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GRUNDLAGEN DER ENZYMKINETIK:
MICHAELIS-MENTEN-GLEICHUNG, HEMMTYPEN
A. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
Die katalytischen Eigenschaften eines Enzyms können durch verschiedene Faktoren
beeinflusst werden. Dazu gehören vor allem Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke des
Reaktionsmilieus. Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion ist in bestimmten
Grenzen auch von der Konzentration des Substrates [S] abhängig. In der Regel nimmt die
Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Substratkonzentration zu, bis bei hohen Konzentra-
tionen ein Sättigungswert (Maximalgeschwindigkeit Vmax) erreicht wird. Das Erreichen dieser
Maximalgeschwindigkeit ist ein wesentliches Charakteristikum enzymatisch katalysierter
Reaktionen. Im einfachsten Fall, in dem nur ein Substrat umgesetzt wird, lässt sich die
Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration mit Hilfe der von
Michaelis und Menten angegebenen Gleichung beschreiben:
Dabei bedeutet:
[S]: Substratkonzentration bei Beginn der Reaktion
V0: Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion bei der entsprechenden Substratkonzentration
[S]
t: Zeit
Vmax: Maximalgeschwindigkeit der Reaktion, die bei Substratsättigung erreicht wird
Beachte: Vmax ist proportional zur gesamten Enzymkonzentration [E]0: Vmax ~ [E]0
Km: Michaelis-Konstante; bei dieser Substratkonzentration läuft die Reaktion mit
halbmaximaler Geschwindigkeit ab. Oft ist die Michaelis-Konstante ein Maß für die
Affinität des Enzyms zum Substrat.
Die Ermittlung der Michaelis-Konstante hat eine große praktische Bedeutung für die
Beurteilung eines Enzyms und der Wirkungsweise von Enzyminhibitoren.
SK
SV
dt
d[S]v
m
max
0
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Die Bestimmung der Maximalgeschwindigkeit spielt im klinisch-chemischen Labor eine große
Rolle. Da die Maximalgeschwindigkeit Vmax proportional zur Enzymkonzentration ist, lässt sich
aus der Maximalgeschwindigkeit die Enzymkonzentration (z.B. im Blut) ermitteln.
Die Michaelis-Konstante lässt sich graphisch ermitteln, wenn man die Anfangsgeschwindigkeit
der Reaktion bei verschiedenen Substratkonzentrationen unter sonst identischen
Bedingungen misst und die Werte V0 gegen [S] aufträgt (Auftragung nach Michaelis und
Menten). Dabei ergibt sich eine Hyperbel, die bei hohen Substratkonzentrationen der
Maximalgeschwindigkeit Vmax zustrebt. Im Bereich hoher Substratkonzentrationen ist also die
Reaktionsgeschwindigkeit praktisch unabhängig von der Substratkonzentration, im Bereich
niedriger Substratkonzentrationen ist V0 dagegen stark von der Substratkonzentration
abhängig. Aus der Kurve lässt sich die halbmaximale Geschwindigkeit und die zugehörige
Substratkonzentration, die der Michaelis-Konstante des Enzyms entspricht, ablesen.
Diese Methode zur Bestimmung der Michaelis-Konstante ist jedoch verhältnismäßig ungenau,
da sich Vmax in den wenigsten Fällen eindeutig festlegen lässt. Die graphische Bestimmung
wird wesentlich vereinfacht durch eine Auftragung nach Lineweaver und Burk, der eine
einfache Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung zugrunde liegt:
Bei einer Auftragung von 1/V0 gegen 1/[S] erhält man eine Gerade, die die Y-Achse im Punkt
1/Vmax und die X-Achse im Punkt -1/Km schneidet. Aus diesen Schnittpunkten lassen sich
sowohl die Maximalgeschwindigkeit als auch die Michaelis-Konstante bestimmen.
Im normalen Stoffwechsel spielt die Hemmung enzymatischer Reaktionen - ebenso wie die
Aktivierung - eine bedeutende Rolle bei der Regulation von metabolischen Prozessen. Daneben
lassen sich in vielen Fällen Vergiftungserscheinungen oder auch die Wirkung bestimmter
Pharmaka auf eine Hemmung spezifischer enzymatischer Reaktionen zurückführen.
Grundsätzlich unterscheidet man bei der Hemmung von Enzymen zwischen irreversibler und
reversibler Hemmung. Im Gegensatz zur irreversiblen Hemmung kann bei der reversiblen
Hemmung der Inhibitor vom Enzym dissoziieren (z.B. durch Verdünnen).
