結核菌檢驗手冊 - CDC ·...

結核菌檢驗手冊

陸坤泰主編

編輯委員

林碧芬、吳竹蘭、彭建芳

薛博仁、蔡文城、鄧麗珍

蘇維鈞

行政院衛生署疾病管制局出版

中華民國九十三年三月

再版序

結核病的病原體是結核菌，找出痰液中有結核菌的病人，儘速給予

有效的治療，使病人不再傳染給別人，就是防治結核病最可靠的方法。但是由於結核菌檢驗需要耗費相當多的人力、物力、時間及空間，

更要特別注意實驗室及操作人員的安全維護，所以一般醫院檢驗室從事

結核菌相關檢驗的意願並不高，熟悉結核菌檢驗的專業人員與實驗室相

對較少，而相關的訓練及資訊亦不易獲得，這些都影響了結核病診斷的

正確性及治療的評估。為積極改善此一問題，本局自九十年起推動結核菌代檢網的建置工

作，委請結核菌檢驗品質經專家認可的醫院，為鄰近的基層衛生所及醫

療院所提供結核菌代檢服務。同時，為提昇結核菌檢驗品質，並使各級

醫院檢驗室在操作結核菌檢驗時有適合本土應用的齊一標準可供遵循，

本局邀請學者專家參考世界公認的標準流程，同時考量台灣現況，共同

編纂「結核菌檢驗手冊」。這項工作歷經多次會商修改，終於在民國九十一年三二四世界結核

病日—也就是紀念柯霍博士發現結核菌的日子前夕完成，經分送各醫院

使用後，獲得熱烈的迴響，不但手冊立刻被索取一空，各界並給予我們

許多寶貴的意見，因此本局復邀請專家詳為修訂，再版印刷。本修訂版「結核菌檢驗手冊」係委請陸坤泰教授主編，蔡文城教授、

吳竹蘭主任、彭健芳教授、薛博仁醫師、鄧麗珍副教授、蘇維鈞醫師、

林碧芬主任主筆，除就原有內容再作補充及更新、加入各項最新結核菌

檢驗方法外，並參考美國微生物學會(ASM)二００三年 Manual of Clinical Microbiology 8th Edition 加入最新資料，另外，新增第九章「結核病的分

子診斷技術」；再版內容兼顧簡要與完整之原則，希望提供各檢驗室更完

善實用的參考指引。

行政院衛生署疾病管制局

局長謹識

中華民國九十三年三月

目錄第一章前言………………………………………………………………....1

第二章實驗室的安全……………………………………………………....3

一、實驗室之配置及注意事項……………………………………......4 二、實驗室應配備的安全設備與器材……………………………......8 三、實驗室工作人員的安全…………………………………………12 四、意外事故之處理…………………………………………………13

第三章檢體的採集及運送……………………………………………..15

一、檢體的採集………………………………………………………15

二、檢體的運送………………………………………………………17

第四章檢體內分枝桿菌的分離與培養………………………………..21

一、消化去污染的方法……………………………………………...21

二、其他檢體之處理…………………………………………………28

三、培養基的製備……………………………………………………29

四、適當培養生長的要件……………………………………………33

五、抗酸菌的鏡檢……………………………………………………35

第五章分枝桿菌的鑑定…………………………………………………..43

一、臨床意義.......................................................................................43

二、分枝桿菌的種類…………………………………………….......43

三、分枝桿菌的生長特性……………………………………………46

四、臨床檢體常分離分枝桿菌鑑定之流程…………………………47

五、分枝桿菌的鑑定試驗……………………………………………52

第六章分枝桿菌的藥物感受性試驗………………………………......78

一、結核菌的藥物感受性試驗...........................................................78

二、兩種配製藥物培養基的方法: 瓊脂稀釋法和紙錠浸出法........81

三、間接藥物感受性試驗...................................................................81

四、直接藥物感受性試驗...................................................................85

第七章培養結果的報告…………………………………………………..88

一、完整的傳統結核菌培養結果報告必須包含……………………88

二、自動偵測結核菌液態快速培養系統(BACTEC MGIT 960 系統) 結果之報告……………………………………………………90

第八章分枝桿菌實驗室的品管................................................................94

一、一般注意事項..............................................................................94

二、實驗室的設置及人員....................................................................94

三、實驗室設備的品管........................................................................94

四、檢體處理、塗片及消化去污染劑的品管......................................96

五、培養基、試劑及生化鑑定試驗的品管..........................................97

六、菌種的保存..................................................................................100

七、菌種的來源.............................................................…................100

八、品管作業常用的標準菌種.........................................…............100

第九章結核病的分子診斷技術..............................................................102

一、PCR 在結核菌診斷的應用........................................…............102

二、限制酵素片段長度多型性 (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP).............103

三、目前應用核酸擴增技術(Nucleic acid amplification，NAA)

之常用分子檢驗試劑...............................................................104

四、臨床上的判斷與應用........................................................…....105

五、結論.................................................................................….......106

索引..........…………………………….........................................................107

前言

第一章前言

結核病是古老的疾病，肆虐人類已超過五千年。經過無數醫學家的努

力，經由發現病原菌、接種卡介苗、發明抗結核藥物、改進防癆措施等過

程，在 1970 年代後期大部分先進國家的結核病患者已大為減少，但是在

開發中國家，結核病仍然猖獗。在 1980 年代初期，在美國發現愛滋病患

者結核病的患病率及死亡率都很高，大約在 1990 前後全球各地即使是先

進國家，結核病都似有反撲的趨勢，而且更加猖獗，多藥抗性菌更成為問

題。於是世界衛生組織在 1993年發表「世界結核病緊急事態宣言」。

在台灣，由於公共衛生的進步及防治工作的推展，結核病的患病率及

死亡率都有顯著的減少，但離已開發國家的理想目標甚遠。近年來，更加

上生活環境的劣質化，人口過度集中於都市、國際間交通頻繁、外籍勞工

的引進，以及結核病高危險群的愛滋病散播等因素，結核病死亡率之下降

逐漸緩慢，結核病患者似有增加的趨勢，因此防癆工作仍有待加強。

在任何社區要預防結核病的散播，最好的方法是尋出痰中有結核菌的

病人，給以有效的治療，使病人不再傳染給別人，也是撲滅結核病最可靠

的途徑。結核病的臨床表現，影像特徵，大部分的醫師都很熟悉，但由於

高齡病患，愛滋病以及免疫力受損的病人增加，臨床上常會遇到不尋常的

表現，只靠臨床診斷及胸部 X光判讀常常是不可靠的。要確實診斷端賴細

菌學檢查來證實。傳統的痰抹片檢查可檢出咳出很多細菌的病人，即抹片

陽性者；痰中細菌量很少者，即痰抹片陰性者，也可藉由培養來檢出病人，

分離出來的結核菌可作抗藥性試驗，治療時當作參考。此外，近年來結核

菌以外的分枝桿菌逐漸增加，有必要加以鑑定。由於傳統的檢驗方法往往

需要耗費相當多的人力、物力、時間及空間，更特別要注意實驗室及操作

人員的安全性，所以目前一般醫院實驗室檢驗人員從事結核病相關檢驗的

意願不高，使能熟練操作相關檢驗的專業人員與實驗室相對減少。這可能

是台灣的防癆工作無法更進一步改善的主要原因。過去廿年來不斷有許多

新的結核病相關檢驗技術被發展出來，如不用培養方法來偵出結核菌，利

用同位素方法或螢光法早期偵出細菌生長，分子生物學方法等等。雖然這

些新方法可以減少許多傳統方法的缺點，並能節省許多時間，但是相對的

將增加很多成本，何況有些方法有待進一步的評估，對台灣的實驗室並不

符合經濟效益，也不適用。因此傳統的檢驗方法仍有其存在的必要性。

基於現實因素及檢驗品質之考量，依目前一般推薦，可將提供分枝桿

菌相關檢驗的實驗室分成三個層級。第一級作業包括收集和傳送檢體，製

作抹片及鏡檢抗酸菌；第二級包括檢出、分離培養以及鑑定結核菌，測定

藥物感受性；第三級實驗室包括第二級實驗室所有服務項目，並能鑑定結

核菌以外的分枝桿菌，及測試其藥物感受性。各實驗室可依本身之檢體

量、人力、設備、實驗安全與興趣等情況，自我判斷所希望達到的作業層

次。若有高於作業層次之檢驗需求時，則可轉介至相關檢驗的專門實驗

室，以確保檢驗之正確性及可靠性。由於國內有充分良好設備的實驗室及

技術熟練的相關檢驗專門人員不多，同時相關檢驗之訓練及資訊亦不易獲

得，本手冊目的即在於提供資料給從事相關檢驗者參考。雖然不如世界各

國所編的檢查指針詳細，但在台灣應該很適用，各實驗室可選擇適用的方

法進行各項檢驗，提供所欲從事服務的層次及項目。

表 1 實驗室層級與分枝桿菌診斷服務項目

層級適用單位* 服務項目

I 診所

小型醫院

採集檢體及轉送至較高層級實驗室，抹片鏡檢。

II 治療中心

大型醫院

採集檢體，抹片鏡檢，菌種培養與分離，結核菌

的鑑定與藥敏試驗，**區域醫院將所分離出的其

它分枝桿菌菌種轉送至較高層級實驗室進行鑑定

與藥敏試驗。

III 醫學中心

參考級實驗室

第二級所有服務項目，所有分枝桿菌的鑑定與藥

敏試驗，分枝桿菌相關檢驗的訓練與諮詢。

＊：本表所列適用單位僅供參考，仍應依各實驗室需求而異。

＊＊：欲進行藥敏試驗的實驗室應以該實驗室能鑑定的菌種為限，同時操

做作人員應具備熟練的操作技術。

實驗室的安全

第二章實驗室的安全由於實驗室工作人員長時間與感染原接觸，受感染機會相對增加，研

究顯示，結核菌實驗室工作人員感染結核病之危險性較其他工作人員高三

到五倍。結核病是一種慢性疾病，一般約需六至十二個月的藥物治療後才

可痊癒，但若是被抗藥性結核菌感染則不易治癒，所以從事相關檢驗者更

應特別重視實驗室之安全。實驗室的安全應自管理階層即開始，管理者對

於工作人員應予定期健康檢查，訓練其檢驗室的安全操作技術，告知工作

人員對特別危險性技術或處理的應注意事項，意外事件的正確處理方法，

並提供適當安全的設備等以減低工作人員之危險性；實驗室工作人員則應

正確地使用安全的設備，遵守相關實驗室規定，擔負安全操作的責任。

大多結核菌實驗室的感染主要可歸因於操作過程中產生含感染性抗

酸菌霧滴(aerosols)，雖然產生的大霧滴(大於 5 µm)會很快沉降於皮膚，衣

服或工作台面，但最危險的是那些小於 5 µm 的細小霧滴，這些細小的霧

滴內可能含 1-2 隻活的結核菌，除非經排氣抽風送走，否則仍會懸浮於空

氣中。若這些感染性小霧滴被吸入肺部則可能造成感染。常見會造成小霧

滴之操作包括如下：一、倒出經離心處理後的培養液或檢體的上清液。二、使用定量自動吸管吸取含菌液體。三、以滴管混合含菌培養液。四、使用高速攪拌器。五、含培養液之試管或錐形瓶掉落至桌面或地面。六、離心時試管破損。七、含細菌之懸浮液自滴管滴到堅硬的桌面而濺開。雖然實驗室之感染大多為吸入含結核菌的小霧滴所造成，但有時被帶

菌的針或注射器扎到、污染的玻璃碎片割到、或操作者的傷口等情形將會

造成肺外感染，所以分離室內的台面或設備均需視為具強烈感染性，應定

期清理消毒並隨時保持清潔。

一、實驗室之配置及注意事項理想上，自收到檢體到發出報告，所有結核菌檢驗相關工作應在配備

有全部設備的獨立單位內進行，實驗室內要有 Class II 或 Class III 的生物

安全操作櫃(BSC，Biological Safety Cabinet) 才能進行分枝桿菌檢驗, 同時

室內空調最好為單向換氣系統(非循環式)，使室內氣流維持由較清潔區域

流向污染區域之單向換氣。

有關於結核菌實驗室的設計可參考美國疾病防治中心（Centers for Disease Control, CDC）於 1994 年 10 月 28 日所發表的「醫療中心肺結核病

傳染防治規範（ the Guidelines for Preventing the Transmission of Mycobacterium Tuberculosis in Health-Care Facilities）」，目前台北榮總有一

新設計的分枝桿菌實驗室，可供其他實驗室參考（如圖 1）。

走廊區域應維持最高氣壓，一般 TB 工作區則氣壓稍低，如此氣流將

自走廊流入 TB 實驗室。若配置有滅菌室(如用於製備培養基的房間)，則其

氣壓應稍高於一般工作區，以防止污染性空氣流入，分離室應維持最低的

氣壓，自分離室所排出的空氣需經 HEPA ( High Efficiency Particulate Air)系統過濾再經送風管排出。於實際監測工作環境的氣流流向時，可將小紙

條貼於門、牆或 BSC 邊緣以觀察氣流的流向，若實驗室內不是呈負壓狀

態則不可進行檢驗操作(例如氣流方向相反或不流動時)。配備 BSC 的分離

室應有獨立的空間，所有可能產生小霧滴之操作(如處理檢體、製作塗片、

接種、各種試驗)均應於 BSC 內進行。自 BSC 排出的空氣需經能除去

99.97% ，> 0.3 µm 的 HEPA 系統過濾才能排出室外。一般狀況下，房間

內空氣作每小時 6 - 12 次的交換，可於 30 ~ 40 分鐘內除去 99% 以上的污

染性粒子，實驗室所排出的空氣應自建築物最高處並遠離進風口處排出，

以減少污染性空氣再流入建築物內。實驗室基本結構及配置結核菌實驗室是由緩衝室及操作室所組成，為標準無塵室，依據各醫

院環境採用特殊設計之供排風系統及自動壓差監控設計，並利用動力學阻

斷原理建造而成，能防止環境受到污染，能夠確保操作人員的安全。

實驗室的安全

1、緩衝室為操作室與外界隔離用之準備空間，為進入操作室之第一層保護，有

下列設備： a、 99.99%之高效率濾網二張（24”× 48”）。 b、不鏽鋼自動門（電眼感應式開關）。 c、配電盤及自動控制系統。 d、數位式壓力顯示器。 e、 120 W 嵌入式無塵燈（二盞）。 f、 30 W 吸頂式紫外燈（二盞）。 2、操作室

為檢驗人員對於結核菌之檢驗，烤片，染色及培養之場所，有可能遭

受結核菌污染之危險性存在，故需有特殊設計之負壓系統及安全的染色烤

片操作箱；離心機排氣罩，及生物安全操作箱來保護檢驗人員，操作室可

包括下列設備： a、99.99%之高效率濾網二張（24”× 48”）。 b、回風柱並有 99.995%之排氣高效率過濾網。 c、數位式壓力顯示器。 d、離心機排氣罩（含 99.995%之排氣高效率過濾網）。 e、離心機 1∼2 台。 f、二氧化碳培養箱二台。 g、微生物安全操作櫃一台。 h、120 W 嵌入式無塵燈（六盞）。 i、30 W 吸頂式紫外燈（八盞）。 j、全負壓式安全操作櫃一台。

實驗室的安全

實驗室安全及保護設計針對結核菌的感染性和特性以及對環境保護的理念，所規劃之實驗室

及設備應有多項安全防護設計，能夠兼顧操作人員及環境安全。 a、由白鐵烤漆組合庫板合成的實驗室，結構安全能防火，並加以矽膠做氣

密處理能夠避免污染及被污染。 b、實驗室內採用獨立排風過濾系統，利用單一獨立排風管經回風柱高效率

過濾網過濾後由屋頂排至大氣，絕不會對院內有任何危險污染。 c、壓力控制系統使緩衝室恆為正壓，且大於操作室 30 Pa 以上，穩定而安

全的隔離環境。 d、採用西德進口之天然橡膠無縫地板，利用高週波熔接可以避免細菌滋生

及殘留，且易於清理及保養。 e、利用大面積 99.99%高效率 HEPA 過濾 0.3 µm 以上的粒子，創造標準無

塵室環境，達到無塵效果。 f、使用腳踏防塵墊提高實驗室潔淨度。 g、消防灑水系統可以避免火災發生。 h、對講機方便操作人員與在外的人員溝通協調。 i、全負壓式安全操作箱可以讓檢驗人員在其內進行烤片及抗酸性染色，以

確保人員的絕對安全性。 j、檢體離心時需有離心排氣罩加強抽氣，並經 99.995%高效率 HEPA 過濾，

避免離心時檢體外洩而污染人員及環境。實驗室使用說明要進入實驗室的人員，首先要建立自我保護的觀念，做好所有的防範

及準備措施，仔細檢查所有裝置及設備，如此才能避免及意外，唯有瞭解

各項設備操作及使用方法才能工作於安全環境。 1、進入結核菌室注意事項

人員方面： a、穿戴單次使用的帽子、口罩（如 N95）、聚氯乙稀手套。 b、無塵衣使用後需經高壓滅菌及清洗後再穿著。 c、每天使用 75%酒精清理安全操作箱，使用完後並開啟紫外燈殺菌。 d、定期對檢驗人員做健康檢查。

環境方面： a、開啟電源並檢查自動控制系統是否運作。 b、待數位壓差顯示 30 Pa 以上負壓後才可進入。

2、各項設備使用說明

對講機操作： a、拿起話筒直接按下呼叫鍵送信號到副機。 b、等對方拿起聽筒就可直接對話。 c、通話完畢後，請放好聽筒準備下一次的呼叫。

自動門： a、自動門使用電眼控制，須讓電眼偵測到人時才會打開。 b、運轉平順，直流電動機用來提高開關速度，這有利於使用繁忙地區

進出更加暢通。 c、微電腦控制器自動調整門扇，使其運轉平順，當門扇快速倒退時，

能使自動控制恰到好處，這有利於防止門卡住或振動。腳踏防塵墊：

a、撕去背面雙面膠帶固定在地板上。 b、每片腳踏防塵墊共有 25 張膠膜，如發現防塵墊污損或黏力不足時，

由右上角撕下舊的膠膜便能更新。

二、實驗室應配備的安全設備與器材結核菌實驗室進行保養及維修時應特別小心，分離室設備之保養、清

潔、檢查等更需要專業人員執行以確保安全。需要進行大保養時，BSC 及整個空間要作消毒處理，若只是一小部份設備需要保養時，則應以消毒劑

消毒後再移出分離室進行保養或維修。結核菌實驗室應配備的基本設備與

器材如後： 1、生物安全操作櫃易於保養，功能良好的 BSC 是結核菌實驗室最重要的設備，處理檢體

及活菌培養之操作只可在 BSC 內進行，實驗室應備有 BSC 的使用，保養

及去污染處理手冊。一般適用於結核菌實驗室的 BSC 有兩型，一為第一級

實驗室的安全

負壓生物安全操作櫃（Class I Negative Pressure Biological Safety Cabinet, NPBSC），本型 BSC 於操作面之氣流至少 70 ft/min ，並排出 100% 空氣

至室外；另一型為第二級垂直負壓生物安全操作櫃（Class II Vertical Laminar Flow Biological Safety Cabinet, LFBSC），為利用 HEPA 系統過濾空氣，低

危險性實驗室，僅操作結核菌的抗酸性染色，而高危險性的實驗室，除了

染色外也操作培養、鑑定及藥敏試驗。會產生氣霧的動作，必需在 Class II BSC 內操作，同時必須在負壓實驗室，工作人員必須有保護性的衣物及口

罩等，而 Class II BSC 只能裝置在使用非循環式排氣系統或能直接將空氣排

出室外的實驗室。有關結核菌實驗室的要求，可參考 CDC/NIH 建議的生物

安全性使用規定（Biosafety guide），網站為 www.cdc.gov/ohs/biosfty/bmb14。一般 BSC 之氣流至少為 70 ft/min，每年應請專業人員檢查，灰塵較多

地區甚至應每季檢查，當氣流不對時，表示可能風扇故障或濾片被阻塞，

應予以消毒後，由專業人員維修或更換濾片。 2、紫外線燈

紫外線燈放出 253.7 nm 波長放射線，可裝置於 BSC 內、牆上或天花

板，用於工作區域表面的消毒及殺死空氣中懸浮的微生物，裝置於牆上或

天花板的紫外線燈應使用適當燈具使工作區的幅射線不超過 0.1 uwatt/cm2 以確保安全，於紫外線燈打開時不可進行作業或直視燈源以避免眼睛或皮

膚被灼傷，應於工作結束後開燈至少一小時以上以達到殺菌效果。紫外線

的穿透力弱，如灰塵、油脂等即可阻斷光線，應每週以酒精棉擦拭燈管，

每三個月檢查殺菌力，若輸出力低於 70% 時即予以更換。 3、防護衣著由於 BSC 不可能提供 100%的防護效果，所以需要其它附加防護裝

備，使用可過濾 90 % 以上 0.5 ~ 1.0 µm 粒子的面罩（如 N95 口罩）以減

少吸入感染性粒子的危險性；結核菌實驗室使用外科手術服除了可用於防

止 > 5 µm 的霧滴污染皮膚及衣服外，並可用以作為辨示為具強感染性衣

物；手套可用於避免手部污染或割傷，鞋套及帽子則可減少將污染原帶出

實驗室的危險性；所有更換的衣物應放入有蓋容器，經高壓蒸氣消毒完全

後再送洗。

4、呼吸道保護裝置（呼吸面罩）在呼吸面罩還不普遍的台灣，目前工作人員必須選用合適的口罩，如

N95，但要注要戴口罩時，必需要緊密；工作量大的結核菌檢驗室最好採用

經過美國職業安全衛生之國家機構（National Institute for Occupational Safety and Health, NIOSH）認證的呼吸口罩 N95（95% 效率），美國疾病防治中心

（CDC）建立呼吸面罩必需符合如下要求（i）濾膜必需可以去除大於 0.3μm 顆粒（ii）臉部的緊密度必須不可超過 10%的漏氣（iii）必須適合臉部

的大小，通常有三種大小的規格讓工作人員選擇，（iv）每次必須檢查戴呼

吸面罩者的緊密度，以符合美國職業安全衛生署（OSHA）的標準，一般的

外殼口罩並非 NIOSH 認證通過，不可用於結核菌室。 5、離心機

離心時，若離心管破損則會釋放感染性粒子，甚至散播到房間中，所

以所有疑似含致病原的檢體於離心處理時均應使用防霧戴具，以防萬一離

心管破損後，能於 BSC 內操作，減少感染原散播的危險性。 6、安全吸球

絕對不可用嘴吸吸管，因為除了可能直接自嘴部吸入感染性物質外，

還可能將操作時產生的霧滴由嘴或鼻吸入肺部造成感染，需使用吸管吸取

任何液體時，一定要使用安全吸球。 7、高壓蒸氣消毒鍋

理想上，高壓蒸氣消毒鍋應裝置於結核菌實驗室內作為污染衣物送洗

前的消毒及感染性廢棄物消毒之用。使用時，應利用生物指試劑 Bacillus stearothermophilus 之芽孢試紙或其它方式如留點溫度計或變色試紙條定期

或不定期檢查是否滅菌完全。 8、廢液瓶

檢體經消化去污染處理後，可將上清液倒入廢液瓶內以減少霧滴之產

生及污染 BSC 內的工作台面，廢液瓶應為廣口容器以利廢液倒入，瓶內需

裝適當消毒劑如之次氯酸鈉（約 50 ppm 漂白水）或 Amphyl 以殺死廢液內

細菌。

實驗室的安全

9、酒精砂瓶當含有菌塊或有機碎片之接種環或接種匙要利用火燄清潔時，可先將

接種環或接種匙插入瓶中，瓶中砂礫可刮去菌塊或有機碎片，而酒精於火

燄清潔時可用以迅速將殘餘的碎片燒掉，一般可利用附蓋的廣口瓶或錐形

瓶裝入約 5 cm 高的乾淨海砂及 2.5 cm 高的 95 % 酒精，即成為相當實用的

酒精砂瓶。 10、無菌塑膠接種環

為了避免接種檢體產生氣霧，除了使用丟棄式無菌滴管接種外，可再

利用可棄式無菌塑膠接種環劃種檢體。可棄式塑膠接種環以具有彈性者為

佳，操作時以手指持中間部位，二端均可劃種檢體或移菌。 11、接種匙

接種匙可利用於將固體培養基上菌落轉接種於另一培養基或菌落的乳

化。可利用 18 號鎳線將前端打薄成約 5 ~ 10 mm 長，1 ~ 2 mm 寬，0.3 ~ 0.5 mm 厚製成；或利用約 6- 8 吋的木棒將前端削成 30 ~ 45 度角製成，前

者消毒後可重複使用，後者為可棄式不可重複使用。 12、消毒劑

消毒劑之效力與其濃度、作用時間、微生物種類及有機碎片之存在等

因素有關，除了一些新產品外，一般四級銨類化合物不能殺死分枝桿菌，5 % 酚溶液由於其對皮膚之毒性，不推薦使用，但其它酚衍生物如 Amphyl（Reckitt Benckiser North America, Wayne, N.J. USA）、Osyl、Staphene、Vesphene 等為有效的消毒劑，其它如 0.05 ~ 0.5 % 次氯酸鈉(Sodium hypochloride solution) 溶液（依照物體表面污染的程度決定濃度），至於 3 ~ 8 % 甲醛 (Formaldehyde)溶液雖然很有效，但由於具強氧化性、刺激味及

具有毒性等性質使用時較不安全，選用時應注意。所以不論選用何種消毒

劑，最重要的是要選擇能殺死結核菌者。日常操作時若手部被污染，一般

可用 70% Isopropyl 或 70% Ethyl 酒精清洗後，再以肥皂及清水洗淨即可達

到消毒的效果，於結核菌實驗室內應備有適當消毒劑，以供操作時或污染

工作區域時之用。

13、抗酸性染色抹片加熱盤特殊設計的加熱盤（約放置 20 個抹片，如美國 SDL 公司製造）可把溫

度固定在 65℃左右，抹片製作後，放在上面乾燥，除了可避免產生氣霧外，

亦可同時殺菌。目前，有些實驗室利用紫外線燈殺死抗酸性抹片上的細菌，

仍具有危險性，因為紫外線燈穿透力差，容易受灰塵及空氣中浮游物阻擋，

而防害殺菌力，因此，可能會有「漏網之魚」，同時，紫外線燈在使用 600個小時後必須要換新，否則，殺菌力將變低。三、實驗室工作人員的安全為確保結核菌實驗室工作人員的安全，除了須提供安全的硬體環境及

