytenbindung/

Phagosombildung/Chemokin-

vermittelte Migration

627 gi|33563250 Cytoskelett Desmin [Mus

musculus] 53522 12/15 2,51 913 19 38 5,21

Muskelaufbau und -

organisation

628 gi|33563250 Cytoskelett Desmin [Mus

musculus] 53522 12/15 2,46 653 16 32 5,21

Muskelaufbau und -

organisation

421 gi|6678740 Cytoskelett Lumican [Mus

musculus] 38726 9/15 1,4 109 4 11 5,84 Proteoglycan/Proteinbindung

378 gi|6754084 Detoxifizierung Glutathione S-

transferase, mu 1 26067 15/15 -1,71 67 1 7 7,71

Protein

turnover/Proteinbindung

[Mus musculus]


Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 -1,41 190 6 28 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 -1,53 232 9 47 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 -1,51 291 13 60 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 -1,6 310 7 32 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 -1,78 879 19 75 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 1,54 39 1 7 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 1,45 42 1 7 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 2,19 542 14 61 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 15/15 2,78 145 6 32 7,71 Protein


908 gi|6754084 Detoxifizierung Glutathione S- 26067 15/15 1,53 42 1 7 7,71 Protein

transferase, mu 1

[Mus musculus]



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 9/15 1,46 156 5 26 7,71 Protein



Glutathione S-

transferase, mu 1

[Mus musculus]

26067 9/15 1,76 358 7 30 7,71 Protein



Glutathione-S-

transferase class M5

[Mus musculus]

25838 15/15 -1,78 154 2 17 6,14 Protein



Glutathione S-

transferase, alpha 4

[Mus musculus]

25559 15/15 -1,41 293 8 35 6,77 Protein



Phospholipid

hydroperoxide

glutathione peroxidase

[Mus musculus]

22660 15/15 1,45 102 2 11 8,65 Peroxidreduktion/Schutz vor

oxidativen Schäden

683 gi|13385466 Entzündung

Leukotriene B4 12-

hydroxydehydrogenas

e [Mus musculus]

35879 15/15 -1,59 236 7 22 8,09 Inaktivierung von Leukotrien

B4

421 gi|6678079 Entzündung

Serine (or cysteine)

proteinase inhibitor,

clade A, member 1a

[Mus musculus]

46145 9/15 1,4 206 6 15 5,44

Akute-Phase Antwort/inhibiert

hämatopoetische

Stammzellmobilität

778 gi|7305247 Entzündung P lysozyme structural

[Mus musculus] 17240 6/15 1,52 45 1 8 9,55

Assoziation mit Monozyten-

Makrophagen-System/

Verstärkung/Immunoaktivität/

Bakteriolytische Funktion

472 gi|74146998 Generelle

Enzyme

ATP synthase, H+

transporting,

mitochondrial F1

complex, alpha

subunit, isoform 1

[Mus musculus]

56033 15/15 -1,41 408 9 20 9,25 Atmungskette/H+ Transport


Enzyme

ATP synthase, H+

transporting,

mitochondrial F1

complex, alpha

subunit, isoform 1

[Mus musculus]



Enzyme

ATP synthase, H+

transporting,

mitochondrial F1

complex, alpha

subunit, isoform 1

[Mus musculus]



Enzyme

Aldolase 1, A isoform

[Mus musculus] 39787 15/15 -1,45 410 9 28 8,31 Metabolismus/Glycolyse


Enzyme




Enzyme




Enzyme

Aspartate

aminotransferase

precursor [Mus

musculus]

47781 15/15 -1,46 109 2 6 9,05 Biosynthese/Aspartat-

Glutamat-Reaktion


Enzyme

Aspartate

aminotransferase

precursor [Mus


Glutamat-Reaktion

musculus]


Enzyme

Glutamate

oxaloacetate

transaminase 2,

mitochondrial [Mus

musculus]


Glutamat-Reaktion


Enzyme

Alcohol

dehydrogenase 1

(class I) [Mus

musculus]

40601 15/15 -1,46 76 2 8 8,44 Oxidoreduktaseaktivität


Enzyme

Alcohol

dehydrogenase 1

(class I) [Mus

musculus]

40601 15/15 -1,62 223 7 16 8,44 Oxidoreduktaseaktivität


Enzyme

Malate dehydrogenase

2, NAD

(mitochondrial) [Mus

musculus]

36045 15/15 -1,77 394 14 55 8,93 Glycolyse/

Oxidoreductaseaktivität


Enzyme

similar to

Glyceraldehyde-3-

phosphate

dehydrogenase [Mus

musculus]

36072 15/15 -1,77 296 11 36 8,44 Glycolyse/

Carbohydratdegradierung


Enzyme

similar to

Glyceraldehyde-3-

phosphate

dehydrogenase [Mus

musculus]

36072 15/15 -1,59 349 7 25 8,44 Glycolyse/



Enzyme

similar to

Glyceraldehyde-3-

phosphate

36072 15/15 -2,97 46 2 10 8,44 Glycolyse/


dehydrogenase [Mus

musculus]


Enzyme

similar to

Glyceraldehyde-3-

phosphate

dehydrogenase [Mus

musculus]

36072 15/15 2,83 132 6 27 8,44 Glycolyse/



Enzyme

similar to

Glyceraldehyde-3-

phosphate

dehydrogenase [Mus

musculus]

36072 6/15 1,62 176 3 13 8,44 Glycolyse/



Enzyme

Hydroxyacyl-

Coenzyme A

dehydrogenase type II

[Mus musculus]

27371 15/15 -1,41 204 5 24 8,89 Metabolismus


Enzyme

Acetyl-Coenzyme A

dehydrogenase, long-

chain [Mus musculus]

42271 15/15 2,19 48 1 3 6,22 Lipid-Metabolismus

(Mitochondrium)


Enzyme

3-hydroxy-3-

methylglutaryl-

Coenzyme A synthase

2 [Mus musculus]

57334 6/15 -2,93 244 7 13 8,53 Lipid-Metabolismus

(Mitochondrium)


Enzyme

3-hydroxy-3-

methylglutaryl-

Coenzyme A synthase

2 [Mus musculus]

57334 6/15 -1,83 271 7 13 8,53 Lipid-Metabolismus

(Mitochondrium)


Enzyme

Peptidylprolyl

isomerase A [Mus

musculus]

18131 15/15 -1,5 322 7 41 7,74 Proteinfaltung/Regulation

viraler Genomregulation


Enzyme

Pyruvate kinase M

[Mus musculus] 58394 12/15 -1,75 307 9 21 7,58 Glycolyse


Enzyme

Pyruvate kinase M

[Mus musculus] 58394 6/15 1,52 83 2 4 7,58 Glycolyse


Enzyme

Glucose-6-phosphate

dehydrogenase X-

linked [Mus

musculus]

59681 12/15 1,46 51 3 6 6,06 Glycolyse/unterstützt

Antioxidants Signalwege


Enzyme

Aldo-keto reductase

family 1, member B8

[Mus musculus]

36440 12/15 1,87 78 4 16 5,97 Katalyse NADP-abhängiger

Reaktionen


Enzyme

PREDICTED: similar

to Phosphoglycerate

kinase 1 [Mus

musculus]

44921 9/15 -1,4 329 11 32 8,02 ATP-Bildung/Glycolyse


Enzyme

Phosphoglycerate

kinase 1 [Mus

musculus]

44907 9/15 1,52 44 2 6 7,53 ATP-Bildung/Glycolyse


Enzyme

Creatine kinase, brain

[Mus musculus] 42971 9/15 1,52 127 3 9 5,4 Energiehomöostase


Enzyme

Enolase 1, alpha non-

neuron [Mus

musculus]

47437 6/15 -1,83 157 3 9 6,37

Glycolyse/Phosphoenolpyruvat

Hydratase & Lyaseaktivität/

Differenzierung und

Entwicklung des Muskels


Enzyme

Enolase 3, beta

muscle [Mus

musculus]

47337 6/15 1,72 397 7 20 6,73

Glycolyse/Phosphoenolpyruvat

Hydratase & Lyaseaktivität/

Differenzierung und

Entwicklung des Muskels/

Myogenese


Enzyme

Aminolevulinate,

delta- dehydratase

[Mus musculus]

36472 6/15 -2,32 346 7 26 6,32 Häm- & Porphyrinbiosynthese

826 gi|7657031 Nucleotid-

metabolismus

5',3'-Nucleotidase,

cytosolic [Mus

musculus]

23290 15/15 1,54 91 3 20 5,31 Nucleotid-Nucleosid-Reaktion

889 gi|10719673 Proteasom

ubc-like protein

MMS2 [Mus

musculus]

16457 15/15 -1,5 58 1 6 6,34 poly-Ubiquitinierung/

postreplikale-DNA-Reparatur

823 gi|6679497 Proteasom

Proteasome (prosome,

macropain) subunit,

alpha type 2 [Mus

musculus]

26023 9/15 1,46 126 2 10 8,39 Proteindegradierung/möglicher

Regulator des Komplexes

644 gi|8393544 Proteinbio-

synthese

Heterogeneous

nuclear

ribonucleoprotein C

[Mus musculus]

34421 15/15 2,34 122 3 10 4,92 RNA-Splicing


synthese

Heterogeneous

nuclear

ribonucleoprotein C

[Mus musculus]

34421 12/15 2,51 44 1 3 4,92 RNA-Splicing


synthese

Heterogeneous

nuclear

ribonucleoproteins

A2/B1 (hnRNP A2 /

hnRNP B1) [Mus

musculus]

36028 15/15 -1,77 43 1 3 8,67 RNA-Splicing von cis-acting

A2 response element (A2RE)


synthese

Heterogeneous

nuclear

ribonucleoproteins

A2/B1 (hnRNP A2 /

36028 15/15 -1,59 85 3 13 8,67 RNA-Splicing von cis-acting

A2 response element (A2RE)

hnRNP B1) [Mus

musculus]


synthese

Eukaryotic translation

elongation factor 1

alpha 2 [Mus

musculus]

50360 6/15 1,62 93 2 4 9,16 Translation/Elongation/Anti-

Apoptose


synthese

PREDICTED: similar

to cleavage and

polyadenylation

specific factor 1 [Mus

musculus]

149571 6/15 1,52 37 1 0 8,73 mRNA Prozessierung,

Polyadenylierung, Spaltung

875 gi|3294227 Signaltrans-

duktion

Protein-tyrosine-

phosphatase [Mus

musculus]

18367 15/15 2,19 72 2 12 6,12 Dephosphorylierungsreaktione

n

660 gi|4506005 Signaltrans-

duktion

Protein phosphatase 1,

catalytic subunit, beta

isoform [Mus

musculus]

37961 9/15 1,52 41 2 5 5,84

Regulation zellulärer Prozesse

(Zellzyklus, Metabolismus,

Kontraktion)

867 gi|82881544

Signaltrans-

duktion/

Zellwachstum

PREDICTED: similar

to Protein phosphatase

1, regulatory

(inhibitor) subunit

12B isoform b isoform

8 [Mus musculus]

111248 12/15 -1,82 91 2 2 5,58 DNA- & Proteinbindung/

Regulation der Transkription

378 gi|12836576

Signaltrans-

duktion/

Metabilsmus

Mod1 protein [Mus

musculus] 64540 15/15 -1,71 290 6 65 7,16 Pyruvat/PPAR-Signalweg

826 gi|423455

Signaltrans-

duktion/

Zellwachstum

Epidermal growth

factor-receptor-

binding protein GRB-

3 - mouse (fragment)

25997 15/15 1,54 41 1 4 4,97

Aktivierung von

Tyrosinkinase- & RAS-

abhängigen Signalwegen

[Mus musculus]

444 gi|6678313

Signaltrans-

duktion/

Zellwachstum

Transforming growth

factor beta 1 induced

transcript 1 [Mus

musculus]

49793 3/15 1,6 46 1 3 6,93 Multifunktionale Kontrolle von

Wachstum, Differenzierung

826 gi|26345182 Transport Apolipoprotein A-I

[Mus musculus] 30597 15/15 1,54 692 14 50 5,51

Lipid/Regulation ABCA1

Expression in Makrophagen

908 gi|14149635 Transport

Fatty acid binding

protein 4, adipocyte

[Mus musculus]

14755 15/15 1,53 82 2 21 8,53

Lipid/negativer Regulator

Proteinkinasen/

Glucosemetabolismus/

Regulation Cholesterol-

aufnahme in Makrophagen &

Entzündungsaktivität


Fatty acid binding

protein 5, epidermal

[Mus musculus]

15470 9/15 1,76 106 3 25 6,14

Lipid/Metabolismus/

Glucosemetabolismus/ Lipid-

Scavenger (Antioxidant)/Haut-

Wasser-Permeabilitätsbarriere


Serum albumin

precursor [Mus

musculus]

70700 9/15 1,52 64 1 2 5,75

Trägermolekül/Lipid- &

Proteinbindung/negative

Apoptoseregulation

904 gi|7305599 Transport Transthyretin [Mus

musculus] 15880 9/15 1,76 72 1 8 5,77 Trägermolekül

472 gi|7304885 Zellwachstum Annexin A11 [Mus

musculus] 54419 15/15 -1,41 146 3 7 7,53 Repressor

682 gi|6996913 Zellwachstum Annexin A2 [Mus

musculus] 38937 9/15 -1,74 637 13 40 7,55

Aktivator, Repressor,

Angiogenese

473 gi|113945 Zellwachstum

Annexin A1 (Annexin

I) (Lipocortin I)

(Calpactin II)

(Chromobindin-9)

38995 3/15 -2,51 71 2 6 6,97 Repressor, Aktivator,

Signaltransduktion

(p35) (Phospholipase

A2 inhib [Mus

musculus]


Prolargin precursor

(Proline-arginine-rich

end leucine-rich

repeat protein) [Mus

musculus]

43607 15/15 -1,62 51 2 5 9,59 Skelettentwicklung/

extrazelluläre Matrix


Lactoylglutathione

lyase

(Methylglyoxalase)

(Aldoketomutase)

(Glyoxalase I) (Glx I)

(Ketone-aldehyd [Mus

musculus]

20967 15/15 1,54 117 4 23 5,24 Anti-Apoptose

868 gi|6755714 Zellwachstum Transgelin [Mus

musculus] 22618 15/15 1,45 138 3 16 8,85

glatte Muskulatur/

Tumorprogressionsrepressor

Identifizierung der Proteine erfolgte mittels ESI-MS/MS und dem Mascot-Fingerprint-Abgleich*. In ihrer Expression waren in K5.COX-2 transgener Harnblase 28 Proteine

erhöht und 37 Protein erniedrigt. Das Auftreten eines Proteins bezieht sich auf die Untersuchungspaare, d. h. das Auftreten eines Proteins in 15/15 entspricht den 5/5

Untersuchungspaaren, denn pro Gruppe werden die drei Kanäle Cy2, Cy3 und Cy5 zu Grunde gelegt.