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Vv wenn KS max
0m
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REVERSIBLE HEMMTYPEN:
Man unterscheidet drei Hemmtypen: kompetitive Hemmung, nichtkompetitive Hemmung und
unkompetitive Hemmung.
Bei der kompetitiven Hemmung wird der Inhibitor reversibel am aktiven Zentrum des Enzyms
gebunden und verhindert so die Bindung des Substrats. Durch erhöhte Substratkon-
zentrationen kann der Inhibitor jedoch verdrängt werden, so dass bei sehr hohen Substrat-
konzentrationen die Maximalgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion erreicht werden
kann. Die scheinbare Michaelis-Konstante des Enzyms nimmt dagegen in Anwesenheit des
kompetitiven Inhibitors zu. Die Auftragung der Kehrwerte der Geschwindigkeit (1/V0) gegen
die Kehrwerte der Substratkonzentration (1/[S]) nach Lineweaver und Burk ergibt eine
Gerade, die die Gerade der ungehemmten Reaktion auf der Y-Achse im Punkt 1/Vmax
schneidet. Aus dem Schnittpunkt mit der X-Achse lässt sich die scheinbare (oder auch
apparente) Michaelis-Konstante (Km app) der gehemmten Reaktion errechnen, die mit der
Inhibitor-Konstante Ki über folgende Formel verknüpft ist:
Dabei ist [I] die molare Konzentration des Inhibitors. Die Inhibitor-Konstante Ki ist ein Maß
für die Affinität zwischen Enzym und Inhibitor. Sie gibt diejenige Konzentration des Inhibitors
an, bei der die apparente Michaelis-Konstante der gehemmten Reaktion gerade doppelt so
groß ist wie die Michaelis-Konstante der ungehemmten Reaktion.
Bei der nichtkompetitiven Hemmung wird der Inhibitor nicht am aktiven Zentrum, sondern an
einer anderen Stelle des Enzymproteins gebunden. Dadurch wird die Aktivität des Enzyms
herabgesetzt oder vollständig unterdrückt. Da in diesem Fall der Inhibitor nicht durch das
Substrat vom Enzym verdrängt werden kann, wird selbst bei sehr hohen
Substratkonzentrationen die Maximalgeschwindigkeit des Enzyms nicht erreicht. Für den
speziellen Fall, dass die Michaelis-Konstante für das Substrat unverändert bleibt, ergibt sich
bei der Kehrwertauftragung nach Lineweaver und Burk bei der nichtkompetitiven Hemmung
eine Gerade, welche die X-Achse im gleichen Punkt schneidet wie die Gerade der
ungehemmten Reaktion. Die Maximalgeschwindigkeit der gehemmten Reaktion lässt sich aus
dem Schnittpunkt mit der Y-Achse bestimmen. Die Dissoziationskonstante des Enzym-
Inhibitor-Komplexes (Ki) berechnet man mit Hilfe der folgenden Formel:
Km
Ki
I1appm
K
Ki
I1
maxV
appV
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Hierbei ist Vapp die in Anwesenheit des Inhibitors erhaltene Maximalgeschwindigkeit, [I] die
molare Konzentration des Inhibitors und Vmax die Maximalgeschwindigkeit der ungehemmten
Reaktion. Ki entspricht der Inhibitorkonzentration, bei der die Maximalgeschwindigkeit der
gehemmten Reaktion gerade halb so groß ist wie die Maximalgeschwindigkeit der nicht
gehemmten Reaktion.
Wird der Inhibitor nur von dem Enzym-Substrat-Komplex und nicht vom freien Enzym ge-
bunden, handelt es sich um eine unkompetitive Hemmung. Bei diesem Hemmtyp wird der
Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplex nicht oder nur verlangsamt zum Enzym-Produkt-Komplex
umgesetzt. In der Auftragung nach Lineweaver und Burk ergibt eine enzymatische Reaktion
in Gegenwart eines unkompetitiven Inhibitors eine Gerade, die parallel zur Geraden für die
ungehemmte Reaktion verläuft. Die Inhibitorkonstante lässt sich nach folgenden Formeln
ermitteln:
wobei Km app bzw. Vapp die in Anwesenheit des Inhibitors erhaltene Michaelis-Konstante und
Maximalgeschwindigkeit, [I] die molare Konzentration des Inhibitors und Km und Vmax die
entsprechenden Konstanten der ungehemmten Reaktion sind. Ein unkompetitiver Inhibitor
reduziert in gleichem Maße sowohl Vmax als auch Km einer enzymatischen Reaktion.