設備外，尚應選擇適任的人選。於從事結核菌實驗室工作前，應訓練其實

驗室之安全操作技術、危險性技術或處理時應注意事項、意外事件的正確

處理方法、如何正確地使用安全的設備、遵守相關實驗規定等事項，同時

應實施定期胸部 X 光檢查，以確保工作人員的安全。一般實驗室的工作人

員多採輪調制度，但是由於從事結核菌實驗室工作被感染的危險性較高，

同時為了維持操作的熟練及結果的精確，一般認為以不採用輪調制度為宜。分離室為實驗室內具強烈感染性的區域，所以進入時應特別注意下列

事項： 1、任何未穿防護衣著者不應進入分離室。進入分離室前，應將工作所需檢

體及材料預先準備妥當，計劃預定完成的工作項目，並儘量不要帶手錶

或手鍊等裝飾品以避免影響操作。進入分離室後，完成預定工作後再離

開分離室。若臨時需要其它設備或材料，應請其它工作人員送入分室，

不可任意進出分離室以避免造成環境的污染。 2、進行檢體處理或培養時，一定要在 BSC 內操作，並隨時利用含消毒劑

濕巾以減少污染。污染性廢棄物如廢液、玻片、應先經消毒液殺菌後再

高壓蒸氣消毒，檢驗申請單若與檢體接觸亦應經過消毒再進行登錄等作

業。吸取檢體時，絕對不可用嘴吸吸管，應使用安全吸球。 3、工作完成後，應將所有廢棄物裝入附蓋容器以消毒劑擦拭外表後高壓蒸

氣滅菌，BSC 內及工作區域應以消毒劑擦拭消毒, 然後打開紫外線燈一

小時以上以殺死工作區域表面及懸浮的微生物，更換工作服後離開分離

室，更換的衣著應高壓蒸氣滅菌後再送洗。

實驗室的安全

四、意外事故之處理實驗室的意外事故最好不發生，但若發生應有完整的防護計畫以阻止

感染原的散播，我們可依產生感染性霧滴的量及空氣處理系統的種類來討

論因應對策。 1、單向式空氣處理系統

單向式空氣處理系統可供給 100%新鮮空氣入實驗室，污染性空氣經過

BSC 之 HEPA 系統過濾後排出。其它大部份空氣(BSC 外區域)則不經過濾

直接由抽風管排出，使用單向式空氣處理系統實驗室若產生霧滴，霧滴將

不會在建築物或實驗室內循環，所以能有效的減低被污染的危險性，大多

新建的公共衛生實驗室都採用此種空氣處理系統。若發生只產生少量感染

性霧滴之意外事故時，例如打破一支含細菌的固體培養基試管或培養皿或

痰檢體濺出等，這種情況，基於固體培養基及痰的黏稠性不致於產生大量

含菌霧滴，此時應採取的處理如下： (1) 將受污染區域迅速以抹布或實驗衣覆蓋以防止進一步產生霧滴。 (2) 噴灑消毒劑浸泡整個抹布或實驗衣。 (3) 離開房間兩小時以上, 讓空氣處理系統排除所產生的霧滴。 (4) 穿著防護衣著再進入房間清理受污染區域。 (5) 將所清理的污染物丟入適當容器再高壓蒸氣消毒。 (6) 以消毒劑擦拭地面及工作檯面。

若發生產生大量感染性霧滴之意外事故時，例如打破一瓶或一支含高

濃度細菌的培養液，此時應採取的處理如下： (1) 立即疏散房間的工作人員，因為此時將產生大量感染性霧滴。 (2) 讓 BSC 持續開機四小時以上，人員不得進入，此時除了可經由 BSC 內

HEPA過濾系統清除大部份感染性霧滴外並能減低建築物外人員被感染

的危險性。 (3) 若可能，於 4 小時後以甲醛氣體消毒整個房間。(本方法不適用於有天

花板、有孔牆壁及再循環式空氣處理系統的環境)

甲醛氣體的消毒方法： (a) 封閉所有空氣的進出管路及門縫。 (b) 取適量福馬林 (36 % ~ 40 % fomaldehhyde) 依房間大小，以電熱

板蒸乾，( 約 1 mL/cu.ft., 例如房間為 12 x 10 x 10 feet = 1,200 cu.ft. 時，可使用 1,200 mL 福馬林。使用時濃度不能太高 ( > 8%)，以避免爆炸的危險性。

(c) 將房間相對濕度調整至約 70 %，以得到最好效果。 (例如若房間

為 12 x 10 x 10 feet = 1,200 cu.ft.，以 500 ml 水蒸乾即成。) (d) 讓福馬林蒸氣薰蒸房間 4 小時以上或隔夜後，再穿上防護衣著進

入房間，除去房間空調管路的封塞讓房間空氣流通至無福馬林，

最後再擦拭整個房間。(若房間有白色粉狀殘留物, 可利用 10% NH4OH 溶液擦去。)

2、再循環式空氣處理系統許多建築物的空氣處理系統為利用抽入 20% 新鮮空氣混合建築物內

原有的 80% 空氣循環利用，這種處理系統雖可節省能源的耗費，但並不適

用於會產生傷害性或感染性物質的實驗室，因為容易造成整個建築物的污

染。一般再循環式空氣處理系統建築物的消毒可使用製霧機*( fogging machine)進行，因為以製霧機加上消毒劑，能使懸浮的污染性霧滴迅速沉降

並予以消毒, 一般處理方法如下： (1) 除了造成意外的當事人外，立即疏散其他人員。 (2) 封閉整個空調系統的進出管路。 (3) 開啟裝好適量消毒劑的製霧機，離開房間並封閉門縫。 (4) 讓製霧機*將消毒劑散佈整個房間，使含消毒劑的霧氣充滿一小時以上。 (5) 穿上防護衣著再進入房間，以消毒劑擦拭房間。 (6) 除去空氣管路之封塞讓房間的空氣流通。

本處理方法雖然麻煩，但是能迅速有效的應用於使用再循環式空氣處

理系統，懸吊式天花板、有孔牆壁等情況的建築物。 * 製霧機: Fogmaster (Germfee Laboratories, Inc., Miami, FL)，Oxford Jet

Fogger (Oxford Chemicals, Inc., Camblee, GA)

檢體的採集及運送

第三章檢體的採集及運送檢體內是否含抗酸菌可經由顯微鏡鏡檢或培養得知，但是利用鏡檢並

無法鑑別分枝桿菌的種類，由於仍有許多已知的分枝桿菌會侵襲或感染人

類，所以唯有確認所分離出的菌種加上臨床診斷才能確定是否被感染。自

檢體培養出結核菌的效率與檢體的採集及處理有關，因此檢體應很小心地

收集並妥善的運送到實驗室。一、檢體的採集為得到理想的結果，檢體之取得應注意下列事項： 1、應於未開始治療前即予採檢。因為即使是數日的藥物治療仍可能殺死

或抑制足夠量的結核菌，使細菌無法培養出來，而影響診斷的正確性。 2、應將檢體收集於清潔、無菌、單次用的塑膠容器或經清潔、滅菌的玻

璃容器。 3、應收集至少三次早晨第一口痰檢體。 4、儘速將檢體送實驗室檢驗。 5、檢體運送時，應妥善包裝避免漏出或破損。

負責檢體採集及運送的工作人員，應備有檢體處理步驟的操作手冊。

收取檢體時，須注意檢體是否適當(如量不足、包裝不良、儲存過久等)，要成功的分離出病原菌除了需採得最適當的檢體外，同時要妥善予以運

送、處理。 1、肺部檢體的採集

雖然結核菌對人體各器官均可能造成病變，但是仍以肺部感染佔最大

的比例(約 85 %)，其它分枝桿菌感染亦類似，因此實驗室最常見的檢體為

肺的分泌物，一般可利用下列方式取得所需的檢體： a、痰

為採得理想的痰檢體應指導受檢者，於取痰前應先以水漱口，以

減少口內的食物殘渣、漱口液、藥物等物質污染檢體或抑制結核菌的

生長。同時於咳痰時，應用力咳出肺部深處的痰，而不是咳出唾液或

喉頭分泌物。採得的痰檢體應收集於明確標示受檢者資料的適當容器再

送檢，需採集的檢體數可依初期塗片鏡檢結果決定，例如於前三次檢查

中有兩次以上抹片鏡檢為陽性，則採集三次檢體即足夠；若三次檢查中

只有一次或無抹片鏡檢為陽性，則需採集較多次檢體(一般約為六次)以確定是否罹病，有些病人只會咳出少量細菌或不規則的排菌，則此類病

人增加採檢培養次數將能提高陽性率，若病人只能咳出很少量的痰，可

收集 24∼48 小時痰檢體以供培養所需，若檢體須外送至其它實驗室檢

驗，則以早晨第一口痰檢體較 24∼48 小時痰檢體不易受污染，若病人

無法咳出痰可利用下列方法取得檢體。 b、導痰

利用吸入溫暖的霧化高張性食鹽水(5 %∼10 %)，以刺激肺部，誘

導受檢者咳嗽及產生薄、水樣的檢體。由於採得的檢體呈水樣，應特

別予以標示註明。 c、胃洗出液

無法以上述方法採得檢體時可利用本方法，為採得理想檢體受檢

者須住院，於早晨未進食前或未離床前採檢，若利用本法取得的檢體

應於四小時內處理完成。若採得的檢體未能立即送檢時，可加入 10% Na2CO3 溶液或 23% Na3PO4 溶液暫時保存，並於四小時內完成檢體處

理。 d、支氣管沖洗液、擦刷物、活體切片及氣管穿刺抽取物

利用本方法採檢，除了能直接取得檢體外，往後數日並可使受檢

者自然產生痰，以供檢查。 2、肺外檢體的採集肺外結核感染往往由於 X 光檢查、結核菌素皮膚試驗等檢查皆呈陰性

反應，使而不被認為是肺外疾病的致病原，但是結核菌於人體各器官均可

能造成病變，所以實驗室可能收到各種肺部以外的檢體，如體液、組織、

膿、尿等，這些檢體依受污染情形約可分成兩大類。 a、無菌採檢技術取得的體液

經醫師利用無菌技術抽出或外科手術取得的體液(如腦脊髓液、胸

水、心包膜液、關節液、腹水、血液，膿、骨髓等)。此類檢體往往被

大量液體稀釋，不易分離出結核菌，若要增加陽性率，可將檢體以 1：

5∼10 比例迅速接種入液體培養基 (如 Middlebrook 7H9, Dubos Tween Albumin Broth, Proskauer-Beck Broth)，然後培養於 35-37℃，10% CO2，

暗處，每日以手搖動，以促使少量結核菌繁殖，每週觀察塗片，若陽

性時，再轉種於固體培養基繼代培養，並鑑定之。若四至六週後仍未

生長，則將接種的液體培養基離心 3000 x g 以上，再取沉澱物種入固

體培養基。若檢體凝固或無法即時種入液體培養基，可加入無菌草酸

鹽或肝素抗凝劑後儘速送檢。自血液中發現分枝桿菌(尤其是愛滋病患

者)雖然可比照一般體液進行接種培養，但是依目前技術效果不佳，近

來有利用溶血離心技術(Isolator Tube)效果不錯。 b、無菌採檢技術取得的組織

懷疑含有結核菌的組織檢體，可裝入無菌容器送檢(不能固定或防

腐)，若無法立即處理可加入無菌生理食鹽水防止乾燥並覆以乾冰，保

持 5∼10℃，儘速送檢。收到的組織檢體應於 BSC 內予以研碎均質化

後直接接種入液體及固體培養基。若無法確定檢體是否污染，可將一

半檢體種入液體及固體培養基，另一半檢體則經消化去污染處理再接

種入培養基，接種於液體培養基者應如上述體液培養方法處理及檢查。 c、可能受污染的檢體

實驗室收到的檢體多屬本類，其中自肺部取得的檢體可依前述「肺

部檢體的採集」方式處理。其它未經無菌操作技術取得的檢體及尿亦

可依痰處理方法處理。尿為常見培養前需要處理的檢體，因為生殖泌

尿系統為人類常見的肺外結核病灶之一，同時生殖泌尿系統的結核病

往往在其它部位也會有病灶存在。採檢時，應先清潔外生殖器，以減

少污染發生，檢體可採取早晨第一次中段尿或全尿，增加採檢次數將

可提高陽性率。二、檢體的運送

2003 年出版的 Manual of Clinical Microbiology 8th edition 有鑑於結核

菌為感染性物質，有關於運送必須嚴格管控，避免工作者或一般民眾接觸

到感染性物質，因此，若檢體須郵寄運送時，（i）應予以妥善包裝，使用

的包裝需能防止檢體漏出（ii）經得起運送過程中產生的振動、壓力等變

化，（iii）並明顯標示如使用感染性物質的標誌，（iv）包裝必須附上文件

說明緊急處置辦法，訓練工作人員熟悉危險物之緊急處置辦法，以提醒運

送者小心處理。若由專人運送，亦應使用適當容器以防止檢體漏出造成污

染。有關結核菌診斷檢體的運送，可參考國際空運協會（International Air Transport Association, IATA）所出版的 Dangerous Goods Regulations（42nd. Ed：2001）。有關收集及運送結核菌檢驗痰檢體的安全裝置所包括的材料

說明如圖 1A，而檢體包裝步驟則敘述於圖 1B。基本上，首先將結核菌檢

驗檢體如痰放在 50 mL 之火箭筒狀無菌塑膠離心管，然後以小塑膠袋套

住，然後放到海綿墊的孔中（a），最多共 5 支離心管，再將海綿座置入大

型夾鏈塑膠袋（b），然後將檢驗單放在塑膠袋外套，最後將套袋連同海綿

墊一起塞入適當大小並貼有生物危險性標籤的塑膠容器中，蓋以另一海綿

墊，然後轉緊容器蓋子（c），取一個內含保麗龍之紙盒，將塑膠筒放在紙

盒的中央（d），取數個冰寶，蓋上保麗龍後將紙箱封裝（e），即可專人運

送或快捷掛號寄出。

圖 1A 收集及運送結核菌檢驗痰檢體的安全裝置：(a) 兩片海綿墊子； (b) 貼有生物

危險性標籤的圓形容器； (c) 可放置 5 支 50 mL 離心管的海綿座； (d) 用於

收集及放置病人痰檢體的 50 mL 火箭筒形離心管，收集痰後緊蓋，然後放在小

夾鏈塑膠袋中； (e) 大型夾鏈塑膠袋。

圖 1B 檢體包裝步驟： (a) 首先將放置病人痰檢體的 50 mL 火箭筒形離心管，收集痰

後緊蓋，然後放在小夾鏈塑膠袋，分別插入海綿座，最多共 5 支； (b) 將海綿

座置入大型夾鏈塑膠袋； (c) 將海綿座放入底部有一片海綿墊子並貼有生物危

險性標籤的圓形容器內，再於海綿座上方置入另一片海綿墊子，緊蓋圓形容器；

(d) 將圓形容器放到含有保麗龍的紙箱內； (e) 在圓形容器蓋子上方放置冰

寶，然後蓋上保麗龍蓋子，並將紙箱蓋子以膠帶黏貼妥當，貼上收件人地址及

單位，即可用快遞寄出。上述(d)及(e)可用如下方式取代：將圓形容器放入有背

袋的冰桶中（依冰桶的大小決定圓形容器的數目），然後在上方及桶間空隙放

置冰寶，蓋緊後運送。

1A (a) (b) (c) (d) (e) 1B (a) (b) (c)

(d) (e)

台灣面積不大，人口集中，因此，結核菌檢體之運送皆可在１∼２小

時內送達，然而，目前有些醫院之檢體外送，常以簡單的容器箱及離心管

架為之，對接觸檢體的人包括委託檢驗者、運送者、實驗室工作者等具有

很大的危險性，因此，需要大大的改進。至少每一支裝有痰檢體之個別火

箭筒離心管必須裝於緊密的塑膠袋，要運送整個離心管架時，必須外套一

個大的塑膠袋，然後在塑膠袋外貼上「感染性物質」的標誌，然後在攜送

容器箱內適當位置放置冰寶，而整個容器箱外也要貼上明顯的「感染性物

質」的標誌，除此以外，對運送者施於安全教育，而且也要經常考核評估

是否遵照感染性檢體之運送規定。除了將病人的結核菌檢驗檢體不做任何處理的情況下送檢外，亦可利

用 cetylpyridinium chloride（CPC）w/2%NaCl 去污染劑先將痰檢體處理後

再外送，此方法於檢體長時間運送過程中除了能減少檢體被污染外，並能

有效減少實驗室處理檢體的時間，為相當實用的方法。遠距離運送之痰檢體內結核菌的分離與培養 1、痰：為採得理想的痰檢體應指導受檢者，於取痰前應先以水漱口，以

減少口內的食物殘渣、漱口液、藥物等物質污染檢體或抑制結核

菌的生長。咳痰時，應用力咳出肺部深處的痰，而不是咳出唾液

或喉頭分泌物。 2、取不多於 10 mL 的痰檢體裝入 50 mL 塑膠離心管，並加入等量的

CPCw/2%NaCl 消化去污劑。蓋上蓋子，以手搖動混合至檢體液化。 3、實驗室收到檢體後，須證實確實超過 24 小時，如否，須等滿 24 小時

才進行操作。加入無菌蒸餾水稀釋至 50 mL，3000 x g 離心 15 分鐘，

離心完成後，上清液倒入含消毒劑的廢液瓶內。 4、加入 1~2 mL bovine albumin fraction V 做成懸浮液，以滴管混合沉澱

後，取三滴接種於蛋基培養基（L-J medium）。 5、將 L-J 斜面試管蓋鬆蓋並水平放置，孵育於 35~37℃培養箱。

檢體內分枝桿菌的分離與培養

第四章檢體內分枝桿菌的分離與培養

取自非無菌部位的檢體會受到生長快速的雜菌污染，所以這些檢體要

經由消化去污染處理，除去不必要的雜菌，以免影響生長緩慢的分枝桿菌

之生長。目前使用的消化去污染處理的方法，大多利用分枝桿菌對強酸或

強鹼消化劑的相對抗性除去雜菌，但是強酸或強鹼消化劑對結核菌同樣有

殺傷力，所以消化去污染的時間應該嚴格控制。同時為提高分離率，檢體

應經過離心濃縮的步驟，離心速度對結核菌的分離率影響很大，一般建議

離心速度至少要 3000 x g 以上，最好能達 3800 x g。同時因高速離心會產

生高熱，所以應用能控制溫度的離心機。所有檢體處理步驟皆應在 Class II生物安全箱內操作。一、消化去污染的方法

任何消化去污染處理方法的污染率，應不高於 5﹪或低於 3﹪。檢體過

度處理會殺死過多待分離的分枝桿菌，但若不足，則會因污染菌太多，使

生長緩慢的分枝桿菌無法長出。當污染率明顯變化時，應對整個處理流程

進行檢討，若需修正時，應先改變消化劑的濃度，而不應改變消化的時間。

分枝桿菌感染率應控制在 5﹪以下，若有長期污染率在 5﹪以上，應考慮

以下一種或多種方式改善。 1、小心增加 NaOH 的濃度，但最後濃度如達 4﹪，可能會殺死分枝桿菌。 2、增加加入抗生素的選擇性培養基。 3、污染檢體再用另一種方法作污染處理，如先用 NALC-NaOH 方法後，

再用 5﹪Oxalic acid 處理。檢驗室在操作新批號試劑時，可以選 5-6 個檢體，除了原先的培養基

外，加種血液培養皿，血液培養皿培養 48 小時後，應該接近無菌生長。常見消化去污染的方法說明如後。 1、N-Acetyl-L-Cysteine-Sodium Hydroxide （NALC-NaOH）法

本方法中，NALC 用於迅速液化痰，NaOH 用於去污染（最後濃度約

為 2﹪），trisodium citrate 用於結合檢體內可能存在的重金屬離子，防止重

金屬離子抑制 NACL 的活性，由於 NALC 於溶液狀態下會迅速失去活性，

所以本消化劑需當日操作前新鮮配製。

試劑配製： a、N-Acetyl-L--Cysteine--Sodium Hydroxide （NALC-NaOH）溶液 (a) 配製 4﹪NaOH 溶液。 (b) 配製取 2.6﹪sodium citrate anhydrate 溶液（或 2.9﹪sodium citrate

dihydrate）。 (c) 4﹪NaOH 及 2.6﹪sodium citrate 溶液等量混合，滅菌後，儲存於無菌

附蓋錐形瓶備用。 (d) 使用時加入 NALC 粉末，使其濃度為 0.5﹪，NALC-NaOH 消化去污

染劑的配製如下：

要配製的消化去污染劑量（mL）

NaOH-Na citrate （mL）

需加入的 NALC （grams）

50 50 0.25 100 100 0.50 200 200 1.00 500 500 2.50 1000 1000 5.00

(e) 所配製成的消化液應於 24小時用完，否則NALC會失去液化痰的活性。 b、0.067M，pH 6.8，磷酸鹽緩衝液儲存液： (a) 溶解 9.47 g anhydrous Na2 HPO4於 1000 mL 蒸餾水。 (b) 溶解 9.07 g KH2 PO4於 1000 mL 蒸餾水。工作液： (a) 混合（a）及（b）各 50 mL，以酸鹼測定儀測酸鹼度是否為 6.8，若需

調整可加入（a）增加酸鹼度，加入（b）降低酸鹼度。 (b) 高溫高壓滅菌。 c、Bovine albumin，0.2﹪in saline

2.0 ﹪儲存液：溶解 0.85 g NaCl 於 100 mL蒸餾水，加 2 g bovine albumin

fraction V，溫和混合，以 4﹪NaOH 調整至 pH 6.8，以

薄膜過濾法滅菌。 0.2 ﹪工作液：取上述溶液加無菌生理食鹽水 1：10 稀釋即可。

痰檢體的處理 a、取少於 10 mL 痰檢體裝入 50 mL 塑膠離心管，加入等量 NALC-NaOH

消化液。 b、蓋緊蓋子 c、以 Vortex mixer 混合至液化，但應注意不要讓液體碰到瓶蓋，混合時並

使離心管內壁經 NALC-NaOH 消化液潤濕（避免劇烈搖動，混合時間

不可超過 30 秒，以免 NALC 氧化或失去活性）。 d、靜置於室溫 15 分鐘進行去污染。 e、加入無菌磷酸鹽緩衝液稀釋至 50 mL。 f、蓋緊蓋子，上下均勻混合。 g、3000 x g，離心，15 分鐘。 h、離心完成後，上清液倒入含消毒劑的防濺（splash proof）廢液瓶內，再

以沾有消毒劑的紗布消毒離心管管口，再蓋上蓋子，但要注意消毒劑不

可進入試管內。廢液瓶可取三角錐瓶，加入消毒液，再放上一個漏斗。

使用完後蓋上沾有消毒劑的棉紗布後滅菌。 i、將沉澱檢體輕微混合成懸浮液。 j、懸浮液接種適當的培養基。 k、取一滴懸浮液作成 1 ×2 cm 範圍抹片，空氣乾燥後，以 65-75 ℃加熱器

固定或火燄固定後染色鏡檢。 l、將剩餘的未稀釋懸浮液冷藏保存，以備進行直接藥物感受性試驗。尿檢體的處理 a、將所有檢體倒入 50 mL 離心管，3000 x g 離心 30 分鐘。 b、將上清液倒入含消毒劑的防濺廢液瓶內，將多個離心管的沉澱物集於

一管。 c、以下步驟同痰檢體處理。

2、Sodium Hydroxide （NaOH）法 NaOH 對非抗酸菌污染菌及結核菌均有毒性，所以進行本方法時需特

別注意消化處理的時間，使用的 NaOH 溶液濃度約 2﹪至 4﹪，選用濃度

以能有效將檢體消化去污染為原則。試劑配製 a、NaOH 溶液

將適量 NaOH 溶解於適量蒸餾水中（如 2 ﹪=2 g/100 mL，4﹪=4 g/400 mL），高壓蒸氣滅菌後備用。

b、2N HCL 溶液取 33 mL 濃 HCL 以蒸餾水稀釋至 200 mL（將 HCl 加入水中，不

可將水加入 HCl 中），高壓蒸氣滅菌後備用。 c、Phenol red 指示劑

溶解 8 mg phenol red 粉末於 20 mL 4﹪NaOH，加蒸餾水 1000 mL，高壓蒸氣滅菌後備用。

痰檢體的處理 a、取不多於 10 mL 的痰檢體裝入 50 mL 的塑膠離心管，並加入等量 NaOH

溶液。 b、蓋緊蓋子，以 Vortex mixer 混合，但應注意不要讓液體碰到瓶蓋，靜置

15 分鐘。 c、加入無菌蒸餾水或磷酸鹽緩衝液到 50 mL 標記。 d、 3000 x g，離心，15 分鐘。 e、離心完成後，上清液倒入含消毒劑的防濺廢液瓶內，再以沾有消毒劑

的紗布消毒離心管管口，但要注意消毒劑不可進入試管內。 f、沉澱物加入一滴 phenol red 指示劑，逐滴加入 2N HCL 溶液至指示劑由

紅色變成持續性黃色。 g、蓋上蓋子，將沉澱檢體輕微混合成懸浮液。 h、懸浮液接種適當的培養基。 i、取一滴懸浮液作成 1 ×2 cm 範圍抹片，空氣乾燥後，以 65-75 ℃加熱

器固定或火燄固定後染色鏡檢。 j、將剩餘的未稀釋懸浮液冷藏保存，以備進行直接藥物感受性試驗。

3、 Oxalic Acid 法本方法特別適用於受 Pseudomonas species 污染的檢體。試劑配製 a、5﹪Oxalic Acid 溶液溶解 5 g oxalic acid 於 100 mL 蒸餾水，高壓蒸氣滅菌後備用。 b、4﹪NaOH 溶液溶解 4 g NaOH 於 100 mL 蒸餾水，高壓蒸氣滅菌後備用。 c、85﹪生理食鹽水溶解 0.85 g NaCl 於 100 mL 蒸餾水，高壓蒸氣滅菌後備用。 d、Phenol red 指示劑溶解 8 mg phenol red 粉末於 20 mL 4﹪NaOH，加蒸餾水至 1000 mL 高

壓蒸氣滅菌後備用。痰檢體的處理 a、取不多於 10 mL 的痰檢體裝入 50 mL 的塑膠離心管，並加入等量 5﹪

oxalic acid 溶液。 b、蓋上蓋子，以 Vortex mixer 搖動混合後，靜置 30 分鐘，並偶而搖動之，

但在開蓋前應至少靜置 15 分。 c、加入無菌生理食鹽水稀釋至 50 mL。 d、 3000 x g，離心，15 分鐘。 e、離心完成後，上清液倒入含消毒劑的防濺廢液瓶內，再以沾有消毒劑

的紗布消毒離心管管口，再蓋上蓋子，但要注意消毒劑不可進入試管

內。 f、沉澱物加入一滴 phenol red 指示劑，以 NaOH 溶液中和至酚紅指示劑變

成持續性粉紅色。 g、將沉澱檢體輕微混合成懸浮液。 h、懸浮液接種適當的培養基。 i、取一滴懸浮液作成 1 ×2 cm 範圍抹片，空氣乾燥後，以 65-75 ℃加熱

器固定或火燄固定後染色鏡檢。 j、將剩餘的未稀釋懸浮液冷藏保存，以備進行直接藥物感受性試驗。

4、Sulfuric Acid 法本方法適用無法以鹼性消毒劑去污染的尿檢體或水樣體液檢體。試劑配製 a、4﹪Sulfuric Acid 溶液

將 40 mL 濃硫酸緩慢加入 960 mL 蒸餾水中，高壓蒸氣滅菌後儲存於 4℃備用。

b、4﹪NaOH 於 100 mL 蒸餾水，高壓蒸氣滅菌後備用。 c、無菌蒸餾水。 d、Phenol red 指示劑

溶解8 mg phenol red粉末於20 mL 4﹪NaOH加蒸餾水至1000 mL。尿檢體的處理 a、將所有檢體裝入離心管，3000 x g，離心，30 分鐘。 b、上清液倒入含消毒劑的廢液瓶內，將多個離心管的沉澱物集於一管。 c、加入等量 4﹪硫酸溶液。 d、蓋上蓋子，均勻混合後，靜置於室溫 15 分鐘。 e、加入無菌蒸餾水稀釋至 50 mL。 f、 3000 x g，離心，15 分鐘。 g、離心完成後，上清液倒入含消毒劑的防濺廢液瓶內，再以沾有消毒劑

的紗布消毒離心管管口，但要注意消毒劑不可進入試管內。 h、沉澱物加入一滴 phenol red 指示劑，以 NaOH 溶液中和至酚紅指示劑變

成持續性粉紅色。 i、將沉澱檢體輕微混合成懸浮液。 j、懸浮液接種適當的培養基。 k、取一滴懸浮液作成 1 ×2 cm 範圍抹片，抹片以 65-75℃加熱器固定，固