*Der Mascot Score ist eine wahrscheinlichkeits-basierende Bestimmung, die aussagt, dass der beobachtete Match zwischen experimentellen Daten und einer Proteinsequenz ein

zufälliges Ereignis ist, das näherungsweise für jedes Protein in der Sequenzdatenbank berechnet wird. Der Mascot Score ergibt sich aus S = -10log(P), wobei P die

Wahrscheinlichkeit ist, dass der beobachtete Match ein randomisiertes Ereignis ist. Die Signifikanz des Resultats ist von der Größe der verwendeten Datenbank abhängig.

Mascotschattierungen in Diagrammen sind grün und deren nicht-signifikanten Treffer unterliegen der p = 0,05 Ausschlussgrenze.


178

Aus Tabelle 19 ist ersichtlich, dass einige Proteine mehrfach unter verschiedenen

Spotnummern identifiziert werden konnten und zudem in ihrer Expression nicht einheitlich

differentiell exprimiert waren, wie die Glutathione S-transferase mu 1 (GST). Daraus

konnte auf einen pI-Shift geschlossen werden, der tatsächlich im 2D-Gel beobachtet

werden konnte, wie es am Beispiel der GST in Abbildung 70 gezeigt ist. Jede Spotnummer

im Bereich von 26 kDa repräsentierte die GST. Verglichen mit dem theoretischen pI von

7,1, der im Bereich der Spotnummer 805 und 806 lag, zeigte sich eindeutig ein pI-Shift der

GST in den basischen als auch in den sauren Bereich. Während im Bereich des

theoretischen pI die GST der Spotnummer 805 und 806 (jeweils in 5/5

Untersuchungspaaren vertreten) in transgenen Mäusen in ihrer Expression erniedrigt war

(> 1,5), zeigte sich, dass nur im sauren Bereich die GST der Spotnummer 823 (in 3/5) und

826 (in 5/5) in ihrer Expression erhöht war (> 1,4). Um die erhöhte Expression der GST im

Transgen eindeutig zu bestätigen (s. intra-Assay Ansatz Tabelle 18), erfolgte ein

Immunoblot von sechs und 12 Monate alter Harnblase transgener und Wildtyptiere. Wie in

Abbildung 71 erkennbar, ergab die semi-quantitative Analyse der IDV über -Aktin eine

2,4-fach signifikant erhöhte Expression der GST in 12 Monate alter Harnblase transgener

Mäuse (p-Value 0,040). Zusätzlich wurde das Expressionsprofil der Hemoxygenase-1

untersucht, da die Expression oft unter (oxidativen) Stresssituationen erhöht ist (180-183).

Jedoch war die Expression der Hemoxygenase-1 unter diesen oxidativen

Stressbedingungen in der Harnblase transgener Mäuse nicht verändert.

Abbildung 70 Differentielle Expression und pI-Shift der Glutathione S-transferase Isoform mu 1 in der Harnblase

transgener Mäuse. Darstellung des Wildtyp- (wt) und Transgenkanals (tr) des Mastergels nach

Datenquantifizierung differentiell exprimierter Proteine mittels DyCyder-Software 6.5 des inter-Assay Ansatzes

im Bereich von 26 kDa. Jede Spotnummer (außer 778) repräsentierte die Glutathione S-transferase. Verglichen

mit dem theoretischen pI von 7,1, im Bereich der Spotnummer 805 und 806, zeigte sich ein pI-Shift in den

basischen als auch in den sauren Bereich. Nur die GST der Spotnummer 823 und 826 (Kreis) waren im Transgen

in ihrer Expression erhöht (> 1,4).

202 220

252 253 274

378 399

421 440

444

470 472

473 480

515 518 537 580

627 628 630 632

633

643 644 660

673 677

680 682

683

708 709

710

711 715

742 743

752

778 794

802

805

806 807 820 823 826

864 867

868 872

873 875 879

882

883 889

904 905 906 908

944

945

948

202 220

252 253 274

378 399

421 440

444

470 472

473 480

515 518 537 580

627 628 630 632

633

643 644 660

673 677

680 682

683

708 709

710

711 715

742 743

752

778 794

802

805

806 807 820 823 826

864 867

868 872

873 875 879

882

883 889

904 905 906 908

944

945

948

pH 3 10

wt

tr

kDa

26

26


179

Abbildung 71 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Glutathione S-transferase (GST) und

Hemoxygenase-1 (HO-1) in der Harnblase K5.COX-2 transgener Mäuse. Die semi-quantitative Analyse über

-Aktin zeigte, dass GST in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse um den Faktor 2,4 signifikant

erhöht war (p-Value 0,04). Die Expression von Hemoxygenase-1 war unverändert. Mittels 12 %-igen SDS-Gel

wurden 100 µg Gesamtprotein separiert. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.

Dieses Ergebnis bestätigte die Aussage des intra-Assay Ansatzes und bekräftigte die

Resultate hinsichtlich dem erhöhten oxidativen Stress in der Harnblase transgener Mäuse.

Eine differenziertere Auswertung der Ergebnisse ließ erkennen, dass differentiell

exprimierte Proteine, wie Peroxiredoxin und Glutathione S-transferase, zur Gruppe der

Phase-II Detoxifizierungsenzyme gehören. Die koordinierte, transkriptionale Aktivierung

der Gene, die für die Phase-II Detoxifzierungs- und anti-oxidativer Stress Antwortenzyme

kodieren, obliegt dem Nuclear factor, erythroid derived 2, like 2 (Nrf-2)

Transkriptionsfaktor (97;147;159;184). Die Regulation der Expression dieser

cytoprotektiven Gene wird vorrangig über die ARE´s (antioxidant responsive element)

vermittelt. Ein Literaturvergleich zeigte, dass eine Reihe von Proteinen, deren

transkriptionale Genaktivierung unter der Kontrolle von Nrf-2 stehen, in der Harnblase

transgener Mäuse differentiell exprimiert waren (97-99;143-147;154-157;159;160;185-

192). In Tabelle 20 sind einige in der Literatur beschriebenen Nrf-2 regulierten Gene

zusammengefasst, die den durch das 2D-DIGE Experimente identifizierten Proteine

6 Mo 12 Mo

wt wttr trkDa

29

GST

45 -Aktin

35HO-1


180

gegenübergestellt wurden. Block I repräsentiert dabei eine exakte Übereinstimmung der

identifizierten Proteine mit den in der Literatur beschriebenen Nrf-2 abhängigen Gene,

während Block II Familienmitglieder gegenüberstellt, von denen vermutet werden kann,

dass die Gene der identifizierten 2D-DIGE Proteine ebenfalls unter der Regulation von

Nrf-2 stehen könnten. Block III repräsentiert Signalwege korrespondierender Protein-Gen-

Kombinationen. Diese Zusammenstellung basiert vorrangig auf einer Annahme, von der

jedoch ausgegangen wurde, dass auch hierbei mögliche Regulationen innerhalb abhängiger

bzw. ergänzender Signalwege durch Nrf-2 vermittelt werden könnten, so dass dieser

Block, entsprechend wie Block II, ebenfalls Anhaltspunkte möglicher abhängiger und

gemeinsamer Regulationen, vermittelt durch Nrf-2, liefern könnte. Die Tabelle 20, wie

auch die Ergebnisse der 2D-DIGE Experimente, implizierte damit eine wichtige Rolle dem

Transkriptionsfaktor Nrf-2 unter den oxidativen Stressbedingungen in der hyperplastischen

Harnblase transgener Tiere, denn die Auflistung zeigt eindeutig, dass die Gene der

Proteine, die in der Harnblase transgener Mäuse differentiell exprimiert waren, wie die

Aldolase 1, Hemopexin, Heat shock protein, Peroxiredoxin und Glutathione S-transferase

unter der Regulation von Nrf-2 stehen. Daher erfolgte in der Harnblase von sechs und

12 Monate alten transgenen Mäusen eine Analyse des Expressionsprofils von Nrf-2 mittels

RT-PCR. Die semi-quantitative Analyse über -Aktin ergab keine Unterschiede im mRNA

Expressionsprofil von Nrf-2 zwischen transgenen Mäusen und Wiltyptieren (Abbildung

72). Da bereits bei den PGES und EP-Rezeptor Isoformen gezeigt werden konnte, dass das

mRNA Expressionsprofil nicht mit dem Protein Expressionsprofil korrelieren muss,

erfolgte eine Immunoblot-Analyse. Wie aus Abbildung 73 eindeutig hervorgeht, ergab die

semi-quantitative Auswertung der IDV über -Aktin bezogen auf Wildtyptiere eine 2-fach

signifikante Erhöhung (p-Value < 0,009) der Expression von Nrf-2 in 12 Monate alter

Harnblase transgener Mäuse. Es konnte die von Pi et al. beschriebene unspezifische Bande

bei 85 kDa (nicht gezeigt) detektiert werden, sowie eine spezifische Bande für Nrf-2 bei

57 kDa, 67 kDa (theoretisch erwartete Masse von Nrf-2) und bei 118 kDa (188;193). Das

im Immunoblot gezeigte und in der Literatur beschriebene Bandenmuster für Nrf-2 kann

z. B. durch posttranslationale Modifikation wie Phosphorylierungen (188;194),

Stabilisierungen durch Ubiquitinierung (186) oder durch Neuanordnungen mit

Aktinfilamenten (185;193) verursacht werden.


181

Tabelle 20 2D-DIGE identifizierte, Nrf-2 abhängige Proteine

Nrf-2 regulierte Gene 2D-DIGE identifizierte Proteine

I Exakte Übereinstimmung

Glutathione S-transferase, mu 1 Glutathione S-transferase, mu 1

Aldolase 1, A isoform Aldolase 1, A isoform

Serum amyloid P-component Serum amyloid P-component

Hemopexin Hemopexin

Transthyretin Transthyretin

NADPH-dependent Isocitrate dehydrogenase Isocitrate dehydrogenase 1

II Familienmitglieder

Peroxiredoxin-1/Thioredoxin Peroxiredoxin-2 (Thioredoxin peroxidase 1)

Heat shock protein 70 protein 6 Heat shock protein 70 cognate

Proteasome alpha type 1 Proteasome (macropain) subunit, alpha type 2

Ubiquitin-conjugating enzyme E2-32 ubc-like protein MMS2

ubiquitin carboxy-terminal esterase L1/ubiquitin-

specific protease 14 Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1

Carbonic anhydrase 14,111 Carbonic anhydrase 3

Aldo-keto reductase family 1, member A1 Aldo-keto reductase family 1, member B8, B10

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C, A2/B1

Peptidylprolyl isomerase B Peptidylprolyl isomerase A

ATP synthase, H+ transporting, lysosomal (vacuolar

proton pump)

ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1

complex, alpha subunit, isoform 1

Serine proteinase inhibitor 2,4 Serine (or cysteine) proteinase inhibitor 1a

Transforming growth factor beta regulated gene 1 Transforming growth factor beta induced transcript 1

Fatty acid binding protein L-FABP Fatty acid binding protein 4, adipocyte und 5,

epidermal

Apolipoprotein A-IV,V Apolipoprotein A-I

alpha Tropomyosin Tropomyosin alpha-3 chain (Tropomyosin-3)

Myosin, light polypeptide 4 Myosin, light polypeptide 1

Actin gamma put. beta-Actin (aa 27-375) und Alpha-actin (aa 40-

375)

III Signalweg abhängig

eukaryotic initiation factor 2 alpha eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2

Malate oxidoreductase Malate dehydrogenase 2, NAD (mitochondrial)

Pyruvate dehydrogenase Pyruvate kinase M

In Literatur beschriebene Nrf-2 abhängige Gene (Spalte 1) wurden mit den durch 2D-DIGE Experimente

identifizierten Proteine (Spalte 2) abgeglichen und gegenübergestellt (97-99;143-147;154-157;159;160;185-192).