Häufig wird auch das Auftreten von gemischten Hemmtypen beobachtet, die sich nicht
eindeutig einer dieser drei Grundarten zuordnen lassen.
ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN:
Enzyme als Biokatalysatoren;
Substratspezifität, Klassifizierung der Enzyme;
Grundlagen der Messung einer Reaktionsgeschwindigkeit im optischen Test;
Michaelis-Menten-Gleichung;
Mechanismen der Hemmung von Enzymen;
Interpretation von Km, Vmax, Ki;
Medizinische Bedeutung der Enzyme.
iK
I1
maxV
appV
oder
iK
I1
mK
appmK
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B. ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
1. BESTIMMUNG DER MICHAELIS-KONSTANTE DER LACTATDEHYDROGENASE AUS
KANINCHEN-SKELETTMUSKELN
Die Lactatdehydrogenase (L-Lactat: NAD Oxidoreductase, EC 1.1.1.27) (LDH) katalysiert den
letzten Schritt der anaeroben Glykolyse
LDH
CH3-CHOH-COO + NAD+ CH3-CO-COO + NADH + H+
L (+) Lactat Pyruvat
Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der Seite der Lactatproduktion.
Die Gleichgewichtskonstante K(25°C) =
Unter den Reaktionsbedingungen in diesem Versuch liegt das gesamte Enzym in Form eines
LDH-NADH Komplexes vor. Die Michaelis-Konstante Km für Pyruvat beschreibt in diesem Falle
die Wechselwirkung zwischen Pyruvat und dem LDH-NADH Komplex.
Die Reaktionsgeschwindigkeit wird mit dem photometrischen Test nach Otto Warburg
gemessen, wobei der Unterschied im Absorptionsmaximum von NAD+ und NADH ausgenutzt
wird.
Nikotinamid-Adenin-Dinukleotide (NAD) sind als Coenzyme von Dehydrogenasen in der
Übertragung von Reduktionsequivalenten beteiligt. Dabei geht die oxidierte Form, NAD+, in
die reduzierte Form, NADH, über:
RH2 + NAD+ R + NADH + H+
Bei der Dehydrogenierung wird ein H-Hydridion (1 Proton + 2 Elektronen) auf die C4-Position des
Pyridinringes übertragen. Der zweite Substratwasserstoff wird als Proton H+ freigesetzt. Dieser
Prozess ist schematisch am Beispiel der LDH-Reaktion dargestellt:
12102,7
NADLactat
HNADHPyruvat
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NADH besitzt neben dem Absorptionsmaximum bei 260 nm ein zusätzliches Maximum bei 340
nm, das der oxidierten Form, dem NAD+, fehlt.
In der Praxis wird die Messung statt bei 340 nm oft bei 366 nm durchgeführt, da Wolframdraht-
Glühlampen in diesem Bereich benutzt werden können.
Der Extinktionskoeffizient für NADH beträgt in Abhängigkeit von der Wellenlänge:
340 = 6,2 · 103 (ℓ · mol-1 · cm-1)
366 = 3,3 · 103 (ℓ · mol-1 · cm-1)
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(Bei Verwendung von zur Berechnung ist neben der verwendeten Wellenlänge die Dimen-
sion von unbedingt zu berücksichtigen.)
HEMMUNG DER LACTATDEHYDROGENASE DURCH OXAMAT
In diesem Versuch wird die Hemmung des Lactatdehydrogenase-NADH – Komplexes durch
Oxamat untersucht. Substrat ist dabei Pyruvat.
Man kann aber auch NADH als Substrat der Lactatdehydrogenase betrachten. Entsprechend
könnte auch die Hemmung des Umsatzes von NADH durch Oxamat untersucht werden. Aus
rein praktischen Gründen ist dieses Experiment mit den im Praktikum zur Verfügung
stehenden Mitteln nicht möglich: Wegen der hohen Affinität von NADH, also dem niedrigen
Km-Wert für die Bindung von NADH an Lactatdehydrogenase, müssten die Messungen bei
NADH-Konzentrationen durchgeführt werden, die so niedrig sind, dass ein photometrische
Bestimmung nicht möglich ist. Bei geeigneter Versuchsanordnung (Messung der NADH-
Konzentrationen durch Fluoreszenz) würde sich herausstellen, dass Oxamat nur an den
Lactatdehydrogenase–NADH–Komplex, aber nicht an die Lactatdehydrogenase bindet.