定後染色鏡檢。 l、將剩餘的未稀釋懸浮液冷藏保存，以備進行直接藥物感受性試驗。

5、Cetylpyridinium Chloride-Sodium Chloride (CPC)法本方法可用於檢體外送時痰檢體的消化去污染處理。實驗室收到檢體

後，只需離心取沉澱物即可直接接種於培養基。CPC 為一季銨化合物用於

檢體的去污染，NaCl 則用於液化檢體。由於經 CPC 處理的檢體接種於瓊

脂基培養基（7H11 agar）時，CPC 仍會繼續抑制分枝桿菌的生長，此作

用於消化去污染過程中無法去除，所以利用本方法處理的檢體只能接種於

蛋基培養基（L-J medium），雖然本方法相當方便，但是需要較長的去污染

時間，所以適用於需將檢體外送，且運送所須時間超過 24 小時的情況。試劑配製 a、CPC 消化去污染劑

取 10 g CPC 及 20 g NaCl 溶解於 1000 mL 蒸餾水，本溶液具自我

滅菌能力，儲存時應避免光線照射、溫度過高、蒸發等，使用時若有

結晶產生可稍加熱溶解即可。 b、Bovine albumin, 0.2% in saline 2.0 % 儲存液：溶解 0.85 g NaCl 於 100 mL 蒸餾水，加 2 g bovine

albumin fraction V，溫和混合, 以 4 % NaOH 調整至 pH 6.8，以薄膜過濾法滅菌。

0.2 % 工作液：取上述溶液加生理食鹽水 1:10 稀釋即可。檢體的處理 a、取不多於 10 mL 的痰檢體裝入 50 mL 塑膠離心管，並加入等量 CPC 消

化去污染劑。 b、蓋上蓋子，以手搖動混合至檢體液化(應於 BSC 內操作)。 c、將檢體適當包裝後送實驗室，於運送途中即進行去污染作用。 d、實驗室收到體檢體後，加入無菌蒸餾水稀釋至 50mL。 e、 3000 x g，離心，15 分鐘。 f、離心完成後，上清液倒入含消毒劑的廢液瓶內，加入 1-2 mL 無菌蒸餾

水作成懸浮液(或 1-2 mL bovine albumin fraction V)。 g、以滴管混和沉澱後，取三滴接種於蛋基培養基。 h、取剩餘懸浮液於玻片上製成約 1-2 cm 範圍的塗片，經空氣中乾燥後，

以 65-75℃加熱器固定或火燄固定，染色後鏡檢。二、其他檢體之處理胃液檢體的處理：採得的胃液應於 4 小時內處理完畢，或加入 100 mg 碳酸鈉保存。 a、若檢體成黏液狀，每 50 mL 檢體加入約 50-100 mg NALC 粉末後，以

Vortex mixer 混合 30 秒。若檢體成水樣，直接進入以下步驟。 b、 3000 x g，離心，15 分鐘。 c、離心完成後，上清液倒入含消毒劑的防濺廢液瓶內，再以沾有消毒劑

的紗布消毒離心管管口，但要注意消毒劑不可進入試管內，加入 2-5 mL無菌蒸餾水，蓋上蓋子，輕搖作成懸浮液。

d、懸浮液加入等量 NALC-NaOH 溶液，以下如痰檢體的處理。組織檢體的處理 a、將組織檢體移入無菌組織研磨器，加入適量(檢體 10 倍)無菌生理食鹽

水或 0.2﹪bovine albumin 溶液或 Middlebrook 7H9 液體培養基，均勻研

磨使組織均質化，若組織檢體含黏液質，可加入一匙 NALC 均勻研磨

使組織均質化。 b、若組織檢體為經無菌技術採得，可將經均質化的檢體直接種入 MGIT

液體培養基及 L-J 斜面或 Middlebrook 瓊脂平板培養基。 c、若組織檢體已知有污染，則均質化組織比照痰檢體作去污染處理。 d、若是無法確定檢體是否無菌，則可將部份均質化的檢體接種液體培養

基及血液培養平板，其餘檢體置 4℃冰箱保存。液體培養基及血液培養

平板培養於 37℃溫箱，每天觀察生長情形，連續觀察 5 天，若染色發

現污染，則將剩餘的檢體依照痰檢體作去污染處理。血液檢體的處理 a、建議採用自動血液培養系統，包括 BACTEC Myco/F lytic 培養瓶，ESP

Myco 培養瓶或 MB/BacT ALERT 3D 培養瓶，依照原廠建議的方式執

行。 b、若機器顯示培養陽性，必須作抹片染色檢查，發現抗酸菌，將培養液

再接種於 L-J 斜面或 Middlebrook 瓊脂平板培養基。其他體液檢體的處理 a、黏稠狀體液

(a)若檢體量少於 10 mL，如痰檢體的處理。 (b)若檢體量多於 10 mL，如胃液檢體的處理。

b、液狀體液 (a)若檢體為經無菌技術採得，檢體離心後（3000 x g，15 分鐘），沉澱

物直接種入 MGIT 液體培養基及 L-J 斜面或 Middlebrook 瓊脂平板培

養基。 (b)若檢體為未經無菌技術採得，檢體量少於 10 mL，操作如痰檢體的

處理。檢體量多於 10 mL 時，如胃液的檢體處理。三、培養基的製備要診斷是否為分枝桿菌感染，需培養分離出致病菌，並配合各項鑑定

試驗才能確認。可用於培養分枝桿菌的培養基種類很多，約可分成蛋基培

養基及瓊脂基培養基兩大類。 1、蛋基培養基及瓊脂基培養基的優缺點比較：

蛋基培養基的優點 a、若保持不蒸發乾化，能冷藏儲存數個月之久。 b、由於製備時經蒸厚過程，所以較不易被污染。 c、大多數分枝桿菌都能生長良好。有些結核菌在此培養基比瓊脂培養

基生長較好。蛋基培養基的缺點當被污染時，整個培養基會全被污染。

瓊脂培養基的優點 a、由於組成成分簡單，污染菌不易生長所以不易被污染。 b、培養基呈透明，若使用實體顯微鏡能及早觀察出菌落之生長情形及

形態。 c、製備時不經過蒸厚過程，所以用於藥物感受性試驗時，藥物之最後

濃度能準確控制。

d、若培養於 10﹪CO2，35-37℃培養箱約 2-3 週即能長出菌落。瓊脂培養基的缺點 a、由於製成平板培養基，長時間儲存或孵育時容易乾化，需利用塑膠袋防

止溼度散失。 b、受陽光照射時產生甲醛氣體會抑制菌的生長。 c、加入 0.1﹪L-aspartic acid 能促進結核菌產生 niacin，但用於藥物感受性

試驗時會影響某些藥物的活性。 d、製備過程中，加入滋養劑（OADC）時需特別小心，否則容易造成污染。

市售的結核菌培養基大多為成品或只需簡單製備即成。使用成品時應

利用已知生長特性的標準菌株檢查其品質。 2、蛋基培養基的製備

最常用的分枝桿菌培養基為改良式 Lowenstein-Jensen（L-J）斜面。含

抗生素的選擇性培養基如 L-J-Gruft（含 penicillin，nalidixic acid），此類培

養基主要目的為防止污染菌的過度生長，由於較昂貴只用於特定情況，同

時應併用不含抗生素的培養基，常見的培養基製備方法如下：改良式 Lowenstein-Jensen 蛋基培養基 a、將還不超過一星期的新鮮雞蛋以肥皂水先用手刷洗清潔，在浸泡於肥

皂水中 30 分鐘後，以清水沖洗，最後以 70﹪酒精浸泡 15 分鐘，於打

蛋前先將手刷洗乾淨，再將蛋打入無菌錐形瓶，以手輕搖錐形瓶均勻

混合蛋液，以四層無菌紗布將蛋液過濾入量筒。 b、將下列成分依序加入以配製鹽溶液

Monopotassium phosphate（anhydrous）……………………… 2 . 4 g Magnesium sulfate.7H2O………………………………………… 0 . 2 4 g Magnesium citrate…………………………….…………….......... 0 . 6 g Asparagine…………………………………….………………… 3 . 6 g Glycerol（reagent grade）…………………….……………........ 12.0 mL Distilled water………………………………...…………………. 600.0 mL

c、加入 potato flour 30.0g 到鹽溶液

d、高壓蒸氣滅菌 121℃，30 分鐘。 e、冷卻至室溫。 f、加入 malachite green（新鮮配製的 2﹪水溶液）20 mL。 g、加入全蛋液 1000 mL。

上述（a-g）步驟可利用市售粉末狀 L-J 培養基基劑，依其說明取

適量溶解於蒸餾水中，加適量甘油後，高壓蒸氣滅菌，冷卻至室溫，

加入全蛋液。 h、均勻混合後加入分裝器。 i、將約 6-8 mL 培養基分裝入 20 × 150 mm 無菌附蓋試管。 j、將試管斜置，約 85℃，50 分鐘蒸厚。 k、孵育於 37℃，48 小時後檢查是否滅菌完全。若蓋緊蓋子防止蒸發可冷

藏保存數月。 3、瓊脂培養基的製備

最常見的瓊脂培養基為 Middlebrook 7H10、7H11。 7H11 為 7H10 加

入酪蛋白（emzymatic digest casein）作為滋養劑，使分枝桿菌能更茂盛生

長，但是用於藥物感受性試驗時，有些藥物的最低抑菌濃度會受影響，所

以用不同培養基時應注意藥物濃度。 7H10 瓊脂培養基 Middlebrook 7H10 瓊脂培養基為以 7H10 粉狀基劑及 Middlebrook OADC (Oleic Acid-Albumin-Dextrose-Catalase）滋養劑配製而成。製備時以

少量為宜（200-400 mL），以減少溶解瓊脂所需的加熱。於高壓蒸氣滅菌前

不可將培養基基劑預先加熱溶解，因為雙重加熱將造成培養基品質不良。依下列步驟製備 200 mL 的 7H10 培養基 a、取 3.6 g Middlebrook 7H10 基劑及 1 mL glycerol 加入裝妥 180 mL 新鮮

蒸餾水的容器。 b、均勻混合成懸浮液，於 121℃，15 分鐘高壓蒸氣滅菌。 c、滅菌完成後儘速取出，隨即放入 50-56℃ 水浴，此時培養基應為澄清

透明。 d、於冷卻至 50-56℃ 時，儘速加入預溫至室溫的 OADC 20 mL。

註：用於藥物感受性試驗者，於冷卻至 50-52℃ 時加入適量藥物溶液。 e、於一小時內分裝完成以避免產生沉澱。 g、分裝完成後，避免日光照射，室溫固化。 7H11 瓊脂培養基依下列步驟製備 200 mL 的 7H11 培養基 a、取 3.78 g Middlebrook 7H11 基劑及 1 mL glycerol 加入裝妥 180 mL 新鮮

蒸餾水的容器。 b、均勻混合成懸浮液後，於 121℃，15 分鐘高壓蒸氣滅菌。 c、滅菌完成後儘速取出，隨即放入 50-56℃ 水浴，此時培養基應為澄清

透明。 d、於冷卻至 50-52℃ 時，儘速加入預溫至室溫的 OADC 20 mL。 e、於一小時內分裝完成以避免產生沉澱。 f、分裝完成後，避免日光照射，室溫固化。選擇性 7H10 或 7H11 培養基

7H10 或 7H11 培養基尚未固化時加入抗生素即成選擇性培養基，使用

的藥物及濃度如下：藥物最終濃度

a、Polymyxin 200 units/mL

b、Amphotericin B 200 units/mL c、Carbenicillin 50 μg/mL d、Trimethoprim 20 μg/mL

4、含有 Heme 的培養基由於 M. haemophilum 必須在含有 heme、hemoglobin 或 ferric ammonia citrate 的培養基才能生長，所以如果懷疑 M. haemophilum 造成的感染，如

皮膚、關節液及骨骼檢體應加種 chocolate 培養基，及添加 hemin 的

Middlebrook 7H10 或添加 1% ferric ammonia citrate 的 L－J 斜面。 5、液體培養基液體培養基可用在初步分離結核菌、次培養菌株及準備藥物感受性試

驗。在初步分離結核菌可以比固體培養基較早有培養陽性結果。一般分離

結核菌常用的液體培養基有 Middlebrook 7H9 及 Dubo Tween albimin 。目

前很多商品化分離結核菌的系統多是採用 Middlebrook 7H9 液體培養基，

如 BACTEC MGIT 960 ( Becton Dikinson)，BACTEC 9000 MB (Becton Dikinson) ，MB/BacT ALERT 3D(bioMerieux) 及 ESP culture system(Trek Diagnostic system)。 6、培養基的儲存

a、所有培養基均應防止光線直接照射。 b、將平板培養基以乾淨塑膠袋或無菌乾燥容器保存。 c、試管培養基儲存時應將蓋子蓋緊。 d、將所有培養基冷藏以防止蒸發脫水。 e、丟棄被污染或脫水的培養基。

7、培養基之選擇

理想的分枝桿菌培養基應符合下列需求（1）能使很少量的分枝桿菌

迅速的長出茂盛的菌落，（2）能初步區分菌落的顏色及型態，（3）能抑制

污染菌的生長，（4）便宜、易於製備，（5）可用於藥敏試驗。由於目前使

用單一的培養基無法完全符合上列需求，同時有些分枝桿菌只能生長在特

定培養基，所以培養分枝桿菌時，應同時使用蛋基培養基及瓊脂基培養

基。商品化液體培養基由於可以較早分離出分枝桿菌，所以一般建議最好

是選擇液體培養基再加上 LJ 斜面，但也可以用 L-J 斜面加 Middlebrook 瓊

脂平板培養基。L-J 斜面及 Middlebrook 瓊脂平板培養基應分別接種 0.1 mL處理後之檢體懸浮液，MGIT 液體培養管應接種 0.5 mL 處理後之檢體懸浮

液。若懷疑 M . haemophilum 感染時，應增加一片 chocolate 培養基或添加

heme 的瓊脂培養基。四、適當培養生長的要件自經消化去污染處理之檢體培養分枝桿菌時，應注意（1）不同菌種，

甚至不同菌株的分枝桿菌生長時會有不同的需求條件，（2）於檢體內分枝

桿菌可能會成團或不均勻分布，（3）消化去污染處理對分枝桿菌亦有毒性

作用，（4）檢體本身或其內含物可能對分枝桿菌具有毒性作用，所以進行

分枝桿菌培養時應注意所有相關步驟方能得到最滿意的結果。 1、培養基的孵育試管培養基（如 L-J）培養時應斜置約 30 度，讓檢體與斜面表面充分

接觸，並將蓋子鬆蓋至少一天以上，第二天再蓋緊以防止培養基蒸發乾

化，然後將試管培養基直放。平板固體培養基裝入能透過二氧化碳的塑膠

袋，封好，平板培養基培養時應使培養基平放，以防止接種液未完全被吸

收而漏出，經包裝的培養基於放置時不可堆疊超過六個以上，以防傾倒。所有培養基於接種 5-7 天後，應檢查是否有快速生長的分枝桿菌菌落

長出或除去被污染的培養基，然後每週觀察 1-2 次是否有菌落，至第八週

若未長出菌落即為陰性。雖然少數分枝桿菌可能於十至十二週會長出菌

落，此種情況一般可經再次採檢培養檢查出來，所以延長孵育時間是不必

要的。 2、孵育的大氣環境二氧化碳培養箱能促進結核菌及早長出菌落，所以初次分離所接種的

培養基均應孵育於 10﹪二氧化碳環境中。若可能應至少在 10﹪二氧化碳

35-37℃培養箱培養 4 週。培養箱內二氧化碳的濃度應每日監測。有時因

溫度上的特殊需求（如 23-33℃，40-42℃）可利用不通透二氧化碳的 Mylar塑膠袋定期更換容器內二氧化碳等方式，作為代用二氧化碳培養箱。 3、孵育的溫度一般分枝桿菌最適合的孵育溫度為 35-37℃。但是若為皮膚或表淺病

灶檢體而懷疑有 M.marinum、M.ulcerans 及 M.haemophilum 等菌感染時，

應加種一組培養基孵育於 25-33℃環境。 4、注意事項

要在培養基上得到最大量生長菌落，一定要精確地進行去污染步驟，

離心不足或消化去污染時間過長，都會造成檢體內分枝桿菌的損失，影響

爾後培養的結果。為減少污染應注意：

a、每次蓋離心管或蛋基培養基瓶蓋子前，先用適當的消毒劑擦拭瓶

口，蓋後再擦拭管壁。 b、每個培養皿都應用可通氣的塑膠袋密封。 c、平板培養基培養時經常會產生潮氣，干擾分枝桿菌生長及造成污

染，可利用下列方法防止：（a）於接種前先將冷藏的培養基置室溫中回溫，不要將接種液接

種於潮濕的培養基。（b）先讓接種液蒸發或被培養基吸收後再以塑膠袋密封。（c）不要將培養基放在培養箱近門處，以防止由於開門造成氣溫

變化產生潮氣堆積。（d）若檢查判讀結果時，培養基邊緣有潮氣產生可利用電熱墊加

熱培養基邊緣除去。五、抗酸菌的鏡檢

顯微鏡鏡檢是實驗室能最早且最快發現抗酸菌的方法，但研究指出每

mL 中約需有 5000-10000 隻抗酸菌才能由染色的抹片鏡檢察出。相對的，

每 mL 檢體中只需 10-100 隻活抗酸菌，即能經由培養發現抗酸菌。雖然顯

微鏡鏡檢的敏感度比培養差，但是仍有許多用途，如（1）能迅速確認是

否被感染，提供作為初步診斷結核菌感染的參考，（2）能監測病人接受化

學治療進行的狀況，（3）於確認培養出的菌落為分枝桿菌，（6）可作為直

接藥物感受性試驗時稀釋倍數的參考。 1、一般建議及注意事項顯微鏡鏡檢時應使用乾淨無刮痕的新玻片，因為舊玻片可能會造成偽

陽性。於玻片一端應註明受檢者姓名、病歷號、日期等資料。製作抹片時，

可將檢體塗成約 1 × 2 cm 範圍，全部抹片約 100-300 個視野，若所塗佈

的範圍過大，將會減低檢視的效率。製作好的抹片可利用玻片加熱器 65-75℃加熱兩小時以上。加熱固定並不一定能殺死分枝桿菌，所以處理時應特

別小心，建議使用 UV 燈照射滅菌一小時以上再染色。抹片丟棄前應先經

消毒劑消毒再高壓蒸氣滅菌或浸泡 3﹪amyphyl 隔夜。

為減少抹片品質不良，偽陽性或偽陰性等情形發生應注意下列事項： a、避免酸性酒精脫色不完全

大部份結核菌為強抗酸菌不容易被脫色，若酸性酒精脫色不完全

會造成偽陽性。抹片太厚不易脫色時，加上背景染色容易掩蓋抗酸菌

造成偽陰性。 b、使用對比性的背景染色。

使用背景染色時其強度不應過強，以避免影響觀察抗酸菌造成偽

陰性，若鏡檢者辨色力不佳時，可利用螢光染色法以利鏡檢。 c、注意可能造成偽陽性的污染源。

一些環境存在的分枝桿菌會造成偽陽性，如下過大雨後，自來水

中有時會有分枝桿菌的存在，未經常清潔的蒸餾水儲水槽、製冰機，

因使用自來水亦可能有分枝桿菌的存在。當同時進行大量抹片染色

時，由於玻片上檢體的彼此污染可能造成偽陽性。進行大量染色時應

小心分開各抹片，顯微鏡鏡檢時，若前一玻片含很多結核菌可能經由

油鏡油造成下一玻片的污染，此時應將油鏡擦拭乾淨再進行觀察。 2、抹片的製備

直接抹片法由於陽性率低，所以不建議使用。但如果一定要作製備抹

片時，應選擇檢體內成乳酪狀、壞死組織或含血絲的部分製成直接抹片較

易得到陽性結果。製備濃縮抹片的方法很多，檢體經各種消化去污染處理後，先將得到

的沉澱物接種於培養基，剩餘的部分即可用於製備濃縮抹片。若檢體只用

於製備濃縮抹片，可利用次氯酸（sodium hypochloride）濃縮法以減低操作

者被感染的危險性。由於漂白水或 5﹪-6﹪次氯酸溶液能殺死大多微生物

及檢體內的結核菌，所以利用本方法作檢體的處理可不在生物安全櫃內操

作，但若處理時間超過 15 分鐘以上時會造成抗酸菌分解，所以檢體處理

時應注意時間不可過長。 Sodium Hypochloride 濃縮法 a、取不多於 10 mL 的痰檢體裝入 50 mL 塑膠離心管，並加入等量漂白水

Clorox 或 5﹪NaOCl。

b、蓋上蓋子，以手搖動混合至檢體液化。 c、靜置於室溫 15 分鐘。 d、加入無菌蒸餾水稀釋至 50 mL。 e、 3000 x g，離心，15 分鐘。 f、離心完成後，上清液倒入含消毒劑的廢液瓶內，加入數滴蒸餾水作成

懸浮液。 g、取一滴稀釋懸浮液於玻片上製成 1 × 2 cm 範圍的抹片，經空氣中乾

燥後，以 65-75℃加熱器固定，染色後鏡檢。 3、染色法

抗酸菌染色可分利用鹼性複紅染劑及螢光染劑兩大類。（1）Ziehl-Neelsen 染色法

為正統 carbolfuchsin 染色，需要於玻片下加熱使染色劑溶液透到

結核菌細胞壁內，又稱為熱染法。至少要觀察 300 個視野，都不見抗

酸菌，才能報告為陰性反應。抗酸菌細胞壁中 mycolic acid 和 waxes與 carbolfuchsin 結合成複合物，即使使用酸性酒精亦不會脫色。 a、抹片染色前必須於 80℃加熱 15 分鐘，使之固定。 b、覆蓋 carbolfuchsin 染色劑（0.3 g basic fuchsin 溶於 10 mL95﹪

ethanol，再加入 5 mL phenol 和 95 mL H2O，使用前，染色劑必須

過濾）於抹片上。 c、使用酒精燈的火焰於抹片下，緩慢移動加熱一分鐘，可使玻片上的

染色液冒出少許蒸氣，但不可沸騰或者乾掉。 d、讓染色液停留玻片上 5 分鐘，不必再加熱。 e、使用酸性酒精（97 mL 95﹪ethanol 加入 3 mL HCl）於抹片上脫色 3

分鐘。 f、以水沖洗，傾斜玻片，使滴乾。 g、覆蓋甲基藍染色液（0.3 g methylene blue 溶液 100 mL H2O）於抹片

上一分鐘。 h、再以水沖洗、晾乾。 i、以油鏡（1000 倍）觀察紅色的抗酸菌，背景或其他細菌是藍色。 j、必要時，做陽性和陰性對照組染色。

（2）Kinyoun 染色法

試劑配製 a、複紅（Fuchsin）溶液

溶解 4 g basic fuchsin 於 20 mL 95﹪乙醇。 b、Phenol 溶液

溶解 8 g phenol 於 100 mL 蒸餾水（若不溶解可稍加熱）。 c、石碳酸複紅（Carbolfuchsin）溶液

取（a）+（b）均勻混合。 d、酸性酒精液

取 3 mL 濃 HCl 加入 97 mL 95﹪乙醇，均勻混合。 e、Methylene blue 溶液

溶解 0.3 g methylene blue 於 100 mL 蒸餾水。抹片的染色

a、依前述方法製備抹片。 b、加入石碳酸複紅染液覆蓋整個玻片，靜置兩分鐘。 c、以水沖洗抹片。 d、加入酸性酒精脫色到沒有顏色。 e、以水沖洗抹片後吸乾。 f、加入甲基藍溶液覆蓋整個抹片一分鐘。 g、以水沖洗抹片後吸乾，至於空氣中乾燥（不可用吹風機吹乾）。 h、顯微鏡油鏡（1000 倍）鏡檢。結核菌為紅色，背景為藍色。 Ziehl-Neelsen 法之 Carbolfuchsin 濃度較低，需加熱較麻煩，但放久較

不會褪色。Kinyoun 法則複紅濃度較高，不必加熱，較方便，但可能較會

褪色。國際抗癆聯盟專家，較推薦 Ziehl-Neelsen 法。（3）螢光抗酸菌染色

螢光染色法於顯微鏡鏡檢時容易觀察且敏感度較好，近來使用者有增

加的趨勢，因為螢光染色的抹片一般於 250 倍至 450 倍鏡檢，而複紅染色

的抹片則於 800 倍至 1000 倍鏡檢。由於顯微鏡使用的倍數不同，鏡檢時，

相同時間內螢光鏡檢染色抹片的視野較複紅染色抹片廣（約 4-10 倍），所

以螢光染色敏感度較好，此外螢光染色法將抗酸菌於黑色或暗紅色背景下

染成具黃色光的菌體，而複紅染色將抗酸菌於藍色背景下染成紅色菌體，

顯然螢光染色法較易於觀察。螢光染色的抹片應於 24 小時內鏡檢，否則

螢光可能會消失。雖然將經染色的抹片於 5℃隔夜保存可減少螢光的消

失，但是最好能於 24 小時內完成鏡檢時才染色抹片。試劑配製

a、螢光染色液 Auramin O 溶液 1：取 0.1g auramin O 溶解於 10 mL 95﹪乙醇。

溶液 2：製作 Phenol 溶液：取 3.0 g phenol crystal 溶解於 87 mL 蒸餾

水。溶液 1 與溶液 2 混合，儲於棕色瓶。

b、螢光染色液 Auramine O-Rodamine B-Phenol 溶液 1：取 1.5 g auramine O，0.75 g rodammine B 溶解於 75 mL

glycerol。溶液 2：取 10 mL phenol 溶液加入 50 mL 蒸餾水的溶液。溶液 1 與溶液 2 混合均勻，用磁棒混合 24 小時，經玻璃絨（glass wool）過濾。

c、酸性酒精取 0.5 mL 濃 HCl 加入 100 mL 70﹪乙醇中。

d、高錳酸鉀溶液取 0.5 g KMnO4 溶解於 100 mL 蒸餾水。

e、Acridine orange 取 0.01 g anhydrous dibasic sodium phosphate 溶解於 100 mL 蒸餾水，

在加入 0.01 g acridine orange 溶解之。抹片的染色

a、依前述方法製備抹片。 b、加入螢光染劑(auramine O 或 auramine O - rodamine B-phenol)，覆蓋整

個抹片，靜置 15 分鐘。（不必加濾紙片，不必加熱）。 c、以蒸餾水或去離子水沖洗（所用的水不可含氯，因為氯會干擾螢光的

產生）。 d、加入酸性酒精覆蓋整個抹片脫色約兩分鐘。 e、以水沖洗抹片後吸乾。 f、加入複染溶液(高錳酸鉀溶液或 acridine orange 溶液)，覆蓋整個抹片

複染約兩分鐘。時間不能過長，否則螢光會消失。 g、以水沖洗抹片後吸乾，置於空氣中乾燥。 h、儘速以螢光顯微鏡鏡檢。Auramine O 染色結核菌為金黃色。Auramine

O-rodamine B-phenol 染色結核菌為橘紅色。高錳酸鉀溶液複染背景為

黑色，acridine orange 溶液複染背景成暗橘色。 4、抹片的鏡檢

從事抹片的鏡檢要有好的顯微鏡及舒適的工作環境，鏡檢抹片區應全

片檢視，觀察時一個視野接一個視野左右三次來回或上下九次來回，如此

約能觀察三百個視野，若抹片為中度或強度陽性，觀察數個視野即可發出

陽性報告。檢體內的抗酸菌一般成桿狀，1-10μm 長，0.2-0.6μm 寬，但有時會

成球狀或絲狀（長、細長或分枝），菌體常呈略彎曲狀，有濃染的帶狀區。

有時採取長有 M.tuberculosis 菌落的 L-J 培養基底部的混濁液體作成的抹

片，菌體會相連形成「索」狀（cord formation）。由純培養作成的抹片可發

現並非所有的抗酸菌均為分枝桿菌，所以鏡檢時亦應觀察菌體的型態及大

小，有些其他微生物如 Nocardia，Corynebacterium 亦為抗酸菌。組織或培

養基碎片也可能會產生螢光而被誤認為抗酸菌，唯有經由經常的抹片觀察

才能熟練的區分出何者為分枝桿菌，經螢光染色的抹片，可直接用鹼性複

紅染劑染色確認，但經複紅染色的玻片，則不能再用於螢光染色。 5、抹片結果的報告抹片的結果應予量化才有意義，複紅染色抹片報告可利用下列方式發

報告：

＊複紅染色抹片的報告方法油鏡視野下觀察到的抗酸菌數報告結果

None No AFB observed 1-2/300 fields* +/- 1-9/100 fields 1+

1-9/10 fields 2+ 1-9/ fields 3+ > 9/ fields 4+

*若鏡檢時為<3/300 fields 抹片應重檢或製作新抹片以確認是否為陽性。使用螢光染色法時，抹片於較低放大倍數鏡檢，所以每一視野觀察到

的範圍較大，報告結果時應避免與一般複紅染色法混淆。其換算方式見表

一。表一複紅染色法與螢光染色法鏡檢結果的比較

螢光染色法各視野觀察的平均值複紅染色法（1000 倍）

250X k/k* RWS*

450X k/k* RWS*

報告方式

0 1-2/300F

1-9/100F

1-9/10F

0 0 1-2/30F 1-9/10F 1-9/1F 10-90/F >90/F

0 0 1-2/70F 2-18/50F 4-36/10F 4-36/F >36/F

NO AFB 重檢

*K/K：Kent/Kubica 法，RWS：R.W.Smithwick 法。 *以抹片 2 × 1 cm 範圍為準，觀察時，複紅染色法左右三次來回觀察；

螢光染色法 250 倍左右一次來回觀察，450 倍左右一次半來回觀察。

觀察的平均菌數除十

發出抹片報告時，應注意註明使用的染色法及所觀察到抹片的抗酸菌

數，只需觀察足以計算出抹片平均菌數的視野即可，計算菌數時一團菌體

或一隻菌體都是以一個菌體計算，因為都只能在培養基上長出一個菌落，

有成團菌體時應註明，因為會影響真正菌體計算，若鏡檢時為＜3/ 300 視

野，則抹片應重檢或製作新抹片重檢，以確認是否陽性。 6、偽陽性抹片的來源

當抹片陽性，但培養陰性之檢體增加時（＞2﹪，不包括因治療有效

者），應懷疑是否染色過程受到抗酸菌的污染。一般而言，自污染源能找

到的抗酸菌微生物量很少，除非用薄膜過濾法或高速離心才能找到。若是

沒有這些設備，可利用加入「絮狀介質」（flocculating medium）使水中的

污染抗酸菌能離心沉澱出來，念珠菌（Candida spp.）即為一種相當適用的

材料；試驗時，將念珠菌加入待檢的溶液內作成 106cell/mL 的懸浮液，再

3000 x g，離心 15 分鐘，倒去上清液，然後取沉澱物製成抹片檢查，除了

使用水的污染外，消化或染色的過程中所有可能用到的試劑，如消化液、

緩衝液、稀釋液、染液等，亦應檢查是否被分枝桿菌污染。抗酸菌染色應

定期作品管，複紅抗酸染色應每週至少作一次陽性及陰性品管抹片，螢光

抗酸染色應每天作一次陽性及陰性品管抹片。螢光抗酸染色結果陽性抹

片，可以再用複紅抗酸染色確認。若對報告懷疑時，可經由有經驗者再檢

查陽性的抹片予以確認。參考資料 Patrick R. Murray, et al,. (2003). Manual of Clinical Microbiology (8th ed.). American Society for Microbiology. Henry D. Isenberg. (1992). Clinical Microbiology Procedures Handbook. American Society for Microbiology.