182

Abbildung 72 RT-PCR zum Nachweis der Expression von Nrf-2 in der Harnblase von sechs und 12 Monate alten

Wildtyptieren und K5.COX-2 transgenen Mäusen. Semi-quantitative Analyse zeigte keine Veränderung der

mRNA-Expressionsprofile in der Harnblase von Transgenen. Als interne Kontrolle diente β-Aktin. n = 3 Tiere pro

Gruppe wurden analysiert. DNA-Größenstandards: M1 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter. (-) Negativ-PCR;

(--) Negativ-RT-PCR. Student´s t-Test.

Abbildung 73 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Nrf-2 in der Harnblase von sechs und 12 Monate

alten Wildtyptieren und transgenen Mäusen. Die Normierung über -Aktin zeigte mittels semi-quantitativer

Analyse eine signifikante 2-fache Erhöhung des Nrf-2 Proteins (< p-Value 0,009) in der Harnblase 12 Monate alter

transgener Tiere bei 57 kDa, 67 kDa (* kalkulierte Proteinmasse) und 118 kDa. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s

t-Test.

700 -

500 -

M1 wt tr wt tr

6 Mo 12 Mo

(-) (--)bp

- ß-Aktin

- Nrf-2

6 Mo 12 Mo

wt wttr trkDa

-Aktin45

70Nrf-2*

55 Nrf-2

130

Nrf-2

100


183

Dieses Ergebnis bestärkte die Aussage der 2D-DIGE Experimente, dass die Regulation

einiger differentiell exprimierter Proteine in der Harnblase transgener Mäuse unter den

oxidativen Stressbedingungen durch Nrf-2 erfolgte.

Um zu überprüfen, ob auch tatsächlich eine erhöhte Translokation von Nrf-2 in den

Zellkern transgener Mäuse erfolgte, wurde an Kryoschnitten 12 Monate alter transgener

und Wildtyptiere eine Immunhistochemie durchgeführt. Wie aus Abbildung 74 hervorgeht,

kam es in Immunzellen und vereinzelten Zellen der Submucosa in der Harnblase

transgener Mäuse, vorrangig cytoplasmatisch und vereinzelt nukleär zu einem positiven

Signal von Nrf-2 (Abbildung 74A), während dieses Signal nur sehr selten in Wildtyptieren

beobachtet werden konnte (Abbildung 74B). Dies suggerierte eine beginnende

Translokation von Nrf-2 in den Zellkern der hyperplastischen Harnblase transgener Mäuse.

Abbildung 74 Nachweis einer beginnenden Translokation von Nrf-2 in den Zellkern in der Harnblase 12 Monate

alter transgener Mäuse. Immunhistochemische Analyse von Kryoschnitten. In Zellen der Submucosa als auch

vereinzelt in Entzündungszellen transgener Mäuse (A) konnte vorrangig ein erhöhtes cytoplasmatisches Signal in

offensichtlich Immunzellen detektiert werden, welches scheinbar eine beginnende Translokation des

Transkriptionsfaktors Nrf-2 in den Zellkern signalisierte, während in Wildtyptieren partial positive Signale der

Translokation detektiert wurden. Negativkontrollen ohne Inkubation mit dem primären Antikörper zeigten keine

spezifischen Signale (C, D). Vergrößerung: x 63

Schlussfolgernd zeigte dies eindeutig, dass eine COX-2 Überexpression zu einem erhöhten

oxidativen Stress führte, der die differentielle Expression von Phase-II Detoxifizierungs-

proteinen verursachte, deren Gene unter Regulation des Transkriptionsfaktors Nrf-2 stehen

und zudem Nrf-2 selbst erhöht exprimiert und in den Zellkern transloziert wurde. Um zu

überprüfen, ob in Übereinstimmung zum AmplexRed Assay, bei dem gezeigt werden

A B DC


184

konnte, dass der oxidative Stress bei Hemmung der COX-2 Aktivität abnahm und dieser

inhibitorische Effekt durch Zusatz von PGE2 aufgehoben werden konnte, ebenfalls eine

Celecoxibbehandlung Einfluss auf die Nrf-2 Translokation hat, wurden die humanen

TCC-Zelllinien RT112 und 5637 für 24 Stunden mit 2,5 µM selektiven COX-2 Inhibitor

Celecoxib sowie in Kombination mit 2,5 µM bzw. 5 µM PGE2 inkubiert und anschließend

die Translokation mittels Immunhistochemie untersucht. In den unbehandelten

Kontrollzellen der Abbildung 75 (A, B) konnte eine hohe Translokation von Nrf-2 in den

Zellkern beobachtet werden, während in den CX behandelten TCC-Zelllinien (C, D) die

Translokation von Nrf-2 in den Zellkern deutlich abnahm. Ähnlich, wie im AmplexRed

Assay, konnte durch Zusatz von steigenden Konzentrationen von PGE2 der inhibitorische

Effekt der Translokation aufgehoben werden, welches in der Abbildung 75E-H deutlich zu

erkennen ist.

Diese Untersuchung zeigte eindrucksvoll die Beziehung zwischen verminderten oxidativen

Stress durch Hemmung der COX-2 Aktivität und der reduzierten Translokation von Nrf-2

in den Zellkern, als Regulator der Phase-II Gene und bekräftigte damit die Aussage der

oberen Ergebnisse.

Pi et al. konnte zeigen, dass die Translokation und Degradierung von Nrf-2 durch Casein

Kinase 2 (CK2) vermittelte Phosphorylierung erfolgt, während Kang et al. und andere

zeigen konnten, dass die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) die nukleäre Translokation

von Nrf-2 unter oxidativen Stressbedingungen kontrolliert, welches die Neuanordnung von

Aktinmikrofilamenten mit einschließt (185;188;193;195;196). Aus Tabelle 19 des

2D-DIGE Experiments ist ersichtlich, dass auch Aktinfilamente, wie alpha 1 Actin

precursor, beta-Actin, alpha-Actin sowie Actin related protein 2/3 complex, subunit 3 in

K5.COX-2 transgener Harnblase differentiell exprimiert waren. Um das Expressionsprofil

der PI3K zu untersuchen, erfolgte eine Immunoblot-Analyse von 12 Monate alter

Harnblase transgener und Wildtyptiere (Abbildung 76). Die Analyse ergab, dass die nicht

phosphorylierte inaktive PI3K (p85) in der Harnblase transgener Mäuse bezogen auf

Wildtyptiere 1,8-fach (p-Value 0,054) erhöht war und die phosphorylierten aktiven

Untereinheiten p-p85 1,3-fach (p-Value 0,126) und p-p55 2,2-fach (p-Value 0,019), so dass

von einer erhöhten Expression und Aktivierung der katalytischen Aktivität ausgegangen

werden konnte. Die katalytische Aktivität der PI3K wird durch den Tumorsuppressor

PTEN (Phosphatase and tensin homolog) kontrolliert (197). Silencing durch Promotor-

methylierungen oder PTEN Mutationen führen zu einer erhöhten Aktivität von PI3K (198).


185

Abbildung 75 Effekt einer Celecoxibbehandlung auf die Translokation von Nrf-2 in den Zellkern humaner

Urothelkarzinomzelllinien mittels immunhistochemische Analyse. Zellen, die 24 Stunden mit dem selektiven

COX-2 Inhibitor Celecoxib behandelt wurden, zeigten eine schwächere Translokation des Transkriptionsfaktors

Nrf-2 in den Zellkern (C, D) als die unbehandelten Kontrollzellen (A, B). Die exogene Zugabe steigender

Konzentrationen von PGE2 (E-H) kehrte den inhibitorischen Effekt um und erhöhte wieder die Translokation von

Nrf-2 in den Zellkern. Negativkontrollen ohne Inkubation mit dem primären Antikörper zeigten keine

spezifischen Signale (I, J). Vergrößerung: x 63.

Ko

RT112

2,5 µM CX

2,5 µM PGE2

5637

A B

D

FE

G H2,5 µM CX

5 µM PGE2

I J

2,5 µM CX C


186

Abbildung 76 Immunoblot-Analyse von totaler und phosphorylierter PI3K in der Harnblase 12 Monate alten

transgenen und Wildtyptieren. Semi-quantitative Analyse normiert über Wildtyptiere ergab in der Harnblase

transgener Mäuse eine Erhöhung an totaler PI3K um den Faktor 1,8 (p-Value 0,054), während die Untereinheiten

der aktiven p-PI3K p-p85 1,3-fach (p-Value 0,126) und p-p55 2,2-fach (0,019) im Transgen erhöht waren. Mittels

7,5 %-igen SDS-Gel wurden 100 µg Gesamtprotein elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe.

Student´s t-Test.

Daher erfolgte mittels Immunoblot die Analyse der Expression von PTEN in der Harnblase

12 Monate alter transgener Mäuse und Wildtyptiere. Die semi-quantitative Analyse über -

Aktin ergab eine leichte signifikante Erhöhung (1,3-fach, p-Value 0,017) der Expression

von PTEN in der Harnblase transgener Mäuse, so dass von einer vorhandenen,

kontrollierten Regulation der katalytischen Aktivität von PI3K vermittelt durch PTEN

ausgegangen werden konnte (Abbildung 77).

Ein wichtiges downstream Target der PI3K ist der Akt/Erk MAP (Protein kinase B/

Extracellular-signal regulated kinase Mitogen activated protein) Kinase Signalweg.

Papaiahgari et al. konnte in diesem Zusammenhang zeigen, dass hyperoxische

Bedingungen eine Nrf-2 transkriptionale Reaktion über den ROS-EGFR-PI3K-Akt/Erk

MAP Kinase Signalweg stimulierte (196). Um zu überprüfen, ob in der Harnblase

transgener Mäuse ebenfalls dieser Signalweg stimuliert war, erfolgte eine Immunoblot-

Analyse des Expressionsprofils vom totalen und phosphorylierten Akt sowie Erk-1/-2 in

sechs und 12 Monate alter Harnblase transgener und Wildtyptiere. Wie aus Abbildung 78

hervorgeht, war nur in 12 Monate alten transgenen Mäuse die Expression von Akt 1,3-fach

wtkDa tr

p-PI3K (p85)70

p-PI3K (p55)55

PI3K (p85)70


187

signifikant (p-Value 0,024) erhöht, während phosphoryliertes p-Akt keine Veränderung

zeigte.

Abbildung 77 Immunoblot-Analyse der Expression von PTEN in der Harnblase 12 Monate alten transgenen und

Wildtyptieren. Semi-quantitative Analyse zeigte eine geringe signifikante Erhöhung der PTEN Expression in der

Harnblase transgener Mäuse (1,3; p-Value 0,017). Als Ladekontrolle diente -Aktin. 100µg Gesamtprotein

wurden im 7,5 %-igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe. Student´s t-Test.

Hinsichtlich Erk-1 und Erk-2 zeigte sich ein komplett anderes signifikantes

Expressionsprofil in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse. Während Erk-1 und

Erk-2 in ihrer Expression 1,8-fach (p-Value 0,015) bzw. 1,9-fach (p-Value 0,012) erhöht

waren, konnte eine 4,0 bzw. 4,5-fache Reduktion (p-Value 0,003) von p-Erk-1 bzw.

p-Erk-2 detektiert werden. Dies zeigte eine eindeutige Inhibierung der Aktivierung des

Akt/Erk MAP Kinase Signalweges, so dass die Nrf-2 transkriptionale Reaktion unter den

vorherrschenden oxidativen Stressbedingungen in der Harnblase K5.COX-2 transgener

Mäuse über einen anderen als den PI3K-Akt/Erk MAP Kinase Signalweg erfolgen musste.

Die PI3K ist vielen Signalwegen involviert. So kann zum Beispiel auch eine erhöhte

Aktivität der PI3K zu einer Induktion der Expression von HIF-1 (Hypoxia inducible

factor 1alpha) führen (199). In diesem Zusammenhang konnten Laughner et al. und

Blancher et al. zusätzlich zeigen, dass sowohl eine gesteigerte Aktivität von Her-2 im

Brustkarzinom als auch eine V12

Ras Überexpression zu einer erhöhten Expression von

HIF-1 führte (200;201). Da in der Harnblase transgener Mäuse erhöhte Level von Her-2

und gesteigerte Ras-GTP Level detektiert werden konnten (Abbildung 34, Abbildung 36),

wtkDa tr

-Aktin45

PTEN55


188

erfolgte mittels RT-PCR die Analyse des mRNA Expressionsprofils von HIF-1 in sechs

und 12 Monate alter Harnblase transgener und Wildtyptiere (Abbildung 79).