Oxamat (Halbamid der Oxalsäure)
FRAGEN:
Vergleichen Sie die Struktur des Inhibitors Oxamat mit der Struktur der Substrate Pyruvat und
NADH
Welchen Hemmtyp erwarten Sie für die Hemmung der Lactatdehydrogenase durch Oxamat
a) bezüglich Pyruvat?
b) bezüglich NADH?
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C. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL
Mitbringliste: 30cm langes Lineal, Taschenrechner, Kittel
MESSUNG DER REAKTIONSGESCHWINDIGKEIT DER LDH-REAKTION IN ABHÄNGIGKEIT VON DER
PYRUVAT-KONZENTRATION
1. IN ABWESENHEIT VON OXAMAT
PIPETTIERPLAN A
Küvette Nr. 1 2 3 4 5
ml Na-Phosphat-Puffer
(Flasche)
(0,1 mol/ℓ, pH 7.4)
2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
ml NADH
(gelbes Eppendorf-
Gefäß)
(5 mmol/ℓ)
0,15 0,15 0,15 0,15 0,15
ml Na-Pyruvat
(blaues Eppendorf-
Gefäß)
(10 mmol/ℓ)
0,02 0,05 0,10 0,20 0,40
ml H2O 0,81 0,78 0,73 0,63 0,43
START der Reaktion
ml LDH*
(rotes Eppendorf-Gefäß) 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02
Die Messung erfolgt gegen eine mit 3ml Wasser gefüllte Küvette.
Der Küvetteninhalt wird durch dreimaliges Umdrehen der Küvette (bitte vorher mit Parafilm
verschließen) dreimal invertiert und die Anfangsextinktion (E0) wird gemessen. Nach 30 sec wird
überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Die Küvette wird aus dem Photometer herausgenommen.
Das Enzym (jeweils 0,02 ml) wird in die Küvette pipettiert. Der Küvetteninhalt wird sofort mit
Parafilm verschlossen und durch dreimaliges Wenden der Küvette gemischt. Für einen Zeitraum
von 2 min wird in Abständen von 15 sec die Extinktion abgelesen.
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2. IN ANWESENHEIT VON OXAMAT
PIPETTIERPLAN B
Küvette Nr. 6 7 8 9 10
ml Na-Phosphat-Puffer
(Flasche)
(0,1 mol/ℓ, pH 7.4)
2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
ml NADH
(gelbes Eppendorf-Gefäß)
(5 mmol/ℓ)
0,15 0,15 0,15 0,15 0,15
ml Na-Pyruvat
(blaues Eppendorf-Gefäß)
(10 mmol/ℓ)
0,02 0,05 0,10 0,20 0,40
ml Oxamat
(grünes Eppendorf-Gefäß)
(1 mmol/ℓ)
0,24 0,24 0,24 0,24 0,24
ml H2O 0,57 0,54 0,49 0,39 0,19
START der Reaktion
ml LDH*
(rotes Eppendorf-Gefäß) 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02
Der Küvetteninhalt wird durch dreimaliges Umdrehen der Küvette (bitte vorher mit Parafilm
verschließen) gründlich gemischt und die Anfangsextinktion (E0) gemessen. Nach 30 sec wird
überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Die Küvette wird aus dem Photometer herausgenommen.
Das Enzym (jeweils 0,02 ml) wird in die Küvette pipettiert. Der Küvetteninhalt wird sofort mit
Parafilm verschlossen und durch dreimaliges Wenden der Küvette gemischt und in das
Photometer eingesetzt. Für einen Zeitraum von 2 min wird in Abständen von 15 sec die
Extinktion abgelesen.