分枝桿菌的鑑定

第五章分枝桿菌的鑑定

一、臨床意義細菌學檢查在結核病防治上擔負著重要的角色。尤其是用來控制結核

病的蔓延，因為它能適時的發現、分離及鑑定出結核菌，並且瞭解其藥物

的感受性。胸部 X 光檢查，再配合抗酸菌抹片檢驗與培養技術可使結核病

的診斷更為準確，也可以提高結核病的發現率。傳統的結核菌培養，雖然

所需時間較久，仍是當今診斷結核病的標準方法，重要的是結核菌檢驗的

品質管制。

近幾年來，由於愛滋病肆虐，人類感染多種非結核分枝桿菌

(non-tuberculous mycobacteria， NTM)的病例急速增多，尤其是以

M.avium-intracellulare complex (MAC)的感染最為顯著，因此MAC的診斷

與治療受到重視。然而，由於發生在肺部的 MAC 在臨床症狀與胸部 X 光

的表現很容易與肺結核混淆。此時，需要正確的培養與鑑定過程來區別。

臨床醫師應該瞭解僅由臨床症狀、胸部 X 光檢查及痰抹片的抗酸菌檢查並

不足以診斷為肺結核，必須由病患取得適當的檢體經由培養與鑑定，才能

證實病原菌的種類。也唯有經由培養與分離，才能決定分枝桿菌的藥物感

受性特色，協助臨床醫師用藥。

二、分枝桿菌的種類分枝桿菌可分為結核菌群 ( Mycobacterium tuberculosis complex )

和非結核性分枝桿菌兩大類來說明他們的培養及其鑑定。結核菌群包含 M.

tuberculosis 、M.bovis、M.microti、M.africanum 及 M.canetti。非結核分枝

桿菌叉可依生長速度分為快速生長菌群(七天以內可形成菌落)和緩慢生長

菌群(七天以上形成菌落)。分枝桿菌色素形成的特色不同，可分為三大類。

第一類、在光線照射下形成有色素的菌體稱為光產色菌(photochromogens)，

若於黑暗處，菌體並不形成色素，但若暴露於光線下在培養後，會形成色

素。第二類、在見光與黑暗處均會形成有色素的菌體稱為暗產色菌

(scotochromogens)不論在光線下或黑暗處均會形成黃色到橘色的菌落,有些

菌株會因連續照光而增強色素的濃度。第三類、即使照光也不會產生色素

稱為非產色菌(nonphotochromogens)，無論在照光或黑暗處，只有淡黃色的

菌落。

目前已知有八十幾種分枝桿菌，新的菌種也陸續被發現。然而其中只

有一部份菌種對人類有致病性，其餘大部分都是存在於周遭環境中的腐生

菌或伺機性病原菌。臨床檢體常分離的分枝桿菌及其與人類疾病之相關性

如下:

1、結核菌群

常見者為M.tuberculosis和M.bovis。M.tuberculosis (結核菌)是人類

肺結核之主要病原菌，大約佔 85%的人體分枝桿菌感染。HIV患者大多

屬於肺感染，引起淋巴結結核以及散播性結核為多。

2、非結核性分枝桿菌群

非結核分枝桿菌群屬於緩慢生長菌群依色素形成的特色不同共分

為三群，光產色菌、暗產色菌和非產色來區別鑑定。

a、緩慢生長光產色菌群：常見者為M.kansaii及M.marimum。形成的菌

落於暗處培養呈灰白色，但轉移到光線下培養 24小時後，菌落呈檸

檬黃色。

(a) M.kansasii

主要引起人體肺部感染，但 AIDS病患則呈散播性感染。

(b) M.marinum

似為魚類感染病原菌。人體感染主要來自處理熱帶魚的飼養

水槽或水池的清洗因皮膚創傷而受污染，導致皮膚感染。大多屬

於局部性感染。淋巴管型偶發性病例或散播性全身性感染的病例

亦有。本菌適當的生長溫度是 30℃。

b、緩慢生長暗產色菌群：不常引起人類疾病。M.scrofulaceum、

M.gordonae偶而引發疾病。

(a) M.scrofulaceum

孩童頸部淋巴腺炎(lymphadenitis)曾分離M. scrofulaceum。病

變常在下頷或頷下處形成之淋巴結，為潛伏性發病以及單側性發

生。往往造成組織軟化，破裂，廔管流膿。

(b) M.gordonae

廣泛存在土壤、水中，又稱之為水龍頭自來水管暗產色菌(tap

water scotochromogen)。臨床檢查室常見之污染腐生性抗酸菌。

也會引起人體肺部感染或軟組織或骨髓炎之感染。

c、緩慢生長非產色菌群：M.avium、M.interacellulare、M.xenopi

等。

(a) M.avium complex(MAC)

MAC複合菌群包括 M avium (M.subsp.avium, M.subsp.

paratuberculosis 和 subsp.silvatium)以及 M.intracellulare 兩大菌

種。M.avium 常來自家禽、豬等動物。M.intracellulare 對人體會

引起類似肺結核的病變。M.avium和 M.intracellulare 在常規實驗

室檢查不能明顯區分，常以 M.avium-intracellulare 來發報告，或

M.avium complex (MAC)來表示。對於非 AIDS病患，MAC菌為

人體感染非結核分枝桿菌最常見的菌種。MAC 菌株常見於自來

水水源或空氣中，為感染的來源。

(b) M.xenopi

會引起類似肺結核病變，對於易感染宿主則常會有肺外感染

和全身擴散性的感染症出現。感染來源常見於醫院熱水供應系統

(43－45℃)。

3、快速生長菌群(Rapid grower)

常見者為 M.fortuitum、M.absessus及 M.chelonae，屬於 M.fortuitum

complex。M.fortuitum complex菌種對人體大都屬於皮膚的感染，包括外

科傷口或創傷的局部皮膚病變為主。

a、 M.fortuitum

感染的病例包括胸部乳房手術後的感染和耳道以及皮膚和軟

組織的感染。

b、 M.chelonae

感染的病例包括皮膚和軟組織的感染，手術後的傷口感染或者

眼睛結膜炎。

c、 M.absessus

對免疫不全病患造成全身性擴散性的病變，皮膚和軟組織的感

染，肺部感染以及手術後感染。

三、分枝桿菌的生長特性典型的結核菌為表面粗糙的淡黃色(buff)菌落，但有時與非結核性分枝

桿菌並不易區別，需依賴生化檢查進行鑑定。一系列的生化檢查之前，必

須確實知道這分枝桿菌的生長特性包括生長速度，不同溫度之下生長情

形，了解分別在黑暗及亮光下色素產生情形，作為分枝桿菌鑑定的第一步

驟。

1、生長速度和最佳生長溫度

指分枝桿菌在固定培養基形成成熟的菌落，不需使用放大鏡，

用肉眼即可辨識，所需要的時間，7天以內者，稱快速生長菌，超

過 7 天者，稱緩慢生長菌。分枝桿菌中緩慢生長菌群與快速生長

菌群之區別鑑定是將試驗菌落分別接種於 L-J培養基於 35℃或 30

℃，7天內發育完全者為快速生長菌群，否則為緩慢生長菌群。同

時，觀察在MacConkey agar(不含 crystal violet)生長能力試驗。緩

慢生長菌群會受到抑制。

a、取 7天生長之液體培養物或來自固體培養基上之菌體懸浮液。

b、接種 0.l mL、100倍稀釋之菌體於 L-J培養基上， 35℃培養。

若懷疑為 M.ulcerans、M.marinum、或 M.haemophilum培養於

30℃。

c、5－7天時，觀察是否有可辨識的菌落，之後每週觀察之。

2、色素的形成和受光線照射之反應

有些分枝桿菌在沒有光線下，會產生 carotenoid色素。有些分

枝桿菌則需在光線照射下產生色素。分枝桿菌色素形成的特性不

同，如上所述，可分為三大類。結核菌群屬於非產色菌，因此會

形成色素的分枝桿菌，可初步報告為 NTM菌株。

a、使用新鮮菌體 5－7天培養菌體接種於三支 L-J培養基，其中兩

支覆包錫箔紙或黑色紙遮光，第三支不包任何東西放置一般光

線下培養。

b、當第三支已發現有生長的菌落時，要檢查前二支包有錫箔紙的

L-J培養基，若有生長，其中一支打開錫箔紙放置光線下(100 W

鎢絲燈距離 20－25 cm)3.5小時，鬆蓋。之後再用錫箔紙包覆，

連同未打開者一起培養，24、 48、 72小時分別觀察，比較兩

支試管菌落顏色的變化。

c、有些 MAC 菌株會有色素形成。有些分枝桿菌在不同溫度生長

時會有不同的產色性。例如 M.szulgai 在 37℃為暗產色性，在

25℃下，呈光產色性。

3、菌落的形態

a、將分枝桿菌接種於Middlebrook 7Hl 0瓊脂培養基。

b、 5－14天後，開始觀察培養基上之菌落形態，之後每週觀察記

錄。

c、可分為粗糙，平滑，圓形，扁平等。

四、臨床檢體常分離分枝桿菌鑑定之流程分枝桿菌的鑑定要確定分枝桿菌的生長速度，最佳生長溫度，以及色

素形成之特性。先將分枝桿菌依據生長速度，分為兩大類，一為快速生長

菌，二為緩慢生長菌(表 1)。再依據色素形成之特性，分別將上述兩大類分

枝桿菌，進一步分類其步驟參照分枝桿菌鑑定之流程表(圖 1A，lB)。緩慢

生長菌群依生化特性區別為結核菌群或非結核性分枝桿菌群緩慢生長非結

核分枝桿菌依色素及見光產色特徵又可分為光產色菌，暗產色菌，和非產

色菌(表 1)。流程表之建立是依據傳統生化學檢查特性(表 4)來設計，方便臨

床上分枝桿菌的鑑定。

1、結核菌群與非結核菌群之區別鑑定

從各種培養基，挑起可疑菌落，抗酸性染色確定為抗酸性分枝桿菌

取適量進行下列試驗包括：1) p-nitrobenzene (PNB)培養基生長抑制試

驗；2) p-nitro-α-acetylamino-β-hydroxpropiophnone(NAP 培養基生長抑制

試驗；3) 28℃之培養基生長情形觀察；4) 68℃ catalase試驗(表 2)。結

核菌在四種試驗均為陰性反應，反之為非結核菌群(表 2)。

2、M.tuberculosis與 M.bovis之區別鑑定

M.tuberculosis與 M.bovis同屬於結核菌菌群，兩者分別鑑定試驗以

1) nitrate還原試驗；2) niacin試驗；3) pyrazinamidase之活性試驗； 4)

TCH 生長抑制試驗為主。M.tuberculosis 在這四種試驗均為陽性反應；

反之為 M. bovis(表 2)。

a、M.tuberculosis之鑑定

(a)、於 Lowenstein Jensen(L－J)斜面培養基上菌落型態表現組糙，淡

黃臘狀，為鑑定上重要特徵。純化後菌體接種於 Middlebrook

7H10培養基 5－10天後，在低倍顯微鏡下觀察是鳥巢式，繩索

狀的菌落。但 25天後則為組糙、臘狀、淡黃的外表。

(b)、抗酸性染色、菌體細小、微微彎曲、強抗酸性染色、帶有明顯

的珠狀菌體。

(c)、生化試驗之區別特性如下：1) nitrate還原(+)；;2) niacin試驗(＋)；

3) TCH生長(+)； 4) pyrazinamidase試驗(+)；; 5) NAP生長(－)。

b、M.bovis之鑑定

(a)、與M. tuberculosis同屬於結核菌群。於 L-J培養基，6－8週後，

才可見到菌落，呈淡黃扁平，小型菌落，有粗糙型或光滑型。

在Middlebrook 7H10培養基上，生長不良，很細小，似小水滴。

(b)、抗酸性染色，菌體比M.tuberculosis細長，較少彎曲，較少珠狀

菌體。

(c)、生化試驗之區別特性如下：nitrate試驗(－)；niacin試驗(－)；TCH

生長(－)；pyrazinamidase試驗(－)。

3、臨床檢體常分離之緩慢生長菌群與非結核分枝桿菌之鑑定

其常用鑑定試驗如表 3所示。光產色菌群的M.kansasii和M.marinum

之區別鑑定試驗以 42℃生長情形，nitrate還原試驗，Tween 80水解試驗，

niacin試驗， urease試驗，和 pyrazinamidase試驗為主。暗產色菌群的

M.scrofulaceum和M.gordonae的區別鑑定為 nitrate還原試驗，Tween 80

水解試驗，和 68℃ catalase。非產色菌群的MAC和M.xenopi的區別鑑

定為 nitrate還原試驗，Tween 80水解試驗，45℃生長情形和 28℃生長

情形(表 3)。

(1)光產色菌群

a、M.kansasii之鑑定

(a)、 M.kansasii 是屬於緩慢生長菌(10－20 天), 見光產色菌群。

生長溫度範圍在 32℃到 42℃，45℃下不能生長。若分枝桿

菌的 catalase 試驗(+)，nitrate 還原(+)與 Tween80(+)時，為

M. kansasii的重要特徵。

(b)、本菌明顯的特性是暗處的灰白菌落受到光線照射後，有明顯

的黃色出現在菌落。若培養時間一久(20－30 天)菌落會有紅

色的β胡蘿蔔素結晶色彩。

(c)、於Middlebrook 7Hl 0培養基上，5－10天後微小菌落呈高凸，

鳥巢狀，周邊較薄。

(d)、生化試驗的區別特性如下：1) 快速水解 Tween 80 (3天內)；

2) 強烈還原 nitrate； 3) 68℃ catalase試驗快速反應； 4) 強

烈的 pyrazinamidase活性。

b、M.marinum之鑑定

(a)、 M.marinum亦為見光產色菌。30－32℃下，生長較良好，37

℃下生長不良為鑑定上重要特徵。

(b)、菌落 8－14天後置於暗處呈灰白色，但光線照射後，呈現深

黃色菌落。於 Middlebrook7Hl0 培養基上，菌落多變化，縐

裂，粗糙，但有時呈光滑型，菌落似半球狀。

(c)、抗酸性染色觀察，菌體相當細長，帶交叉狀。

(d)、生化試驗之區別特性如下：1) nitrate還原試驗(－)；2) Tween

80(＋)；3) urease試驗(+)；4) pyrazinamidase活性(＋)；5)68

℃catalase試驗(－)。

(2)暗產色菌群

a、M.scrofulaceum之鑑定

(a)、M.scrofulaceum 屬暗光產色菌，色素形成不受光線照射的影

響，呈黃色~深橙黃色。

(b)、生長速度緩慢(4－6 週)，不受各種溫度的影響。菌落光滑，

具乳酪狀稠度，呈球形狀。

(c)、生化試驗區別特性如下：1) nitrate的還原試驗(－)；2) Tween

80(－)；3) 68℃ catalase試驗(＋)；4) urease試驗(＋)。

b、M.gordonae之鑑定

(a)、為暗光產色菌株，於Middlebrook 7H10培養基 37℃，5－10

天後,出現光滑，深黃橘色中－大型的菌落為本菌鑑定特徵。

(b)、抗分枝桿菌藥物感受性試驗結果，M.gordonae對 isoniazid，

streptomycin，和 p-aminosalicylic aci d具抗藥性，對 rifampin

和 ethambutol具感受性。

(c)、生化試驗區別特性如下：1) 68℃ catalase試驗(＋)； 2) Tween

80試驗(＋)；3 nitrate的還原試驗(－)； 4) urease試驗(－)。

(3)非產色菌群

a、M.avium complex之鑑定

(a)、 M.avium-intracellulare complex(MAC)之菌落型態常為下列三

種變異之一：1) 光滑，不透明，呈圓頂狀；2) 光滑，透明，

扁平；3) 粗糙狀。分離自 AIDS病患的MAC菌株，大部分

屬於扁平，透明，光滑型。

(b)、培養於Middlebrook 7Hl0培養基，5－10天後，形成扁平，

薄膜狀，透明，微小菌落中央較暗凸起，類似煎蛋。這種型

態的微小菌落是 MAC 菌群鑑別上重要特徵。單一菌落的

MAC菌株的周邊可見到根狀物的延伸、為鑑定的重要參考。

(c)、抗酸性染色，菌體是典型短的球桿菌，但細長菌體細胞也有。

(d)、生化試驗區別特性如下：本菌的重要特徵是多項試驗均屬於

惰性反應。唯有 68℃ catalase(＋)；TCH生長試驗(+)。

b、M.xenopi之鑑定

(a)、 M.xenopi鑑定特徵是可以生長在 45℃， 28℃下不能生長。

早期，M.xenopi被歸類為不產色菌群，但從臨床檢體初次分

離的菌株都有亮麗的黃色，所以M.xenopi應歸屬暗產色菌較

恰當。

(b)、菌落粗糙，有空中菌絲體的形成。在Middlebrook 7H10培養

基，5－10天後，菌落表現特殊鳥巢狀外表，有桿狀突出物。

培養時間長久，呈現樹枝分叉，絲狀延伸的菌落。

(c)、抗酸性染色，菌體細胞成細長絲狀，兩端尖細，排列成木柵

狀。

(d)、生化試驗區別特性如下：1) 最適宜生長溫度是 42℃；;2)具

有亮麗黃色的暗光產色特性；3) niacin 試驗(－)；4) nitrate

還原試驗(－)；5) 68℃ catalase試驗(+)；6) arylsulfatase活性

(+)； 7) pyrazinamidase活性(+)。

4、快速生長菌群 M.fortuitum、M.chelonae和 M.abscessus之鑑定

a、 M.fortuitum、M.chelonae和M.abscessus鑑別之重要特徵是生長快速，

2－4 天，可見到菌落。年輕的菌落呈現光滑，半圓形，有時帶乳酪

或蠟質的黏稠狀。菌落不具色彩，呈灰白乳酪色。

b、 M.fortuitum和M.abscessus於Middlebrook 7H10培養基，1－2天後，

會產生樹枝分叉，絲狀延伸的菌落，M. chelonae則沒有此特性。

c、 M.fortuitum、M.chlonae和M.abscessus大多可生長於MacConkey agar

(不含有 crystal violet)表面光滑，圓頂菌落，帶有粉色彩。

d、抗酸性染色，菌體細胞多形態，細長絲狀或短，粗桿狀均有。

e、生化試驗區別特性如下：這三種菌株共同的鑑定特性是 1) 沒有色素

形成；2) 生長快速；3) 3天內 arylsulfatase活性(＋)； 4) 可長於不

含 crystal violet的MacConkey agar(28℃)上。這三種菌株區別鑑定如

表 3所示。

五、分枝桿菌的鑑定試驗當抗酸菌被分離出時，即可由其色素產生及生長速度初步分類，然後

再依各種鑑定試驗確認菌種，不能僅以單一試驗或特性即作成菌種的最後

確認，因為所有菌株都會有例外情形存在。各種鑑定試驗結果應與已知菌

種的反應特性相比較，若二者反應結果相符，依各實驗室操作情形不同約

能確認出 85%-95%的菌種，若鑑定試驗結果與已知菌種的反應特性不相

符，應至少將鑑定試驗重作一次，若仍然無法確認則此菌種必需加以詳細

研究。分枝桿菌常用的鑑定試驗如後。

(一)Arylsulfatase試驗

試驗原理

Arylsulfatase為能水解具 R-OSO3H結構的化合物內硫酸根及芳香環烷

間鍵結的酵素。將 potassium phenolphthalein disulfate加於培養基內，若產

生紅色即表示發生水解反應 phenolphthalein 被釋出。大多數分枝桿菌都能

產生此 arylsulfatase 活性，可利用 3 日試驗鑑別 M.fortuitum complex、

M.peregrinum、 M.mucogenicum 等致病菌，而 14 日試驗可用於鑑別

M.marinum 、M.szulgai、M.xenopi、M.triviale 等生長緩慢的分枝桿菌。

試驗方法

Centers for Disease Contro1(CDC)法

試劑配製

酵素基質液(Enzyme substrate stock solution)

取 2.6 g phenolphthalein disulfate，trisodium salt 溶解於 50 mL蒸餾水中

製成 0.08 M溶液，以 0.22μm孔徑薄膜過濾滅菌，儲存於 5℃。

液體培養基(Liquid media)

使用 Dubos Tween-albumin或Middlebrook 7H9液體培養基均可。取兩

支錐形瓶加入 180 mL蒸餾水及適量培養基基劑，121℃，5分鐘高壓蒸氣滅

菌，經冷卻至室溫後，以無菌技術加入 20 mL ADC滋養劑，用於 3日試驗

的培養基以無菌技術加入 2.5 mL 0.08 M酵素基質液，作成含 0.0l M 基質

的完整液體培養基，14日試驗的培養基則以無菌技術加入 7.5 mL 0.08 M酵

素基質液加入 0.03 M基質的完整液體培養基，以無菌技術將 2 mL完整液

體培養基分裝入 16 x 125 mm附蓋試管即成，可將不同用途液體培養基標示

以避免混淆，於室溫或冷藏儲存。2N碳酸鈉溶液(2N Na2CO3)：溶解 10.6 g

無水碳酸鈉(anhydrous Na2CO3)於 l00 mL蒸餾水，以 0.22μm孔徑薄膜過濾

滅菌，長期儲存時應注意污染。

品管

陽性品管：M.fortuitum 。

試劑品管：未接種的基質培養基。

3日試驗陰性品管：M.smegmatis或 M.avium。

14日試驗陰性品管：已知陰性的 M.tuberculosis或 M.avium。

試驗步驟

（1）取 3日試驗及 14日試驗基質培養基並予以標示。

（2）取經液體培養基培養 7日的培養液 0.l mL或一接種匙於固體培養

基上生長茂盛的繼代培養菌落接種於基質培養基，孵育於 35-37

℃。

（3）孵育 3天後，加入六滴的碳酸鈉溶液於 3日試驗基質培養基。

（4）孵育 14天後，加入六滴的碳酸鈉溶液於 14日試驗基質培養基。

結果及判讀

陽性反應：加入碳酸鈉溶液後立即產生粉紅至紅色顏色變化。

陰性反應：加入碳酸鈉溶液不產生顏色變化。

紅色標準液的製備

(1) 0.067 M Disodium phosphate

溶解 9.47 g anhydrous Na2HPO4於 1000 mL蒸餾水。

(2) 0.1% Phenol red

溶解 0.1 g phenophthalein(sodium salt )於 100 mL蒸餾水，高壓蒸氣

滅菌後冷藏儲存。

(3) 取六支 16 x 125mm附蓋試管依下表配製。

注意事項

需經常檢查製成的完整液體培養基是否有 phenolphthalein 釋出，可加

入數滴碳酸鈉溶液檢查應為不產生顏色變化，若產生粉紅色顏色變化即表

示有 phenolphthalein釋出，將會造成偽陽性，此批培養基應丟棄不能使用，

並取少量 phenolphthalein disulfate粉末溶於水中，加入數滴的碳酸鈉溶液，

檢查是否產生顏色變化，若產生粉紅色顏色變化即表示有 phenolphthalein

用於製備培養基時將會造成偽陽性，此時可將 phenolphthalein disulfate,

trisodium salt 溶解於少量蒸餾水中，再加入過量乙醇使之沉澱，以試紙過

濾取得沉澱，再取乙醇清洗沉澱後，將沉澱物乾燥即能再使用。

(二)碳源試驗(Carbon source)