Abbildung 78 Immunoblot-Analyse vom totalen und phosphorylierten Akt, Erk-1 und Erk-2 in der Harnblase von

sechs und 12 Monate alten transgenen und Wildtyptieren. Das totale Akt war in sechs und 12 Monate alter

Harnblase transgener Mäuse um den Faktor 1,3 erhöht (6 Mo: p-Value 0,061; 12 Mo: p-Value 0,024), während

das aktive p-Akt keine Erhöhung zeigte. Totales Erk-1 bzw. Erk-2 waren in sechs Monate alten Transgenen

1,6-fach (p-Value 0,121) bzw. 1,5-fach (p-Value 0,095), in 12 Monate alten Transgenen 1,8-fach (p-Value 0,015)

bzw. 1,9-fach (p-Value 0,012) erhöht, während p-Erk-1 bzw. p-Erk-2 in sechs Monate alten Transgenen 1,4-fach

(p-Value 0,202) bzw. 1,3-fach (p-Value 0,229) erhöht und in 12 Monate alten Transgenen 4,0-fach (p-Value 0,003)

bzw. 4,5-fach (p-Value 0,003) erniedrigt waren. 100µg Gesamtprotein wurden mittels 7,5 %-igen SDS-Gel

elektrophoretisch aufgetrennt. n = 3 Tiere pro Gruppe wurden analysiert. Student´s t-Test.

Die semi-quantitative Analyse über -Aktin ergab eine 1,7-fache Erhöhung

(p-Value 0,071) des mRNA Expressionsprofils in 12 Monate alter Harnblase K5.COX-2

transgener Tiere, welches hypoxische Bedingungen in der Harnblase transgener Mäuse

suggerierte. Um zusätzlich das Expressionsprofil auf Proteinebene zu analysieren, erfolgte

ein Immunoblot von entsprechend gleichaltrigen Mäusen. Aufgrund posttranslationaler

70

p-Akt

55

p-Erk-1

6 Mo 12 Mo

wt wttr trkDa

p-Erk-240

70

Akt

55

Erk-1

Erk-240


189

Modifikationen kann ein Banden-laddering im Immunoblot zwischen 100-130 kDa des

HIF-1 Proteins detektiert werden. Wie Abbildung 80 zeigt, ergab die semi-quantitative

Auswertung über -Aktin eine 2,7-fach erhöhte Expression (p-Value 0,167) von HIF-1 in

12 Monate alten transgenen Mäuse, das die Annahme einer scheinbar beginnenden

Hypoxie bekräftigte, da die Expression von HIF-1 nur unter hypoxischen Bedingungen

erhöht ist, um die Transkription von Genen zu aktivieren, deren Proteinprodukte die

Sauerstoffverfügbarkeit erhöhen (Erythropoese, Angiogenese) oder die adaptive

intrazelluläre Antwort bei Sauerstoffentfall vermitteln (Glycolyse) (202). Abbildung 80

zeigt jedoch zusätzlich, dass die Expression der HIF-1 regulatorischen Proteine VHL

(Von Hippel-Lindau factor) und FIH-1 (factor inhibiting HIF-1) 1,6-fach (p-Value 0,016)

bzw. 1,4-fach (p-Value 0,011) in 12 Monate alter Harnblase transgener Mäuse signifikant

erhöht waren (203). FIH-1, wie auch VHL sind sauerstoffabhängige, negative Regulatoren

von HIF-1, so dass dies vermuten ließ, dass einer beginnenden Hypoxie, der erhöhten

Expression von HIF-1 entgegengewirkt wurde. Unterstützt wird diese Vermutung

dahingehend, dass die Promotorregion von Enolase 1 und Aldolase A HRE´s (hypoxia

responsive elements) aufweisen (204), deren Expression der Proteinprodukte im

biologischen 2D-DIGE Experiment reduziert war (s. Tabelle 19). Außerdem besitzt die

Promotorregion von Aldolase A ARE´s, so dass die Regulation der Transkription durch

Nrf-2 vermittelt werden kann. Dieses Ergebnis suggerierte den Eindruck, dass sich eine

Verlagerung hyperoxischer Bedingungen, die durch erhöhten oxidativen Stress

gekennzeichnet waren, in eine scheinbar beginnend auszubildende Hypoxie einstellte und

dass Nrf-2 eine wichtige Rolle in diesem Zusammenhang einnimmt.


190

Abbildung 79 RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von HIF-1 in sechs und 12 Monate alter Wildtyp- und

K5.COX-2 transgener Harnblaser. Semi-quantitative Analyse zeigte in der Harnblase von 12 Mo alten transgenen

Mäusen eine Erhöhung der HIF-1 mRNA Expression (1,7; p-value 0,071). Als interne Kontrolle diente β-Aktin.

n = 3 Tiere pro Gruppe wurden analysiert. DNA-Größenstandards: M1 = GeneRuler 100 bp DNA Leiter.

(-) Negativ-PCR; (--) Negativ-RT-PCR. Student´s t-Test.

Abbildung 80 Immunoblot-Analyse der Expression von HIF-1, der regulatorischen Proteine VHL und FIH-1 in

der Harnblase transgener und Wildtyptiere. Die semi-quantitative Analyse normiert über -Aktin zeigte nur in

der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse eine Erhöhung der Expression von HIF-1 (Hypoxia inducible

factor 1 2,7; p-Value 0,167), VHL (Von Hippel-Lindau factor 1,6; p-Value 0,014) sowie FIH-1 (factor inhibiting

HIF-1 1,4; p-Value 0,011). 100µg Gesamtprotein wurden im 7,5 %-igen SDS-Gel aufgetrennt. n = 3 Tiere pro

Gruppe. Student´s t-Test.

500 -

M1 wt tr wt tr

6 Mo 12 Mo

(-) (--)bp

- HIF-1

500 -- -Aktin

6 Mo 12 Mo

wt wttr trkDa

40 FIH-1

45 -Aktin

130 HIF-1

100

25 VHL


191

Insgesamt konnte eindeutig gezeigt werden, dass die aberrante COX-2 Überexpression in

der Harnblase transgener Mäuse entscheidend bei der Entwicklung der

Übergangszellhyperplasie (TCH) und des Urothelkarzinoms (TCC) beiträgt und

möglicherweise über die PGE2 Rezeptor Isoformen EP2 und EP4 vermittelt wurde, da

deren Expression in transgenen Mäusen erhöht war. Zusätzlich förderte die COX-2

Überexpression den oxidativen Stress und führte zu einer differentiellen Expression von

verschiedenen Proteinen, deren Regulation der Transkription zum Teil durch den

Transkriptionsfaktor Nrf-2 reguliert wird. Die Expression von Nrf-2 war in der Harnblase

transgener Mäuse erhöht und außerdem konnte eine vermehrte Translokation in den

Zellkern detektiert werden, die bei COX-2 Inhibierung reduziert war.

Kapitel 5 Diskussion

192


Krebs ist nach Herz-Kreislauferkrankungen mit steigender Tendenz die 2. häufigste

Todesursache und tritt im mittleren 65. Lebensjahr auf (42;205). Steigende

durchschnittliche Lebenserwartungen in der Bevölkerung, erhöhte Umweltbelastungen

z. B. durch Feinstaub oder zunehmend ungesunde Lebensweisen, wie z. B. Fast-Food,

Alkoholkonsum und Rauchen, erhöhen das Risiko, an Krebs zu erkranken (5;88;206-208).

Während noch 2002 das Urothelkarzinom die 10. häufigste Erkrankung bei Männern und

11. häufigste bei Frauen war, so stieg das Risiko bis zum Jahre 2006 bereits ab dem

40. Lebensjahr am Urothelkarzinom zu erkranken tendenziell an und liegt der zeitlich bei

Männern auf Position vier und bei Frauen auf Position sechs der häufigsten

Krebserkrankungen (2;42;43). Cote et al. beschrieb, dass die Entwicklung und Progression

vom Urothelkarzinom durch spezifische genetische Läsionen bestimmt werden, die als

chromosomale Loci definierbar sind (6). Diese molekularen Veränderungen, die auf

Genebene (z. B. Mutation im p53 Gen am chromosomalen Locus 17p13) oder auf Ebene

der Proteinexpression (z. B. COX-2) erfolgen oder den funktionalen Status eines Proteins

betreffen können (z. B. Phosphorylierungen von pRB), haben vorhersagbare und

prognostische Werte im Hinblick auf den klinischen Verlauf von Patienten gezeigt

(10;12;58;209). Aber auch die Verbindung zwischen Karzinomentstehung und chronischen

Entzündungen, die z. B. durch Saugwürmer hervorgerufen werden können (4), stehen im

Zusammenhang mit der Entstehung von Karzinomen und gehen bereits auf Virchow im

Jahre 1863 zurück, als er lymphoretikuläre Infiltrate in neoplastischen Geweben

beobachtete (210;211). Schon zu jener Zeit wurde vermutet, dass der Ursprung des

Karzinoms im Zusammenhang mit chronischen Entzündungen zu finden ist. Die

Entstehung von Karzinomen ist von starken Entzündungsreaktionen begleitet, die auch bei

Wundheilungsprozessen auftreten können, so dass 1986 Dvorak postulierte, dass

Karzinome offene, nicht-heilende Wunden sind (211;212). Bei der Behandlung von

Wundreaktionen, die begleitet wurden von Fieber, Entzündungen und Schmerzen, wurde

schon 1950 sehr schnell als Goldstandard die Wirkung des Aspirins (NSAR) entdeckt.

Dessen Entwicklung ist auf den Chemiker Dr. Felix Hoffmann im Jahre 1897

zurückzuführen (213). Erst nach der erfolgreichen Schmerztherapie von Neil Armstrong

nach seiner Rückkehr vom Mond, wurde von Wissenschaftlern der Wirkmechanismus von


193

Aspirin aufgeklärt, bei dem sich zeigte, dass es zur Hemmung der

Prostaglandinbiosynthese kommt. Diese körpereigenen Substanzen üben als Mediatoren

zahlreiche Funktionen im Organismus aus und werden durch die Cyclooxygenase

Isoformen, COX-1 und COX-2 aus Arachidonsäure synthetisiert. Dabei dient

Arachidonsäure den Lipoxygenasen und Cytochromen P450 neben den Cyclooxygenasen

als Substrat (17;69). Neben einigen Lipoxygenasen konnte besonders der induzierbaren

Cyclooxygenase Isoform COX-2 eine wichtige Beteiligung bei der Entstehung von

zahlreichen Karzinomen, z. B. Pankreas, Colon, Brust, Haut oder Harnblase, nachgewiesen

werden (13;15;103;105;121;161;209;214). Um die Rolle der COX-2 und um ein COX-2

abhängiges Signaling während der Entstehung des Urothelkarzinoms zu untersuchen und

zu analysieren, wurde für diese Arbeit ein transgenes Mausmodell verwendet, bei dem die

COX-2 cDNA unter der Kontrolle des Keratin 5-Promotors steht, so dass es zu einer nicht-

physiologisch konstitutiven Expression von COX-2 in basalen Epithelien kommt (161).

Shirahama et al. und Wülfing et al. konnten zeigen, dass COX-2 mit unterschiedlicher

Stärke in den verschiedenen Tumorstadien und -graden exprimiert wird und mit einer

schlechten Prognose in Zusammenhang steht (9-11;64;85). Shariat et al. deutete die

COX-2 Überexpression als ein frühes Ereignis in der urothelialen Karzinogenese (56;215).

Tatsächlich verursachte die COX-2 Überexpression im transgenen Mausmodell die

spontane Entwicklung einer Übergangszellhyperplasie und -dysplasie, wie sie auch bei der

Entwicklung humaner Karzinome beobachtet werden kann (59;77;83). Die Hemmung des

hyperplastisch/dysplastischen Phänotyps durch den selektiven COX-2 Inhibitor Celecoxib

war konsistent mit früheren Beobachtungen, die zeigten, dass selbst NSAR das

experimentelle Wachstum des Blasenkarzinoms inhibierten (14;104;216). Jedoch im

Unterschied zu vorangegangen Experimenten der Haut des transgenen Mausmodells,

konnte gezeigt werden, dass die alleinige Überexpression von COX-2 ausreichend war für

eine spontane Entwicklung des Urothelkarzinoms (TCC), wie es auch von R. Klein et al.

gezeigt werden konnte (13;161;209). Weitere immunologische Analysen zeigten, dass die

Entwicklung des TCC scheinbar entlang dem humanen papillären Urothelkarzinommodell,

aufgrund der erhöhten Her-2 Level und der Aktivierung von Ras erfolgte. Da es sich um

einen Pull-down-Assay handelte, bei dem die Aktivität aller drei Ras Isoformen

gleichzeitig bestimmt wird, kann keine Aussage getroffen werden, welche Isoform

tatsächlich aktiviert war. Beim humanen Urothelkarzinom liegt vorrangig im Codon 12 des

H-Ras Gens eine Punktmutation vor (22;217), welches zu einer konstitutiven Aktivierung


194

von H-Ras führt. Jedoch beschrieb Vageli et al., dass auch K-Ras vielfach im

Blasenkarzinom aktiviert ist und Rodenhuis konnte zeigen, dass auch eine Aktivierung von

K-Ras mit einer erhöhten Expression von COX-2 im Lungenkarzinom assoziiert ist (218-

220). Da demnach sowohl H-Ras als auch K-Ras aktiviert sein können, kann letztlich

davon ausgegangen werden, dass der humane papilläre Urothelkarzinomsignalweg die

Basis für die Entwicklung des TCC im transgenen Mausmodell bildete. Histologische

Analysen zeigten, dass Hyperplasien in sechs Monate alten transgenen Mäusen auftraten,

aber die Entwicklung des TCC erst im Alter von frühestens zehn Monaten erfolgte. Auch

auf molekularer Ebene konnte nicht nur für Her-2 gezeigt werden, dass erst im höheren

Alter (signifikante) Unterschiede in der Expression verschiedener Proteine zu beobachten

waren, welches suggerierte, dass erst weitere wichtige Signalwegketten aus einer

regulierten Kontrolle entzogen sein müssen, damit es zur Entartung und damit zum

Karzinom kommt. Ein wichtiger Mediator ist das PGE2, welches über die drei

PGES-Isoformen synthetisiert wird. Sowohl dem PGE2 als auch der mPGES-1 wird ein

malignes Potenzial impliziert, da sie nicht nur im Urothelkarzinom involviert sind, sondern

auch in anderen wie z. B. in gastrointestinalen Karzinomen (133;134). Shi et al.

schlussfolgerte, dass die Erhöhung des PGE2-Spiegels über den cPLA2-COX-2-mPGES-1

Signalweg erfolgt, der eine wichtige Rolle in der Blasenkarzinogenese spielt (221;222).