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MESSERGEBNISSE ZU PIPETTIERPLAN A
Zeit
Küvette
1
2
3
4
5
Vor Zugabe von LDH
0
30“
Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)
15“
30“
45“
1’
1’15“
1’30“
1’45“
2'
MESSERGEBNISSE ZU PIPETTIERPLAN B
Zeit
Küvette
6
7
8
9
10
Vor Zugabe von LDH
0
30“
Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)
15“
30“
45“
1’
1’15“
1’30“
1’45“
2'
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D. AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION
Die Anfangsgeschwindigkeiten (NADH Verbrauch pro Zeiteinheit) werden mit Hilfe des
Lambert-Beer Gesetzes errechnet:
E = · c · d
E = ermittelte Extinktionsänderung
= molarer Extinktionskoeffizient von NADH bei 366 nm = 3,3·103 l · mol-1· cm-1
d = Schichtdicke, 1 cm
c = Änderung der NADH-Konzentration
Für die mit Hilfe des Steigungsdreiecks für ein Zeitintervall von t min ermittelte
Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, v0, ergibt sich dann:
Für t = 1 min folgt daraus:
1-min
1mol
Δt1033,3
ΔE
Δtdε
ΔE
Δt
Δc
0v
1min
1mlµmol0,30ΔE
0v
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AUFGABEN:
1. Stellen Sie die Zeitverläufe der Extinktion der Versuche 3 und 8 jeweils in einem
Graphen dar.
2. Bestimmen Sie Extinktionsabnahme pro min ab dem Messpunkt 15sec.
3. Stellen Sie die Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeiten von den Substratkonzen-
trationen in An- und Abwesenheit des Inhibitors jeweils in einem Graphen nach
Michaelis-Menten (Anfangsgeschwindigkeit gegen Substratkonzentration) und
Lineweaver-Burk (1/Anfangsgeschwindigkeit gegen 1/Substratkonzentration) dar.
BESTIMMUNG DER SUBSTRATKONZENTRATIONEN [S] (PYRUVATKONZENTRATIONEN):
Die Konzentration der Na-Pyruvat-Lösung beträgt 10 mmol/ℓ (siehe Pipettierplan A und B).
Diese Na-Pyruvat-Lösung wird durch das Pipettieren um folgenden Faktor verdünnt:
Pyruvatlösung
Volumen des gesamten Küvetteninhaltes (=3 ml)
Folglich beträgt die Konzentration [S] der Na-Pyruvat-Lösung in den einzelnen Küvetten:
[𝑺]=Konzentration der Na-Pyruvatlösung Pyruvatlösung
Volumen des gesamten Küvetteninhaltes
=10 mmol/l∙Pyruvatlösung (ml)
3 ml
4. Ermitteln Sie für die ungehemmte und die gehemmte Reaktion jeweils Vmax, Km und Km app
5. Welcher Typ der Enzymhemmung durch Oxamat liegt vor?
6. Berechnen Sie mit Hilfe der im Text für den jeweiligen Hemmtyp angegebenen Formel
die Inhibitor-Konstante, Ki.
Bestimmung der Konzentrationen des Hemmstoffs Oxamat (l)
Die Konzentration der Oxamatlösung beträgt 1mmol/ℓ (siehe Pipettierplan B). Diese
Lösung wird durch das Pipettieren um folgenden Faktor verdünnt:
Oxamatlösung
Volumen des gesamten Küvetteninhaltes (=3 ml)
Folglich beträgt die Konzentration der Oxamatlösung in den einzelnen Küvetten:
Konzentration der Oxamatlösung Oxamatlösung
Volumen des gesamten Küvetteninhaltes
=1 mmol/𝓵 ∙Oxamatlösung (ml)
3 ml
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TABELLE
Küvette Nr.
Extinktions-abnahme pro Minute 30“ – 1‘30“
min
E
Anfangs-geschwindigkeit
*30,0min
Ev
0
minml
µmol
0v
1
µmol
minml
Substratkon-zentration [S] (in der Küvette)
mmol/
][
1
S
mmol
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
* siehe Berechnung
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HÄUFIGSTE FEHLER BEIM EXPERIMENT UND SEINER AUSWERTUNG
1. EXPERIMENT
- Photometer nicht gemäß der Anleitung am Arbeitsplatz eingestellt
- Mangelhafte Pipettierung (Merke: Pipettenspitze soll bei Entnahme aus dem Vorrat und
beim Pipettieren in die Küvette schräg aufstehen. Pipetten senkrecht halten,
Küvetten schräg!
- Durchmischung des Küvetteninhalts vergessen
- Ungenaue Ablesung vom Photometer (zu früh oder zu spät)
2. AUSWERTUNG
- Messpunkte nicht vollständig, unklar oder falsch eingetragen
- Dimension nicht angegeben, Koordinatenbezeichnung in Abbildungen ungenügend.