試驗原理

本試驗主要用於快速生長群分枝桿菌的鑑定，於 ammoniacal nitrogen

存在下，試驗分枝桿菌是否能利用檸檬酸鈉 ( sodium citrate )、木蜜糖

(mannitol) 作為碳源而生長於培養基。

試驗方法

試劑配製

(1)基礎培養基

取 950 mL蒸餾水加入 2.4 g (NH4)2SO4，0.5 g KH2PO4，0.5 g

MgSO4•7H20稍加熱並攪拌使成份溶解，以 10% KOH及 10% HCl 調

整所需酸鹼度(如下)，再加入 20 g purified agar，加熱溶解後以 121

℃，20分鐘高壓蒸氣滅菌。

(2)檸檬酸鈉試驗培養基

將 950 mL基礎培養基酸鹼度調整至 7.0, 高壓蒸氣滅菌後以水

浴冷卻至 56℃，取 5.6 g檸檬酸鈉溶解於 50 mL蒸餾水，以薄膜過

濾滅菌，將溶液以無菌技術加入基礎培養基，分裝 8 mL 培養基於

20 x 150 mm附蓋試管，固化作成斜面。

(3)木蜜糖試驗培養基

將 950 mL基礎培養基酸鹼度調整至 7.2，高壓蒸氣滅菌後以水

浴冷卻至 56℃，取 5.0 g 木蜜糖溶解於 50 mL蒸餾水，以薄膜過濾

滅菌，將溶液以無菌技術加入基礎培養基，分裝 8 mL培養基於 20 x

150 mm附蓋試管，固化作成斜面。

(4)品管培養基

以 1000 mL蒸餾水配製基礎培養基並將酸鹼度調整至 7.2，再加

入 20 g purified agar，加熱溶解後以 121℃，20分鐘高壓蒸氣滅菌，

分裝 8 mL培養基於 20 x 150 mm附蓋試管，固化作成斜面。

品管

本試驗為自我品管。

試驗步驟

(1)將液體培養基培養七日的培養液以無菌生理食鹽水作十倍稀釋至不

呈混濁。

(2)取稀釋懸浮液 0.1 mL接種於各培養基。

(3)孵育於 28℃兩週。

結果及判讀

陽性反應：能長出菌落。

陰性反應：不能長出菌落。

(三)Catalase試驗

試驗原理

Catalase 為細胞內可溶性酵素能將過氧化氫分解成水及氧氣，

2H202→2H2O + O2。試驗時，產生氧氣氣泡即表示具 catalase 活性。除了

M.tuberculosis的 INH抗藥性變種及M.bovis 外，所有分枝桿菌均產生此酵

素。研究顯示,分枝桿菌可產生數種不同型熱安定性的 catalase，半定量

catalase試驗可用於檢查分枝桿菌所產生酵素的量，68℃ catalase試驗可用

於檢查分枝桿菌所產生的不同型熱安定性酵素。所有分枝桿菌依其酵素活

性可分成四類(1)不產生酵素者，(2)半定量 catalase 試驗＜45 mm 者，(3)

半定量 catalase試驗＞45 mm者，(4)68℃， 20分鐘處理後仍具酵素活性

者。

試驗方法

1、半定量 Catalase 試驗

本試驗可將分枝桿菌分成能產生45 mm 氣泡及不能產生45 mm 氣

泡兩類。一般而言，M. kansasii、M. simiae、暗產色菌群、非產色菌群

的腐生菌及快速生長菌群能產生 45 mm 氣泡；M.tuberculosis、M.

marinum、M.avium complex、M.xenopi及M.gastri不能產生 45 mm 氣泡。

試劑配製

L-J 平面培養基

將 L-J 或其它蛋基培養基 5 mL分裝於 20 x 150 mm 附蓋試管，直

立放置於 85℃，50分鐘蒸厚。

10% Tween：80取 10 mL Tween 80及蒸餾水 90 mL 均勻混合後，於 121

℃，10分鐘高壓蒸氣滅菌，於滅菌完成後，冷卻時予以搖動使 Tween 80

溶解，儲存於 5℃。

30% H2O2 ：儲存於 5℃於使用前，取等量 10% Tween 80及 30% H2O2 ，

均勻混合。

品管

強陽性品管(> 45 mm)：M.gordonae或 M.terrae complex。

弱陽性品管(< 45 mm)：M.gastri或 M.avium complex。

陰性品管：未接種的培養基。

試驗步驟

(1) 取經液體培養基培養七日的培養液 0.1 mL或一接種匙於固體培養

基上生長茂盛的繼代培養菌落接種於基質培養基。

(2) 將蓋子鬆蓋孵育於 35－37℃ 兩週。

(3) 孵育完成後，加入新鮮配製的 Tween-peroxide 1.0 mL，將蓋子鬆

蓋，靜置於室溫五分鐘。

(4) 測量自培養基表面起氣泡高度的 mm數。

結果及判讀

將分枝桿菌分成能產生 45 mm 氣泡及不能產生 45 mm 氣泡兩類。

2、熱穩定 Catalase試驗 (pH 7.0/68℃)

有些分枝桿菌經 68℃(pH 7.0)， 20分鐘處理會失去 catalase活性，

如 M.tuberculosis、M.bovis、M.gastri及 M.haemophilum。本試驗最適用

於 niacin test弱陽性或陰性的M.tuberculosis菌株，所有非產色菌群分枝

桿菌均應進行本試驗。

試劑配製

0.067 M phosphate buffer，pH 7

儲存液

(1) 0.067 M disodium phosphate：取 9.47 g anhydrous Na2HP04溶解於 1000

mL蒸餾水。

(2) 0.067 M monopotassium phosphate：取 9.07 g KH2P04溶解於 1000 ml

蒸餾水。取 61.1 mL(1)+38.9 mL(2)，均勻混合，以酸鹼度測定儀測酸

鹼度。

10% Tween 80：取 10 mL Tween 80及蒸餾水 90 mL均勻混合後, 於

21℃，10 分鐘高壓蒸氣滅菌，於滅菌完成後冷卻時立即予以搖動使

Tween 8 0溶解，儲存於 5℃。

30% H2O2 ：儲存於 5℃，於使用前取等量 10% Tween 80及 30% H2O2

均勻混合。

品管

陽性品管：M. gordonae。

陰性品管：M. tuberculosis。

試驗步驟

(1)自固體培養基上的菌落取數接種匙，加於含 0.5 mL 0.067 M，pH 7

磷酸緩衝液的 16 x 125 mm附蓋試管。

(2) 將懸浮液孵育於 68℃水浴(或電熱器) 20分鐘，溫度及時間需準確。

(3) 孵育完成後於室溫冷卻，加入新鮮配製的 Tween- H2O2 1 mL，將蓋

子鬆蓋。

(4) 觀察是否有氣泡的形成 20分鐘。

結果及判讀

陽性反應：有氣泡產生，有時會自沉澱的細胞產生少量的氣泡仍為陽

性反應。

陰性反應：無氣泡產生。

注意事項

不能搖動試管，因為 Tween 8 0經搖動會產生氣泡容易誤判為陽性反應。

(四)生長速度試驗

試驗原理

分枝桿菌經常以生長速度分類，緩慢生長菌群需 7 天以上才能於培養

基觀察到菌落，快速生長菌群則僅於 7天以內即能於培養基上觀察到菌落。

但是由於初次分離時需經過消化去污染處理，有些快速生長菌群需三週以

上方能自於培養基上觀察到菌落，所以進行生長速率鑑定時，應以經適當

稀釋足以長出菌落的接種液，接種於固體培養基作繼代培養，才能得到正

確客觀的評估。

試驗方法

1、由 Lowenstein-Jensen(L-J)培養基判斷

將懷疑菌落挑出，以無菌蒸餾水配成相當於McFarland nephelometer

No.l標準液之懸浮液。

(1) 分別接種 0.1 mL菌落至二支 L-J 培養基。

(2) 培養在 35℃ , CO2 培養箱。若懷疑為 M.ulcerans, M.marinum 或

M.haemophilum則培養在 30℃。

(3) 在適當時間觀察菌落生長情形，通常在接種後 5-7天，及隨後之每星

期檢查，直至菌落發育完全。

(4) 判讀：

生長菌：在七天內完全發育。

緩慢生長菌：在七天後完全發育。

註：生長速度與溫度關係通常由培養在 37℃及 30℃判斷，若必要則培養在

24℃、30℃、37℃及 42℃。

2、由Middlebrook 7H 9液體培養基判斷

試劑配製

Middlebrook 7H 9液體培養基取 4.7 g Middlebrook 7H9液體培養基基劑

加於含 2 mL glycerol或 0.5 mL Tween 80的 900 mL蒸餾水中。Glycerol或

Tween 8 0不能同時使用，於 121℃，15分鐘高壓蒸氣滅菌，冷卻至 45℃以

無菌技術加入 100 mL ADC滋養劑均勻混合後，分裝入 5mL入 20 X 150 mm

覆蓋試管。

試驗步驟

(1)取初次分離出的菌落作成抹片，觀察菌種的純度，以無菌技術挑取

數菌落接種於Middlebrook 7H 9的液體培養基。

(2)孵育於 37℃，5-7天，每天以手搖動以促進生長。

(3)孵育完成後，將培養液稀釋成能培養分離菌落的懸浮液。（懸浮液的

濁度相當於McFarland nephelometer No. 1*）

(4)接種 0.l mL懸浮液於蛋基培養基或瓊脂基培養基。

(5)孵育於 35℃或最適合待鑑定分枝桿菌生長的溫度。

(6)於 5-7天後及往後每週觀察並記錄是否有明顯菌落長出。

＊McFarland 濁度標準液的製備

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1﹪BaCl2（mL） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

1﹪H2SO4（mL） 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

大約細菌密度（×108mL） 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 18.0 21.0 24.0 27.0 30.0

結果及判讀

快速生長菌群：於七日內長出明顯菌落。

緩慢生長菌群：於七日以上長出明顯菌落。

(五)Iron Uptake試驗

試驗原理

本試驗用於測定分枝桿菌是否能將 ferric ammonium citrate轉化為 iron

oxide，而於菌落及培養基產生鐵銹般紅棕色。本試驗適用於區分

M .chelonae(陰性)及 M.fortuitum(陽性)。

試驗方法

1、Szabo and Vandra(Wayne )改良法

本試驗方法為 L-J培養基長出菌落後，再加入 ferric amnonium citrate

觀察反應。

試劑配製

L-J蛋基培養基：見前述 L-J蛋基培養基配製方法 Ferric ammonium

citrate：分裝 5-8 mL 20% ferric ammonium citrat e於適當容器後，高壓蒸

氣滅菌即可，若溶液產生沉澱或混濁應重新配製。

品管

陽性品管：M.fortuitum。

陰性品管：M.chelonae。

試驗步驟

(1)取一滴混濁的含菌懸浮液接種於兩支 L-J培養基。

(2)蓋子鬆蓋，孵育至有明顯菌落長出。

(3)加 6-8滴無菌 20% ferric ammonium citrate 溶液於一支 L-J培養基。

(4)孵育於 28℃，三週，每週觀察。

結果及判讀

陽性反應：產生鐵銹般紅棕色的菌落及培養基。

陰性反應：兩支培養基均長出菌落但無顏色變化的差異。

(六)在不含結晶紫之MacConkey瓊脂培養基之發育

試驗原理

本試驗適用於快速生長群分枝桿菌的鑑別，例如 M.fortuitum 菌群於

5-11天能生長於MacConkey瓊脂培養基，有時並會產生顏色變化，而其它

快速生長群腐生菌則無法生長。

試驗方法

試劑配製

MacConkey瓊脂(不含結晶紫)：

依市售培養基配製說明配製，將 20 mL培養基分裝於 15x 100 mm

培養皿。

培養液：

待檢的分枝桿菌應預先以 Middlebrook 7H9 液體培養基於 28℃，

培養七天。

品管

陽性品管：M.fortuitum。

陰性品管：M phlei 。

試驗步驟

(1)將培養皿置於旋轉台上，打開蓋子，使旋轉台旋轉，將沾培養液的

3 mm接種環接觸於旋轉的培養基中心並逐漸向外移動，造成一螺旋

狀接種，重覆 6-12次，或直接將沾培養液的 3 mm接種環塗劃培養

皿。

(2)將培養皿蓋子打開培養於 28℃環境，不可培養於 CO2培養箱。

(3)於第 5及 11天觀察。

結果及判讀

大多數M. fortuitum及M. chelonae菌株均能沿所劃的螺旋線生長，但

不一定會使培養基產生顏色變化，若接種很濃厚時，有些腐生菌會長於螺

旋線中心部份。

(七) Niacin試驗

試驗原理

Niacin 為所有分枝桿菌合成代謝過程中氧化還原反應的必要成份，可

作為輔酉每生合成的前驅物質。雖然所有分枝桿菌均會製 nicotinic acid，但是

由於代謝過程的阻斷現象，使M.tuberculosis產生最大量的 niacin ，以此可

利於M.tuberculosis的鑑定，但是不能只用本試驗來鑑定M.tuberculosis，因

為有些菌種會有陽性反應(M.simiae、M.chelonae chemovar niacinogenes，

BCG)，所以可加上 nitrate還原試驗及 68℃ catalase鑑定 M.tuberculosis。

本試驗一般使用蛋基培養基可得到理想的結果，若使用 Middlebrook

7Hl0或 7Hl1培養基時，應加入 0.1% potassium asparate或於 37℃萃取兩小

時才能得到理想的結果。進行本試驗時，應先鏡檢測試分枝桿菌的純度，

同時應有 3-4週菌落 50個以上，若於四週時仍為陰性反應且經無菌操作，

可再培養至六週再檢，否則應重新培養至六週再進行檢查。由於分枝桿菌

會將 niacin 分泌入培養基內，所以當菌落生長過於茂盛時會因抽取不當造

成偽陰性，此時應將菌落挑開方能抽取出 niacin。

試驗方法

1、化學試劑法

試劑配製

4% Aniline：取無色 aniline 4 mL加入 96 mL 95%乙醇，冷藏儲存於棕色

小瓶，若變黃色表示變性，不能使用。

3% Benzidine：取 3 g benzidine 溶解於 100 mL 95% 乙醇冷藏儲存於棕

色小瓶。

10% Cyanogen bromide：取 5 g cyanogen bromide 溶解於 50 mL蒸餾水，

冷藏儲存於緊蓋棕色小管使用時若有沉澱產生可於室溫中回溫溶解。由

於 cyanogen bromide具揮發性且儲存時易失去活性，所以製備時應少量

配製。

0.85% Saline：取 0.85 g NaCl溶解於 100 mL蒸餾水，高壓蒸氣滅菌。

品管

陽性品管：M. tuberculosis。

陰性品管：M. avium complex。

試劑品管：未接種的培養基。

試驗步驟

(1)取 1 mL無菌蒸餾水或無菌生理食鹽水加入長有菌落的 L-J培養基。

(2)將培養基水平放置，使無菌蒸餾水或無菌生理食鹽水浸泡整個培養

基表面。

(3)靜置 15分鐘抽取 niacin，若菌落較少或疑為弱陽性者得延長抽取時

間。

(4)取 0.5 mL抽取液，裝入 16 x 125 mm附蓋試管。

(5)加入 0.5 mL 4% aniline及 0.5 mL l0% cyanogen bromide。

(6)立即觀察是否變為黃色。

結果及判讀

陽性反應：黃色。

陰性反應：不變色

注意事項

進行本試驗時應注意(1)aniline 若曝露於陽光及空氣中可能會變色，應

重新配製以免造成偽陽反應，(2)cyanogen bromide為強催淚劑，吸入時具相

當毒性，應於排煙櫃內配製，並於生物安全操作櫃內進行試驗，同時進行

大量試驗時應注意空氣循環避免造成不適，(3)於酸性溶液，cyanogen

bromide 會水解產生 hydrocyanic acid 為劇毒性物質，所以只能於通風良好

的環境操作，所有廢棄物均應放入含 NaOH 的鹼性消毒劑消毒，(4)可利用

3% benzidine酒精溶液取代 4% aniline 酒精溶液，此時陽性反應者將呈粉紅

至紅色，而陰性反應則不變色。

2、濾紙條法

品管

陽性品管：M. tuberculosis。

陰性品管：M. avium complex。

試劑品管：未接種的培養基。

試驗步驟

(1)、(2)、(3)如試管法抽取 Niacin

(4)取 0.5 mL抽出液於試管。

(5)依正確方向放入試紙並立即蓋上蓋子。(避免試紙中段被沾濕)

(6)靜置室溫的 15-20分鐘，偶爾輕搖。

(7)於白色背景下觀察試管底部液體的顏色變化。(試紙可能因氧化作用

而變色)

(8)試驗完成後加入 10% NaOH或將試管置鹼性消毒劑內處理。

結果及判讀

陽性反應：抽出液變黃色(非濾紙條)。

陰性反應：抽出液不變色。

注意事項

應經常檢查試紙的失效日期，於加入試紙後應立即蓋上蓋子，否則反

應產生的氣體會散失而發生偽陰性。

(八) Nitrate還原試驗

試驗原理

分枝桿菌能還原硝酸鹽(nitrate reduction)的性質於鑑別時很有價值。其

還原能力與培養的時間、溫度、酵素抑制劑、氫離子濃度等因子有關。用

於本試驗的菌種應經繼代培養四週以上再進行試驗，若為快速生長菌群而

於兩週即生長完全者亦可進行試驗，能還原硝酸鹽的分枝桿菌有

M.tuberculosis、M.kansasii、M.szulgai、M.flavescens、M.terrae complex , 及

除 M.chelonae外的快速生長菌群。

試驗方法

1、液體試劑傳統法

試劑配製

(1)基質液

取 0.085 g NaNO3，0.177 g KH2PO4， 0.485 g Na2PO4‧12H2O溶解於

l00 mL蒸餾水，製成 pH 7， 0.0lM NaNO3的 0.022M磷酸鹽緩衝液。

(2)試劑＃1

取 50 mL濃鹽酸加入 50 mL蒸餾水。

(3)試劑＃2

取 0.2 g sulfanilamide溶解於 100 mL蒸餾水。

(4)試劑＃3

取 0.l g N-naphthylethylenediamine dihydrochloride 溶解於 100 mL蒸

餾水。所有試劑應儲存於 5℃ 暗處，若有變色或沉澱時應重新配製。

品管

陽性品管：M.tuberculosis (3+至 5+)。

陰性品管：M. bovis (BCG)。

試劑品管：不加微生物只含試劑。

試驗步驟

(1)取 0.2 mL無菌蒸餾水裝於 16 x 125 mm附蓋試管。

(2)取蛋基培養基上生長四週以上菌落約二接種環的菌量加入試管作成

懸浮液。

(3)加入 2 mL NaNO3 基質液

(4)以手搖動混合後於 37℃水浴孵育兩小時。

(5)自水浴取出。

(6)加入一滴試劑 #l。

(7)加入兩滴試劑 #2。

(8)加入兩滴試劑 #3。

(9)立即檢查是否產生粉紅至紅色顏色變化。

結果及判讀

陽性反應：產生粉紅至紅色顏色變化，若以標準液比色時，3+至 5+為

陽性。

陰性反應：不變色，若加入鋅粉產生紅色顏色變化，則確認為陰性反

應，若仍未產生紅色顏色變化則可能為陽性應重檢。

2、Nitrate濾紙條法

品管

陽性品管：M. tuberculosis

陰性品管：M. bovis (BCG)

試劑品管：不含微生物只含試劑。

試驗步驟

(1)取 1 mL無菌蒸餾水裝於 13 x 100 mm附蓋試管。

(2)取蛋基培養基(L-J培養基)上生長四週以上菌落約二接種環加入試管

作成懸浮液。

(3)以無菌攝子取試紙放入試管(避免試紙沾到試管壁液體) 。

(4)緊蓋蓋子垂直置於 37℃ 水浴孵育兩小時。

(5)孵育一小時後予以輕搖混合。

(6)孵育兩小時後予以上下倒置混合，使試紙整個潤濕。

(7)將試管斜置使試劑浸泡試紙 10分鐘。

結果及判讀

陽性反應：試紙上端變為淺藍色至深藍色。

陰性反應：不變色。

注意事項

由於試紙對陽光、過熱、潮氣相當敏感，應緊蓋裝入原容器於 2-8

℃儲存，若試紙變色表示變質不能使用，若陽性品管的顏色變化不明

顯時則本試驗結果較不可靠。

(九) Pyrazinamidase試驗

試驗原理

本試驗的原理為利用 pyrazinamide經脫氨作用可生成 pyrazinoic acid及

NH3，此性質適用於區分M.marinum (四日內陽性反應)及 M.kansasii(陰性反

應)；Niacin test 弱陽性的 M.bovis (七日仍陰性反應)及 M.tuberculosis 、

M.avium complex (四日內陽性反應)。

試驗方法

試劑配製

(1)基質培養基

取 6.5 g Dubos broth base溶解於 1000 mL蒸餾水，再加 0.l g

pyrazinamide；2.0 g pyruvic acid sodium salt；15.0 g agar 加熱使瓊脂

溶解，分裝 5 mL於 16 x 125 mm附蓋試管，121℃，15分鐘，高壓

蒸氣滅菌，直立試管使培養基固化，於 5℃ 冷藏可儲存數個月。

(2) 1% Ferrous ammonium sulfate

本溶液需新鮮配製，可預先秤取 0.l g ferrous ammonium sulfate

裝入 16 x 125 mm附蓋試管，配製時加入 10 mL蒸餾水即成。

品管

陽性品管：M.avium complex。

陰性品管： M.bovis或 M.kansasii。

標準品管：如基質培養基配製法，唯以 0.1g pyrazinoic a c id取代

pyrazinamide 。

試驗步驟

(1)分別取一大接種匙生長活躍的菌落(約 2-3週)，接種於兩管基質培養

基表面。

(2)將待檢及品管培養基孵育於 37℃(無 CO2)。

(3)四日後，加入新鮮自己製的 l0 mL 1% ferrous ammonium sulfate。

(4)靜置室溫 30分鐘，於白色背景下觀察基質培養基表層是否產生粉紅

色帶。

(5)將陰性反應的基質培養基管冷藏(2－8℃)防止污染菌生長，四小時後

再觀察基質培養基表層是否產生粉紅色帶。

(6)若四日試驗為陰性反應，於七日時以第二管基質培養基再測試。

(7)若四日試驗為陽性反應，第二管基質培養基不必再測試。

結果及判讀

陽性反應：產生粉紅色帶。

陰性反應：不產生粉紅色帶。

(十) NaCl耐受性試驗

試驗原理

本試驗為測試分枝桿菌是否能生長於含 5% NaCl的培養基。大多數快

速生長分枝桿茵菌群及緩慢生長的 M.triviale能生長於含 NaCl的培養基，

一些 M.flavescens菌株也能生長於含 NaCl的培養基， M.chelonae 不能生

長於含 NaCl的培養基，此特性可用於與 M.fortuitum 和 M.abscessus (能生

長於含 NaCl的培養基) 區別。

試驗方法

試劑配製

配製兩瓶蛋基培養基(如前述)，其中一瓶蛋基培養基每 300 mL 加入

15 g NaC1，分裝 6-8 mL蛋基培養基於 18 x 150 mm附蓋試管，於 85℃，15

分鐘蒸厚作成斜面。

品管

試驗步驟

(1)取 0.l mL 混濁的含菌懸浮液(或培養液)分別接種於含及不含 NaC1

的培養基。

(2)孵育於 28℃

(3)每週觀察是否有菌落長出。

(4)孵育四週內判讀是否有菌落長出。

結果及判讀

陽性反應：於含及不含 NaCl的培養基均長出菌落。

若於孵育四週內，於不含 NaCl培養基應長出無數菌落，而

於 NaCl培養基長出 50個以上菌落表示為陽性反應。

陰性反應：只於不含 NaCl的培養基長出菌落。

(十一) Tellurite還原試驗

試驗原理

於液體培養基的生長高峰期，不同菌種的分枝桿菌對 potassium tellurite

有不同的還原速度。本試驗中 tellurite作為人工添加的電子接受基，於菌體

氧化還原過程被還原成黑色的金屬 tellurium 。雖然分枝桿菌有不同的還原

速度，但是以於三日內能還原 tellurite 的性質最適用於鑑別 M.avium

complex (陽性反應)及其它非產色菌群分枝桿菌(陰性反應)，同時大部份快

速生長菌群分枝桿菌均能於三日內能還原 tellurite 。

試驗方法

試劑配製

Middlebrook 7H9液體培養基：

配製含 0.5 mL Tween 80 的 Middlebrook 7H9 液體培養基 1000

mL(如前述)。分裝約 5mL於 20 x 150 mm附蓋試管，或約 2.5 mL於 16

x 125 mm 附蓋試管。

0.2% Potassium tellurite：

溶解 0.l g potassium tellurite於 50 mL蒸餾水，分裝 2 mL於 13 x 100

mm附蓋試管，121℃，10分鐘高壓蒸氣滅菌，冷藏儲存。

品管

陽性品管：M.avium complex 。

陰性品管：M.terrae complex 。

試驗步驟

(1)取一大接種匙生長活躍的菌落，接種於 Middlebrook 7H9 液體培養

基。

(2)孵育於 35℃ 7日，若生長不夠茂盛，應重新接種較多量菌落重新培

養，經培養 7 日後生長不夠茂盛的培養液可直接進行試驗，但不可

為了增加細菌生長而延長培養時間，於培養期間應每日以手搖動促

進生長。

(3)加入兩滴無菌 0.2% potassium tellurite(若為 2.5 mL液體培養基只加

一滴)，搖動均勻混合，丟棄多餘 0.2% potassium tellurite不可再使用。

(4)再孵育於 35℃ 3日，此期間不可加以搖動。

(5)於第 3日，不可加以搖動，觀察試管底部的沉澱細菌細胞。

結果及判讀

陽性反應：於沉澱細菌細胞內及週圍產生黑色金屬 te1lurium沉澱。

陰性反應：無黑色金屬 tellurium 沉澱，若產生淡棕色或灰色況仍為陰

性反應。

注意事項

孵育於 35℃ 7日後，若生長不夠茂盛，應重新接種較多量菌落重新培

養，以避免產生有問題或偽陰性結果。

(十二) Thiophen-2-Carboxylic Acid Hydrazide(TCH)生長抑制試驗

試驗原理

本試驗適用於鑑別 M.bovis、M.tuberculosis及其它緩慢生長非產色菌群

分枝桿菌。 M.bovis對低濃度 TCH (1-5 µg/mL)具感受性，但M. bovis的 INH

抗藥性菌株則具耐受性。M. tuberculosis及其它緩慢生長非產色菌群分枝桿

菌能抵抗 TCH的抑制作用。

試驗方法

試劑配製

配製兩批完整Middlebrook 7Hl0培養基(如前述)，一批不加 TCH，另一

批加入最後濃度為 2μg/mL的適量 TCH，將培養基分裝入無菌附蓋試管或

四分格培養皿。

品管

試驗步驟

(1)取已培養 7 日的培養液以無菌蒸餾水或生理食鹽水稀釋 1:103及

1:105。

(2)取稀釋菌液 0.1 mL接種於含 TCH及不含 TCH之培養基。

(3)孵育於 35℃，l0% CO2三週。

結果及判讀

若生長於含 TCH培養基的菌落數(如 1:1000)大於或等於 1% 不含 TCH

培養基的菌落數(如 l:100000)，即表示對 TCH有耐受性。

(十三) Tween 8 0水解試驗

試驗原理

本試驗適用於緩慢生長的暗產色菌群及非產色菌群的致病性分枝桿菌

(陽性反應)與腐生菌(陰性反應)的鑑別。使用的培養基合 Tween 80， neutral

red及 pH 7緩衝溶液。正常狀況下 neutral red於 pH 7呈紅色，但是與脂肪

或 Tween 8 0結合時，呈琥珀色或稻草色並使酸鹼度偏鹼性，若細菌的脂解

酉每 (lipase) 水解 Tween 80 切開鍵結釋出 oleic acid 和 polyoxyethylated

sorbitol 後，neutral red於 pH 7下再呈紅色，為陽性反應。

試驗方法

試劑配製

0.067 M Phosphate buffer, pH 7.0

(1) 0.067 M Disodium phosphate：

取 9.47g Na2PO4溶解於 1000 mL蒸餾水。

(2) 0.067 M Monopotassium phosphate：

取 9.07 g KH2P04溶解於 1000 mL蒸餾水。

(3) 取(1) 61.1 mL+(2) 38.9 mL均勻混合。

基質培養基

取 l00 mL磷酸鹽緩衝液，加入 0.5 mL Tween 80，2 mL 0.1% neutral red

水溶液，分裝 2 mL於 16 x 125 mm附蓋試管，121℃，10分鐘高壓蒸氣滅

菌。高壓蒸氣滅菌之後，基質液應呈琥珀色或稻草色，可儲存於 5℃暗處兩

週。

品管

陽性品管：M.kansasii 。

陰性品管：M.bovis或 M.avium complex 。

試驗步驟

(1)取一接種匙生長活躍的菌落接種於基質液。

(2)孵育於 35℃。

(3)於第一、五、十日觀察，判讀時不可加以搖動。

結果及判讀

陽性反應：基質液呈粉紅至紅色，並記錄產生變色所需日數。

陰性反應：於十日孵育後仍呈琥珀色或稻草色。

注意事項

若沉澱的菌體於琥珀色液體中呈紅色，此現象應視為陰性反應。唯有

整個溶液變成紅色方為陽性反應，有時上清液於孵育時會退色，此時應重

檢，若結果相同仍視為陰性反應。

(十四) Urease試驗

試驗原理

本試驗為測試分枝桿菌水解尿素 (urea)的能力，適用於暗產色

菌群分枝桿菌及非產色菌群分枝桿菌的鑑別。M.scrofulaceum、M.szulgai、

M.flavescens、M.bovis、M.tuberculosis 等為陽性反應，M.avium complex、

M.xenopi、M.terrae complex、M.gordonae等為陰性反應。

試驗方法

1、Murphy-Hawkins紙綻法

試劑配製

取一片 urea differentiation disk置入含 0.5 mL蒸餾水的 13 x 100 mm

附蓋試管。

品管

陽性品管：M.scrofulaceum或 M.fortuitum。

陰性品管：M.gordonae。試劑品管：不含微生物只含試劑。

試驗步驟 (1)取一接種環生長活躍的菌落(約三週)接種於含尿素的基質液。 (2)孵育於 35℃ (3)於一小時後及連續三日每日觀察。

結果及判讀陽性反應：變為紅色至深紅色。陰性反應：不變色或淺粉紅色。

注意事項若試管不乾淨或紙碇品質不良時，反應結果會不正確，應作試劑

品管以確保品質。 2、Stesdham氏法:Texas urease試驗試劑配製

取 l g peptone，1g dextrose，5g NaC1， 0.4 g KH2PO4，20 g urea，1 mL 1% phenol red ， 0.1 mL Tween 80(或 l mL 10% Tween 80，溶解於1000 mL蒸餾水，以 NaOH溶液調整酸鹼度至 pH 5.8 ± 0.1，再以 0.22μm孔徑薄膜過濾滅菌，以無菌技術分裝 1.5 mL於 18 x 125 mm附蓋試管，緊蓋後可儲存於 5℃ 兩個月以上。品管陽性品管：M.scrofulaceum或 M.fortuitum。陰性品管：M.gordonae。試劑品管：不含微生物，只有試劑。