Und tatsächlich konnten auch im transgenen Mausmodell erhöhte PGE2-Spiegel gemessen

und im Alter von 12 Monaten eine erhöhte Expression der mPGES-1 nachgewiesen

werden. Die Hemmung der COX-2 Aktivität mittels Celecoxib reduzierte den PGE2-Level

und den hyperplastischen Phänotyp auf Wildtypniveau, so dass die Ergebnisse des

transgenen Mausmodells konsistent zur Literatur sind und R. Kleins Schlussfolgerung, die

COX-2 Überexpression erhöht den PGE2-Level, welches zur spontanen

Karzinomentwicklung führte, bekräftigt. PGE2 kann die vier EP-Rezeptor Isoformen

EP1-EP4 aktivieren, die in zahlreichen (unabhängigen) Signalwegen münden. Bereits im

Alter von sechs Monaten transgener Mäuse konnte eine erhöhte Expression von

EP4 Rezeptor mittels Immunoblot nachgewiesen werden. Miyata et al. konnte auch für

Karzinome des oberen Harntraktes (TCC-UUT) eine erhöhte Expression des

EP4 Rezeptors zeigen und postulierte, dass die Koexpression von COX-2 und

EP4 Rezeptor ein potentieller Marker für Tumorprogression und Überleben von

Betroffenen mit nicht-invasiven TCC-UUT ist (139;222;223). Jedoch konnte sehr schnell

in 12 Monate alten transgenen Mäusen nachgewiesen werden, dass neben EP4 Rezeptor


195

auch EP2 Rezeptor in seiner Expression erhöht war, was Miyata et al. auch für TCC-UUT

bestätigen konnte (132). Aber nicht nur für Urogenitalkarzinome konnte damit eindeutig

eine Rolle der EP-Rezeptor Isoformen EP2 und EP4 zugeschrieben werden, sondern bei

Brustkarzinomen als auch bei Cervixkarzinomen (135;224). Fulton et al. beschrieb, dass

der EP1 Rezeptor sowohl in Brustkarzinomen als auch in Hautkarzinomen eine wichtige

Rolle besitzt, während im transgenen Mausmodell nur in der Brust, aber weder in der Haut

noch in der Harnblase eine veränderte Expression von EP1 Rezeptor detektierbar war

(123;209). Viele Beobachtungen hinsichtlich der Rolle der EP-Rezeptoren in Karzinomen

entstammen von Tiermodellen mit Colonkarzinomen. Demnach sind alle EP-Rezeptor

Isoformen involviert, jedoch abhängig vom jeweiligen Karzinommodell (136). So wurde

für EP3 Rezeptor postuliert, dass die Aktivierung von EP3 Signaling im normalen Gewebe

die von EP1, EP2 und EP4 Rezeptor Tumor-fördernde Wirkung aufheben kann (136;225).

Ferner weisen einige Studien dem EP1 Rezeptor eine onkogene Rolle bei der

Polypenbildung in Apc716 Mäusen zu, während andere Gruppen dem EP2 Rezeptor diese

Rolle zu teilen (226;227). Besonders dem EP4 Rezeptor wird durch Kopplung zur PI3K

und zunehmend auch EP2 Rezeptor, aufgrund der Aktivierung von PKA, eine wichtige

Rolle in der Karzinogenese zu geschrieben. Bekräftig wird dies u. a. durch

pharmakologische Untersuchungen, die zeigen konnten, dass die Hemmung von diesen

EP-Rezeptor Isoformen das Wachstum der Zellen unterdrückte (132;136;228-230).

Fulton et al. postulierte, dass Tumorzellen einen oder mehrere EP-Rezeptor Isoformen

exprimieren (136). Und tatsächlich kann in dieser Arbeit diese Aussage bestätigt werden,

da die Expression von EP2 und EP4 Rezeptor von Zellen eines Tumorareals mittels

indirekter Immunfluoreszenz nachgewiesen werden konnte. In Übereinstimmung mit den

Beobachtungen von Ma und Eisenach konnte ebenfalls eine Lokalisation zum Zellkern

einiger EP-Rezeptor Isoformen detektiert werden (231). Darüber hinaus konnte mittels

indirekter Immunfluoreszenz die Expression von EP2 Rezeptor in B- und T-Zellen sowie

von EP2 und EP4 Rezeptor in Makrophagen der Harnblase transgener Mäuse

nachgewiesen werden. Pavlovic et al. konnte die Expression aller EP-Rezeptor Isoformen

in Makrophagen zeigen, gleichwohl nur die selektive Hemmung des EP4 Rezeptors die

COX-2 abhängige, ECM induzierte Proteinaseexpression blockierte (232). Die Ergebnisse

lassen damit die Schlussfolgerung zu, dass besonders EP4 aber auch EP2 Rezeptor eine

wichtige Rolle während der Karzinogenese spielen und dass das PGE2-vermittelte Signal

vorrangig über diese beiden Rezeptor Isoformen erfolgt.


196

Sowohl EP2 als auch EP4 Rezeptor sind an GS Proteine gekoppelt und können die

Adenylat-Cyclase aktivieren, was zu erhöhten cAMP-Spiegeln führt und eine Reihe von

Signalwegen anschalten kann. Darüber hinaus kann EP4 Rezeptor die PI3K aktivieren und

weitere cAMP-unabhängige Signalwege induzieren. Zur Analyse des COX-2 abhängigen

Signaling in der Harnblase transgener Mäuse wurde die 2D-DIGE-Technologie etabliert.

Derartige Hypothese-generierenden Ansätze geben einen größeren Überblick über

mögliche Kandidatenproteine aus dem Pool möglicher downstream Targets. Dabei handelt

es sich nicht um exakt vorhersagbare Abhängigkeiten und direkte Interaktionen zwischen

den identifizierten Proteinen und COX-2, sondern vielmehr um mögliche Abhängigkeiten.

Somit muss wie bei Genomic-Ansätzen immer die Möglichkeit eines falsch-positiven

Ergebnisses in Betracht gezogen werden, wenn zu dem eine falsche Gewichtung und

Interpretation der Ergebnisse erfolgt. Auch die alleinige Erhöhung an Replikaten ist kein

Garant dafür, um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren, insbesondere dann, wenn bei

der Interpretation der Ergebnisse die Multiplizität unberücksichtigt bleibt. Für die

Interpretation der MS-Daten dienten einerseits die Anzahl der Matches sowie der Mascot

Score als Grundlage. Je nach verwendeter Datenbank sollte der Mascot Score nicht

< 50-80 sein, um das identifizierte Protein als eindeutig zu bestimmen. Aber wie bereits

schon erwähnt, stellt dies ein Problem dar, bei Proteinen, deren Identifizierung signifikant

war, aber der Mascot Score < 50. Erschwerend für die weitere Bewertung des Ergebnisses

ist, wenn der Match nicht > 1 ist. Für eine strikte Interpretation und Auswertung derartiger

Daten, müssten alle Kandidatenproteine vernachlässigt werden, die nicht die Bedingungen

(Mascot Score > 50, Match > 1) für eine zuverlässige Identifizierung erfüllen. Jedoch

würden dabei mögliche wichtige Kandidatenproteine verloren gehen, so dass sichergestellt

werden muss, ob es sich um ein falsch-positives oder um ein tatsächlich positives Ergebnis

handelt. Ein wichtiger Aspekt dabei ist, ob die Identifizierung des Proteins in irgendeiner

Weise mit abhängigen Signalwegen in Verbindung gebracht werden kann, wie es im Falle

des Grb-3 Adapterproteins ist, welches an Wachstumsrezeptoren bindet. Auch die

mehrfache Identifizierung von Proteinen für einen Spot stellt das Problem der

Interpretation und Gewichtung der Daten dar. Ist es tatsächlich das Protein, welches das

höchste Protein Score und die höchste Anzahl an Matches besitzt, das differentiell

exprimiert ist oder ist es eines der sogenannten gering exprimierten (low abundant)

Proteine? Wenn ein Cytoskelettprotein (Myosin) zusammen mit einem Funktionsprotein

(Prx) auf einem Spot liegt, ist die Wahrscheinlichkeit gegeben, dass das Cytoskelettprotein


197

einen höheren Mascot Score hat als das Funktionsprotein und u. U. das Funktionsprotein

gar nicht identifiziert werden kann. Welches ist aber tatsächlich differenziell exprimiert?

Denn es konnte mehrfach gezeigt werden, dass es zu einer Umstrukturierung des

Cytoskeletts während der Karzinogenese kommt. Erschwerend in biologischen Ansätzen

ist außerdem die Regeneration der Proteine. In einem derartigen Ansatz wird nur der

steady-state Level betrachtet, d. h., in genau diesem Zustand kann die differenzielle

Expression eines bereits zuvor identifizierten und durch einen unabhängigen Versuch

validierten Proteins nicht detektierbar sein, obwohl seine differentielle Expression

nachweisbar war und es kommt zur Falle der Multiplizität, die Fehlinterpretation des

Ergebnisses durch extensive Auswertung von Untergruppen bei mehrfachen Endpunkten

und Behandlungen (233). Mittels der 2D-DIGE-Technologie konnten eine Reihe

Kandidatenproteine (POIs) eindeutig identifiziert werden. Auch wenn die Mascot Score

Grenze und der Match unterschritten waren, wurden die POIs mit in die Liste

aufgenommen, da deren Massenspektren signifikant zu den in der Datenbank ermittelten

waren. In den 2D-DIGE Experimenten konnte eindeutig gezeigt werden, dass einige

Proteine, die differentiell exprimiert waren, in die Gruppe der Phase-II

Detoxifizierungsenzyme und/oder anti-oxidativer Stress Antwortenzyme gehören, von

denen GST und Prx mittels Immunoblot validiert wurden. Dieser in der Harnblase

transgener Mäuse suggerierte oxidative Stress konnte durch einen in vitro Ansatz bestätigt

werden, der zeigte, dass der oxidative Stress in der Harnblase transgener Mäuse COX-2

und PGE2 abhängig war. Oxidativer Stress wird als Alterungsprozess, verursacht durch

freie Radikale, verstanden, dem ein Organismus durch Antioxidantien und

Detoxifizierungsreaktionen entgegenwirkt. Aerobe Organismen sind ständig reaktiven

Formen des Sauerstoffs ausgesetzt, die Signalwirkung für zelluläre Prozesse haben und bei

der Verteidigung gegen z. B. Bakterien genutzt werden. Jedoch überschießende Bildung an

ROS, z. B. durch dysregulierte sauerstoffabhängige Reaktionen (z. B. Atmungskette oder

COX-2 Reaktion) führen zur Schädigung von Biomolekülen wie Lipiden, Proteinen und

DNA und haben altersbedingte Erkrankungen wie Diabetes, Arthritis, Morbus Alzheimer

oder Krebs zur Folge (148;234). Kondo et al. konnte zeigen, dass Derivate der

Prostaglandine, die Cyclopentanone, den intrazellulären oxidativen Stress erhöhen (148).