試驗步驟 (1)取一接種匙生長活躍的菌落(約三週)接種於含尿素的基質液。 (2)孵育於 35℃。 (3)於第一、三、七日觀察。

結果及判讀陽性反應：變為黃色、暗粉紅色至紅色。陰性反應：不變色。若反應呈淡粉紅色為陰性反應應重檢，亦可利用硝酸鹽還原試驗

的標準液比色。 3、Wyne氏法試劑配製取一份 Difco-Bacto urea agar concentrat e加九份蒸餾水，均勻混合，

(不可加入瓊脂)分裝 3 mL於無菌的 13 x 100 m m附蓋試管。品管陽性品管：M.scrofulaceum或 M.bovis。陰性品管：M.gordonae 。試劑品管：不含微生物只有試劑。

試驗步驟 (1)取一接種匙生長活躍的菌落(約三週)接種於含尿素的基質液。 (2)孵育於 35℃ (3)觀察顏色變化。

結果及判讀陽性反應：變為琥珀色，粉紅色至紅色。陰性反應：不變色。

表 1、非結核分枝桿菌中緩慢生長菌群與快速生長菌群之區別鑑定

表 2、結核菌群(M. tuberculosis 和 M. bovis) 與非結核分枝桿菌（NTM）

之區別鑑定

M. tuberculosis complex

M. tuberculosis M. bovis NTM

PNB培養基生長情形 - - +

NAP試驗 - - +

28℃培養基生長情形 - - +

68℃ catalase試驗 - - +

Nitrate還原試驗 + - ND

Niacin試驗 + - ND

Pyrazinamidase活性試驗 + - ND

TCH生長抑制試驗 + - ND

ND:not done

MacConkey 生長速率色素產生非結核分枝桿菌

(不含結晶紫) （7天）曝光暗處

快速生長菌群 + + 淺黃淺黃

緩慢生長菌群 - -

光產色菌黃淺黃

暗產色菌黃至橘黃至橘

非產色菌淺黃至黃淺黃至黃

圖 2A、臨床檢體常分離分枝桿菌之鑑定流程

接種百倍稀釋之待試菌液 0.1mL於 L-J培養基

28℃孵養 (-)

平滑、細小、穹狀菌落

M. avium complex(+) M. xenopi(-)

M. scrofulaceum

M. xenopi

緩慢生長菌群

生長速度 >7days

暗產色菌群

黃、橘色

曝光 24 小時

Tween 80 水解(-)

光產色菌群黃色

粗糙、蠟色、乾燥菌落 NAP test(-), PNB test(-) ↓ M. tuberculosis complex ↓ Niacin and NO3 reduction

M. kansasii (+) M. marinum (-)

M. bovis M. tuberculosis

非產色菌群

無色

NO3 還原 (-)

Tween 80 水解

PNB培養基生長 NAP培養基生長 28℃ 培養基生長 68℃ catalase試驗

NO3 還原 , 68℃ catalase M. gordonae

快速生長菌群

生長速度< 7days 圖 2B

(-) (+)

(+) (-)

Tween 80 水解(+)

M. kansasii(3 日) M. marinum(7 日)

(+) (-) ) (-)

圖 2B、臨床檢體常分離分枝桿菌之鑑定流程

接種百倍稀釋之待試菌液 0.1mL於 L-J培養基

快速生長菌生長速度 < 7days

無色素（非產色菌）

3 日 arysulfatase (+), MacConkey 上發育無結晶紫

M. fortuitum-chelonae complex

NO3 還原

(+) (-)

42℃生長, 5% NaCl 耐性

M. fortuitum

(+) (-)

M. abscessus M. chelonae

緩慢生長菌生長速度>7days 圖 2A

表四、Distinctive properties of cultivable mycobacteria encountered in clinical specimensa

Descriptive term Species Optimal

temp (ºC)

Usual colony morphologyb

Pigmen-Tationc

Niacin Growth on

T2H (10μg/mL)

Nitrate reduction

Semi-quantitative catalase

（mm of bubbles） Slow growers TB complex Nonchromogens Chromogens Rapid growers Nonchromogens Chromogens

M.tuberculosis M.africanum M.bovis M.bovis BCG M.canettii M.avium M.intracellulare M.haemophilume M.malmoense M.shimoidei M.genavense M.celatum M.ulcerans M.terrae complex M.triviale M.gastri M.branderi M.heidelbergense M.triplex M.kansasii M.marinum M.avium M.intracellulare M.simiae M.asiaticum M.xenopi M.gordonae M.scrofulaceum M.szulgai M.flavescens M.intermedium M.lentiflavum M.interjectum M.bohemicum M.conspicuum M.tusciae M.heckeshornense M.fortuitum grouph M.septicum M.chelonae M.senegalense M.abscessus M.immunogenum M.mucogenicum M.smegmatis M.wolinskyi M.goodii M.mageritense M.phlei M.vaccae

37 37 37 37 37

35-37 35-37

30 30 37 37 35 30 35 37 35 35 35 35

35-37 35-37

37 37 42 37 37 37 37 35 35 35

37-40 30 30 35

28-30 28-35 28-30

30 28-30 30-35 28-30 28-35 28-35 28-35 30-37

R R Rt R

Sm Smt/R Smt/R

R Sm R

Smt Sm/ Smt

R Sm/R

R Sm/SR/R

Sm Sm Sm

Sm/SR/R Sm/SR/R

Sm/R Sm/R Sm Sm Sm Sm Sm

Sm or R Sm Sm Sm Sm Sm Sm R

Sm R/Sm

R Sm/R

R Sm/R R/Sm Sm

Sm/R Sm

Sm/R Sm R

N(100)

N N(100)

N N N N N

N(88) N N

N(100) N

N(93) N(100) N(100) N(100) N(100) N(100)

P(100) S S

P(90) P(86) N/Sg S(99) S(97)

S/P(93) S(100) g

P P S S S S S

N(100) N(100) N(100)

N N(100) N(100) N(100) LS(95) N(100) LS(78) N(100)

V –(4)

– + – –

ND – (0) – – – –

– (1) – (0) – (0)

– –

– (0)

– (4) –/+ (21)

– –

± (63) – (0)

– – (0) – (0) – (0) – (0)

– –

– – – –

–/+ – – – – – – –

ND – –

+ V – – + + + + + + + + + + + +

+(100)

+ + + + + + + + + + +

ND ND ND ND + +

ND ND ND ND +

ND ND ND + +

V –(9)

– + – – –

– (1) – –

– (0) –

±(67) + (89) – (0)

– –

+ (100)

+ (99) – (0)

– –

– (28) – (5)

– – (1) – (5)

+ (100) + (92)

– – – – – + –

+ (100) +

– (1) + –

– (100) V

+ (95) + (100) + (100) + (70)

< 45(89)

<45 <45(69)

<45 ND <45 <45 <45

<45(99) <45 <45

<45(100) <45

>45(93) >45(100) <45(100)

– –

>45(100)

>45(93) <45 <45 <45

>45(93) >45(95)

<45 >45(90) >45(84) >45(98) >45(94)

ND ±V V –

<45 – –

>45(93) ND

>45(92) ND >45 ND >45

<45(87) <45(89) <45(50)

ND >45 >45

a Modified from references 63 and 75. Plus amd minus signs indicate the presence and absence, respectively;of the feature; V, variable; ±, usually present; –/+, usually absent; ND = not determined. Ref no. reference number. The Percentage of strains positive in each test is given in parentheses, and the test result is based on these percentages. b R, rough ; Sm, smooth; SR, intermediate in toughness; t, thin or transparent; f, filamentous extensions;Smt, smooth and transparent; Rt, rough and thin, or transparent; LS, late scoto (7 to 10 days) on 7H10 agar. c P, photochromogenic; S, scotochromogenic;N, nonchromogenic (M.szulgai is scotochromogenic at 37ºC and photochromogenic at 24ºC) ( 表 4 為美國微生物學會所出版之「臨床微生物學手冊」2003 年, 第八版中所列有關臨床檢體可培養之分枝桿菌之特性，可供參考。)

d Probe identifies M.tuberculosis complex. e Requires hemin as growth factor. f Atylsulfatase teaction at 14 days is positive; number in parenthcses = day. g Young cultures may be nonchromogenic or possess only pale pigment that may intensify with age. h Includes M.fortuicum,M.peregrinum, and M.fortuicum third biovariant complex. i Results for 3–day arylsulfatase not available; 10–day arylsulfatase positive. j Results for 3–day arylsulfatase not available; 10–day arylsulfatase negative. Kmac nucleic acid probe that recognizes M.avium,M.intracellulare,and the“X”strains is commercially available.

Catalase

hydrolysis

Tellurite

reduction

Tolerance

To 5% NaCl

Uptake

Aryl-sulfatase,

3 days

16s rDNA

Ref.no.

Urease Pyrazin-amidase,

Nucleic acid probes

available

–(1) –

–(2) – – ± ± –

–/+ – +

+(100) +

+(92) +(100) –(11)

+(100)

+(91) –(30)

+(95) +(95) +/–

+(96) +(94) +(93)

+(100) +

±(V) + +

–(100)

+ +(90) ND

±(53) ND ND ND

–(12) –(0)

–/+(100) –(7) –(0)

±(68)

– –(21)

± – – – –

+(99) + +

–(0) –

+(99) +(100) +(100)

–(0)

+(99) +(97)

– –

–(9) +(95) +(97)

+(100) –(2)

–/+(49) +(100)

+ – – – +

+(10d) –

–/+(43) ND

–/+(39) ND V

ND + +

–(100) + +

±(36)

– ND ND ND + + –

+(74) ND ND

+(100) ND

–/+(46) –(25) ±(50) ND –

–/+(31) –/+(39)

+(82) –(20) ND

–(29) ±(64) ±(53)

–/+(44) ND ND ND ND –

+(92) ND

+(89) +

ND ND – +

ND ND ND + +

–(0)

– –(0)

– ND – – –

–(0) –

ND –(0)

– –(2)

+(100) –(0) ND – –

–(0) –(0)

– –

–(0) –(0) –(0) –(0) –(0) –(0)

±(62) ND ND ND – – – –

+(85) + V + ± – –

+(100) +(100) +(88) +(80)

– – – –

ND – – – – – –

–(0) ND – – –

ND ND ND

– – – – – – – – – – –

ND ND ND ND ND ND ND + + – – –

–(100) Tan

+(67) + +

+(40) + +

–(0)

– –(0)

– – – – –

–(0) – –

+(100) –

–(2) ±(56) –(0) –f –

–(0) +(50)f –(0)

–/+(41)f – –

–(0) –(0)

+ V V V

–(0) +i –i V –i

+i –f –

+(97) V

+(95) + +

+(100) +(84) –(5) –(5) –(0)

+(80) – –

X58890 IDEM IDEM IDEM IDEM

X52198 X52927 X88923 X52930

AJ005005 X60070

L08170,L08169 X58954

X52925(M.terrae) X88924 X52919 X82234 X70960 U57632

X15916 X52920 X52198 X52927 X52931 X55604 X52929 X52923 X52924 X52926 X52932 X67847

AF317658 X70961 U84502 X88922

AF058299 AF174290

X52921 AF111809 X82236 M29567 X82235

AJ011771 X80771 X52922 Y12871 Y12872 X99838 M29566 X55601

±(64)

+ ±(50)

+ ND – – –

–(9) – +

–(0) V

–(13) –/+(33) –/+(44)

+(100)

–/+(49) +(83)

– –

±(69) –(10)

– V(31) V(31) +(72) +(72)

+/–(V) ND +

weak – + –

+(70) ND

+(89) + +

ND ND ND

+(60) ND ND

+ – – – + + + + + + +

+(100) – V V – + +

– + + + + –

ND –/+ ± + + –

±(V) + – –

ND – +

ND ND ND ND ND ND ND

+(100) ND ND

– – – – – – – – – – – –

+ – + + – – – + – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – –

第六章分枝桿菌的藥物感受性試驗

前言結核菌(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)的藥物感受性試

驗，主要有三個目的：1)決定最初的用藥選擇。2)確定抗藥性的發生，而選

擇進一步的用藥。3)估計社區內抗藥性原發與後天的感染率。結核菌的藥物

感受性試驗，必須對於所有病人，初次分離到的菌株都做。而且，當病人

接受治療後 3 個月仍呈現陽性培養，或臨床證據顯示治療反應失敗，則藥

物感受性試驗需要重覆進行。為了確保在最快時間內得知抗藥性的偵測，

快速的藥物感受性試驗需與快速的培養和鑑定結合。因此，對大部份分離

菌株，藥物感受性試驗結果，需要在收取檢體 28天內提出報告。

有別於結核菌，非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)的

藥物感受性試驗僅需考慮於臨床重要分離菌株。例行的藥物感受性試驗對

此菌是不予推薦的。為了確定從呼吸道培養出 NTM的臨床重要性，美國胸

腔協會(ATS)建議以下標準：�三次培養陽性、抹片抗酸性染色陰性；或�

兩次培養陽性和一次抹片陽性，足以確認臨床的重要性；或者�有一次支氣

管的沖洗液培養陽性，或�抗酸性染色 ≥ 2+也足夠建立臨床重要性。此外，

從一般無菌的檢體，如血液、腦脊髓液或組織分離出者都被認為有臨床重

要性。目前，足夠的資料支持對於快速生長的分枝桿菌(Mycobacterium

fortuitum group, M. abscessus, M. chelonae)；M. avium complex, 和 M,

kansasii，有暫時性的藥物感受性試驗方法。

一、結核菌的藥物感受性試驗介紹

目前檢驗MTBC，即M. tuberculosis， M. bovis， M. africanum， M.

microti， M. canetti的藥物感受性試驗是依據 Canetti等人所建立的標準方

法比例法(proportion method)。此比例法被全球性地使用。多年來，此比例

法（以Middlebrook 7H10 Aga r為基質）在美國被認定為標準測試方法。

瓊脂比例法(agar proportion method)和放射計量方法(radiometric method)

的抗藥性定義為大於 1％的細菌出現在抗結核菌的藥物臨界濃度中。此抗藥

物的臨界濃度，經國際組織採用，代表未層暴露在藥物實驗下的 95％廣泛

分枝桿菌的藥物感受性試驗

結核菌菌株。當用來測試的臨床分離菌株生長超過 1％，則該藥物即將不予

繼續當作抗結核治療藥物。使用第一線的抗結核菌藥物(isoniazid， rifampin，

ethambutol 和 pyrazinamide) ，體外試驗結果與臨床的結核菌病人有效度有

好的關連性。第二線抗結核菌藥物的資訊就相當有限。對於大部份緩慢生

長的非結核分枝桿菌的臨床與體外試驗結果，關連性也少有報告。當然也

有少數例外，如測試M. kansasii對 rifampicin的感受性， M. avium complex

對 clarithromycin的感受性在臨床上的效用有很好的關連性。

測試結核菌藥物感受性的第一線藥包括 isoniazid (INH)兩個濃度（臨界

濃度和高濃度）、rifampin (RIF)，ethambutol (EMB) 和 pyrazinamide (PZA)。

MTBC菌株僅對 INH產生抗藥性時，不必再做第二線藥物的測試。當

結核菌分離菌株對 RIF 或任何兩種第一線藥物產生抗藥性時，一系列完整

的藥物感受性試驗，包括所有第二線藥物，增加高濃度的第一線藥物需進

行。

瓊脂比例法結核菌在含藥的培養基生長菌落數比在不含藥的培養基生長菌落數超

過 1％，即代表對該藥產生抗藥性。不含藥的培養基菌落數(colony-forming

units, CFU)必須是分開，可數的。建議用 7H10瓊脂培養基，7H11瓊脂培養

基有利於 INH 抗藥性的結核菌生長，是可接受的變通。用 7H11 的實驗室

應注意某些藥需不同的濃度。

藥物藥品應有標簽記錄藥名，效力（通常以 (μg) /mg來表示），以及有效

期。且藥物保存在原廠建議的方式或在-20℃或在乾燥器（最好是真空）保

存。將乾燥器從冰箱取出後，最好先回室溫才打開（避免水氣凝集）

稱重體積 (mL) × 濃度 (μg/mL)

�重量(mg)＝─────────────

分析的效力 (μg/mg)

重量 (mg) × 分析效力 (μg/mg)

�體積(mL)＝───────────────

濃度 (μg/mL)

例如：準備 100 mL的保存液含 1,280μg/mL的抗生素用 750μg/mg效力的

藥（如 streptomycin），如果最後稱重是 182.6 mg，那麼最終稀釋的體

積是

(182.6 mg) (重量) × (750μg/mg) (效力)

體積(mL)＝───────────────────

(1,280μg/mL) (需要的濃度)

＝107.0 (mL)

抗結核菌藥物的濃度與選擇 (Middlebrook 7H10 and 7H11 瓊脂培養基)

濃度 (μg/mL)

一線藥 7H10 agar 7H11 agar

0.2 0.2 INH

1.0 1.0

RIF 1.0 1.0

5.0 7.5 Ethambutol hydrochloride

Pyrazinamide 不建議不建議

二線藥

Capreomycin 10.0 10.0

Ethionamide 5.0 10.0

Kanamycin (amikacin) 5.0 6.0

Ofloxacin 2.0 2.0

p-Aminosalicylic acid 2.0 8.0

0.5 0.5 Rifabutin

（1-2）（1-2）

2.0 2.0 Streptomycin

10.0 10.0

二、兩種配製藥物培養基的方法: 瓊脂稀釋法和紙錠浸出法

瓊脂稀釋法，將藥溶入瓊脂中，有一格不加藥當對照組每格倒 5 mL培

養液，（應含 10％ OADC），讓瓊脂厚度約 3-4 mm，使用瓊脂應完全乾，

如置於放生物安全操作櫃數小時或隔夜更好，瓊脂表面乾後，立刻用，或

置入有封口的塑膠袋 4到 8℃，勿超過 28天，避免光照。

紙錠浸出法，先將 5 mL不含藥的 7H10 agar倒入四分格培養皿中，再

投入含固定劑量的抗結核菌藥物紙錠，讓紙錠中的藥浸出到瓊脂中，得到

所需的最終濃度培養基。紙錠儘量放入瓊脂中央位置。每一四分格應確實

分裝 5 mL的培養液，以達到正確的最終藥物濃度。

三、間接藥物感受性試驗以培養分離出的菌株，調製標準的接種量，用瓊脂比例法測試。接種

菌落必須新鮮，勿超過 4∼5星期老的菌落，小心取，勿刮到培養基。儘可

能用原始培養的菌落，勿用次培養的菌落。菌株置入含有 6-10顆塑膠珠，

3-5 mL Tween-albumin液態培養基或者Middlebrook 7H9，之有蓋無菌(16×

125 mm)試管子中。充份震盪 1到 2分鐘，勿生氣泡。管子放置 30分鐘讓

大顆粒沈降，與減少可能產生的氣霧(aerosol)。上清液吸到另一支無菌管，

並用肉湯（如 7H9）調濃度到Mc Farland 1的標準值。

培養基的接種和培養準備10-2和10-4的標準懸浮液的稀釋濃度，用Tween-albumin肉湯， 7H9

或無菌的生理食鹽水，或無菌的水都可。接種 0.1 mL的 10-2稀釋液到對照

組的四分格，以及含藥的其他四分格各種 0.1 mL（此量也可以 3滴的量來

做）。同樣做法，再種一組 10-4稀釋液。如果菌落太老或生長不足夠，可以

用較低稀釋倍數(如 1:10，1:1000)或者直接做肉湯取菌的次培養。肉湯次培

養的製作，是從固態培養基取菌，種到肉湯中，放 37 ± 1℃每天用手搖，

直到濃度達到McFarland 1.0的標準。接種好的平板放室溫，直到接種菌液

吸入瓊脂中（亦即點變乾）。將各平板分別封入 CO2可通透的塑膠袋中。培

養時，培養基那邊在下面，在 37 ± 1℃，5 到 10％ CO2培養。在提高環

境中 CO2對抗結核藥物效力並沒有影響，反而會使菌落長得更大。平板培

養過程，應防光照。

小心地觀察平板，可用低倍顯微鏡幫助。每星期觀察，勿超過 3 星期

才觀察。若對照組的菌落已長成熟，則抗藥性試驗結果可以提早在 3 週報

告。但是，若感受性的結果應該觀察到第 3 個星期，則要觀察 10-2或 10-4

稀釋液接種的培養平板上何者的對照組菌落是可數的結果。

判讀對每一個測試的藥，報告上必須包括測試的藥名，臨床有用的解釋如

〝感受性〞Susceptible，〝抗藥性〞resistant或〝邊界值〞boderline，邊界值

只用於 PZA。如果實驗室要報告藥物測試的濃度，也應該註明所使用的培

養基或者所使用測試的方法，而且註明所測試相當於參考方法(Equivalent

Reference Method)的濃度。

藥物濃度

(μg/mL) 方法

抗藥性判讀

Isoniazid 0.2 瓊脂比例法 0 感受性

藥物濃度

(μg/mL) 方法判讀

Isoniazid 0.2 瓊脂比例法抗藥性

Isoniazid 1.0 瓊脂比例法感受性

藥物濃度

(μg/mL) 方法

抗藥性判讀

Isoniazid 0.2 瓊脂比例法 20 抗藥性

Isoniazid 1.0 瓊脂比例法 0 感受性

以兩種 INH 的濃度測試，而對低濃度產生抗藥性，對高濃度是感受性

時，此結果，指出對 INH 低濃度抗性，甚至有些證明指出，病人感染此一

INH抗性的菌株，如能持續 INH治療，還能從中得到好處。

以下是一些情況以及報告的幾種選擇。

在 7H10瓊脂平板的判讀每四分格生長的量記錄如下：

>500 菌落 4+

200-500菌落 3+

100-200菌落 2+

50-100菌落 1+

<50菌落計錄實際菌落數

1、兩組對照組中至少一組應可計數的菌落數（至少 50個），否則結果無

效。

2、如果對照組已長 3+或 4+，而含藥的四分格沒有長，則可以報此藥是

感受性的。

3、有研究報告指出，大部份的菌株，用瓊脂比例法做 EMB 的感受性試

驗會出現微小菌落(microcolonies) ，因為微小菌落在不同的實驗室可

能會改變，每個實驗室應決定如何來報告。

4、第一星期（7 天）判讀是否有污染的細菌或黴菌或任何快速生長的分

枝桿菌。甚至緩慢生長的分枝桿菌也可能在 2星期的培養出現。感受

性結果不能在此時報告有效，因為有些較具抗藥的菌株，比有效的菌

株長得慢。除非抗藥的菌株在 2星期已出現，可報抗藥性。最後判讀

的時間在培養後 3星期。如果對照組在 3星期仍未長，則再培養 3星

期，成 6星期時間。當對照組有長足夠量時，只能報有效的藥

在含藥的四分格的菌落數

抗藥性％＝──────────────────×100％

在不含藥的四分格之菌落數(對照組)

例一

生長

藥物/濃度 10-2 10-4 %抗藥

對照組 4+ 50菌落－

Isoniazid (0.2 μg/mL) 2+ 10菌落 10

Rifampin (1.0 μg/mL) 0 0菌落 0

Ethambutol (50 μg/mL) 0 0菌落 0

抗藥性%＝───×100％＝10％ 100

例二

生長

藥物/濃度 10-2 10-4 %抗藥

對照組 4+ 100 菌落－

Isoniazid (0.2 μg/mL) 100 菌落 0菌落 2

Rifampin (1.0 μg/mL) 0 0菌落 0

Ethambutol (50 μg/mL) 0 0菌落 0

對照組在稀釋 10-4長 50個菌落，則在稀釋 10-2，應是 50 × 102個菌

落（因 10-2為 10-4的 100倍），所以在稀釋 10-2對照組為 5000個菌落 INH

(0.2) 長 100菌落 100 INH抗藥性%＝────×100％＝2％ 5000

例三

生長

藥物/濃度 10-2 10-4 %抗藥

對照組 l 4+ 50菌落－

Isoniazid (0.2 μg/mL) 2+ >1

Isoniazid (1.0 μg/mL) 0 0

Rifampin (1.0 μg/mL) 0 0

Ethambutol (50 μg/mL) 25菌落 <1

100~200 INH (0.2) R%＝───── × 100％ ≥1％

50×102

25 EMB (5.0) R%＝──── × 100％ ≤1％ 50×102

四、直接藥物感受性試驗原理是已消化去污染而經濃縮的痰檢體，若抗酸性染色是陽性，可直

接取此檢體做藥物感受性試驗，來決定病人體內結核菌抗藥情形。此試驗

只用於抹片是陽性的檢體，而且是用瓊脂比例法。好處是針對主要是抹片

陽性的檢體，從實驗室收到檢體到發感受性試驗報告，可在 3星期內完成。

抗藥菌株的比例更能表現病人菌株的群數。因為無法確實地控制接種的含

菌量，所以有可能比對照組長得過多，或長得不足的結果。也可能污染，

而使結果無法判讀。這個方法，只有用於結核菌或 M. kansasii菌，而且用

於試驗 RIF藥才用。

此直接藥物感受性試驗方法，整個的失敗率為 10-15％或以上，所以

經常要用間接法試驗。

直接藥物感受性試驗是用 7H10 或 7H11 瓊脂。要用多少含藥平板，

決定於僅測第一線藥或第一線第二線藥都要測。檢體經過消化，去污染處

理，且確定是抗酸菌抹片陽性後，痰檢體，即可接種到不含藥(對照組)以及

含藥的四分格培養基。接種量主要是看螢光染色的抗酸菌數來決定。

直接藥物感受性試驗之稀釋倍數

抗藥性數目/每 200倍至 400倍觀察:

螢光染色稀釋

<25 未稀釋

25-50 未稀釋，1:10

50-250 未稀釋，1:100

>250 1:10，1:1000

每一四分格接種 0.1 mL的檢體量，除非螢光染色每視野看到小於 5個

AFB即增加接種量到 0.2 mL。判讀時，在顯微鏡下，直接觀察平板的菌落

而不用取下塑膠袋。在第 1，第 2，第 3 和第 6 週判讀培養結果。第 1、2

週的結果記錄到工作單，但不要報告。這個步驟用意是要檢查是否有污染，

以及決定對照組長的菌量是否足夠。通常污染，以及對照組長的菌量不足

夠，是導致直接試驗法失敗的原因。此時，（在第 2 週後），可以從原始培

養基取菌，來繼續做間接法的藥物感受性試驗。

報告和判讀結果在 3 星期培養後報告。有些菌株在 3 星期培養仍不長或長不好，

此時，可再放進去培養到第 6 個星期，當對照組長好，而含藥的四分格沒

有長，則可報對此藥感受性，但如果是抗藥性則不能報告。因為，延長時

間的培養可能是抗生素 partial degradation的結果。

品管品管目標是監測藥物感受性試驗操作流程，試藥的表現，操作者所作

的試驗，以及判讀的正確性品管。此目標，可藉由選擇使用基因穩定性和

在被控制特別方法下，實用性的參考菌株而達到。

選擇參考菌株結核菌的藥物感受性試驗的品管，應包括一株對所測試的抗生素都是

完全感受性的菌株。H37Rv (ATCC 27294) 結核菌很適合當〝全感受〞

(〝pan-susceptible〞)的品管菌株且有文獻記載。相反地，結核菌 H37Ra，

也可以是選擇。一些觀察者建議，實驗應考慮再同時試驗一株抗藥性的菌

株。特別是對臨界濃度和高濃度的 INH，如果可以再測一株對 INH低濃度

呈抗藥性，而對高濃度呈感受性的結核菌或 NTM。然而，那一菌株可以用

來操作此目的，尚未清楚。參考菌株的保存，應在一個儘可能降低因為連

續次培養而發生突變的情況下保存。保存菌株的小玻璃瓶懸浮液，可由固

態或液態培養製得，並分裝成幾個小瓶後冷凍在-70℃。

第七章培養結果的報告

分枝桿菌實驗室必須建立一套標準的培養結果報告。檢驗報告內容必

須讓所有醫護專業人員能充份瞭解分離出的分枝桿菌之特性，臨床醫師或

相關公衛人員可以根據報告內容進行必要的防治措施，給予病人適當的隔

離與藥物治療。

結核菌生長較緩慢，八至十天的培養只能出現極少量的結核菌菌落，

一般都需要四至八個星期的時間才能觀察到大量的結核菌長成。各種結核

菌檢驗報告所需時間(Turnaround Time)與流程，請參考圖一。

一、完整的傳統結核菌培養結果報告必須包含： (1)菌株培養的溫度：孵育出可見菌落所採用的溫度。

(2)菌落生長的速度：將初次分離之新生菌落接種到新的培養基至長出可見

菌落所需的天數。快速生長之菌種約七天即可見到菌落。

(3)初次分離菌落的數量：生長在固態培養基之菌落數量。

報告菌落數量可參考下表：

(4)產色性：會產生顏色變化之分枝桿菌可初部報告為非結核分枝桿菌

(nontuberculous mycobacteria, NTM)。

A.光產色菌(Photochromogens)：在暗室下培養菌落顏色(白色、乳白色、淡

黃色)不變，但曝光後產生黃色或橙色變化。

B.暗產色菌(Scotochromogens)：菌落顏色不受光線影響。

C.非產色菌(Nonphotochromogens)：菌落顏色呈淡粉紅色或淡黃色，且不受

光線影響。

(5)菌落形態：可根據菌落形態做出初步報告。

觀察結果報告方式

無可見菌落無結核菌生長

小於50菌落實際菌落數

50-100菌落 1+

100-200 菌落 2+

200-500 菌落(經常會融合在一起) 3+

大於 500 菌落(融合在一起) 4+

培養結果的報告

A.表面：平滑、粗糙、索狀、”X”菌落(“X” colony; Mycobacterium xenopi 所

特有，菌落較為密實、平滑至粗糙、生長緩慢，以光線照射可看

到細小棒狀突出結構)。

B.形狀：扁平、凸起、錐形、中央隆起、葉狀、甜甜圈狀。

C.邊緣：完整、不規則、扁平、擴散。

D.透明度：透明、半透明、不透明。

E.產色：無色、有色(註明菌落顏色)

F.生長狀況：

a.優生型(Eugonic)：菌落茂盛。

b.劣生型(Dysgonic)：菌落細小，不易觀察。

培養期間每週應觀察檢體一次，如果有菌落生長或長出類似分枝桿菌

之菌落，必須立即進行菌種鑑定。若觀察八週仍無菌落生長，可報告〝未

長菌〞。若發現有其他細菌過度生長時，應報告〝檢體污染〞。培養結果

的報告必須包含定性(如陽性或陰性)及定量(如菌落數量)結果。每件檢體之

平均菌落數量必須確實記錄在報告表單中。雖然在結核病高盛行區，大於

85%之分枝桿菌屬結核菌，但若培養方法偏重結核菌的生長(如過度的去污

染處理)，也可能會相對減少其他分枝桿菌的生長，而影響診斷的正確性。

因此，培養結果的報告必須確實記錄檢驗作業所使用的培養基，生長環境

與條件(如溫度、營養添加物等)，建議以下列方式報告培養結果：

(檢體種類)，(L-J/ Middlebrook 7H9/7H10/7H11)培養基，長出(菌落數)

分枝桿菌，具(產色)特性。

結核分枝桿菌培養報告範例

□ 未長菌 □ 檢體污染

菌種鑑定結果

□ M. tuberculosis complex □____________________________

□ Photochromogen 光產色菌 □ Non-Photochromogen 非產色菌

□ M. kansasii □ MAIS

□ M. marinum □ MAI complex

□ ________________________ □ M. terrae complex

□ M. xenopi

□ Scotochromogen 暗產色菌 □ M. trivale

□ M. scrofulaceum □ Unclassified

□ M. gordonae □ __________________________

□ M. szulgai

□ Unclassified □ Rapid Growers 快速生長菌

□ M. fortuitum.

□ M. chelonae

□ M. abscessus

□ Unclassified

二、自動偵測結核菌液態快速培養系統(BACTEC MGIT 960 系統) 結

果之報告

由於分枝桿菌的生長週期長(全部過程需要耗時期-3 個月)、陽性檢出

率低、不易標準化等缺點，致使常規細菌學檢查方法不具時效性，無法充

分滿足臨床診斷的需要。最近 20 年來，由 BD 公司研製之全自動分枝桿菌

培養鑑定儀(BACTEC 460TMTB)，具有操作簡單、自動化強、靈敏、快速

等優點。雖然這項技術己被公認為分枝桿菌快速培養與鑑定藥物試驗的國

際標準方法，但因存在放射性廢棄物環境污染的問題，至今仍未被廣泛使

用。因此，BD 公司於 1996 年又研製推出了大容量、安全、快速、全自動

分枝桿菌培養、檢測、藥敏系統-BACTEC MGIT 960 系統，採用連續螢光

探測法，避免了放射性元素對環境的污染。

(1) BACTEC MGIT 960 系統檢測原理：使用 BBL MGIT 分枝桿菌快速培養管，在MGIT Middlebrook 7H9 培

養基底部矽酮樹脂內包埋對氧氣濃度高度敏感的螢光指示劑，若培養管內

接種的標本中有分枝桿菌生長，培養管內的氧氣將被消耗，管底的螢光指

示劑將在內置紫外激發光的照射下發出螢光，螢光強度變化直接反映培養

管內分枝桿菌生長狀態。

(2) BACTEC MGIT 960 系統的操作流程：使用條碼掃描器僅需 4 步簡單的操作就可完成培養、藥敏試驗整個工

作流程。

第一步：選擇操作項

第二步：掃描培養管

第三步：將培養管放入綠色指示燈亮的測試孔內

第四步：當出現陽性或陰性結果，掃描取出對應的培養管

BACTEC TM MGITTM 960 系統檢測出陽性樣本會立即以聲音和光

的信號報警，測試孔指示燈會發出紅光以指示位置。

(3) BACTEC MGIT 960 系統培養報告： BACTEC MGIT 960 螢光強度記憶探測器每隔 60 分鐘連續自動測定

培養管內螢光強度的變化，經過電腦處理系統分析後，判斷管內分枝桿菌

的生長情況。當螢光強度呈現加速度變化時，系統將以生長單位「GU」形

式報告該標本為陽性，利於快速早期發現分枝桿菌生長狀況，使陽性標本

檢出時間縮短至 3-6 天。系統內置實驗標準管，每小時自動進行一次管控，

自動化程度高。陽性培養管可立即取出進行塗片和抗酸性染色，以確定是

否為分枝桿菌，並將菌株懸浮液稀釋後，接種於預先配製好的含有藥物敏

感驗所需之標準藥物濃度的MGITTM 培養管，及空白對照MGITTM 培養

管內（二者菌液濃度比便為 100：1）進行培養。根據分枝桿菌的生長情況

對比，判斷該藥物之敏感性。根據 NAP、PNB（對硝基苯甲酸）及 TCH（噻

吩-2-羧酸月井）的藥敏試驗結果可進行分枝桿菌菌種的初步鑑定。此外，為

了適合樣本量小的用戶的需求，BD 公司還推出了 BBL/MGIT 手工螢光判

讀器，它可以直接判斷培養結果，內含定標管，操作簡單快捷。由於其設

計精巧，便於攜帶，使其更適合異地考察，進行流行病學調查等工作的需

要。由於 MGIT 液態檢驗系統的設備成本實在太高，目前國內僅有少數的

醫學中心具有此項設備。結語

由於分枝桿菌生長緩慢，往往需要數週甚至數月才能得到完整的結

果，所以檢驗室應配合需要發出階段性報告，如接受檢體當日內應發出抹

片檢查報告，約七至十天發出檢體污染的報告以利重檢。六至十二週期間

每週觀察培養基一次，約三至四週發出已分離出來之菌落報告，同時立即

完成藥物敏感試驗，儘速發出藥敏結果。最後再發出菌種鑑定結果。

培養檢驗作業流程冗長且複雜，無法將所有結果記錄在發出的報告單

上，但仍應將各種試驗結果詳細記錄在實驗室內部之實驗工作清單，放置

在實驗室中以便隨時備查。工作清單內容應包含：生長速度(快速/緩慢)、

分離菌菌落數量、菌落產色性(無變色/產色及顏色變化)、菌落形狀(粗糙/

平滑/發亮/平淡)、及其他鑑定方法的結果。

（圖一）各種結核菌檢驗報告所需時間（Turnaroound Time）與流程

S pecim en C ollection

Transport to Labora tory30 m in (O ptim al)24 h r(M axim al)

D irect, N onsta in ingP CRTubercu lostearic A cid

Detection

D irect, S ta in ingZ ieh l-N ee lsenF luorescen t

R eport by Te lephone< 24 h r

P ositive S m ear

C u ltu re

B A CTE C5-14 D

S E PT I-C HE K7-21 D

C O N V E NTIO N A L3-4 W K

B A CTE C7-28 D

S E PT I-C HE K7-28 D

N egative S m ear

C u ltu re

Iden tifica tion

N AP2-5 D

P RO B E2-4 hr

H PLC2-4 hr

Ind irec t susceptib ility

B A CTE C4-7 D

D irect suscep tib ility

第八章分枝桿菌實驗室的品管

實驗室品管是所有工作人員的責任，因為品管為實驗室結果再現性及

可靠性的依據，品管計畫應實際可行且運用時所有品管作業能符合需求，

一設計良好適當的品管計畫除了能維持試驗的品質，確保報告正確性外，

更能減少實驗過程中因試劑、檢體等產生的問題，並防止儀器或設備發生

嚴重的損壞或花費。

一、一般注意事項 1、所有品管相關記錄均需保存兩年以上。 2、實驗室應具備所有相關試驗操作步驟的操作手冊，若有更新記錄應

隨時記錄。 3、所有培養基、染液、試劑均應標示收貨及使用日期，所有材料均應

定期檢查，若為污染或失效應立即丟棄，最好能保持六個月庫存量。 4、所有採用的相關試驗操作步驟的均應為已發表於參考書，操作手冊

或文獻的方法，若採用的方法為未經發表者，應具備完整品管資料

及與相關文獻方法的比較結果，並即將發表於文獻者才能採用。 5、實驗室應備有從事品管計畫所需的標準菌種。二、實驗室的設置及人員 1、各種儀器，設備及工作區域的安排設計需能符合作業流程，工作區

域應保持清潔，桌椅每日以適當消毒劑擦拭清潔。 2、分枝桿菌實驗室的工作人員應定期接受胸部 X 光檢查或結核菌素

皮內試驗。三、實驗室設備的品管

實驗室的儀器或設備均應定期檢測，以確保使用時能維持準確與精

確，常見者如下: 1、高壓蒸氣消毒鍋應記錄每次操作的溫度及壓力並作成檔案，至少每月要測試儀

器的滅菌效果一次。

分枝桿菌實驗室的品管

2、生物安全操作櫃定期以流量計檢測操作櫃正面及排氣口的氣流是否符合要

求，於初次裝置或移動生物安全操作櫃時，應測試儀器氣流方向是

否正常，若所測定的氣流流速不正常應將整個操作櫃消毒後更換濾

片。紫外線殺菌燈能殺死操作櫃內懸浮的細菌，使用 100 小時或六

個月後，應檢測其強度，若降低至 70% 時應予更換，每兩週應以

酒精綿擦拭燈管以確保殺菌效果，操作櫃表面亦需以適當消毒劑清

潔擦拭。 3、離心機定期檢測離心機的轉速，每六個月應檢查碳刷，選用的離心機

需能提供 3000 x g 離心力者，因為若離心力不足，將可能需延長

離心時間造成離心機溫度升高而殺死檢體內的分枝桿菌。 4、35℃培養箱使用溫度計錄器或每日定時記錄培養箱的溫度，同時應避免培

養箱內有光線照射。 5、二氧化碳每日記錄培養箱二氧化碳的濃度。 6、顯微鏡於觀察到陽性塗片後應立即清潔油鏡，顯微鏡使用後應予以清

潔並蓋上防塵套。 7、酸鹼度測定儀每次測定時應先作溫度及酸鹼度校正，若標準液過期或失效應

丟棄不可使用。 8、水浴槽每次使用前及使用中應測定其溫度，每月清洗清潔。 9、2 - 8 ℃冰箱每日記錄冰箱的溫度，應接警報裝置，每月清洗清潔，每三個

月除霜或檢查冷凍庫。 10、0 ~ -70 ℃冷凍櫃

每日記錄冷凍櫃的溫度，應接警報裝置，每六個月清洗清潔。

11、玻璃器皿不可使用有瑕疵或含清潔劑的玻片，玻璃器皿以乾淨鋁箔封口

再滅菌，滅菌後應檢查是否滅菌完全，並於三個月內使用。 12、菌種純度以抗酸性染色或培養分離菌落檢查菌種純度。 13、染色利用已知陽性的痰或其它檢體作成塗片染色，檢測染色液，並

應使用清潔的玻片及不含抗酸性桿菌的水。四、檢體處理、塗片及消化去污染劑的品管

1、檢體的性質亦應注意，例如檢體為濃稠、黏液狀、膿狀或唾液狀，

若檢體呈唾液狀或不足 5 mL，而塗片或培養結果為陰性，此時應

建議是否重檢。 2、若想得到正確檢驗結果，所收集的檢體應儘速送檢(七日內)，若運

送時有所延誤應予註明，特別是塗片或培養結果為陰性者更應註

明。 3、利用已知陽性的塗片可檢測染液是否有效，而利用已知陰性的塗片

可檢測染液是否受污染，當觀察到陽性塗片時最好經第二者確認並

將塗片保存以備查證。 4、日常操作時應定期統計塗片鏡檢的陽性率，若陽性率突然增高需加

以研究是否發生污染，塗片陽性者一般培養應為陽性，除非病人正

接受治療，若塗片陽性而培養為陰性的比例增高(一般應低於 2%)應懷疑是否發生污染或檢討鏡檢者的鏡檢能力。

5、自行製備培養基時，應記錄所使用試劑或培養基基劑的來源及批

號、固化時間、蛋基培養基蒸厚的溫度、外觀、硬度等資料，並應

定期記錄培養基的陽性率，經製備完成或採購的培養基應檢查其滅

菌度及敏感性，培養基的敏感性可利用 M.tuberculosis (H37Rv, R1Rv) 的標準懸浮液接種於培養基，再計算生長出的菌落是否於可接受範

圍，若培養基品質不良則生長出的菌落相對將減少。 6、檢查每批新製備成消化去污染劑的消化去污染能力，可利用四至六

個痰檢體經消化去污染處理，離心濃縮，分別接種於一般細菌用培

養基 (如血液瓊脂培養基等) 及分枝桿菌培養基(如 L-J, 7H10)，37℃孵育 24-48 小時應不長或僅長出少數菌落，日常操作時應定期統

計檢體的污染率，一般可接受的污染率為 3% - 5% ，若低於 3 %表

示去污染力過強，若低於 5 %表示去污染力過弱或消化不完全，此外 M. godornae 的分離率亦可作為消化去污染處理的參考，一般而

言，本菌種的分離率約 10%，由於 M. godornae 對消化去污染劑的

敏感性較 M. tuberculosis 強，若 M. godornae 的分離率低於 5%，

即表示去污染力過強。 7、若塗片陽性而培養為陰性的比例過高或 M. godornae , M. terrae

complex 等腐生菌的分離率增高時，應定期檢測實驗室所用的蒸餾

水或自來水是否被污染，若使用的水呈混濁或骯髒可將 200-250 mL 水 3000 x g 離心後取沉澱接種於培養基，或以 0.22 μm 孔徑

薄膜過濾，取濾膜接種於培養基，檢測實驗室用水是否被污染。

五、培養基、試劑及生化鑑定試驗的品管 1、每批新配製的培養基，試劑及每次操作生化鑑定試驗均應進行品管，

一般約包括滅菌，生長試驗及生化試驗反應等項目。 2、滅菌試驗需取每批新配製的培養基孵育於 25℃及 37℃，依日常操作

步驟將無菌接種液接種入無菌培養基或基質液可用以檢測"環境性"污染。

3、生長試驗為將已知生長特性的菌種接種於新配製的培養基，以決定

是否品質良好；生化鑑定試驗則利用已知反應特性的菌種管制試驗

品質，常見品管步驟如表 1。

4、分枝桿菌之品質控制確效試驗 4.1 試劑： (1)、培養基：用於培養分枝桿菌之培養基。 (2)、品管菌株：a、近期分離出的 M. tuberculosis。

b、標準菌株 H37Rv。 (3)、其他材料：a、經高壓滅菌過的痰(AFS 陰性)或人工痰。

b、7H9 含 15%甘油液體培養基，PH 7.0。 c、50 mL 塑膠尖底離心管。

4.2 步驟： (1)、使用 3 mL 7H9 含 15%甘油液體培養基將標準菌株 H37Rv 做成懸浮

液(A)並充分混合。 (2)、備製大約 106 cells/mL 濃度懸浮液(B)：將標準菌株 H37Rv 做成懸浮

液(A)一滴一滴加入 1 mL 緩衝液直到有一點混濁為止。 (3)、將懸浮液(B)取 0.5 mL 加入 4.5 mL 含甘油的瓶子中做成 105 cells/mL

濃度懸浮液，重覆上述步驟做成 104 cells/mL 濃度懸浮液及 103

cells/mL 濃度懸浮液。 (4)、將 15 個小玻璃瓶分別標示 105 cells/mL、104 cells/mL、103 cells/mL，

取各濃度懸浮液 0.3 mL 加至每個小玻璃瓶中，存放在-70℃備用。 (5)、每次做品管時分別取不同濃度加入 2.7 mL 經高壓滅菌過的痰液

(AFS 陰性)或人工痰，10 倍稀釋混合後取 0.1 mL 種於三管 L-J 斜面

試管。 (6)、培養於 35℃、5-10﹪CO2、 21 天。 4.3 判讀及記錄：痰痰檢體 104 103 102 判讀

1 2+ 1+~2+ 大約 10 培養基及去污染過程可被接受 2 1+ 0 0 培養基可被接受但去污染過程太毒 3 +或 0 +或 0 0 培養基不被接受

4.4 無菌性試驗每一批號培養基，隨機取 5 支培養於 35℃、5-10﹪CO2、１∼

３星期，觀察是否長出污染菌，若無則符合無菌。 4.5 抑制雜菌試驗

接種 Escherichia coli、Staphylococcus aureus，培養 35℃ 3-7 天，

若無生長，代表其可抑制常見之病原菌。

六、菌種的保存 1、取 2 mL 蒸餾水裝入平底附蓋小瓶。 2、鬆放蓋子將小瓶以 121℃，15 分鐘高壓蒸氣滅菌。 3、取約五至六個菌落加入小瓶中，並乳化成懸浮液。亦可直接利用含

菌的 7H9 培養液。 4、緊蓋蓋子將小瓶直立儲藏於-16℃ 至 -70℃冷凍櫃，一些菌種(如

M.tuberculosis) 於長期儲藏(一年以上)於-20℃時會死亡，但是若儲

藏於-70℃則所有分枝桿菌菌種均能長久保存。(雖然經數次回溫再

冷凍操作仍可培養出菌落。) 七、菌種的來源 1、American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852 2、各保有儲存菌種的實驗室。八、品管作業常用的標準菌種

品管作業時，至少應備有下列菌種以便操作， 1. M. avium, TMC 1403 Arylsulfatase, 3 days (-) Pyrazinamidase (+) Semi-quantitative catalase (<45 mm) Tellurite reduction (+) Tween hydrolysis (-) Tween opacity (-) Urease (-)

2. M. bovis, TMC 1011 Heat stable catalase (-) MacConkey agar (-) Pyrazinamidase (-) Sodium chloride tolerance (-) TCH susceptibility test (-) 3. M. chelonae, TMC 1544 Iron uptake (-) Nitrate reduction (-) Urease (+) 4. M. flavescens, TMC 1541 Tween opacity (+) 5. M. fortuitum, TMC 1529 Arylsulfatase, 3 days (+) Heat stable catalase (+) Iron uptake (+) MacConkey agar (+) Niacin (-) Sodium chloride tolerance (+) 6. M. kansasii, TMC 1201 MacConkey agar (-) Photochromogenic (+) Semiquantitative catalase (> 45 mm) Tween hydrolysis (+) 7. M. trivale, TMC 1453 Tellurite reduction (-) Sodium chloride tolerance (+) 8. M. tuberculosis, R1Rv, TMC 205 Niacin (+) Nitrate reduction (+) TCH susceptibility test (+) 9. M. tuberculosis, H37Rv, TMC 201 Growth on egg and agar

media;drug susceptibility test

第九章結核病的分子診斷技術

目前臨床上診斷結核病的方法，主要靠塗片耐酸性染色鏡檢及結核菌

培養，方法雖然簡單，但是塗片檢查的敏感度(Sensitivity)只有 50%至 60%，

通常在 1mL的痰檢體中，需要至少一萬隻的結核菌，才可以在顯微鏡下被

發現。致於結核菌培養方法，其特異性雖然很高，但是需要至少六到八週

的時間才能得到確定診斷，在時效上幫忙不大，且在培養過程中發生任何

變化皆可能導致無法確定診斷，而影響臨床診斷與治療。

最近發展出來的診斷方法，BACTEC，利用含具有放射性碳-14之軟酯

酸(14C-palmitic acid)，代謝後產生 14CO2，可快速偵測結核菌的存在，雖然

是個不錯的方法，但是由於所產生的放射性廢棄物不易處理，且仍需要藉

助傳統的染色鏡檢及養菌方法以確定診斷，目前未被廣泛應用於臨床檢

驗。其他如利用免疫血清反應偵測結核菌之抗原、抗體，雖然快速，但是

由於結核菌感染可誘發多種不同的抗原及抗體，其敏感度與特異性仍不盡

理想。此外尚有許多的新方法陸續被推出，如 MGIT 快速培養方法逐漸受

到重視，雖然效果不錯，但是由於費用昂貴，目前在臺灣僅有少數醫療單

位使用。因此，為有效掌握結核病患，加強結核病的防治工作，我們需要

改進已使用多年的傳統塗片染色鏡檢及結核菌培養，研發更快速、準確的

診斷方法，以提早發現結核病例，鑑定感染菌種，評估對藥物之抗藥性，

及早給予適當的治療。近年來，分子生物學技術的發展，聚合酉每鏈反應

(Polymerase Chain Reaction, PCR)與核酸探針(DNA probe)的應用，可直接從

檢體中測出分枝桿菌的 DNA 或 RNA，大幅縮短了診斷的時間。而限制酵

素片段長度多型性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)提供快

速準確的菌種分型資料，對結核病之流行病學具臨床價值。利用這些方法

臨床醫師可以從各種檢體中直接偵測出結核菌的感染，及早給予病人適當

有效的治療。

一、 PCR 在結核菌診斷的應用

將分子生物學技術應用於結核病的診斷是近十年來的事，早期利用標

記放射性元素之核酸探針(DNA probe)進行雜交反應(hybridization)，需要約

結核病的分子診斷技術

至少 2x104個結核菌才能偵測出來，其敏感度與一般傳統方法差不多，因此

並不被重視。聚合鏈酉每反應（PCR）是一種以核酸生物化學為基礎的分子

生物學診斷技術。利用這種技術，吾人可從極少量的臨床檢體中分離出結

核菌的核酸，再以特定的核酸片段作為連鎖反應的引子(primers)，在試管內

反覆進行(1)變性(Denaturation)、(2)鍛化(Annealing)、及(3)延伸(Extension)

等三個步驟，經過 30至 40回反應後，可複製得到約 106個相同的核酸片段。

這些 PCR產物用 ethidium bromide染色後，以電泳分離，可在洋菜凝膠上

辨視出來，或以南方墨跡轉漬(Southern blotting)到雜交膜上，再以特定之探

子進行雜交檢驗。使用 PCR方法，吾人可以輕易的由各種檢體中偵測到結

核菌的存在，這是過去用傳統方法不易作到的。PCR自 1989年應用於結核

病的診斷以來，立即成為結核病細菌學診斷領域中備受關注的焦點。經過

多年的努力累積了大量的資料和經驗，技術方法不斷改進，其反應靈敏、

特異、快速的特性在多數報告中已得到肯定。目前已有許多針對各種特定

結核菌核酸片段所合成的引子被運用於結核病的診斷，其中 IS6110為結核

菌特有的重複序列，在結核菌基因組中具有 10∼20個拷貝，敏感度相對地

提高許多，是設計結核菌 PCR檢測方法的首選基因。PCR的技術操作並不

複雜，但是由於對技術質量的要求很高，且因 PCR產物的污染而導致的偽

陽性率(約 1-2%)，與因標本中抑制物質存在而導致的偽陰性等問題，以及

各種 PCR缺乏標準化等因素皆是影響 PCR結果可信度的關鍵。雖然如此，

PCR 技術的高敏感性、高特異性、高再現性、簡便、快速等優點，是診斷

結核病的一項重要工具。至今已開發出許多新的高敏度和高特異性的 PCR

方法，如反轉錄 PCR法、巢式 PCR法、單管巢式反轉錄 PCR法、即時螢

光 PCRE、多重式 PCR等，在一定程度上提高了 PCR方法的敏感性和特異

性，可使聚合酉每鏈反應技術成為一項理想的診斷方法，造福更多的病人。

二、限制酵素片段長度多型性(Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP) 由於結核病的流行再次對今日的公共衛生造成不可忽視的威脅，欲有