Der Anstieg an Cyclopentanonen unter Hyperoxia führte zur vermehrten

Lipidperoxidation, verringertem GSH Spiegel sowie reduzierter GSH Peroxidase Aktivität,

veränderter mitochondrialer ROS Produktion und schließlich zum Zelltod, woraufhin


198

postuliert wurde, dass der intrazelluläre oxidative Stress den beschriebenen anti-

proliferativen und anti-tumorösen Effekten, den Cyclopentanonen zu Grunde liegen könnte

und dass damit eine Verbindung zwischen intrazellulären Stress und Zellentartung,

induziert durch Prostaglandine, vorliegt (148;149;235-238). In der Harnblase transgener

Mäuse konnte mittels 2D-DIGE eine erhöhte Expression von Glutathione S-transferase,

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase und Peroxiredoxin-2 nachgewiesen

und mittels einem in vitro Ansatz der suggerierte oxidative Stress bestätigt werden. Mittels

Immunoblot-Analyse konnte zusätzlich eine signifikant erhöhte Expression von Prx-1,

Prx-3 und Prx-6 nachgewiesen werden. Diese erhöhte Expression der Phase-II

Detoxifizierungs- und anti-oxidativer Stress Antwortenzyme spiegelte einen Schutz gegen

die erhöhte oxidative Schädigung wieder. Soini et al. konnte in diesem Zusammenhang

zeigen, dass eine positive Prx-2 Expression mit einem niedrigen Tumorgrad assoziiert ist

und eine bessere Prognose betroffener Patienten zeigte (239). Für Prx-6 konnte

nachgewiesen werden, dass eine erhöhte Expression nicht nur zur besseren Wundheilung

beiträgt und anti-apoptische Wirkung nach UV-Behandlung der Haut besitzt, sondern auch

einen Schutz vor Lungenschäden unter Hyperoxia zeigt (240;241). Für die regulatorische

Expression derartiger Schutzenzyme bedarf es eine strikte Kontrolle. Die koordinierte

Regulation der Transkription der Gene, deren Genprodukte an Detoxifizierungs- und/oder

anti-oxidativer Stress Antwortprozessen oder bei der Regulation von

Entzündungsprozessen beteiligt sind, erfolgt durch den Transkriptionsfaktor Nrf-2

(97;191), der in der Harnblase transgener Mäuse in seiner Expression erhöht und in den

Zellkern transloziert war. Durch einen in vitro Ansatz konnte gezeigt werden, dass in

Übereinstimmung zum oxidativen Stress auch die Nrf-2 Zellkerntranslokation COX-2 und

PGE2 abhängig erfolgte. Durch Immunoblot-Analysen mit separierten Proteinfraktionen

könnte diese Aussage weiter gestützt werden. Die Nrf-2 Zellkerntranslokation kann durch

Aktivierung verschiedener Signalwege und Faktoren stimuliert werden

(154;185;190;192;193;195;196). Lim et al. zeigte, dass 15-deoxy-PGJ2, ein potenter

endogener Ligand für PPAR, die Nrf-2 Translokation und folglich die HO-1 Expression

induzierte (242). Jedoch konnte in der Harnblase transgener Mäuse keine veränderte

Expression von PPAR auf mRNA-Ebene detektiert werden (nicht gezeigt) und die HO-1

Expression war im Immunoblot unverändert, so dass davon ausgegangen werden konnte,

dass die Nrf-2 Translokation über eine andere Induktion erfolgen musste. Nach Pi et al. ist

die Phosphorylierung von Nrf-2 durch Casein kinase 2 für die Translokation in den


199

Zellkern entscheidend (188), aber auch der Export von Nrf-2 aus dem Zellkern zur

Degradierung wird durch Phosphorylierung bestimmt (188;194). Nakaso et al. und

Kang et al. und andere schreiben jedoch der PI3K eine wichtige Funktion für die Nrf-2

Translokation zu (193;195). Tatsächlich konnte in der Harnblase transgener Mäuse eine

erhöhte Aktivierung der PI3K detektiert werden, so dass wohl die Nrf-2 Translokation

durch Phosphorylierung durch die PI3K vermittelt wurde. Da PI3K auch in Prozessen wie

Zellproliferation, Differenzierung, Zellüberleben und Metabolismus involviert ist, muss die

katalytische Aktivität streng kontrolliert werden, um eine Entartung zu vermeiden. Barthel

und Klotz dokumentierten, dass PI3K durch verschiedene reaktive Sauerstoffverbindungen

aktiviert werden kann und damit als Bindeglied zwischen oxidativen Stress und

Signalwegen in neoplastischen, metabolischen und entarteten Erkrankungen gesehen wird

(243). Des Weiteren beschrieben sie molekulare Mechanismen, in denen die Regulation

der PI3K Signalwege beim oxidativen Stress und wichtige anti-oxidative Reaktionspartner

wie Glutaredoxin-Familie, Thioredoxin-Familie und Serin/Threonin und Tyrosin

Phosphatasen involviert sind, welches Übereinstimmung findet zu den in dieser Arbeit

identifizierten Proteinen mittels 2D-DIGE und den daraus schlussfolgernden Aussagen. Im

Gegensatz zu Papaiahgari et al. beobachteter transkriptionaler Nrf-2 Reaktion über den

ROS-EGFR-PI3K-Akt/Erk MAP Kinase Signalweg und der von Barthel und Klotz

beschriebenen Aktivierung von Akt, ein wichtiges downstream Target der PI3K, unter

oxidativen Stress, konnte in der Harnblase transgener Mäuse keine Aktivierung von Akt,

jedoch eine geringfügig, signifikant erhöhte Expression von Akt, detektiert werden

(196;243). Akt ist ein Onkogen, welches Zellüberleben reguliert und durch PI3K

kontrolliert wird. In diesem konservierten Signalweg konnte gezeigt werden, dass ein

Verlust des Tumorsuppressorproteins PTEN eine Hyperaktivierung von Akt zur Folge

hatte (197;198). Da in der Harnblase transgener Mäuse eine geringe signifikante Erhöhung

der Expression von PTEN mittels Immunoblot detektiert wurde, konnte von einer

regulierten Hemmung der Akt Aktivierung ausgegangen werden. Dies kann auch eine

Ursache für die Hemmung der Aktivierung von Erk-1/-2 in der Harnblase transgener

Mäuse gewesen sein, die mittels Immunoblot-Analyse gezeigt werden konnte. Die

Regulation des Erk Signalweges, welcher in Zellproliferation involviert ist, wird ebenfalls

heftig und kontrovers diskutiert. Xia et al. konnte zeigen, dass eine Überexpression von

EGFR/erbB2 (Her-2), die mit schlechter Prognose von betroffenen Patienten einhergeht, zu

einer Aktivierung von Erk-1/-2 sowie Akt führte (244). In der Harnblase transgener Mäuse


200

konnte eine erhöhte Expression von Her-2 nachgewiesen werden. Jedoch schien somit

PTEN die Aktivierung zu unterdrücken. Andererseits konnte Preston et al. zeigen, das

ROS, wie Wasserstoffperoxid, bei der Übertragung von intrazellulären Signalen, wie

Wachstum und Transformation, involviert sind und dass Her-2 eine wichtige Rolle dabei

spielt. Nur in Zellen mit mutiertem Her-2 kam es zu einer Aktivierung von Erk-1/-2,

während beim exprimierten Wildtyp Her-2 die Erk-1/-2 Phosphorylierung durch Katalase,

welches in Detoxifizierungsprozessen beteiligt ist, blockiert wurde. Im Gegensatz dazu

zeigte Fushimi et al., dass die Inhibierung der Erk-1/-2 Aktivierung durch EP4 Rezeptor

vermittelt werden kann, welches über den Raf-1/MEK/Erk Signalweg erfolgt (245). Raf-1

ist wie die PI3K ein downstream Target von Ras, wobei die verschiedenen Ras Isoformen

Raf und PI3K unterschiedlich aktivieren können. Während die effektivere Aktivierung der

PI3K durch H-Ras erfolgt, kann K-Ras Raf-1 besser an die Zellmembran lokalisieren und

aktivieren (246;247). Folglich kann eine Aktivierung der verschiedenen Ras Proteine

unterschiedliche Konsequenzen auf weitere Signalkaskaden haben. Da es sich bei dem

Pull-down Ras-Assay um Raf-1-RBD-Agarose Beads handelte, ist die Schlussfolgerung

nahe liegend, dass die ermittelte Ras Aktivierung vom K-Ras stammte und die beobachtete

Erk-1/-2 Inhibierung durch den EP4/Her-2/Ras/Raf-Signalweg vermittelt wurde. Aber

sowohl Her-2, Ras, PI3K als auch EP4 Rezeptor werden in fortgeschrittenen Karzinomen

mit Tumorpromotion und -progression in Verbindung gebracht (s. 1.3 und 1.5). Zudem

belegen Literaturdaten, dass eine Überexpression mit einer schlechten Prognose korreliert,

durch die Aktivierung von downstream Targets (wie z. B. Erk-1/-2, Akt, VEGF, MMP),

die das Überleben von Karzinomzellen sicherstellen. In Übereinstimmung zu den

Literaturdaten zeigt diese Arbeit jedoch, dass in den Hyperplasien/Dysplasien der

Harnblasen transgener Mäuse genau diese wichtigen Zentralpunkte in Signalwege

involviert sind, die eine andere, scheinbare protektive Wirkung haben. Durch Nrf-2

vermittelte Aktivierung von Überlebensgenen werden wichtige Detoxifizierungsgene

angeschalten und proliferative Signalwege sowie Sauerstoff-zehrende Metabolismen (wie

z. B. Glycolyse, vgl. 2D-DIGE Experiment Tabelle 19) inhibiert, die dann wieder in

Karzinomen aktiviert sind. Somit muss es beim Übergang von der Hyperplasie zum

Karzinom einen Mechanismus geben, der diese Hyperoxie-abhängigen protektiven

Signalwege zu Gunsten der Hypoxie-abhängigen und Proliferation sowie Progression

fördernden Signalkaskaden verschiebt. Ein sehr wichtiger Transkriptionsfaktor, der die

adaptive Antwort unter Hypoxie und der damit verbundenen Aktivierung von abhängigen


201

Signalwegen (wie z. B. Glycolyse, Glucosetransporter, Angiogenese, Erythropoese)

vermittelt, um das Überleben von Karzinomzellen sicherstellen, ist Hif-1 (199;202;248).

Eine Überexpression von Hif-1 korreliert mit erhöhter Tumoraggressivität und schlechter

Prognose (199). Besonders die Expression von VEGF wird unter Hypoxia stimuliert (200).

Klein et al. konnte in K5.COX-2 transgener Harnblase einen erhöhten VEGF Level und

vermehrtes Gefäßwachstum detektieren (13), während in dieser Arbeit erstmalig ein

eindeutiger Zusammenhang auf diese späteren Beobachtungen hergestellt werden kann,

denn sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene konnte eine erhöhte Expression von

Hif-1 nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Hif-1

regulatorischen Proteine FIH-1 und VHL, die durch Bindung an Hif-1 dessen

Ubiquitinierung und proteasomale Degradierung initiieren, in ihrer Expression erhöht

waren. Sowohl die Bindung von VHL als auch die von FIH-1 an Hif-1 erfolgt

sauerstoffabhängig, so dass der Verlust der Tumorsuppressoraktivität von VHL und sogar

der von PTEN in einer gesteigerten Expression von Hif-1 resultiert, denn

Untersuchungen zeigten in diesem Zusammenhang, dass eine erhöhte Aktivität von PI3K

ebenfalls eine gesteigerte Expression von Hif-1 fördert (199-201;203). Laughner et al.

konnte zusätzlich zeigen, dass die Aktivierung von Her-2, in Abhängigkeit von der PI3K

Aktivität, die Hif-1 Expression induzieren kann (201). Komplettiert wurde dieser

Signalweg durch Blancher et al., der zeigen konnte, dass dominant aktives V12

Ras die

Expression von Hif-1 und Hif-2 förderte. Erstaunlicherweise wurden die Effekte von

Hif-1 stärker durch einen PI3K Inhibitor geblockt als durch VHL (200). Damit zeigt sich

eindeutig, dass die Her-2/Ras/PI3K-Signalkaskade sowohl protektive als auch progressive

Effekte in Abhängigkeit der vorliegenden Stimuli ausüben kann. Erstaunliche Einsichten

hinsichtlich des Hif-1 downstream Signaling erfolgten durch die Analysen von

Masyugin et al. und Semenza et al., die zeigen konnten, dass die Cytochrome P450 (CYP)

Monooxygenase CYP4B1 Promotorregion zwei Bindestellen für Hif-1 aufweist (248-

250). CYP gehören zur Phase-I Detoxifizierungsenzyme und sind auch an

Entzündungsprozessen sowie an der Biosynthese von Steroiden, Prostaglandinen und

Retinoiden beteiligt. CYP sind Monooxygenasen, die ähnlich wie die acetylierte COX-2,

Arachidonsäure in 12-R-HETE (12-R-hydroxy-5,8,10,14-eicosatetraenoic acid) umsetzen

können (92). Neben diesem potenten Na+/K

+-ATPase Inhibitor können CYP auch

12-R-HETrE (12-R-hydroxy-5,8,14-eicosatrienoic acid) synthetisieren, das


202

vasodilatorische, chemotaktische und angio-genetische Eigenschaften besitzt (248). Die

CYP4B1 Promotorregion weißt zusätzlich eine AP1 und SP1 Bindestelle auf (251). Auch

die Hif-1 und die COX-2 Promotorregionen besitzen eine SP1 Bindestelle (252;253).