效控制結核病的流行，首先必須快速掌握感染源，確定診斷後給與有效的

治療。然而，傳統鑑定菌種主要靠區別菌叢形狀及不同的生化反應，通常

需要 4 到 6 週或更長的時間，且特異性不高，若使用藥物試驗方法鑑定，

則需要再等 2至 4週才能得到結果，不具時效性。

RFLP方法利用限制酵素切割多變重覆序列片段旁，兩邊固定的切位(其

切位不可在重覆序列內)。由於重覆序列數目不同，所產生的 DNA 片段長

度就不同，經 DNA電泳分離可在不同位置上產生不同大小的核酸片段，藉

由這些電泳圖上所產生的限制酵素片段長度多型性是否相同或相似來幫助

判斷不同來源之 DNA 的差異與否。最近以結核菌獨有的 IS6110 片段為標

記探針之 RFLP方法是目前應用於流行病學及院內感染的研究，最常被應用

的分型方法。雖然如此，此法仍有許多地方急待改進，如缺乏專一可靠的

基因片段作為分析的對象，及尚無統一的操作方法，以致無法比較不同來

源的結果，其中最大的問題即需要大量的核酸才能切割出清楚的圖譜，因

此無法直接分析臨床檢體。近年來，由於 PCR的應用，吾人可以從極少量

的檢體中複製出大量具特定序列的核酸以供分析，顯著地提高了 RFLP的臨

床價值。藉由 PCR-RFLP 方法鑑定各結核菌種基因序列的異同，吾人可以

省略費時、費力的養菌步驟，快速準確的掌握感染原，鑑定感染原間的相

關性，建立地方性的菌種資料，是控制傳染病的流行及院內感染管制不可

或缺的重要方法，近來逐漸受到廣泛的重視，認為此法敏感度高，且較傳

統生化方法省時、省力，對提升結核病的防治與公共衛生的品質將有極大

的助益。

三、目前應用核酸擴增技術(Nucleic acid amplification，NAA)之常用分子檢驗試劑（一）Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test 或 E-MTD

這項檢驗是利用複製 RNA 的原理，以結核菌的 rRNA 為偵測對

象，採用 TMA(Transcription-Mediated Amplification)方法複製 rRNA，

及 HPA (Hybridization Protection Assay)技術偵測複製出的 RNA 產

物，最後再以 Gen-Probe luminometer 來測定雜交探針上 acridinium

ester 所釋出的冷光信號，可直接檢測出臨床檢體中的結核菌存在。

E-MTD 擁有相當不錯的敏感性和特異性，對於呼吸道檢體的敏感度

可達 90.9%~95.2%，特異性約 98.8% ~100%，尤其對於塗片染色鏡檢

為陰性的檢體，其敏感性高達 83%~100%。檢體經過標準去污染方法

處理過後，利用 E-MTD test只須耗時 2.5個小時即可得到結果。目前

結核病的分子診斷技術

經美國「藥物與食品管理局」(FDA)核淮，配合細菌培養方法，使用

於診斷臨床未接受抗結核藥物治療的病人，此法同時適用於塗片染色

鏡檢為陽性及陰性的呼吸道檢體之檢測。

（二）The Roche Amplicor Test

這項檢驗試劑是利用 PCR複製 DNA的方法及核酸雜交技術，直

接偵測臨床檢體中的結核菌。整個實驗包含了四個主要的步驟：檢體

的處理、標記 Biotin 的引子來進行 DNA 複製放大、再與特定的核酸

探針進行雜交、最後利用呈色反應，在波長 450 nm下測其吸光值來偵

測結果。整個試驗從處理過的檢體開始，約需 6.5 小時，其特色是利

用 dUTP代替原有的 dTTP，及添加 Uracil-N-glycosylase酵素，可避免

因實驗操作時造成污染而出現偽陽性；另外因含有 internal control，可

防止在 PCR 複製過程中，因含有抑制物而影響 PCR 反應，導致偽陰

性的結果出現。美國 FDA 在 1996 年核淮上市至今，其臨床評價與

MTD相近。但由於對耐酸性染色鏡檢呈陰性的檢體檢出率偏低，美國

FDA建議Amplicor test的檢測目前只能用染色鏡檢為陽性的呼吸道檢

體。

目前這兩種方法皆僅適用於呼吸道檢體，雖然有些文獻報告使用在非

呼吸道檢體的檢驗上，但結果不儘理想。此外，由於這些分子檢驗技術敏

感度高，使用者必須提供充份的臨床資料，再配合實驗室細菌學檢查的結

果，才能作最後的判斷。

四、臨床上的判斷與應用根據美國 FDA的建議，臨床上檢測結核菌的痰檢體，需取自三個不同

的採集日期，並分別做染色及培養。取第一個檢體，或第一個染色呈陽性

的檢體進行核酸擴增技術(NAA)；如果有需要，則再收集另一套檢體作確

認。如果第一套檢體染色及 NAA檢查皆呈陽性，則可確認為結核感染。若

塗片染色呈現陽性，但是 NAA 檢查呈陰性，則必須檢查是否因 PCR反應

中含有核酸複製的抑制物所引起。若無抑制物的影響，且重複另一套檢體

的結果亦呈陰性，則可推測病人可能感染非結核性的分枝桿菌

(nontuberculosis mycobacteria，NTM)。若塗片染色呈陰性，但 NAA檢查呈

陽性的情形，則必須再做另一套檢體，如果得到相同結果，則可推論此病

人極可能感染結核病。最後，如果兩者皆為陰性，則表示這個病人並無感

染的癥兆。然而，單靠 NAA結果並不能將病人為活動性結核帶原者的可能

性完全排除，最後診斷仍需要仔細評估臨床症狀的嚴重度與感染結核病的

可能性，以及是否接受藥物治療等因素考慮進去。尤其是當分子檢驗結果

與臨床症狀不一致時，病人的臨床病情是否高度懷疑結核感染是判讀 NAA

結果與決定後續處置的重要依據。

五、結論雖然分子檢驗技術可提高結核病診斷的速度，但它仍不能取代傳統的

抗酸性染色鏡檢及結核菌培養方法。主要原因是目前多數 NAA方法只針對

結核菌群(Mycobacterium tuberculosis complex)的診斷而設計，至於其它的非

結核分枝桿菌(NTM)及藥敏試驗，還是得仰賴傳統培養方法來確定診斷。由

於 NAA方法無法區別所測得的菌體為活菌或死菌，因此它也無法用來評估

治療的效果，尚必須根據病人的臨床症狀，才能進一步解讀 NAA檢驗的結

果。目前診斷結核菌的分子生物學方法很多，雖然能對部份分枝桿菌進行

快速診斷，但仍缺乏統一的標準化方法，致使每個實驗室之間的資料無法

進行比較。今後，如何針對分枝桿菌設計出一套全面性、準確且更有效率

的方法，將是未來發展 NAA方法所要努力的方向。

分子生物技術的領域十分浩瀚，在結核病的應用多數仍屬於起步階

段，本文僅介紹兩種最常用的方法，提供大家作為參考，希望不久的將來，

吾人可以發展出更快速、更準確的新方法，使結核病的診斷更上一層樓，

則杜絕結核病的夢想即可早日實現。

索引

A Acridinium ester 104 Acridine orange 39,40 Acid fast bacilli, AFB 抗酸菌 2, 3, 15, 23, 28, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 44, 51, 52,78,85,86,87,99 Aerosol 霧滴 3, 4, 9, 10, 13, 14, 81 Ager 27,46,51,54,65,71,76,78,81,101 AIDS 44,45,50 Albumin-dextrose-catalase, ADC 31, 52, 58, 81 American Type Culture Collection, ATCC 100 Amikacin 80 Ammoniacal nitrogen 54 Amphotericin B 32 Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test 104 Amphyl 10,11 Amyphyl 35 anhydrous dibasic sodium phosphate 39 Anhydrous Na2CO3 無水碳酸鈉 53,58 Anhydrous Na2HPO4 22, 52, 56 Aniline 61, 62 Annealing 鍛化 103 Arylsulfatase 51, 52, 73,77, 98, 100,101 Asparagine 30 ATS 78 Auramin O 39,40 B BaCl2 59 Bacillus stearothermophilus 10 BACTEC 28,33,90,91,93,102 BACTEC 9000 MB (Becton Dikinson) 33 BACTEC MGIT 960 ( Becton Dikinson) 33,90,91 Basic fuchsin 37 BCG 61, 63, 64, 66, 76

Benzene 47 Benzidine 61, 62 Biological Safety Cabinet, BSC 生物安全操作櫃 4, 8, 9, 10, 12, 13, 17, 27, 62, 81,95 Biosafety guide 9 Biotin 105 Boderline 82 Bovine albumin 22, 27, 28 Bovine albumin fraction V 20, 22,23, 27 Buff 46 C Candida spp. 42 Capreomycin,CAP 80 Carbenicillin 32 Carbolfuchsin 38 Carbon source 54 Carotenoid 46 Catalase 31, 47, 48, 49, 50, 51, 55, 56, 61, 72,73,74,76,77,98,100,101 Centers for Disease Control, CDC 美國疾病防治中心 4, 9,10,52 Cetylpyridinium chloride, CPC 20,27 Chocolate 32,33 Chromogens 76,88 Ciproflo-xacin 73 Citrate 73 Clarithromycin 79 Clorox 36 Colony 79, 89 Colony-forming units CFU 79 Cord formation 40 Corynebacterium 40 CO2 17,34,60,66,69,81,95,98,99,100 14CO2 102 14C-palmitic acid 102 Crystal violet 46,51 Cyanogen bromide 61, 62 D Denaturation 變性 103 Dextrose 31, 71 DH2O 98

索引

Dibasic sodium phosphate 39 Difco-Bacto urea agar concentrate 71 Disodium phosphate 53, 56, 69 Distilled water 30 Dissecting microscope 實體顯微鏡 29 DNA 102,104,105 Dubos broth base 65 Dubos Tween-albumin 52,17,33, 52 dTTP 105 dUTP 105 Dysgonic 劣生型 89 E E-MTD 104 Emzymatic digest casein 31 Enzyme substrate stock solution 酵素基質液 52 Escherichia coli 100 ESP 28 ESP culture system(Trek Diagnostic system) 33 Ethambutol, EMB 50,79, 80, 83, 84, 85 Ethanol 乙醇 37,38,39,54,61 Ethidium bromide 103 Ethionamide, THA 80 Ethyl 11 Eugonic 優生型 89 Extension 延伸 103 F FDA 美國「藥物與食品管理局」104,105 Ferric ammonium citrate 32,59,65,66 Flocculating medium 42 Fogging machine 製霧機 14 Formaldehyde 甲醛 11, 13, 14,30 Fuchsin 38

G Gen-Probe luminometer 104 glass wool 玻璃絨 39 Glycerol 30,31,32,39,58 H H2O 37,55,63 H202 55,56,57 H2SO4 59 H37Ra 87 H37RV 87,96,99 Hydrochloride 80 Hydrocyanic acid HCL 24,37,38,39,54, 62,63 Heme 32 Hemin 32 Hemoglobin 32 High Efficiency Particulate Air, HEPA 4, 7, 9, 13 HIV 44 HPLC 93 Hybridization 雜交反應 102,104 Hybridization Protection Assay,HPA 104

I International Air Transport Association, IATA 國際空運協會 18 internal control 105 Iron oxide 59 Iron Uptake 59, 73, 101 Isolator Tube 17 Isoniazid, INH 50, 55, 68, 79, 80, 82, 84, 85, 87 Isopropyl 11 IS6110 103,104

索引

K Kanamycin, KM 80 Kent 41 KH2PO4 22,54, 56,63, 69,71 Kinyoun 38 K/K Kent/Kubica 41 KMnO4 39 KOH 54 Kubica 41 L L-aspartic acid 30 Laminar Flow Biological Safety Cabinet, LFBSC 9 Lipase 69 Liquid media 52 Lowenstein-Jensen, L-J 20, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 46, 47,48, 55, 57, 58,59, 62, 64, 74, 75, 89, 96,97, 98, 99 L-J-Gruft 30 Lymphadenitis 44 M M. abscessus 45,46,51,66,73,75,76,78,90 M. africanum 43, 76, 78 M. asiaticum 76 M. avium complex MAC 19,43,45,48, 49,50,52,55,56,61,62,65,67,68,69,70,73, 74,76,78,79,98 M. avium, TMC 1403 100 M.bohemicum 76 M.bovis 43,44,47,48,55,56,63,64,65,66,68,69, 70,71,72,74,76,78,98 M.bovis BCG 64,76 M. bovis, TMC 1011 100 M.branderi 76 M.canettii 43,76,78 M.celatum 76 M. chelonae 45,51,59,60,63,66,73,75,

76,78,90 M.chelonae chemovar niacinogenes 61 M. chelonae, TMC 1544 101 M.conspicuum 76 M. flavescens 10, 63, 66, 70, 76 M. flavescens, TMC 1541 101 M. fortuitum 45 ,51,52,59,60,66,70,71,73, 75,76,78,90,98,101 M. fortuitum, TMC 1529 101 M. gastri 55, 56, 76 M.genavense 76 M.goodii 76 M. gordonae 44,45,48,49,50,55,56, 70,71,72,73,74, 76,90,97,98 M. haemophilum 32,33,34,46,56,58,76 M.heckeshomense 76 M.heidelbergense 76 M.immunogenum 76 M. intracellulare 45,76,77 M.intermedium 76 M.interjectum 76 M. kansasii 44,48,49,55,63,65,66,70,73,74,76,78,79,85, 90,98 M. kansasii, TMC 1201 101 M.lentiflavum 76 M.mageritense 76 M. malmoense 76 M. marinum 34,44,46,48,49,52,55,58,65, 73,74,76,90 M.microti 43,78 M.mucogenicum 52,76 M.peregrinum 52 M phlei 60,76 M. scrofulaceum 44,49,70,71,72,73,74,76,90 M.septicum 76 M.senegalense 76 M. shimoidei 76 M. simiae 55,61,76 M. smegmatis 52,76

M.subsp.avium 45 M.subsp.paratuberculosis 45 M. subsp.silvatium 45 M. szulgai 47,52,63,70,76,90 M. terrae 56,63,67,68,70,76,77,90,97 M.triplex 76 M. triviale 52,66,76,90 M. triviale, TMC 1453 101 M. tuberculosis 40,43,44,47,48, 53,55,56,61,62,63,64,65,68,70, 72,74,76,78,79,90,96,97,98,99,100,106 M. tuberculosis, H37Rv, TMC 201 101 M. tuberculosis, R1Rv, TMC 205 101 M.tusciae 76 M. ulcerans 34,46,58,76 M. vaccae 76 M. xenopi 45,48,49,50,52,55,70,73, 74,76,89,90 M.wolinskyi 76 MacConkey 46,51,59,60,72,75,100,101 Magnesium citrate 30 Magnesium sulfate.7H2O 30 MAI 90 MAIS 90 Malachite green 30 Mannitol 木蜜糖 54,73 MB/BacT ALERT 3D 28,33 McFarland 59,81 McFarland nephelometer 58 Methylene blue 38 MGIT 28,29,33,90,91,92,102 MgSO4•7H20 54 Microcolonies 83 Middlebrook 28,29,31,33,50 Middlebrook 7H9 17,28,33,52,58,60,67,68,83 89,91,98,99,100 Middlebrook 7H10 31,32,47,48,49,50,51, 61,68,78,79,80,81,85,89,97 Middlebrook 7H11 27,31,32,61,79,85,89 Monopotassium phosphate 30,56,69 MTD 105 Murphy-Hawkins 70 Mycolic acid 37

Mylar 34

N NaCl 21,25,27,61,66,67,71,73,75,98 Na2CO3 碳酸鈉溶液 16,52,53 Na2HPO4 22,53 Na2PO4 63,69 N-Acetyl-L-Cysteine, NALC 21,22,23,28 Nalidixic acid 30 NaNO3 63 NaOCl 36 NaOH 21,22,23,24,25,26,27,28,61,63,71 NaOH-Na citrate 22 Naphthylethylenediamine dihydrochloride 63 Na3PO4 16 National Institute for Occupational Safety and Health, NIOSH 10 Negative Pressure Biological Safety Cabinet, NPBSC 9 Neutral red 69 NH3 65 NH4OH 14 (NH4)2SO4 54 Niacin 30,48,49,51,61,62,72,73,74,98,101 Niacin test 56,65 Nicotinic acid 61 NIH 9 Nitrate 48,49,50,51,61,63,64,72,73, 76,98,101 NO3 74,75 Nocardia 40 Nonphotochromogens 非產色菌 43,44,45,46,47,48,50,55,56,67,68,69,70,72, 73,88,90 Non-tuberculous Mycobacteria, NTM 43,46,72,74,78,87,88,105,106 Nucleic acid amplification，NAA 核酸擴增技術 104,105,106

索引

O O2 55 Ofloxacin 80 oleic acid 69 Oleic Acid- Albumin-Dextrose-Catalase, OADC 30,31,32,81 OSHA 10 Osyl 11 Oxalic Acid 22,25 P P-aminosalicylic acid, PAS 50,80 Pan-susceptible 87 Penicillin 30 Peptone 71 Phenol 38,39,40 phenol crystal 39 Phenol red 酚紅 24,25,26,53,71 Phenolphthalein 52,53 Phenolphthalein disulfate 53 Phosphate buffer 56,69,98 Photochromogens 光產色菌群分枝桿菌 43,44,47,88,90,101 P-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone, NAP 47,63,72,74,91,93 p-nitrobenzoic acid, PNB 47,72,74,91 Polymerase Chain Reaction, PCR 聚合酉每鏈反應 93,102,103,104,105 Polymyxin 32 Polymxin B 73 polyoxyethylated sorbitol 69 Potassium asparate 61 Potassium phenolphthalein disulfate 52 Potassium tellurite 67,68 Potato flour 30 Primers 引子 103 Probe 93,102 Proportion method 比例法 78 Proskauer-Beck Broth 17 Pseudomonas 25 Purified agar 54 Pyrazinamidase 48,49,51,65,72,73,100

Pyrazinamide, PZA 65,66,79,80 Pyrazinoic acid 65,66 Pyruvic acid sodium salt 65 R R1Rv 96 Radiometric 78 Rapid grower 45,90 Resistant 82 Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP 限制酵素片段長度多型性 102,103,104 Rifabutin 80 Rifampin, RIF 50,56,79,80,84,85 RNA 102,104 Roche Amplicor Test 105 Rodamine B 39,40 R-OSO3H 51 rRNA 104 RWS R.W.Smithwick 41 S Saline 61 Scotochromogens 暗產色菌 43,44,47,48,49,50,55,69,70,72,73,74,88,90 SDL 12 Semi-quantitative 100 Smithwick 41 Sodium chloride 101 Sodium citrate 檸檬酸 21,22,54 Sodium citrate anhydrate 22 Sodium citrate dihydrate 22 Sodium hyperchloride 次氯酸鈉 10,11,36 Sodium salt 53 Southern blotting 南方墨跡轉漬 103 Splash proof 防濺 23,25,26 S.Q. 98 Staphene 11 Staphylococcus aureus 100 Stesdham 71 Streptomycin, SM 50,80 Sulfanilamide 63

Sulfuric Acid 26 Susceptible 82 Szabo and Vandra 59 T Tap water scotochromogen 45 Tellurite 67,68,77,98,100,101 Tellurium 67,68 Texas urease 71 Thiophen-2-Carboxylic acid Hydrazide, TCH 48,50,68,69,72,91,98,101 Transcription-Mediated Amplification, TMA 104 Trimethoprim 32 Trisodium citrate 21 trisodium salt 52,54 Tuberculostearic acid 93 Tween 80 48,49,50,55,56,57,58,67,69,71, 73,74,98 Tween-albumin 81 Tween- H2O 57 Tween hydrolysis 100,101 Tween opacity 100,101 Tween-peroxide 56 U Uracil-N-glycosylase 105 Urea 尿素 70,71 Urease 48,49,50,70,71,73,77,98,100,101 V Vesphene 11 Vortex mixer 23,24,25,28 W Wyne 71 Waxes 37

Wayne 11,59,98 Z Ziehl-Neelsen 38,93

GPN：1009300426

國家圖書館出版品預行編目資料

結核菌檢驗手冊 / 陸坤泰主編. －－再版.－－

台北市：衛生署疾管局, 民 93

面；公分

ISBN 957-01-6691-6（平裝）

1. 肺結核－手冊,便覽等 2. 病源檢驗－手

冊, 便覽等 3. 檢疫－手冊,便覽等

412.44026 93002323

書名：結核菌檢驗手冊（再版）主編：陸坤泰編輯委員：林碧芬、吳竹蘭、彭建芳、薛博仁、蔡文城

鄧麗珍、蘇維鈞出版機關：行政院衛生署疾病管制局地址：100 台北市林森南路 6 號網址：http://www.cdc.gov.tw 電話：（02）2395-9825 傳真：（02）3393-6149 設計印刷：李白彩色製版印刷有限公司地址：116 台北市景福街 204 號 2 樓電話：（02）2930-9958 出版年月：中華民國九十三年三月版次：再版定價：新台幣 250 元整展售處：台北國家書坊

地址：臺北市八德路三段 10 號電話：（02）2578－1515 轉 643 台北三民書局地址：臺北市重慶南路一段 61 號電話：（02）2361－7511 台中五南文化廣場地址：台中市中山路 2 號電話：（04）226－0330 彰化新進圖書廣場地址：彰化市光復路 177 號電話：（04）725－2792 高雄青年圖書地址：高雄市青年一路 141 號電話：（07）332－4910

結核菌檢驗手冊 - CDC ·...

Documents

Transcript of 結核菌檢驗手冊 - CDC ·...

結核病傳播之流行病學及結核 病群聚事件實例homepage.ntu.edu.tw/~ntuidrec/file/Case Studies in Infectious Disease... · 結核病傳播之流行病學及結核 病群聚事件實例

日本結核・非結核性抗酸菌症学会 | 日本結核 ......analysis. Lancet. 2018 ; 392 (10150) : 821-834. 2017 ; 92 529-534. Ferlazzo G, Mohr E, Laxmeshwar C, et al.: Early

結核A2ポスター版下Title 結核A2ポスター版下 Created Date 3/14/2018 2:18:32 PM

高齢者施設等における 結核対策マニュアル · 2 高齢者施設における結核予防対策 結核感染対策の基本となる要素は、①結核菌の除去、②結核菌の密度の低下、③吸入結

結核病 （ tuberculosis ） 人獣共通

第七章 肺外結核 · 或病理學證據。 7.9 肺外結核之治療 肺外結核的治療基本上與肺結核的治療相同，唯一的差別是治療期間是否延長。美

ヒト型結核菌による腸結核における感染と発病の機序2010)/Vol85_No9/Vol...Kekkaku Vol. 85, No.9:711_721, 2010 712 結核 第85巻 第9 号 2010年9 月 新規結核感染をきたすことが知られている

結 核 Ⅰ 結核は決して過去の病気ではありませんE2%85%A0-4.… · Ⅰ 結核 は決して過去 ... ・慢性肺結核症が代表で中学生のときに結核になると、この病

3．皮膚疣状結核A．結核菌によるもの／b．結核疹 5496 3．皮膚疣 ゆう 状 じょう 結核 warty tuberculosis，tuberculosis verrucosa cutis 症状・病理所見

結核の統計 2019を読む4 9/2019 複十字 No.388 結核の統計 2019を読む ―結核低蔓延化は近づいてきたか― 結核研究所 臨床・疫学部 内村 和広

第178回日本結核・非結核性抗酸菌症学会関東支部 …...第178回日本結核・非結核性抗酸菌症学会関東支部学会 第241回日本呼吸器学会関東地方会

医療機関における結核対策の手引 - metro.tokyo.jp · PDF fileはじめに ・都の結核患者数は減少傾向にあるものの、今なお毎年3千人近くの新たな結核患者が発

私たちの目標 02050年、結核のない世界へ ⑳世界の … STB.pdf結 核 菌 に 国 境 は 結核（TB）は過去の病気ではありません。未だアフリカ・アジア地域を中心に、結核の蔓延

肺結核及 咳嗽禮儀

切除後に再発した腹壁結核の 12010)/Vol85_No6/Vol...553 はじめに 結核は肺結核と肺外結核に大別される。肺外結核の中 で比較的まれな病型として体壁結核があり，そのなかで

結核に対する感染防御機構2010)/Vol85_No6/Vol...539 ミニ特集「免疫と結核」 結核に対する感染防御機構 河村伊久雄 キーワーズ：結核菌，マクロファージ，ファゴリソソーム，アポトーシス，ネクローシス，サイトカ

もっと知ろう！結核のこと 3 日本と世界の結核 4 結 …もっと知ろう！結核のこと 結核をなくすためには 何よりも、皆さんに結核に ついて正しく理解してもらうことが大切。あなたと身近な人を結核から守るため

宮城県結核予防計画 - pref.miyagi.jp核の病態が多様化・複雑化してきている u 本県の結核予防計画は t結核予防法に基づき平成16 年に国が定めた「結核の予

本日の内容 - pref.nara.jp · PDF file奈良県における結核 ... 大正2年内務省衛生局：結核蔓延系統図 「結核」の病

南アフリカの若い女性イングリッドの結核との闘い結核を生きる 南アフリカの若い女性イングリッドの結核との闘い I イングリッド ngrid

結核病傳播之流行病學及結核病群聚事件實例homepage.ntu.edu.tw/~ntuidrec/file/Case Studies in Infectious Disease... · 結核病傳播之流行病學及結核病群聚事件實例

高齢者施設等における結核対策マニュアル · 2 高齢者施設における結核予防対策結核感染対策の基本となる要素は、①結核菌の除去、②結核菌の密度の低下、③吸入結

結核病（ tuberculosis ）　人獣共通

第七章肺外結核 · 或病理學證據。 7.9 肺外結核之治療肺外結核的治療基本上與肺結核的治療相同，唯一的差別是治療期間是否延長。美

ヒト型結核菌による腸結核における感染と発病の機序2010)/Vol85_No9/Vol...Kekkaku Vol. 85, No.9:711_721, 2010 712 結核第85巻第9 号 2010年9 月新規結核感染をきたすことが知られている

結核 Ⅰ 結核は決して過去の病気ではありませんE2%85%A0-4.… · Ⅰ 結核は決して過去 ... ・慢性肺結核症が代表で中学生のときに結核になると、この病

3．皮膚疣状結核A．結核菌によるもの／b．結核疹 5496 3．皮膚疣ゆう状じょう結核 warty tuberculosis，tuberculosis verrucosa cutis 症状・病理所見

結核の統計 2019を読む4 9/2019 複十字 No.388 結核の統計 2019を読む ―結核低蔓延化は近づいてきたか― 結核研究所臨床・疫学部内村和広

第178回日本結核・非結核性抗酸菌症学会関東支部 …...第178回日本結核・非結核性抗酸菌症学会関東支部学会第241回日本呼吸器学会関東地方会

医療機関における結核対策の手引 - metro.tokyo.jp · PDF fileはじめに・都の結核患者数は減少傾向にあるものの、今なお毎年3千人近くの新たな結核患者が発

私たちの目標 02050年、結核のない世界へ ⑳世界の … STB.pdf結核菌に国境は結核（TB）は過去の病気ではありません。未だアフリカ・アジア地域を中心に、結核の蔓延

肺結核及咳嗽禮儀

切除後に再発した腹壁結核の 12010)/Vol85_No6/Vol...553 はじめに結核は肺結核と肺外結核に大別される。肺外結核の中で比較的まれな病型として体壁結核があり，そのなかで

結核に対する感染防御機構2010)/Vol85_No6/Vol...539 ミニ特集「免疫と結核」結核に対する感染防御機構河村伊久雄キーワーズ：結核菌，マクロファージ，ファゴリソソーム，アポトーシス，ネクローシス，サイトカ

もっと知ろう！結核のこと 3 日本と世界の結核 4 結 …もっと知ろう！結核のこと結核をなくすためには何よりも、皆さんに結核について正しく理解してもらうことが大切。あなたと身近な人を結核から守るため

本日の内容 - pref.nara.jp · PDF file奈良県における結核 ... 大正2年内務省衛生局：結核蔓延系統図「結核」の病

南アフリカの若い女性イングリッドの結核との闘い結核を生きる南アフリカの若い女性イングリッドの結核との闘い I イングリッド ngrid