Unter hypoxischen Bedingungen erfolgt die Aktivierung von SP1, die über EGF Signaling

vermittelt wird (254;255). Benoit et al. postulierte in einem Modell zusätzlich die

Aktivierung von COX-2 über einen Her-2/Ras/AP1 vermittelten Signalweg (7) und in

einer positiven Feedback-Reaktion von PGE2 Her stimulieren, welches in einer

Aktivierung von Hif-1 resultieren kann. Interessanterweise zeigen einige Promotoren,

deren Genregulation durch Nrf-2 vermittelt wird, auch HREs (hypoxia response elements),

wie z. B. die der Hemoxygenase-1 und Aldolase A. Nrf-2 und Hif-1 scheinen somit in

einem komplexen Netzwerk einander gegenseitig zu kontrollieren und gegensätzliche bzw.

gleiche, jedoch zum Vorteil ihrer Signalkaskaden entsprechende Signalwege zu aktivieren.

So z. B. sind die Chaperone Hsp70/Hsp90 Targets von Nrf-2 und bei der Proteinfaltung

involviert. Unter Hypoxia kann die Expression von Hsp70 zur direkten Stabilisierung von

Hif-1 stimuliert werden (256). Auch die Expression anderer Chaperone wird unter

Hypoxie oder direkt durch Hif-1 induziert (257). Das Transporter Chaperone

Hsp70 cognate (Hsc70), welches in K5.COX-2 transgener Harnblase in seiner Expression

erhöht war (s. Tabelle 19), ist der Zellkerntransporter für Ndrg-1, welches zur Gruppe der

stress response genes gehört und für die DNA Reparatur essentiell ist. DNA-Schäden

entstehen auch unter oxidativen Stressbedingungen. Ein Hauptprodukt ist das 8-oxo-

desoxy-Guanin, welches eine Reihe von Missense Mutationen in Karziom bezogenen

Genen verursachen kann (234). Ndrg-1 ist möglicherweise ein direktes Target von Hif-1

da die Expression unter Hypoxia erhöht ist. Folglich kommt es zu erhöhten

Proteinexpressionsleveln von Hsc70 (257). Neben Hsp70 sind auch Erythropoietin und

iNOS direkte Targets von Hif-1(258). Interessanterweise konnte in Nrf-2 defizienten

Mäusen eine erhöhte Expression von iNOS und COX-2 nachgewiesen werden (97).

Ähnliches lässt sich auch für Familienmitglieder der Carbonic anhydrases finden, deren

Transkription durch Nrf-2 oder Hif-1 reguliert werden kann (144;259;260). Neben DNA-

Reparatur spielt auch die mRNA Prozessierung unter derartigen Bedingungen eine

wichtige Rolle. An Prozessierungen der mRNA sind z. B. Heterogeneous nuclear

ribonucleoproteins (hnRNP) beteiligt, deren Regulation der Genexpression durch Nrf-2

vermittelt werden kann (144;186). In hyperplastischer Harnblase transgener Mäuse war die


203

Expression von hnRNP A2/B1 reduziert (s. Tabelle 19), während hnRNP A2/B1 im

Lungen- und Brustkarzinom überexprimiert wird. Untersuchungen konnten zeigen, dass

die Sequenz zwei Consensus Sequenzen für Hif-1 in der 5´-Region besitzt und damit

einen direktes Target von Hif-1 darstellt (261). Dies zeigt insgesamt die Komplexheit der

Regulation und Vernetzung von Signalwegen und deren Konsequenzen für die Zelle bei

einer Verschiebung des Regulationsgleichgewichts. Somit bildet diese Arbeit eine wichtige

solide Grundlage, um auf diesem aufzubauen und COX-2 abhängige Signalwege

tiefgründiger zu analysieren und dabei weitere Zusammenhänge und Abhängigkeiten z. B.

in Prozessen der Entzündungsreaktionen, Glycolyse, proteasomalen Abbau, sowie im

MAPK, PI3K und EP-Rezeptor Signaling zu entschlüsseln. Ferner, um die Beziehungen

zwischen Nrf-2 und Hif-1 abhängigen Signalkaskaden und den daraus resultierenden

veränderten Proteinprofilen beim Übergang der Hyperplasie zum Karzinom weiter zu

entschlüsseln. Als proteosomaler Ansatz dient dabei die etablierte hochauflösende 2D-

DIGE-SDS-PAGE-Technologie, um weitere mögliche Kandidatenproteine zu

identifizieren und Anhaltspunkte über abhängig regulierte Signalwege zu erhalten. Um die

Auflösung und Trennung sowie deren Identifizierung von Kandidatenproteinen weiter zu

erhöhen, können speziell ausgewählte pH-Bereiche, z. B. pH 6,2-7,5 anstelle des

gewählten linearen pH-Bereich 3,0-10,0, analysiert werden. Damit lassen sich neue

Ansätze generieren, um weitere wichtige Targets neben COX-2 für die Tumortherapie zu

identifizieren.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eindeutig gezeigt werden, dass die aberrante

COX-2 Expression in der Harnblase von K5.COX-2 transgenen Mäusen zur spontanen

Entwicklung einer Hyperplasie/Dysplasie und schließlich zum Urothelkarzinom führt, die

einhergeht mit erhöhten PG und Her-2 Leveln, sowie einer erhöhten Aktivierung von Ras

und Expression der EP-Rezeptoren EP2 und EP4. Ferner verursacht die COX-2

Überexpression eine Erhöhung des oxidativen Stresses, der zudem COX-2 und PGE2

abhängig war, sowie die differentielle Expression verschiedener Proteine, die in einem

komplexen Netzwerk unter der Regulation von Nrf-2 und Hif-1 stehen, die ebenfalls in

ihrer Expression erhöht waren. Diese Transkriptionsfaktoren sind wichtige Targets der

aktivierten PI3K, die in Abhängigkeit der jeweiligen Situation verschiedene

Signalkaskaden aktivieren kann. Somit kann mittels dieser Arbeit ein Signalweg als

Konsequenz einer COX-2 Überexpression in K5.COX-2 transgener Harnblase

zusammengefasst werden, der eindeutig auf die komplexen Regulationsmechanismen


204

hindeutet, bei denen PI3K, Nrf-2 und Hif-1 entscheidende Regulatoren darstellen, um

einerseits die Zelle vor oxidativer Schädigung zu schützen und eine Entartung zu

vermeiden, während andererseits das Überleben und die Progression der Zelle unter

hypoxischen Bedingungen sichergestellt werden soll. Ein Gleichgewicht, welches nicht nur

die Embryonalentwicklung sicherstellt, hat bei einer ungleichen Regulationsverteilung

katastrophale Konsequenzen, die schließlich zum Karzinom führen und deren

Identifizierung maßgebend für weitere Therapieerfolge sein wird.


205

Abbildung 81 Konsequenz einer COX-2 Überexpression der Harnblase K5.COX-2 transgener Mäuse. (Erklärung

s. Text).

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Abbildungsverzeichnis

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Abbildung 1 Schematische Darstellung der Regulation der Zellzahl durch Proliferation,

Differenzierung und Apoptose .............................................................................................. 2

Abbildung 2 Eigenschaften eines invasiv wachsenden Karzinoms ..................................... 4

Abbildung 3 Schritte der hämatogenen Metastasierung am Beispiel der Lunge ................. 5

Abbildung 4 Hemmung der Apoptose durch Aktivierung der PI3K durch ECM

gebundene Integrine .............................................................................................................. 7

Abbildung 5 Aufbau der männlichen (A) und weiblichen (B) Harnblase ........................... 9

Abbildung 6 Ureterwand (Harnleiterwand) ....................................................................... 10

Abbildung 7 Querschnitt einer kontrahierten Harnblase einer Maus ................................. 10

Abbildung 8 Übersichtsaufnahme eines Querschnitts der Harnblase ................................ 11

Abbildung 9 Spiralig angeordnete glatte Muskulatur der Harnblasenwand ...................... 12

Abbildung 10 Einteilung des Urothelkarzinoms ................................................................ 14

Abbildung 11 Das zu 90 % auftretende Urothelkarzinom (TCC) wird klinisch zwischen

dem papillären Urothelkarzinom und dem invasiven Urothelkarzinom unterschieden ...... 16

Abbildung 12 Umsetzung von Arachidonsäure ................................................................. 21

Abbildung 13 Synthese von PGH2 aus Arachidonsäure (AA) durch die Prostaglandin-

endoperoxid-Synthase (COX-1 und COX-2) ...................................................................... 22

Abbildung 14 PGH2 dient als Vorstufe weiterer Prostaglandine sowie Prostacyclin und

Thromboxan ........................................................................................................................ 23

Abbildung 15 Schematische Darstellung der humanen COX-1 und COX-2 Enzyme ....... 26

Abbildung 16 Kristallstruktur der Kette A der Cyclooxygenase-2 mit gebundenem

Prostaglandin H2 .................................................................................................................. 27

Abbildung 17 Schematische Darstellung der Strukturunterschiede zwischen den

Substratbindungstaschen von COX-1 und COX-2, das die Nutzung eines selektiven

Inhibitors ermöglicht ........................................................................................................... 28

Abbildung 18 Prostaglandin H2 bildet die Vorstufe der biologisch aktiven Prostanoide,

die über spezifische G-Protein-gekoppelte 7-Transmembranrezeptoren autokrin,

parakrin, endokrin oder intrakrin z. B. über PPAR (Peroxisomal proliferativ activated

receptor ) wirken können. .................................................................................................. 32

Abbildung 19 Prostaglandin EP2 und EP4 Rezeptoren abhängige Signalwege fördern

Proliferation, Überleben, Angiogenese und Migration nach PGE2-Aktivierung ................ 38

Abbildung 20 Molekularer Mechanismus von Nrf-2-Keap1 bei oxidativen und

elektrophilen Stress ............................................................................................................. 39

Abbildung 21 Schematische Darstellung des K5.COX-2 DNA-Konstrukts ...................... 57

Abbildung 22 Prinzip der isoelektrischen Fokussierung .................................................... 67

Abbildung 23 Schematische Darstellung des 2D-DIGE Arbeitsflusses mit einem Drei-

Farbsystem ........................................................................................................................... 73

Abbildung 24 Schematische Darstellung des Temperatur-Zeit-Profils einer dreistufigen

PCR ...................................................................................................................................... 91

Abbildung 25 Die Keratin 5-Promotor COX-2 transgene Maus ........................................ 98


237

Abbildung 26 Expression von COX-Isoenzymen in K5.COX-2 transgener und

Wildtypharnblase ............................................................................................................... 100

Abbildung 27 Immunolokalisation von Keratin 5 und COX-2 im basalen Epithel der

Harnblase ........................................................................................................................... 101

Abbildung 28 Immunolokalisation von COX-1 in der Tunica muscularis und in

Blutgefäßen der Harnblase ................................................................................................ 102

Abbildung 29 Prostaglandinbestimmung in der Harnblase sowie im Plasma von

7 Wochen weiblichen (w) und männlichen (m) homozygoten COX-2 transgenen und

Wildtyptieren ..................................................................................................................... 103

Abbildung 30 Prostaglandinbestimmung in der Harnblase von 6 Monate alten COX-2

transgenen und Wildtyptieren nach Celecoxibbehandlung ............................................... 105

Abbildung 31 Effekt einer Celecoxibbehandlung von 6 bzw. 12 Monate alten

homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen auf die Hyperplasie .................................. 106

Abbildung 32 Nachweis von Ki67 in der Harnblase von 6 Monate alten homozygoten

Celecoxib unbehandelten und behandelten K5.COX-2 transgenen und Wildtyptieren .... 107

Abbildung 33 Urothelkarzinom (TCC) in der Harnblase von heterozygoten K5.COX-2

transgenen Mäusen ............................................................................................................ 108

Abbildung 34 Kinetische Analyse der Expression von Her-2 in K5.COX-2 transgener

Harnblase ........................................................................................................................... 110

Abbildung 35 Effekt der Celecoxibbehandlung auf die Her-2 Expression in der

Harnblase 12 Monate alter homozygoter transgener Mäuse ............................................. 111

Abbildung 36 Erhöhter Ras-GTP Spiegel in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener

Harnblase ........................................................................................................................... 113

Abbildung 37 Nachweis von Entzündungsclustern in K5.COX-2 trangener Harnblase.. 115

Abbildung 38 Charakterisierung der Entzündungscluster in 12 Monate alten

homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen und Wildtyptieren..................................... 116

Abbildung 39 Kinetischer RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von der

induzierbaren mPGES-1 in Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblaser................... 118

Abbildung 40 Immunoblot der Prostaglandin E Synthase Isoformen in 3 Monate alten

K5.COX-2 transgenen und Wildtyptieren ......................................................................... 119

Abbildung 41 Immunoblot zum Nachweis der Expression der Prostaglandin E

Synthase Isoformen in der Harnblase von sechs und 12 Monate alten K5.COX-2

transgenen und Wildtyptieren ............................................................................................ 120

Abbildung 42 Kinetischer RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression der EP-Rezeptor

Isoformen in Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblaser ......................................... 122

Abbildung 43 Kompetition der EP-Rezeptoren in der Harnblase 3 Monate alter

K5.COX-2 transgener Mäuse ............................................................................................ 123

Abbildung 44 Kinetische Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen in sieben

und 12 Wochen alter Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblase .............................. 124

Abbildung 45 Kinetische Analyse der Expression der EP-Rezeptor Isoformen in sechs

und 12 Monate alter Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblase ............................... 125

Abbildung 46 Immunolokalisation von EP1 Rezeptor in den Blutgefäßen und

Nervenfaszikel der Harnblase 12 Monate alter Mäuse ...................................................... 127


238

Abbildung 47 Immunolokalisation von EP2 Rezeptor im Epithel- und Tumorgewebe

der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse ............................................................. 128

Abbildung 48 Immunolokalisation von EP3 Rezeptor in den Blutgefäßen und

Nervenfaszikel der Harnblase 12 Monate alter Mäuse ...................................................... 129

Abbildung 49 Immunolokalisation von EP3 Rezeptor im Epithelgewebe und in der

Muskulatur der Harnblase 12 Monate alter Mäuse ........................................................... 130

Abbildung 50 Immunolokalisation von EP4 Rezeptor in der Harnblase 12 Monate alter

Mäuse ................................................................................................................................ 132

Abbildung 51 Doppelimmunfluoreszenz von EP1 Rezeptor und Entzündungszellen in

der Harnblase von 12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen ......... 133

Abbildung 52 Nachweis von EP2 Rezeptor in Entzündungszellen in der Harnblase von

12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen ........................................ 134

Abbildung 53 Doppelimmunfluoreszenz von EP3 Rezeptor und Entzündungszellen in

der Harnblase von 12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen ......... 135

Abbildung 54 Nachweis von EP4 Rezeptor in Entzündungszellen in der Harnblase von

12 Monate alten homozygoten K5.COX-2 transgenen Mäusen ........................................ 136

Abbildung 55 Nachweis von EP2 und EP4 Rezeptor in Makrophagen in der Harnblase

12 Monate alter Wildtyptiere. Indirekte Immunfluoreszenz in Gefrierschnitten der

Harnblase ........................................................................................................................... 137

Abbildung 56 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Her-2 in den humanen

Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637 ..................................................................... 138

Abbildung 57 Nachweis der Expression von COX-Isoenzymen in humanen RT112

und 5637 Urothelkarzinomzelllinien ................................................................................. 139

Abbildung 58 Expressionsanalyse der PGE-Synthase Isoformen in humanen RT112

und 5637 Zellen ................................................................................................................. 140

Abbildung 59 RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression der EP-Rezeptor Isoformen

in humanen Urothelkarzinomzelllinien RT112 und 5637 ................................................. 141

Abbildung 60 Immunoblot zum Nachweis der EP-Rezeptor Isoformen in RT112 und

5637 Zellen ........................................................................................................................ 142

Abbildung 61 Etablierung der 2-Dimensionalen Gelelektrophorese. Repräsentative

Darstellung eines Gesamtproteinhomogenats der Harnblase einer 12 Monate alten

transgenen Maus ................................................................................................................ 145

Abbildung 62 Analytische Auswertung der 2-Dimensionalen Differenz-In-Gel-

Elektrophorese (2D-DIGE)................................................................................................ 146

Abbildung 63 Analytische Auswertung der 2D-DIGE mit anschließender Silberfärbung

des technischen Versuchsansatzes ..................................................................................... 148

Abbildung 64 Immunoblot zum Nachweis der differentiellen Expression der

Peroxiredoxin-(Prx-)Isoformen in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener Harnblase ..... 153

Abbildung 65 Darstellung der Expression der Peroxiredoxin (Prx-)Isoformen mittels

Immunoblot in RT112 und 5637 Zellen ............................................................................ 155

Abbildung 66 Effekt einer Celecoxib-(CX-)Behandlung auf den oxidativen Stress der

humanen RT112 und 5637 Zellen ..................................................................................... 157


239

Abbildung 67 Bestimmung von PGE2 in humanen Urothelkarzinomzelllinien nach

Celecoxibbehandlung ........................................................................................................ 158

Abbildung 68 Zunahme des oxidativen Stresses nach Aufhebung der Hemmung der

katalytischen Aktivität von COX-2 durch den Inhibitor Celecoxib .................................. 159

Abbildung 69 Analytische Auswertung der 2D-DIGE mit anschließender

Silberfärbung ..................................................................................................................... 161

Abbildung 70 Differentielle Expression und pI-Shift der Glutathione S-transferase

Isoform mu 1 in der Harnblase transgener Mäuse ............................................................. 178

Abbildung 71 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Glutathione

S-transferase (GST) und Hemoxygenase-1 (HO-1) in der Harnblase K5.COX-2

transgener Mäuse ............................................................................................................... 179

Abbildung 72 RT-PCR zum Nachweis der Expression von Nrf-2 in der Harnblase von

sechs und 12 Monate alten Wildtyptieren und K5.COX-2 transgenen Mäusen ................ 182

Abbildung 73 Immunoblot zum Nachweis der Expression von Nrf-2 in der Harnblase

von sechs und 12 Monate alten Wildtyptieren und transgenen Mäusen ........................... 182

Abbildung 74 Nachweis einer beginnenden Translokation von Nrf-2 in den Zellkern

in der Harnblase 12 Monate alter transgener Mäuse ......................................................... 183

Abbildung 75 Effekt einer Celecoxibbehandlung auf die Translokation von Nrf-2 in

den Zellkern humaner Urothelkarzinomzelllinien mittels immunhistochemische

Analyse .............................................................................................................................. 185

Abbildung 76 Immunoblot-Analyse von totaler und phosphorylierter PI3K in der

Harnblase 12 Monate alten transgenen und Wildtyptieren. .............................................. 186

Abbildung 77 Immunoblot-Analyse der Expression von PTEN in der Harnblase 12

Monate alten transgenen und Wildtyptieren ...................................................................... 187

Abbildung 78 Immunoblot-Analyse vom totalen und phosphorylierten Akt, Erk-1 und

Erk-2 in der Harnblase von sechs und 12 Monate alten transgenen und Wildtyptieren ... 188

Abbildung 79 RT-PCR-Nachweis der mRNA Expression von HIF-1 in sechs und 12

Monate alter Wildtyp- und K5.COX-2 transgener Harnblaser.......................................... 190

Abbildung 80 Immunoblot-Analyse der Expression von HIF-1, der regulatorischen

Proteine VHL und FIH-1 in der Harnblase transgener und Wildtyptiere.......................... 190

Abbildung 81 Konsequenz einer COX-2 Überexpression der Harnblase K5.COX-2

transgener Mäuse ............................................................................................................... 205

Tabellenverzeichnis

240

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Klassifikation des Tumors nach der TNM-Nomenklatur ................................... 18

Tabelle 2 Eigenschaften der humanen Cyclooxygenasen COX-1, COX-2 und COX-3 .... 30

Tabelle 3 Signaltransduktion von Prostanoidrezeptoren. ................................................... 33

Tabelle 4 Pathophysiologische und physiologische Effekte der Prostaglandine. ............... 34

Tabelle 5 Verwendete Primäre Antikörper ......................................................................... 52

Tabelle 6 Verwendete Sekundäre Antikörper ..................................................................... 54

Tabelle 7 Eingesetzte Oligonukleotide ............................................................................... 55

Tabelle 8 Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels ................................................. 65

Tabelle 9 Molekulargewichte des SDS-6H-Standard-Markers nach Sigma....................... 65

Tabelle 10 Molekulargewichte des Low-Molecular-Weight-Markers nach Sigma ........... 65

Tabelle 11 Laufprogramm der isoelektrischen Fokussierung nach GE Healthcare in der

ersten Dimension für 180 mm lange IPG-Streifen .............................................................. 68

Tabelle 12 Zusammensetzung der 12,5 %-igen SDS-Polyacrylamidgele in der zweiten

Dimension ............................................................................................................................ 69

Tabelle 13 Eigenschaften der Fluorochrome Cy2, Cy3 und Cy5 ....................................... 71

Tabelle 14 Eigenschaften der Fluoreszenzfarbstoffe .......................................................... 86

Tabelle 15 Reaktionsansatz für die RT-Reaktion mit 20 µl Reaktionsvolumen ................ 90

Tabelle 16 Reaktionsansatz für die PCR ............................................................................ 91

Tabelle 17 Analytische Auswertung des intra-Assay 2D-DIGE Versuchsansatz auf

Grundlage der Nullhypothese ............................................................................................ 147

Tabelle 18 Differentiell exprimierte Proteine in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener

Harnblase verglichen mit Wildtyptieren des intra-Assay Versuchsansatzes..................... 150

Tabelle 19 Differentiell exprimierte Proteine in 12 Monate alter K5.COX-2 transgener

Harnblase des biologischen (inter-Assay) Versuchsansatzes. ........................................... 162

Tabelle 20 2D-DIGE identifizierte, Nrf-2 abhängige Proteine ......................................... 181

Danksagung

241

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich ein paar spezielle Worte an einige Menschen richten, die mich

auf meinem Weg begleitet und auch unterstützt haben sowie viel Kraft spendeten in

weniger erfreulichen Stunden, so dass das Geschriebene nicht losgelöst vom ganzen

betrachte werden darf.

An erster Stelle möchte ich mich natürlich bei meinen Eltern bedanken, die mir seit Jahren

immer in allen Lebenslagen geholfen haben und immer für mich da waren. Ich danke

meinem Bruder, mit dem ich so viele lustige und abenteuerliche Stunden verbringen

konnte und wir uns gegenseitig immer wieder aufgebaut haben. Ich danke speziell meiner

Freundin Kerstin, mit der ich schon so manches Tief überwunden habe, was uns insgesamt

nur stärkte, wie auch die 3-jährige Fernbeziehung für diese Arbeit.

Ich danke Herrn Dr. Fürstenberger für sein Engagement der kontinuierlichen

Unterstützung hinsichtlich meiner Arbeitsverträge, für die informativen, fachlichen wie

auch privaten Gesprächen. Außerdem danke ich Herrn Dr. Fürstenberger und Frau

Dr. Müller-Decker für die Möglichkeit, in ihrer Gruppe meine Arbeit anzufertigen, sowie

für deren Bereitstellung der Arbeitsmaterialien und Geräte.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Buselmaier für sein großes universitäres

Engagement und seiner Unterstützung als „Doktorvater“. Ferner danke ich Herrn Dr. Kern

für seinen Einsatz als Gutachter und seine fachliche Kompetenz sowie Frau Prof. Berger

für ihre Unterstützungen.

Für die technische Unterstützung möchte ich gern Brigitte Steinbauer, Andrea Pohl-Arnold

und Dagmar Kucher danken, ferner meinen Azubis Marcello Schifani und Jasmin Meckler,

die erfrischende Eindrücke hinterlassen haben. Ich wünsche beiden weiterhin viel Erfolg

für ihre berufliche Verwirklichung.

Von meinen Mitarbeitern möchte ich besonders Timo Kehl und Seema Noor sowie Markus

Stauch und Steffi Klappenecker danken für ihre aufmunternden Gespräche, dass sie immer

für einen da waren, wenn man sie brauchte und dass sie die Eingewöhnung in die neue

Heimat erleichterten. Für die tollen Stimmungen in unserem Labor danke ich Ina

Kutschera, Susy Hummel, Sarah Chiblac, Nico Epp, Silvia de Juanes und Mareen Neuman.

Ich wünsche Euch viel Glück bei Eurem weiteren Werdegang!

Danksagung

242

An dieser Stelle möchte ich mich auch für die sehr gute Zusammenarbeit bei

GE Healthcare bedanken. Ohne den Einsatz von Herrn Dr. Goddemaier, Herrn Dr.

Junghans, Herrn Dr. Thiermann sowie Herrn Dr. Wirtz, die mich ständig in einem

Vorhaben der 2D-DIGE-Technologie begleiteten und unterstützten. Mein weiterer Dank

gilt an dieser Stelle Dr. Henning Urlaub. Durch dessen Einsatz wurde das „Summer School

in Proteomic Basics“ Projekt in Brixen/Bressanon ins Leben gerufen. Hierbei war es mir

möglich, tiefe Eindrücke in Proteomics zu erzielen. In diesem Zusammenhang möchte ich

besonders Herrn Dr. Burkhard Scheibe, Herrn Prof. Helmut E. Meyer, Herrn Dr.

Lottspeich und Herrn Dr. Hanno Steen für ihre ausgiebigen Gespräche, offen Antworten

und den vielen Anregungen danken im Bereich der Proteomics danken. Im Bereich der

Massenspektroskopie möchte ich mich besonders bei Dr. Uwe Warnken, Dr. Martina

Schölzer und Dr. Tore Kempf für die tolle Zusammenarbeit bei der Identifizierung der

POIs bedanken. Zusätzlich bedanke ich mich bei Genebio für die Bereitstellung ihrer

Melanie-Software.

Mein größter Dank geht an Herrn Prof. M. Yamamoto für seine kompetenten

Unterstützungen im Bereich des Nrf-2 Signaling und des oxidativen Stresses.

All denjenigen, denen nicht persönlich gedankt werden konnte, danke ich auf diesem Wege

für ihre Unterstützungen und wünsche allen alles Gute für die weitere Zukunft und bis zum

Wiedersehen!

INAUGURAL - DISSERTATION · urinary bladder which was shown on mRNA- and protein level as well as...

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